CN117486835A - 一种卡巴他赛前药自组装纳米制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种卡巴他赛前药自组装纳米制剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，涉及四种卡巴他赛前药及其自组装纳米粒的构建，具体涉及以三种不同的二硫键作为连接键，以9‑芴甲醇或环戊甲醇作为侧链，合成了四种不同的卡巴他赛前药并进一步制备了自组装纳米粒以及探究其在制备药物递送系统中的应用。通过将亚二硫基二乙酸，3,3'‑二硫代二丙酸或4,4'‑二硫代二丁酸成酸酐，然后与9‑芴甲醇或环戊甲醇成酯得到中间产物，然后中间产物再与卡巴他赛发生成酯反应即得卡巴他赛前药。通过一步纳米沉淀法得到卡巴他赛前药自组装纳米粒。所制备的前药自组装纳米粒能够在肿瘤部位快速释放母药，发挥其肿瘤杀伤作用，体现出优异的抗肿瘤效果。

Description

一种卡巴他赛前药自组装纳米制剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，涉及四种卡巴他赛前药及其自组装纳米制剂的制备方法及应用，具体涉及四种以不同位置二硫键为连接键，以9-芴甲醇或环戊甲醇为侧链的卡巴他赛前药及其自组装纳米制剂的制备及其在药物递送系统中的应用。
背景技术
卡巴他赛(CTX)是紫杉烷类家族的重要成员，现已有溶液剂上市并应用于临床治疗。相比于其它紫杉烷类药物，卡巴他赛对P-糖蛋白的亲和力较低，有效阻碍了药物外排，因而具更低的耐药风险。目前，卡巴他赛在临床上常与作用与泼尼松联用治疗治疗前列腺癌。且卡巴他赛对转移性去势抵抗性前列腺癌的患者也发挥了较高的治疗效果。总之，CTX是一种具有光明临床应用前景的化疗药物。
然而在临床应用中同时显示出了严重的毒副作用。一方面，由于其在体内分布不均匀，因此容易在肠道细胞中蓄积从而导致腹泻等胃肠道毒性。另一方面由于添加了大量的乙醇和吐温80增溶，造成患者耐受性差，大大制约了其广泛使用。而且游离药物在体内易被快速清除，且缺乏肿瘤靶向性，递送效率低下。这些缺点极大限制了卡巴他赛的临床应用。因此，如何减轻卡巴他赛毒副作用并提高其递送效率至关重要。
前药策略在减轻药物毒副作用方面效果显著，经过结构修饰以后，药物活性与毒性大大降低，并且通过引入靶部位特异性相应的连接键，使其能够在靶部位特异性释放药物，减轻对其他组织与器官的损伤。此外，近年来纳米药物递送系统备受关注。纳米递药系统可以改善药物的药代动力学，延长化疗药物的体内循环时间，提高药物的生物利用度和稳定。其中，有些纳米药物递送系统已被用于临床使用，如阿霉素脂质体紫杉醇胶束/>和紫杉醇白蛋白纳米粒/>等。这些传统的纳米递药系统一般通过非共价的物理包埋方式来对药物进行包载，因此存在一些缺点。例如：载体相关毒性、药物易泄露、载药量低(通常小于10％)等。
相比于传统纳米载体存在的不足，基于小分子前药的自组装纳米递送系统集前药策略与纳米递药技术为一体，具有明显的优势。具体而言，药物通过简单的化学修饰得到无活性或低药理活性的前体药物，进而改善其物理化学性质，甚至能够仅依靠分子相互作用在水溶液中发生自组装形成稳定均匀的纳米制剂，具有无需载体材料、载药量高、稳定性好、高肿瘤蓄积能力、毒副作用低以及肿瘤部位快速释药发挥药效等优势。
发明内容
为了解决卡巴他赛高毒性以及体内递送效率低等缺陷，本发明提供三种以不同位置二硫键为连接键，以9-芴甲醇或环戊甲醇为侧链，合成了四种不同卡巴他赛前药，并进一步通过一步纳米沉淀法制备无载体自组装纳米制剂，以及探究其在制备药物递送系统中的应用。本发明制备工艺非常简单，粒径较小且均匀，载药量高于40％，稳定性良好。体外实验表明，二硫键的引入能够大大提高前药在还原环境中的释放速率，发挥良好的细胞毒性效果。相比于溶液剂，自组装纳米制剂的细胞摄取效率更高。体内研究表明，前药自组装纳米粒的体内血液循环时间大大延长，肿瘤蓄积明显提高，抗肿瘤效果显著。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明提供一种具有肿瘤还原响应特性的卡巴他赛前药，以抗肿瘤治疗剂和具有共轭结构的基团或者环状基团通过肿瘤敏感连接键相连。
进一步地，所述的抗肿瘤治疗剂为含有活性羟基的抗癌治疗剂，选自卡巴他赛及其衍生物、蒽环类化合物或喜树碱类化合物，所述的肿瘤特异性响应的连接键包括二硫键、单硫键、三硫键、单硒键、二硒键、酯键或酰胺键，所述的具有共轭结构的基团的化合物为9-芴甲醇、2-(9-芴基)乙醇、9-芴乙酸，环状基团的化合物为环戊甲醇、环己甲醇、环庚甲醇。
具体地，本发明提供所述的卡巴他赛前药，以卡巴他赛作为模型药物，以9-芴甲醇(Fmoc)为侧链，分别通过(a)二硫代二乙酸，(b)3,3'-二硫代二丙酸，(c)4,4'-二硫代二丁酸相连；以卡巴他赛作为模型药物，以环戊甲醇(COPL)为侧链，通过(d)4,4'-二硫代二丁酸相连，其结构式如下：
进一步地，本发明提供所述的四种卡巴他赛前药的合成方法，包括如下步骤：
(1)分别将二硫代二乙酸、3,3’-二硫代二丙酸或4,4’-二硫代二丁酸通过乙酸酐脱水成酸酐；
(2)将得到的酸酐分别与9-芴甲醇(Fmoc)或环戊甲醇(COPL)成酯(发生酯化反应)，得到中间产物；
(3)将得到的中间产物分别与卡巴他赛(CTX)发生酯化反应，最终经过分离后得到终产物。
反应式如下：
进一步地，步骤(1)中，反应温度为15～60℃，时间为2-6小时。
进一步地，步骤(2)中，溶剂为二氯甲烷，酸酐与9-芴甲醇(Fmoc)或环戊甲醇(COPL)摩尔比为1:1～5:1，催化剂为4-二甲氨基吡啶(DMAP)，9-芴甲醇(Fmoc)或环戊甲醇(COPL)与催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)的摩尔比为1：0.05～0.8，优选为1：0.1；反应温度为20～50℃，优选为室温，时间为4～24小时，优选为过夜。
进一步地，步骤(3)中，溶剂为二氯甲烷，催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑(HOBt)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，卡巴他赛、中间产物、EDCI、HOBt与DMAP的摩尔比为1:0.2～5:0.5～4:0.5～4:0.05～0.8，优选为1:1:2:2:0.2；反应温度为15～40℃，优选为25℃，时间为24-60小时，优选为48-60小时。
具体地，所述的四种卡巴他赛前药的合成方法，包括如下步骤：
(1)将二硫代二乙酸、3,3’-二硫代二丙酸或4,4’-二硫代二丁酸溶解于过量乙酸酐中，氮气保护，室温下反应2-4小时，后除去多余的乙酸酐；
(2)将步骤(1)所得产物溶于二氯甲烷中，并加入9-芴甲醇或环戊甲醇，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)作为催化剂，室温条件下搅拌过夜，反应完毕后采用二氯甲烷-甲醇洗脱体系利用柱层析分离得到中间产物；
(3)将中间产物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑(HOBt)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，溶于无水二氯甲烷中，在冰浴下活化2-4小时，然后加入多西他赛，氮气保护，在25℃条件下反应48-60小时，所得产物经制备液相分离纯化。
本发明还提供了所述的卡巴他赛前药的自组装纳米制剂，所述的卡巴他赛前药纳米制剂可以是非PEG化的卡巴他赛前药纳米制剂、PEG修饰剂修饰的卡巴他赛前药纳米制剂或包载荧光物质或疏水性药物的卡巴他赛前药纳米制剂；所述的PEG修饰剂为TPGS(维生素E聚乙二醇琥珀酸酯)、PLGA-PEG(聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇)、PE-PEG(聚乙烯-聚乙二醇)、DSPE-PEG-AA(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-花生四烯酸)或DSPE-PEG(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)，所述的卡巴他赛前药与PEG修饰剂的重量比为90:10～50:50；所述的荧光物质或疏水性药物为香豆素-6、罗丹明、DiR、DiI、Cy-5和Cy-7中的至少一种，荧光物质或疏水性药物占卡巴他赛前药的重量分数为1％～30％。
进一步地，所述PEG修饰剂中PEG的分子量为200～4000。
本发明还提供了卡巴他赛前药前药自组装纳米制剂的制备方法：
将一定量的卡巴他赛前药或卡巴他赛前药和PEG修饰剂的混合物、或卡巴他赛前药与PEG修饰剂、荧光物质或疏水性药物的混合物溶解到适量无水乙醇中，在磁力搅拌器的搅拌下，将该无水乙醇溶液缓慢滴加到水中，前药可以自发地组装成粒径均匀的纳米粒。具体地，
(1)非PEG化的纳米粒的制备方法：将一定量的卡巴他赛前药溶解到适量无水乙醇中，在磁力搅拌器的搅拌下，将该无水乙醇溶液缓慢滴加到去离子水中，前药可以自发地组装成粒径均匀的纳米粒，采用减压旋转蒸发法除去制剂中的无水乙醇，得到不含有机溶剂的纳米制剂。
(2)PEG化的纳米粒的制备方法：将一定量的卡巴他赛前药和PEG修饰剂溶解到适量无水乙醇中，在磁力搅拌器的搅拌下，将该无水乙醇溶液缓慢滴加到去离子水中，前药可以组装成粒径均匀的PEG修饰的纳米粒，采用减压旋转蒸发法除去制剂中的无水乙醇，得到不含有机溶剂的PEG化的纳米粒，所述的PEG修饰剂为TPGS、PLGA-PEG、PE-PEG、DSPE-PEG-AA或DSPE-PEG。
(3)包载荧光物质或疏水性药物的小分子前药自组装纳米粒的制备方法：将一定量的荧光物质(例如香豆素-6、罗丹明、DiR、DiI、Cy-5或Cy-7)或疏水性药物(例如紫杉醇、多西他赛、SN-38、喜树碱)、卡巴他赛前药和PEG修饰剂溶解到适量的乙醇中，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。采用减压旋蒸除去制剂中的乙醇，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
本发明还提供所述的卡巴他赛前药或所述的卡巴他赛前药自组装纳米粒在药物传递系统中的应用。
本发明还提供所述的卡巴他赛前药或所述的卡巴他赛前药自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供所述的卡巴他赛前药或所述的卡巴他赛前药自组装纳米粒在注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)将卡巴他赛制备成前药，能够大大缓解卡巴他赛强烈的毒副作用，并进一步将其通过一步纳米沉淀法制备成自组装纳米制剂，能够避免载体材料以及助溶剂的使用，进一步减轻其毒副作用。(2)所述的纳米制剂通过一步纳米沉淀法制备，制备工艺极其简单，易于制剂的规模化生产；(3)纳米粒粒径小且均匀，通过PEG修饰能够延长药物在血液中的循环时间，易于通过EPR效应富集于肿瘤部位；(5)所述的前药引入了肿瘤特异性响应的二硫键，具有肿瘤还原敏感释药特性，能够实现在肿瘤部位细胞内高还原环境中实现特异性快速释放母药，发挥其肿瘤杀伤作用，体现出优异的抗肿瘤效果。
附图说明
图1为本发明实施例1中的卡巴他赛前药γ-Fmoc-SS-CTX质谱图及1HNMR谱图，其中A为质谱图，B为1HNMR谱图。
图2为本发明实施例1中的卡巴他赛前药γ-CPOL-SS-CTX质谱图及1HNMR谱图，其中A为质谱图，B为1HNMR谱图。
图3为本发明实施例1的卡巴他赛前药α-Fmoc-SS-CTX的质谱图及1HNMR谱图，其中A为质谱图，B为1HNMR谱图。
图4为本发明实施例1的卡巴他赛前药β-Fmoc-SS-CTX的质谱图及1HNMR谱图，其中A为质谱图，B为1HNMR谱图。
图5为本发明实施例2的非PEG化的γ-Fmoc-SS-CTX和γ-CPOL-SS-CTX前药自组装纳米粒的外观照片，其中a为γ-CPOL-SS-CTX，b为γ-Fmoc-SS-CTX。
图6为本发明实施例3的PEG修饰的三种卡巴前药自组装纳米粒的外观图片，其中a为α-Fmoc-SS-CTX，b为β-Fmoc-SS-CTX，c为γ-Fmoc-SS-CTX。
图7为本发明实施例3的PEG修饰的三种卡巴前药自组装纳米粒的电镜图。
图8为本发明实施例4的PEG修饰的前药自组装纳米粒的胶体稳定性考察，其中A为在PBS中的稳定性，B为在含10％胎牛血清的PBS中的稳定性。
图9为本发明实施例4的PEG修饰的前药自组装纳米粒的放置稳定性实验。
图10为本发明实施例5的PEG修饰的前药自组装纳米粒的体外释放实验，其中A为10mM DTT的条件，B为5mM DTT的条件，C为1mM DTT的条件，D为0mM DTT的条件。
图11为本发明实施例6的PEG修饰的前药自组装纳米粒的共聚焦观察细胞摄取情况，其中左图为0.5小时的细胞摄取情况，右图为2小时的细胞摄取情况，a为α-Fmoc-SS-CTX@C-6纳米粒，b为β-Fmoc-SS-CTX@C-6纳米粒，c为γ-Fmoc-SS-CTX@C-6纳米粒，d为C-6溶液剂。
图12为本发明实施例6的PEG修饰的前药自组装纳米粒的流式测定细胞摄取情况。
图13为本发明实施例7的PEG修饰的前药自组装纳米粒的细胞毒性，其中A为对4T1细胞的细胞毒性，B为对RM-1细胞的细胞毒性，C为对L02细胞的细胞毒性。
图14为本发明实施例8的PEG修饰的前药自组装纳米粒的药动学，其中A为释放的母药，B为前药，C为两者的总和。
图15为本发明实施例9的PEG修饰的前药自组装纳米粒的体内药物分布在体照片图，其中左图为在体荧光图片，右图为离体荧光图片，a为DiR/α-Fmoc-SS-CTX纳米粒,b为DiR/β-Fmoc-SS-CTX纳米粒,c为DiR/γ-Fmoc-SS-CTX纳米粒,d为DiR溶液剂，H:心，Li:肝，S:脾，L:肺，K:肾，T:肿瘤。
图16为本发明实施例9的PEG修饰的前药自组装纳米粒的体内药物分布荧光定量图。
图17为本发明实施例10的PEG修饰的前药自组装纳米粒的药效学，其中A为肿瘤生长曲线，B为荷瘤率，C为肿瘤图片，D为体重变化。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1：四种卡巴他赛前药的合成(γ-Fmoc-SS-CTX、γ-CPOL-SS-CTX、α-Fmoc-SS-CTX、β-Fmoc-SS-CTX)的合成
(1)γ-Fmoc-SS-CTX的合成
在100mL圆底烧瓶内加入4,4'-二硫代二丁酸(499.9mg,2.1mmol)，在5mL乙酸酐作为溶剂的条件下25℃反应2h。反应结束后将反应物进行减压蒸馏除去体系内乙酸酐，再将10mL甲苯分三次加入体系中，进行减压蒸馏干燥。将所得产物用25mL二氯甲烷溶解，并加入Fmoc(412.1mg,2.1mmol)和DMAP(25.1mg,0.21mmol)，25℃条件下搅拌反应12h，通过柱层析法分离纯化中间产物(230.0mg,产率46.0％)。
将中间产物(230.0mg,0.48mmol)、EDCI(184.0mg,0.96mmol)、HOBT(127.8mg,0.96mmol)和DMAP(5.9mg,0.048mmol)溶于30mL二氯甲烷中，冰水浴活化2h，活化完成后加入卡巴他赛(409.9mg,0.48mmol)，25℃搅拌48h，通过制备液相分离纯化终产物(120mg，产率29.1％)。上述反应均在氮气保护下进行。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例1中前药的结构，结果如图1所示。核磁氢谱解析结果分别如下：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.99-7.95(m,2H),7.90(d,J＝7.4Hz,2H),7.74(s,1H),7.69-7.63(m,4H),7.42(t,J＝7.3Hz,4H),7.38-7.31(m,4H),5.76(s,1H),5.36(d,J＝7.1Hz,1H),5.09(d,J＝8.1Hz,1H),4.68(s,1H),4.49(s,1H),4.45(d,J＝6.4Hz,2H),4.27(s,1H),4.01(s,2H),2.69(t,J＝7.1Hz,2H),2.59(t,J＝7.2Hz,2H),2.53(d,J＝7.3Hz,1H),2.41(t,J＝7.2Hz,2H),2.23(s,3H),1.92(t,J＝7.2Hz,2H),1.79(d,J＝6.6Hz,6H),1.50(s,3H),1.37(s,9H),1.23(s,2H),0.96(d,J＝9.8Hz,6H).
(2)γ-CPOL-SS-CTX的合成
在100mL圆底烧瓶内加入4,4'-二硫代二丁酸(518.30mg,2.2mmol)，在5mL乙酸酐作为溶剂的条件下25℃反应2h。反应结束后将反应物进行减压蒸馏除去体系内乙酸酐，再将10mL甲苯分三次加入体系中，进行减压蒸馏干燥。将所得产物用25mL二氯甲烷溶解，并加入CPOL(234.7μL,2.2mmol)和DMAP(26.8mg,0.22mmol)，25℃条件下搅拌反应12h，通过柱层析法分离纯化中间产物(270.0mg,产率52.0％)。
将中间产物(150.0mg,0.48mmol)、EDCI(184.0mg,0.96mmol)、HOBT(127.8mg,0.96mmol)和DMAP(6.1mg,0.05mmol)溶于30mL二氯甲烷中，冰水浴活化2h，活化完成后加入卡巴他赛(412.5mg,0.48mmol)，25℃搅拌48h，通过制备液相分离纯化终产物(90mg，产率21.8％)。上述反应均在氮气保护下进行。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例1中前药的结构，结果如图2所示。核磁氢谱解析结果分别如下：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.99-7.95(m,2H),7.89(d,J＝7.6Hz,3H),7.74(s,1H),7.66(t,J＝7.6Hz,4H),7.42(t,J＝7.4Hz,4H),7.38-7.31(m,4H),5.36(d,J＝7.1Hz,1H),5.09(d,J＝8.0Hz,1H),4.68(s,1H),4.49(s,1H),4.45(d,J＝6.4Hz,2H),4.27(s,1H),4.01(s,2H),2.69(t,J＝7.1Hz,2H),2.59(d,J＝7.2Hz,1H),2.53(d,J＝7.1Hz,1H),2.41(d,J＝7.2Hz,2H),2.23(s,3H),1.94-1.89(m,2H),1.79(d,J＝6.7Hz,6H),1.50(s,4H),1.37(s,9H),1.24(s,3H),0.96(d,J＝10.1Hz,7H).
(3)α-Fmoc-SS-CTX的合成
在100mL圆底烧瓶内加入2,2'-二硫代二乙酸(495.5mg,2.7mmol)，在5mL乙酸酐作为溶剂的条件下25℃反应2h。反应结束后将反应物进行减压蒸馏除去体系内乙酸酐，再将10mL甲苯分三次加入体系中，进行减压蒸馏干燥。将所得产物用25mL二氯甲烷溶解，并加入Fmoc(529.8mg,2.7mmol)和DMAP(11.7mg,0.1mmol)，25℃条件下搅拌反应12h，通过柱层析法分离纯化中间产物(230.0mg,产率46.0％)。
将中间产物(230.0mg,0.64mmol)、EDCI(245.4mg,1.28mmol)、HOBT(170.6mg,1.28mmol)和DMAP(7.8mg,0.064mol)溶于30mL二氯甲烷中，冰水浴活化2h，活化完成后加入卡巴他赛(546.5mg,0.64mmol)，25℃搅拌48h，通过制备液相分离纯化终产物(135.0mg，产率24.7％)。上述反应均在氮气保护下进行。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例1中前药的结构，结果如图图3所示。核磁氢谱解析结果分别如下：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.00-7.95(m,1H),7.90(dd,J＝11.9,7.5Hz,3H),7.73(s,1H),7.76-7.63(m,5H),7.46-7.39(m,4H),7.41-7.34(m,3H),7.37-7.28(m,2H),7.16(t,J＝8.0Hz,1H),5.81(t,J＝9.4Hz,1H),5.76(s,1H),5.07(t,J＝8.6Hz,1H),4.94(dd,J＝15.2,10.1Hz,1H),4.68(d,J＝16.0Hz,1H),4.48(s,1H),4.42(dd,J＝14.3,7.0Hz,2H),4.28(dt,J＝14.6,7.0Hz,1H),4.01(d,J＝5.0Hz,2H),3.85(d,J＝6.0Hz,3H),3.80(s,1H),3.16(s,2H),2.24(d,J＝10.1Hz,2H),1.80(d,J＝5.1Hz,4H),1.50(d,J＝6.5Hz,4H),1.37(d,J＝11.0Hz,9H),0.96(dd,J＝11.0,7.5Hz,4H).
(4)β-Fmoc-SS-CTX的合成
在100mL圆底烧瓶内加入3,3'-二硫代二丙酸(492.7mg,2.3mmol)，在5mL乙酸酐作为溶剂的条件下25℃反应2h。反应结束后将反应物进行减压蒸馏除去体系内乙酸酐，再将10mL甲苯分三次加入体系中，进行减压蒸馏干燥。将所得产物用25mL二氯甲烷溶解，并加入Fmoc(451.4mg,2.3mmol)和DMAP(28.1mg,0.23mmol)，25℃条件下搅拌反应12h，通过柱层析法分离纯化中间产物(200.0mg,产率40.6％)。
将中间产物(200.0mg,0.46mmol)、EDCI(176.3mg,0.92mmol)、HOBT(122.6mg,0.92mmol)和DMAP(5.6mg,0.046mmol)溶于30mL二氯甲烷中，冰水浴活化2h，活化完成后加入卡巴他赛(392.7mg,0.46mmol)，25℃搅拌48h，通过制备液相分离纯化终产物(95mg，产率11.7％)。上述反应均在氮气保护下进行。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例1中前药的结构，结果如图1图4所示。核磁氢谱解析结果分别如下：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.90(d,J＝7.5Hz,3H),7.69-7.64(m,4H),7.42(d,J＝6.9Hz,3H),7.34(d,J＝1.1Hz,1H),5.76(s,2H),5.09(s,1H),4.43(d,J＝6.8Hz,2H),4.01(s,2H),3.19(s,3H),2.92(s,1H),2.85(s,1H),2.75(s,1H),2.24(s,3H),1.81-1.78(m,4H),1.50(s,3H),1.37(s,9H),0.96(d,J＝9.1Hz,7H).
实施例2：非PEG化γ-Fmoc-SS-CTX和γ-CPOL-SS-CTX前药纳米粒的制备
分别精密称取实施例1制备的γ-Fmoc-SS-CTX前药以及γ-CPOL-SS-CTX前药各0.2mg，分别溶于100μL无水乙醇中，涡旋超声使前药充分溶解于有机溶剂中。在磁力搅拌下将无水乙醇溶解的前药缓慢滴加到1.0mL的去离子水中，滴加结束后继续搅拌3min。于25℃下，通过减压蒸馏除去纳米制剂中的有机溶剂，加入去离子水定容至1mL得前药浓度为0.2mg/mL非PEG化纳米粒。结果如图5所示，γ-CPOL-SS-CTX前药不能够自组装成纳米粒，滴入到水里后立马析出(图5a)，而γ-Fmoc-SS-CTX前药能够自组装成均匀的纳米粒(图5b)，粒径在152.40±5.46nm，上述结果证明了我们所引入的Fmoc基团能够促进前药的纳米组装。
实施例3：PEG化Fmoc前药纳米粒的制备
分别精密称取实施例1制备的α-Fmoc-SS-CTX、β-Fmoc-SS-CTX、γ-Fmoc-SS-CTX前药、以及DSPE-PEG2K(艾伟拓医药科技有限公司)各1.0mg，分别溶于100μL无水乙醇中，涡旋超声使其充分溶解，分别得到三种前药无水乙醇溶液，以及DSPE-PEG2K无水乙醇的混合溶液。向前药无水乙醇溶液中加入25.0μL DSPE-PEG2K无水乙醇溶液，混匀后将其在磁力搅拌下缓慢滴加入1.0mL去离子水中，滴加结束后继续搅拌3min。于25℃下，通过减压蒸馏除去纳米制剂中的有机溶剂，采用去离子水定容至1mL即得前药浓度为1mg/mL的PEG化前药纳米粒。
在前面的实验中，我们已经证明了前药中引入Fmoc基团能够促进前药的纳米组装，而不具有π共轭结构的γ-CPOL-SS-CTX前药无法自组装成稳定的纳米粒，因此，γ-CPOL-SS-CTX前药不再进行后续的研究。此外，为了提高纳米粒的稳定性，我们制备了PEG化的Fmoc前药纳米粒(α-Fmoc-SS-CTX NPs、β-Fmoc-SS-CTX NPs和γ-Fmoc-SS-CTX NPs)，以满足后续的体内外制剂评价，制剂的外观结果如图6所示：所有的前药在DSPE-PEG2K的修饰下，均能够组装成纳米粒。粒径测定结果如表1所示，三种纳米粒的粒径均在90nm左右，PDI均小于0.2，Zeta电位为-25mV左右，载药量均大于50％。
通过透射电子显微镜观察所制备的纳米粒的形态，结果如图7所示，前药纳米粒为均匀的球形颗粒。
表1.PEG修饰的卡巴他赛前药自组装纳米粒的粒径、PDI、Zeta电位和载药量
实施例4：PEG化卡巴他赛前药自组装纳米粒的胶体稳定性
将实施例3中制备的PEG化的卡巴他赛前药自组装纳米粒(α-Fmoc-SS-CTX NPs、β-Fmoc-SS-CTX NPs、γ-Fmoc-SS-CTX NPs)分别与PBS(pH 7.4)、或含10％胎牛血清的PBS(pH7.4)混合(PEG化的卡巴他赛前药自组装纳米粒与PBS(pH 7.4)或含10％胎牛血清的PBS(pH7.4)的比例为1:20,v/v)后，置于恒温振荡器中(37℃,120rpm)，分别在第0、2、4、6、8和12h测定粒径。如图8所示，3种前药自组装纳米粒在PBS(pH 7.4)以及含10％胎牛血清的PBS(pH7.4)中均具有较好的稳定性，粒径没有产生明显变化。此外，将三种卡巴他赛纳米粒(1mg/mL)储存在4℃条件下，考察其长期稳定性。结果如图9所示，3种卡巴他赛前药纳米粒的长期稳定性均良好，粒径没有明显变化。
实施例5：PEG化卡巴他赛前药自组装纳米粒的体外释放实验
以PBS(pH 7.4，含30％乙醇(v/v))为释放介质，在添加或不添加二硫苏糖醇(DTT)的条件下，考察CTX从前药纳米粒(α-Fmoc-SS-CTX NPs、β-Fmoc-SS-CTX NPs、γ-Fmoc-SS-CTX NPs)中的释放情况。具体实验方法如下：量取30mL释放介质加入到锥形瓶中，加入200μL实施例3中制备的PEG化的前药纳米粒(1mg/mL)，立即转移至37℃恒温振荡器中，在提前设定好的时间点取出样品，采用高效液相色谱(HPLC)测定从前药纳米粒中释放出的CTX的量。结果如图10所示，三种前药纳米粒释药速率顺序为：α-Fmoc-SS-CTX NPs＞γ-Fmoc-SS-CTXNPs＞β-Fmoc-SS-CTX NPs。当DTT浓度为5mM时，α-Fmoc-SS-CTX NPs在2h内释放了90％左右的CTX，γ-Fmoc-SS-CTX NPs在8h内释放了50％左右的CTX，β-Fmoc-SS-CTX NPs在8h内CTX释放最少，仅有20％左右。
实施例6：PEG化卡巴他赛前药自组装纳米粒的细胞摄取
香豆素6(C-6)标记的PEG化纳米粒的制备方法：分别精密称取α-Fmoc-SS-CTX、β-Fmoc-SS-CTX、γ-Fmoc-SS-CTX前药、C-6和DSPE-PEG2K各1.0mg，分别溶于100μL无水乙醇中，涡旋超声使其充分溶解，分别得到三种前药无水乙醇溶液，C-6无水乙醇溶液以及DSPE-PEG2K无水乙醇的混合溶液。向前药无水乙醇溶液中加入10.0μL C-6无水乙醇溶液和25.0μLDSPE-PEG2K无水乙醇溶液，混匀后将其在磁力搅拌下缓慢滴加入1.0mL去离子水中，滴加结束后继续搅拌3min。于25℃下，通过减压蒸馏除去纳米制剂中的有机溶剂，采用去离子水定容至1mL即得前药浓度为1mg/mL、C-6浓度为0.1mg/mL的C-6标记的PEG化前药纳米粒。
共聚焦定性观察细胞摄取情况：将状态良好的4T1细胞消化并制备成细胞悬液(2×104个/mL)，向24孔细胞培养板中提前放入无菌爬片，将上述细胞悬液加入孔中(500μL/孔)，置于细胞培养箱(37℃，5％ CO2)中使细胞充分贴壁(培养24h)。使用新鲜的培养基将香豆素溶液剂或香豆素标记的3种前药自组装纳米粒(1mg/mL)稀释10倍，C-6的浓度为200ng/mL。从细胞培养箱中取出24孔板，弃去旧的培养基，加入新鲜的含有香豆素C-6溶液剂或者C-6标记的前药纳米粒的培养基(1mL/孔)，按设定的时间(0.5h，2h)将上述细胞培养板置于细胞培养箱(37℃，5％ CO2)中孵育，孵育结束后取出细胞培养板，倒掉其中的培养基，用冰冷的PBS(pH 7.4)终止细胞摄取，并洗去残余的未摄取进入细胞的药物，加入组织固定液固定细胞，用PBS(pH 7.4)清洗3遍，后用Hoechst 33342染色细胞核，置于共聚焦显微镜下观察拍照。结果如图11所示，相比于溶液剂，细胞对于纳米粒的摄取具有更高的效率。而3种纳米粒的细胞摄取情况没有明显的区别，这是由于其具有相似的形状、粒径以及PEG化的外壳。
流式细胞术半定量测定细胞摄取情况：将状态良好的4T1细胞消化并制备成细胞悬液，加入到12孔板中，每孔105个细胞，后置于细胞培养箱中培养24h使其充分贴壁。使用新鲜的培养基将香豆素溶液或香豆素标记的3种前药自组装纳米粒稀释10倍，C-6的浓度为200ng/mL。将12孔板从细胞培养箱中取出，弃去旧的培养基，加入含药的新鲜培养基，重新放回培养箱中继续培养0.5h或者2h，后立即弃去含药培养基，使用PBS(pH 7.4)清洗掉未摄取进细胞的药物，每孔加入300μL胰蛋白酶，将细胞吹打下来，加入1mL培养基终止消化，4℃低温离心后弃去上述培养基，加入1mL PBS(pH 7.4)重悬细胞，立即用流式细胞仪测定细胞摄取情况。结果如图12所示，相比于溶液剂，细胞对于纳米粒的摄取具有更高的效率。而3种纳米粒的细胞摄取情况没有明显的区别，这是由于其具有相似的形状、粒径以及PEG化的外壳，与共聚焦的结果相一致。
实施例7：PEG化卡巴他赛前药自组装纳米粒的细胞毒性
以4T1细胞、RM-1细胞、L02细胞为细胞模型，采用MTT法测定比较了CTX溶液剂和实施例3中制备的3种PEG化的Fmoc-CTX前药(α-Fmoc-SS-CTX、β-Fmoc-SS-CTX、γ-Fmoc-SS-CTX)自组装纳米粒的抗肿瘤细胞增殖活性，具体步骤如下：细胞铺板：将状态良好，长满至80％左右的细胞转移至超净台中，弃去旧的培养基，加入PBS(pH 7.4)洗去残余的培养基以防止干扰胰酶消化，后加入1mL胰蛋白酶溶液(0.25％)消化细胞3min，立即使用移液枪将细胞轻轻吹打下来至悬浮分散状态，加入5mL培养基终止消化，并将含有胰蛋白酶的细胞悬液转移至15mL离心桶中，低速离心(1000rpm，5min)后弃去上清，加入适量的培养基制成细胞悬液(浓度为1×104个/mL)，然后将细胞悬液加入至96孔细胞培养板中(100μL/孔)，后置于细胞培养箱中培养适宜时间(12h)。加药及测定：使用新鲜的培养基将CTX溶液剂和3种Fmoc-CTX前药自组装纳米粒稀释成不同浓度的含药培养基备用。从细胞培养箱取出接种细胞的96孔板，弃去旧的培养基，加入含不同浓度药物的培养基，每孔加入200μL，加入不含药物的培养基作为对照孔，加入新鲜的培养基到不含细胞的孔中作为调零孔，每个浓度平行加入6个孔，96孔板的四周边缘孔加入无菌的PBS(pH 7.4)减少培养液的挥发，后置于细胞培养箱中孵育适宜时间(48h)，孵育结束后向孔中加入MTT溶液(25μL/孔)，放置在细胞培养箱中孵育4h。待孵育结束后取出细胞培养板弃去上清液，向孔中加入DMSO(200μL/孔)来溶解蓝紫色甲臜，溶解后通过酶标仪测定每个孔的吸光度值，以加不含药物的培养基的孔的吸光度值作为对照(100％存活)，计算加药孔的细胞存活率。实验结果如图13所示，在4T1(图13A)和RM-1(图13B)肿瘤细胞模型中，3种前药自组装纳米粒相比于CTX溶液剂显示出稍逊的抗肿瘤细胞增殖活性，这是由于前药必须在肿瘤细胞中释放出CTX母药才能很好地发挥抗肿瘤细胞增殖的作用。此外，我们发现不同的二硫键也会影响Fmoc-CTX前药自组装纳米粒的抗肿瘤细胞增殖活性，其活性大小顺序为：α-Fmoc-SS-CTX NPs>γ-Fmoc-SS-CTXNPs>β-Fmoc-SS-CTX NPs。这与体外释放实验中各种前药释放母药的速率是一致的，这也验证了我们的猜想，即前药释放母药的速率会直接影响到其抗肿瘤细胞增殖毒性。在L02(图13C)细胞模型中，3种前药自组装纳米粒的IC50值明显高于CTX溶液剂，显示出良好的减毒效果，这与我们预期的设计目标是一致的，即：将CTX设计成前药的形式能够大大减轻其全身毒性。
实施例8：PEG化卡巴他赛前药自组装纳米粒的药代动力学
将提前禁食12h的Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为4组，每组6只(体重为180～220g)。分别通过尾静脉注射CTX溶液剂和实施例3中制备的3种不同位置二硫键的Fmoc-CTX前药纳米粒(CTX等效给药剂量为5mg/kg)，在预设的时间点(分别为0.03、0.08、0.25、0.5、1、2、4、8和12h)，通过大鼠眼眶静脉丛取血0.5mL到EP管中，通过高速离心(10000rpm,5min)后取上层血清200μL到EP管中，立即置于-80℃超低温冰箱存放待测。
于1.1mL 12-联排EP管中，依次加入血浆50μL、内标50％乙腈-水溶液(地西泮，20.0ng/mL)20μL，振荡3min；向所有样品中加入乙腈150μL，振摇10min(摇板机设置值1200)，离心10min(水平转子4000rpm，4℃)；
CTX处理方法：转移50μL上清液至干净的96-孔板中，向CTX上清液中加入200μL水溶液，振摇混匀10min(摇板机设置值1200)，进样分析，进样量为5μL。
前药的处理方法：转移50μL上清液至干净的96-孔板中，向所有上清液中加入50μL90％乙腈-水溶液，振摇混匀10min(摇板机设置值1200)，进样分析，进样量为8μL。
通过液相色谱-质谱联用技术对采集的不同时间点血浆样品进行分析，测定血浆中的药物浓度，测定结果如图14所示。使用DAS软件计算了CTX溶液剂和3种PEG修饰的Fmoc-CTX前药纳米制剂的药动学相关参数(AUC0-12 h、t1/2、MRT)，结果如表2所示。可以看到，CTX溶液剂经尾静脉注射至大鼠体内会被快速地清除，因此不利于药物经过血液循环到达肿瘤部位，3种CTX前药纳米制剂显现出更高的AUC，为CTX的肿瘤靶向蓄积提供了保障。同时，不同二硫键对前药纳米制剂的药动学行为有显著的影响。与CTX溶液剂相比，3种CTX纳米制剂的总AUC(前药与母药的和)提高了：10.22倍(α-Fmoc-SS-CTX NPs)、83.94倍(β-Fmoc-SS-CTX NPs)、106.18倍(γ-Fmoc-SS-CTX NPs)。而前药纳米制剂释放出CTX的AUC h顺序是：α-Fmoc-SS-CTX NPs>β-Fmoc-SS-CTX NPs>γ-Fmoc-SS-CTX NPs。这说明前药纳米制剂的AUCh与其还原释药敏感性有关，药物释放得越快，前药纳米粒越不稳定，AUC越低。
表2.卡巴他赛溶液剂以及卡巴他赛前药纳米粒的药动学参数(n＝6).
实施例9：PEG化卡巴他赛前药自组装纳米粒的体内分布
DiR标记的PEG化纳米粒的制备方法：分别精密称取α-Fmoc-SS-CTX、β-Fmoc-SS-CTX、γ-Fmoc-SS-CTX前药、DiR和DSPE-PEG2K各1.0mg，分别溶于100μL无水乙醇中，涡旋超声使其充分溶解，分别得到三种前药无水乙醇溶液，DiR溶液以及DSPE-PEG2K无水乙醇的混合溶液。向前药无水乙醇溶液中加入10.0μL DiR无水乙醇溶液和25.0μL DSPE-PEG2K无水乙醇溶液，混匀后将其在磁力搅拌下缓慢滴加入1.0mL去离子水中，滴加结束后继续搅拌3min。于25℃下，通过减压蒸馏除去纳米制剂中的有机溶剂，采用去离子水定容至1mL即得前药浓度为1mg/mL，DiR浓度为0.1mg/mL的DiR标记的PEG化前药纳米粒。
取生长至80％～90％的4T1细胞，在超净台内将培养皿中的培养基倒掉后加入2mLPBS(pH 7.4)除去剩余的培养基后，向培养皿中加入1mL胰蛋白酶溶液(0.25％)对细胞进行3min消化，使用移液枪将贴壁细胞轻轻吹打下去，立即加入5mL培养液终止消化，转移到离心桶中，低速离心弃去含胰蛋白酶的培养基，加入适量PBS(pH 7.4)使细胞重悬(浓度5×107个细胞/mL)。为了避免小鼠的毛发对活体成像结果产生干扰，需用脱毛膏提前将BALB/C小鼠的背部提前脱毛。用胰岛素注射器吸取100μL上述细胞悬液注射入脱毛小鼠的右后侧腰背部皮下，继续饲养小鼠至肿瘤的体积长至500mm3左右，将小鼠随机分为4组，每组3只，通过尾部静脉分别注射DiR溶液剂或DiR/α-Fmoc-SS-CTX NPs、DiR/β-Fmoc-SS-CTX NPs、DiR/γ-Fmoc-SS-CTX NPs，DiR的等效给药剂量为1mg/kg，分别于2h、4h和6h将小鼠麻醉，通过小动物活体成像仪观察荧光在肿瘤部位的蓄积情况。最终于6h将小鼠通过脱臼处死，将主要器官和肿瘤分离出来，通过小动物活体成像仪记录荧光在不同器官及肿瘤部位的蓄积情况，并做定量分析。
结果如图15和16所示。可以看出，DiR溶液剂由于没有肿瘤靶向性且进入血液后很快被清除，因此主要分布在脾等器官，难以到达肿瘤部位，在肿瘤部位蓄积很少。而3种前药纳米粒由于具有延长的血液循环时间、更高的AUC以及基于EPR效应的肿瘤被动靶向性，在肿瘤部位具有较高的蓄积。且不同的前药纳米粒在体内分布情况也有所不同，DiR/γ-Fmoc-SS-CTX NPs由于在体内消除速率更慢，因此在肿瘤部位蓄积更高，这与药动结果保持一致。
实施例10：PEG化卡巴他赛前药自组装纳米粒的药效学
待BALB/C小鼠背部肿瘤长至100mm3左右时，将小鼠随机分为5组，每组5只，分别通过尾部静脉注射生理盐水、CTX溶液剂、实施例3制备的α-Fmoc-SS-CTX NPs，β-Fmoc-SS-CTXNPs，γ-Fmoc-SS-CTX NPs，给药前称量体重，CTX的给药剂量为5mg/kg，前药按CTX给药剂量等量换算。每隔两天给一次药，共9天(给药3次)，在每次给药之前称量小鼠体重并用游标卡尺测量肿瘤的长和宽。在治疗期结束后将小鼠进行脱臼处死，解剖小鼠分离出肿瘤并进行拍照和称重。
不同位置二硫键的Fmoc-CTX前药纳米粒在4T1荷瘤小鼠模型中的药效结果如图17所示：由于生理盐水无任何治疗作用，生理盐水组中的肿瘤细胞无法被抑制，肿瘤体积迅速增大。尽管在CTX溶液剂组，肿瘤的生长受到一定的抑制作用，但是依旧表现出相当大的小鼠毒副作用，CTX溶液剂组的小鼠体重在第九天下降了治疗前体重的20％左右，但3种前药纳米粒组小鼠体重并无明显变化。
此外，3种Fmoc-CTX前药纳米粒也展现出不同的抗肿瘤效果：γ-Fmoc-SS-CTX NPs＞α-Fmoc-SS-CTX NPs＞β-Fmoc-SS-CTX NPs。γ-CTX-SS-Fmoc前药在肿瘤部位蓄积最多，并且具有更大的AUC，因此展现出最强的抗肿瘤效果，而β-CTX-SS-Fmoc NPs则显示出最差的抗肿瘤效果。

Claims (10)

1.卡巴他赛前药，其特征在于，以抗肿瘤治疗剂和具有共轭结构的基团或者环状基团通过肿瘤敏感连接键相连。
2.如权利要求1所述的卡巴他赛前药，其特征在于：所述的抗肿瘤治疗剂为含有活性羟基的抗癌治疗剂，选自卡巴他赛及其衍生物、蒽环类化合物或喜树碱类化合物，所述的肿瘤特异性响应的连接键包括二硫键、单硫键、三硫键、单硒键、二硒键、酯键或酰胺键，所述的具有共轭结构的基团的化合物为9-芴甲醇、2-(9-芴基)乙醇、9-芴乙酸，环状基团的化合物为环戊甲醇、环己甲醇、环庚甲醇。
3.如权利要求1或2所述的卡巴他赛前药，其特征在于，其结构式为如下a-d中的一种：
4.如权利要求3所述的卡巴他赛前药的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：首先将亚二硫基二乙酸、3,3'-二硫代二丙酸或4-4'-二硫代二丁酸通过乙酸酐脱水成酸酐，然后将其与9-芴甲醇或环戊甲醇成酯得到中间产物；中间产物再与卡巴他赛发生成酯反应，得到卡巴他赛前药；
优选的，在亚二硫基二乙酸、3,3'-二硫代二丙酸或4-4'-二硫代二丁酸通过乙酸酐脱水成酸酐反应中，反应温度为15～60℃，时间为2-6小时；
在酸酐与9-芴甲醇或环戊甲醇反应中，酸酐与9-芴甲醇或环戊甲醇的摩尔比为1:1～5:1，催化剂为4-二甲氨基吡啶，9-芴甲醇或环戊甲醇与催化剂4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：0.05～0.8，反应温度为20～50℃，时间为4～24小时；
在中间产物与卡巴他赛发生成酯反应中，溶剂为二氯甲烷，催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和4-二甲氨基吡啶，卡巴他赛、中间产物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:0.2～5:0.5～4:0.5～4:0.05～0.8，反应温度为15～40℃，时间为24-60小时。
5.权利要求1或2所述的卡巴他赛前药的自组装纳米粒，其特征在于，所述的自组装纳米粒为非PEG化的卡巴他赛前药纳米粒、PEG修饰剂修饰的卡巴他赛前药纳米粒、或包载荧光物质或疏水性药物的卡巴他赛前药自组装纳米粒。
6.如权利要求5所述的卡巴他赛前药自组装纳米粒的制备方法，其特征在于，其制备过程如下：
将卡巴他赛前药、或卡巴他赛前药与PEG修饰剂、或卡巴他赛前药与PEG修饰剂、荧光物质或疏水性药物溶解到无水乙醇中，得到无水乙醇溶液，搅拌下，将无水乙醇溶液滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒，最后，采用减压蒸馏的方法除去制剂中的无水乙醇，得到不含任何有机溶剂的纳米制剂。
7.根据权利要求6所述的的制备方法，其特征在于，所述的PEG修饰剂为TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG、PE-PEG和DSPE-PEG-AA中的至少一种，卡巴他赛前药与PEG修饰剂的重量比为90:10～50:50；所述的荧光物质或疏水性药物为香豆素-6、罗丹明、DiR、DiI、Cy-5和Cy-7中的至少一种，荧光物质或疏水性药物占卡巴他赛前药的重量分数为1％～30％。
8.权利要求1-3任何一项所述的卡巴他赛前药或权利要求5所述的卡巴他赛前药自组装纳米粒在药物传递系统中的应用。
9.权利要求1-3任何一项所述的卡巴他赛前药或权利要求5所述的卡巴他赛前药自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.权利要求1-3任何一项所述的卡巴他赛前药或权利要求5所述的卡巴他赛前药自组装纳米粒在注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
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