CN102702453A - 一种pH响应6臂星型嵌段共聚物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种pH响应6臂星型嵌段共聚物及其制备方法与应用。本发明的共聚物以季戊四醇为内核，每条臂上接有疏水性基团，pH响应基团和亲水性基团；其制备方法为：首先以季戊四醇通过开环聚合得到疏水性基团聚合物，将其末端酰化，作为大分子引发剂，依次引发pH响应单体和亲水性基团的电子转移活化剂再生-原子转移自由基聚合，制得pH响应6臂星型嵌段共聚物。本发明的聚合物在水溶液中自组装为纳米胶束，可以有效增溶水难溶性药物，用于水难溶性抗癌药物的胶束载药系统的制备，并保持药物在正常组织的pH7.4时缓慢释放，在肿瘤细胞的pH5~6弱酸性条件下快速可控释放；其功能基团比例易调控，合成工艺简单，产率较高。
Description
技术领域
本发明属于生物医药用高分子聚合物材料领域，涉及一种高分子聚合物材料及其制备方法与应用，具体涉及一种pH响应6臂星型嵌段共聚物及其制备方法和应用。
背景技术
星型聚合物是由至少三个线性高分子链通过化学键连接到同一中心核上所形成的多臂支化聚合物，与线性聚合物相比，星型聚合物具有紧凑的结构和分子表面官能度高、结晶度较低和流体动力学体积及更易发生微相分离等独特的性质。两亲性嵌段共聚物是指包含两个或两个以上嵌段并且这些嵌段在溶剂中的溶解能力有较大差别的共聚物。两亲性嵌段共聚物达到或高于临界胶束浓度会发生自组装，形成各种各样的胶束形态，其在药物和基因载体方面有潜在的应用前景。两亲性星型聚合物除具备一般两亲性线性嵌段共聚物的性质外，由于多个链段通过共价键连接于一个多官能团核上，其形成的胶束比线性聚合物胶束具有更好的稳定性。
如：Yuan等[Weizhong Yuan, Jinying Yuan, Mi Zhou1, Caiyuan Pan. Synthesis, characterization, and fluorescence of pyrene-containing eight-arm star-shaped dendrimer-like copolymer with pentaerythritol core. Journal of Polymer Science, 2008, 46: 2788]以季戊四醇为核，通过原子转移自由基聚合（简称：ATRP）和己内酯开环聚合（简称：ROP）得到一种8臂聚合物，表现出与线性已内酯不同的性质，在荧光探针，光动力疗法和光电器件方面有潜在应用；王蓓蕾等[王蓓蕾, 涂松, 邱永兵, 陈元维, 罗祥林. 星型两亲性聚己内酯-b-聚甲基丙烯酸(2-羟乙酯)嵌段共聚物的合成和表征. 高分子学报, 2011, 10: 1151]制备了一类新型的嵌段共聚物：六臂星型聚(ε-己内酯)-b-聚甲基丙烯酸(2-羟乙酯)（简称：6sPCL-b-PHEMA），PCL与HEMA进行共聚以后，可以降低PCL的结晶性并提高聚合物的亲水性。
随着可控/“活性”自由基聚合技术的发展，如原子转移自由基聚合（简称：ATRP）、氮氧稳定自由基聚合（简称：NMP）、可逆加成-裂解链转移聚合（简称：RAFT）等，两亲性星型聚合物的合成更加容易，种类也更多。其中ATRP方法速度快，反应温度适中，甚至可以在少量氧存在下进行，原则上可以使所有自由基聚合单体发生可控/“活性”聚合，并可有效地对现有聚合物进行结构改性。
将开环聚合和活性自由基聚合相结合合成星形嵌段共聚物是一种较常见的聚合方法。首先用含有多羟基的引发剂，如季戊四醇、双季戊四醇、端羟基超支化聚酯等，引发ε-己内酯的开环聚合得到星形聚己内酯，然后，将星形聚己内酯的端羟基化学改性，形成大分子引发剂，引发乙烯基单体的自由基聚合，可以制得含PCL链段的星形嵌段共聚物。如：Li等[Xiaojie Li, Yinfeng Qian, Tao Liu, Xianglong Hu, Guoying Zhang, Yezi You, Shiyong Liu. Amphiphilic multiarm star block copolymer-based multifunctional unimolecular micelles for cancer targeted drug delivery and MR imaging. Biomaterials, 2011, 32(27): 6595]以超支化聚酯为内核，通过己内酯ROP和ATRP反应合成了一种两亲性星型聚合物，里层是疏水性，外面是亲水性的，可以用作疏水性抗癌药物载体。
pH响应型两亲性共聚物大多含有一个可以稳定存在的可离子化功能基团，当介质的pH发生变化时，这类聚合物的可离子化功能基团的物理性质或化学性质发生相应的改变。如Huang等[Xiujuan Huang, Yan Xiao, Meidong Lang. Self-assembly of pH-sensitive mixed micelles based on linear and star copolymers for drug delivery. Journal of Colloid and Interface Science, 2011, 364: 92]合成一种具有pH敏感性的六臂聚合物S(PCL-b-PDEAEMA)6，内核是PCL，外层是pH敏感材料N,N-二甲氨基乙基-甲基丙烯酸酯（简称：DMAEMA），与线性分子混合胶束可以作为一种稳定的pH可控释放体系；专利申请200910024899.X公布了一种星型嵌段酸敏性纳米胶束，由笼型八聚硅倍半氧烷引发D,L-丙交酯活性开环聚合，再与DEAEMA进行ATRP反应所合成的，通过对温度和pH敏感实现对药物的控释。现有的这些多臂星型嵌段共聚物在稳定性和控释性能上还不够完善。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种pH响应6臂星型嵌段共聚物及其制备方法与应用。
本发明以季戊四醇为核，每条臂上依次接上疏水性基团，pH响应基团和亲水性基团形成6臂星型嵌段聚合物，首先以季戊四醇为内核通过开环聚合得到疏水性基团聚合物，将其末端酰化，以此作为大分子引发剂，依次引发pH响应单体和亲水性基团的电子转移活化剂再生-原子转移自由基聚合，制得pH响应6臂星型嵌段共聚物。本发明的聚合物在水溶液中自组装为纳米胶束，可以有效增溶水难溶性药物，可用于疏水性抗癌药物的包载。在正常组织的pH 7.4时缓慢释放，在肿瘤细胞的pH 5~6弱酸性条件下快速可控释放。本发明的pH响应6臂星型嵌段共聚物结构可以在维持高载药量的前提下更有效的控制药物释放，从而提高胶束的pH响应灵敏度及释放效率，改善胶束载药体系的控释性能。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种pH响应6臂星型嵌段共聚物，具有如下结构：
其中，x=15~23，y=8~22，z=7~13。
所述pH响应6臂星型嵌段共聚物的数均分子量为30000~56000g/mol。
本发明还提供一种pH响应6臂星型嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：
（1）接枝疏水基团：在惰性气体保护和无水条件下将疏水单体、催化剂A和引发剂混合，在110~140℃下反应24~48h，经旋转蒸发、沉淀、过滤、干燥得接枝疏水基团的聚合物，反应式如下：
（2）制备大分子引发剂：在惰性气体保护和无水条件下，将步骤（1）得到的聚合物、酰化剂、缚酸剂和溶剂混合，在冰水浴中反应2~5h，然后在室温下反应24~48h，经旋转蒸发、沉淀、过滤、干燥得到大分子引发剂，反应式如下：
（3）制备pH响应6臂星型嵌段共聚物：在惰性气体保护和无水条件下，将步骤（2）得到的大分子引发剂、pH响应单体、配体、催化剂B及溶剂混合，搅拌15min后再加入还原剂，在60~90℃下反应5~10h，然后加入亲水单体反应5~10h后，用四氢呋喃溶解，除去催化剂，旋转蒸发、沉淀、过滤、干燥得到pH响应6臂星型嵌段共聚物，反应式如下：
步骤（1）中反应物的重量份数如下：
引发剂 1.56~2.47份，
疏水单体 97.33~98.39份，
催化剂A 0.05~0.19份；
步骤（2）中反应物的重量份数配方如下：
聚合物 54.69~58.48份，
酰化剂 28.82~31.45份，
缚酸剂 12.70~13.86份；
步骤（3）中反应物的重量份数配方如下：
大分子引发剂 24.85~39.48份，
催化剂B 0.02~0.04份，
配体 0.20~0.45份，
还原剂 0.36~0.80份，
pH响应单体 29.61~45.69份，
亲水单体 22.85~35.08份。
本发明所述引发剂为季戊四醇；所述疏水单体为e-己内酯；所述pH响应单体为甲基丙烯酸二乙氨基乙酯；所述亲水单体为甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯。
本发明步骤（1）中，所述催化剂A为辛酸亚锡。
本发明步骤（2）中，所述溶剂为四氢呋喃，所述缚酸剂为三乙胺，所述酰化剂为2-溴异丁酰溴。
本发明步骤（3）中，所述配体为六甲基三亚乙基四胺，所述溶剂为甲苯，所述还原剂为辛酸亚锡，所述催化剂B为溴化铜。
本发明步骤（1）中，所述催化剂A的用量为疏水单体的质量的0.05~0.2%，优选为0.1%。
本发明步骤（2）中，所述酰化剂的用量为聚合物的物质的量的4~8倍，优选为5倍；所述缚酸剂的用量为聚合物的物质的量的4~8倍，优选为5倍。
本发明步骤（3）中，所述配体的用量为催化剂B的物质的量的5~10倍，优选为10倍；所述还原剂的用量为催化剂B的物质的量的5~10倍，优选为10倍。
所述步骤（1）中的反应温度优选为130℃，反应时间优选为36h。
所述步骤（3）中的反应温度优选为70℃，反应时间优选为8h。
本发明步骤（1）和（2）中，所述沉淀包括以下步骤：将旋转蒸发后的溶液加入到相当于其体积10倍的0℃冷甲醇与水的混合溶液中，冷甲醇与水体积比为1:1。
本发明步骤（3）中，所述除去催化剂包括以下步骤：将四氢呋喃溶解的反应产物，过中性氧化铝层析柱，采用四氢呋喃作为洗脱剂；所述沉淀包括以下步骤：将旋转蒸发后的溶液加入到相当于其体积10倍的0℃冷正己烷中。
本发明还提供一种pH响应6臂星型嵌段共聚物在制备水难溶性抗癌药物的胶束载药系统中的应用。
所述水难溶性抗癌药物的胶束载药系统的制备过程为：将pH响应6臂星型嵌段共聚物和水难溶性抗癌药物溶于有机溶剂中，搅拌4h后用去离子水透析48h后冷冻干燥，得到水难溶性抗癌药物的胶束载药系统；所述有机溶剂为二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；所述水难溶性药物是在1L水中溶解度小于或等于1g的药物。
通过本发明的pH响应6臂星型嵌段共聚物制备的胶束载药系统可控制疏水性药物在正常组织的pH 7.4条件下缓慢释放，在肿瘤细胞的pH 5~6弱酸性条件下快速可控释放。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
（1）本发明的6臂星型聚合物内层由疏水性的高聚物聚己内酯组成，疏水性药物在其中有较高的载药量；中间层是pH敏感的聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯，保护药物在正常组织的中性pH值下不释放或缓慢释放，而在肿瘤的酸性环境中药物以较快速率释放；外层是亲水性的聚甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯，可通过调节聚合物分子材料中各基团的含量来调控药物的释放速率，满足不同药物的释放要求；
（2）本发明的制备方法操作简单，反应条件温和，所得的四臂星型聚合物的臂长易控，分子量在较宽的范围内可调，是一种性能优异、具有pH敏感性的载药材料；
（3）本发明的聚合物的临界聚集浓度远低于表面活性剂及常规聚合物胶束，仅为2~3mg/L，因而其载药胶束具有较高的稳定性。
附图说明
图1为实施例1中接枝疏水基团的聚合物的凝胶渗透色谱图（简称：GPC），流动相为四氢呋喃。
图2为实施例1中接枝疏水基团的聚合物的核磁共振氢谱（简称：1H NMR），溶剂为氘代氯仿（简称：d-CDCl3）。
图3为实施例1中大分子引发剂的1H NMR谱，溶剂为d-CDCl3。
图4为实施例1中pH响应6臂星型嵌段共聚物的GPC洗脱曲线。
图5为实施例1中pH响应6臂星型嵌段共聚物的1H NMR谱，溶剂为d-CDCl3。
图6为实施例1产物pH响应6臂星型嵌段共聚物（聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯嵌段分子量约9000）载阿霉素胶束的体外释放曲线。
图7为实施例5产物pH响应6臂星型嵌段共聚物胶束的扫描电镜（简称：SEM）图。
图8为实施例5产物pH响应6臂星型嵌段共聚物（聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯嵌段分子量约18000）的临界胶束浓度测试曲线。
图9为实施例5产物pH响应6臂星型嵌段共聚物（聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯嵌段分子量约18000）载阿霉素胶束的体外释放曲线。
图10为实施例1产物pH响应6臂星型嵌段共聚物空白胶束的体外细胞毒性。
图11为实施例1和5产物pH响应6臂星型嵌段共聚物载阿霉素胶束的体外细胞毒性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于此。在实施例中单体、催化剂、引发剂等使用的缩写对照如下表。
表1 实施例中使用的物质的中英文缩写对照
（1）合成接枝疏水基团的聚合物：将搅拌子和0.254g季戊四醇置于反应瓶中，密封后抽真空-通氩气三次，依次用注射器加入12g单体e-CL和0.012g Sn(Oct)2，用液氮三次冷冻-抽气-升温循环后，在氩气保护下于120℃油浴中搅拌反应36h，反应完成后，冷却至室温，减压蒸去甲苯，加入50mL THF稀释，然后用300mL 0℃甲醇/水（1:1体积比）沉淀，在45℃下真空干燥24h，得到白色粉末即为接枝疏水基团的聚合物6AS-PCL，产率为93%，M n=12322，PDI=1.59；
（2）合成大分子引发剂：取烘烤干燥的250mL三口烧瓶，加入12g 6AS-PCl和150mL THF，密封后通氩气10min，密封后注入3.04g TEA，用冰水浴冷却至0℃，然后加入6.90g 2-溴异丁酰溴，先在0℃反应5h后再在室温下反应24h，反应完成后，冷却至室温，用中性氧化铝柱子过滤除去季铵盐，THF作洗脱剂，得到的溶液经旋转蒸发浓缩后缓慢加入300mL 0℃甲醇/水（1:1体积比）沉淀，过滤，然后在45℃下真空干燥24h，得到白色粉末即为大分子引发剂6AS-PCL-Br，产率为86%；
（3）合成pH响应6臂星型嵌段共聚物：将搅拌子、0.013g CuBr2和12g 6AS-PCL-Br置于反应瓶中，密封后抽真空-通氩气三次，依次用注射器加入30mL溶剂甲苯、9g pH响应单体DEAEMA、0.138g配体HMTETA，搅拌15min使催化剂络合物形成，再加入还原剂0.243g Sn(Oct)2，搅拌5min后转入70℃油浴中搅拌反应7h，继续加入9g亲水性单体PEGMA进行连续聚合反应7h，反应完成后，冷却至室温，加入40mL THF稀释，然后用中性氧化铝柱子过滤除去催化剂，THF作洗脱剂，得到的溶液经旋转蒸发浓缩后缓慢加入到300mL 0℃正己烷中沉淀，过滤后在35℃下真空干燥24h，得到白色粉末即为pH响应6臂星型嵌段共聚物6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA，产率为81%，M n=24783，PDI=1.46。
图1为实施例1中6AS-PCL的GPC洗脱曲线，可以看出，产物为正态单峰分布，M n=33385，PDI=1.45。
图2为实施例1中6AS-PCL的1H NMR谱图，溶剂为d-CDCl3，可以看出，4.06ppm是季戊四醇结构中-CH2O-的质子峰，1.38、1.65和2.31ppm是PCL主链上相连的-CH2-的质子峰，3.65ppm为与PCL末端羟基相连-CH2-的特征质子峰。
图3为实施例1中6AS-PCL-Br的1H NMR谱图，溶剂为d-CDCl3，可以看出，经过酰化后，原先与末端羟基相连的亚甲基的质子峰从3.65ppm完全转移到4.17ppm，同时新接上的两个侧甲基的质子峰出现在1.93ppm。
图4为实施例1中6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA的GPC洗脱曲线，可以看出，曲线呈现对称的单峰形态，表明连续ARGET ATRP的可控性良好，产物分子量分布均匀。
图5为实施例1中6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA的1H NMR谱，溶剂为d-CDCl3，可以看出，化学位移0.90和1.82~1.92ppm分别为甲基丙烯酸酯主链上-CCH3和-CH2-的氢质子峰，2.71和4.01ppm对应于-CH2CH2-的两个相连亚甲基质子峰，1.05和2.59ppm的化学位移分别对应于DEAEMA结构中-CH2CH3的末端甲基和亚甲基的质子峰。
采用透析法制备实施例1产物6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA的载药胶束，具体步骤为：准确称取20mg 阿霉素溶于20mL DMF中，加入2倍摩尔量的TEA 20μL，搅拌过夜，同时称取40mg 6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA溶于20mL DMF中，将两者混合继续搅拌4h后透析，前12h每4h换水一次，随后6h换水一次，经0.45m过滤头过滤后冻干即得到DOX载药胶束粉末。
体外释放实验：分别称取5mg上述制备的DOX载药胶束分散在pH 7.4、pH 6.5、pH 5.0的5mL缓冲液中，然后置于透析袋中，转入35mL相同pH值的缓冲液中置于药物溶出仪在37℃，110rpm转速下进行体外释放，定时取样2mL进行分析，并加入2mL新鲜缓冲液，用紫外分光光度法测定不同时间释放液中布洛芬浓度，绘制其体外释放曲线。
图6是实施例1产物6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA（PDEAEMA分子量约9000）的体外释放曲线，在正常组织的pH 7.4环境下，DOX的释放速率非常慢，DOX的突释量约为7%，24h的累积释药量只有20%左右，108h的累积释药量为27%；当pH降低至肿瘤组织附近条件（6.5）时，DOX的释放速率加快，24h以及108h的累积释放量与pH 7.4相比都增加了7%左右；而在肿瘤细胞内涵体的pH 5.0环境下，DOX的释放速率明显加快，且突释现象没有随之增加（7%），24h累积释放量增加到50%，60h达到65%，108h释放了76%。
实施例2
（1）合成6AS-PCL：将搅拌子和0.254g季戊四醇置于反应瓶中，密封后抽真空-通氩气三次，依次用注射器将10g单体e-CL和0.020g Sn(Oct)2加入反应瓶中，用液氮三次冷冻-抽气-升温循环后，在氩气保护下于140℃油浴中搅拌反应24h，反应完成后，冷却至室温，减压蒸去甲苯，加入50mL THF稀释，然后用300mL 0℃甲醇/水（1:1体积比）沉淀，在45℃下真空干燥24h，得到白色粉末即为6AS-PCL，产率为86%，M n=10918，PDI=1.62；
（2）合成6AS-PCL-Br：取烘烤干燥的250mL三口烧瓶，加入10g 6AS-PCl和150mL THF，密封后通氩气10min，密封后注入2.43g TEA，用冰水浴冷却至0℃，然后加入5.52g 2-溴异丁酰溴，先在0℃反应2h后再在室温下反应36h，反应完成后，冷却至室温，用中性氧化铝柱子过滤除去季铵盐，THF作洗脱剂，得到的溶液经旋转蒸发浓缩后缓慢加入300mL 0℃甲醇/水（1:1体积比）沉淀，过滤，然后在45℃下真空干燥24h，得到白色粉末即为6AS-PCL-Br，产率为81%；
（3）合成6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA：将搅拌子、0.013g CuBr2和10g 6AS-PCL-Br置于反应瓶中，密封后抽真空-通氩气三次，依次用注射器加入30mL溶剂甲苯、12g pH响应单体DEAEMA、0.069g配体HMTETA，搅拌15min使催化剂络合物形成，再加入还原剂0.122g Sn(Oct)2，搅拌5min后转入60℃油浴中搅拌反应5h，继续加入12g亲水性单体PEGMA进行连续聚合反应8h，反应完成后，冷却至室温，加入40mL THF稀释，然后用中性氧化铝柱子过滤除去催化剂，THF作洗脱剂，得到的溶液经旋转蒸发浓缩后缓慢加入到300mL 0℃正己烷中沉淀，过滤后在35℃下真空干燥24h，得到白色粉末即为6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA，产率为80%，M n=28917，PDI=1.47。
实施例3
（1）合成6AS-PCL：将搅拌子和0.254g季戊四醇置于反应瓶中，密封后抽真空-通氩气三次，依次用注射器将16g单体e-CL和0.008g Sn(Oct)2加入反应瓶中，用液氮三次冷冻-抽气-升温循环后，在氩气保护下于110℃油浴中搅拌反应48h，反应完成后，冷却至室温，减压蒸去甲苯，加入50mL THF稀释，然后用300mL 0℃甲醇/水（1:1体积比）沉淀，在45℃下真空干燥24h，得到白色粉末即为6AS-PCL，产率为89%，M n=17543，PDI=1.60；
（2）合成6AS-PCL-Br：取烘烤干燥的250mL三口烧瓶，加入16g 6AS-PCl和150mL THF，密封后通氩气10min，密封后注入3.64g TEA，用冰水浴冷却至0℃，然后加入8.28g 2-溴异丁酰溴，先在0℃反应5h后再在室温下反应24h，反应完成后，冷却至室温，用中性氧化铝柱子过滤除去季铵盐，THF作洗脱剂，得到的溶液经旋转蒸发浓缩后缓慢加入300mL 0℃甲醇/水（1:1体积比）沉淀，过滤，然后在45℃下真空干燥24h，得到白色粉末即为6AS-PCL-Br，产率为88%；
（3）合成6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA：将搅拌子、0.013g CuBr2和16g 6AS-PCL-Br置于反应瓶中，密封后抽真空-通氩气三次，依次用注射器加入30mL溶剂甲苯、18g pH响应单体DEAEMA、0.138g配体HMTETA，搅拌15min使催化剂络合物形成，再加入还原剂0.243g Sn(Oct)2，搅拌5min后转入80℃油浴中搅拌反应8h，继续加入12g亲水性单体PEGMA进行连续聚合反应5h，反应完成后，冷却至室温，加入40mL THF稀释，然后用中性氧化铝柱子过滤除去催化剂，THF作洗脱剂，得到的溶液经旋转蒸发浓缩后缓慢加入到300mL 0℃正己烷中沉淀，过滤后在35℃下真空干燥24h，得到白色粉末即为6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA，产率为76%，M n=40168，PDI=1.45。
实施例4
（1）合成6AS-PCL：将搅拌子和0.254g季戊四醇置于反应瓶中，密封后抽真空-通氩气三次，依次用注射器将14g单体e-CL和0.014g Sn(Oct)2加入反应瓶中，用液氮三次冷冻-抽气-升温循环后，在氩气保护下于130℃油浴中搅拌反应36h，反应完成后，冷却至室温，减压蒸去甲苯，加入50mL THF稀释，然后用300mL 0℃甲醇/水（1:1体积比）沉淀，在45℃下真空干燥24h，得到白色粉末即为6AS-PCL，产率为90%，M n=15107，PDI=1.57；
（2）合成6AS-PCL-Br：取烘烤干燥的250mL三口烧瓶，加入14g 6AS-PCl和150mL THF，密封后通氩气10min，密封后注入3.04g TEA，用冰水浴冷却至0℃，然后加入6.90g 2-溴异丁酰溴，先在0℃反应4h后再在室温下反应48h，反应完成后，冷却至室温，用中性氧化铝柱子过滤除去季铵盐，THF作洗脱剂，得到的溶液经旋转蒸发浓缩后缓慢加入300mL 0℃甲醇/水（1:1体积比）沉淀，过滤，然后在45℃下真空干燥24h，得到白色粉末即为6AS-PCL-Br，产率为83%；
（3）合成6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA：将搅拌子、0.013g CuBr2和14g 6AS-PCL-Br置于反应瓶中，密封后抽真空-通氩气三次，依次用注射器加入30mL溶剂甲苯、24g pH响应单体DEAEMA、0.115g配体HMTETA，搅拌15min使催化剂络合物形成，再加入还原剂0.203g Sn(Oct)2，搅拌5min后转入90℃油浴中搅拌反应10h，继续加入18g亲水性单体PEGMA进行连续聚合反应10h，反应完成后，冷却至室温，加入40mL THF稀释，然后用中性氧化铝柱子过滤除去催化剂，THF作洗脱剂，得到的溶液经旋转蒸发浓缩后缓慢加入到300mL 0℃正己烷中沉淀，过滤后在35℃下真空干燥24h，得到白色粉末即为6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA，产率为85%，M n=49816，PDI=1.48。
实施例5
（1）合成6AS-PCL：将搅拌子和0.254g季戊四醇置于反应瓶中，密封后抽真空-通氩气三次，依次用注射器将12g单体e-CL和0.012g Sn(Oct)2加入反应瓶中，用液氮三次冷冻-抽气-升温循环后，在氩气保护下于120℃油浴中搅拌反应36h，反应完成后，冷却至室温，减压蒸去甲苯，加入50mL THF稀释，然后用300mL 0℃甲醇/水（1:1体积比）沉淀，在45℃下真空干燥24h，得到白色粉末即为6AS-PCL，产率为93%，M n=12322，PDI=1.59；
（2）合成6AS-PCL-Br：取烘烤干燥的250mL三口烧瓶，加入12g 6AS-PCl和150mL THF，密封后通氩气10min，密封后注入3.04g TEA，用冰水浴冷却至0℃，然后加入6.90g 2-溴异丁酰溴，先在0℃反应5h后再在室温下反应24h，反应完成后，冷却至室温，用中性氧化铝柱子过滤除去季铵盐，THF作洗脱剂，得到的溶液经旋转蒸发浓缩后缓慢加入300mL 0℃甲醇/水（1:1体积比）沉淀，过滤，然后在45℃下真空干燥24h，得到白色粉末即为6AS-PCL-Br，产率为86%；
（3）合成6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA：将搅拌子、0.013g CuBr2和12g 6AS-PCL-Br置于反应瓶中，密封后抽真空-通氩气三次，依次用注射器加入30mL溶剂甲苯、18g pH响应单体DEAEMA、0.138g配体HMTETA，搅拌15min使催化剂络合物形成，再加入还原剂0.122g Sn(Oct)2，搅拌5min后转入70℃油浴中搅拌反应8h，继续加入9g亲水性单体PEGMA进行连续聚合反应7h，反应完成后，冷却至室温，加入40mL THF稀释，然后用中性氧化铝柱子过滤除去催化剂，THF作洗脱剂，得到的溶液经旋转蒸发浓缩后缓慢加入到300mL 0℃正己烷中沉淀，过滤后在35℃下真空干燥24h，得到白色粉末即为6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA，产率为83%，M n=33295，PDI=1.39。
采用荧光探针法测定实施例5制备的产物6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA的临界胶束浓度，具体步骤如下：
（1）配制芘溶液：用丙酮将芘配制成12′10-5mol/L的溶液；
（2）配样品溶液：称取10mg 6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA溶于5mL丙酮，逐滴加入到100mL去离子水中，挥发丙酮后得到0.1mg/mL溶液，随后稀释成0.0001~0.1mg/ml的系列浓度，取20支10mL容量瓶，每支加入0.1mL芘溶液，然后分别加入上述不同浓度的聚合物溶液配成样品液，样品液中芘的浓度为6′10-7 M；
（3）荧光光谱测试：以373nm作为发射波长，测试样品液在300~350nm的激发光谱，取I 339/I 336比值对浓度对数logC作图，如图7所示，曲线转折点即为临界胶束浓度值，测得6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA的临界胶束浓度为3.8mg/L。
采用透析法制备实施例5产物6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA的载药胶束。采用SEM观察其形貌为球形，结果如图8所示。
体外释放实验：分别选取pH 7.4、pH 6.5、pH 5.0的缓冲液，药物溶出实验条件为37℃，110rpm，用紫外分光光度法测定不同时间释放液中布洛芬浓度，绘制其体外释放曲线。
图9是实施例5产物6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA（PDEAEMA分子量约18000）的体外释放曲线。在正常组织的pH 7.4环境下，DOX的释放速率较慢，DOX的突释量仅为6%，24 h的累积释药量只有17%，108 h的累积释药量为26%。当pH降低至肿瘤组织附近条件（6.5）时，DOX的释放速率加快，24h以及108h的累积释放量与pH 7.4相比都增加了10%左右。而在肿瘤细胞内涵体的pH 5.0环境下，DOX的释放速率明显加快，12 h即释放出40%，60 h累积释放量增加到70%，108 h释放了86%。
体外细胞毒性测试：分别测试实施例1和5的产物6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA的细胞毒性，具体步骤如下：取96孔平底组织培养板，将四周孔板中分别加入200mL DMEM细胞培养基作为空白组，中间60个孔中每孔以1x104细胞/孔（200 mL）的细胞浓度接种HepG2细胞，其中第2列作为对照，将96孔板放置到37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱中培养24h；随后将游离阿霉素、冻干的空白或载药胶束用细胞培养介质稀释成不同的聚合物浓度（空白胶束1~400mg/L）或药物浓度（游离阿霉素或载阿霉素胶束，0.1~20mg/L），在移走96孔板中从第2列到第11列所有孔中的细胞培养介质后，在第2列中加入新鲜的培养介质，作为对照，从第3列到第10列，向所有的孔中分别加入200mL的样品溶液，每个浓度的样品加入到6个孔中进行重复；在经过24h的培养后，吸走所有含有细胞的孔中的上清液，加入200mL的PBS润洗细胞，然后吸走PBS，从第2列到第11列，分别向每个孔中加入20mL的MTT溶液和180mL的培养介质，然后将96孔板放置于培养箱中培养4h，随后吸走未还原的MTT溶液和培养介质，每个孔用200mL的PBS洗一遍，并吸走PBS，向每个孔中加入200mL的DMSO溶解MTT结晶，整个96孔板放在37℃摇床中振荡10min，然后利用酶标仪测定490nm处每个孔的吸光度，进而计算细胞存活率。
图10是空白6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA胶束的毒性结果，从图中可知，6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA对HepG2细胞基本无毒，在400mg/L的高浓度下细胞存活率仍然高达90%。
图11是游离DOX及6AS-PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA载DOX胶束的细胞毒性结果，从图中可知，随着PDEAEMA分子量从实施例1产物中的9000增加到实施例5中的18000，载阿霉素胶束的毒性也相应增加，这主要是由于PDEAEMA具有pH响应性质，当胶束进入细胞后，PDEAEMA质子化使胶束溶胀，从而促进阿霉素的释放。实施例5产物的载阿霉素胶束与游离阿霉素有了相近的细胞毒性，说明阿霉素经包载后可以有效的保持其抗癌活性。
Claims (10)
1.一种pH响应6臂星型嵌段共聚物，其特征在于，具有如下结构：
其中，x=15~23，y=8~22，z=7~13。
2.根据权利要求1所述的pH响应6臂星型嵌段共聚物，其特征在于，所述pH响应6臂星型嵌段共聚物的数均分子量为30000~56000g/mol。
3.权利要求１或2所述的pH响应6臂星型嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）接枝疏水基团：在惰性气体保护和无水条件下将疏水单体、催化剂A和引发剂混合，在110~140℃下反应24~48h，经旋转蒸发、沉淀、过滤、干燥得接枝疏水基团的聚合物；
（2）制备大分子引发剂B：在惰性气体保护和无水条件下，将步骤（1）得到的聚合物、酰化剂、缚酸剂和溶剂混合，在冰水浴中反应2~5h，然后在室温下反应24~48h，经旋转蒸发、沉淀、过滤、干燥得到大分子引发剂；
（3）制备pH响应6臂星型嵌段共聚物：在惰性气体保护和无水条件下，将步骤（2）得到的大分子引发剂、pH响应单体、配体、催化剂B及溶剂混合，搅拌均匀后再加入还原剂，在60~90℃下反应5~10h，然后加入亲水单体反应5~10h后，用四氢呋喃溶解，除去催化剂，旋转蒸发、沉淀、过滤、干燥得到pH响应6臂星型嵌段共聚物；
步骤（1）中反应物的重量份数如下：
引发剂 1.56~2.47份，
疏水单体 97.33~98.39份，
催化剂A 0.05~0.19份；
步骤（2）中反应物的重量份数配方如下：
聚合物 54.69~58.48份，
酰化剂 28.82~31.45份，
缚酸剂 12.70~13.86份；
步骤（3）中反应物的重量份数配方如下：
大分子引发剂 24.85~39.48份，
催化剂B 0.02~0.04份，
配体 0.20~0.45份，
还原剂 0.36~0.80份，
pH响应单体 29.61~45.69份，
亲水单体 22.85~35.08份。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述引发剂为季戊四醇；所述疏水单体为e-己内酯；所述pH响应单体为甲基丙烯酸二乙氨基乙酯；所述亲水单体为甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
步骤（1）中，所述催化剂A为辛酸亚锡；
步骤（2）中，所述溶剂为四氢呋喃，所述缚酸剂为三乙胺，所述酰化剂为2-溴异丁酰溴；
步骤（3）中，所述配体为六甲基三亚乙基四胺，所述溶剂为甲苯，所述还原剂为辛酸亚锡，所述催化剂B为溴化铜。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
步骤（1）中，所述催化剂A的用量为疏水单体的质量的0.05~0.2%；
步骤（2）中，所述酰化剂的用量为聚合物的物质的量的4~8倍；所述缚酸剂的用量为聚合物的物质的量的4~8倍；
步骤（3）中，所述配体的用量为催化剂B的物质的量的5~10倍；所述还原剂的用量为催化剂B的物质的量的5~10倍。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）和（2）中，所述沉淀包括以下步骤：将旋转蒸发后的溶液加入到相当于其体积10倍的0℃冷甲醇与水的混合溶液中，冷甲醇与水体积比为1:1；
步骤（3）中，所述除去催化剂包括以下步骤：将四氢呋喃溶解的反应产物，过中性氧化铝层析柱，采用四氢呋喃作为洗脱剂；所述沉淀包括以下步骤：将旋转蒸发后的溶液加入到相当于其体积10倍的0℃冷正己烷中。
8.权利要求1或2所述的pH响应6臂星型嵌段共聚物在制备水难溶性抗癌药物的胶束载药系统中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述水难溶性抗癌药物的胶束载药系统的制备过程为：将pH响应6臂星型嵌段共聚物和水难溶性抗癌药物溶于有机溶剂中，搅拌4h后用去离子水透析48h后冷冻干燥，得到水难溶性抗癌药物的胶束载药系统。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述有机溶剂为二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；所述水难溶性药物为在1L水中溶解度小于或等于1g的药物。
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