CN112245591A - 化疗药物-低氧激活前药一体化前药自组装纳米粒的构建 - Google Patents

化疗药物-低氧激活前药一体化前药自组装纳米粒的构建 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及化疗药物‑低氧激活前药一体化前药，将化疗药物与低氧激活前药以氧化还原敏感键或非敏感键相连，实现化疗药物和低氧激活前药高效共载和同步递送。本发明以喜树碱作为化疗药物，以PR104A作为低氧激活前药，以二硫键或非敏感碳酸酯键相连，合成一体化前药，并制备自组装纳米递药系统。本发明制备工艺简单，纳米粒载药量高；粒径小且均一，利于纳米粒通过EPR效应富集于肿瘤部位；在肿瘤内高水平谷胱甘肽的作用下，触发二硫键断裂实现两种药物的快速释放；低氧激活前药能够有效克服化疗药物通过邻位效应向肿瘤内部渗透与杀伤的限制，实现有效的肿瘤深部渗透与协同抗肿瘤效果。

Description

化疗药物-低氧激活前药一体化前药自组装纳米粒的构建
技术领域
本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，涉及化疗药物-低氧激活前药一体化前药及其合成方法，还涉及所述的化疗药物-低氧激活前药一体化前药自组装纳米粒的构建，以及其在药物传递系统中的应用。
背景技术
癌症仍是威胁人类健康的一大病症，目前癌症的治疗仍是以化疗为主。据报道，化疗药物在杀死肿瘤细胞后，死细胞内剩余的药物能够接着传递给周围的邻近细胞，实现化疗药物自身的增强渗透与放大杀伤作用，这种现象被称为邻位效应。然而这种效应在实际治疗中往往表现得并不理想，原因主要由于化疗药物在发挥作用过程中逐渐被消耗，导致治疗药量下降。同时，当通过邻位效应向肿瘤内部渗透后，内部的低氧肿瘤细胞往往会对常规化疗药物表现出耐受性。因此，单一化疗治疗效果往往并不理想。低氧激活前药是一类在常氧肿瘤细胞内无毒，而在低氧肿瘤细胞内能够选择性地发挥细胞毒作用的药物。将低氧激活前药与化疗药物进行联合递送，低氧激活前药与化疗药物发挥互补作用，能够克服化疗药物发挥邻位效应的障碍，实现在肿瘤低氧区的进一步渗透与杀伤。
然而，因低氧激活前药和化疗药物在理化性质和药动学性质上存在差异，如何实现二者的高效同步递药仍是一个亟待解决的难题。传统纳米载体能将低氧激活前药和化疗药物通过物理包埋的方式实现共载，但这种非共价方式的共载策略存在载药量低、稳定性差、药物易在载体中结晶或提前泄漏等问题。因此，亟需构建更高效的新型药物传递系统用于低氧激活前药和化疗药物的联合递药。相比于传统纳米载体存在的不足，前药自组装纳米递药系统因前药自身作为纳米结构的主体而使得载药量非常高，高载药量则意味着减小载体材料的用量，减少甚至避免因载体材料的大量使用而导致的辅料相关不良反应。
发明内容
针对现有技术的上述缺陷，本发明拟设计合成化疗药物-低氧激活前药一体化前药，并构建还原敏感触发释药的化疗药物-低氧激活前药一体化前药自组装纳米递药系统，通过共价键合的方式实现化疗药物和低氧激活前药的高效共载和同步递送。化疗药物-低氧激活前药一体化前药自组装纳米系统具有以下特征：一是到达肿瘤细胞内，细胞内的高水平谷胱甘肽触发二硫键的断裂，实现两种药物的快速同步释放；二是低氧激活前药克服化疗药物通过邻位效应向肿瘤深部渗透与杀伤的障碍，实现二者的高效协同抗肿瘤作用。
本发明设计化疗药物-低氧激活前药一体化前药自组装纳米粒的目的是提高低氧激活前药与化疗药物的协同治疗效果，并考察该药物递送系统的还原敏感药物释放及机制、细胞毒性、肿瘤渗透、药动学、组织分布以及抗肿瘤效率。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
化疗药物-低氧激活前药一体化前药，是将低氧激活前药与化疗药物通过氧化还原敏感键或非敏感键相连，所述的氧化还原敏感键为单硫键、单硒键、单碲键、二硫键、二硒键、二碲键、三硫键或间隔二硫醚键，所述的非敏感键为酯键、酰胺键、碳酸酯键或氨基甲酸酯键。
优选地，低氧激活前药与化疗药物以氧化还原敏感键二硫键相连，或以非敏感碳酸酯键相连。
其中，低氧激活前药为一类对正常组织无毒或毒性较低，进入肿瘤低氧微环境后即可被激活产生抗肿瘤活性的药物，优选替拉扎明、TH-302、EO9、AQ4N或PR104A，化疗药物为含有活性羟基或氨基的抗癌药物，选自紫杉烷类化合物、核苷类化合物、蒽环类化合物或喜树碱类化合物。
Figure BDA0002734959120000021
本发明优选以PR104A作为低氧激活前药，以喜树碱类化合物作为化疗药物，以二硫键相连的化疗药物-低氧激活前药一体化前药，其结构式为：
Figure BDA0002734959120000022
本发明还提供了所述的化疗药物-低氧激活前药一体化前药的合成方法，包括如下步骤：化疗药物先与二硫二乙醇或1,6-己二醇反应成碳酸酯键或氨基甲酸酯键，而后与低氧激活前药再进行反应生成化疗药物-低氧激活前药一体化前药，即得。
具体地，本发明提供了以PR104A作为低氧激活前药，以喜树碱类化合物作为化疗药物，以二硫键相连的化疗药物-低氧激活前药一体化前药的合成方法：
将喜树碱类化合物喜树碱与三光气溶于无水二氯甲烷中于低温冰浴下搅拌，将DMAP溶于少量二氯甲烷并逐滴加入到上述混合溶液中，冰浴下反应1-2小时。将二硫二乙醇或1,6-己二醇溶于少量二氯甲烷加入到该反应液中，而后室温反应24小时，分离纯化得到两种中间产物CPT-SS-OH或CPT-CC-OH。
将所得的两种中间产物与三光气溶于无水二氯甲烷中于低温冰浴下搅拌，将DMAP溶于少量二氯甲烷并逐滴加入到上述混合溶液中，冰浴下反应1-2小时。将PR104A溶于少量二氯甲烷加入到该反应液中，而后室温反应24小时，分离纯化得所述的两种化疗药物-低氧激活前药一体化前药。
Figure BDA0002734959120000031
本发明还提供了所述的化疗药物-低氧激活前药一体化前药自组装纳米粒，所述的前药纳米粒可以为非PEG化的前药纳米粒、PEG修饰的前药纳米粒和主动靶向的前药纳米粒。
所述的前药自组装纳米粒的制备方法如下：
将一定量的前药或前药与磷脂与PEG修饰剂的混合物溶解到适量的丙酮或乙醇中，搅拌下，将该溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。最后，采用旋蒸法或透析法除去制剂中的丙酮或乙醇，得到不含有机溶剂的纳米胶体溶液。所述的PEG修饰剂为TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG和PE-PEG等，优选的PEG修饰剂为DSPE-PEG或茴香胺修饰的DSPE-PEG。所述的磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂或合成磷脂，优选的磷脂为蛋黄卵磷脂。所述PEG的分子量为1000-5000，优选为1000、2000和5000，更优选的PEG分子量为2000。
(1)非PEG化的前药自组装纳米粒的制备方法：将一定量的前药溶解到适量的丙酮或乙醇中，搅拌下，将该溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。
(2)PEG修饰的前药自组装纳米粒的制备方法：将一定量的PEG修饰剂(TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG或PE-PEG)和磷脂与前药溶解到适量的丙酮或乙醇中，搅拌下，将该混合溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。其中，前药与PEG修饰剂的质量比例为95:5～70:30，前药与磷脂的质量比例为95:5～70:30，前药、磷脂和PEG修饰剂的质量比为：85:5:10～70:10:20。
(3)主动靶向的前药自组装纳米粒的制备方法：将一定量的茴香胺修饰的DSPE-PEG(DSPE-PEG-AA)和磷脂与前药溶解到适量的丙酮或乙醇中，搅拌下，将该混合溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。所述前药与DSPE-PEG-AA的质量比例为95:5～70:30，前药与磷脂的质量比例为95:5～70:30，前药、磷脂和PEG修饰剂的质量比为：85:5:10～70:10:20。
本发明的化疗药物-低氧激活前药一体化前药首次被发现可以自组装形成均匀的纳米体系。该纳米药物传递系统的优势在于：(1)采用一步纳米沉淀的方法，制备工艺简单，易于产业化；(2)粒径均一(～170nm)，有利于纳米粒通过EPR效应富集于肿瘤部位；(3)超高的载药量，有利于减小因辅料和生物材料而引发的不良反应；(4)易于表面修饰，可通过PEG和主动靶向修饰有效避免网状内皮系统摄取和提高肿瘤细胞对纳米粒的摄取；(5)肿瘤细胞内高浓度谷胱甘肽触发二硫键断裂，实现两种药物的快速同步释放；(6)低氧激活前药克服化疗药物通过邻位效应向肿瘤深部渗透与杀伤的障碍，实现二者的高效协同抗肿瘤作用。
本发明具有以下有益效果：1、设计合成了化疗药物-低氧激活前药一体化前药，合成方法简单易行；2、制备了粒径均匀的前药自组装纳米粒，制备方法简单易行，稳定性好，实现化疗药物和低氧激活前药的高效共载；3、在还原环境下实现二硫键敏感断裂，触发在肿瘤部位的选择性药物释放；4、PEG修饰的前药自组装纳米粒能有效延长药物在血液中的循环时间，增加在肿瘤部位的蓄积；5、化疗药物与低氧激活前药具有良好的联合抗肿瘤效果，即协同抗肿瘤作用。
附图说明
图1为本发明实施例1的二硫键相连的喜树碱-PR104A前药(CPT-SS-PR104A)的质谱图以及1H NMR谱图。
图2为本发明实施例2的非敏感键相连的喜树碱-PR104A前药(CPT-CC-PR104A)的质谱图以及1H NMR谱图。
图3为本发明实施例3的PEG修饰的前药自组装纳米粒的透射电子显微镜图。
图4为本发明实施例4的PEG修饰的前药自组装纳米粒的胶体稳定性图。
图5为本发明实施例5的PEG修饰的前药自组装纳米粒体外药物释放图。
图6为本发明实施例5的CSSP纳米粒在DTT作用下前药分子量变化质谱图和释放机制。
图7为本发明实施例6的PEG修饰的前药自组装纳米粒和溶液剂的细胞毒性图。
图8为本发明实施例7的PEG修饰的前药自组装纳米粒的细胞摄取图(n.s.代表无显著性差异；**，***分别代表显著性p<0.01，p<0.001)。
图9为本发明实施例8的PEG修饰的前药自组装纳米粒的3D肿瘤球渗透图。
图10为本发明实施例8的PEG修饰的前药自组装纳米粒的3D肿瘤球细胞杀伤图(n.s.代表无显著性差异；*，**，***分别代表显著性p<0.05，p<0.01，p<0.001)。
图11为本发明实施例9的PEG修饰的前药自组装纳米粒的血药浓度-时间曲线图。
图12为本发明实施例10的PEG修饰的前药自组装纳米粒的活体分布图。
图13为本发明实施例10的PEG修饰的前药自组装纳米粒的离体组织分布图(*代表显著性p<0.05)。
图14为本发明实施例11的PEG修饰的前药自组装纳米粒的抗肿瘤实验肿瘤体积变化图(n.s.代表无显著性差异；**，***分别代表显著性p<0.01，p<0.001)。
图15为本发明实施例11的PEG修饰的前药自组装纳米粒的抗肿瘤转移图(n.s.代表无显著性差异；**，***分别代表显著性p<0.01，p<0.001)。
图16为本发明实施例11的PEG修饰的前药自组装纳米粒的抗肿瘤实验小鼠体重变化图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1：
二硫键相连的喜树碱-PR104A前药(CPT-SS-PR104A)的合成
将喜树碱与三光气溶于无水二氯甲烷中于低温冰浴下搅拌，将DMAP溶于少量二氯甲烷并逐滴加入到上述混合溶液中，冰浴下反应1-2小时。将二硫二乙醇溶于少量二氯甲烷加入到该反应液中，而后室温反应24小时，分离纯化得到中间产物CPT-SS-OH。
将所得的中间产物与三光气溶于无水二氯甲烷中于低温冰浴下搅拌，将DMAP溶于少量二氯甲烷并逐滴加入到上述混合溶液中，冰浴下反应1-2小时。将PR104A溶于少量二氯甲烷加入到该反应液中，而后室温反应24小时，分离纯化得CPT-SS-PR104A。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例1中前药的结构，结果如图1所示，核磁共振选用的溶剂为CDCl3，解析结果如下：
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C40H42BrN6O17S3,1053.09465；found,1053.09476.1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.60(d,J＝2.8Hz,1H),8.55(d,J＝2.8Hz,1H),8.43(s,1H),8.23(d,J＝8.5Hz,1H),7.96(d,J＝7.4Hz,1H),7.85(t,J＝7.1Hz,1H),7.68(t,J＝7.0Hz,1H),7.57(t,J＝5.8Hz,1H),7.36(s,1H),5.66(d,J＝17.2Hz,1H),5.35(d,J＝17.2Hz,1H),5.29(s,2H),4.46–4.21(m,8H),3.76(t,J＝5.2Hz,2H),3.66–3.49(m,6H),3.01(s,3H),2.98–2.86(m,4H),2.30–2.07(m,2H),0.99(t,J＝7.5Hz,3H).
实施例2：
非敏感键相连的喜树碱-PR104A前药(CPT-CC-PR104A)的合成
将喜树碱与三光气溶于无水二氯甲烷中于低温冰浴下搅拌，将DMAP溶于少量二氯甲烷并逐滴加入到上述混合溶液中，冰浴下反应1-2小时。将1,6-己二醇溶于少量二氯甲烷加入到该反应液中，而后室温反应24小时，分离纯化得到中间产物CPT-CC-OH。
将所得的中间产物与三光气溶于无水二氯甲烷中于低温冰浴下搅拌，将DMAP溶于少量二氯甲烷并逐滴加入到上述混合溶液中，冰浴下反应1-2小时。将PR104A溶于少量二氯甲烷加入到该反应液中，而后室温反应24小时，分离纯化得CPT-CC-PR104A。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例2中前药的结构，结果如图2所示，核磁共振选用的溶剂为CDCl3，解析结果如下：
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd for C42H46BrN6O17S,1017.18180；found,1017.18416.1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.62(d,J＝2.7Hz,1H),8.56(d,J＝2.8Hz,1H),8.42(s,1H),8.23(d,J＝8.5Hz,1H),7.96(d,J＝8.1Hz,1H),7.85(t,J＝7.5Hz,1H),7.68(t,J＝7.5Hz,1H),7.41(t,J＝5.7Hz,1H),7.35(s,1H),5.68(d,J＝17.2Hz,1H),5.38(d,J＝17.2Hz,1H),5.30(s,2H),4.49–4.28(m,4H),4.22–4.02(m,4H),3.82–3.71(m,2H),3.66–3.50(m,6H),3.01(s,3H),2.34–2.08(m,2H),1.70–1.66(m,2H),1.64–1.57(m,2H),1.42–1.32(m,4H),0.99(t,J＝7.4Hz,3H).
实施例3：
PEG修饰的前药自组装纳米粒的制备
将DSPE-PEG2k(1.6mg)和蛋黄卵磷脂(0.8mg)和前药(CPT-SS-PR104A或CPT-CC-PR104A，8mg)溶解于2mL无水丙酮中。在搅拌下(1000rpm)将混合溶液滴加到8mL去离子水中。在25℃的条件下旋蒸除去纳米制剂中的有机溶剂，即分别得到CSSP纳米粒和CP纳米粒。如表1所示，喜树碱和PR104A的载药量都很高，实现了化疗药物和低氧激活前药的高效共载。
表1、PEG修饰的前药自组装纳米粒的粒径、粒径分布、表面电位和载药量
Figure BDA0002734959120000071
通过透射电子显微镜测定实施例3中制备的前药自组装纳米粒的粒径和形态，结果如图3，透射电镜图表明载药纳米粒为均一的球形，粒径在170nm左右。
实施例4：
PEG修饰的前药自组装纳米粒的胶体稳定性实验
将实施例3中制备的PEG修饰的前药自组装纳米粒CSSP纳米粒和CP纳米粒(0.25mg/mL)在37℃的条件下在含有10％FBS的PBS(pH为7.4)中孵育24h，并且在预定的时间点(0，1，2，4，6，8，12和24h)通过动态光散射法测定其粒径变化。结果如图4所示，PEG修饰的前药自组装纳米粒在24小时内粒径无明显变化，显示出良好的胶体稳定性。
实施例5：
PEG修饰的前药自组装纳米粒的体外释放实验
将实施例3中制备的CSSP纳米粒和CP纳米粒(300nmol)于30mL的pH 7.4PBS(含30％乙醇)释放介质中，在10mM，1mM或0mM DTT的存在下，在预定的时间点，取样使用高效液相色谱法(HPLC)同时测定喜树碱和PR104A的药物释放。同时，为了验证药物释放机制，CSSP纳米粒在与1mM DTT孵育2h后使用质谱测定溶液中前药的分子量变化。
药物释放结果如图5，在没有DTT的作用下，CSSP纳米粒释放了少于5％的喜树碱与PR104A，而在10mM DTT的作用下，CSSP纳米粒在2h内释放了95.7％的喜树碱和94.4％的PR104A。喜树碱和PR104A的释放比约为1：1，说明了两者在还原触发下的同时释放。相比而言，CP纳米粒即使在10mM DTT的作用下也几乎没有药物的释放，说明药物的释放是由于二硫键的敏感性实现的。为了进一步确定释放机制，如图6质谱所示，可以观察到CPTSH分子量的存在，证明了二硫键的断裂，而硫醇的生成会快速触发分子内脱去五元环进而释放出游离药物。
实施例6：
PEG修饰的前药自组装纳米粒的细胞毒性实验
将4T1细胞(1000个/孔)或3T3细胞(2000个/孔)接种于96孔板中，在常氧条件下培养12小时，而后在常氧或低氧条件下再培养12h。然后用梯度浓度的喜树碱溶液、PR104A溶液、PR104A和喜树碱混合溶液、CSSP纳米粒或CP纳米粒处理细胞。在常氧或低氧条件下再培养孵育48小时后，每孔加入10μLCCK-8再孵育2小时，用酶标仪测量450nm波长处的吸光度。
如图7和表2结果所示，CSSP纳米粒对4T1肿瘤细胞的毒性要强于对3T3正常细胞的毒性，主要原因为据报道4T1细胞内具有比3T3细胞更高的还原型谷胱甘肽，因而CSSP纳米粒在4T1细胞内具有更快的药物释放速度，进而表现出更明显的毒性。相比于常氧而言，在低氧条件下，PR104A被激活表现出更高的毒性，而喜树碱的毒性由于低氧耐药性而降低。另外，CSSP纳米粒和混合溶液剂组都表现出比常氧下更强的毒性。CP纳米粒由于其化学惰性，很难释放出游离的药物，因而始终表现为低毒性。
表2、前药自组装纳米粒和溶液剂对4T1和3T3细胞的IC50值
Figure BDA0002734959120000081
实施例7：
PEG修饰的前药自组装纳米粒的细胞摄取
将4T1细胞以每孔1×105个细胞的密度接种于12孔板中，孵育24小时。然后，用PBS(pH为7.4)清洗细胞，加入含有喜树碱溶液、CSSP纳米粒或CP纳米粒(喜树碱的量为10μM)的培养基，孵育12或24小时。孵育后，用PBS(pH为7.4)清洗细胞，采用共聚焦显微镜观察细胞内摄入的喜树碱的荧光，或收集细胞用流式细胞仪测定细胞摄取情况。
实验结果如图8所示，两种前药纳米粒相比于喜树碱溶液而言具有更高的细胞摄取效率。另外，由于CSSP纳米粒在细胞内谷胱甘肽作用下解聚，克服聚集诱导淬灭效应，因而表现出比CP纳米粒稍强的荧光。
实施例8：
PEG修饰的前药自组装纳米粒的3D肿瘤球渗透与杀伤研究
将每1×104个4T1细胞分散到15μL的培养基(含有0.24％的甲基纤维素)中，将该细胞混悬液滴加到圆底96孔板的板盖上，然后扣置于96孔板上，培养箱中培养24h。24h后，将圆底96孔板的孔中加入200μL完全培养基，于2800rpm转速下离心3min，将细胞球由板盖离心到孔中，而后继续培养，每2天换新的培养液，第6天即可加药做实验。将喜树碱溶液、PR104A溶液、PR104A和喜树碱混合溶液、CSSP纳米粒或CP纳米粒(喜树碱和PR104A的量均为10μM)处理细胞球，24h后洗去游离药物，于共聚焦显微镜下观察药物渗透情况。另外，使用碘化丙啶溶液对肿瘤球的死细胞进行染色，洗去多余染色液，于共聚焦显微镜下观察细胞杀伤情况。
如图9结果所示，相比于喜树碱溶液剂，两药的联合(无论是CSSP纳米粒形式，还是PR104A和喜树碱混合溶液剂形式)都表现出更深的肿瘤球渗透效果，说明PR104A的引入能够促进实现更深的肿瘤渗透。CP纳米粒由于很难释放出游离药物，则表现出相对差的渗透效果。另外，如图10结果所示，两药的联合具有最好的渗透能力，进而也具有最强的肿瘤球细胞杀伤能力。
实施例9：
PEG修饰的前药自组装纳米粒的药代动力学研究
雄性Sprague-Dawley大鼠(220-250g)通过尾静脉注射给予喜树碱溶液、CSSP纳米粒、或CP纳米粒(喜树碱的量为2mg/kg)。在预定的时间点(0.083，0.5，1，2，4，6，8，12和24h)进行大鼠眼底静脉丛采血，将血样离心获得血浆。血浆样品的处理如下：首先取50μL血浆样品，加入25μL四丁基氢氧化铵溶液(0.5％)，涡旋10min，然后加入150μL乙腈，再涡旋3min，13000rpm离心5min，取上清液加入到96孔黑板中，采用酶标仪测定总的喜树碱的血浆浓度(激发：365nm，发射：430nm)。
如图11所示喜树碱溶液剂被迅速从血液中清除，半衰期较短。相比之下，前药纳米粒明显延长了血液循环时间。其中，CP纳米粒由于其化学惰性，血液循环时间最长。而CSSP纳米粒由于具有敏感释放特性，其循环半衰期与CP纳米粒相比稍短。
实施例10：
PEG修饰的前药自组装纳米粒的组织分布实验
将4T1细胞(5×106个)注入BALB/c雌性小鼠背部皮下。当肿瘤生长到300mm3，通过尾静脉注射给予DiR溶液、DiR标记的CSSP纳米粒或DiR标记的CP纳米粒(DiR的量为1mg/kg)。在2、4、8、12和24h静脉注射后，将小鼠麻醉并使用小动物成像系统进行活体成像。注射24h后处死小鼠，收集心、肝、脾、肺、肾、肿瘤等器官，进行离体组织荧光成像。
结果如图12和图13所示，DiR溶液在给药后在体内被迅速清除。相比较而言，CSSP纳米粒和CP纳米粒在肿瘤部位具有很明显的蓄积，并且肿瘤中的荧光信号随着时间的延长而增加。该肿瘤蓄积结果与药代动力学研究结果一致，前药纳米粒在肿瘤内蓄积量的增加归因于血液循环时间的延长进而通过EPR效应聚集于肿瘤部位，CP纳米粒由于具有比CSSP纳米粒更长的血液循环时间，进而表现出比CSSP纳米粒更高的肿瘤蓄积。
实施例11：
PEG修饰的前药自组装纳米粒的体内抗肿瘤实验
将4T1细胞(5×105)注入BALB/c雌性小鼠乳腺脂肪垫中构建原位4T1荷瘤小鼠模型。当肿瘤大小约100mm3时，小鼠尾静脉注射生理盐水、喜树碱溶液、PR104A溶液、PR104A和喜树碱混合溶液、CSSP纳米粒或CP纳米粒(CPT量为4mg/kg；PR104A量为5.7mg/kg)，给药时间为第0，2，4，6，8天。每两天记录小鼠体重及肿瘤生长情况。第12天处死小鼠，将原位4T1荷瘤小鼠的肺在Bouin’s溶液中固定18h，70％乙醇保存，记录肺叶表面的肿瘤转移数目。
如图14所示，生理盐水对照组肿瘤生长最快。PR104A稍表现出一定的肿瘤生长抑制效果。PR104A和CPT混合溶液组与单独CPT溶液组相比，在肿瘤抑制方面没有显著提升，表明单单依靠溶液剂混合的方式实现两种药物的联合效果比较差，因为两种药物具有不同的体内药动性质。相比之下，CSSP纳米粒由于其良好的协同共递送的能力，以及还原敏感触发的喜树碱与PR104A快速释放，能够有效克服化疗药物邻位效应的障碍，实现深部的肿瘤渗透以及协同杀伤，进而表现出最好的抗肿瘤效果。CP纳米粒缺少敏感释药特性，因此抗肿瘤效果要差。如图15所示，CSSP纳米粒同样表现出最好的抑制肿瘤转移的能力。如图16所示，除了喜树碱和混合溶液组外，其余制剂组体重无明显变化，说明该PEG化的前药自组装纳米粒是安全有效的抗癌药物传递系统。

Claims (10)

1.化疗药物-低氧激活前药一体化前药，其特征在于，将化疗药物与低氧激活前药以氧化还原敏感键或非敏感键相连，所述的化疗药物为含有活性羟基或氨基的抗癌药物，所述的低氧激活前药为一类对正常组织无毒或毒性较低，进入肿瘤低氧微环境后即可被激活产生抗肿瘤活性的药物。
2.如权利要求1所述的化疗药物-低氧激活前药一体化前药，其特征在于，所述的氧化还原敏感键为单硫键、单硒键、单碲键、二硫键、二硒键、二碲键、三硫键或间隔二硫醚键，所述的非敏感键为酯键、酰胺键、碳酸酯键或氨基甲酸酯键。
3.如权利要求1所述的化疗药物-低氧激活前药一体化前药，其特征在于，所述的低氧激活前药为替拉扎明、TH-302、EO9、AQ4N或PR104A，所述的化疗药物为紫杉烷类化合物、核苷类化合物、蒽环类化合物或喜树碱类化合物；
Figure FDA0002734959110000011
4.如权利要求1-3任何一项所述的光敏剂-低氧激活前药一体化前药，其特征在于，以PR104A作为低氧激活前药，以喜树碱作为化疗药物，其结构式为：
Figure FDA0002734959110000012
5.如权利要求1-4任何一项所述的化疗药物-低氧激活前药一体化前药的合成方法，其特征在于，采用如下步骤制备：
化疗药物先与二硫二乙醇或1,6-己二醇反应成碳酸酯键或氨基甲酸酯键，而后与低氧激活前药再进行反应生成碳酸酯键或氨基甲酸酯键，即得。
6.权利要求1-4任何一项所述的化疗药物-低氧激活前药一体化前药的自组装纳米粒，其特征在于，将一定量的前药或前药与磷脂与PEG修饰剂的混合物溶解到丙酮或乙醇中，搅拌下，将该溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。
7.根据权利要求6所述的前药自组装纳米粒，其特征在于，所述的前药自组装纳米粒为非PEG化的前药纳米粒、PEG修饰的前药纳米粒或主动靶向靶头修饰的PEG化前药纳米粒，其中，所述的PEG为TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG和PE-PEG，所述的磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂或合成磷脂，前药与PEG修饰剂的质量比例为95:5～70:30，前药与磷脂的质量比例为95:5～70:30。
8.权利要求1-4任何一项所述的化疗药物-低氧激活前药一体化前药或权利要求6-7任何一项所述的前药自组装纳米粒在制备药物传递系统中的应用。
9.权利要求1-4任何一项所述的化疗药物-低氧激活前药一体化前药或权利要求6-7任何一项所述的前药自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.权利要求1-4任何一项所述的化疗药物-低氧激活前药一体化前药或权利要求6-7任何一项所述的前药自组装纳米粒在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
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