CN101338322A - 高分子聚合物构建的新型基因载体及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高分子聚合物构建的新型基因载体及制备方法，由交联的阳离子聚合物形成水性核心结构，再与阳离子脂质体形成双分子层结构，并通过聚二乙醇分子稳定粒子结构。本发明的新型基因载体介导的DNA/siRNA转染，可转染的细胞品种多，转染效率高，可在含血清培养液中使用，无需更换培养基，操作简便，转染后无细胞毒性。
Description
技术领域
本发明涉及高分子聚合物构建的新型基因载体及制备方法，具体涉及的是由交联的阳离子聚合物形成水性核心结构，由阳离子磷脂形成双分子层结构继续赋予该基因载体穿透细胞膜的功能，并通过聚二乙醇(PEG)分子稳定粒子结构，形成物化性质稳定、生物兼容性好的基因传递系统。本发明主要应用于：A、DNA质粒的转染试剂；B、肿瘤治疗用基因治疗药物的制剂；C、用于反义核酸和siRNA(RNA干扰)转染试剂；D、制备反义核酸和siRNA(RNA干扰)治疗用的药物制剂。
背景技术
已经上市的重组人肿瘤抑制基因(p53)腺病毒注射液，商品名：今又生，采用腺病毒，但其本身存在不可避免的安全性问题，如表达外源基因时间短，免疫原性强，易引发强烈的炎症反应和免疫反应，毒性较大等缺点。2000年，宾州大学有病人在基因治疗使用病毒载体中死亡，2002年在法国又发生先天免疫不全症基因治疗临床试验发生白血病的副作用。这两件失败的案例皆被归因于病毒载体的不安全性。因此，开发全新的非病毒载体迫在眉睫。
厦门太阳马生物工程公司对DNA转染试剂有过研究，它的主要成分是阳离子脂质体的聚合物，但由于其产品毒性高，转染效率低而不能为市场所接受。
美国INVITROGEN公司的各种系列的基因载体。大部分采用的是阳离子脂质体和中性磷脂为基本材料，毒性很高。
基因载体是指将基因或其它核酸物质运载到细胞中的工具。其化学本质可以是蛋白质或多肽、核酸、脂类、糖类、其它有机分子或它们的复合物。载体在生物技术中具有不可或缺的作用。根据载体的组成和制备过程可将基因载体分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体是将外源基因包装到天然病毒的外壳中，利用病毒对宿主细胞的感染性将外源基因导入细胞中。病毒载体因具有转导效率及表达效率高的特点而得到广泛应用。目前常用的病毒载体有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体等。非病毒载体是将外源基因用各种人工的或天然的材料包装起来形成的″人工病毒″。用于制备″人工病毒″的材料主要包括核酸、脂质和蛋白质，还可以偶联各种其它化学成分。基因载体是基因药物的重要组成部分，也是目前基因治疗的瓶颈。病毒载体尽管效率高，但是病毒载体的安全性问题限制了它的应用。非病毒载体具有安全、易于制备等优点，将来人们更乐于选择非病毒载体。
发明内容
本发明的目的提供一种高分子聚合物构建的新型基因载体及制备方法，该基因载体综合了最常用阳离子聚合物和脂质体两种非病毒载体的优点，由交联的阳离子聚合物形成水性核心结构，由阳离子磷脂形成双分子层结构继续赋予该基因载体穿透细胞膜的功能，并通过PEG分子稳定粒子结构，形成物化性质稳定、生物兼容性好的基因传递系统，适合作为体内外基因传递的载体。
本发明的作用机理
主要有带负电荷的基因和带正电荷的阳离子脂质体和阳离子聚合物组成，阳离子聚合物与带负电荷的基因及带正电荷的阳离子脂质体形成稳定的胶体复合物，如图1所示。相对于高分子聚合物复合体(polyplexes)和磷脂复合体(lipoplexes)，磷脂聚合物复合体(Lipopolyplexes)具有转染效率提高、毒性降低、稳定性更好等特点。阳离子聚合物有助于核酸压缩聚集，以便通过胞膜，而脂质体部分则使整个磷脂聚合物复合体更加稳定，并有效介导细胞内化后载体的内涵体逃逸，提高转染效率。
本发明的技术方案为：
高分子聚合物构建的新型基因载体，由交联的阳离子聚合物形成水性核心结构，再与阳离子脂质体形成双分子层结构，并通过聚二乙醇分子稳定粒子结构。交联的阳离子聚合物与阳离子脂质体按0.5-2∶1的比例，以疏水作用力形成双分子层结构，聚二乙醇又通过和磷脂共价结合的方式被安插在双分子层结构外层，从而使整个纳米粒子具有聚二乙醇化的外包膜，其理化稳定性在聚合物复合体和磷脂复合体基础上得以提高。其中阳离子聚合物为聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、壳聚糖、或聚甲基丙烯甲酯，阳离子脂质体为N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基硫酸铵(DOTAP)或N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-二甲基硫酸铵(DODAP)。
新型基因载体的制备方法，按以下步骤进行：
(1)阳离子聚合物的制备方法为：以分子量1000-5000的聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、壳聚糖或聚甲基丙烯甲酯进行巯基化修饰后自发反应形成生物可降解的分子量为1万-50万阳离子聚合物，控制交联的修饰度在50％，带电量控制在+50mV、形成亲水的凝胶结构；
(2)阳离子脂质体的制备方法为：先将N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基硫酸铵或N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-二甲基硫酸铵(DODAP)、胆固醇和聚乙二胺硬酯酸磷脂酰胺按重量比0.5-5∶1∶1在放入叔丁醇中进行溶解，溶解后的溶液进行冻干处理以形成稳定混合物，并以无DNA酶的缓冲液进行水化形成悬浮液；再将悬浮液进一步以超声探头加以混合，并通过高压匀浆机破碎，制得阳离子脂质体；
(3)将上述步骤制备得到的阳离子聚合物Polyplex和阳离子脂质体按体积比为0.5-2∶1进行混合，继续通过高压匀浆机进行充分混合和粒径控制在50纳米，其分布区间控制在30％，最终用Millipore PVDF0.22微米的无菌过滤膜进行过滤，得到澄清，粒径均一、小于100纳米的新型基因载体。
主要技术创新点表现在以下几个方面：
1、创新性地将阳离子聚合物和阳离子脂质体同时运用于基因载体，充分利用了两种非病毒基因载体的优点，构建全新的基因载体；其中采用了全新的阳离子聚合物的活化和交联技术。
该技术是通过将低分子的聚合物通过巯基化修饰，逐步形成生物可降解的高分子阳离子聚合物，通过控制交联的修饰度，对该聚合物的分子量、带电量、空间构想加以优化，使其成为和DNA分子在空间三维结构上匹配，可以形成紧密的纳米粒的结构，并且可以在进入细胞以后在溶酶体里可以通过生物降解而把DNA分子释放出来的性能。
上述是生物可降解阳离子高分子聚合物的合成的反应式。
2、筛选出一种阳离子脂质体，使之能同阳离子聚合物有效结合
阳离子脂质体的制备以冻干-水化-超声-匀浆法进行制备。首先将N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基硫酸铵和胆固醇和聚乙二胺硬酯酸磷脂酰胺按重量比0.5-5∶1∶1在叔丁醇进行溶解，进行冻干处理以形成稳定混合物，并以无DNA酶的缓冲液进行水化形成悬浮液，该悬浮液进一步以超声方法加以混合，并最终通过高压匀浆机将该阳离子脂质体制备得到；
将上述步骤制备得到的阳离子高分子聚合物和阳离子脂质体进行按体积比2-0.5∶1混合，继续通过高压匀浆机进行充分混合和粒径控制，同时确保工艺过程中磷脂和聚合物的稳定性。最终无菌过滤得到澄清，粒径均一，小于100纳米的新型基因载体。
3、新型基因载体介导的转染，可转染的细胞品种多，转染效率高，无需换液，操作简便；
对贴壁细胞的总体转染效果与脂质体(Lipofectamin2000)介导的转染相当；部分细胞株的转染效率超过Lipofectamin2000；对悬浮细胞转染效率超过Lipofectamin2000，如表1所示，
表1为本发明对各细胞株的转染效率。
转染效率 转染效率
细胞株 细胞株
(％GFP) (％GFP)
HepG2 67％ KB 73％
Raji 45％ Ramos 40％
SHEP 68％ MC3T3-E1 80％
Primary mouse
3T3-442A 5％ 20％
keratinocytes
Primary human
COS-7 64％ 20％
pre-adipocytes
Primary human skin
CV-1 50％ 16％
fibroblasts
Primary mouse embryonic
D 407 60％ 8％
fibroblast
DHD
50％ Primary melanocyte 15％
Pro.b
3LL 50％ K562 20％
B16-F10 76％ L929 49％
BAEC 51％ MCF-7 51％
BHK-21 80％ MDCK 52％
Ca Ski 78％ Neuro2A 76％
CaCo2 31％ NIH 3T3 76％
CHO 88％ PC12 30％
HCS-2/8 41％ SH-SY5Y 14％
HEK-293 86％ SiHa 60％
HeLa 78％ SKOV3 50％
HLMEC 62％ HUVEC 50％
H-MVEC 49％ IGROV1 20％
DF-1，Chicken Embryonic
huh-7D12 22％ 50％
Cell Line
ATT20 36％ 6CSFMEo 71％
SK-N-SH 17％ WEHI 231 26％
HepG2细胞按2×105接种于12孔板中，5％CO2孵箱37℃培育24h后，转染GFP质粒DNA。转染程序如下：本发明的基因载体与DNA按40∶1混合，加无血清培养液DMEM，室温静置40min；用1×DMEM洗脱细胞两次后，将本发明的基因载体与DNA复合物覆盖到细胞上，5％CO2孵箱37℃培育48小时后，荧光显微镜下观察。观察的转染荧光质粒(GFP)效果如图2所示。
4、本发明的基因载体在细胞毒性方面有巨大的突破
本发明的基因载体转染后无细胞毒性，无需更换培养基，而作为用量大的进口试剂，Lipofectamin2000具有细胞毒性，在转染后8-10小时必须更换培养基，否则细胞就会变形或不能生长；
高效率而低毒性的基因载体是基因治疗进入临床的必要条件，基因载体的毒性根据其侵害的对象可分为细胞毒性、血液毒性、组织毒性，其中细胞毒性是体外基因转染时评价基因载体的一个重要指标，并为进一部开展体内实验提供有利的证据，生物可降解阳离子高分子聚合物与脂质体中的中性脂质体均可大大降低细胞毒性。
本发明的基因载体制备工艺如图3所示。
本发明的基因载体的理化指标如表2所示，本发明的基因载体的微生物指标如表3所示。
表2理化指标
| 项目 | 指标 |
| 粒子直径 纳米 ≤ | 30 |
| PH值范围 | 5.5-6.5 |
| RNase， unit/mL ≤ | 4 |
| DNase， unit/mL ≤ | 2 |
表3微生物指标
| 项目 | 指标 |
| 菌落总数，cfu/ML ≤ | 1000 |
| 大肠菌群，MPN/100mL ≤ | 60 |
| 内毒素， EU/1mL ≤ | 1.0 |
附图说明
图1为本发明的基因载体结构示意图。
图2为GFP质粒转染HepG2细胞培养48小时后荧光显微镜显示图。
具体实施方式
实例1：阳离子聚合物的制备方法
称取分子量为2000的聚乙烯亚胺5克，加入琥珀酰亚氨基二硫吡啶丙酸酯0.5克进行修饰，同时将分子量为2000的聚乙烯亚胺5克通过2-亚氨氢氯化硫醇0.5克进行巯基化修饰，上述两种修饰后的聚合物溶液过交联葡聚糖(Sephadex)50柱，以pH6.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液进行洗脱，收集高分子组分；将上述收集到的组分进行混合，在常温下过夜，通过自发反应12小时形成生物可降解的高分子阳离子聚合物，并控制交联的修饰度在50％左右，使该聚合物的分子量在1万到50万之间，形成亲水的凝胶结构，用pH6的2-N-吗啉代乙磺酸水合物(MES)缓冲液调整体积为1升；
实例2：阳离子脂质体的制备方法为：先将N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基硫酸铵(DOTAP)5克，胆固醇2.5克和聚乙二胺硬酯酸磷脂酰胺2.5克加入5毫升叔丁醇中溶解，进行-20度冷冻，然后放入4升台式冷冻干燥机(Labconco)中冻干处理24小时形成稳定混合物；该除去有机溶剂的磷脂混合物以1升无DNA酶的pH 6磷酸缓冲液进行水化形成悬浮液；该悬浮液进一步以高能超声探头加以混合(30％，100赫兹，15分钟)，并通过高压匀浆机(Avestin C5)在60度进行10个循环的破碎，压力采用15000psi，制得粒子直径在50纳米，粒子分布在30％内的阳离子脂质体；
实例3：磷脂聚合物复合体的制备方法。
将上述步骤制备得到的阳离子聚合物凝胶和阳离子脂质体悬浮液以1比1体积进行混合，获得共2升的混合液，该液体继续通过高压匀浆机(Avestin C5)高压匀浆法进行15000psi，常温处理共10个循环，制备得到粒径小于30纳米，其分布区间控制在20％以下的纳米粒，最终用Millipore PVDF0.22微米的无菌过滤膜负压进行过滤，得到澄清，粒径均一、小于30纳米的新型基因载体。
实例4：磷脂聚合物/DNA复合物的制备。
以1μgDNAGFP质粒使用30μL不含血清和抗生素的培养液的比例，将实验所需的DNA质粒溶液稀释于不含血清和抗生素的培养液中，轻轻混匀，该溶液为溶液A；以每2μL转染试剂使用30μL无菌不含血清和抗生素的培养液的比例，将实验所需的转染试剂稀释于不含血清和抗生素的培养液中，轻轻混匀，该溶液为溶液B；常温下，将上述溶液B滴加入溶液A中，一边滴加一边混匀，形成60μL复合物混悬液，室温孵育20-30分钟，将实验所需的细胞悬浮于培养液中(含血清和抗生素)，每孔0.5毫升细胞培养液，将含1μgDNA质粒的复合物混悬液(60μL)加入每孔中并轻轻摇动使其均匀混合，将上述添加复合物混悬液的24孔板放置于37℃的5％CO2孵育箱孵育。48小时后，将细胞分离得到进行荧光检测GFP质粒的转染效果，如图2所示。
实例5：阳离子聚合物的制备方法
称取分子量为2000的聚谷氨酸5克，加入琥珀酰亚氨基二硫吡啶丙酸酯0.5克进行修饰，同时将分子量为2000的聚谷氨酸5克通过2-聚谷氨酸氨氢氯化硫醇0.5克进行巯基化修饰，上述两种修饰后的聚合物溶液过交联葡聚糖(Sephadex)50柱，以pH6.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液进行洗脱，收集高分子组分；将上述收集到的组分进行混合，在常温下过夜，通过自发反应12小时形成生物可降解的高分子阳离子聚合物，并控制交联的修饰度在50％左右，使该聚合物的分子量在1万到50万之间，形成亲水的凝胶结构，用pH6的2-N-吗啉代乙磺酸水合物(MES)缓冲液调整体积为1升；
实例6：阳离子脂质体的制备方法为：先将N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基硫酸铵(DOTAP)5克，胆固醇2.5克和聚乙二胺硬酯酸磷脂酰胺2.5克加入5毫升叔丁醇中溶解，进行-20度冷冻，然后放入4升台式冷冻干燥机(Labconco)中冻干处理24小时形成稳定混合物；该除去有机溶剂的磷脂混合物以1升无DNA酶的pH 6磷酸缓冲液进行水化形成悬浮液；该悬浮液进一步以高能超声探头加以混合(30％，100赫兹，15分钟)，并通过高压匀浆机(Avestin C5)在60度进行10个循环的破碎，压力采用15000psi，制得粒子直径在50纳米，粒子分布在30％内的阳离子脂质体；
实例7：磷脂聚合物复合体的制备方法。
将上述步骤制备得到的阳离子聚合物凝胶和阳离子脂质体悬浮液以1比1体积进行混合，获得共2升的混合液，该液体继续通过高压匀浆机(Avestin C5)高压匀浆法进行15000psi，常温处理共10个循环，制备得到粒径小于30纳米，其分布区间控制在20％以下的纳米粒，最终用Millipore PVDF0.22微米的无菌过滤膜负压进行过滤，得到澄清，粒径均一、小于30纳米的新型基因载体。
实例8：磷脂聚合物/DNA复合物的制备.
以1μgDNAGFP质粒使用30μL不含血清和抗生素的培养液的比例，将实验所需的DNA质粒溶液稀释于不含血清和抗生素的培养液中，轻轻混匀，该溶液为溶液A；以每2μL转染试剂使用30μL无菌不含血清和抗生素的培养液的比例，将实验所需的转染试剂稀释于不含血清和抗生素的培养液中，轻轻混匀，该溶液为溶液B；常温下，将上述溶液B滴加入溶液A中，一边滴加一边混匀，形成60μL复合物混悬液，室温孵育20-30分钟，将实验所需的细胞悬浮于培养液中(含血清和抗生素)，每孔0.5毫升细胞培养液，将含1μgDNA质粒的复合物混悬液(60μL)加入每孔中并轻轻摇动使其均匀混合，将上述添加复合物混悬液的24孔板放置于37℃的5％CO2孵育箱孵育。48小时后，将细胞分离得到进行荧光检测GFP质粒的转染效果。
实例9：阳离子聚合物的制备方法
称取分子量为2000的聚甲基丙烯甲酯5克，加入琥珀酰亚氨基二硫吡啶丙酸酯0.5克进行修饰，同时将分子量为2000的聚甲基丙烯甲酯5克通过2-聚谷氨酸氨氢氯化硫醇0.5克进行巯基化修饰，上述两种修饰后的聚合物溶液过交联葡聚糖(Sephadex)50柱，以pH6.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液进行洗脱，收集高分子组分；将上述收集到的组分进行混合，在常温下过夜，通过自发反应过夜(12小时)形成生物可降解的高分子阳离子聚合物，并控制交联的修饰度在50％左右，使该聚合物的分子量在1万到50万之间，形成亲水的凝胶结构，用pH6的2-N-吗啉代乙磺酸水合物(MES)缓冲液调整体积为1升；
实例10：阳离子脂质体的制备方法为：先将N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基硫酸铵(DOTAP)5克，胆固醇2.5克和聚乙二胺硬酯酸磷脂酰胺2.5克加入5毫升叔丁醇中溶解，进行-20度冷冻，然后放入4升台式Labconco(冷冻干燥机)中冻干处理24小时形成稳定混合物；该除去有机溶剂的磷脂混合物以1升无DNA酶的pH 6磷酸缓冲液进行水化形成悬浮液；该悬浮液进一步以高能超声探头加以混合(30％，100赫兹，15分钟)，并通过高压匀浆机(Avestin C5)在60度进行10个循环的破碎，压力采用15000psi，制得粒子直径在50纳米，粒子分布在30％内的阳离子脂质体；
实例11：磷脂聚合物复合体的制备方法。
将上述步骤制备得到的阳离子聚合物凝胶和阳离子脂质体悬浮液以1比1体积进行混合，获得共2升的混合液，该液体继续通过高压匀浆机(Avestin C5)高压匀浆法进行15000psi，常温处理共10个循环，制备得到粒径小于30纳米，其分布区间控制在20％以下的纳米粒，最终用Millipore PVDF0.22微米的无菌过滤膜负压进行过滤，得到澄清，粒径均一、小于30纳米的新型基因载体。
实例12：磷脂聚合物/DNA复合物的制备.
以1μgDNAGFP质粒使用30μL不含血清和抗生素的培养液的比例，将实验所需的DNA质粒溶液稀释于不含血清和抗生素的培养液中，轻轻混匀，该溶液为溶液A；以每2μL转染试剂使用30μL无菌不含血清和抗生素的培养液的比例，将实验所需的转染试剂稀释于不含血清和抗生素的培养液中，轻轻混匀，该溶液为溶液B；常温下，将上述溶液B滴加入溶液A中，一边滴加一边混匀，形成60μL复合物混悬液，室温孵育20-30分钟，将实验所需的细胞悬浮于培养液中(含血清和抗生素)，每孔0.5毫升细胞培养液，将含1μgDNA质粒的复合物混悬液(60μL)加入每孔中并轻轻摇动使其均匀混合，将上述添加复合物混悬液的24孔板放置于37℃的5％CO2孵育箱孵育。48小时后，将细胞分离得到进行荧光检测GFP质粒的转染效果。
实例13：阳离子聚合物的制备方法
称取分子量为2000的壳聚糖5克，加入琥珀酰亚氨基二硫吡啶丙酸酯0.5克进行修饰，同时将分子量为2000的壳聚糖5克通过2-聚谷氨酸氨氢氯化硫醇0.5克进行巯基化修饰，上述两种修饰后的聚合物溶液过交联葡聚糖(Sephadex)50柱，以pH6.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液进行洗脱，收集高分子组分；将上述收集到的组分进行混合，在常温下过夜，通过自发反应过夜(12小时)形成生物可降解的高分子阳离子聚合物，并控制交联的修饰度在50％左右，使该聚合物的分子量在1万到50万之间，形成亲水的凝胶结构，用pH6的2-N-吗啉代乙磺酸水合物(MES)缓冲液调整体积为1升；
实例14：阳离子脂质体的制备方法为：先将N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-二甲基硫酸铵(DODAP)5克，胆固醇2.5克和聚乙二胺硬酯酸磷脂酰胺2.5克加入5毫升叔丁醇中溶解，进行-20度冷冻，然后放入4升台式冷冻干燥机(Labconco)中冻干处理24小时形成稳定混合物；该除去有机溶剂的磷脂混合物以1升无DNA酶的pH 6磷酸缓冲液进行水化形成悬浮液；该悬浮液进一步以高能超声探头加以混合(30％，100赫兹，15分钟)，并通过高压匀浆机(Avestin C5)在60度进行10个循环的破碎，压力采用15000psi，制得粒子直径在50纳米，粒子分布在30％内的阳离子脂质体；
实例15：磷脂聚合物复合体的制备方法。
将上述步骤制备得到的阳离子聚合物凝胶和阳离子脂质体悬浮液以1比1体积进行混合，获得共2升的混合液，该液体继续通过高压匀浆机(Avestin C5)高压匀浆法进行15000psi，常温处理共10个循环，制备得到粒径小于30纳米，其分布区间控制在20％以下的纳米粒，最终用Millipore PVDF0.22微米的无菌过滤膜负压进行过滤，得到澄清，粒径均一、小于30纳米的新型基因载体。
实例16：磷脂聚合物/DNA复合物的制备.
以1μgDNAGFP质粒使用30μL不含血清和抗生素的培养液的比例，将实验所需的DNA质粒溶液稀释于不含血清和抗生素的培养液中，轻轻混匀，该溶液为溶液A；以每2μL转染试剂使用30μL无菌不含血清和抗生素的培养液的比例，将实验所需的转染试剂稀释于不含血清和抗生素的培养液中，轻轻混匀，该溶液为溶液B；常温下，将上述溶液B滴加入溶液A中，一边滴加一边混匀，形成60μL复合物混悬液，室温孵育20-30分钟，将实验所需的细胞悬浮于培养液中(含血清和抗生素)，每孔0.5毫升细胞培养液，将含1μgDNA质粒的复合物混悬液(60μL)加入每孔中并轻轻摇动使其均匀混合，将上述添加复合物混悬液的24孔板放置于37℃的5％CO2孵育箱孵育。48小时后，将细胞分离得到进行荧光检测GFP质粒的转染效果。
聚赖氨酸实例17：阳离子聚合物的制备方法
称取分子量为2000的壳聚糖5克，加入琥珀酰亚氨基二硫吡啶丙酸酯0.5克进行修饰，同时将分子量为2000的聚赖氨酸5克通过2-聚谷氨酸氨氢氯化硫醇0.5克进行巯基化修饰，上述两种修饰后的聚合物溶液过交联葡聚糖(Sephadex)50柱，以pH6.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液进行洗脱，收集高分子组分；将上述收集到的组分进行混合，在常温下过夜，通过自发反应12小时形成生物可降解的高分子阳离子聚合物，并控制交联的修饰度在50％左右，使该聚合物的分子量在1万到50万之间，形成亲水的凝胶结构，用pH6的2-N-吗啉代乙磺酸水合物(MES)缓冲液调整体积为1升；
实例18：阳离子脂质体的制备方法为：先将N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基硫酸铵(DOTAP)5克，胆固醇2.5克和聚乙二胺硬酯酸磷脂酰胺2.5克加入5毫升叔丁醇中溶解，进行-20度冷冻，然后放入4升台式冷冻干燥机(Labconco)中冻干处理24小时形成稳定混合物；该除去有机溶剂的磷脂混合物以1升无DNA酶的pH 6磷酸缓冲液进行水化形成悬浮液；该悬浮液进一步以高能超声探头加以混合(30％，100赫兹，15分钟)，并通过高压匀浆机(Avestin C5)在60度进行10个循环的破碎，压力采用15000psi，制得粒子直径在50纳米，粒子分布在30％内的阳离子脂质体；
实例19：磷脂聚合物复合体的制备方法。
将上述步骤制备得到的阳离子聚合物凝胶和阳离子脂质体悬浮液以1比1体积进行混合，获得共2升的混合液，该液体继续通过高压匀浆机(Avestin C5)高压匀浆法进行15000psi，常温处理共10个循环，制备得到粒径小于30纳米，其分布区间控制在20％以下的纳米粒，最终用Millipore PVDF0.22微米的无菌过滤膜负压进行过滤，得到澄清，粒径均一、小于30纳米的新型基因载体。
实例20：磷脂聚合物/DNA复合物的制备.
以1μgDNAGFP质粒使用30μL不含血清和抗生素的培养液的比例，将实验所需的DNA质粒溶液稀释于不含血清和抗生素的培养液中，轻轻混匀，该溶液为溶液A；以每2μL转染试剂使用30μL无菌不含血清和抗生素的培养液的比例，将实验所需的转染试剂稀释于不含血清和抗生素的培养液中，轻轻混匀，该溶液为溶液B；常温下，将上述溶液B滴加入溶液A中，一边滴加一边混匀，形成60μL复合物混悬液，室温孵育20-30分钟，将实验所需的细胞悬浮于培养液中(含血清和抗生素)，每孔0.5毫升细胞培养液，将含1μgDNA质粒的复合物混悬液(60μL)加入每孔中并轻轻摇动使其均匀混合，将上述添加复合物混悬液的24孔板放置于37℃的5％CO2孵育箱孵育。48小时后，将细胞分离得到进行荧光检测GFP质粒的转染效果。
Claims (5)
1、高分子聚合物构建的新型基因载体，由交联的阳离子聚合物形成水性核心结构，再与阳离子脂质体形成双分子层结构，并通过聚二乙醇分子稳定粒子结构。
2、根据权利要求1所述的新型基因载体，其特征在于：所述的交联的阳离子聚合物与阳离子脂质体按体积比0.5-2∶1，以疏水作用力形成双分子层结构，聚二乙醇又通过和磷脂共价结合的方式被安插在双分子层结构外层。
3、根据权利要求1或2所述的新型基因载体，其特征在于：所述的阳离子聚合物为聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、壳聚糖或聚甲基丙烯甲酯。
4、根据权利要求1或2所述的新型基因载体，其特征在于：所述的阳离子脂质体为用N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基硫酸铵(DOTAP)或N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-二甲基硫酸铵(DODAP)。
5、根据权利要求1所述的新型基因载体的制备方法，其特征在于：按以下步骤进行：
(1)阳离子聚合物的制备方法为：以分子量1000-5000的聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、壳聚糖或聚甲基丙烯甲酯进行巯基化修饰后自发反应形成生物可降解的分子量为1万-50万阳离子聚合物，控制交联的修饰度在50％，带电量控制在+50mV、形成亲水的凝胶结构；
(2)阳离子脂质体的制备方法为：先将N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基硫酸铵或N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-二甲基硫酸铵(DODAP)、胆固醇和聚乙二胺硬酯酸磷脂酰胺按重量比0.5-5∶1∶1在放入叔丁醇中进行溶解，溶解后的溶液进行冻干处理以形成稳定混合物，并以无DNA酶的缓冲液进行水化形成悬浮液；再将悬浮液进一步以超声探头加以混合，并通过高压匀浆机破碎，制得阳离子脂质体；
(3)将上述步骤制备得到的阳离子聚合物和阳离子脂质体按体积比2-0.5∶1进行混合，继续通过高压匀浆机进行充分混合和粒径控制在20纳米，其分布区间控制在20％，最终用Millipore PVDF0.22微米的无菌过滤膜进行过滤，得到澄清，粒径均一、小于100纳米的新型基因载体。
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