CN106265509B - 一种pH和Redox双响应两亲性嵌段共聚物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种pH和Redox双响应两亲性嵌段共聚物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

一种pH和Redox双响应两亲性共聚物及其制备方法和用途。本发明提供的共聚物分子式为MPEG‑Linker‑PAE‑ss‑PLGA，具有如式I所示结构。可通过如下步骤得到：通过反应修饰大分子单体聚乙二醇单甲醚(MPEG)，得到具有pH响应性的亲水大分子单体(MPEG‑Linker)；通过反应采用二硫键修饰大分子单体聚乳酸‑羟基乙酸共聚物(PLGA)，得到具有Redox响应性的疏水大分子单体(PLGA‑Cys)；通过迈克尔加成反应一步法得到所述共聚物。本发明提供的共聚物可用于装载水难溶性药物胶束系统中，可控制装载的药物在正常组织处缓慢释放，且长时间累计释放量较低，而在病灶组织处富集并快速释放，从而提高药物的生物利用度及治疗效果。

Description

一种pH和Redox双响应两亲性嵌段共聚物及其制备方法和 用途
技术领域
本发明属于生物医药用高分子共聚物材料技术领域，特别涉及一种pH和Redox双响应两亲性嵌段共聚物及其制备方法和用途。
背景技术
当今，癌症已成为人类疾病死因之首，且发病率和死亡率仍持续攀升，对人类健康造成了巨大威胁。据统计，2015年中国有280多万人死于癌症，平均每天就有7500人，癌症已日益成为人类生命健康的主要杀手。
癌症的治疗有化学治疗、放射治疗和手术治疗，其中化疗是临床上最为重要、最为有效的治疗手段。临床上使用的疏水性小分子化疗药物，如阿霉素、喜树碱、紫杉醇等，水溶性差，不能在血液中进行稳定的长循环，也不能区分杀伤正常组织与癌症组织，所以最终到达肿瘤部位的药物很少，并且治疗效率低、毒副作用大。对于很多化疗药物，癌细胞的内吞作用也很关键，如小分子抗癌药物阿霉素需要进入癌细胞，进而进入细胞核才能发挥作用：插入DNA相邻碱基对之间，产生活性自由基，使DNA双股螺旋解旋，DNA链断裂，干扰转录过程，阻止mRNA合成，从而杀伤肿瘤细胞。并且随着化疗的进行，会引发癌症组织的抗药机制，从而使机体产生严重的抗药性。简言之，作为临床上最为重要的治疗癌症的方法，化疗面临诸多挑战，疗效堪忧。
为了解决上述问题，研究人员发展了纳米药物递送体系：使用胶束等含有空腔的载体包载药物，实现难溶性药物的增溶；外层接上聚乙二醇(PEG)等生物相容性分子延长血液循环时间，从而延长药物在血液中的半衰期；通过EPR效应或者纳米粒子外层修饰靶向分子，最终实现药物在癌症组织附近的聚集，从而实现药物对病灶组织的治疗目的。
研究发现，癌症组织的微环境异于正常组织。由Warburg effect可知，癌细胞由于快速的生长需要摄取更多的葡萄糖，葡萄糖酵解产生乳酸，使得癌症组织附近呈现弱酸环境，pH在6.5-7.0间；癌细胞内部的溶酶体和内涵体pH更低，大约在5.0左右。并且由于癌细胞的致癌基因激活、线粒体损伤以及慢性炎症，癌细胞内部GSH浓度水平比正常细胞和血液中都要高。我们知道载体的PEG化有利于纳米载药体系在癌症组织附近的积累，但由于细胞膜表面带负电荷，中性或带负电的纳米粒子难以被癌细胞内吞摄取，基于癌症组织微环境的特点，若在体系中引入pH和Redox响应基团，使纳米载药体系在到达癌症组织后能够脱掉最外层的PEG并且显露正电荷将有利于癌细胞对药物载体的摄取。
现有的载体材料有脂质体、水凝胶、树枝状大分子、碳纳米管、金属颗粒以及共聚物等，其中共聚物具有可设计的多样性的结构，最为研究者所青睐。但是目前基础研究中用到的常规性共聚物poly(ethylene imine)(PEI)多为难降解材料，对生物体伤害较大，而Poly(β-amino esters)(PAE)具有良好的生物相容性，能够降解，并且在酸性环境下能够质子化由难溶变为可溶，具有极优良的性能。
然而，到目前为止，鲜有文献和专利报道基于PAE的pH和Redox双响应的两亲性嵌段共聚物，能够同时实现载药胶束在血液中的长循环、在癌症组织的积累，以及提高癌细胞摄入量，并且由于对癌细胞内部环境的响应使胶束结构破坏实现高效的药物释放。通过这种多级靶向策略，最终使更多的药物进入到癌细胞内部发挥效能。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的目的之一在于提供一种pH和Redox双响应两亲性嵌段共聚物。本发明提供的共聚物能够同时实现载药胶束在血液中的长循环、在癌症组织的积累，以及提高癌细胞摄入量，并且由于对癌细胞内部环境的响应使胶束结构破坏实现高效的药物释放。通过这种多级靶向策略，最终使更多的药物进入到癌细胞内部发挥效能。
为达上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种pH和Redox双响应两亲性共聚物，分子式为MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA，具有如下式I所示结构：
其中，n＝25～90，x＝2～8，y＝10～40，z＝3～10。
优选地，所述共聚物的数均分子量为6170～78650g/mol，优选为22100～78650g/mol。
本发明提供的共聚物的结构为：通过反应修饰大分子单体聚乙二醇单甲醚(MPEG)，得到具有pH响应性的亲水大分子单体(MPEG-Linker)；通过反应采用二硫键修饰大分子单体聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，得到具有Redox响应性的疏水大分子单体(PLGA-Cys)；通过迈克尔加成反应一步法得到基于聚-β氨基酯(PAE)的pH和Redox双响应两亲性嵌段共聚物。
本发明的目的之一还在于提供一种本发明所述pH和Redox双响应的两亲性共聚物的制备方法，包括以下步骤：
通过酯化反应采用对醛基苯甲酸修饰末端带有羟基的聚乙二醇单甲醚(MPEG)，得到醛基封端的聚乙二醇单甲醚大分子单体，再通过亲核加成反应与1,3-丙二胺反应，得到具有pH响应性能的苯甲酰亚胺键修饰的氨基封端亲水性大分子单体(MPEG-Linker)；
通过催化中和反应将胱氨修饰末端带有羧基的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，得到二硫键修饰的末端为氨基的疏水性大分子单体(PLGA-Cys)；
通过迈克尔加成反应以上述得到的两种大分子单体以及1,6-己二醇二丙烯酸酯(HDD)和3-氨基-1-丙醇(TDP)为原料，一步法制备基于聚-β氨基酯(PAE)的pH和Redox双响应两亲性共聚物聚乙二醇单甲醚-Linker-聚-β氨基酯-ss-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA)。
作为优选，所述方法包括如下步骤：
(1)制备pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Linker：
a)在惰性气体保护和无水条件下，将催化剂二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)、单体MPEG、小分子单体对醛基苯甲酸(FA)溶于无水有机溶剂中，优选在搅拌的下充分溶解，反应，反应后过滤、浓缩、沉淀、洗涤、干燥，得到醛基封端的大分子单体MPEG-CHO；
b)将步骤a)所得MPEG-CHO溶解在无水有机溶剂中，加入二胺，优选在搅拌的条件下充分溶解后反应，反应结束后冷却、浓缩、沉淀、干燥，得到pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Linker；
(2)制备Redox响应的疏水性大分子单体PLGA-Cys：
a)将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS)催化剂体系逐滴加入到聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)的无水有机溶剂溶液中，反应，反应后浓缩、沉淀、洗涤、干燥，得到末端羧基功能化的大分子中间单体PLGA-NHS；
b)将胱氨二盐酸盐(Cys)的无水有机溶剂溶液逐滴加入到步骤a)所得PLGA-NHS的无水有机溶剂溶液中，加入无水三乙胺(TEA)，反应，反应后沉淀，干燥，得到Redox响应的疏水性大分子单体PLGA-Cys；
(3)将步骤(1)和步骤(2)所得产物采用迈克尔逐步加成法制备pH和Redox双响应的两亲性共聚物。
作为优选，步骤(1)的a)中反应物的摩尔份数如下：
优选地，所述无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿或无水二甲基亚砜中1种或2种以上的组合，优选为无水二氯甲烷(DCM)。
优选地，所述反应的温度为室温，反应的时间为6～36h，优选为24h。
作为优选，步骤(1)的b)中反应物的摩尔份数如下：
MPEG-CHO 1～10份
1,3-丙二胺 1.2～20份。
优选地，所述无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿或无水二甲基亚砜中1种或2种以上的组合，优选为无水二甲基亚砜(DMSO)。
优选地，所述反应的温度为30～60℃，反应的时间为0.5～6h，优选地，所述反应的温度为40℃，反应的时间为3h；
反应(1)中b)所述的二胺为1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、1,5-戊二胺，优选地，所述二胺为1,3-丙二胺。
作为优选，步骤(1)中所述过滤为采用漏斗，优选布式漏斗过滤收集液体。
优选地，所述沉淀为向旋转蒸发浓缩的溶液中加入10倍体积的0℃异丙醇进行沉淀。
优选地，所述洗涤为采用异丙醇和二乙醚清洗沉淀，得到固体。
作为优选，步骤(2)的a)中反应物的摩尔份数如下：
PLGA 1～5份
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 5～25份
N-羟基丁二酰亚胺 5～25份。
优选地，所述无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿或无水二甲基亚砜中1种或2种以上的组合，优选为无水二氯甲烷(DCM)。
优选地，所述反应的温度为室温，反应的时间为3～12h，优选为4h。
优选地，所述沉淀为向旋转蒸发浓缩的溶液中加入10倍体积的-20℃冷冻乙醚中逐滴进行沉淀。
优选地，所述洗涤为采用甲醇与乙醚的混合溶液洗涤沉淀，得到固体。
优选地，所述洗涤剂为甲醇和乙醚的混合液。
优选地，甲醇与乙醚的体积比为1:9～7:3，优选为3:7。
优选地，所述沉淀为2次以上。
作为优选，步骤(2)的b)中反应物的摩尔份数如下：
MPEG-NHS 1～10份
胱氨二盐酸盐 2～20份
三乙胺 2～20份。
优选地，所述无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿或无水二甲基亚砜中1种或2种以上的组合，优选为无水二甲基亚砜(DMSO)。
优选地，所述反应的温度为室温，反应的时间为12～48h，优选为24h。
优选地，所述反应在避光下进行。
优选地，所述沉淀为向溶液中加入10倍体积的在4℃的三次水中逐滴进行沉淀。
作为优选，步骤(3)迈克尔逐步加成法的过程为：在惰性气体保护和无水条件下，将1,6-己二醇二丙烯酸酯(HDD)和3-氨基-1-丙醇(AP)加入到步骤(1)和(2)所制得的pH和Redox响应大分子单体的无水有机溶剂溶液中，反应，反应后冷却、沉淀、干燥，得到具备pH和Redox双响应的两亲性共聚物。
优选地，反应物的摩尔份数配方如下：
优选地，所述无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿或无水二甲基亚砜中1种或2种以上的组合，优选为无水氯仿(CHCl3)；
优选地，所述反应的温度为30℃～90℃，反应的时间为24～120h。
优选地，所述反应的温度为65℃，反应的时间为72h。
优选地，所述沉淀为向旋转蒸发浓缩的溶液中加入10倍体积的0℃正己烷进行沉淀。
所述MPEG和PLGA其结构式分别如下：
本发明的目的之一还在于提供本发明所述的pH和Redox双响应的两亲性共聚物在装载水难溶性药物胶束系统中的用途。
优选地，所述装载水难溶性药物胶束系统由以下方法制备得到：将水难溶性药物溶于有机溶剂中，将pH和Redox双响应的两亲性共聚物溶于同一种有机溶剂中，待共聚物完全溶解后，将共聚物溶液与水难溶性药物溶液混合；透析；过滤、冷冻干燥，得到装载水难溶性药物胶束系统。
基于上述pH和Redox双响应的两亲性共聚物，采用透析法制备得到内层为PLGA和PAE形成的疏水内核、外壳为亲水链段MPEG的纳米级共聚物胶束，实现对水难溶性抗癌药物的装载。在正常人体生理环境下，共聚物胶束能较好包载药物形成结构稳定在载药体系，避免被人体内皮网状系统清除以及药物的失效，延长了体内循环时间；在肿瘤组织处(pH 6.5～7.0，DTT 0～10μM)，连接亲水性外壳MPEG和主链的苯甲酰亚胺键逐步断裂，促使外层MPEG层逐渐脱离，从而减弱了MPEG的屏蔽作用，提高了肿瘤细胞对载药纳米胶束的摄取量；在肿瘤细胞内(pH 5.0～6.5，DTT 10mM)，主链中的叔氨基发生质子化作用，吸收一个氢离子，逐渐由疏水性嵌段转变为亲水性，同时，连接PLGA嵌段与主链的二硫键断裂，内核快速溶胀，导致整个胶束结构被破坏，从而实现负载药物的控缓释作用。
这种pH和Redox双响应两亲性共聚物的结构可以维持体系较高载药量，使得载药胶束能精确响应体内循环过程中的pH梯度变化，增强细胞的内吞作用，在维持体系较高稳定性，延长体内循环时间的前提下，提高载药胶束的细胞摄取量，更有效的提高药物的生物利用度，同时，体系还具备氧化还原响应性，在细胞内能控制药物释放，降低毒副作用，提高药物的治疗效率。
优选地，将水难溶性药物溶于有机溶剂中过夜。
优选地，共聚物溶液与水难溶性药物溶液混合后室温下搅拌，优选搅拌1h以上，更优选搅拌4～6h。
优选地，所述透析采用去离子水进行。
优选地，所述透析的时间为12h以上，优选为24h。
优选地，所述水难溶性药物为在1L水中溶解度小于或等于1g的药物。
优选地，所述有机溶剂为二甲基亚砜或二甲基甲酰胺中的一种或其混合。
所述的装载水难溶性药物胶束系统可控制装载的药物在正常组织处缓慢释放，且长时间累计释放量较低，在肿瘤细胞外弱酸性环境(pH 6.5～7.0)下，亲水性的外壳逐渐脱除，在肿瘤细胞内弱酸性条件(pH 5.0～6.5)及强还原性条件(高谷胱甘肽GSH浓度)实现快速可控释放，且药物累计释放量较大。
本发明的机理为：
胶束外层亲水性的MPEG具有无毒、无免疫原性和无抗原性等优点，在增加胶束稳定性的同时，延长胶束在血液中的循环时间；疏水PLGA内核能够增强对难溶药物的包载性能；中间层的PAE在pH 7.4时表现为疏水性，可与PLGA共同组成胶束的疏水内核，这不仅可以防止药物突释，同时可以增强胶束内核的稳定性；在肿瘤组织处(pH 6.5～7.0)，连接外层MPEG主链的苯甲酰亚胺键逐步断裂，使得亲水外壳MPEG逐步脱除，促进药物递送体系通过细胞内吞等作用进入肿瘤细胞，使得细胞摄取量增大；在肿瘤细胞内弱酸性(pH 5.0～6.5)及强还原性条件(高GSH浓度)条件下，PAE将完全质子化，此时胶束溶胀程度变大，甚至出现解离行为，通过“质子海绵效应”将所包载的药物释放到肿瘤细胞中，同时，高GSH浓度，促使二硫键断裂，PLGA与主链脱离，载药胶束体系瓦解，使得药物能快速释放。通过调节共聚物中各嵌段的比例，可以调控药物的释放速率，满足不同药物的释放要求。
本发明相对于现有技术具有如下优点：
(1)本发明的共聚物分子能在水溶液中自组装为结构稳定的纳米胶束，能有效包载水难溶性药物，通过调整共聚物中不同嵌段的比例，可有效调节其pH响应范围，使胶束不但能迅速、精确响应环境pH值的变化，而且能有效的缓解突释，控制药物释放；
(2)本发明的pH和Redox双响应的两亲性共聚物分子，能精确响应体内循环过程中环境pH值的变化，在维持药物递送体系结构稳定、延长体内循环时间、增大药物递送体系在病灶部位的累积量的同时，也能有效的提高细胞摄取量，增大药物的生物利用度，优化肿瘤的治疗效果；
(3)本发明的pH和Redox双响应的两亲性共聚物分子，在精确响应pH梯度变化的同时，能对细胞内GSH的浓度有很好的响应性，实现pH和Redox双重刺激-响应体系，能更好的控制药物的释放行为，增强药物疗效；
(4)经疏水胆固醇修饰后的共聚物对水难溶性药物的包载能力增强，包载效率提高；
(5)本发明制备得到的pH和Redox双响应的两亲性共聚物，易于调控各嵌段的比例，应用于制备装载水难溶性药物胶束系统，可满足不同药物的释放要求。
附图说明
图1为实施例1中MPEG和MPEG-Linker的1H-NMR图，溶剂为d-CDCl3；
图2为实施例1中MPEG和MPEG-Linker的傅里叶转换红外光谱图；
图3为实施例1中PLGA和PLGA-Cys的1H-NMR图，溶剂为d-CDCl3；
图4为实施例1中PLGA和PLGA-Cys的傅里叶转换红外光谱图；
图5为实施例1中MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA的1H-NMR图，溶剂为d-CDCl3；
图6为实施例1中MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA的傅里叶转换红外光谱图；
图7为实施例1中MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA的GPC洗脱曲线；
图8为实施例1中MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA的临界胶束浓度曲线；
图9(实施例6中MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA自组装胶束的粒径与pH和DTT浓度的关系；
图10为实施例6中MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA自组装胶束的zeta电位与pH和DTT浓度的关系；
图11为实施例6中载阿霉素胶束的体外释放曲线；
图12为实施例6中MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA空白胶束对MDA-MB-231细胞的毒性曲线图；
图13为实施例6中MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA载药胶束以及有利阿霉素对MDA-MB-231细胞作用24h后的毒性曲线图；
图14为实施例6中MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA载药胶束以及有利阿霉素对MDA-MB-231细胞作用48h后的毒性曲线图。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1：pH和Redox双响应的两亲性共聚物MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA的制备
(1)制备pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Linker：在惰性气体保护和无水条件下，依次将溶剂DCM(20mL)、催化剂DCC(41mg，0.2mmol)、DMAP(4.88mg，0.04mmol)、单体MPEG(80mg，0.02mmol)、小分子单体FA(45mg，0.3mmol)加入100mL圆底烧瓶瓶中，在搅拌的条件下，室温，反应24h后，将反应液过滤，除去其中沉淀，收集滤液旋转蒸发浓缩后缓慢加入到10倍(体积比)的冷异丙醇中，置于冰箱中静止2h，收集沉淀，用异丙醇和二乙醚清洗沉淀，得到固体，在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到醛基封端的大分子单体MPEG-CHO，依次用注射器将MPEG-CHO(41.32mg，0.01mmol)和DAP(1.0mL，0.012mmol)的DMSO溶液(20mL)加入100mL装有搅拌子的茄型瓶中，用反口橡皮塞封口，在搅拌的条件，在40℃，反应4h，将反应液旋转蒸发浓缩后冷却至室温，将其缓慢加入到10倍(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Linker。合成反应式见公式(1)，利用核磁和红外分析，见图1和2，产率为85％。
(2)制备Redox响应的疏水性大分子单体PLGA-Cys：称取PLGA(0.6g，0.2mmol)于100mL圆底反应瓶中，加入20mL的无水DCM使其完全溶解，依次称取EDC(0.192g，1mmol)、NHS(0.115g，1mmol)加入20mL的无水DCM中，待其完全溶解后，将EDC/NHS的混合溶液逐滴滴加到反应瓶中，常温下搅拌反应3h，采用旋转蒸发浓缩反应液，在10倍(体积比)-20℃冷冻乙醚中逐滴沉淀，再用200mL甲醇与乙醚的混合溶液(体积比为3：7)洗涤沉淀2次，在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到PLGA-NHS，产率为93％。称取PLGA-NHS(0.310g，0.1mmol)的于100mL圆底烧瓶中，加入20mL无水DMSO使其完全溶解，再称取胱胺二盐酸盐(0.113g，0.2mmol)溶于10mL无水DMSO中，将其逐滴滴加到PLGA-NHS溶液中，再往混合溶液中加入TEA(69.5μL，0.5mmol)，室温下避光搅拌反应20h后停止反应。所得反应液在4℃的三次水中逐滴沉淀，在35℃、35mbar下真空干燥48h。合成反应式见公式(2)，并进行核磁和红外分析，见图3和图4，产率为87％。
(3)制备pH和Redox双响应的两亲性共聚物：于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，冷冻-抽真空-通氮气三次，依次用注射器将15mL的MPEG-Linker(0.838g，0.2mmol)、PLGA-Cys(0.636g，0.2mmol)和AP(45.6μL，0.6mmol)的无水氯仿溶液加入到反应瓶中，再用注射器将5mL的HDD(224μL，1mmol)无水氯仿溶液缓慢滴加如反应瓶中，在氮气氛围中，65℃，搅拌，反应72h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到10倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到基于PAE的pH和Redox双响应的两亲性共聚物，合成反应式见公式(3)，利用核磁和红外分析，见图5和图6，利用GPC测定其分子量，见图7，产率为80％，Mn＝22100，Mw/Mn＝1.35。
实施例2：pH和Redox双响应的两亲性共聚物MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA的制备
(1)制备pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Linker：在惰性气体保护和无水条件下，依次将溶剂DCM(30mL)、催化剂DCC(51.25mg，0.25mmol)、DMAP(30.5mg，0.25mmol)、单体MPEG(40mg，0.01mmol)、小分子单体FA(75mg，0.5mmol)加入100mL圆底烧瓶瓶中，在搅拌的条件下，室温，反应24h后，将反应液过滤，除去其中沉淀，收集滤液旋转蒸发浓缩后缓慢加入到10倍(体积比)的冷异丙醇中，置于冰箱中静止2h，收集沉淀，用异丙醇和二乙醚清洗沉淀，得到固体，在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到醛基封端的大分子单体MPEG-CHO，依次用注射器将MPEG-CHO(41.32mg，0.01mmol)和DAP(1.67mL，0.02mmol)的DMSO溶液(20mL)加入50mL装有搅拌子的茄型瓶中，用反口橡皮塞封口，在搅拌的条件，在40℃，反应4h，将反应液旋转蒸发浓缩后冷却至室温，将其缓慢加入到10倍(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Linker，产率为80％。
(2)制备Redox响应的疏水性大分子单体PLGA-Cys：称取PLGA(0.6g，0.2mmol)于100mL圆底反应瓶中，加入20mL的无水DCM使其完全溶解，依次称取EDC(0.038g，0.2mmol)、NHS(0.023g，0.2mmol)加入20mL的无水DCM中，待其完全溶解后，将EDC/NHS的混合溶液逐滴滴加到反应瓶中，常温下搅拌反应3h，采用旋转蒸发浓缩反应液，在10倍(体积比)-20℃冷冻乙醚中逐滴沉淀，再用200mL甲醇与乙醚的混合溶液(体积比为3：7)洗涤沉淀2次，在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到PLGA-NHS，产率为75％。称取PLGA-NHS(0.310g，0.1mmol)的于100mL圆底烧瓶中，加入20mL无水DMSO使其完全溶解，再称取胱胺二盐酸盐(0.113g，0.2mmol)溶于10mL无水DMSO中，将其逐滴滴加到PLGA-NHS溶液中，再往混合溶液中加入TEA(27.8μL，0.2mmol)，室温下避光搅拌反应20h后停止反应。所得反应液在4℃的三次水中逐滴沉淀，在35℃、35mbar下真空干燥48h，产率为88％。
(3)制备pH和Redox双响应的两亲性共聚物：于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，冷冻-抽真空-通氮气三次，依次用注射器将15mL的MPEG-Linker(0.838g，0.2mmol)、PLGA-Cys(0.636g，0.2mmol)和AP(45.6μL，0.6mmol)的无水氯仿溶液加入到反应瓶中，再用注射器将5mL的HDD(246.4μL，1.1mmol)无水氯仿溶液缓慢滴加如反应瓶中，在氮气氛围中，65℃，搅拌，反应72h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到10倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到基于PAE的pH和Redox双响应的两亲性共聚物，产率为72％，Mn＝39870，Mw/Mn＝1.37。
实施例3：pH和Redox双响应的两亲性共聚物MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA的制备
(1)制备pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Linker：在惰性气体保护和无水条件下，依次将溶剂DCM(20mL)、催化剂DCC(4.1mg，0.02mmol)、DMAP(2.44mg，0.02mmol)、单体MPEG(80mg，0.02mmol)、小分子单体FA(9mg，0.06mmol)加入100mL圆底烧瓶瓶中，在搅拌的条件下，室温，反应24h后，将反应液过滤，除去其中沉淀，收集滤液旋转蒸发浓缩后缓慢加入到10倍(体积比)的冷异丙醇中，置于冰箱中静止2h，收集沉淀，用异丙醇和二乙醚清洗沉淀，得到固体，在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到醛基封端的大分子单体MPEG-CHO，依次用注射器将MPEG-CHO(41.32mg，0.01mmol)和DAP(4.17mL，0.05mmol)的DMSO溶液(20mL)加入100mL装有搅拌子的茄型瓶中，用反口橡皮塞封口，在搅拌的条件，在40℃，反应4h，将反应液旋转蒸发浓缩后冷却至室温，将其缓慢加入到10倍(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Linker，产率为83％。
(2)制备Redox响应的疏水性大分子单体PLGA-Cys：称取PLGA(0.6g，0.2mmol)于100mL圆底反应瓶中，加入20mL的无水DCM使其完全溶解，依次称取EDC(0.960g，5mmol)、NHS(0.575g，5mmol)加入20mL的无水DCM中，待其完全溶解后，将EDC/NHS的混合溶液逐滴滴加到反应瓶中，常温下搅拌反应3h，采用旋转蒸发浓缩反应液，在10倍(体积比)-20℃冷冻乙醚中逐滴沉淀，再用200mL甲醇与乙醚的混合溶液(体积比为3：7)洗涤沉淀2次，在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到PLGA-NHS，产率为88％。称取PLGA-NHS(0.310g，0.1mmol)的于100mL圆底烧瓶中，加入20mL无水DMSO使其完全溶解，再称取胱胺二盐酸盐(0.565g，1mmol)溶于10mL无水DMSO中，将其逐滴滴加到PLGA-NHS溶液中，再往混合溶液中加入TEA(139μL，1mmol)，室温下避光搅拌反应20h后停止反应。所得反应液在4℃的三次水中逐滴沉淀，在35℃、35mbar下真空干燥48h，产率为86％。
(3)制备pH和Redox双响应的两亲性共聚物：于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，冷冻-抽真空-通氮气三次，依次用注射器将15mL的MPEG-Linker(0.419g，0.1mmol)、PLGA-Cys(0.318g，0.1mmol)和AP(60.8μL，0.8mmol)的无水氯仿溶液加入到反应瓶中，再用注射器将5mL的HDD(246.4μL，1.1mmol)无水氯仿溶液缓慢滴加如反应瓶中，在氮气氛围中，65℃，搅拌，反应72h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到10倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到基于PAE的pH和Redox双响应的两亲性共聚物，产率为89％，Mn＝55637，Mw/Mn＝1.42。
实施例4：pH和Redox双响应的两亲性共聚物MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA的制备
(1)制备pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Linker：在惰性气体保护和无水条件下，依次将溶剂DCM(20mL)、催化剂DCC(20.5mg，0.1mmol)、DMAP(24.4mg，0.2mmol)、单体MPEG(80mg，0.02mmol)、小分子单体FA(30mg，0.2mmol)加入100mL圆底烧瓶瓶中，在搅拌的条件下，室温，反应24h后，将反应液过滤，除去其中沉淀，收集滤液旋转蒸发浓缩后缓慢加入到10倍(体积比)的冷异丙醇中，置于冰箱中静止2h，收集沉淀，用异丙醇和二乙醚清洗沉淀，得到固体，在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到醛基封端的大分子单体MPEG-CHO，依次用注射器将MPEG-CHO(41.32mg，0.01mmol)和DAP(1.67mL，0.02mmol)的DMSO溶液(20mL)加入100mL装有搅拌子的茄型瓶中，用反口橡皮塞封口，在搅拌的条件，在40℃，反应4h，将反应液旋转蒸发浓缩后冷却至室温，将其缓慢加入到10倍(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Linker，产率为77％。
(2)制备Redox响应的疏水性大分子单体PLGA-Cys：称取PLGA(0.6g，0.2mmol)于100mL圆底反应瓶中，加入20mL的无水DCM使其完全溶解，依次称取EDC(0.384g，2mmol)、NHS(0.23g，2mmol)加入20mL的无水DCM中，待其完全溶解后，将EDC/NHS的混合溶液逐滴滴加到反应瓶中，常温下搅拌反应3h，采用旋转蒸发浓缩反应液，在10倍(体积比)-20℃冷冻乙醚中逐滴沉淀，再用200mL甲醇与乙醚的混合溶液(体积比为3：7)洗涤沉淀2次，在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到PLGA-NHS，产率为92％。称取PLGA-NHS(0.310g，0.1mmol)的于100mL圆底烧瓶中，加入20mL无水DMSO使其完全溶解，再称取胱胺二盐酸盐(0.0565g，0.1mmol)溶于10mL无水DMSO中，将其逐滴滴加到PLGA-NHS溶液中，再往混合溶液中加入TEA(13.9μL，0.1mmol)，室温下避光搅拌反应20h后停止反应。所得反应液在4℃的三次水中逐滴沉淀，在35℃、35mbar下真空干燥48h，产率为88％。
(3)制备pH和Redox双响应的两亲性共聚物：于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，冷冻-抽真空-通氮气三次，依次用注射器将15mL的MPEG-Linker(1.676g，0.4mmol)、PLGA-Cys(1.272g，0.4mmol)和AP(15.2μL，0.2mmol)的无水氯仿溶液加入到反应瓶中，再用注射器将5mL的HDD(224μL，1mmol)无水氯仿溶液缓慢滴加如反应瓶中，在氮气氛围中，65℃，搅拌，反应72h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到10倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到基于PAE的pH和Redox双响应的两亲性共聚物，产率为70％，Mn＝78650，Mw/Mn＝1.28。
实施例5：pH和Redox双响应的两亲性共聚物的临界胶束浓度CMC值
利用荧光探针法测试实施例1制备得到的pH和Redox双响应的两亲性共聚物MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA在不同pH条件下的临界胶束浓度。
(1)芘溶液的配置：用丙酮溶解芘，配置浓度为12×10-5M的芘溶液。
(2)样品溶液的配置：称取5mg MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA溶于10mL丙酮中，快速将溶液加入到50mL去离子水中，搅拌24h以挥发掉丙酮，得到浓度为0.1mg/mL的共聚物母液，稀释成一系列浓度(浓度范围为0.0001～0.1mg/mL)。取20支10mL容量瓶，分别加入0.1mL步骤(1)配置的芘溶液，然后分别加入上述不同浓度的共聚物溶液定容，摇匀，得到样品溶液。样品溶液中芘的浓度为12×10-7M。
(3)荧光光谱测试：以373nm为发射波长，在300～350nm扫描样品溶液的荧光激发光谱。取波长为338nm和335nm的强度比值(I338/I335)对共聚物浓度对数作图，如图8所示，曲线突变点所对应的横坐标即为lg(CMC)。测得实施例1制备得到的MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA的临界胶束浓度分别为8.7mg/L。
实施例6：pH和Redox双响应的两亲性共聚物载药和空白胶束的制备
采用透析法制备载阿霉素(DOX)的共聚物胶束，具体方法如下：称取100mg DOX·HCl溶于10mL DMSO中，加入适量TEA(1μL/1mg DOX·HCl)，避光，充分搅拌2h，得到疏水性的DOX。取300mg实施例1制备得到的MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA溶于30mL DMSO中，待共聚物完全溶解后，将共聚物溶液加入到之前已制备好的DOX溶液中，继续搅拌1h后，转入透析袋(MWCO 3500Da)中进行透析，每2h更换一次去离子水(pH 7.4)，12h后每4h更换一次，共透析48h。透析完成后，将透析液用0.45μm过滤膜进行过滤，过滤液冷冻干燥后，得到红色粉末状固体即为DOX载药胶束。
空白胶束的制备方法与此相同。
采用动态光散射法(DLS)测定空白胶束和载药胶束的粒径、分布和zeta电位。空白胶束的粒径Dh为207.5nm，PDI为0.23，zeta电位为8.2mV。载药胶束的粒径Dh为214.3nm，PDI为0.31，zeta电位为9.7mV。
实施例7：pH和Redox双响应的两亲性共聚物的pH响应行为研究
分别取20mg实施例6中制备的共聚物空白胶束溶于含有不同DTT浓度(0、10μM、10mM)的pH 7.4、6.8、6.5、6.0、5.5和5.0的PBS缓冲溶液中，孵育4h后，采用动态光散射法(DLS)测定空白胶束在不同pH值、不同DTT浓度的PBS缓冲液中下的粒径大小、分布和zeta电位，如图9和10所示。由图可知，当DTT浓度一定时，随着pH值的降低，胶束大小和zeta电位逐渐增大，特别是在6.8至5.0范围内，胶束粒径和zeta电位变化较大，粒径的增大主要是由于共聚物主链段中叔氨基的质子化作用，使其由疏水性嵌段逐渐变为亲水性嵌段，内核扩张，使得共聚物胶束颗粒溶胀而增大，zeta电位的增大，主要是由于叔氨基吸收一个氢离子，从而使得正电荷增多，电位增大；当pH 7.4时，随着DTT浓度增大，在0至10μL时，胶束粒径只有稍微的增大，当其浓度增大至10mM时，共聚物胶束的粒径明显增大，这主要是由于DTT将连接内核PLGA和主链的双硫键切断，胶束颗粒快速膨胀，而zeta电位并无明显变化；随着pH值的降低(7.4～5.0)和DTT浓度的增大(0～10mM)，共聚物胶束粒径呈现逐渐增大的趋势的同时zeta电位同样有所增大，这主要是主链叔氨基质子化和二硫键断裂的双重作用所致。因此，共聚物胶束粒径和电位随着pH值的降低和DTT浓度的增大，而不断增大，在pH 5.0和DTT10mM的情况下，共聚物胶束的粒径和zeta电位最大。
实施例8：载药胶束的体外释放
分别称取10mg实施例6中制备的MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA载药胶束分散于4mL不同pH值(pH 7.4、6.5、5.0)和DTT浓度(0、10μM、10mM)的PBS缓冲液中。将上述溶液置于透析袋(MWCO：3500Da)中，转入46mL相同pH值的缓冲液中，置于药物溶出仪，在37℃，120rpm转速下进行体外释放。定时取样1mL进行紫外分析，并同时补加1mL新鲜缓冲液。用紫外分光光度法测定不同时间释放液中DOX浓度，绘制体外释放曲线，如图11所示。
由图11可知，载药胶束在正常组织环境(pH 7.4，DTT 0～10μM，模拟正常人体环境)下，DOX的释放速率非常慢，24h的累积释放量不超过30％，随后的释放速率基本趋于平稳，120h累计释放量在40％左右，当DTT浓度增大至10mM时，药物释放速率明显加快，24h时累计释放量接近65％，120h时药物累计释放量接近75％。随着pH值的降低(pH 6.5，DTT 0～10μM，模拟肿瘤组织处环境)条件下，DOX的释放速度有所加快，24h的累积释放量达到45％以上，120h累计释放量超过65％；当DTT浓度增大至10mM时，DOX的释放速率明显加快，24h的累积释放量达到接近70％，120h累计释放量超过80％。随着pH值的继续降低(pH 5.0，DTT 0～10μM，模拟肿瘤细胞内环境)，DOX的释放速率继续加快，24h的累积释放量超过70％，100h累计释放量接近85％；当DTT浓度增大至10mM时，24h的累积释放量超过75％，120h累计释放量接近95％。说明随着pH值的降低和DTT浓度的增大，药物从载药胶束中释放的速率和累计释放量逐渐加快，从而实现药物的控制释放。
实施例9
利用实施例6制备得到的MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA空白胶束和载药胶束进行细胞毒性评价。将HepG2细胞(购买于ATCC)按1×104的密度平铺在96孔板上，加入200μL培养液，培养24h。将一定浓度的游离阿霉素(DOX)，空白胶束和载药胶束添加进入孔板中，更新培养介质。每个浓度平行重复3个。将孔板放入卵化器中，5％CO2和37℃，分别维持24h和48h。用180μL新鲜培养液和20μL MTT溶液替换孔板中介质，继续卵化4h，用200μL DMSO替换孔板介质。将孔板放在37℃摇床中振荡15min，然后利用酶标仪测定480nm出每个孔的吸光度A，计算细胞存活率，评价其细胞毒性。
图12是空白MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA的细胞毒性图。由图可知，随着共聚物浓度的增大，细胞存活率仍维持在较高水平，当共聚物浓度为400μg/mL时，细胞存活率仍在97％以上，可见次pH和Redox双响应两亲性共聚物材料对细胞的毒性较低，说明材料本身几乎不具有毒副作用。图13和图14分别是游离阿霉素和共聚物载药胶束在24h和48h后的细胞毒性图。由图可知，随着时间和载药胶束浓度的增大，细胞成活率均呈现明显降低的趋势，特别是在48h、载药胶束浓度为15μg/mL时，细胞的成活率接近50％。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (57)

1.一种pH和Redox双响应两亲性共聚物，分子式为MPEG-Linker-PAE-ss-PLGA，具有如式I所示结构：
其中，n＝25～90，x＝2～8，y＝10～40，z＝3～10。
2.根据权利要求1所述的共聚物，其特征在于，所述共聚物的数均分子量为6170～78650g/mol。
3.根据权利要求1所述的共聚物，其特征在于，所述共聚物的数均分子量为22100～78650g/mol。
4.权利要求1～3之一所述pH和Redox双响应的两亲性共聚物的制备方法，包括以下步骤：
通过酯化反应采用对醛基苯甲酸修饰末端带有羟基的聚乙二醇单甲醚，得到醛基封端的聚乙二醇单甲醚大分子单体，再通过亲核加成反应与1,3-丙二胺反应，得到具有pH响应性能的苯甲酰亚胺键修饰的氨基封端亲水性大分子单体；
通过催化中和反应将胱氨修饰末端带有羧基的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，得到二硫键修饰的末端为氨基的疏水性大分子单体；
通过迈克尔加成反应以上述得到的两种大分子单体以及1,6-己二醇二丙烯酸酯和3-氨基-1-丙醇为原料，一步法制备基于聚-β氨基酯的pH和Redox双响应两亲性共聚物聚乙二醇单甲醚-Linker-聚-β氨基酯-ss-聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Linker：
a)在惰性气体保护和无水条件下，将催化剂二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶、单体MPEG、小分子单体对醛基苯甲酸溶于无水有机溶剂中反应，反应后过滤、浓缩、沉淀、洗涤、干燥，得到醛基封端的大分子单体MPEG-CHO；
b)将步骤a)所得MPEG-CHO溶解在无水有机溶剂中，加入二胺，溶解后反应，反应结束后冷却、浓缩、沉淀、干燥，得到pH响应的亲水性大分子单体MPEG-Linker；
(2)制备Redox响应的疏水性大分子单体PLGA-Cys：
a)将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺催化剂体系逐滴加入到聚乳酸-羟基乙酸共聚物的无水有机溶剂溶液中，反应，反应后浓缩、沉淀、洗涤、干燥，得到末端羧基功能化的大分子中间单体PLGA-NHS；
b)将胱氨二盐酸盐(Cys)的无水有机溶剂溶液逐滴加入到步骤a)所得PLGA-NHS的无水有机溶剂溶液中，加入无水三乙胺，反应，反应后沉淀，干燥，得到Redox响应的疏水性大分子单体PLGA-Cys；
(3)将步骤(1)和步骤(2)所得产物采用迈克尔逐步加成法制备具备pH和Redox双响应的两亲性共聚物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的a)中反应物的摩尔份数如下：
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的a)中无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿或无水二甲基亚砜中1种或2种以上的组合。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的a)中无水有机溶剂为无水二氯甲烷。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的a)中反应的温度为室温，反应时间为6～36h。
10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的a)中反应的温度为室温，反应时间为24h。
11.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的b)中无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿或无水二甲基亚砜中1种或2种以上的组合。
12.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的b)中无水有机溶剂为无水二甲基亚砜。
13.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的b)中反应的温度为30～60℃，反应的时间为0.5～6h。
14.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的b)中反应的温度为40℃，反应的时间为3h。
15.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的b)中二胺为1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、1,5-戊二胺中1种或2种以上的组合。
16.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的b)中二胺为1,3-丙二胺。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的b)中反应物的摩尔份数如下：
MPEG-CHO 1～10份
1,3-丙二胺 1.2～20份。
18.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述过滤为采用漏斗。
19.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述过滤为采用布式漏斗过滤收集液体。
20.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述沉淀为向旋转蒸发浓缩的溶液中加入10倍体积的0℃异丙醇进行沉淀。
21.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述洗涤为采用异丙醇和二乙醚清洗沉淀，得到固体。
22.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的a)中反应物的摩尔份数如下：
PLGA 1～5份
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 5～25份
N-羟基丁二酰亚胺 5～25份。
23.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的a)中无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿或无水二甲基亚砜中1种或2种以上的组合。
24.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的a)中无水有机溶剂为无水二氯甲烷。
25.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的a)中反应的温度为室温，反应的时间为3～12h。
26.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的a)中反应的温度为室温，反应的时间为4h。
27.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的a)中沉淀为向旋转蒸发浓缩的溶液中加入10倍体积的-20℃冷冻乙醚中逐滴进行沉淀。
28.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的a)中洗涤为采用甲醇与乙醚的混合溶液洗涤沉淀，得到固体。
29.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的a)中洗涤用的洗涤剂为甲醇和乙醚的混合液。
30.根据权利要求28或29所述的制备方法，其特征在于，所述甲醇和乙醚的混合液中甲醇与乙醚的体积比为1:9～7:3。
31.根据权利要求28或29所述的制备方法，其特征在于，所述甲醇和乙醚的混合液中甲醇与乙醚的体积比为3:7。
32.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的a)中沉淀的次数为2次以上。
33.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的b)中反应物的摩尔份数如下：
MPEG-NHS 1～10份
胱氨二盐酸盐 2～20份
三乙胺 2～20份。
34.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的b)中无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿或无水二甲基亚砜中1种或2种以上的组合。
35.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的b)中无水有机溶剂为无水二甲基亚砜。
36.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的b)中反应的温度为室温，反应的时间为12～48h。
37.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的b)中反应的温度为室温，反应的时间为24h。
38.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的b)中反应在避光下进行。
39.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的b)中沉淀为向溶液中加入10倍体积的在4℃的三次水中逐滴进行沉淀。
40.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中迈克尔逐步加成法的过程为：在惰性气体保护和无水条件下，将1,6-己二醇二丙烯酸酯(HDD)和3-氨基-1-丙醇(AP)加入到步骤(1)和(2)所制得的pH和Redox响应大分子单体的无水有机溶剂溶液中，反应，反应后冷却、沉淀、干燥，得到具备pH和Redox双响应的两亲性共聚物。
41.根据权利要求40所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中反应物的摩尔份数配方如下：
42.根据权利要求40所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿或无水二甲基亚砜中1种或2种以上的组合。
43.根据权利要求40所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中无水有机溶剂为无水氯仿。
44.根据权利要求40所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中反应的温度为30℃～90℃，反应的时间为24～120h。
45.根据权利要求40所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中反应的温度为65℃，反应的时间为72h。
46.根据权利要求40所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中沉淀为向旋转蒸发浓缩的溶液中加入10倍体积的0℃正己烷进行沉淀。
47.权利要求1～3之一所述的pH和Redox双响应的两亲性共聚物在装载水难溶性药物胶束系统中的用途。
48.根据权利要求47所述的用途，其特征在于，所述装载水难溶性药物胶束系统由以下方法制备得到：将水难溶性药物溶于有机溶剂中，将pH和Redox双响应的两亲性共聚物溶于同一种有机溶剂中，待共聚物完全溶解后，将共聚物溶液与水难溶性药物溶液混合；透析；过滤、冷冻干燥，得到装载水难溶性药物胶束系统。
49.根据权利要求48所述的用途，其特征在于，所述将水难溶性药物溶于有机溶剂中为将水难溶性药物溶于有机溶剂中过夜。
50.根据权利要求48所述的用途，其特征在于，所述共聚物溶液与水难溶性药物溶液混合后在室温下搅拌。
51.根据权利要求50所述的用途，其特征在于，所述共聚物溶液与水难溶性药物溶液混合后在室温下搅拌1h以上。
52.根据权利要求50所述的用途，其特征在于，所述共聚物溶液与水难溶性药物溶液混合后在室温下搅拌4～6h。
53.根据权利要求48所述的用途，其特征在于，所述透析采用去离子水进行。
54.根据权利要求48所述的用途，其特征在于，所述透析的时间为12h以上。
55.根据权利要求48所述的用途，其特征在于，所述透析的时间为24h。
56.根据权利要求48所述的用途，其特征在于，所述水难溶性药物为在1L水中溶解度小于或等于1g的药物。
57.根据权利要求48所述的用途，其特征在于，所述有机溶剂为二甲基亚砜或二甲基甲酰胺中的一种或其混合。
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