CN107936058A - 多西紫杉醇衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种多西紫杉醇衍生物及其制备方法和应用。本发明所述的多西紫杉醇衍生物为三苯基膦‑多西紫杉醇(TD)，通过将多西紫杉醇与4‑羧丁基三苯基溴化膦在EDC和DMAP的催化下通过酯化反应制得。多西紫杉醇和线粒体靶向基团三苯基膦通过酯键相连，其结构如下。本发明制备的多相紫杉醇衍生物，合成方法简单易行，为线粒体靶向药物递送提供了新的思路。将紫杉醇衍生物包载于脂质体中，制备方法简单易行，重现性好，稳定性高。PEG修饰的紫杉醇衍生物的脂质体可以增加其在血液中循环时间，同时由于pH敏感的断裂机制，其可以更好的在肿瘤部位释放抗肿瘤药物。

Description

多西紫杉醇衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种抗肿瘤药物的衍生物，具体而言，涉及一种多西紫杉醇衍生物及 其制备方法和应用。

背景技术

紫杉醇作为一种经典的抗肿瘤药物已经受到国内外科研工作者的广泛重视和应用，该类药物通过与微 管蛋白结合，促进微管的组装，同时可以阻止组装好的微管解离，从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂达到抗肿 瘤作用。多西紫杉醇作为二代紫杉烷类抗肿瘤药物相比于紫杉醇具有更强大的抗肿瘤活性被越来越多的应 用到抗肿瘤治疗的研究当中。

近些年来，越来越多的研究者发现将多西紫杉醇特异性递送至线粒体可以降低线粒体膜电位，打开线 粒体模转运通道，直接切断肿瘤细胞的能量供应从而导致肿瘤细胞凋亡。

脂质体作为一种经典的纳米药物递送系统由于其良好的生物相容性，较高的稳定性和制备方法的简易 已经被使用多年。同时，由于其拥有较小的粒径(～200nm)，可以通过EPR效应特异性的富集于肿瘤组 织而被肿瘤细胞摄取从而体现出其靶向性。

目前，线粒体靶向的药物传递系统多数为将具有线粒体靶向功能的官能团修饰于纳米制剂的表面从而 表现出线粒体靶向能力。然而，当制剂以内吞的形式进入细胞后，由于肿瘤细胞的酸性环境和内涵体(溶 酶体)中的复杂成分，大部分的制剂在溶酶体中即失去其原有的制剂结构，这将导致其靶向性的显著降低。 更为重要的是，由于正常细胞的线粒体本身呈现负电荷，大部分的线粒体靶向基团其靶向机理都是依赖于 电荷的相互作用，即大部分的靶向基团都呈现正电荷。将这些基团修饰在制剂表面就会显著增高制剂的zeta-电位。高的zeta电位会与血浆中的很多蛋白发生相互作用，同时其对非肿瘤细胞也会产生一定的细胞 毒性，因此其应用在一定层面上都会受到相应的限制。

发明内容

为了解决上述现有技术中的问题，本发明提供了一种多西紫杉醇衍生物。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明所述的多西紫杉醇衍生物为三苯基膦-多西紫杉醇(TD)，其通过将多西紫杉醇与4-羧丁基三苯 基溴化膦在EDC和DMAP的催化下通过酯化反应制得。多西紫杉醇和线粒体靶向基团三苯基膦通过酯键相 连，其结构如下：

本发明提供了三苯基膦-多西紫杉醇合成方法，包括如下步骤：

多西紫杉醇与4-羧丁基三苯基溴化膦在EDC和DMAP催化下氮气保护反应，反应后产物经分离纯化即 得。

具体地，多西紫杉醇与4-羧丁基三苯基溴化膦溶于无水DMSO中，并加入适量EDC和DMAP，在氮气保 护下室温搅拌3天，产物用重蒸水透析去除EDC和DMAP，二氯甲烷萃取3次，有机相饱和硫酸钠除水后经 分离纯化即得白色粉末。

本发明还提供了多西紫杉醇衍生物的脂质体，所述的脂质体包含非PEG化DTX脂质体，非PEG化TD 脂质体，PEG化TD脂质体，pH敏感PEG化TD脂质体。

所述的脂质体分别采用如下方法制备：

(1)非PEG化DTX脂质体的制备方法：称取一定量磷脂，胆固醇，DTX溶于适量二氯甲烷中，旋转蒸 发去除有机溶剂形成均匀薄膜，在一定温度下用双蒸水水化得到脂质体混悬液。将混悬液超声过膜得到脂 质体。其中磷脂、胆固醇、DTX的重量组成比为：1：0.3～0.5：0.05～0.15。

(2)非PEG化TD脂质体的制备方法：称取一定量磷脂，胆固醇，TD溶于适量二氯甲烷中，旋转蒸发 去除有机溶剂形成均匀薄膜，在一定温度下用双蒸水水化得到脂质体混悬液。将混悬液超声过膜得到脂质 体。其中磷脂、胆固醇、TD的重量组成比为：1：0.3～0.5：0.05～0.15。

(3)PEG化TD脂质体的制备方法：称取一定量磷脂，胆固醇，TD和聚乙二醇2000溶于适量二氯甲烷 中，旋转蒸发去除有机溶剂形成均匀薄膜，在一定温度下用双蒸水水化得到脂质体混悬液。将混悬液超声 过膜得到脂质体。其中磷脂、胆固醇、聚乙二醇2000、TD的重量组成比为：1：0.3～0.5：0.1～0.3： 0.05～0.15。

(4)pH敏感PEG化TD脂质体的制备方法：称取一定量磷脂，胆固醇，pH敏感聚乙二醇胆固醇衍生物 和TD溶于适量二氯甲烷中，旋转蒸发去除有机溶剂形成均匀薄膜，在一定温度下用双蒸水水化得到脂质 体混悬液。将混悬液超声过膜得到脂质体。其中磷脂、胆固醇、pH敏感聚乙二醇胆固醇衍生物和TD的重 量组成比为：1：0.3～0.5：0.1～0.3：0.05～0.15。

本发明还提供了pH敏感聚乙二醇-胆固醇衍生物的合成方法，其将胆固醇与双官能团聚乙二醇通过具 有pH敏感性的腙建相连，以达到在肿瘤酸性环境下迅速断裂的作用。其合成方法包括如下步骤：

n＝45

将对羟基苯甲醛溶解与四氢呋喃后加入N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)进行催化，冰浴条件下加入 胆固醇甲酰氯的二氯甲烷溶液，室温搅拌反应。将反应液倒入适量重蒸水中，用二氯甲烷进行反复萃取， 弃去水层，减压蒸馏除去二氯甲烷得到中间产物A。

将中间产物A溶于甲苯中，加入苯二胺，油浴加热120℃回流反应，减压蒸馏除甲苯，加入乙腈，低 温下析出固体，抽滤得固体化合物B。经分离纯化得到中间产物C。

将C与COOH-PEG₂₀₀₀-NH₂，HATU及DIPEA溶解于二氯甲烷中于室温进行反应。将反应液进行分离 纯化及得到目标产物。

本发明中，将具有线粒体靶向功能的基团三苯基膦(TPP)通过共价键与多西紫杉醇(DTX)连接(TD) 并将其包载于脂质体中。这样制备的脂质体即使制剂会在溶酶体内被降解，结构被破坏，TD的结构仍然 不会被破坏，从溶酶体中释放出的药物在细胞质中仍然具有较好的线粒体靶向功能，进而通过线粒体途径 进一步抑制肿瘤细胞的增殖，减少肿瘤组织的生长，从而达到抗肿瘤的作用。同时，将多西紫杉醇衍生物 包载于脂质体中可以降低靶向基团所带来的正电荷，也可显示出更小的非特异性毒性。本文制备的TD拥 有较高的脂溶性，其可轻易的包载于脂质体的双分子层中，同时也可包载于胶束的疏水内核中，从而极大 的提高了载药量和包封率，增加制剂的稳定性。

脂质体的结构与正常的生物膜具有较高的相似度，这就决定了脂质体容易被体循环中的各种物质降解 代谢从而减少其在体内的循环时间。为了解决这一问题，本发明用PEG修饰于脂质体表面从而达到长循环 作用。在PEG修饰后的脂质体虽然具备了长循环特性，但会存在一个较为严重的问题就是释放速率的下降。 PEG外壳会阻止药物从脂质体的内部释放至脂质体外从而减少释放速率。因此，本发明制备了一种具有pH 敏感的胆固醇-聚乙二醇衍生物。将胆固醇与聚乙二醇用具有pH敏感的腙建连接，在酸性条件下，腙建将会断裂，PEG外壳将从脂质体表面脱去，从而减少其对药物释放的影响。对于本发明，PEG修饰的另外一 个显著优势就是其可以在一定程度上屏蔽由TD所引入到脂质体表面的部分正电荷从而减少脂质体的非特 异性的相互作用。

本发明首次合成一种具有线粒体靶向功能的多西紫杉醇衍生物，并将其包载于脂质体中，这为线粒体 靶向的药物递送提供了一条新颖可行的设计思路。该发明的优势为：(1)将线粒体靶向基团直接与抗肿瘤 药物以共价键连接，克服了传统线粒体靶向药物递送系统在溶酶体内被降解而导致的靶向效率低的问题； (2)制备的脂质体粒径较小(约200nm)，其可以通过EPR效应特异性富集于肿瘤组织从而体现出靶向性； (3)由于脂质体表面易于进行PEG化修饰，可以有效避免网状内皮系统摄取和提高肿瘤细胞对脂质体的 摄取。同时，PEG外壳可以在一定程度上屏蔽由三苯基膦带来的正电荷，其在血液中也拥有更高测循环时 间。(5)通过在脂质体表面修饰pH敏感的PEG外壳，可有效降低PEG对药物释放速率的影响，达到肿瘤 组织的高效和特异性的药物释放，从而显著增加抗肿瘤作用。

本发明具有以下有益效果：(1)设计合成了一种新的具备线粒体靶向功能的多西紫杉醇衍生物，合成 方法简单易行，为线粒体靶向药物递送提供了新的思路。(2)将其包载于脂质体中，制备方法简单易行， 重现性好，稳定性高。(3)PEG修饰的脂质体可以增加其在血液中循环时间，同时由于pH敏感的断裂机制， 其可以更好的在肿瘤部位释放抗肿瘤药物。(4)所制备的脂质体相比于多西紫杉醇具有更为明显的抗肿瘤 活性。

附图说明

图1为本发明所述实例1的三苯基膦-多西紫杉醇衍生物(TD)的¹HNMR图谱。

图2为本发明所述实例1的三苯基膦-多西紫杉醇衍生物(TD)的高分辨质谱谱图。

图3为本发明所述实例2的pH敏感PEG-胆固醇衍生物的¹HNMR图谱。

图4为本发明所述实例3的pH敏感PEG化TD脂质体pH敏感性考察图。

图5为本发明所述实例4的pH敏感PEG化TD脂质体的透射电子显微镜图片。

图6为本发明所述实例6的不同脂质体在不同模拟介质中的体外释放实验。

图7为本发明所述实施例7的不同脂质体对人乳腺癌细胞MCF-7的细胞毒性研究。

图8为本发明所述实施例8的不同脂质体的在体抗肿瘤实验肿瘤体积变化图。

图9为本发明所述实施例8的不同脂质体的在体抗肿瘤实验小鼠体重变化图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围中。

实施例1

三苯基膦-多西紫杉醇衍生物(TD)的合成

将适量多西紫杉醇与4-羧丁基三苯基溴化膦溶于无水DMSO中，并加入适量EDC和DMAP，在氮气保护 下室温搅拌3天，产物用重蒸水透析去除EDC和DMAP，二氯甲烷萃取3次，有机相饱和硫酸钠除水经分离 纯化后即得白色粉末。

采用核磁共振测定¹H-NMR氢谱来确定实施例1中TD的结构，选用的溶剂为，氘代DMSO，结果如图1。 1.15ppm,1.78ppm,5.23ppm,8.13ppm归属与多西紫杉醇的特征峰。7.7-8.2ppm为三苯基膦的特征峰， 在TD的HNMR图谱中为看到4-羧丁基三苯基溴化膦中羧酸的特征峰，证明该化合物已经成功合成。

采用高分辨率质谱来测定实施例1中TD的分子量。结果如图2所示。预测的分子量为1152.501，该 结果与理论值相同，证明该化合物成功合成。

实施例2

pH敏感聚乙二醇-胆固醇衍生物的合成

将对羟基苯甲醛溶解于四氢呋喃后加入N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)进行催化，冰浴条件下加入 胆固醇甲酰氯的二氯甲烷溶液，室温搅拌反应。将反应液倒入适量重蒸水中，用二氯甲烷进行反复萃取， 弃去水层，减压蒸馏除去二氯甲烷得到中间产物A。

将中间产物A溶于甲苯中，加入苯二胺，油浴加热120℃回流反应，减压蒸馏除甲苯，加入乙腈，低 温下析出固体，抽滤得固体化合物B。经分离纯化得到中间产物C。

将C与COOH-PEG₂₀₀₀-NH₂，HATU及DIPEA溶解于二氯甲烷中于室温进行反应。将反应液进行分离纯化及 得到目标产物。

采用核磁共振测定¹H-NMR氢谱来确定实施例2中化合物的结构，溶剂为氘代氯仿。结果如图3所示。 δ7.50ppm为-CH＝N-的特征吸收峰；δ3.71ppm处即为PEG中-O-CH₂CH₂-的特征吸收峰；δ1.24ppm为-OH 特征吸收峰，δ5.35ppm处为-NH-的特征吸收峰。

实施例3

PEG化脂质体的制备

称取适量TD/DTX，磷脂，胆固醇，PEG衍生物于茄型烧瓶中，加入二氯甲烷溶解，置于旋转蒸发仪 上去除有机溶剂使其形成均匀薄膜。加入适量重蒸水水化得到混悬液，并将混悬液超声过膜，即得到PEG 化脂质体。

实施例4

pH敏感PEG的pH敏感性考察

上文中已经提到PEG的修饰可以在一定程度屏蔽由TD引入的正电荷。因此本发明通过测定脂质体的 zeta电位的变化来证明该衍生物的pH敏感性，具体操作如下。

将实施例3制备的脂质体置于pH 5.0的PBS中，在特定时间点取样测定脂质体的zeta电位。结果如 图4所示。pH敏感PEG化脂质体的电位由负值逐渐变化为正值，证明其在酸性条件下PEG外壳逐渐断裂， 暴露出脂质体的磷脂双分子层从而显示出正电性。而对照组测没有明显的zeta电位的改变。这说明该PEG 衍生物具有明显的pH敏感性。

实施例5

脂质体的形态观察

通过透射电子显微镜测定实施例中制备的脂质体的粒径和形状，结果如图5，脂质体呈现球形或类球 形，粒径在150nm左右。

实施例6

PEG化脂质体体外释放实验

以含0.5％(w:w)的吐温-80的PBS缓冲液为释放介质，考察PEG化脂质体的体外释放情况。将实施 例3制备的脂质体装入透析袋中，并置于释放介质中。在规定时间点取样，通过高效液相色谱法测定药物 浓度。调节释放介质pH，考察脂质体在不同pH介质中释放行为。结果如图6所示，在正常pH下，包载 DTX和TD的脂质体均表现出明显的缓释行为，呈现较低的体外释放速率。但是当释放介质的pH下降时， 可观察到脂质体的释放速率明显增加，这说明pH敏感的PEG外壳在酸性条件下迅速断裂，暴露出脂质体 内核，从而增加了药物的释放速率。由于肿瘤部位具有较低的pH，利用这一特点设计的pH响应性脂质体 可以在肿瘤部位特异性释放药物，增加药物在肿瘤部位的蓄积从而达到更高的抗肿瘤作用。

实施例7

脂质体的细胞毒性实验

采用MTT法考察不同脂质体对于人乳腺癌细胞MCF-7细胞的细胞毒性。将状态良好的细胞消化，用培 养液稀释至5000cells/mL的细胞密度，吹匀后将细胞接种至96孔板，每孔加入100μL培养液并置于 培养箱中培养过夜使贴壁。将培养液倾去后，加入设定浓度的脂质体混悬液，每个浓度设定3个副孔。对 照组则不加药，只加培养液。空白组只加PBS。将96孔板培养72h每孔加入20μL MTT溶液(5mg mL^-1) 继续培养6h。将孔内液体倾去，每孔加入100μL DMSO震荡溶解。最后将96孔板置于酶标仪中与490nm 处测定吸光度。

MTT结果如图7所示，相比于DTX溶液，合成的多西紫杉醇衍生物具有更高的细胞毒性，证明将多 西紫杉醇递送至线粒体会降低其线粒体膜电位，造成更高的毒性。将化疗药物包载于脂质体后，其可显著 增加肿瘤细胞对于抗肿瘤药物的摄取，增加药物在肿瘤细胞内的蓄积从而达到更强的抗肿瘤作用。

实施例8

脂质体载体抗肿瘤实验

将MCF-7细胞悬液接种于雌性裸鼠的腋窝下，待肿瘤生长至100-120mm³时分组，每组6只，共分为 3组(空白对照组，PSLP/DTX组和PSLP/TD组)并给予不同的药物治疗。所用的脂质体根据实施例3中 所述的方法制备。每隔一天给药一次，连续给药4次，记录肿瘤的体积和小鼠的体重。文中所用的给药计 量折合成多西紫杉醇的量为10mg kg^-1，对照组给予相同体积的生理盐水。

结果如图8所示，相比于对照组，两个制剂组均表现出明显的抗肿瘤活性，肿瘤体积生长速度明显低 于对照组，说明脂质体为载体的纳米药物递送系统能够通过EPR效应富集于肿瘤组织并且其pH敏感特性 可以使药物释放入细胞质发挥抗肿瘤作用。相比于DTX，TD显示出了更好的抗肿瘤活性，这和前面MTT 实验所述的结果一直，证明该多西紫杉醇衍生物可以通过线粒体途径抑制肿瘤细胞生长，为抗肿瘤的治疗 提供了新的思路。

体重变化的结果如图9所示，各个组别的体重均无明显的变化，说明将脂质体作为药物递送系统具有 更低的毒性，更高的选择性和靶向性。同时，pH敏感的药物释放机制也可以减少药物在非肿瘤区域的非 特异性释放，减少抗肿瘤药物带来的系统毒性。

Claims (10)

1.多西紫杉醇衍生物，其特征在于，将多西紫杉醇和线粒体靶向基团三苯基膦通过酯键相连，其结构如式1所示：

2.如权利要求1中多西紫杉醇衍生物的制备方法，其特征在于，将多西紫杉醇与4-羧丁基三苯基溴化膦在EDC和DMAP的催化下通过酯化反应制得。

3.如权利要求2中所述的多西紫杉醇衍生物的制备方法，其特征在于，将适量多西紫杉醇与4-羧丁基三苯基溴化膦溶于无水DMSO中，并加入适量EDC和DMAP，在氮气保护下室温搅拌3天，产物用重蒸水透析去除EDC和DMAP，二氯甲烷萃取3次，有机相饱和硫酸钠除水后经分离纯化即得白色粉末。

4.一种具有pH敏感性的聚乙二醇衍生物，其特征在于，将胆固醇与双官能团聚乙二醇通过具有pH敏感性的腙建相连，以达到在肿瘤酸性环境下迅速断裂的作用，其结构为：

其中，n＝45。

5.如权利要求4所述具有pH敏感性的聚乙二醇衍生物的制备方法，其特征在于，将对羟基苯甲醛溶解与四氢呋喃后加入N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)进行催化，冰浴条件下加入胆固醇甲酰氯的二氯甲烷溶液，室温搅拌反应，将反应液倒入适量重蒸水中，用二氯甲烷进行反复萃取，弃去水层，减压蒸馏除去二氯甲烷得到中间产物A；将中间产物A溶于甲苯中，加入苯二胺，油浴加热120℃回流反应，减压蒸馏除甲苯，加入乙腈，低温下析出固体，抽滤得固体化合物B；经分离纯化得到中间产物C；将C与COOH-PEG₂₀₀₀-NH₂，HATU及DIPEA溶解于二氯甲烷中于室温进行反应。将反应液进行分离纯化得到具有pH敏感性的聚乙二醇衍生物。

6.一种药物组合物，其特征在于，包含以下成分：权利要求1所述的多西紫杉醇衍生物，pH敏感聚乙二醇衍生物，磷脂和胆固醇；所述pH敏感聚乙二醇衍生物如式2所示：

其中，n＝45。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述的多西紫杉醇衍生物，pH敏感聚乙二醇衍生物，磷脂和胆固醇比例为1～5：5～15：15～25：3～10。

8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物剂型为脂质体。

9.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征是，所述的磷脂选自天然磷脂，半合成磷脂和全合成磷脂中的一种或几种的混合物。

10.一种如权利要求6所述药物组合物的制备方法，其特征在于,将一定量的多西紫杉醇衍生物，pH敏感聚乙二醇衍生物，磷脂和胆固醇溶于适量二氯甲烷中，旋转蒸发去除有机溶剂得到均匀薄膜，在一定温度下用双蒸水水化，将水化后的混悬液超声，过膜，即得到脂质体。