CN104971044A - 一种米托蒽醌雌激素靶向peg修饰脂质体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗癌药物雌激素靶向PEG修饰脂质体制备方法和用途。该脂质体是通过以下方法制备得到的：将活化的雌酮合成为雌酮-聚乙二醇化磷脂，然后取40～80重量份的磷脂，5～45重量份的胆固醇，5～40重量份的聚乙二醇化磷脂溶于甲醇，旋转蒸发后加入硫酸铵水溶液，透析，加入0.5～10重量份的米托蒽醌孵育，透析，再加入0.1～20重量份的雌酮-聚乙二醇化磷脂孵育，过膜后得脂质体制剂。与现有技术相比，所获得雌激素靶向PEG修饰脂质体包封率高、粒径均一、药动学行为改善、抗肿瘤疗效增强、毒性降低；并且制备工艺简单，易于放大生产，有望成为癌症治疗的新型药物制剂。其用途在于靶向治疗乳腺癌、白血病等癌症。
Description
技术领域
本发明涉及药物脂质体领域，尤其涉及一种米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体及其应用。
背景技术
米托蒽醌在临床上是一种经典的化疗药物，化学结构属蒽醌类化合物，对乳腺癌、白血病、淋巴瘤、前列腺癌等具有抗肿瘤疗效，尤其是对难治性、顽固性乳腺癌和白血病疗效显著，近来又被用作免疫抑制剂而用于多发性硬化症的治疗中。由于其在临床应用过程中存在着骨髓抑制、剂量限制性心脏毒性、胃肠毒性以及脱发等严重毒副作用，限制了其临床应用和治疗效果。
脂质体作为药物载体用于肿瘤的化学治疗日渐成熟，作为药物载体具有如下优点：保护药物在循环系统中不被降解，降低药物在肾脏中的清除率，延长药物在体内代谢的半衰期，在机体内具有生物可降解性，不会对机体产生免疫反应及各种毒副作用等。目前已有药物脂质体制剂获得批准在临床上使用。
普通脂质体通过静脉系统给药后，在体循环代谢过程中被巨噬细胞识而主要分布在诸如肝、脾等网状内皮系统组织器官中，以至于不能有效到达药物所作用的靶组织或靶器官，制备长循环脂质体可改善上述药代动力学行为，长循环脂质体中的PEG化脂质体又被成为隐形脂质体或空间稳定脂质体，PEG作为一种极性分子，在代谢过程中减少了单核-巨噬系统对其摄取，从而延长了脂质体在体内的循环时间，进而增强了药物的生物利用度。
为了进一步提高药物的治疗效果并降低其毒性反应，近年来在普通脂质体或长循环脂质体表面链接能够主动靶向肿瘤的靶向配体，即配体靶向脂质体。它能够增加药物的溶解性，延长药物在体内的代谢时间，提高药物在靶组织中的浓度而提高药物的疗效，减少药物在非靶组织的蓄积而降低药物的毒副作用。
近年来研究表明，雌激素受体在多种肿瘤细胞中高表达，并且具有高度特异性，因此成为药物载体系统的重要作用靶点。有临床研究结果表明，子宫内膜癌雌激素膜受体表达阳性率为85.2％,子宫内膜正常组的阳性率仅为9.5％；在几种喉病变组织中,雌激素受体分布有显著差异，在不典型增生中仅20％阳性，在乳头状瘤中40％阳性，在喉癌中78％阳性；在胃癌组织中，雌激素受体阳性率为52％,而在慢性胃炎中无雌激素受体表达；在乳腺癌肿瘤组织中，雌激素受体表达达到70-80％，正常乳腺细胞仅表达15-25％；在慢性淋巴细胞白血病中，其表达率为73％；儿童急性淋巴细胞白血病患者的骨髓单核细胞雌激素受体的α和β型的阳性表达率为56.7％和76.7％，明显高于对照组的20％和6.7％；目前发现雌激素受体存在于人髓细胞白血病细胞(HL-60)的质膜上，它的表达伴随整个细胞周期；在上皮性卵巢癌中,雌激素受体的表达率为80％,显著高于良性卵巢肿瘤44.4％和正常卵巢组织的25％；正常大肠粘膜中雌激素受体阳性率为38.1％，相应癌组织的雌激素受体阳性率为71.4％；在非小细胞肺癌组织中，雌激素受体阳性表达率为69.7％,而在男性肺良性肿瘤组织及正常男性肺组织中无阳性表达；甲状腺癌中雌激素受体表达率为66.7％，甲状腺良性变化的患者雌激素受体表达为22.2％。
米托蒽醌脂质体目前所报道的都是常规脂质体制剂，原料昂贵，体内代谢时间短，肿瘤部位药物浓度低。因此本领域利用雌激素受体与其配体间的特异性高亲和力，在脂质体中载入特异性识别雌激素受体的片段和长效PEG分子，研制出一种具有长循环和肿瘤特异性靶向的米托蒽醌脂质体载药系统，这种载药系统的建立同时可以广泛携带临床上目前使用的多数亲水、亲脂及兼性化疗药物，并针对临床上多种高表达雌激素受体的恶性肿瘤进行治疗，具有广泛良好的应用前景。
发明内容
本发明提供一种雌激素受体靶向的抗癌药物PEG化脂质体制剂，及其制备方法，具有包封率高、载药量高、粒径分布均一、稳定性好等特征。其目的是有效运载药物到达肿瘤靶部位，延长药物体内循环时间，提高药物的治疗效果，降低药物的毒副作用。
本发明还公开了上述脂质体的制备方法，适用于工业化生产。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体，其制备原料包括米托蒽醌、磷脂、胆固醇、聚乙二醇化磷脂、雌酮-聚乙二醇化磷脂，所述雌酮-聚乙二醇化磷脂的结构如下所示：
其中，n＝12～228。
本发明的米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)雌酮活化酯的制备：按照(10～150)：(10～200)：(50～300)：(1～10)的摩尔比将雌酮、丁二酸酐、三乙胺及4-二甲氨基吡啶溶解在二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈或二氧六环中，室温下搅拌反应24～48小时，减压蒸干溶剂，冰水浴下加入适量蒸馏水并调节pH至1～5。静置后析出产物，干燥得雌酮活化酯，反应收率为50％～95％，反应式如下：
(2)雌酮-聚乙二醇化磷脂的合成：将上述雌酮活化酯、羟基苯并三唑(HOBT)与缩合剂，例如二环己基碳二亚胺(DCC)、羰基二咪唑(CDI)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)等以(1～20)：(1～20)：(1～20)的摩尔比溶于二氯甲烷，在室温下反应0.5～5h后加入与雌酮活化酯摩尔比为(1～10)：(1～10)的氨基聚乙二醇二硬脂酸磷脂酰乙醇胺，室温下反应5～20小时后滤除沉淀，溶液减压浓缩，加入适量乙醚沉淀，干燥得终产物，反应收率为40％～70％，反应式如下：
(3)硫酸铵梯度法制备米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体：
1)取40～80重量份的磷脂、5～45重量份的胆固醇、5～40重量份的聚乙二醇化磷脂溶于甲醇中，旋转蒸发除去有机溶剂，然后加入硫酸铵水溶液充分水化，透析，加入0.5～10重量份的米托蒽醌孵育后透析，再加入0.1～20重量份的雌酮-聚乙二醇化磷脂孵育，过膜后即得米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体制剂。
2)取40～80重量份的磷脂、5～45重量份的胆固醇、5～40重量份聚乙二醇化磷脂、0.1～20重量份的雌酮-聚乙二醇化磷脂溶于甲醇中，旋转蒸发除去有机溶剂，加入硫酸铵水溶液充分水化，透析，加入0.5～10重量份的米托蒽醌孵育后透析，过膜后即得米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体制剂。
(4)高压均质法制备米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体：
取40～80重量份的磷脂、5～45重量份的胆固醇、5～40重量份的聚乙二醇化磷脂及0.1～20重量份的雌酮-聚乙二醇化磷脂溶于二氯甲烷中，旋转蒸发除去有机溶剂，然后加入0.5～10重量份的米托蒽醌水溶液充分水化，高压均质后得米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体制剂。
(5)冷冻干燥法制备米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体：
取40～80重量份的磷脂、5～45重量份的胆固醇、5～40重量份的聚乙二醇化磷脂及0.1～20重量份的雌酮-聚乙二醇化磷脂溶解于乙醇中，冷冻干燥，然后加入到含有0.5～10重量份的米托蒽醌的水相，超声后形成乳白色脂质体悬液。
本发明的原料组分中,所述的磷脂选自中性磷脂、正电荷磷脂、负电荷磷脂中的一种或两种以上：氢化大豆卵磷脂、卵磷脂、大豆磷脂、磷脂酰丝氨酸、心磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、二油酰磷脂酰乙醇胺；所选合成磷脂是聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺或聚乙二醇-二肉豆蔻磷脂酰乙醇胺。
本发明的原料组分中,磷脂与胆固醇的质量比为(0.5～50)：1,米托蒽醌与磷脂的质量比为(0.01～1)：1，聚乙二醇化磷脂与磷脂的质量比为(0.05～1)：1,雌酮-聚乙二醇化磷脂与磷脂的质量比为(0.001～1)：1。
本发明的原料组分中,磷脂与胆固醇的质量比为(1～15)：1,米托蒽醌与磷脂的质量比为(0.05～0.5)：1，聚乙二醇化磷脂与磷脂的质量比为(0.1～0.5)：1,雌酮-聚乙二醇化磷脂与磷脂的质量比为(0.002～0.5)：1。
本发明雌酮-聚乙二醇化磷脂结构中的雌酮,可以是雌激素受体激动剂、雌激素受体抑制剂及雌激素受体各亚型的特异性抗体片段，其中包括：雌二醇(E2)、雌炔醇、雌三醇(E3)、乙烯雌酚、雌酮(ES)、异黄酮、莫昔芬、氟维司群、托瑞米芬、雌激素核受体或膜受体某一亚型的单克隆抗体等。其制备方法包括以下步骤：
(1)将雌激素受体的配体先进行羧酸化，之后分别通过化学合成方法共价连接到氨基聚乙二醇化磷脂分子上，生成长效靶向化合物。
(2)将雌激素受体的单克隆抗体巯基化后，通过化学合成的方法与马来酰亚胺-聚乙二醇化磷脂共价连接，生成雌激素受体的长效抗体靶向化合物。
本发明中脂质体包含的抗肿瘤药物是亲水、亲脂或兼性常规化疗药物、天然小分子药物、生物药物等的一种或多种，如：米托蒽醌、阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、环磷酰胺、柔红霉素、人参皂苷、齐墩果酸等。
本发明脂质体的制备方法有很多，例如：薄膜法、逆向蒸发法、硫酸铵梯度或pH梯度法、冷冻干燥法、乙醇注入法、高压均质法等。本发明所用制备方法可以从以上众多方法中选择。
本发明采用硫酸铵梯度法和冷冻干燥法制备的米托蒽醌雌激素受体靶向PEG修饰脂质体的包封率在90％以上；载药量大于8％；放置8小时内稳定性良好。
表1硫酸铵梯度法制备米托蒽醌雌激素受体靶向PEG修饰脂质体包封率、载药量及稳定性
表2冷冻干燥法制备米托蒽醌雌激素受体靶向PEG修饰脂质体的包封率、载药量及稳定性
本发明制备的米托蒽醌雌激素受体靶向PEG修饰脂质体粒径小、分布均一。硫酸铵梯度法制备的脂质体平均粒径为91.89nm，粒径范围为43.82nm-141.8nm；冷冻干燥法制备的脂质体平均粒径为88.47nm，粒径范围为50.75nm-164.2nm。
本发明制备的米托蒽醌雌激素受体靶向PEG修饰脂质体具有较好的MCF-7乳腺癌肿瘤细胞靶向性。
本发明制备的米托蒽醌雌激素受体靶向PEG修饰脂质体能够改善药代动力学行为。米托蒽醌雌激素受体靶向PEG修饰脂质体的半衰期是普通脂质体的17.68倍。
本发明制备的米托蒽醌雌激素受体靶向PEG修饰脂质体与常规制剂相比，对乳腺癌和白血病的抗肿瘤疗效显著高于化疗药物常规制剂和化疗药物长效脂质体制剂。
本发明制备的米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体，其特征在于：该脂质体可用于哺乳动物的肿瘤治疗，其中哺乳动物可以是人；脂质体制剂给药途径可以为口服给药、静脉给药、局部给药、腹膜内给药等，以静脉给药途径为最优；脂质体可以用于治疗子宫内膜癌、喉癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肠癌、肺癌、甲状腺癌、白血病等癌症。
附图说明
图1为雌酮的核磁共振氢谱图。
图2为雌酮活化酯的核磁共振氢谱图。
图3为雌酮活化酯的高分辨质谱图。
图4为聚乙二醇化磷脂的核磁共振氢谱图。
图5为雌酮-聚乙二醇化磷脂的核磁共振氢谱图。
图6为聚乙二醇化磷脂的高分辨质谱图。
图7为雌酮-聚乙二醇化磷脂的高分辨质谱图。
图8为米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体光镜照片图。
图9为米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体电镜照片图。
图10为硫酸铵梯度法制备米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体粒径分布图。
图11为冷冻干燥法制备米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体粒径分布图。
图12为米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体体外靶向MCF-7肿瘤细胞图。
图13为米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质的血浆药物浓度曲线图。
图14为米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质抗乳腺癌各组肿瘤照片图。
图15为米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质对荷乳腺癌裸鼠肿瘤生长曲线图。
图16为米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质对荷白血病裸鼠生存率图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：雌酮-聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的合成
1.雌酮活化酯的制备：称取雌酮108.00mg，丁二酸酐50.00mg，4-二甲氨基吡啶48.80mg和三乙胺40.48mg溶解在二氧六环中。在室温下搅拌过夜。二氧六环在真空状态下蒸发至干，残留物用二氯甲烷溶解，过滤。滤液进一步浓缩，用乙醚沉淀，干燥得到雌酮活化酯。
2.雌酮-聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的合成：将上述得到的雌酮活化酯92.50mg溶解于二氯甲烷和羟基苯并三唑6.75mg中。在冰浴下加入二环己基碳二亚胺51.55mg和氨基聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺137.50mg。将得到的溶液连续搅拌18小时，直到沉淀形成。将沉淀过滤，滤液在真空下浓缩。在浓缩物中加入乙醚，得到沉淀物，干燥收集。
实施例2：氟维司群-聚乙二醇化二棕榈酰磷脂酰乙醇胺的合成
1.氟维司群活化酯的制备：称取氟维司群1122.50mg，丁二酸酐370.00mg，三乙胺561.00mg及4-二甲氨基吡啶122.00mg溶于4ml二氧六环中，置于10ml圆底烧瓶磁力搅拌下25℃反应48h，减压蒸干后冰水浴下加水10mL用5mol/L的HCl溶液调节pH至1，静置后有沉淀析出，减压过滤得产物氟维司群活化酯。
2.氟维司群-聚乙二醇化二棕榈酰磷脂酰乙醇胺的合成：将上述氟维司群活化酯95.40mg溶于4ml二氯甲烷，加入羟基苯并三唑18.24mg和二环己基碳二亚胺21.90mg，室温下反应1h后加入氨基聚乙二醇化二棕榈酰磷脂酰乙醇胺54.00mg，室温下搅拌12～24h。滤除沉淀，滤液浓缩至0.5ml加入10ml乙醚。静置2h后产生沉淀，过滤即得氟维司群-聚乙二醇化二棕榈酰磷脂酰乙醇胺。
实施例3：米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体1
采用硫酸铵梯度法：取大豆磷脂200mg、胆固醇50mg、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺100mg溶于30ml甲醇中，旋转蒸发除去有机溶剂，然后加入250mM硫酸铵水溶液10ml于60℃水化0.5h。用探头超声波破碎仪超声处理5min后于5％葡萄糖溶液中透析4次。加入20mg米托蒽醌孵育1h后透析，再加入雌酮-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺10mg孵育，利用挤出机通过0.22μm聚碳酸酯膜挤出10次后即得米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体制剂。
实施例4：米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体2
采用硫酸铵梯度法：取氢化大豆卵磷脂200mg、胆固醇100mg、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺100mg、雌酮-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺5mg溶于50ml二氯甲烷中，旋转蒸发除去有机溶剂，然后加入300mM硫酸铵水溶液20ml于60℃水化1h。冰水浴中脂质体用探头超声波破碎仪超声处理10min后于生理盐水溶液中透析24h。加入20mg米托蒽醌孵育0.5h后透析，利用挤出机通过0.22μm聚碳酸酯膜挤出10次后即得米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体制剂。
实施例5：米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体3
高压均质法：取大豆卵磷脂18g、磷脂酰肌醇2g、胆固醇6g、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺6g及雌酮-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺0.6g溶于3L三氯甲烷中，旋转蒸发除去有机溶剂，然后加入1mg/ml的米托蒽醌水溶液1.5L，在50℃水化1h，用高压均质机循环均质10次即得米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体制剂。
实施例6：米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体4
冷冻干燥法：取大豆卵磷脂200mg、心磷脂40mg、胆固醇80mg、聚乙二醇化磷脂80mg及雌酮-聚乙二醇化磷脂8mg混匀后冻干。加入1mg/ml米托蒽醌水溶液15ml，充分混合后超声处理10min即得米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体制剂。
实施例7：实施例3和实施例6所得米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体的表征实验
采用透析法测定米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体的包封率和稳定性；采用动态光散射粒径分析仪测定米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体的粒径大小。结果表明，通过硫酸铵梯度法和冷冻干燥法制备的米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体的包封率分别为90.26％和92.15％，8小时内稳定性良好，平均粒径分别为91.89nm和88.47nm。
实施例8：实施例3所得米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体的靶向性实验
24孔板中预置无菌10mm2的圆形盖玻片，将表达雌激素受体的MCF-7乳腺癌细胞铺板，每孔8×104个细胞，每孔加入0.5mL培养液，在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养过夜，待细胞爬片后，分别将培养液换成含有游离盐酸米托蒽醌、普通米托蒽醌载药脂质体或雌激素受体靶向米托蒽醌长效脂质体的培养液0.5mL，于4h后按弃去培养液，用PBS洗涤3次，用Hoechst 33342(10μg/mL)孵育20min，将盖玻片装载于载玻片上5％仲甲醛固定，激光共聚焦显微镜观察细胞内米托蒽醌的含量和分布。
结果表明，在雌激素靶向米托蒽醌PEG修饰脂质体组，MCF-7细胞对米托蒽醌的摄取量显著高于普通米托蒽醌脂质体组及游离米托蒽醌组，普通米托蒽醌脂质体组显著高于游离米托蒽醌组。
实施例9：实施例3所得米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体的药效学实验
将雌激素受体阳性的HL60人白血病细胞复苏和培养扩增，尾静脉接种于SCID小鼠建立白血病动物模型。肿瘤接种24h之后，小鼠随机分为5组(n＝10)，分别通过尾静脉单剂量给药生理盐水、游离米托蒽醌、普通米托蒽醌脂质体、长效米托蒽醌脂质体或米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体。米托蒽醌剂量为10.0mg/kg。每天观察小鼠状态并称量体重，实验进行60天。记录实验动物死亡时间，计算动物生存率并绘制生存曲线。结果表明生理盐水组小鼠生存时间最短且与游离米托蒽醌组小鼠全部死亡。至第60天普通米托蒽醌脂质体组小鼠生存率为20％，长效米托蒽醌脂质体组为60％，雌激素受体靶向米托蒽醌长效脂质体组为80％；雌激素受体靶向米托蒽醌长效脂质体组小鼠体重无明显变化，提示米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体的抑瘤效果优于其他上述各种制剂，并且未呈现明显的毒副作用。
实施例10：实施例3所得米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体的药效学实验
首先进行雌激素受体阳性的MCF-7人乳腺癌细胞复苏和培养，将对数生长期的细胞(2×106个/0.2ml)皮下接种于雌性Balb/c裸鼠的乳腺区域。待肿瘤平均体积达到50mm3时，将小鼠随机分为5组(n＝6)。分别尾静脉注射给予生理盐水、游离米托蒽醌(1.25mg/kg)、普通米托蒽醌脂质体(2.5mg/kg)、长效米托蒽醌脂质体(2.5mg/kg)或米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体(2.5mg/kg)，隔天给药1次，共计给药4次。每周测定2次肿瘤体积并称量体重，于给药后21天处死各组小鼠。于给药后前5天，各组小鼠肿瘤体积无显著性差异，随着时间延长，模型组与游离米托蒽醌组小鼠肿瘤生长迅速，普通米托蒽醌脂质体及长效米托蒽醌脂质体组次之，米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体组小鼠肿瘤生长最慢，抑瘤率最高，且于实验结束时与其他各组均具有显著性差异；雌激素受体靶向米托蒽醌长效脂质体组小鼠体重下降程度显著低于游离米托蒽醌组和普通米托蒽醌脂质体，提示米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体抑瘤效果优于其他上述各种制剂，并且未呈现明显的毒副作用。
实施例11：实施例3所得米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体的毒性实验
每天测量实施例9及实施例10各组模型小鼠体重，并绘制体重变化曲线考察各米托蒽醌制剂的毒性。结果表明，于给药后，游离米托蒽醌组小鼠体重显著下降，普通米托蒽醌脂质体及长效米托蒽醌脂质体组小鼠体重有所降低，米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体组小鼠体重无明显变化，提示米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体制剂毒副作用小。
实施例12：实施例3所得米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体的药动学实验
建立MCF-7人乳腺癌小鼠模型，于平均肿瘤体积达到50-100mm3后随机分为3组，每40只。分别尾静脉注射给予游离米托蒽醌，普通米托蒽醌脂质体或米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体，米托蒽醌剂量为5mg/kg。于给药前和给药后5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时通过心脏穿刺的方式对不同组的4只小鼠进行取血置于肝素管中，血液样本在4℃下4000rpm离心10min以分离血浆。利用反向HPLC对血液样本中的米托蒽醌进行分析。
Claims (10)
1.一种米托蒽醌雌激素靶向的PEG修饰的脂质体，其特征在于所述米托蒽醌雌激素受体靶向PEG修饰脂质体的制备原料包括米托蒽醌、磷脂、胆固醇、聚乙二醇化磷脂、雌酮-聚乙二醇化磷脂，所述雌酮-聚乙二醇化磷脂的结构如下所示：
其中，n＝12～228。
2.如权利要求1所述的米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体，其特征在于所述米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体的制备包括如下步骤：
(1)雌酮活化酯的制备：按照(10～150)：(10～200)：(50～300)：(1～10)的摩尔比将雌酮、丁二酸酐、三乙胺及4-二甲氨基吡啶溶解在二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈或二氧六环中，室温下搅拌反应24～48小时，减压蒸干溶剂，冰水浴下加入适量蒸馏水并调节pH至1～5，静置后析出产物，干燥得雌酮活化酯，反应式如下：
(2)雌酮-聚乙二醇化磷脂的合成：将上述雌酮活化酯、羟基苯并三唑(HOBT)与缩合剂，例如二环己基碳二亚胺(DCC)、羰基二咪唑(CDI)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)等以(1～20)：(1～20)：(1～20)的摩尔比溶于二氯甲烷，在室温下反应0.5～5h后加入与雌酮活化酯摩尔比为(1～10)：(1～10)的氨基聚乙二醇二硬脂酸磷脂酰乙醇胺，室温下反应5～20小时后滤除沉淀，溶液减压浓缩，加入适量乙醚沉淀，干燥得终产物，反应式如下：
(3)硫酸铵梯度法制备米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体：
1)取40～80重量份磷脂、5～45重量份的胆固醇、5～40重量份聚乙二醇化磷脂溶于甲醇中，旋转蒸发除去有机溶剂，然后加入硫酸铵水溶液充分水化，透析，加入0.5～10重量份米托蒽醌孵育后透析，再加入0.1～20重量份雌酮-聚乙二醇化磷脂孵育，过膜后即得米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体制剂；
2)取40～80重量份的磷脂，5～45重量份的胆固醇，5～40重量份的聚乙二醇化磷脂及0.1～20重量份的雌酮-聚乙二醇化磷脂溶于甲醇，旋转蒸发后加入硫酸铵水溶液，透析，加入0.5～10重量份的米托蒽醌孵育，透析，过膜后即得脂质体制剂。
3.如权利要求1所述的米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体，其特征在于所述米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体的制备包括如下步骤：
(1)高压均质法制备米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体：
取40～80重量份的磷脂、5～45重量份的胆固醇、5～40重量份的聚乙二醇化磷脂及0.1～20重量份的雌酮-聚乙二醇化磷脂溶于二氯甲烷中，旋转蒸发除去有机溶剂，然后加入0.5～10重量份的米托蒽醌水溶液充分水化，高压均质后即得米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体制剂；
(2)冷冻干燥法制备米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体：
取40～80重量份的磷脂、5～45重量份的胆固醇、5～40重量份的聚乙二醇化磷脂及0.1～20重量份的雌酮-聚乙二醇化磷脂溶解于乙醇中，冷冻干燥，加入到含有0.5～10重量份的米托蒽醌的水相，超声后形成乳白色脂质体悬液。
4.如权利要求1～3所述的米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体，其特征在于：所述的磷脂选自中性磷脂、正电荷磷脂、负电荷磷脂中的一种或两种以上：氢化大豆卵磷脂、卵磷脂、大豆磷脂、磷脂酰丝氨酸、心磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、二油酰磷脂酰乙醇胺、2-二油酰基羟丙基-3-N,N,N-三甲铵、双十八烷基二甲基溴化铵；所选合成磷脂是聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺或聚乙二醇-二肉豆蔻磷脂酰乙醇胺。
5.如权利要求1～3所述的米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体，其特征在于：磷脂与胆固醇的质量比为(0.5～50)：1,米托蒽醌与磷脂的质量比为(0.01～1)：1，聚乙二醇化磷脂与磷脂的质量比为(0.05～1)：1,雌酮-聚乙二醇化磷脂与磷脂的质量比为(0.001～1)：1。
6.如权利要求5所述的米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体，其特征在于：磷脂与胆固醇的质量比为(1～15)：1,米托蒽醌与磷脂的质量比为(0.05～0.5)：1，聚乙二醇化磷脂与磷脂的质量比为(0.1～0.5)：1,雌酮-聚乙二醇化磷脂酯与磷脂的质量比为(0.002～0.5)：1。
7.如权利要求1～3所述的米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体，其特征在于：雌酮-聚乙二醇化磷脂结构中的雌酮可以是雌激素受体激动剂、雌激素受体抑制剂及雌激素受体各亚型的特异性抗体片段，其中包括：雌二醇(E2)、雌炔醇、雌三醇(E3)、乙烯雌酚、雌酮(ES)、异黄酮、他莫昔芬、氟维司群、托瑞米芬、雌激素核受体或膜受体某一亚型的单克隆抗体等，其制备方法包括以下步骤：
(1)将雌激素受体的配体先进行羧酸化，之后分别通过化学合成方法共价连接到氨基聚乙二醇化磷脂分子上，生成长效靶向化合物；
(2)将雌激素受体的单克隆抗体巯基化后，通过化学合成的方法与马来酰亚胺-聚乙二醇化磷脂共价连接，生成雌激素受体的长效抗体靶向化合物。
8.如权利要求1～7所述的米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体，其特征在于：脂质体包含的抗肿瘤药物可以是亲脂、亲水或兼性常规化疗药物、天然小分子药物、生物药物等的一种或多种，如：米托蒽醌、阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、环磷酰胺、柔红霉素、人参皂苷、齐墩果酸等。
9.如权利要求1～8所述的米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体，其特征在于：脂质体的制备的常用方法有很多，例如：薄膜法、逆向蒸发法、硫酸铵或pH梯度法、冷冻干燥法、乙醇注入法、高压均质法等，本发明所用的制备方法可以从以上众多方法中选择。
10.如权利要求1～8所述的米托蒽醌雌激素靶向PEG修饰脂质体，其特征在于：该脂质体可用于哺乳动物的肿瘤治疗，其中哺乳动物可以是人；脂质体制剂给药途径可以为口服给药、静脉给药、局部给药、腹膜内给药等，以静脉给药途径为最优；脂质体可以用于治疗子宫内膜癌、喉癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肠癌、肺癌、甲状腺癌、白血病等肿瘤，其抗肿瘤疗效显著高于化疗药物常规制剂和化疗药物长效脂质体制剂。
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