CN102775602A - 一种聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有式（Ⅰ）结构的聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物，本发明还提供了一种聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物的制备方法，包括以下步骤：将聚乙烯亚胺与ε-苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐在第一有机溶剂中进行聚合反应，得到聚乙烯亚胺聚ε-苄氧羰基-L-赖氨酸共聚物；将卤化氢溶液、第二有机溶剂与所述聚乙烯亚胺聚ε-苄氧羰基-L-赖氨酸共聚物混合，反应后得到具有式（Ⅰ）结构的聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物。本发明提供的聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物是一种新型的聚阳离子基因载体，集成了聚乙烯亚胺和聚氨基酸的性质，具有较高的转染率；

Description

一种聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物及其制备方法

技术领域

本发明涉及高分子化合物技术领域，尤其涉及一种聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物及其制备方法。

背景技术

随着生物科学技术的不断进步，基因治疗将在人类攻克癌症及遗传疾病等顽症的过程中占据重要地位，并将逐步成为一种常见的有效手段。基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。成功的基因治疗依赖于有效的基因载体，常见的载体分为病毒类载体和非病毒载体。

病毒类载体包括逆转录病毒、腺病毒（AV）、腺相关病毒（AAV）、单纯疱疹病毒（HSV）、痘苗病毒（VV）等。但是病毒类载体在临床应用中存在着很大的安全隐患。非病毒载体多为高分子阳离子聚合物，因其具有安全、有效、无免疫原性等优点，已成为病毒类载体最有希望的替代者。聚乙烯亚胺（PEI）由于其具有独特的“质子海绵效应”，能够实现高效的基因传递而倍受关注。PEI的优点在于电荷密度集中，对基因物质有较强的复合能力，在低质量（m/m）比即能获得最佳转染效率。

人工合成的聚氨基酸（酯）具有与天然多肽相似的性质，能在生物体内被酶所降解，具有很好的生物降解性和生物相容性，是组织工程和药物释放体系载体材料中理想的医用材料之一。近期研究者使用2-羟基吡啶为催化剂，通过胺解反应成功将支化的PEI分子接枝到线型的聚天冬氨酸骨架上，制备了线型聚天冬氨酸接枝聚乙烯亚胺共聚物，实验证明该阳离子共聚物是一种高效低毒并可降解的体外基因转染载体。然而，相对于分子量为25000的PEI均聚物，该载体转染率却较低。因此，发明人考虑了一种新型的基因载体。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种转染率高的聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物及其制备方法。

有鉴于此，本发明提供了一种具有式（Ⅰ）结构的聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物，

其中，n1≥1；n2≥1；n3≥1；

x≥1，y≥1且40≤x+y≤60。

本发明还提供了一种具有式（Ⅰ）结构的聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物的制备方法，包括以下步骤：

将聚乙烯亚胺与ε-苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐在第一有机溶剂中进行聚合反应，得到聚乙烯亚胺聚ε-苄氧羰基-L-赖氨酸共聚物；

将卤化氢溶液、第二有机溶剂与所述聚乙烯亚胺聚ε-苄氧羰基-L-赖氨酸共聚物混合，反应后得到具有式（Ⅰ）结构的聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物；

其中，n1≥1；n2≥1；n3≥1；

x≥1，y≥1且40≤x+y≤60。

优选的，所述第一有机溶剂为氯仿、二氯甲烷或N’N’-二甲基甲酰胺。

优选的，所述ε-苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐与所述第一有机溶剂的比例为1g：（10~100）mL。

优选的，所述聚乙烯亚胺与所述第一有机溶剂的比例为1g：（10~100）mL。

优选的，所述聚乙烯亚胺与所述ε-苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐的质量比为1：9~9：1。

优选的，所述第二有机溶剂为三氟乙酸或二氯乙酸。

优选的，所述聚合反应的时间为12~24h，所述聚合反应的温度为0~50℃。

优选的，所述卤化氢溶液为卤化氢的醋酸溶液。

优选的，得到聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物的步骤中所述反应的时间为2~10h。

本发明提供了一种聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物及其制备方法，该聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物是一种新型的聚阳离子基因载体，其中聚乙烯亚胺本身具有较好的质子缓冲能力，但是由于具有过高的电荷密度，导致其毒性较大，而通过引入赖氨酸链段，有效的分散了电荷密度，降低了细胞毒性，从而促进了共聚物转染效率的提高，另一方面，由于聚赖氨酸的引入，增加了伯胺的数量，更有利于载体与基因的复合和压缩DNA，从而易于形成稳定、细小的纳米颗粒，有利于增加细胞内吞，促进转染效率的提高。

附图说明

图1为聚乙烯亚胺聚ε-苄氧羰基-L-赖氨酸共聚物的核磁图；

图2为聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物的核磁图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明实施例公开了一种具有式（Ⅰ）结构的聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物，

其中，n1≥1；n2≥1；n3≥1；

x≥1，y≥1且40≤x+y≤60。

按照本发明，所述具有式（Ⅰ）结构的聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物由聚乙烯亚胺与聚赖氨酸接枝形成，所述聚乙烯亚胺的分子量优选为1800~25000，更优选为10000~20000。所述n1、n2和n3为聚赖氨酸的聚合度，优选的，1≤n1≤300，更优选的，20≤n1≤150；优选的，1≤n2≤300，更优选的，20≤n2≤150；优选的，1≤n3≤300，更优选的，20≤n3≤150。本发明中，所述聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物作为基因物质的载体，所述聚乙烯亚胺为阳离子聚合物，所述聚赖氨酸带正电，聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物与基因物质通过静电复合作用，形成基因复合颗粒。其中，基因物质作为人体正常的基因或具有治疗作用的基因，可以为真核细胞表达的质粒DNA、siRNA，如绿色荧光蛋白质粒、β-半乳糖苷酶质粒和荧光素酶质粒。

在所述聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物中，所述聚乙烯亚胺具有独特的“质子海绵效应”，能够实现高效的基因传递，但是其具有较高的毒性，从而限制了其转载基因的效率，而通过在聚乙烯亚胺中引入聚赖氨酸链段，能够分散其电荷密度，降低聚乙烯亚胺的毒性，使转染细胞的成活率增加，促进转染效率的提高；同时由于聚赖氨酸的引入，增加了伯胺的数量，更有利于基因与共聚物复合和压缩DNA，形成稳定、细小的纳米颗粒，较小的颗粒有利于细胞内吞，从而也能提高转染率。与DNA的转染不同，转染si RNA时阳离子载体需要把si RNA释放到细胞质里，因此需要阳离子基因载体在一定条件下能够很容易的释放si RNA，本发明提供的聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物在细胞质里释放si RNA的能力较高，因此所述聚乙烯亚胺聚赖氨酸共聚物的基因沉默效率比较高。

关于具有式（Ⅰ）结构的聚乙烯亚胺-聚赖氨酸，本发明还提供了其制备方法，具体包括以下步骤：

将聚乙烯亚胺与ε-苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐在第一有机溶剂进行共聚反应，得到聚乙烯亚胺聚ε-苄氧羰基-L-赖氨酸共聚物；

将氯化氢溶液、第二有机溶剂与所述聚乙烯亚胺聚ε-苄氧羰基-L-赖氨酸共聚物混合，反应后得到聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物。

按照本发明，所述ε-苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐（赖氨酸-NCA）对氧气极为敏感，在有氧的环境中易被氧化，因此本发明优选在无氧无水的环境中进行。本发明对所述聚乙烯亚胺、赖氨酸-NCA与有机溶剂的加入反应的先后顺序没有限制，可以将所述聚乙烯亚胺和赖氨酸-NCA同时加入第一有机溶剂中进行聚合反应，也可以将所述赖氨酸-NCA先溶解到第一有机溶剂中，同时将聚乙烯亚胺溶解于第一有机溶剂中，再将溶解赖氨酸-NCA的有机溶剂与溶解聚乙烯亚胺的有机溶剂混合即可。为了使所述赖氨酸-NCA充分溶解于有机溶剂中，本发明优选按照后种加入顺序，具体为：将所述赖氨酸-NCA与所述第一有机溶剂置于干燥的反应器中，充入氮气保护，搅拌溶解；然后将聚乙烯亚胺作为多胺引发剂溶解在第一有机溶剂中，并加入反应器内。所述第二有机溶剂包括但不限于三氟乙酸或二氯乙酸。所述赖氨酸-NCA与所述第一有机溶剂的配比优选为1g：（10~100）mL，更优选为1g：（40~80）mL，所述聚乙烯亚胺与所述第一有机溶剂优选为1g：（10~100）mL，更优选为1g：（30~90）mL。所述聚乙烯亚胺与所述赖氨酸-NCA的质量比为1：9~9：1，更优选为2：1~8：1，最优选为4：1~6：1。

所述赖氨酸-NCA与所述聚乙烯亚胺溶解后，其发生共聚反应，所述反应的温度优选控制为0~50℃，更优选为20~40℃，所述反应的时间优选为12~24h，更优选为15~20h。作为优选方案，反应结束后，需要对所得物进行提纯，具体为：反应完成后在乙醚或正己烷中沉降，过滤，干燥滤饼，即得到聚乙烯亚胺聚ε-苄氧羰基-L-赖氨酸共聚物。

按照本发明，上述聚乙烯亚胺聚ε-苄氧羰基-L-赖氨酸共聚物，并不具有转染率或转染率很低，需要将上述聚乙烯亚胺聚ε-苄氧羰基-L-赖氨酸共聚物通过脱保护去掉聚赖氨酸的保护基团后，形成聚乙烯亚胺接枝聚赖氨酸，才能具有较高的转染率。所述聚乙烯亚胺聚ε-苄氧羰基-L-赖氨酸共聚物脱保护的具体过程为：将所述聚乙烯亚胺聚ε-苄氧羰基-L-赖氨酸共聚物在冰水浴中用三氟乙酸溶解，加入溴化氢的乙酸溶液，反应2~10h，用乙醚沉降，干燥，并用水溶解后，采用透析袋透析54~72h，期间换水4~6次，冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺聚赖氨酸共聚物。上述反应的时间优选为4~8h。

上述所制备的聚乙烯亚胺聚赖氨酸共聚物是一种新型的聚阳离子基因载体，集成了聚乙烯亚胺和聚氨基酸的性质，降低聚乙烯亚胺毒性的同时，分散了聚乙烯亚胺的电荷密度，由于引入了聚赖氨酸，增加了伯胺的数量，从而能够形成稳定、细小的纳米颗粒，从而能够促进转染效率的提高。

按照本发明，将上述聚乙烯亚胺聚赖氨酸共聚物通过静电复合作用与基因形成基因复合颗粒，进而将基因复合颗粒进行体外DNA转染实验和体内siRNA转染实验。实验结果表明，在同等条件下对HeLa细胞介导荧光素酶质粒的转染效率最高为商业化PEI25K的10~20倍，在最佳转染比例范围内，细胞存活率在80%以上；其基因沉默效率高，对恒定表达荧光素酶的Huh 7细胞的最高基因沉默效率为59%，该聚合物相对于商业转染试剂PEI25K有较高基因沉默效率和较小的细胞毒性。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的聚乙烯亚胺聚赖氨酸共聚物及其应用进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1：聚乙烯亚胺-聚赖氨酸的制备

1）在无水无氧条件下，将ε-苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐（Lys（z）-NCA）与氯仿按照1g：50mL的配比置于干燥的反应器中，充入氮气保护，搅拌溶解；然后将支化聚乙烯亚胺作为多胺引发剂溶解在氯仿中，并加入反应器内，其中聚乙烯亚胺与氯仿的配比为1：40；控温0~50℃搅拌反应至少12小时，反应完成后在乙醚中沉降，过滤，干燥滤饼，得到聚乙烯亚胺聚ε-苄氧羰基-L-赖氨酸共聚物。

2）将得到的聚乙烯亚胺聚ε-苄氧羰基-L-赖氨酸共聚物在冰浴中用三氟乙酸溶解，加入溴化氢的乙酸溶液脱保护，反应在冰浴中进行2h以上，用乙醚沉降，干燥；并用水溶解后，用透析袋透析72小时，期间换水4~6次，冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物（PEI-PLL）。如图1和图2所示，图1为聚乙烯亚胺ε-苄氧羰基-L-赖氨酸共聚物的核磁图，图2为聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物的核磁图，图1与图2相比，图2中7.1ppm和5.0ppm左右的核磁峰消失，说明保护基苄氧羰基已经完全脱去。由图2可知，聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物是可以制备的。根据聚乙烯亚胺和聚赖氨酸的质量比，将聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物进行了编号，如表1所示，表1为原料的质量比与产物分子量的数据表。

表1原料的质量比与产物分子量的对应的数据表

实施例2

利用聚乙烯亚胺-聚赖氨酸介导pGL3（荧光素酶质粒）、pEGFPN1（绿色荧光蛋白质粒）、pCMV-lac Z（β-半乳糖苷酶质粒）对HeLa细胞的体外转染

（1）取人宫颈癌细胞（HeLa细胞），置于含有10%小牛血清的培养液中连续培养（5%CO₂、37℃孵箱）。

（2）体外转染

转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×10⁴细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL，继续培养24小时。

（3）体外转染效率的测定

取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。表2为荧光素酶质粒的复合物的转染效率表。

绿色荧光蛋白（GFP）表达用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号。阳性细胞发出明亮的绿色荧光，而阴性细胞则无。用流式细胞仪检测阳性细胞的百分率。表3为绿色荧光蛋白质粒的复合物的转染效率表。

β-半乳糖苷酶染色细胞用0.01mol/L的PBS洗涤，用0.4%多聚甲醛固定5min,PBS冲洗后加入5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）染色液（配方为0.04%X-gal,5mmol/L亚铁氰化钾,5mmol/L高铁氰化钾和2mmol/LMgCl₂）,放置37℃，5%CO₂孵育3h。阳性细胞呈深蓝色，计算阳性细胞的百分率。表4为β-半乳糖苷酶质粒的复合物的转染效率表。

表2聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导荧光素酶质粒的体外转染效率数据表

表3聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率数据表

表4聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导β-半乳糖苷酶质粒的体外转染效率数据表

实施例3

利用聚乙烯亚胺-聚赖氨酸介导pGL3（荧光素酶质粒）、pEGFPN1（绿色荧光蛋白质粒）、pCMV-lac Z（β-半乳糖苷酶质粒）对COS7细胞的体外转染

（1)将COS7细胞在含有10%小牛血清的培养液中连续培养（5%CO₂、37℃孵箱）。

（2）体外转染

转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×10⁴细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL，继续培养24小时。

（3）体外转染效率的测定

取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。表5为荧光素酶质粒的复合物的转染效率表。

绿色荧光蛋白（GFP）表达用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号。阳性细胞发出明亮的绿色荧光，而阴性细胞则无。用流式细胞仪检测阳性细胞的百分率。表6为绿色荧光蛋白质粒的复合物的转染效率表。

β-半乳糖苷酶染色细胞用0.01mol/L的PBS洗涤，用0.4%多聚甲醛固定5min,PBS冲洗后加入5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）染色液（配方为0.04%X-gal,5mmol/L亚铁氰化钾,5mmol/L高铁氰化钾和2mmol/LMgCl₂）,放置37℃，5%CO₂孵育3h。阳性细胞呈深蓝色，计算阳性细胞的百分率。表7为β-半乳糖苷酶质粒的复合物的转染效率表。

表5聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导荧光素酶质粒的体外转染效率数据表

表6聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率数据表

表7聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导β-半乳糖苷酶质粒的体外转染效率数据表

实施例4

利用聚乙烯亚胺-聚赖氨酸介导pGL3（荧光素酶质粒）、pEGFPN1（绿色荧光蛋白质粒）、pCMV-lac Z（β-半乳糖苷酶质粒）对HEK-293细胞的体外转染

（1）将HEK-293细胞在含有10%小牛血清的培养液中连续培养（5%CO₂、37℃孵箱）。

（2）体外转染

转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×10⁴细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL，继续培养24小时。

（3）体外转染效率的测定

取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。表8为荧光素酶质粒的复合物的转染效率表。

绿色荧光蛋白（GFP）表达用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号。阳性细胞发出明亮的绿色荧光，而阴性细胞则无。用流式细胞仪检测阳性细胞的百分率。表9为绿色荧光蛋白质粒的复合物的转染效率表。

β-半乳糖苷酶染色细胞用0.01mol/L的PBS洗涤，用0.4%多聚甲醛固定5min,PBS冲洗后加入5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）染色液（配方为0.04%X-gal,5mmol/L亚铁氰化钾,5mmol/L高铁氰化钾和2mmol/LMgCl₂）,放置37℃，5%CO₂孵育3h。阳性细胞呈深蓝色，计算阳性细胞的百分率。表10为β-半乳糖苷酶质粒的复合物的转染效率表。

表8聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导荧光素酶质粒的体外转染效率数据表

表9聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率数据表

表10聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导β-半乳糖苷酶质粒的体外转染效率数据表

实施例5

利用聚乙烯亚胺-聚赖氨酸介导pGL3（荧光素酶质粒）、pEGFPN1（绿色荧光蛋白质粒）、pCMV-lac Z（β-半乳糖苷酶质粒）对NIH-3T3细胞的体外转染

（1）将NIH-3T3细胞在含有10%小牛血清的培养液中连续培养（5%CO₂、37℃孵箱）。

（2）体外转染

转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×10⁴细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL，继续培养24小时。

（3）体外转染效率的测定

取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。表11为荧光素酶质粒的复合物的转染效率表。

绿色荧光蛋白（GFP）表达用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号。阳性细胞发出明亮的绿色荧光，而阴性细胞则无。用流式细胞仪检测阳性细胞的百分率。表12为绿色荧光蛋白质粒的复合物的转染效率表。

β-半乳糖苷酶染色细胞用0.01mol/L的PBS洗涤，用0.4%多聚甲醛固定5min,PBS冲洗后加入5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）染色液（配方为0.04%X-gal,5mmol/L亚铁氰化钾,5mmol/L高铁氰化钾和2mmol/LMgCl₂）,放置37℃，5%CO₂孵育3h。阳性细胞呈深蓝色，计算阳性细胞的百分率。表13给出了β-半乳糖苷酶质粒的复合物的转染效率表。

表11聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导荧光素酶质粒的体外转染效率数据表

表12聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率数据表

表13聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导β-半乳糖苷酶质粒的体外转染效率数据表

实施例6

利用聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体介导沉默荧光素酶的LucsiRNA在HeLa细胞系中的转染

（1）将HeLa细胞在含有10%小牛血清的培养液中连续培养（5%CO₂、37℃孵箱）。

（2）体外转染

转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×10⁴细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL，继续培养24小时。

（3）体外转染效率的测定

取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。表14为荧光素酶沉默效率表。

表14聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导沉默荧光素酶的Luc siRNA的体外转染效率数据表

实施例7

利用聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体介导沉默荧光素酶的LucsiRNA在CT26细胞系中的转染

（1）取CT26细胞，在含有10%小牛血清的培养液中连续培养（5%CO₂、37℃孵箱）。

（2）体外转染

转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×10⁴细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL，继续培养24小时。

（3）体外转染效率的测定

取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。表15为荧光素酶的沉默效率数据表。

表15聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导沉默荧光素酶的Luc siRNA的体外转染效率数据表

实施例8

利用聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体介导沉默荧光素酶的LucsiRNA在Huh7细胞系中的转染

（1）取Huh7细胞，在含有10%小牛血清的培养液中连续培养（5%CO₂、37℃孵箱）。

（2）体外转染

转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×10⁴细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL，继续培养24小时。

（3）体外转染效率的测定

取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。表16为荧光素酶沉默效率表。

表16聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导沉默荧光素酶的Luc siRNA的体外转染效率的数据表

实施例9

利用聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体介导沉默荧光素酶的Luc siRNA在CHO细胞系中的转染

CHO细胞的培养

（1）取CHO细胞，在含有10%小牛血清的培养液中连续培养（5%CO2、37℃孵箱）。

（2）体外转染

转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×10⁴细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL，继续培养24小时。

（3）体外转染效率的测定

取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。表17为荧光素酶沉默效率数据表。

表17聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导沉默荧光素酶的Luc siRNA的体外转染效率数据表

实施例10聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统在体内pDNA转染中的应用

（1）CT26细胞的培养

取小鼠结肠癌CT26细胞，在含有10%（质量/体积百分数）的牛血清的培养液中，在含5%（体积百分数）CO₂、温度为37℃的孵箱中培养；

（2）肿瘤接种

购买重量在20g的Balb/C小鼠，肿瘤接种前，取对数生长期的CT26细胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×10³离心5min，PBS洗涤三次后，用PBS重悬细胞，按每只小鼠2×10⁶细胞的密度接种于腋下，10天后，瘤径长大至10mm时进行体内转染。

（3）体内转染

基因组转染的复合物颗粒在含有5%（质量/体积百分数）的葡萄糖溶液中至终体积0.5mL，尾静脉注射。

（4）体内转染效率的测定

体内转染48h后，处死小鼠，取出肿瘤，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，匀浆，然后加入荧光素底物，测定转染效率。表18为体内实验荧光素酶质粒的复合物的转染效率表。

表18聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导荧光素酶质粒体内转染效率的数据表

实施例11

聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统在体内si RNA转染中的应用

（1）取小鼠结肠癌CT26细胞，在含有10%（质量/体积百分数）的牛血清的培养液中，在含5%（体积百分数）CO₂、温度为37℃的孵箱中培养；

（2）肿瘤接种

购买重量在20g的Balb/C小鼠，肿瘤接种前，取对数生长期的CT26细胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×10³转/min离心5min，PBS洗涤三次后，用PBS重悬细胞，按每只小鼠2×10⁶细胞的密度接种于腋下，8天后，瘤径长大至7mm时进行体内siRNA的转染。

（3）体内转染

基因物质选用沉默血管内皮生长因子的VEGF siRNA，通过抑制VEGF的表达实现抑制肿瘤生长的目的，基因组转染的复合物颗粒在含有5%（质量/体积百分数）的葡萄糖溶液中至终体积50μL，尾静脉注射给药。

（4）体内肿瘤生长的测定

从第一次给药开始测量瘤径大小，实验共14天。表19为体内实验VEGF siRNA的复合物对肿瘤抑制14天后的瘤径。

表19聚乙烯亚胺-聚赖氨酸基因载体系统介导VEGF siRNA体内的转染效率和瘤径大小的数据表

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种具有式（Ⅰ）结构的聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物，

其中，n1≥1；n2≥1；n3≥1；

x≥1，y≥1且40≤x+y≤60。

2.一种具有式（Ⅰ）结构的聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物的制备方法，包括以下步骤：

将聚乙烯亚胺与ε-苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐在第一有机溶剂中进行聚合反应，得到聚乙烯亚胺聚ε-苄氧羰基-L-赖氨酸共聚物；

将卤化氢溶液、第二有机溶剂与所述聚乙烯亚胺聚ε-苄氧羰基-L-赖氨酸共聚物混合，反应后得到具有式（Ⅰ）结构的聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物；

其中，n1≥1；n2≥1；n3≥1；

x≥1，y≥1且40≤x+y≤60。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一有机溶剂为氯仿、二氯甲烷或N’N’-二甲基甲酰胺。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述ε-苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐与所述第一有机溶剂的比例为1g：（10~100）mL。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺与所述第一有机溶剂的比例为1g：（10~100）mL。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺与所述ε-苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐的质量比为1：9~9：1。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第二有机溶剂为三氟乙酸或二氯乙酸。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述聚合反应的时间为12~24h，所述聚合反应的温度为0~50℃。

9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述卤化氢溶液为卤化氢的醋酸溶液。

10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，得到聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物的步骤中所述反应的时间为2~10h。

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