CN104857525B - 一种以聚乙二醇‑b‑聚ε‑己内酯为载体的pH响应型抗肿瘤前药及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以聚乙二醇‑b‑聚ε‑己内酯为载体的pH响应型抗肿瘤前药及其制备方法；pH响应型抗肿瘤前药的制备方法是以聚乙二醇单甲醚为引发剂，引发α位溴代ε‑己内酯开环聚合，得到聚乙二醇‑b‑聚α位溴代ε‑己内酯两亲性嵌段共聚物；所得共聚物再进一步与巯基官能化的抗肿瘤药物分子发生巯基‑溴点击反应，即得pH响应型抗肿瘤前药；该pH响应型抗肿瘤前药具有两亲性结构，可组装成稳定的纳米胶束，同时载药量高、可降解性好，生物相容性好；特别是抗肿瘤药物与高分子载体之间通过酰腙键连接，具有酸响应性，在肿瘤微环境中能快速释放，大大提高了抗肿瘤药物的利用效率；另外前药制备方法简易，工艺条件温和，制备过程不需引入高毒性催化剂，毒副作用低。

Description

一种以聚乙二醇-b-聚ε-己内酯为载体的pH响应型抗肿瘤前 药及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种以聚乙二醇-b-聚ε-己内酯两亲性嵌段共聚物为载体的pH响应型抗肿瘤前药的制备方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

紫杉醇是从太平洋紫杉树及红豆杉中提取得到的抗肿瘤药物，是目前应用最广泛的抗肿瘤药物之一，临床上主要应用于治疗乳腺癌、卵巢癌以及膀胱癌。使用传统的紫杉醇制剂对肿瘤进行化疗，药物对肿瘤组织或细胞虽然具有一定抑制或杀灭效果，但也因为不能区分正常组织与肿瘤组织而对人体正常组织细胞造成损伤，从而产生毒副作用。此外，紫杉醇还存在强疏水性以及半衰期短等缺点，这极大地限制了它在临床上的应用。为提高紫杉醇的稳定性以及水溶性，最早是采用制剂内添加表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油与无水乙醇的方法，该方法虽然提高了紫杉醇的水溶性，但是聚氧乙烯蓖麻油的引入会降低药物的抗肿瘤效果，并引起严重的不良反应。

为了有效消除药物的副作用，提高治疗效果，提高紫杉醇的水溶性以及增加靶向性成为提高药物疗效的关键。为了实现以上目的，人们探索了多种紫杉醇药物传递系统，并使药物通过物理包埋或与载体化学键合的方式负载于传递系统。物理包埋的方式因为药物容易从传递系统中漏出，在释放初期还会出现暴释的缺陷，从而限制了该类制剂的发展与应用。将药物通过共价键的方式键接到水溶性载体材料制备聚合物键合药则很好地兼顾了药物水溶性与稳定性的问题，还克服了物理包埋时存在药物暴释的缺点。因此两亲性或水溶性的大分子前药具有以下优良性能：药物缓释；稳定性好；因增强渗透-保留效应而具有被动靶向性，降低药物对正常组织细胞的杀伤；生物利用度高。当前制约聚合物键合药应用的因素在于，载体材料的生物可降解性；载体材料的官能度低，主链缺少能与药物分子反应的活性位点；连接药物与载体间的化学键太过稳定，药物释放缓慢。为此，具有生物可降解性的智能型抗肿瘤药物传递系统成为当前的研究热点。根据肿瘤组织细胞内环境的特点，人们设计了以下智能型药物传递系统：酶响应型；pH响应型；还原响应型。智能型药物释放的原理是根据肿瘤部位细胞与正常组织细胞的内生理环境间存在的差异，设计具有生理响应性的化学键，在分子水平上智能地控制药物从传递系统中释放速度和释放部位，提高药物的疗效。目前所研究的酸响应型基团有腙、缩醛、亚胺等。Bae(Angewandte ChemieInternational Edition,2003,42(38):4640-4643)等人设计了两亲性结构的聚酰胺，聚合物的疏水段侧基上带有酰肼基团，侧基通过与阿霉素C₁₃’上的羰基形成腙键将阿霉素键接到聚合物上，从而制备了具有pH敏感性的两亲性阿霉素抗肿瘤前药。中国专利CN1895676A公开了以聚乙二醇-聚乳酸为载体的紫杉醇或多西紫杉醇前药制备方法，药物分子是通过与聚合物的端羧基反应键接到载体，制备了两亲性紫杉醇或多西紫杉醇前药。中国专利CN101569748B公开了一种端基使用柠檬酸官能化的分枝型聚乙二醇修饰剂，该修饰剂对小分子药物的负载能力得到显著提高。这些公开的技术中，因为载体材料的不具生物可降解性或者前药不具有智能型药物释放效果而限制了其应用。

发明内容

针对现有技术中合成的高分子载体抗肿瘤前药等抗肿瘤药物只能通过与载体末端官能团键接，制备的前药载药量低，特别是现有的前药一般都以酯键连接在高分子载体上，存在在肿瘤微环境中水解缓慢，导致人体对药物的生物利用度不高的缺陷，本发明的目的是在于提供一种将抗肿瘤药物与高分子载体之间通过酰腙键连接的pH响应型抗肿瘤前药，该前药具有酸响应性，在肿瘤微环境中能快速释放，大大提高了抗肿瘤药物的利用效率，且高分子载体载药量高、可降解性好，生物相容性好。

本发明的另一个目的是在于提供一种操作简单、反应条件温和、反应效率高的制备pH响应型抗肿瘤前药的方法。

为了实现本发明的技术目的，本发明提供了一种以聚乙二醇-b-聚ε-己内酯为载体的pH响应型抗肿瘤前药，该抗肿瘤前药具有式1结构：

其中，

D₁为含有羰基的抗肿瘤药物基团；

D₂和D₃各自独立地选自不含羰基且含有羟基和/或氨基的抗肿瘤药物基团；

m为50～228；

1≤x+y+z≤100，且x为0～100，y为0～100，z为0～100；

R₁、R₂各自独立地选自C₁～C₄的亚烷基；

R₃为H原子、苯基或C₁～C₄的烷基。

本发明的pH响应型抗肿瘤前药中D₁为阿霉素基团、表阿霉素基团、吡喃阿霉素基团中一种或几种。D₁抗肿瘤药物基团是由含羰基的抗肿瘤药物与氨基通过胺醛缩合反应或胺酮缩合反应形成的基团。

本发明的pH响应型抗肿瘤前药中D₂和D₃各自独立地选自紫杉醇基团、多西紫杉醇基团、喜树碱基团、丝裂霉素C基团中的一种或几种。D₂和D₃抗肿瘤药物基团是含有羟基和/或氨基的抗肿瘤药物与羧基通过酰胺化反应或者通过酯化反应形成的基团。

本发明还提供了制备所述的pH响应型抗肿瘤前药的方法，该方法包括以下步骤：

步骤一：抗肿瘤药物官能化

将含有羰基的抗肿瘤药物与具有式2结构的巯基肼化合物进行胺醛缩合反应或胺酮缩合反应得到具有式3结构的巯基官能化抗肿瘤药物；

或者将不含羰基且含有羟基和/或氨基的抗肿瘤药物先与具有式4结构的羰基羧酸化合物进行酯化反应或酰胺化反应，再与具有式2结构的巯基肼化合物进行胺醛缩合反应或胺酮缩合反应得到具有式5结构或具有式6结构的巯基官能化抗肿瘤药物；

步骤二：制备pH响应型抗肿瘤前药

将具有式3结构和/或具有式5结构和/或具有式6结构的巯基官能化抗肿瘤药物与具有式7结构的聚乙二醇-b-聚α溴代-ε-己内酯进行巯基-溴点击反应，即得；

其中，

m为50～228；

n为1～100；

R₁、R₂各自独立地选自C₁～C₄的亚烷基；

R₃为H原子、苯基或C₁～C₄的烷基。

优选的制备方法中含有羰基的抗肿瘤药物为阿霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素中一种或几种。

优选的制备方法中不含羰基且含有羟基和/或氨基的抗肿瘤药物为紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、丝裂霉素C中的一种或几种。

优选的制备方法中聚乙二醇-b-聚α溴代-ε-己内酯通过如下方法制备得到：环己酮和溴代丁二酰亚胺进行自由基取代反应，得到α溴代环己酮；α溴代环己酮与间氯过氧苯甲酸通过Baeyer-Villiger反应，生成α溴代己内酯；α溴代己内酯通过聚乙二醇单甲醚引发剂引发开环聚合，即得。

本发明的pH响应型抗肿瘤前药通过以下方法制备：

A、聚乙二醇-b-聚α位溴代ε-己内酯两亲性嵌段共聚物的制备：

以聚乙二醇单甲醚为引发剂引发α位溴代ε-己内酯开环聚合，得到聚乙二醇-b-聚α位溴代ε-己内酯两亲性聚合物；

B、抗肿瘤药物的巯基化修饰：

如紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、丝裂霉素C等含羟基和/或氨基的抗肿瘤药物在二环己基二亚胺(DCC)作用下通过与乙酰丙酸发生酯化反应或酰胺化反应，得到羰基官能化的抗肿瘤药物，再进一步与巯基肼在DMSO中进行胺醛缩合反应或胺酮缩合反应得到；如阿霉素、表阿霉素或吡喃阿霉素等自身带酮羰基或醛羰基官能化的抗肿瘤药物与巯基肼在DMSO进一步中进行胺醛缩合反应胺酮缩合反应得到；

C、pH响应型抗肿瘤前药的制备：

将上述B中所得的官能化抗肿瘤药物与A中所得聚合物在无水DMSO中加入缚酸剂进行巯基-溴点击反应得到。

所述的开环聚合使用的催化剂为低毒或无毒的有机碱TBD、DBU或DMAP。催化剂用量为α位溴代ε-己内酯质量的0.5～2％。

所述的开环聚合温度为0～40℃。

所述的开环聚合反应时间为12～48h。

所述的开环聚合使用无水的四氢呋喃、二氯甲烷、甲苯作为反应溶剂。

所述的巯基肼化合物为2-巯基乙酰肼、3-巯基丙酰肼、4-巯基丁酰肼或5-巯基戊酰肼中的一种或几种。

所述的巯基-溴点击反应温度是0～45℃。

所述的巯基-溴点击反应时间为24～48h。

所述的巯基-溴点击反应使用三乙胺、4-二甲氨基吡啶或吡啶作为缚酸剂。

所述的抗肿瘤药物的酯化或酰胺化反应温度是0～45℃。

所述的抗肿瘤药物的酯化或酰胺化反应时间是12～48h。

所述的pH响应型抗肿瘤前药制备反应所用溶剂为无水DMF或DMSO。

所述的pH响应型抗肿瘤前药制备反应温度为25～45℃。

所述的pH响应型抗肿瘤前药制备反应时间为12～48h。

本发明的α位溴代己内酯制备方法：

利用溴代剂溴代丁二酰亚胺(NBS)与环己酮在醋酸铵催化下发生自由基取代反应，生成α位溴代的环己酮；所得溴代环己酮与间氯过氧苯甲酸(m-CPBA)通过Baeyer-Villiger反应，氧化生成α位溴代己内酯。其中自由基取代反应所用溶剂为无水乙醚、二氯甲烷、四氯化碳、四氢呋喃或乙腈，反应温度为0～80℃；Baeyer-Villiger氧化反应溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃或乙腈，反应温度为0～45℃。

本发明的以聚乙二醇-b-聚ε-己内酯为载体的pH响应型抗肿瘤前药合成路线如下：抗肿瘤药物以紫杉醇(Paclitaxel)为例，羰基羧酸以4-羰基戊酸为例，巯基肼以3-巯基丙酰肼为例：

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、选择脂肪族聚酯作为载体材料，载体具有可降解性，且生物相容性较好；

2、载体为主链官能化聚酯，在其主链具有多个能与抗肿瘤药物分子反应的活性基团，从而使载体对小分子药物的运载能力大幅度提高；

3、在小分子阶段对抗肿瘤药物进行官能化，并除去副产物DCU，降低了前药的生物毒性；

4、官能化后的药物分子与载体聚合物间的“巯基-溴点击”反应在温和的条件下即可完成，反应效率高，不需引入高毒性的催化剂；

5、载体与药物间通过具有酸响应性的腙键相连，制备的前药在肿瘤组织微环境刺激下能快速地释放抗肿瘤药物。

附图说明

【图1】为实施例1制备的聚乙二醇-b-聚α位溴代ε-己内酯两亲性嵌段共聚物的¹H-NMR；

【图2】为实施例1制备的巯基官能化后的紫杉醇的¹H-NMR；

【图3】为实施例1制备的负载紫杉醇的pH响应性两亲性前药的¹H-NMR；

【图4】为实施例1制备的官能化聚合物及紫杉醇前药前药的红外光谱图：聚乙二醇-b-聚α位溴代ε-己内酯(A)两亲性嵌段共聚物；负载紫杉醇的pH响应性两亲性前药(B)；

【图5】为实施例1制备的官能化聚合物及前药的凝胶渗透谱图：MPEG₅₀₀₀(A)；聚乙二醇-b-聚α位溴代ε-己内酯(B)两亲性嵌段共聚物；负载紫杉醇的pH响应型两亲性前药(C)。

【图6】为实施例2制备的巯基官能化阿霉素的¹H-NMR；

【图7】为实施例2制备的官能化聚合物及阿霉素前药的红外光谱图：聚乙二醇-b-聚α位溴代ε-己内酯(A)两亲性嵌段共聚物；负载阿霉素的pH响应性两亲性前药(B)。

具体实施方式

以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是现在本发明权利要求的保护范围。

实施例1

1、α位溴代ε-己内酯单体的制备

称取溴代丁二酰亚胺(NBS)38.14g、环己酮20.00g、1.54g醋酸铵、无水乙醚300mL于1000mL于圆底烧瓶内，加入磁子搅拌，室温反应1h。反应结束后过滤，蒸馏水洗三遍，经过柱分离得到产物α位溴代环己酮。称取所得α位溴代环己酮17.70g与间氯过氧苯甲酸(m-CPBA)20.64g用300mL二氯甲烷溶于500mL单口烧瓶内，室温下搅拌反应48h；反应结束后过滤，滤液置于冰箱过夜再滤去析出的间氯苯甲酸，滤液分别用饱和硫代硫酸钠、碳酸氢钠、蒸馏水洗三遍，有机相经干燥浓缩后同样经过硅胶柱分离，得到浅黄色油状液体，经过低温重结晶得到白色固体。

2、聚乙二醇-b-聚α位溴代ε-己内酯两亲性嵌段共聚物的合成

称取0.8gα位溴代ε-己内酯，2.0g聚乙二醇单甲醚(Mn＝5000)置于真空干燥器内真空干燥过夜。在氩气保护下，将单体及聚乙二醇单甲醚加到已真空烧烤三遍的聚合瓶内，用5mL预先配好TBD的二氯甲烷溶解，室温反应24h，产物加100mL异丙醇沉降，0℃静置30min，抽虑，固体用无水乙醚洗涤，真空干燥(聚合物核磁见图1)。

3、抗肿瘤药物紫杉醇的官能化

称取0.1708g紫杉醇，0.0808g二环己基二亚胺(DCC)及0.012g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)于50mL单口圆底烧瓶内，加20mL精制乙酸乙酯在搅拌下充分溶解后将反应瓶置于冰浴中，将0.0348g乙酰丙酸溶于10mL乙酸乙酯，并滴加到反应瓶内，滴加完毕后继续冰浴30min，将烧瓶移到40℃油浴下反应24h。反应结束后，过滤除去生成的白色固体，旋干乙酸乙酯并用150mL二氯甲烷溶解，分别用10％(v/v)的醋酸水溶液、饱和碳酸氢钠溶液洗三遍，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩，通过硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯＝3：1)分离，得到白色固体。称取羰基官能化紫杉醇0.0952g，3-巯基丙酰肼0.024g，用3mL无水四氢呋喃溶解密闭反应24h。反应结束后将溶液浓缩，加入50mL二氯甲烷，蒸馏水洗三遍，除去过量的巯基肼，有机相干燥后旋干即得巯基官能化紫杉醇。(核磁见图2)。

4.pH响应性紫杉醇前药的制备

称取聚乙二醇-b-聚α位溴代ε-己内酯两亲性嵌段共聚物100mg，官能化紫杉醇50mg于25mL反应瓶内，再加入5mL精制四氢呋喃溶解，氩气保护下滴加10mg三乙胺，45℃搅拌反应24h。反应结束后加入无水乙醇做沉降，0℃静止30min，产物离心并用无水乙醚洗涤，真空干燥(核磁见图3，红外见图4B，分子量分布见图5C)。

实施例2

步骤1和2合成聚乙二醇-b-聚α位溴代ε-己内酯两亲性嵌段共聚物的方法与实施例1相同。

3、抗肿瘤药物阿霉素的官能化

称取116mg盐酸阿霉素溶于50mL无水甲醇，用2mL无水甲醇将48mg 3-巯基丙酰肼溶解，氩气保护下滴加到反应瓶内，室温避光反应24h，生成的官能化阿霉素用无水乙醚沉降，离心得到深红色固体(核磁见图6)。

4、pH响应性阿霉素前药的制备

称取聚乙二醇-b-聚α位溴代ε-己内酯两亲性嵌段共聚物75mg，官能化阿霉素75mg，溶于5mL无水DMF，氩气保护下滴加三乙胺12mg，室温避光反应24h。反应结束后，用去离子水透析除去未反应的官能化药物及副产物，并用无水乙醇沉降，离心，干燥(红外表征见图7)。

Claims (3)

1.一种以聚乙二醇-b-聚ε-己内酯为载体的pH响应型抗肿瘤前药的制备方法，其特征在于，所述以聚乙二醇-b-聚ε-己内酯为载体的pH响应型抗肿瘤前药具有式1结构：

其中，

D₁为阿霉素基团、表阿霉素基团、吡喃阿霉素基团中一种或几种；

D₂和D₃各自独立地选自紫杉醇基团、多西紫杉醇基团、喜树碱基团、丝裂霉素C基团中的一种或几种；

m为50～228；

1≤x+y+z≤100，且x为0～100，y为0～100，z为0～100；

R₁、R₂各自独立地选自C₁～C₄的亚烷基；

R₃为H原子、苯基或C₁～C₄的烷基；

制备以聚乙二醇-b-聚ε-己内酯为载体的pH响应型抗肿瘤前药的方法，包括以下步骤：

步骤一：抗肿瘤药物官能化

将含有羰基的抗肿瘤药物与具有式2结构的巯基肼化合物进行胺醛缩合反应或胺酮缩合反应得到具有式3结构的巯基官能化抗肿瘤药物；

或者将不含羰基且含有羟基和/或氨基的抗肿瘤药物先与具有式4结构的羰基羧酸化合物进行酯化反应或酰胺化反应，再与具有式2结构的巯基肼化合物进行胺醛缩合反应或胺酮缩合反应得到具有式5结构或具有式6结构的巯基官能化抗肿瘤药物；

步骤二：制备pH响应型抗肿瘤前药

将具有式3结构和/或具有式5结构和/或具有式6结构的巯基官能化抗肿瘤药物与具有式7结构的聚乙二醇-b-聚α溴代-ε-己内酯进行巯基-溴点击反应，即得；

其中，

m为50～228；

n为1～100；

R₁、R₂各自独立地选自C₁～C₄的亚烷基；

R₃为H原子、苯基或C₁～C₄的烷基。

2.如权利要求1所述的以聚乙二醇-b-聚ε-己内酯为载体的pH响应型抗肿瘤前药的制备方法，其特征在于，所述的聚乙二醇-b-聚α溴代-ε-己内酯通过如下方法制备得到：环己酮和溴代丁二酰亚胺进行自由基取代反应，得到α溴代环己酮；α溴代环己酮与间氯过氧苯甲酸通过Baeyer-Villiger反应，生成α溴代己内酯；α溴代己内酯通过聚乙二醇单甲醚引发剂引发开环聚合，即得。

3.如权利要求2所述的以聚乙二醇-b-聚ε-己内酯为载体的pH响应型抗肿瘤前药的制备方法，其特征在于，所述的开环聚合采用1,5,7-三氮杂双环[4.4.0] 癸 -5-烯、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯或4-二甲氨基吡啶作为催化剂。