CN113952464A - 含酮羰基的疏水性抗肿瘤药物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含酮羰基的疏水性抗肿瘤药物及其应用。所述引入酮羰基的疏水性抗肿瘤药物由含有异氰酸酯基和酮羰基的化合物中的异氰酸酯基团与含有羟基的疏水性抗肿瘤药物上的羟基反应而得到。所述含有羟基的疏水性抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西紫杉醇、紫杉醇衍生物及多西紫杉醇衍生物中的至少任一种。所述含酮羰基的疏水性抗肿瘤药物与多西紫杉醇相比具有更高的抗肿瘤活性。

Description

含酮羰基的疏水性抗肿瘤药物及其应用
本申请是申请号为201810185012.4、申请日为2018年3月6日、发明名称为“含酮羰基的疏水性抗肿瘤药物及其缀合物、含有缀合物的纳米制剂及其制备方法及应用”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及包含酮羰基的疏水性抗肿瘤药物、由酰肼封端的聚乙二醇和/或乳糖酰肼与引入酮羰基的疏水性抗肿瘤药物经脱水缩合反应而得到的缀合物，含有该缀合物的纳米制剂及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
一些疏水性抗肿瘤药物，例如紫杉醇和多西紫杉醇，对乳腺癌、卵巢癌等具有良好的治疗效果，但由于其水溶性太差，目前临床上使用的紫杉醇注射液(Taxol)和多西紫杉醇注射液(Taxoter)是将紫杉醇和多西紫杉醇溶解在由聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)或吐温80(Tween 80)与无水乙醇混合的溶液中，使用前用生理盐水或5％葡萄糖稀释到适当浓度。但含有Cremophor EL或Tween 80的注射液会给病人带来严重的毒副作用，给临床应用带来安全隐患，因此开发安全、无毒的紫杉醇和多西紫杉醇剂型一直是肿瘤治疗研究的热点。
近年来，随着纳米科技的发展，人们开发了各种各样的载体对紫杉醇和多西紫杉醇进行包埋，以便其体内输送，如脂质体(Pharmaceutical Research,1994,11(6),889-896.)、聚合物胶束(Journal of Controlled Release,2005,109(1-3),158-168.)、纳米颗粒(Small,2009,5,1706-1721.)等。除了利用物理包埋的方法进行药物体内运输外，目前还有大量的研究工作尝试通过化学键合的方式在疏水性紫杉醇和多西紫杉醇药物上连接一个亲水性基团，形成两亲性缀合物前药，继而通过各种胶束制备方式使其在水相中形成胶束。这样既能增加药物的水溶性，还能通过纳米颗粒的形成减少小分子药物在体内运输过程中的损失。
根据紫杉醇和多西紫杉醇的结构特点，目前报道的两亲性缀合物前药的设计通常是在羟基位，通过酯键的方式引入水溶性或者靶向性基团。所得产物通过酯键水解释放出前药，继而发挥抗肿瘤效果，但重要的是酯键的水解速率会大大影响其抗肿瘤活性。Greenwald用低分子量的聚氧化乙烯(PEG,MW＝350,750,2000,5000)与紫杉醇的7-OH键合，修饰紫杉醇以形成药物前体，其产物的溶解度比紫杉醇增大30000倍，但抑瘤活性却几乎完全丧失(Journal of Organic Chemistry 1995,60(2),331-336)。若釆用高分子量PEG(40000)与紫杉醇的2'-OH反应，所得的产物容易水解释放出紫杉醇，其体外抗种瘤活性与紫杉醇原药相当，体内对白血病肿瘤P388的抑瘤效果略高于紫杉醇原药。然而高分子量载体一方面会显著降低药物前体的载药率，另一方面注射大量的非活性载体材料进入体内可能会带来毒副反应。因此，研制出抗肿瘤活性强、安全性好的新型紫杉醇、多西紫杉醇及其衍生物的药物前体为临床肿瘤治疗所亟需。
发明内容
发明要解决的问题
本发明提供了由酰肼封端的聚乙二醇和/或乳糖酰肼与引入酮羰基的疏水性抗肿瘤药物经脱水缩合反应而得到的缀合物、含有该缀合物的pH响应性纳米制剂，以解决现有疏水性抗肿瘤药物例如紫杉醇、多西紫杉醇及其衍生物在体内输送所存在的技术问题，并且提高疏水性抗肿瘤药物例如紫杉醇、多西紫杉醇及其衍生物的体内抗肿瘤活性。本发明还提供了包含上述缀合物的纳米制剂的制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。此外，本发明还提供了包含酮羰基的疏水性抗肿瘤药物，以及含有酮羰基的多西紫杉醇衍生物。
用于解决问题的方案
本发明的第一方面提供一种缀合物，其由酰肼封端的聚乙二醇和/或乳糖酰肼与引入酮羰基的疏水性抗肿瘤药物经脱水缩合反应而得到。所述脱水缩合反应发生在酮羰基和酰肼基之间。所述缀合物为两亲性pH响应性缀合物。
所述引入酮羰基的疏水性抗肿瘤药物由含有异氰酸酯基和酮羰基的化合物中的异氰酸酯基与含有羟基的疏水性抗肿瘤药物中的羟基反应而得到。
所述含有异氰酸酯基和酮羰基的化合物包括对异氰酸酯苯甲酮、间异氰酸酯苯甲酮、邻异氰酸酯苯甲酮、对异氰酸酯苯乙酮、间异氰酸酯苯乙酮、邻异氰酸酯苯乙酮、对异氰酸酯基二苯酮、间异氰酸酯基二苯酮、邻异氰酸酯基二苯酮。
所述含有羟基的疏水性抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西紫杉醇、紫杉醇衍生物及多西紫杉醇衍生物中的至少任一种。
所述酰肼封端的聚乙二醇的数均分子量为148～100000，1<PDI<2。
所述酰肼封端的聚乙二醇具有如下式Ⅰ所示的化学结构：
Figure BDA0003338691100000031
其中，R为H、-CH3或者选自生物素、叶酸、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、氟脲苷、阿糖胞苷、吉西他滨、艾沙托立宾、曲沙他滨、羟基脲、米托蒽醌、阿美蒽醌、链脲菌素、平阳霉素、博来霉素的衍生基团中的任一种基团。
所述乳糖酰肼具有如下式Ⅱ所示的化学结构：
Figure BDA0003338691100000041
所述紫杉醇的衍生物，包括具有式Ⅲ所示结构的10-去乙酰紫杉醇，或者具有式Ⅳ所示结构的三尖杉宁碱:
Figure BDA0003338691100000042
所述多西紫杉醇的衍生物具有式Ⅴ所示结构：
Figure BDA0003338691100000051
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10各自独立地为氢、氘或氟，条件是其中至少有一个为氘或氟；优选，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9中一个或多个为氘，且R10为氘。
所述缀合物，优选包括具有式(1)-式(7)所示结构。
Figure BDA0003338691100000052
Figure BDA0003338691100000061
式(7)中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10各自独立地为氢、氘或氟，条件是其中至少有一个为氘或氟；优选，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9中一个或多个为氘，且R10为氘。
本发明的第二方面提供一种纳米制剂，其包含纳米颗粒，所述纳米颗粒中包含前述的缀合物。所述纳米颗粒的粒径小于300纳米，优选为20～200纳米。所述纳米制剂为pH响应性纳米制剂。
本发明的第三方面提供所述纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：将酰肼封端的聚乙二醇和/或乳糖酰肼与引入酮羰基的疏水性抗肿瘤药物进行脱水缩合反应，得到缀合物；
步骤(2)：将所述缀合物溶解在有机溶剂中形成溶液，在室温下在所述溶液加入水中，除去有机溶剂后，得到包含纳米颗粒的水溶液。
优选地，在步骤(1)中，将含酰肼封端的聚乙二醇和/或乳糖酰肼的有机溶液加入引入酮羰基的疏水性抗肿瘤药物的有机溶液中，于室温下搅拌反应。
优选地，步骤(1)和(2)中的有机溶剂选自N,N′-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、乙腈、甲醇、二氧六环中的至少一种。
本发明的第四方面提供所述缀合物或纳米制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的第五方面提供一种包含酮羰基的疏水性抗肿瘤药物，其由含有异氰酸酯基和酮羰基的化合物中的异氰酸酯基与含有羟基的疏水性抗肿瘤药物中的羟基反应而得到。
所述含有羟基的疏水性抗肿瘤药物选自紫杉醇、多西紫杉醇、紫杉醇衍生物及多西紫杉醇衍生物中的至少任一种。
所述含有异氰酸酯基和酮羰基的化合物包括对异氰酸酯苯甲酮、间异氰酸酯苯甲酮、邻异氰酸酯苯甲酮、对异氰酸酯苯乙酮、间异氰酸酯苯乙酮、邻异氰酸酯苯乙酮、对异氰酸酯基二苯酮、间异氰酸酯基二苯酮、邻异氰酸酯基二苯酮。
所述紫杉醇的衍生物，包括具有式Ⅲ所示结构的10-去乙酰紫杉醇，或者具有式Ⅳ所示结构的三尖杉宁碱:
Figure BDA0003338691100000081
所述多西紫杉醇的衍生物包括式Ⅴ所示结构：
Figure BDA0003338691100000082
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10各自独立地为氢、氘或氟，条件是其中至少有一个为氘或氟；优选，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9中一个或多个为氘，且R10为氘。
本发明的第六方面提供一种含有酮羰基的多西紫杉醇衍生物，其由含有异氰酸酯基和酮羰基的化合物中的异氰酸酯基与多西紫杉醇或氘代多西紫杉醇中的羟基反应而得到；所述含有异氰酸酯基和酮羰基的化合物包括对异氰酸酯苯甲酮、间异氰酸酯苯甲酮、邻异氰酸酯苯甲酮、对异氰酸酯苯乙酮、间异氰酸酯苯乙酮、邻异氰酸酯苯乙酮、对异氰酸酯基二苯酮、间异氰酸酯基二苯酮、邻异氰酸酯基二苯酮。
所述氘代多西紫杉醇具有式Ⅴ所示结构
发明的效果
本发明的引入酮羰基的疏水性抗肿瘤药物及pH响应纳米制剂与目前临床上使用的多西紫杉醇制剂相比，在治疗恶性肿瘤过程中，抗癌活性更好，对肿瘤抑制率更高，具有潜在的临床应用价值。本发明的两亲性pH响应缀合物的结构明确，在水中可以自组装形成纳米颗粒进行输送，避免了再引入其它载体带来的毒副作用。通过肿瘤组织的高通透性和滞留(EPR)效应，pH响应纳米颗粒可以被动靶向到肿瘤组织中。由于肿瘤组织的微酸环境，pH响应纳米颗粒能够快速释放出疏水性抗肿瘤药物分子，避免了释放的滞后所引起的抗肿瘤活性的减弱甚至丧失。
附图说明
图1为实施例1制备的两亲性pH响应单甲基化PEG-多西紫杉醇缀合物的1H NMR谱图；
图2为实施例1制备得到纳米颗粒的流体力学直径数据图；
图3为实施例1制备纳米颗粒的透射电镜照片；
图4为小鼠体重随治疗时间的变化情况；
图5为相对肿瘤体积随治疗时间的变化情况；
图6为相对肿瘤抑制率随治疗时间的变化情况；
图7为治疗结束后各组的肿瘤照片。
具体实施方式
本发明的缀合物，是由酰肼封端的聚乙二醇和/或乳糖酰肼与引入酮羰基的疏水性抗肿瘤药物经脱水缩合反应而得到。
所述引入酮羰基的疏水性抗肿瘤药物，是由含有异氰酸酯基和酮羰基的化合物中的异氰酸酯基团与含有羟基的疏水性抗肿瘤药物上的羟基反应而得到。所述含羟基的疏水性抗肿瘤药物可以为含羟基的紫杉醇类药物及其衍生物，例如可以包括选自紫杉醇、多西紫杉醇及它们的衍生物的至少任一种。
所述衍生物包括上述化合物的旋光异构体、药学可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药、多晶型物、其立体异构体、几何异构体或互变异构体、氘代物等。
所述紫杉醇、多西紫杉醇及它们的衍生物，不仅主要结构类似，而且其作用机理也基本相同，因此可以通过本发明的方法形成缀合物以及纳米制剂从而改善其药效。
本发明中所使用的酰肼封端的聚乙二醇，其具有如下式Ⅰ所示的化学结构:
Figure BDA0003338691100000101
R可为H、-CH3，也可为亲水性分子或亲水性药物的衍生基团，如生物素、叶酸、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、氟脲苷、阿糖胞苷、吉西他滨、艾沙托立宾、曲沙他滨、羟基脲、米托蒽醌、阿美蒽醌、链脲菌素、平阳霉素、博来霉素等的衍生基团中的任一种基团。
本发明所使用的酰肼封端的聚乙二醇的数均分子量为148～100000,1<PDI<2。
酰肼封端的聚乙二醇的制备方法参见本申请的制备例。
本发明中所使用的乳糖酰肼，其具有如下式Ⅱ所示的化学结构:
Figure BDA0003338691100000111
乳糖酰肼的制备方法参见本申请的制备例。
本发明中所述紫杉醇的衍生物，包括10-去乙酰紫杉醇及三尖杉宁碱，其分别具有如下式Ⅲ及式Ⅳ所示的化学结构：
Figure BDA0003338691100000112
所述多西紫杉醇的衍生物，包括多西紫杉醇的氘代衍生物，其具有如下式Ⅴ所示的化学结构：
Figure BDA0003338691100000121
式Ⅴ中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9各自独立地为氢、氘或氟，R10为氘。优选，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9中一个或多个为氘；更优选，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10均为氘，或者，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9均为氟，R10为氘。
上述紫杉醇、10-去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱或多西紫杉醇的衍生物，包括其旋光异构体、溶剂化物、多晶型物、其立体异构体、几何异构体或互变异构体。
本发明的缀合物由于一端是引入酮羰基的疏水性的抗肿瘤药物，另一端是亲水性的化合物，因此具有两亲性。两亲性的结构使得缀合物在水中受到疏水缔合(主要)的作用，自发地组装成纳米胶束。
将本发明所述的缀合物溶解在有机溶剂中形成溶液，在室温下将所述溶液加入水中，除去有机溶剂后，得到包含纳米颗粒的水溶液。其中，所述缀合物以2ng/ml～70mg/ml的浓度、优选以3μg/ml～35mg/ml的浓度溶于有机溶剂中，所得溶液与水的比例(体积比)可以为1:1～1:50，优选1:2～1:10。除去有机溶剂的方法可以为现有技术中常用的方法，例如减压蒸馏等。在包含本发明所述缀合物的纳米制剂中，所述引入酮羰基的疏水性抗肿瘤药物的含量为0.8ng/ml～20mg/ml，优选为1μg/ml～10mg/ml。所述纳米制剂中的引入羰基的疏水性抗肿瘤药物的含量可根据具体的应用进行调节。
本申请所述纳米制剂的治疗剂量可根据具体的治疗用途、疾病的种类和发展程度、患者的健康状况以及医师的判断而决定。某些典型的剂量范围为40～300mg/kg体重/日，优选为200mg/kg体重/日。
下面给出制备例以及实施例并结合附图对本发明的技术方案作进一步说明，但是以下制备例和实施例只是本发明的示例性说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述本发明的内容，对本发明作一些非本质性的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
除非另有说明，所使用原料均为商购原料。
关于部分原料的说明：
聚乙二醇单甲醚：分子量：2000，购自Sigma-Aldrich公司
羧基封端的单羟基聚乙二醇：分子量：2000，购自Sigma-Aldrich公司乳糖酸：纯度：97％，购自Adamas公司
多西紫杉醇：纯度：98％，购自江苏红豆杉药业有限公司
紫杉醇：纯度：98％，购自江苏红豆杉药业有限公司
<合成酰肼封端的聚乙二醇的制备例>
制备例1
将聚乙二醇单甲醚(20g,10mmol)完全溶于甲苯(200mL)中，通氮气除去反应瓶中空气，逐步滴加叔丁醇钾(4.12g,36mmol)的叔丁醇溶液(60mL)。反应半小时后，滴加溴代乙酸乙酯(6.4mL,48mmol)半个小时，反应溶液在室温下反应24小时。反应结束后，反应液用布氏漏斗过滤，滤液浓缩，并在冰乙醚中沉淀三次，白色沉淀物在35℃真空干燥24小时，最终得到乙酸乙酯封端的聚乙二醇单甲醚，产率90％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,20℃):δ＝1.18(t,J＝7.043Hz,3H；CH3),3.22(s,3H；OCH3),3.31-3.66(m,180H；OCH2CH2),4.22(m,2H；OCH2CH2OCO),4.70(s,2H；OCOOCH2)ppm.
随后，将乙酸乙酯封端的聚乙二醇单甲醚(10.00g,4.8mmol)溶于甲醇(100mL)中，逐步滴加水合肼(30mL)的甲醇溶液(40mL)。反应24小时后，反应液过滤，滤液浓缩，用二氯甲烷萃取三次，无水硫酸镁干燥，布氏漏斗抽滤。滤液浓缩后，在冰乙醚中沉淀，白色沉淀物在35℃真空干燥24小时，最终得到酰肼封端的单甲基化聚乙二醇，产率90％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,20℃):δ＝3.22(s,3H；OCH3),3.30-3.68(m,180H；OCH2CH2),3.87(s,2H；OCH2CH2OCO),8.87(s,1H；CONHNH2)ppm.
制备例2
将羧基封端的单羟基聚乙二醇(10g,5mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)(61.1mg,0.5mmol)完全溶于甲醇(100mL)中，在冰浴的条件下，缓慢滴加二环己基碳二亚胺(DCC)(2.1g,10mmol)的甲醇(20ml)溶液，滴加完毕后，反应溶液在室温下反应48小时。反应结束后，反应液用布氏漏斗过滤，滤液浓缩，并在冰乙醚中沉淀三次，白色沉淀物在35℃真空干燥24小时，最终得到甲酯封端的单羟基聚乙二醇，产率76％。
随后，将甲酯封端的单羟基聚乙二醇(5.00g,5mmol)溶于甲醇(50mL)中，逐步滴加水合肼(15mL)的甲醇溶液(20mL)。反应24小时后，反应液过滤，滤液浓缩，用二氯甲烷萃取三次，无水硫酸镁干燥，布氏漏斗抽滤。滤液浓缩后，在冰乙醚中沉淀，白色沉淀物在35℃真空干燥24小时，最终得到酰肼封端的单羟基聚乙二醇，产率90％。
<合成乳糖酰肼的制备例>
制备例3
乳糖酸(5.0000g,13.96mmol)溶于无水甲醇(70.0mL)中，在75℃条件下回流直至乳糖酸完全转化成乳糖内酯。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):5.33–4.01(br,OH),4.34–4.13(m,2H,CH),4.02–3.86(m,1H,CH),3.75–3.25(m,10H,CH&CH2).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm):173.44,105.42,84.19,76.01,73.66,71.83,71.63,71.41,70.94,68.55,62.64,60.79.经HRMS:(ESI)[M-H]-检测C12H19O11分子量为339.0927.
在25℃条件下，将乳糖内酯(3.0000g,8.82mmol)溶于无水甲醇中(40.0mL)中。随后，将水合肼(2.2270g,44.10mmol)逐滴加入反应液中，25℃条件下反应1h。有白色沉淀产生。减压蒸馏得到白色固体即乳糖酰肼，产率76.2％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.91–8.50(s,1H,NH),5.23–4.03(br,OH),4.32–4.17(d,J＝4.27Hz,1H,CH),4.19–4.09(d,J＝4.16Hz,1H,CH),4.04–3.93(m,1H,CH),3.73–3.60(m,2H,CH),3.60–3.46(m,5H,CH&CH2),3.45–3.24(m,3H,CH),3.18–3.16(s,2H,NH2).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm):171.46,104.95,82.96,76.15,73.67,72.05,71.86,71.56,70.92,68.74,62.77,61.15.经HRMS:(ESI)[M+H]+检测C12H20O11分子量为339.0927.
<合成引入酮羰基的疏水性抗肿瘤药物的制备例>
制备例4
将6g多西紫杉醇(DTX)溶解在110ml无水二氯甲烷与吡啶的混合溶液中。在冰浴的条件下，向DTX溶液中滴加40ml三乙基氯硅烷(TESCl)，滴加速度为10ml/10min,共滴加四次。滴加完毕后，在冰浴的条件下继续搅拌40min。随后，将反应体系置于35℃油浴中继续反应24h。反应结束后，缓慢加入水致无气泡产生。随后用水洗涤3次，减压蒸馏除去二氯甲烷。所得混合物用乙酸乙酯和石油醚梯度洗脱，经硅胶柱分离得到白色粉末状固体三乙基硅烷保护的多西紫杉醇(DTX-TES)，产率98％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.01–7.94(m,2H),7.72–7.66(m,1H),7.59(t,J＝7.6Hz,2H),7.48(d,J＝9.9Hz,1H),7.38–7.30(m,4H),7.16(tt,J＝6.0,2.5Hz,1H),5.86–5.74(m,1H),5.39(d,J＝7.1Hz,1H),4.92(tt,J＝12.6,5.0Hz,4H),4.50(s,1H),4.45(d,J＝7.1Hz,1H),4.29(dd,J＝10.5,6.6Hz,1H),4.03(s,2H),3.65(d,J＝7.1Hz,1H),2.34(s,4H),1.91(dd,J＝15.3,9.2Hz,1H),1.71–1.57(m,4H),1.53(s,3H),1.34(s,9H),0.96(d,J＝6.4Hz,6H),0.87(td,J＝7.9,2.2Hz,18H),0.60–0.39(m,12H).
将DTX-TES(2.06g)，4-二甲氨基吡啶(25mg),对异氰酸酯苯甲酮(AI)(1.63g)溶于100ml无水N，N-二甲基甲酰胺中，缓慢搅拌至固体完全溶解，溶解完毕后，将反应体系放入56℃油浴中，反应12h。反应结束后，减压蒸馏除去N，N-二甲基甲酰胺。所得混合物用乙酸乙酯和石油醚梯度洗脱，经硅胶柱分离得到白色粉末状固体(DTX-TES-AI)，产率98％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.24(s,1H),8.03–7.93(m,2H),7.94–7.85(m,2H),7.75–7.65(m,1H),7.66–7.51(m,5H),7.41–7.28(m,4H),7.17(tt,J＝5.8,3.0Hz,1H),6.26(s,1H),5.78(t,J＝9.1Hz,1H),5.44(d,J＝7.1Hz,1H),4.95(d,J＝9.1Hz,1H),4.89(dd,J＝9.9,7.1Hz,1H),4.66(s,1H),4.49–4.33(m,2H),4.09–3.94(m,3H),3.62(d,J＝7.0Hz,1H),2.49(s,3H),2.36(d,J＝5.4Hz,3H),1.96(s,2H),1.79(s,3H),1.75–1.60(m,1H),1.54(s,3H),1.33(s,9H),1.12(d,J＝5.1Hz,3H),0.98(s,3H),0.85(td,J＝7.9,6.2Hz,18H),0.52(hept,J＝7.9Hz,12H).
将DTX-TES-AI(2g)溶于16ml 5％HCl/甲醇中，26℃下开始反应,30min后加入50ml乙酸乙酯，随后用水洗涤3次，减压蒸馏除去乙酸乙酯。所得混合物用乙酸乙酯和石油醚梯度洗脱，经硅胶柱分离得到目标得到的引入羰基的疏水性抗肿瘤药物(DTX-AI)，为白色粉末状固体，产率88％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.21(s,1H),8.02–7.94(m,2H),7.91(d,J＝8.7Hz,2H),7.69(t,J＝7.4Hz,1H),7.66–7.56(m,4H),7.43(d,J＝9.4Hz,1H),7.36(t,J＝7.6Hz,2H),7.29(d,J＝7.6Hz,2H),7.19(t,J＝7.2Hz,1H),6.31(s,1H),5.87(td,J＝9.6,8.6,5.5Hz,2H),5.45(d,J＝7.1Hz,1H),4.98(d,J＝6.9Hz,1H),4.95–4.84(m,2H),4.67(s,1H),4.34(t,J＝7.2Hz,1H),4.14(dt,J＝11.1,7.0Hz,1H),4.06–3.96(m,2H),3.63(d,J＝7.0Hz,1H),2.50(s,3H),2.38–2.27(m,1H),2.22(s,3H),1.95–1.75(m,4H),1.64(t,J＝12.5Hz,1H),1.52(s,3H),1.33(s,9H),1.14(d,J＝10.9Hz,3H),1.04(s,3H).
制备例5
将6g紫杉醇(PTX)溶解在110ml无水二氯甲烷与吡啶的混合溶液中。在冰浴的条件下，向PTX溶液中滴加40ml二甲基叔丁基氯硅烷(TBSCl)，滴加速度为10ml/10min,共滴加四次。滴加完毕后，在冰浴的条件下继续搅拌40min。随后，将反应体系置于35℃油浴中继续反应24h。反应结束后，缓慢加入水致无气泡产生。随后用水洗涤3次，减压蒸馏除去二氯甲烷。所得混合物用乙酸乙酯和石油醚梯度洗脱，经硅胶柱分离得到白色粉末状固体二甲基叔丁基硅烷保护的紫杉醇(PTX-TBS)，产率98％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.81(d,J＝9.4Hz,1H),8.01–7.92(m,2H),7.87–7.79(m,2H),7.70(t,J＝7.4Hz,1H),7.58(t,J＝7.6Hz,2H),7.55–7.42(m,5H),7.38(t,J＝7.5Hz,2H),7.19(t,J＝7.3Hz,1H),6.24(s,1H),5.83(t,J＝9.1Hz,1H),5.52(t,J＝9.1Hz,1H),5.40(d,J＝7.2Hz,1H),4.94(t,J＝8.3Hz,2H),4.76(d,J＝8.7Hz,1H),4.68(s,1H),4.05(dq,J＝27.1,8.2,7.1Hz,3H),3.62(d,J＝7.1Hz,1H),2.45(s,3H),2.34(p,J＝9.4,8.6Hz,1H),2.07(s,3H),1.94(q,J＝10.3,7.2Hz,1H),1.63(t,J＝12.2Hz,2H),1.52(d,J＝17.6Hz,6H),0.98(d,J＝15.6Hz,6H),0.78(s,9H),0.03(d,J＝16.1Hz,6H).
将PTX-TBS(2.06g)，4-二甲氨基吡啶(25mg),对异氰酸酯苯甲酮(AI)(1.63g)溶于100ml无水N，N-二甲基甲酰胺中，缓慢搅拌至固体完全溶解，溶解完毕后，将反应体系放入56℃油浴中，反应12h。反应结束后，减压蒸馏除去N，N-二甲基甲酰胺。所得混合物用乙酸乙酯和石油醚梯度洗脱，经硅胶柱分离得到白色粉末状固体(PTX-TBS-AI)，产率98％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.87(s,1H),8.84(d,J＝9.4Hz,1H),8.03–7.94(m,2H),7.91–7.80(m,4H),7.72(t,J＝7.3Hz,1H),7.62(t,J＝7.6Hz,2H),7.59–7.37(m,8H),7.19(t,J＝7.4Hz,1H),6.29(s,1H),5.86(t,J＝9.1Hz,1H),5.58–5.38(m,3H),5.00(d,J＝9.4Hz,1H),4.80–4.67(m,2H),4.14–3.95(m,3H),3.79(d,J＝7.0Hz,1H),2.49(s,3H),2.43(s,2H),1.97(s,3H),1.91(dd,J＝15.2,9.6Hz,2H),1.69(d,J＝15.6Hz,7H),1.00(d,J＝6.5Hz,6H),0.79(s,9H),0.05(d,J＝23.3Hz,6H).
将PTX-TBS-AI(2g)溶于16ml 5％HCl/甲醇中，26℃下开始反应,30min后加入50ml乙酸乙酯，随后用水洗涤3次，减压蒸馏除去乙酸乙酯。所得混合物用乙酸乙酯和石油醚梯度洗脱，经硅胶柱分离得到目标得到的引入酮羰基的疏水性抗肿瘤药物(PTX-AI)，为白色粉末状固体，产率88％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.81(d,J＝9.4Hz,1H),8.01–7.92(m,2H),7.87–7.79(m,2H),7.70(t,J＝7.4Hz,1H),7.58(t,J＝7.6Hz,2H),7.55–7.42(m,5H),7.38(t,J＝7.5Hz,2H),7.19(t,J＝7.3Hz,1H),6.29(s,1H),5.86(t,J＝9.1Hz,1H),5.58–5.38(m,3H),5.00(d,J＝9.4Hz,1H),4.80–4.67(m,2H),4.14–3.95(m,3H),3.79(d,J＝7.0Hz,1H),2.49(s,3H),2.43(s,2H),1.97(s,3H),1.91(dd,J＝15.2,9.6Hz,2H),1.69(d,J＝15.6Hz,7H),1.00(d,J＝6.5Hz,6H).
<合成pH响应性缀合物的实施例>
实施例1
将制备例1得到的酰肼封端的单甲基化PEG(6g)溶解在150毫升无水甲醇中。将制备例4得到的引入酮羰基的多西紫杉醇衍生物(968.39mg)溶于20毫升无水甲醇中，将所得溶液加入至上述含酰肼封端的单甲基化PEG的溶液中，在氮气保护下室温搅拌反应48小时。减压蒸馏除去甲醇，混合物用乙腈和水梯度洗脱，经反相柱分离得到白色粉末状产物单甲基化PEG-多西紫杉醇衍生物缀合物(mPEG-DTX-AI)，产率90％。
本实施例合成的mPEG-DTX-AI的化学结构如式(1)所示。本实施例制得的缀合物的1H NMR谱图如图1所示，测试溶剂为DMSO-d6。谱图1中各质子峰的归属如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.51(s,1H),10.06–9.87(m,2H),7.97(d,J＝7.6Hz,2H),7.74(d,J＝8.4Hz,1H),7.69(d,J＝7.9Hz,2H),7.60(t,J＝7.6Hz,2H),7.52(d,J＝8.3Hz,2H),7.41(d,J＝9.3Hz,1H),7.35(t,J＝7.5Hz,2H),7.29(d,J＝7.6Hz,2H),7.19(t,J＝7.3Hz,1H),6.30(s,1H),5.87(d,J＝7.7Hz,2H),5.44(d,J＝7.0Hz,1H),4.99–4.83(m,3H),4.65(s,1H),4.51(s,1H),4.34(t,J＝7.2Hz,1H),4.11(d,J＝14.4Hz,2H),4.01(s,2H),3.64(t,J＝4.9Hz,2H),3.49(s,195H),3.22(s,3H),2.32(s,1H),2.22(s,3H),2.17(s,3H),1.87(s,4H),1.63(t,J＝12.7Hz,1H),1.51(s,3H),1.33(s,9H),1.12(s,3H),1.03(s,3H).
将上述制得的两亲性缀合物溶解在四氢呋喃中，在室温下将其加入水中，除去四氢呋喃，得到两亲性缀合物的纳米颗粒水溶液，其中多西紫杉醇衍生物的浓度为1mg/ml。本实施例制备的含有pH响应两亲性缀合物的纳米颗粒(Nano mPEG-DTX-AI)的粒径平均尺寸在170纳米左右。本实施例得到的纳米颗粒的流体力学直径数据如图2所示，透射电镜照片如图3所示。
实施例2
将制备例1得到的酰肼封端的单甲基化PEG(6g)溶解在150毫升无水甲醇中。将制备5得到的引入酮羰基的紫杉醇衍生物(1015.06mg)溶于20毫升无水甲醇中，将所得溶液加入至上述含酰肼封端的单甲基化PEG的溶液中，在氮气保护下室温搅拌反应48小时。减压蒸馏除去甲醇，混合物用乙腈和水梯度洗脱，经反相柱分离得到白色粉末状产物单甲基化PEG-紫杉醇衍生物缀合物(mPEG-DTX-AI)，产率89％。
本实施例合成的两亲性pH响应单甲基化PEG-紫杉醇衍生物缀合物的化学结构如式(2)所示。
将上述制得的两亲性缀合物溶解在四氢呋喃中，在室温下将其加入水中，除去四氢呋喃，得到两亲性缀合物的纳米颗粒水溶液，其中紫杉醇衍生物的浓度为1mg/ml。本实施例制备的含有pH响应两亲性缀合物的纳米颗粒(Nano mPEG-DTX-AI)的粒径平均尺寸在200纳米左右。
实施例3
将制备例1得到的酰肼封端的单甲基化PEG(6g)溶解在150毫升无水甲醇中形成溶液。将与制备例4类似方法得到的引入酮羰基的氘代多西紫杉醇衍生物(968.39mg)溶于20毫升无水甲醇中，将所得溶液加入至上述含酰肼封端的单甲基化PEG的溶液中，在氮气保护下室温搅拌反应48小时。减压蒸馏除去甲醇，混合物用乙腈和水梯度洗脱，经反相柱分离得到白色粉末状产物单甲基化PEG-氘代多西紫杉醇衍生物缀合物，产率90％。
本实施例合成的两亲性pH响应单甲基化PEG-氘代多西紫杉醇衍生物缀合物的化学结构如式(7)所示:
Figure BDA0003338691100000201
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10均为氘。
将上述制得的两亲性缀合物溶解在四氢呋喃中，在室温下将其加入水中，除去四氢呋喃，得到两亲性缀合物的纳米颗粒水溶液，其中氘代多西紫杉醇衍生物的浓度为1mg/ml。本实施例制备的含有pH响应两亲性缀合物的纳米颗粒的粒径平均尺寸在200纳米左右。
实施例4
将制备例1得到的酰肼封端的单甲基化PEG(6g)溶解在150毫升无水甲醇中形成溶液。将与制备例4类似方法得到的引入酮羰基的10-去乙酰紫杉醇衍生物(973.03mg)溶于20毫升无水甲醇中，将所得溶液加入至上述含酰肼封端的单甲基化PEG的溶液中，在氮气保护下室温搅拌反应48小时。减压蒸馏除去甲醇，混合物用乙腈和水梯度洗脱，经反相柱分离得到白色粉末状产物单甲基化PEG-10-去乙酰紫杉醇衍生物缀合物，产率85％。
本实施例合成的两亲性pH响应单甲基化PEG-10-去乙酰紫杉醇衍生物缀合物的化学结构如式(3)所示:
Figure BDA0003338691100000211
将上述制得的两亲性缀合物溶解在四氢呋喃中，在室温下将其加入水中，除去四氢呋喃，得到两亲性缀合物的纳米颗粒水溶液，其中10-去乙酰紫杉醇衍生物的浓度为1mg/ml。本实施例制备的含有pH响应两亲性缀合物的纳米颗粒的粒径平均尺寸在200纳米左右。
实施例5
将制备例1得到的酰肼封端的单甲基化PEG(6g)溶解在150毫升无水甲醇中形成溶液。将与制备例4类似方法得到的引入酮羰基的三尖杉宁碱衍生物(992.39mg)溶于20毫升无水甲醇中，将所得溶液加入至上述含酰肼封端的单甲基化PEG的溶液中，在氮气保护下室温搅拌反应48小时。减压蒸馏除去甲醇，混合物用乙腈和水梯度洗脱，经反相柱分离得到白色粉末状产物单甲基化PEG-三尖杉宁碱衍生物缀合物，产率90％。
本实施例合成的两亲性pH响应单甲基化PEG-三尖杉宁碱衍生物缀合物的化学结构如式(4)所示:
Figure BDA0003338691100000221
将上述制得的两亲性缀合物溶解在四氢呋喃中，在室温下将其加入水中，除去四氢呋喃，得到两亲性缀合物的纳米颗粒水溶液，其中三尖杉宁碱衍生物的浓度为1mg/ml。本实施例制备的含有pH响应两亲性缀合物的纳米颗粒的粒径平均尺寸在200纳米左右。
实施例6
将制备例3得到的乳糖酰肼(6g)溶解在150毫升无水甲醇中。将制备例4得到的引入酮羰基的多西紫杉醇衍生物(1015.06mg)溶于20毫升无水甲醇中，将所得溶液加入至上述含乳糖酰肼的溶液中，在氮气保护下室温搅拌反应48小时。减压蒸馏除去甲醇，混合物用乙腈和水梯度洗脱，经反相柱分离得到白色粉末状产物乳糖-多西紫杉醇衍生物缀合物，产率87％。
本实施例合成的两亲性pH响应乳糖-多西紫杉醇衍生物缀合物的化学结构如式(5)所示。
将上述制得的两亲性缀合物溶解在四氢呋喃中，在室温下将其加入水中，除去四氢呋喃，得到两亲性缀合物的纳米颗粒水溶液，其中多西紫杉醇衍生物的浓度为1mg/ml。本实施例制备的含有pH响应两亲性缀合物的纳米颗粒的粒径平均尺寸在200纳米左右。
实施例7
将制备例3得到的乳糖酰肼(6g)溶解在150毫升无水甲醇中。将制备例5得到的引入酮羰基的紫杉醇衍生物(1015.06mg)溶于20毫升无水甲醇中，将所得溶液加入至上述含乳糖酰肼的溶液中，在氮气保护下室温搅拌反应48小时。减压蒸馏除去甲醇，混合物用乙腈和水梯度洗脱，经反相柱分离得到白色粉末状产物乳糖-紫杉醇衍生物缀合物，产率85％。
本实施例合成的两亲性pH响应乳糖-紫杉醇衍生物缀合物的化学结构如式(6)所示。
将上述制得的两亲性缀合物溶解在四氢呋喃中，在室温下将其加入水中，除去四氢呋喃，得到两亲性缀合物的纳米颗粒水溶液，其中紫杉醇衍生物的浓度为1mg/ml。本实施例制备的含有pH响应两亲性缀合物的纳米颗粒的粒径平均尺寸在200纳米左右。
本发明中纳米颗粒的流体力学直径的测试方法：
纳米胶束平均粒後(Z-Average)和粒径：分布(PDI)由动态光散射仪(Dynamiclight scattering,DLS)测定，测试温度25℃，激光波长633nm，探头角度为173°。每个样品平衡时间为2min，测试3次。实验数据通过软件Dispersion Technology software version5.32来分析。
本发明中纳米颗粒的透射电镜照片的测试方法：
透射电镜(TEM)测试在JEM-2010/INCA OXFORD型上完成,电镜加速电压为200kV。样品制备方法如下：将组装体溶液滴加到附有碳膜的铜网上,室温下自然晾干。干燥过程中注意避免空气中的灰尘等杂质的污染。
药效实验：
pH响应纳米制剂对体内肿瘤的影响实验
将Hela荷瘤小鼠分为四组，5只一组。第一、二及三组为治疗组，即对于每一只Hela荷瘤小鼠，通过尾静脉处分别注射药物进行肿瘤治疗。对第一组用多西紫杉醇注射液进行治疗(25mg DTX/kg)，第二组用制备例4得到的抗肿瘤药物DTX-AI进行治疗(40mg DTX/kg)及第三组用实施例1得到的pH响应纳米制剂进行给药治疗(200mg DTX/kg)。第四组为空白对照组。
对第一、二及第三组小鼠每七天进行一次给药治疗，共注射3次。每组的每只荷瘤小鼠都进行标记，记录其在整个治疗过程中的体重及肿瘤的体积。肿瘤的体积通过以下公式计算：V(mm3)＝1/2×长(mm)×宽(mm)2。相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)的计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。d45天处死动物，解剖取瘤块，称瘤重，计算去瘤后动物体重。
图4示出了小鼠体重随时间的变化情况。如图4所示，第二及三组的小鼠体重与空白对照组基本保持一致，说明DTX-AI及纳米mPEG-DTX-AI的体内安全性比较高。
图5示出了相对肿瘤体积随时间的变化情况。如图5所示，与空白对照组及第一组相比，第二及三组显示出相对肿瘤体积大幅度降低的态势。另外，在21天以后(停止给药后)后，第一组的相对肿瘤体积随着时间的推移，持续增加，抑瘤作用逐渐减弱，出现反弹的现象。然而第二及三组的相对肿瘤体积随着时间的进行依然呈现降低的趋势，即停药后，抑瘤作用继续增强。
此外，还对相对肿瘤的抑制率进行了计算和分析。相对肿瘤抑制率％的计算公式为：相对肿瘤抑制率％＝(1-TRTV/CRTV)*100％，(其中，TRTV表示治疗组的RTV；CRTV表示空白对照组RTV)，其结果如图6所示。
治疗组均显示出相对肿瘤抑制率持续增长的趋势。与第一组相比，第二组与第三组的相对肿瘤抑制率呈现大幅度增长，并且在21天以后(停止给药后)持续保持90％以上。距离末次给药30天时，第一组的相对肿瘤抑制率为67.62％，第二组的相对肿瘤抑制率达到93.5％，第三组的相对肿瘤抑制率达到95.61％。
图7示出了治疗结束后各组的肿瘤照片。从照片中可以直观的看出第二组与第三组的肿瘤尺寸明显小于第一组和空白对照组。
以上数据说明引入酮羰基的疏水性抗肿瘤药物及pH响应纳米制剂与目前临床上使用的多西紫杉醇制剂相比，在治疗恶性肿瘤过程中，抗癌活性更好，对肿瘤抑制率更高，具有潜在的临床应用价值。
以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。

Claims (5)

1.一种包含酮羰基的疏水性抗肿瘤药物，其特征在于，其由含有异氰酸酯基和酮羰基的化合物中的异氰酸酯基与含有羟基的疏水性抗肿瘤药物中的羟基反应而得到；
所述含有异氰酸酯基和酮羰基的化合物包括对异氰酸酯苯甲酮、间异氰酸酯苯甲酮、邻异氰酸酯苯甲酮、对异氰酸酯苯乙酮、间异氰酸酯苯乙酮、邻异氰酸酯苯乙酮、对异氰酸酯基二苯酮、间异氰酸酯基二苯酮、邻异氰酸酯基二苯酮；
所述含有羟基的疏水性抗肿瘤药物选自紫杉醇、多西紫杉醇、紫杉醇衍生物及多西紫杉醇衍生物中的至少任一种。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述紫杉醇的衍生物，包括具有式Ⅲ所示结构的10-去乙酰紫杉醇，或者具有式Ⅳ所示结构的三尖杉宁碱:
Figure FDA0003338691090000011
所述多西紫杉醇的衍生物包括式Ⅴ所示结构：
Figure FDA0003338691090000021
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10各自独立地为氢、氘或氟，条件是其中至少有一个为氘或氟；优选，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9中一个或多个为氘，且R10为氘。
3.一种含有酮羰基的多西紫杉醇衍生物，其特征在于，由含有异氰酸酯基和酮羰基的化合物中的异氰酸酯基与多西紫杉醇或氘代多西紫杉醇中的羟基反应而得到；所述含有异氰酸酯基和酮羰基的化合物包括对异氰酸酯苯甲酮、间异氰酸酯苯甲酮、邻异氰酸酯苯甲酮、对异氰酸酯苯乙酮、间异氰酸酯苯乙酮、邻异氰酸酯苯乙酮、对异氰酸酯基二苯酮、间异氰酸酯基二苯酮、邻异氰酸酯基二苯酮。
4.根据权利要求3所述的含有酮羰基的多西紫杉醇衍生物，其特征在于，所述氘代多西紫杉醇具有式Ⅴ所示结构，
Figure FDA0003338691090000031
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10各自独立地为氢、氘或氟，条件是其中至少有一个为氘或氟；优选，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9中一个或多个为氘，且R10为氘。
5.根据权利要求1或2所述的包含酮羰基的疏水性抗肿瘤药物、或者根据权利要求3或4所述的含有酮羰基的多西紫杉醇衍生物，在制备抗肿瘤药物中的应用。
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