CN117756752A - 一种提高紫杉醇安全性的前药抗肿瘤制剂与应用 - Google Patents

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CN117756752A CN202311746742.4A CN202311746742A CN117756752A CN 117756752 A CN117756752 A CN 117756752A CN 202311746742 A CN202311746742 A CN 202311746742A CN 117756752 A CN117756752 A CN 117756752A
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孙丙军
李雅琪
孙一鑫
何仲贵
王丹平
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Abstract

本发明公开了一种提高紫杉醇安全性的前药抗肿瘤制剂与应用，属于药物制剂新辅料和新剂型领域。所述紫杉醇‑不饱和脂肪醇小分子前药由紫杉醇与不饱和脂肪醇通过二元酸作为连接链连接得到；所述的紫杉醇‑不饱和脂肪醇小分子前药结构如通式(I)所示：式中，R为不饱和的C3‑C30烃基，其中，不饱和的C3‑C30烃基中含有的烯基、炔基或烯基与炔基数目之和为1‑5个。本发明的紫杉醇‑不饱和脂肪醇前药自组装纳米粒能够有效提高紫杉醇的安全性，降低其毒副作用。

Description

一种提高紫杉醇安全性的前药抗肿瘤制剂与应用
技术领域
本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，涉及一种提高紫杉醇安全性的前药抗肿瘤制剂与应用，具体涉及紫杉醇-不饱和脂肪醇前药的合成及其自组装纳米粒的构建，以及其在药物递送系统中的应用。
背景技术
紫杉醇(paclitaxel，PTX)作为一线化疗药在临床上广泛用于治疗非小细胞肺癌和乳腺癌。然而，由于紫杉醇的水溶性极低，市售的溶液剂泰素(Taxol)不得不使用聚氧乙烯蓖麻油和乙醇作为增溶剂和助溶剂，进而引起严重的过敏反应，极大地限制了其在临床上的应用。近年来，纳米技术在药物递送领域的广泛应用，极大地丰富了紫杉醇的递送策略。目前已经有多个紫杉醇纳米制剂成功上市或进入临床实验，包括紫杉醇白蛋白纳米粒(Abraxane)、紫杉醇脂质体(Lipusu)以及紫杉醇纳米胶束(Genexol-PM)等。虽然纳米技术显著改善了紫杉醇的成药性，但传统纳米制剂仍存在一些缺陷，包括：载体相关毒副作用、载药量低(通常低于10％)、稳定性差、药物在储存过程中易结晶、泄露等。
前体药物，也称为前药、药物前体，是指将母药进行可逆的化学修饰，使其在体外没有生物活性或活性很低，经过体内代谢后转变为有活性的母药而发挥药理作用。通过将前药策略与纳米技术相结合的前药纳米粒可以有效的改善药物溶解性差、毒副作用大等问题。基于小分子前体药物的自组装纳米药物递送系统将前药策略和纳米技术的优点结合到一起，以其载药量高、稳定性好、毒副作用低等优势，已成为近几年化疗药物递送研究的热点。CN105833284A公开了将油酸与乙二醇连接，通过2,2’-二硫代二乙酸与紫杉醇共价桥连到一起。体内实验结果表明，紫杉醇-油酸小分子前药(PTX-S-S-OA)自组装纳米粒具有较强的抗肿瘤活性，但也存在一定安全性问题。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高紫杉醇安全性的前药抗肿瘤制剂与应用，本发明通过结构改善提高紫杉醇的安全性，具体为紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药的合成及其纳米粒的制备与应用，该纳米粒为自组装纳米粒，具有粒径小、分布均一、载药量高、稳定性好、抗肿瘤效果好和安全性好的优点。
本发明的目的是合成不饱和脂肪醇(油醇)侧链修饰的紫杉醇前药，制备其自组装纳米粒，并对其抗肿瘤活性及安全性进行对比。实验结果表明，侧链结构的调整(将不饱和脂肪酸替换为不饱和脂肪醇)会使前药自组装纳米粒的抗肿瘤效果和安全性产生差异，相比紫杉醇-油酸前药，紫杉醇-油醇前药的安全性显著提高。本发明为开发新的前药自组装纳米药物递送系统提供了更多的选择，满足了临床对于高效-低毒化疗制剂的迫切需求。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
第一方面，本发明提供了一种紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药或其药学上可接受的盐，所述紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药由紫杉醇与不饱和脂肪醇通过二元酸作为连接链连接得到；所述的紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药结构如通式(I)所示：
式中，R为不饱和的C3-C30烃基，其中，不饱和的C3-C30烃基中含有的烯基、炔基或烯基与炔基数目之和为1-5个；
X为单硫代二元酸、单硒代二元酸或二硫代二元酸。
进一步地，R为不饱和的C3-C24烃基，其中，不饱和结构为直链C3-C24烯基或C3-C24炔基中的一种或多种。
进一步地，R为不饱和的C10-C24烃基，其中，不饱和结构为直链C10-C24烯基或C10-C24炔基中的一种或多种。
进一步地，R为不饱和的C16-C24烃基，其中，不饱和结构为直链C16-C24烯基或C16-C24炔基中的一种或多种。
进一步地，所述的不饱和脂肪醇为油醇、反油醇、亚油醇、亚麻醇、1-十七碳烯醇、1-十六碳烯醇、1-十五碳烯醇、13-十四稀醇、(E)-5-十四烯醇、12-十三稀醇、反-2-十三烯醇、羊毛脂醇、十一烯醇、反-2-十一烯醇的一种或两种以上。
优选地，所述的不饱和脂肪醇为油醇或反油醇。
进一步地，所述的二元酸为单硫代二元酸、单硒代二元酸或二硫代二元酸。
进一步地，所述的单硫代二元酸为单硫代二乙酸、单硫代二丙酸或单硫代二丁酸；所述的单硒代二元酸为单硒代二乙酸、单硒代二丙酸或单硒代二丁酸；所述的二硫代二元酸为2,2'-二硫代二乙酸、3,3'-二硫代二丙酸或4,4'-二硫代二丁酸。
进一步地，本发明提供一种紫杉醇-油醇前药，选择2,2'-二硫代二乙酸为连接链，将对应的前药命名为PTX-S-S-OAL，其结构式如式(Ⅱ)所示：
第二方面，本发明提供一种紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药的合成方法，包括如下步骤：
步骤1：将二元酸成二元酸酐后，在4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化下与不饱和脂肪醇成酯，得到不饱和脂肪醇-二元酸单边酯，其中，按摩尔比，4-二甲氨基吡啶：不饱和脂肪醇：二元酸酐＝1:(1-10):(5-15)；
步骤2：不饱和脂肪醇-二元酸单边酯与紫杉醇发生成酯反应，得到紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药，其中，按摩尔比，不饱和脂肪醇-二元酸单边酯:紫杉醇＝1:(0.5-10)。
进一步地，紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药的合成方法，具体包括如下步骤：
(1)将二元酸溶于乙酸酐中搅拌2-4小时，使二元酸成酸酐，反应完毕后，加入甲苯，旋蒸除去甲苯和乙酸酐，获得二元酸酐；
(2)取不饱和脂肪醇、步骤(1)所得的二元酸酐以及4-二甲氨基吡啶(DMAP)一并溶于二氯甲烷中，室温条件下搅拌12-18小时，通过柱层析分离，得到中间产物不饱和脂肪醇-二元酸单边酯；
(3)取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑(HOBt)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，与步骤(2)所得中间产物不饱和脂肪醇-二元酸单边酯一并溶于无水二氯甲烷中，冰浴搅拌2-4小时后，加入紫杉醇，室温条件下搅拌24-48小时，再经制备型液相分离纯化得终产物紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药，上述反应全程在氮气保护下进行。
进一步地，步骤(1)中，所述的二元酸为单硫代二元酸、单硒代二元酸或二硫代二元酸，其中，所述的单硫代二元酸为单硫代二乙酸、单硫代二丙酸或单硫代二丁酸；所述的单硒代二元酸为单硒代二乙酸、单硒代二丙酸或单硒代二丁酸；所述的二硫代二元酸为2,2'-二硫代二乙酸、3,3'-二硫代二丙酸或4,4'-二硫代二丁酸，优选二硫代二元酸。
进一步地，步骤(1)中，按比例，二元酸：乙酸酐＝1:(1-10)，优选为1:(1-2)，单位mmol:ml。
进一步地，步骤(2)中，不饱和脂肪醇为C3-C30不饱和脂肪醇，所述的不饱和脂肪醇为油醇、反油醇、亚油醇、亚麻醇、1-十七碳烯醇、1-十六碳烯醇、1-十五碳烯醇、13-十四稀醇、(E)-5-十四烯醇、12-十三稀醇、反-2-十三烯醇、羊毛脂醇、十一烯醇、反-2-十一烯醇等中的一种或两种以上。
进一步地，步骤(2)中，按摩尔比，DMAP：不饱和脂肪醇：二元酸酐＝1:(1-10):(5-15)，优选为1:(2-5):(10-15)。
进一步地，步骤(3)中，按摩尔比，不饱和脂肪醇-二元酸单边酯：HOBt：EDCI：DMAP：紫杉醇＝1:(1-10):(2-6):(0.2-5):(0.5-10)，优选为1:(1-2):(2-4):(0.5-2):(0.8-2)。
进一步地，步骤(3)中，制备的紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药纯度在99％以上。
第三方面，本发明还提供了一种基于紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药的自组装纳米粒，包括非PEG化的前药自组装纳米粒、PEG修饰/主动靶向修饰的前药自组装纳米粒或包载疏水性荧光物质/药物的前药自组装纳米粒。
第四方面，本发明还提供了紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药的自组装纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
当为非PEG化的前药自组装纳米粒时，制备方法包括：将前药溶解到有机溶剂中，搅拌下将该溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒；采用减压旋转蒸发法除去制剂中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液，即为非PEG化的前药自组装纳米粒。
当为PEG修饰或主动靶向基团修饰的前药自组装纳米粒时，制备方法包括：将PEG修饰剂或主动靶向修饰剂和前药溶解到有机溶剂中，搅拌下，将该溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒；采用减压旋转蒸发法除去制剂中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液，即为PEG修饰或主动靶向基团修饰的前药自组装纳米粒。其中，前药与PEG修饰剂或主动靶向修饰剂的质量比为1:(0.1-1)，PEG修饰剂为DSPE-PEG、TPGS、PLGA-PEG、PE-PEG或DSPE-PEG-FA等两亲性聚合物或靶向基团，主动靶向修饰剂为抗体、糖残基、激素、受体或配体等能够靶向到特定组织的物质。
当为包载水溶性荧光物质或疏水性荧光物质的前药自组装纳米粒时，制备方法包括：将水溶性荧光物质或疏水性荧光物质与PEG修饰剂和前药溶解到有机溶剂中，搅拌下将该溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒；采用减压旋转蒸发法除去制剂中的有机溶剂，得到不含有机溶剂的纳米胶体溶液，即为包载水溶性荧光物质或疏水性荧光物质的前药自组装纳米粒。其中，所述水溶性荧光物质包括DiR，所述疏水性荧光物质包括香豆素6和Cy5；前药、PEG修饰剂与水溶性荧光物质或疏水性荧光物质的质量比为1:(0.1-1):(0.1-1)。
第五方面，本发明还提供了所述的紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药或所述的自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
第六方面，本发明还提供了所述的紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药或所述的自组装纳米粒在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
第七方面，本发明还提供了所述的紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药或所述的自组装纳米粒在制备提高疗效、降低毒性的药物传递系统中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明设计合成了含有不饱和脂肪醇侧链的紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药，合成方法简单易行；并制备了粒径较小、粒度分布均一的紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药自组装纳米粒，制备方法简单易行。
(2)本发明对比了不饱和脂肪酸侧链与不饱和脂肪醇侧链对前药自组装纳米粒制剂学性质、体内命运和抗肿瘤活性等方面的差异。结果表明：紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药自组装纳米粒能有效降低其毒副作用，提高其安全性；侧链结构的调整(将不饱和脂肪酸替换为不饱和脂肪醇)会对紫杉醇前药自组装纳米粒的体内命运与抗肿瘤活性产生显著影响；油醇作为侧链时前药自组装纳米粒的安全性显著提高；油酸作为侧链时前药自组装纳米粒的抗肿瘤效果最佳。
附图说明
图1为对比例1中紫杉醇-油酸前药(PTX-S-S-OA)的质谱结果图。
图2为对比例1中紫杉醇-油酸前药(PTX-S-S-OA)的1HNMR谱图。
图3为实施例1中紫杉醇-油醇前药(PTX-S-S-OAL)的质谱结果图。
图4为实施例1中紫杉醇-油醇前药(PTX-S-S-OAL)的1HNMR谱图。
图5为对比例1和实施例1的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的小鼠乳腺癌细胞(4T1细胞)存活曲线。
图6为对比例1和实施例1的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的人非小细胞肺癌细胞(A549细胞)存活曲线。
图7为对比例1和实施例1的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的人口腔表皮样癌细胞(KB细胞)存活曲线。
图8为对比例1和实施例1的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的人正常肝细胞(L02细胞)存活曲线。
图9为本发明对比例1和实施例1的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的体内药物动力学实验中前药的血药浓度-时间曲线图。
图10为本发明对比例1和实施例1的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的体内药物动力学实验中母药(紫杉醇)的血药浓度-时间曲线图。
图11为本发明对比例1和实施例1的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的体内药物动力学实验中前药与母药加和的血药浓度-时间曲线图。
图12为本发明对比例1和实施例1的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒低剂量(30mg/kg)给药的在体抗肿瘤实验中肿瘤体积变化图。
n.s.：P≥0.05*：P<0.05**：P<0.01***：P<0.001****：P<0.0001(均为双侧t检验)
图13为本发明对比例1和实施例1的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒低剂量(30mg/kg)给药的在体抗肿瘤实验中小鼠体重变化图。
n.s.：P≥0.05*：P<0.05**：P<0.01***：P<0.001****：P<0.0001(均为双侧t检验)
图14为本发明对比例1和实施例1的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒高剂量(45mg/kg)给药的在体抗肿瘤实验中肿瘤体积变化图。
n.s.：P≥0.05*：P<0.05**：P<0.01***：P<0.001****：P<0.0001(均为双侧t检验)
图15为本发明对比例1和实施例1的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒高剂量(45mg/kg)给药的在体抗肿瘤实验中小鼠体重变化图。
n.s.：P≥0.05*：P<0.05**：P<0.01***：P<0.001****：P<0.0001(均为双侧t检验)
图16为本发明对比例1和实施例1的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的在体抗肿瘤实验中血液常规指标图。
n.s.：P≥0.05*：P<0.05**：P<0.01***：P<0.001****：P<0.0001(均为双侧t检验)
图17为本发明对比例1和实施例1的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的BALB/c小鼠耐受性实验的体重变化图。
n.s.：P≥0.05*：P<0.05**：P<0.01***：P<0.001****：P<0.0001(均为双侧t检验)
图18为本发明对比例1和实施例1的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的BALB/c-nude耐受性实验的体重变化图。
n.s.：P≥0.05*：P<0.05**：P<0.01***：P<0.001****：P<0.0001(均为双侧t检验)。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
为了更好的理解上述技术方案，下面将更详细地描述本发明的示例性实施例。应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更清楚、透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
对比例1：2,2'二硫代二乙酸作为连接链的紫杉醇-油酸前药(PTX-S-S-OA)的合成
以适量对甲苯磺酸为催化剂，将油酸缓慢滴注到乙二醇溶液中，其中，按摩尔比，油酸：对甲苯磺酸：乙二醇＝1:0.1:0.03，110℃条件下搅拌2-3h，层析柱法采用环己烷-乙酸乙酯洗脱体系进行分离提纯，得到纯化产物油酸-乙二醇酯。
将适量的2,2'-二硫代二乙酸溶于乙酸酐后置于250mL茄形瓶中，溶解完全后，25℃磁力搅拌2h，转移到100mL茄形瓶中，加入三倍体积的甲苯，减压旋转蒸法除去甲苯与乙酸酐，加入适量二氯甲烷溶解所形成的二硫代二乙酸酐，然后加入油酸-乙二醇酯的二氯甲烷溶液，并缓缓滴加4-二甲氨基吡啶(DMAP)的二氯甲烷溶液，25℃磁力搅拌12h，得到中间产物油酸-乙二醇酯-二硫代二乙酸单边酯，层析柱法采用环己烷-丙酮洗脱体系进行分离提纯；得到纯化的上一步产物后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)的二氯甲烷溶液，0℃冰浴活化2h，然后加入紫杉醇的二氯甲烷溶液，25℃搅拌36h。反应结束后采用制备液相对产物进行分离，制得2,2'二硫代二乙酸作为连接链的紫杉醇-油酸前药。反应中，按比例，2,2'二硫代二乙酸：乙酸酐＝1:1，单位mmol:mL；按摩尔比，DMAP：油酸-乙二醇酯：二硫代二乙酸酐＝0.4:2:1，油酸-乙二醇酯-二硫代二乙酸单边酯：HOBt：EDCI：DMAP：紫杉醇＝1:1:2:0.4:0.8。
采用质谱和1H-NMR对产物结构进行确证。结果如图1-2所示，波谱解析结果如下：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.18–8.11(m,2H,Ar-H),7.81–7.75(m,2H,Ar-H),7.64–7.58(m,1H,Ar-H),7.56–7.47(m,3H,Ar-H),7.46–7.36(m,6H,Ar-H,-CO-NH-),7.36-7.31(m,1H,Ar-H),7.28-7.25(m,1H,Ar-H),6.29(s,1H,-OH),6.28–6.21(m,1H,2’-H),6.00(dd,J＝9.1,3.5Hz,1H,10-H),5.68(d,J＝7.2Hz,1H,3’-H),5.52(d,J＝3.5Hz,1H,-OH),5.39-5.29(m,2H,-CH2-CH＝CH-CH2-),4.97(dd,J＝9.7,2.6Hz,1H,13-H),4.45(dd,J＝11.1,6.7Hz,1H,2-H),4.35–4.18(m,6H,20-CH 2,-OCH2 CH2 O-),3.81(d,J＝7.6Hz,1H,5-H),3.64(s,2H,-SCH2 ),3.49(s,2H,-SCH2 ),2.63–2.48(m,2H,3-H,7-H),2.45(s,3H,-OCOCH3 ),2.39–2.32(m,1H,14-Ha),2.30(t,J＝7.6Hz,2H,-OCCH2 CH2-),2.23(s,3H,-OCOCH3 ),2.13(dd,J＝15.3,9.0Hz,1H,14-Hb),2.00(q,J＝6.8Hz,4H,-CH2 -CH＝CH-CH2 -),1.94(d,J＝1.5Hz,3H,18-CH3 ),1.91–1.84(m,1H,6-Ha),1.75-1.70(m,1H,6-Hb),1.68(s,3H,19-CH3 ),1.63–1.55(m,2H,-OCOCH2CH2-),1.34–1.24(m,20H,-(CH2)10),1.23(s,3H,16-CH3 ),1.14(s,3H,17-CH3 ),0.88(t,J＝7.0Hz,3H,-CH2CH3 ).
MS(ESI)m/z for C71H91NO19S2Na[M+Na]+:1348.551892
实施例1：2,2'二硫代二乙酸作为连接链的紫杉醇-油醇前药(PTX-S-S-OAL)的合成
将适量的2,2'-二硫代二乙酸溶于乙酸酐后置于250mL茄形瓶中，溶解完全后，25℃磁力搅拌2h，转移到100mL茄形瓶中，加入三倍体积的甲苯，减压旋转蒸法除去甲苯与乙酸酐，加入适量二氯甲烷溶解所形成的二硫代二乙酸酐，然后加入油醇的二氯甲烷溶液，并缓缓滴加4-二甲氨基吡啶(DMAP)的二氯甲烷溶液，25℃磁力搅拌12h，得到中间产物油醇-二硫代二乙酸单边酯，层析柱法采用环己烷-乙酸乙酯洗脱体系进行分离提纯；得到纯化的上一步产物后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)的二氯甲烷溶液，0℃冰浴活化2h，然后加入紫杉醇的二氯甲烷溶液，25℃搅拌36h。反应结束后采用制备液相对产物进行分离，制得2,2'二硫代二乙酸作为连接链的紫杉醇-油醇前药。反应中，按比例，2,2'二硫代二乙酸：乙酸酐＝1:1，单位mmol:mL；按摩尔比，DMAP：油醇：二硫代二乙酸酐＝0.4:2:1，油醇-二硫代二乙酸单边酯：HOBt：EDCI：DMAP：紫杉醇＝1:1:2:0.4:0.8。
采用质谱和1H-NMR对产物结构进行确证。结果如图3-4所示，波谱解析结果如下：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.18–8.11(m,2H,Ar-H),7.81–7.75(m,2H,Ar-H),7.65–7.59(m,1H,Ar-H),7.55–7.50(m,2H,Ar-H),7.50–7.35(m,7H,Ar-H),7.35–7.28(m,2H,Ar-H-CONH-),6.29(s,1H,-OH),6.27–6.19(m,1H,2’-H),5.99(dd,J＝9.1,3.6Hz,1H,10-H),5.68(d,J＝7.1Hz,1H,3’-H),5.51(d,J＝3.7Hz,1H,-OH),5.39–5.29(m,2H,-CH2-CH＝CH-CH2-),4.97(dd,J＝9.7,2.5Hz,1H,13-H),4.45(d,J＝7.0Hz,1H,2-H),4.31(d,J＝8.1Hz,1H,20-CH 2a),4.20(dd,J＝8.5,1.0Hz,1H,20-CH 2b),4.08(t,J＝6.9Hz,2H,-COOCH2 -),3.81(d,J＝7.6Hz,1H,5-H),3.63(s,2H,-SCH2 ),3.46(s,2H,-SCH2 ),2.61–2.47(m,2H,3-H,7-H),2.44(s,3H,-OCOCH3 ),2.33(dd,J＝15.4,9.4Hz,1H,14-Ha),2.23(s,3H,-OCOCH3 ),2.12(dd,J＝15.3,9.0Hz,1H,14-Hb),2.04–1.98(m,4H,-CH2 -CH＝CH-CH2 -),1.93(d,J＝1.5Hz,3H,18-CH3 ),1.90–1.83(m,1H,6-Ha),1.68(s,3H,19-CH3 ),1.65-1.56(m,3H,6-Hb,-OCOCH2CH2-),1.36–1.24(m,22H,-(CH2)11),1.23(s,3H,16-CH3 ),1.13(s,3H,17-CH3 ),0.88(t,J＝7.0Hz,3H,-CH2CH3 ).
MS(ESI)m/z for C69H89NO17S2Na[M+Na]+:1290.546413
实施例2：PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的制备
精密称取DSPE-PEG2K 0.25mg和前药1mg，用200μL乙醇将其溶解，搅拌下将该乙醇溶液缓缓滴加到1mL去离子水中，自发形成粒径均匀的PEG修饰的纳米粒。用减压旋转蒸发法去除乙醇，得到不含有机试剂的纳米胶体溶液。如表1所示，纳米粒的粒径都在70-80nm左右，粒径分布均小于0.2。纳米粒的表面电荷均在-20mV左右。
表1.PEG修饰的前药自组装纳米粒的粒径和粒径分布
结果表明：不饱和脂肪酸和不饱和脂肪醇侧链修饰的紫杉醇前药均可以形成自组装纳米粒。紫杉醇-不饱和脂肪酸/脂肪醇小分子前药自组装纳米粒的粒径均在70-80nm左右，同时粒径分布均匀，粒径分布均小于0.2，有助于纳米粒通过实体肿瘤的高通透性和滞留效应实现肿瘤靶向蓄积。纳米粒表面电荷在-20mV左右，有利于通过电荷排斥作用阻止纳米粒的聚集。
实施例3：PEG化的小分子前药自组装纳米粒的体外细胞毒实验
采用MTT法考察前药自组装纳米粒对小鼠乳腺癌细胞(4T1细胞)、人非小细胞肺癌细胞(A549细胞)、人口腔表皮样癌细胞(KB细胞)以及人正常肝细胞(L02细胞)的细胞毒性。将4T1细胞、A549细胞、KB细胞(2000个/孔)或L02细胞(5000个/孔)接种到96孔板中，37℃二氧化碳细胞培养箱内贴壁培养24h。待细胞贴壁后，弃去培养液，加入新鲜培养基稀释的不同浓度的紫杉醇溶液剂(泰素)、紫杉醇(白蛋白结合型)或紫杉醇-油酸/油醇自组装纳米粒。每个浓度6个平行孔。只加空白细胞培养液的孔作为对照组，只加PBS不含细胞的孔作为调零孔。于加药后48h，将96孔板取出，每孔加入200μL MTT溶液(0.5mg/mL)，置培养箱中孵育4h，甩板并吸干残留液体，每孔加入200μL DMSO后于振荡器上振荡10min以溶解蓝紫色甲瓒结晶。使用酶标仪在490nm或570nm处测定各孔调零后的吸光度值并计算存活率(图5-8)。通过GraphPad Prism 8.0软件计算半数抑制浓度(IC50值)。
表2.泰素、紫杉醇(白蛋白结合型)以及前药自组装纳米粒的IC50值
结果表明：相比于紫杉醇溶液剂(泰素)和紫杉醇(白蛋白结合型)纳米粒，二硫键作为化学连接的紫杉醇-油酸/油醇小分子前药自组装纳米粒对三种肿瘤细胞(4T1细胞、A549细胞和KB细胞)具有一定细胞毒性，且紫杉醇-油酸前药的细胞毒性强于紫杉醇-油醇前药。然而，紫杉醇-油酸/油醇小分子前药自组装纳米粒对正常细胞(L02细胞)的细胞毒性明显弱于泰素和紫杉醇(白蛋白结合型)。
实施例4：PEG化的小分子前药自组装纳米粒的药代动力学研究
将24只体重为180-220g的健康雄性SD大鼠随机分为4组，给药前禁食12h，自由饮水。其中3组大鼠分别尾静脉注射紫杉醇溶液剂(泰素)以及实施例2中制备的PEG修饰的前药自组装纳米粒，其剂量为5mg/kg(以紫杉醇计)。于规定的时间点取血。通过液相色谱-质谱联用仪测定血浆中的药物浓度。结果如表3和图9-11所示。给药后，紫杉醇溶液剂(泰素)在体内迅速被代谢清除，其药时曲线下面积最小；相比之下，PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒循环时间明显延长，其中，PTX-S-S-OAL纳米粒在体内清除缓慢，药时曲线下面积最大(图9-11)。
表3.紫杉醇溶液剂和前药自组装纳米粒的药代动力学参数
结果表明：给药后，紫杉醇溶液剂(泰素)在体内迅速被代谢清除，循环时间较短。相比之下，PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒循环时间明显延长，药动学参数提升明显。PTX-S-S-OA纳米粒和PTX-S-S-OAL纳米粒的总体AUC0-24 h分别为紫杉醇溶液剂(泰素)的8.14倍和15.58倍；Cmax分别为紫杉醇溶液剂(泰素)的4.97倍和5.93倍。PTX-S-S-OAL纳米粒在体内清除缓慢，药动学参数提升最为明显。
实施例5：PEG化的小分子前药自组装纳米粒的在体抗肿瘤实验
将小鼠乳腺癌细胞悬液(4T1，5x106 cells/100μL)接种于雌性BALB/c小鼠背侧皮下。待肿瘤体积生长至100-120mm3时，将荷瘤小鼠随机分为8组，每组8只，分别为生理盐水组、PTX-S-S-OA纳米粒组(30mg/kg，45mg/kg)、PTX-S-S-OAL纳米粒组(30mg/kg，45mg/kg)、紫杉醇(白蛋白结合型)纳米粒组(30mg/kg，45mg/kg)以及泰素组(30mg/kg)。给药所用的纳米粒为实施例2中制备的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒。每隔2天给药1次，连续给药3次。给药后，每天监测小鼠的存活状态和体重变化情况，测量和记录荷瘤鼠的肿瘤体积，并绘制肿瘤体积随时间变化曲线。药效实验结束后，将小鼠处死，剥离肿瘤组织，摘除小鼠眼球取血，进行进一步分析评价，结果如图12-16所示。图12表明，在低剂量(30mg/kg)给药的条件下，生理盐水组小鼠肿瘤体积迅速增长，在第9天达到800mm3左右。相比之下，泰素和纳米粒均能够抑制肿瘤的生长，其中，紫杉醇-油酸自组装纳米粒与泰素抑瘤效果相当，紫杉醇-油醇自组装纳米粒与紫杉醇(白蛋白结合型)纳米粒抑瘤效果相当；图13表明，低剂量给药时，泰素组和紫杉醇-油酸自组装纳米粒组的小鼠体重明显下降，而紫杉醇-油醇自组装纳米粒组以及紫杉醇(白蛋白结合型)纳米粒组小鼠体重无显著变化；图14表明，在高剂量(45mg/kg)给药的条件下，生理盐水组小鼠肿瘤体积迅速增长，在第9天达到800mm3左右。紫杉醇(白蛋白结合型)纳米粒和前药自组装纳米粒均能够显著抑制肿瘤的增长；图15表明，高剂量给药时，紫杉醇-油酸自组装纳米粒组小鼠体重下降幅度最大且在第6天该组小鼠全部死亡，紫杉醇(白蛋白结合型)纳米粒组和紫杉醇-油醇自组装纳米粒组小鼠体重略有下降。图16表明，泰素和紫杉醇-油酸纳米粒组(30mg/kg)小鼠体内白细胞的数量显著降低；紫杉醇(白蛋白结合型)纳米粒和紫杉醇-油醇纳米粒在高剂量(45mg/kg)给药时使小鼠体内的白细胞数量略有下降。
结果表明：二硫键作为化学连接的紫杉醇-油酸小分子前药(PTX-S-S-OA)自组装纳米粒具有与紫杉醇溶液剂(泰素)相当的抗肿瘤效果；相比于市售紫杉醇(白蛋白结合型)纳米粒，紫杉醇-油酸小分子前药自组装纳米粒具有更强的抗肿瘤效果，但其安全性较差。二硫键作为化学连接的紫杉醇-油醇小分子前药(PTX-S-S-OAL)自组装纳米粒与市售紫杉醇(白蛋白结合型)纳米粒相比，抗肿瘤效果相当的同时，没有造成明显的小鼠体重下降和血液系统毒性，是安全有效的化疗药物递送系统。相比于紫杉醇-油酸小分子前药(PTX-S-S-OA)自组装纳米粒，紫杉醇-油醇小分子前药(PTX-S-S-OAL)自组装纳米粒显著提高了紫杉醇的安全性。
实施例6：PEG化的小分子前药自组装纳米粒的BALB/c小鼠耐受性实验
将雌性BALB/c小鼠分为4组，每组5只。分别为生理盐水组、紫杉醇(白蛋白结合型)纳米粒组、PTX-S-S-OA纳米粒组以及PTX-S-S-OAL纳米粒组。第1至5天每隔24h给药75mg/kg，剂量以紫杉醇浓度计算。每次给药后观察小鼠的生存状况，记录小鼠的体重变化，结果如表4和图17所示。表4表明，紫杉醇-油酸(PTX-S-S-OA)纳米粒组小鼠在结束给药后全部死亡，而紫杉醇(白蛋白结合型)纳米粒组和紫杉醇-油醇(PTX-S-S-OAL)纳米粒组小鼠在实验结束时均全部存活。图17表明，紫杉醇(白蛋白结合型)纳米粒组和紫杉醇-油醇(PTX-S-S-OAL)自组装纳米粒组小鼠体重下降幅度相近。
表4.紫杉醇(白蛋白结合型)和前药自组装纳米粒的耐受剂量
结果表明：在BALB/c小鼠中，紫杉醇-油醇前药(PTX-S-S-OAL)自组装纳米粒的耐受性与市售紫杉醇(白蛋白结合型)纳米粒相当，而紫杉醇-油酸前药(PTX-S-S-OA)自组装纳米粒的耐受性较差。说明减少乙二醇连接链的引入，可进一步提高前药的安全性。
实施例7：PEG化的小分子前药自组装纳米粒的BALB/c-nude耐受性实验
为进一步模拟健康人体环境，取雌性BALB/c-nude小鼠分为4组，每组3只。分别为生理盐水组、紫杉醇(白蛋白结合型)纳米粒组、PTX-S-S-OA纳米粒组以及PTX-S-S-OAL纳米粒组。第0至4天每隔24h给药75mg/kg，剂量以紫杉醇浓度计算。每次给药后观察小鼠的生存状况，记录小鼠的体重变化，结果如表5和图18所示。表5表明，紫杉醇-油酸(PTX-S-S-OA)纳米粒组和紫杉醇(白蛋白结合型)纳米粒组小鼠在结束给药后全部死亡，紫杉醇-油醇(PTX-S-S-OAL)纳米粒组小鼠在实验结束时无死亡现象。图18表明，与生理盐水组相比，紫杉醇-油醇(PTX-S-S-OAL)自组装纳米粒组小鼠体重无明显下降。
表5.紫杉醇(白蛋白结合型)和前药自组装纳米粒的耐受剂量
结果表明：在BALB/c-nude小鼠中，紫杉醇-油醇前药(PTX-S-S-OAL)自组装纳米粒的耐受性远高于市售紫杉醇(白蛋白结合型)纳米粒，而紫杉醇-油酸前药(PTX-S-S-OA)自组装纳米粒的耐受性较差。说明减少乙二醇连接链的引入，能够显著提高前药的安全性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药由紫杉醇与不饱和脂肪醇通过二元酸作为连接链连接得到；所述的紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药结构如通式(I)所示：
式中，R为不饱和的C3-C30烃基，其中，不饱和的C3-C30烃基中含有的烯基、炔基或烯基与炔基数目之和为1-5个；
X为单硫代二元酸、单硒代二元酸或二硫代二元酸。
2.根据权利要求1所述的紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的不饱和脂肪醇为油醇、反油醇、亚油醇、亚麻醇、1-十七碳烯醇、1-十六碳烯醇、1-十五碳烯醇、13-十四稀醇、(E)-5-十四烯醇、12-十三稀醇、反-2-十三烯醇、羊毛脂醇、十一烯醇、反-2-十一烯醇的一种或两种以上。
3.根据权利要求1所述的紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的二元酸为单硫代二元酸、单硒代二元酸或二硫代二元酸。
4.根据权利要求3所述的紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的单硫代二元酸为单硫代二乙酸、单硫代二丙酸或单硫代二丁酸；所述的单硒代二元酸为单硒代二乙酸、单硒代二丙酸或单硒代二丁酸；所述的二硫代二元酸为2,2'-二硫代二乙酸、3,3'-二硫代二丙酸或4,4'-二硫代二丁酸。
5.根据权利要求1所述的紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药结构如式(Ⅱ)所示：
6.权利要求1-5中任一项所述的紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将二元酸成二元酸酐后，在4-二甲氨基吡啶的催化下与不饱和脂肪醇成酯，得到不饱和脂肪醇-二元酸单边酯，其中，按摩尔比，4-二甲氨基吡啶：不饱和脂肪醇：二元酸酐＝1:(1-10):(5-15)；
步骤2：不饱和脂肪醇-二元酸单边酯与紫杉醇发生成酯反应，得到紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药，其中，按摩尔比，不饱和脂肪醇-二元酸单边酯:紫杉醇＝1:(0.5-10)。
7.一种基于权利要求1-5中任一项所述的紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药的自组装纳米粒，其特征在于，包括非PEG化的前药自组装纳米粒、PEG修饰或主动靶向修饰剂修饰的前药自组装纳米粒或者包载疏水性荧光物质或药物的前药自组装纳米粒。
8.权利要求7所述的紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药的自组装纳米粒的制备方法，其特征在于，
当为非PEG化的前药自组装纳米粒时，制备方法包括：将前药溶解到有机溶剂中，搅拌下将该溶液滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒，去除有机溶剂后，即得；
当为PEG修饰或主动靶向修饰剂修饰的前药自组装纳米粒时，制备方法包括：将PEG修饰剂或主动靶向修饰剂和前药溶解到有机溶剂中，搅拌下，将该溶液滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒，去除有机溶剂后，即得；
其中，前药与PEG修饰剂或主动靶向修饰剂的质量比为1:(0.1-1)；PEG修饰剂为DSPE-PEG、TPGS、PLGA-PEG、PE-PEG或DSPE-PEG-FA，主动靶向修饰剂为抗体、糖残基、激素、受体或配体；
当为包载水溶性荧光物质或疏水性荧光物质的前药自组装纳米粒时，制备方法包括：将水溶性荧光物质或疏水性荧光物质与PEG修饰剂和前药溶解到有机溶剂中，搅拌下将该溶液滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒，去除有机溶剂后，即得；
其中，所述水溶性荧光物质包括DiR，所述疏水性荧光物质包括香豆素6和Cy5；前药、PEG修饰剂与水溶性荧光物质或疏水性荧光物质的质量比为1:(0.1-1):(0.1-1)。
9.权利要求1-5中任一项所述的紫杉醇-不饱和脂肪醇小分子前药或权利要求7所述的自组装纳米粒的应用，其特征在于，在制备抗肿瘤药物中的应用或在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用或在制备提高疗效、降低毒性药物传递系统中的应用。
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