CN109402177A - 一种适用于外源基因转染的纳米载体材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种可用于细胞转染的阳离子型纳米材料及其制备方法，本发明首先利用高分子交联、纳米自组装法，制备出具有高效转染效率的阳离子纳米材料；其次利用DNA电泳检测转染材料携载质粒DNA的能力；最后利用倒置荧光显微镜及流式细胞仪检测转染材料的转染效率。该转染材料不但可直接瞬转细胞，还可以作为细胞稳转的载体，尤其是有血清条件下的转染能力，可取得更好的转染效果；且其转染效率可以由温度来调节。本发明获得的纳米转染材料实现了不同真核细胞的瞬转和稳转，可替代病毒载体转染，增加了外源基因转染的生物安全性，应用前景广阔。

Description

一种适用于外源基因转染的纳米载体材料及其制备方法
技术领域
本发明属于细胞分子生物学领域以及纳米生物学领域，特别涉及一种适用于外源基因转染真核细胞的纳米载体材料及其制备方法。
背景技术
自从人类基因图谱绘制完成后，人类即进入了后基因组时代。随着近年来基因研究的不断深入，基因编辑与细胞改造成为了生命时代的主旋律，而基因转染技术是研究该目的基因在细胞内表达研究的主要手段。基因转染技术就是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达(Transfection,at the US National Library ofMedicine Medical Subject Headings(MeSH),2011,Tree Number:E05.393.350.810)。这种技术不但革新了生命科学和医学中许多基本问题的研究，也推动了诊断和治疗方面的分子技术发展，并使基因治疗成为可能。
目前基因转染技术已广泛用于生命科学中的基因结构和功能分析、生物医药、基因治疗与细胞免疫治疗等研究领域。随着今后基因编辑技术的迅速发展，基因转染技术具有巨大的应用前景，目前常用的基因转染方法主要分为病毒转染和非病毒转染，其中病毒转染主要包括腺病毒转染和慢病毒转染(Kamimura K,Suda T,Zhang G,Liu D,Advancesin Gene Delivery Systems,Pharm Med,2011,25(5):293-306；Nimesh S,HalappanavarS,Kaushik NK,Kumar P,Advances in Gene Delivery Systems,BioMed ResearchInternational，2015，DOI:10.1155/2015/610342)。非病毒转染主要包括阳离子脂质体、阳离子型共聚物、电穿孔、显微注射法等(Saul JM,Linnes MP,Ratner BD,Giachelli CM,PunSH,Delivery of non-viral gene carriers from sphere-templated fibrin scaffoldsfor sustained transgene expression,Biomaterials,2007,28(31):4705–16.)。
传统的阳离子脂质体的转染效率相对较低，有待提高，虽然病毒转染效率很高，但存在很大的生物安全性，而电转转染效率也较高但对细胞的损伤很大，为此开发一种新型的安全高效低毒的转染试剂是非常必要的。尤其目前在生物医药开发，基因治疗和细胞免疫治疗领域，国家食品药品监督管理局提出了更高的质量安全标准。当前生物医药、卫生领域在竞争激烈，病毒载体虽然转染效率很高，但其应用安全性上一直以来受到质疑，目前还没有定论，并且在医药审批方面要求非常严格，所以其限制了病毒载体的应用。本专利技术可有效替代病毒等传统载体，提高生物安全性，从助力提升我国医药的健康发展。
本专利通过高分子交联纳米自组装方法提供了一种阳离子型纳米转染材料，可作为有效的基因转染载体，其理化特性稳定、生物相容性好，具有携载较多质粒DNA的能力。该纳米材料不但可作为真核细胞的优良外源基因导入载体，同时也替代了病毒载体，提高了细胞基因转染的安全性，具有良好的发展前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明的目的在于提供一种用于基因高效转染的阳离子型纳米载体材料，从而实现体外真核细胞高效率的瞬转和稳转，替代病毒载体，提高细胞基因转染的安全性。
本发明的技术方案
本发明采用的主要技术方案是，利用交联剂，通过高分子交联以及纳米自组装技术获得纳米转染材料。该技术方案通过改变交联剂的量，进而控制阳离子型高分子的交联程度。而且该纳米载体由于其合成工艺简单而可以在工业生产中大量得到，并可得到了广泛的应用，本发明的制备过程为常温常压、易于操作、具有很好的实用价值。
在本发明的第一方面，提供了一种纳米转染载体，其特征在于，所述纳米转染载体包含阳离子高分子材料和交联剂。
优选地，所述纳米转染载体以所述阳离子高分子材料作为底物，经分子交联及纳米自组装获得。
优选地，所述阳离子高分子材料是脂质体、树枝状聚合物、阳离子聚合物。
更优选地，所述阳离子高分子材料是聚赖氨酸、线性和分枝聚乙烯亚胺、聚酰胺基胺。
应该理解，本领域普通技术人员根据本发明的描述能选用任何其他合适的阳离子高分子材料并取得本发明描述的技术效果，因此，本发明的阳离子高分子材料并限于上述所列的阳离子高分子材料。
优选地，所述交联剂为3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯。
应该理解，本领域普通技术人员根据本发明的描述能选用任何其他合适的交联剂并取得本发明描述的技术效果，因此，本发明的交联剂并限于上述所列的交联剂。
优选地，所述阳离子高分子材料和所述交联剂的摩尔比为1:0.1-1:100。
更优选地，所述阳离子高分子材料和所述交联剂的摩尔比为1:1。
在本发明的第二方面，提供了一种转染质粒DNA的方法，其特征在于，所述方法利用本发明的纳米转染载体转染质粒DNA。
优选地，所述转染是瞬时转染或稳定转染。
优选地，所述转染的对象是真核细胞。
在本发明的第三方面，提供了一种制备如本发明所述的纳米转染载体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
A、通过分子交联法制备纳米转染载体前体；
B、利用纳米自组装法制备纳米转染载体。
优选的，所述的步骤A为：取所述阳离子高分子材料于水浴中搅拌；通氮气，滴加所述交联剂，继续搅拌。
优选的，所述的步骤B为：取透析袋，将步骤A所得到的纳米转染载体前体转移到透析袋中，用去离子水透析，回收。
优选的，在所述步骤A之前，对交联前的体系：聚合高分子溶液、去离子水、DMSO进行超声处理10-30分钟，功率范围75-150KW。
优选的，所述步骤A中，阳离子高分子材料的使用浓度范围为0.1-100g/L，优先选择50mg/mL。
优选的，所述步骤B中，透析袋分子量为1KD、3KD、5KD、10KD、25KD或75KD。
更优选地，透析袋分子量为25KD。
优选的，所述步骤B中，透析时间为12-48h。
优选的，所述步骤B中透析次数为2-3次，即每6小时、8小时或12小时更换一次去离子水。
本发明的有益效果
本发明的纳米转染材料本身不仅可以实现对真核细胞的瞬时转染和稳定转染，还可以替代病毒载体的使用，提高基因转染的生物安全性。因此本发明的制备方法将拓展基于外源基因导入真核细胞的方法上的应用范围。
本发明中优先使用采用廉价易得的阳离子高分子聚合物为主体材料，通过交联剂形成球状纳米材料。另外通过控制交联剂的使用量控制纳米材料尺寸。从而进一步提高纳米材料的生物相容性以及真核细胞基因转染效果。
所述的纳米转染载体，其特征在于该载体对质粒DNA的转染具有温度敏感性，且转染效率随温度升高明显提高达2左右；且其特征在于该载体对质粒DNA的转染具有血清稳定性，能够在有血清或者蛋白的溶液中转染，且转染效率不变。
为对基于高效转染的阳离子型纳米材料的生物相容性评价及真核细胞转染效果研究，本专利进行全面研究：主要包括通过分ALV-DLS测试了粒径分布，马尔文检测了其Zeta电位，透射电镜观察了其形貌，通过CCK-8评价了其细胞增殖抑制-毒性，琼脂糖凝胶电泳分析了其携载外源DNA的能力，通过荧光显微镜观察了其细胞转染效果，通过流式细胞仪检测细胞转染效率。
(1)ALV-DLS测试结果
ALV-DLS测试结果表明所制备的阳离子型纳米材料颗粒大小约200nm。图2为阳离子型纳米转染材料的粒径分布图。
(2)Zeta电位检测
阳离子型纳米转染材料各取0.01mL，用1mL 18.2Ω的超纯水进行重悬，混合均匀。上机检测阳离子型纳米材料的Zeta电位。见图3，结果表面该纳米载体呈现正电性。
(3)电镜测试结果
用透射电镜观察阳离子型纳米材料的形态，结果如图4，从图中可以发现，阳离子型纳米材料的形状为球形。
(4)琼脂糖凝胶电泳分析了其携载外源DNA的能力。结果如图5，表明获得的阳离子型纳米转染材料具有很高的携载质粒DNA的能力。
(5)CCK-8细胞增殖抑制分析
用正常细胞293T来研究阳离子型纳米转染材料的细胞相容性和毒性评价。将含不同浓度(0、1、2、4、6、8、10μg/mL)的阳离子型纳米材料分别与293T细胞共培养24h后，用CCK-8增殖抑制检测试剂盒检测其对正常细胞的毒性，参见图6；随后通过倒置显微镜观察纳米转染材料对细胞的影响，参见图7。从图中可以看出，相对于用PBS处理的对照组细胞，阳离子型纳米转染材料在一定浓度范围内对正常细胞具有一定的增殖抑制影响，但无细胞毒性。
(5)纳米材料携载不同量的质粒DNA(即不同的N/P比)情况下观察其转染效果，结果如图8表明阳离子型纳米转染材料在N/P为15:1时效率较高，所以本实施方案优先考虑的N/P比范围为1-50:1。
(6)通过荧光显微镜观察了其细胞转染效果，结果如图9表明阳离子型纳米转染材料在有血清和无血清条件下都有较高的转染效率，优先考虑无血清转染。
(7)通过荧光显微镜观察细胞转染效果和流式细胞仪检测细胞转染效率，结果见图10、11，相对于lipo3000转染试剂，本专利产品具有更高的转染效率和效果。
(8)通过荧光显微镜观察不同分子量聚合物纳米载体的转染效果，结果见图12，结果表明不同分子量的量聚合物纳米载体都有一定的转染效果。
(9)通过荧光显微镜观察纳米转染材料在不同细胞中的转染效果，结果见图13，结果显示该纳米转染试剂具有良好的转染效果，不仅能应用于正常细胞，同对肿瘤细胞、免疫细胞方面也能得到应用。
本发明通过利用化学交联法，以阳离子高分子材料作为底物，在交联剂催化交联反应下，形成纳米转染载体。通过其有效携载外源质粒DNA的能力，可以实现对真核细胞的瞬时转染和稳定转染。
(1)本发明制备过程简单，所有材料价廉易得，实验条件为常温常压，易于操作，所采用的制备程序可用于制备其它基于该阳离子型有机的高分子合成，具有很好的实用价值；
(2)本发明实现了将外源基因瞬时和稳定导入真核细胞，同时也替代了病毒载体，提高了细胞基因转染的安全性，具有良好的发展前景。
附图说明
图1为本发明制备的纳米转染材料合成路线示意图。
图2为利用ALV-DLS光散射仪检测纳米转染材料的粒径大小分布图。
图3为利用Zeta电位仪检测纳米转染材料的表面电势结果。
图4为利用透射电镜表征纳米转染材料的形貌图。
图5为利用琼脂糖凝胶检测纳米转染材料携载DNA的能力。
图6为利用cck-8评价纳米转染材料的细胞毒性。
图7为利用倒置显微镜观察纳米转染材料对细胞的影响。
图8为纳米转染试剂携载不同量质粒(不同的N/P比)的转染效果。
图9为利用倒置荧光显微镜观察在293T细胞中，纳米转染材料在有、无血清条件下转染质粒EGFP的效果。
图10为利用倒置荧光显微镜观察293T细胞中，纳米转染材料转染质粒EGFP的转染效果。
图11为利用流式细胞仪检测293T细胞中，纳米转染材料转染质粒EGFP的转染效率。
图12为不同分子量聚合物纳米载体转染效果。
图13为纳米转染试剂在不同细胞系的转染效果。
图14为纳米转染试剂在不同温度下的转染效果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例中所用的各种试剂和仪器设备均是本领域技术人员所熟知的，并可通过商业渠道购买得到或可由本领域技术人员制备得到。
本发明的制备高效转染的阳离子型纳米材料的方法包括以下步骤：
A、通过化学交联法制备纳米载体前体；
B、利用纳米自组装法制备高效转染的纳米载体。
所述的步骤A具体为：取1mL 50mg/mL的阳离子型高分子于干净的玻璃瓶中，掷一小的搅拌子，于28℃恒温水浴缓慢搅拌；通氮气，缓慢滴加0.809mL 1mg/mL的交联剂，继续搅拌2小时。
所述的步骤B具体为：取5cm长度的透析袋，分子量为25KD，将步骤A所得到的反应产物转移到透析袋中，用去离子水透析,在12h时更换一次去离子水，24h后回收，对其粒径和电位，电镜等理化特性表征。
所述步骤A中所用的阳离子高分子材料主要包括阳离子脂质体、树枝状聚合物、阳离子聚合物，优选聚赖氨酸、线性和分枝聚乙烯亚胺、聚酰胺基胺，以及与其具有类似结构特征的高分子。
所述步骤A中阳离子高分子材料的使用浓度范围为0.1-100g/L，优先选择50mg/mL。
所述步骤A中一干净的玻璃瓶是经过铬酸洗液浸泡过夜后，再用18.2MΩ*cm的去离子水清洗，置于60℃烘箱中烘干即可。
所述步骤A中交联前的体系，包括阳离子高分子溶液，去离子水，DMSO等都需要超声处理10-30min,功率选择范围75-150KW。
所述步骤A中所使用的交联剂为3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯，但非仅限于这一种交联剂，与其交联原理类似的相关交联剂皆在本专利保护范围内。
所述步骤A中，由于交联剂具有还原性，所以交联过程中需要通氮气进行保护。
所述步骤A中转子的搅拌速度为低速，控制范围在100-2000r/min。
所述步骤A中交联的具体工艺为：交联剂的使用量越多其合成的纳米载体粒径约大，阳离子高分子材料和交联剂的摩尔比可为1:0.1-1:100，本方案优先选择1:1摩尔比。
所述步骤B中透析袋分子量有1KD、3KD、5KD、10KD、25KD、75KD等，优先选择为25KD分子量。
所述步骤B中透析液使用的是18.2MΩ*cm的去离子水。
所述步骤B中透析时间为12-48h。
所述步骤B中透析次数(更换去离子水)为2-3次，即每6h、8h或12h更换一次去离子水。
所述步骤B中合成的具体工艺为：将步骤A所得到的反应产物转移到透析袋中，用去离子水透析,优先选择24小时，每12h更换一次去离子水。
所述的纳米转染载体，其特征在于该载体对质粒DNA的转染具有温度敏感性，且转染效率随温度升高明显提高达2左右；且其特征在于该载体对质粒DNA的转染具有血清稳定性，能够在有血清或者蛋白的溶液中转染，且转染效率不变。
实施例1：
制备纳米转染载体
取1mL 50mg/mL的高分子聚合物聚异丙基丙烯酰胺或聚乙烯亚胺或聚赖氨酸(分子量在103～106g/mol之间)，或两种高分子的组合物(按照0.05～0.85的比例)于干净的玻璃瓶中，掷一小的搅拌子，于28℃恒温水浴缓慢搅拌；通氮气，缓慢滴加0.809mL 1mg/mL的DTSP(3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯)，继续搅拌2小时；取5cm长度的透析袋(分子量为30KD)，将得到的反应产物转移到透析袋中，用去离子水透析，在12h时更换一次去离子水，24h后回收，对其粒径和电位，电镜等理化特性表征。
实施例2：
利用ALV-DLS动静态光散射仪对施例1合成的纳米转染试剂JH-ZRR2000的流体力学半径进行表征。具体操作过程为取实例1的纳米转染试剂JH-ZRR2000原液10μl，并溶解在1mL的18.2Ω超纯水中，混匀后进行上机检测。设置的温度为20℃，波长632.8nm，溶液粘度系数为0.8900，检测信号时间为300s。其检测结果(见图2)显示其粒子半径大小约为186nm。
实施例3：
利用马尔文Zeta电位仪对施例1合成的纳米转染试剂JH-ZRR2000的表面电势进行检测，首先取施例1合成的纳米转染试剂JH-ZRR2000 10μl，并溶解在1mL的18.2Ω超纯水中，混匀后进行上机检测。其检测结果(见图3)显示其表面电势大小约为12.5mV。
实施例4：
通过透射电子显微镜观察施例1合成的纳米转染试剂JH-ZRR2000的形貌，首先取一个电镜铜网(购北京中镜科仪技术有限公司)在施例1合成的纳米转染试剂JH-ZR-2原液100倍稀释溶液中捞一下，并置于一干净的玻璃皿中，在通风厨中过夜风干，再置于标记好的干净的1.5mL离心管中存放。随后在电镜下观察金纳米棒的形貌并获取图片。结果(见图4)表明合成的纳米转染试剂JH-ZR-2形态为球形，直径大小介于200-400nm。
实施例5：
制备30μl混合体系，其中载体为2μg,GFP质粒为0.5μg、1μg、2μg、5μg、10μg、20μg；载体的浓度为0.1mg/mL，GFP的浓度为0.5mg/mL，使用的10×loading各3μl,其余用去离子水补齐至30μl。配制0.8％的琼脂糖凝胶，以200V电压，20min进行电泳。结果(见图5)表明，纳米转染载体具有很强的DNA携载能力。
实施例6：
用CCK-8实验来研究所制备的纳米转染试剂JH-ZRR2000的细胞毒性。
收集对数期的正常细胞—肾上皮细胞(293T)，铺96孔板，细胞浓度为5×104/mL，培养过夜，更换含不同浓度的纳米转染试剂JH-ZRR2000培养基(浓度分别为1、2、4、8、10μg/mL)，各3个复孔。在培养箱中孵育24h后，每孔加入含10％CCK-8的细胞培养基，孵育培养2h后，在酶联免疫检测仪450nm处测量各孔的吸光值，同时以630nm作为参比波长。同时通过倒置显微镜进行拍照。使用Excel软件统计学分析数据。在所有的评估中，认为P<0.05时，样品之间的差异具有统计学显著性。分析结果以细胞存活率来显示纳米转染试剂对293T细胞的毒性作用。结果(见图6、7)显示，在一定浓度范围内纳米转染试剂对293T细胞基本没有毒性。
实施例10：
对生长状态良好的293T细胞进行传代和铺24孔板用于此次实施例。
配纳米转染载体母液0.1mg/mL，取80μl加入到20μl的DMEM培养基中，得溶液A；同时分别将不同质量的GFP质粒(0.1μg、1μg、10μg、20μg)加入到25μl DMEM培养基中，得溶液B、C、D、E；将溶液A均分4等份，分别和溶液B、C、D、E混合均匀，静置5min，补加450μl DMEM培养基，混合均匀后，替换已标记24孔板中的对应孔中的旧培养基，37℃，5％CO2，培养6h后，更换含10％FCS的DMEM培养基，孵育24；倒置荧光显微镜下观察拍照(见图8)。
实施例7：
复苏并培养293T细胞三代后，铺24孔板。
配纳米转染载体母液1mg/mL，取8μl加入到92μl的DMEM培养基中，得溶液A；同时将1μg、2μgGFP质粒加入到48μl、46μlDMEM培养基中，得溶液B、C；分别将溶液B和溶液C与1/2体积的溶液A混合均匀，分别得到溶液E和F，静置5min；将溶液E、F均分为两份，一份补加450μlDMEM培养基，另一份补加450μl含10％FCS的DMEM培养基，混合均匀后，替换24孔板对应标注的孔中培养基，37℃，5％CO2，培养6h后，对无血清组进行更换含10％FCS的DMEM培养基，孵育24。倒置荧光显微镜下观察拍照。结果见图9，表明阳离子型纳米转染材料在有血清和无血清条件下都有较高的转让效率，优先考虑无血清转染。
实施例8：
复苏并培养293T细胞三代后，铺24孔板。
配纳米转染载体母液1mg/mL，取2μl加入到23μl的DMEM培养基中，得溶液A；同时将1μg GFP质粒加入到25μl DMEM培养基中,得溶液B；将溶液A和溶液B混合均匀，静置5min，补加450μl DMEM培养基，混合均匀后，替换已标记24孔板中的对应孔中的旧培养基，37℃，5％CO2，培养6h后，更换含10％FCS的DMEM培养基，孵育24,48h；倒置荧光显微镜下观察拍照(见图10)；随后通过流式细胞仪检测有效转染效率(见图11)。结果表明相对于lipo3000转染试剂，本专利产品具有更高的转染效率和效果。
实施例9：
对生长状态良好的293T细胞进行传代和铺24孔板用于此次实施例。
不同分子量(1.8KD、10KD、25KD、750KD)的分枝聚乙烯亚胺各配1mg/mL的母液，各取2μl加入到23μl的DMEM培养基中，得溶液A、B、C、D；同时将4μg GFP质粒加入到100μl DMEM培养基中，得溶液E；将溶液E4等份后分别和等体积的溶液A、B、C、D混合均匀，静置5min，补加450μl DMEM培养基，混合均匀后，替换已标记24孔板中的对应孔中的旧培养基，37℃，5％CO2，培养6h后，更换含10％FCS的DMEM培养基，孵育24；倒置荧光显微镜下观察拍照(见图12)
实施例11：
对生长状态良好的293T、CHO、N87、HEPG2细胞进行传代和铺24孔板用于此次实施例。
配纳米转染载体母液0.1mg/mL，取80μl加入到20μl的DMEM培养基中，得溶液A；同时将4μg GFP质粒加入到100μl DMEM培养基中，得溶液B；将溶液A和溶液B混合均匀，静置5min，补加1.5Ml DMEM培养基，混合均匀后，替换已标记24孔板中的对应孔中的旧培养基，每孔0.5mL，37℃，5％CO2，培养6h后，更换含10％FCS的DMEM培养基，孵育48h；倒置荧光显微镜下观察拍照(见图13)；
实施例12：
复苏并培养293T细胞三代后，铺24孔板2块。
配纳米转染载体母液1mg/mL，取2μl加入到23μl的DMEM培养基中，得溶液A；同时将1μg GFP质粒加入到25μl DMEM培养基中,得溶液B；将溶液A和溶液B混合均匀，静置5min，补加450μl DMEM培养基，混合均匀后，替换已标记24孔板中的对应孔中的旧培养基，分别在37℃和40℃下培养，5％CO2，培养6h后，更换含10％FCS的DMEM培养基，孵育24,48h；随后通过流式细胞仪检测有效转染效率(见图14)。结果表明相对随着温度稍微增加约2-5度，本发明载体的转染效率能够增加2左右，本专利产品具有更高的转染效率和效果。
以上已对本发明的较佳实施例进行了具体说明，但本发明并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出各种等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (15)

1.一种纳米转染载体，其特征在于，所述纳米转染载体包含阳离子高分子材料和交联剂。
2.根据权利要求1所述的纳米转染载体，其特征在于，所述纳米转染载体以所述阳离子高分子材料作为底物，经分子交联及纳米自组装获得。
3.根据权利要求1或2所述的纳米转染载体，其特征在于，所述阳离子高分子材料是脂质体、树枝状聚合物、阳离子聚合物，优选聚赖氨酸、线性和分枝聚乙烯亚胺、聚酰胺基胺。
4.根据权利要求1或2所述的纳米转染载体，其特征在于，所述交联剂为3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯。
5.根据权利要求1或2所述的纳米转染载体，其特征在于，所述阳离子高分子材料和所述交联剂的摩尔比为1:0.1-1:100。
6.根据权利要求1或2所述的纳米转染载体，其特征在于，所述阳离子高分子材料和所述交联剂的摩尔比为1:1。
7.一种转染质粒DNA的方法，其特征在于，所述方法利用根据权利要求1-6任一项所述的纳米转染载体转染质粒DNA。
8.一种制备如权利要求1-6任一项所述的纳米转染载体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
A、通过分子交联法制备纳米转染载体前体；
B、利用纳米自组装法制备纳米转染载体。
9.根据权利要求8所述的纳米转染载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤A为：取所述阳离子高分子材料于水浴中搅拌；通氮气，滴加所述交联剂，继续搅拌。
10.根据权利要求8或9所述的纳米转染载体的制备方法，其特征在于，所述步骤B中，所述透析袋的分子量为1KD、3KD、5KD、10KD、25KD或75KD，优选25KD。
11.根据权利要求9所述的纳米转染载体的制备方法，其特征在于，在所述步骤A之前，对交联前的体系：聚合高分子溶液、去离子水、DMSO进行超声处理10-30分钟，功率范围75-150KW。
12.根据权利要求9所述的纳米转染载体前体的制备方法，其特征在于，所述步骤A中，阳离子高分子材料的使用浓度范围为0.1-100g/L，优选50mg/mL。
13.根据权利要求1或2所述的纳米转染载体或权利要求7或8所述的制备纳米转染载体的方法，其特征在于该载体对质粒DNA的转染具有温度敏感性，且转染效率随温度升高明显提高达2左右。
14.根据权利要求1或2所述的纳米转染载体或权利要求7或8所述的制备纳米转染载体的方法，其特征在于该载体对质粒DNA的转染具有血清稳定性，能够在有血清或者蛋白的溶液中转染，且转染效率不变。
15.根据权利要求10所述的纳米转染载体的制备方法，其特征在于，所述步骤B中，透析次数为2-3次，每6小时、8小时或12小时更换一次去离子水。
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