CN103320471A

CN103320471A - 一种非病毒基因载体及其制备方法

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Publication number: CN103320471A
Application number: CN2013102604730A
Authority: CN
Inventors: 田华雨; 王萍; 陈学思; 郭兆培
Original assignee: Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Current assignee: Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Priority date: 2013-06-26
Filing date: 2013-06-26
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-06-26
Also published as: CN103320471B

Abstract

本发明提供了一种非病毒基因载体，包括超支化聚乙烯亚胺、金银合金纳米颗粒；所述金银合金纳米颗粒以硫金键和硫银键与超支化聚乙烯亚胺结合。本发明提供的非病毒基因载体能够与基因物质较好的复合，将基因物质导入细胞进行表达，并实现治疗的目的。在本发明中，超支化聚乙烯亚胺与基因物质能够良好的复合，且金银合金纳米颗粒能够促进基因的转染，提高了基因的转染效率。而且，本发明提供的非病毒基因载体具有较强的发光性能与光稳定性能，能够用于荧光标记，有利于对基因物质在体内的示踪。

Description

一种非病毒基因载体及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因治疗技术领域，尤其涉及一种非病毒基因载体及其制备方法。

背景技术

随着人类基因组计划的迅速发展，人们对生命基因基础的认识达到了一个新的水平，对遗传病等对人类生命有重大威胁的疾病的治病原因也有了更全面的认识。基因治疗是伴随DNA重组技术而发展起来的一种治疗手段，它是指用正常或野生型基因矫正或置换致病基因的一种治疗方法。基因治疗不仅可以治疗遗传病，如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等，现在已可以治疗肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、传染病等各个领域。近年来国内外对多种疾病致病基因的研究发展迅速，为基因治疗发展提供了坚实的理论基础和技术条件，使基因治疗有望成为攻克人类顽疾的一种有效方法。

将基因物质导入细胞进行表达并且实现治疗的目的，离不开基因载体对基因物质的运载。最开始应用也是应用最广泛的基因载体是病毒类基因载体，其中包括逆转录病毒、腺病毒（AV）、腺相关病毒（AAV）、单纯疱疹病毒（HSV）、痘苗病毒（VV）等载体。然而，病毒类基因载体有着对外源基因的容纳少，稳定性差，会引起免疫系统的反应等缺点，并且病毒类基因载体的应用有着潜在的不安全因素，已经发生了由于病毒类基因载体引发的医疗事故。

所以现在常用安全、有效、无免疫原性的非病毒类基因载体来代替病毒类基因载体对基因物质进行运载。阳离子聚合物是非病毒类基因载体中受关注程度最大，应用也是最多的基因载体，它主要包括聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、壳聚糖等。这些载体虽然比病毒类的基因载体安全，但是仍然存在转染效率低的缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非病毒基因载体及其制备方法，本发明提供的非病毒基因载体具有较高的转染效率。

本发明提供了一种非病毒基因载体，包括超支化聚乙烯亚胺和金银合金纳米颗粒；

所述金银合金纳米颗粒以硫金键和硫银键与超支化聚乙烯亚胺结合。

优选的，所述超支化聚乙烯亚胺的数均分子量为300～30000。

优选的，所述金银合金纳米颗粒的质量与所述超支化聚乙烯亚胺的质量比为1:100～100:1。

优选的，所述金银合金纳米颗粒中金银的摩尔比为1:100～100:1。

优选的，所述金银合金纳米颗粒的粒径为1nm～20nm。

本发明提供了一种非病毒基因载体的制备方法，包括以下步骤：

a）在冰浴条件下，将硫辛酸、N-羟基琥珀酰亚胺和N,N’-二环己基碳二亚胺在有机溶剂中进行反应，再在20℃～45℃下反应，得到活化后的硫辛酸；

b）将所述活化后的硫辛酸与聚乙烯亚胺在有机溶剂中反应，得到连接有硫辛酸的聚乙烯亚胺；

c）将所述连接有硫辛酸的聚乙烯亚胺与硝酸银、氯金酸和还原剂混合，反应后得到非病毒基因载体。

优选的，所述硫辛酸、N-羟基琥珀酰亚胺、N,N’-二环己基碳二亚胺与聚乙烯亚胺的质量比为（1～500）:（1～300）:（1～500）:（10～5000）。

优选的，所述步骤a）中在20℃～45℃下反应的时间为12h～24h。

本发明提供了一种非病毒基因载体复合物，包括上述技术方案所述的非病毒基因载体或上述技术方案所述制备方法得到的非病毒基因载体和基因物质。

优选的，所述非病毒基因载体与基因物质的质量比为0.1:1～100:1。

本发明提供了一种非病毒基因载体，包括超支化聚乙烯亚胺和金银合金纳米颗粒；所述金银合金纳米颗粒以硫金键和硫银键与超支化聚乙烯亚胺结合。本发明提供的非病毒基因载体能够与基因物质较好的复合，将基因物质导入细胞进行表达，并实现治疗的目的。在本发明中，超支化聚乙烯亚胺与基因物质能够良好的复合，且金银合金纳米颗粒能够促进基因的转染，提高了基因的转染效率，且毒性较低，使用安全。而且，本发明提供的非病毒基因载体具有较强的发光性能与光稳定性能，能够用于荧光标记，有利于对基因物质在体内的示踪。实验结果表明，本发明提供的非病毒基因载体用于基因转染时的体外转染效率可达到3.976×10⁶RLU/mg Protein，体内转染的转染效率可达到2.321×10⁴RLU/mg Protein。

附图说明

图1为本发明实施例1得到的非病毒基因载体中Au的4f能级的XPS谱图；

图2为本发明实施例1得到的非病毒基因载体中Ag的3d能级的XPS谱图；

图3为本发明实施例2得到的非病毒基因载体中Au的4f能级的XPS谱图；

图4为本发明实施例2得到的非病毒基因载体中Ag的3d能级的XPS谱图；

图5为本发明实施例3得到的非病毒基因载体中Au的4f能级的XPS谱图；

图6为本发明实施例3得到的非病毒基因载体中Ag的3d能级的XPS谱图；

图7为本发明实施例4得到的复合物颗粒的电泳实验结果；

图8为本发明实施例14得到的共聚焦结果；

图9为本发明实施例15得到的共聚焦结果；

图10为本发明实施例16得到的共聚焦结果；

图11为本发明实施例17得到的体内标记结果。

具体实施方式

本发明提供的非病毒基因载体能够与基因物质，如质粒DNA或RNA较好的复合，得到的基因复合颗粒在体内和体外均具有较高的转染效率，而且，本发明提供的非病毒基因载体具有较高的发光强度和光稳定性能，有利于其在基因治疗领域的应用。

本发明提供的非病毒基因载体包括超支化聚乙烯亚胺。本发明对所述超支化聚乙烯亚胺的来源、支化度等没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的任意支化度的聚乙烯亚胺即可。在本发明中，所述超支化聚乙烯亚胺的数均分子量优选为300～30000，更优选为500～25000，最优选为1000～20000。

本发明提供的非病毒基因载体包括金银合金纳米颗粒，所述金银合金纳米颗粒与上述技术方案所述的超支化聚乙烯亚胺以硫金键和硫银键结合。在本发明中，所述金银合金纳米颗粒的粒径优选为1nm～20nm，更优选为2nm～10nm。在本发明中，所述金银合金纳米颗粒中金银的的摩尔比优选为1:100～100:1，更优选为5:90～90:5，最优选为10:80～80:10；所述金银合金纳米颗粒的质量与所述超支化聚乙烯亚胺的质量比优选为1:100～100:1，更优选为5:95～95:5，最优选为15:85～85:15。

本发明在冰浴条件下，将硫辛酸（Lip）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和N,N’-二环己基碳二亚胺（DCC）在有机溶剂中进行反应，再在20℃～45℃下反应，得到活化后的硫辛酸。本发明对所述有机溶剂的种类和用量没有特殊的限制，能够将硫辛酸、N-羟基琥珀酰亚胺和N,N’-二环己基碳二亚胺溶解，提供一个良好的反应介质，且有利于后期的除去即可。在本发明中，所述有机溶剂优选为无水氯仿。在本发明中，所述硫辛酸、N-羟基琥珀酰亚胺和N,N’-二环己基碳二亚胺的质量比优选为（1～500）:（1～300）:（1～500）:（10～5000），更优选为（20～300）:（10～200）:（20～300）:（50～2000）；在本发明中，所述冰浴条件下反应的时间优选为1h～5h，更优选为2h～3.5h；优选将冰浴条件下得到的反应液在15℃～40℃下反应，更优选为20℃～30℃，该反应的时间优选为12h～24h，更优选为15h～21h。

完成对硫辛酸的活化，得到活化后的硫辛酸后，本发明将活化后的硫辛酸与聚乙烯亚胺在有机溶剂中反应，得到连接有硫辛酸的聚乙烯亚胺。本发明优选将聚乙烯亚胺溶于有机溶剂，然后将得到的活化后的硫辛酸用G₄砂芯漏斗过滤，将滤液加入到聚乙烯亚胺的有机溶液中，进行反应，得到连接有硫辛酸的聚乙烯亚胺。本发明对所述有机溶剂的种类和用量没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的能够将聚乙烯亚胺溶解、为聚乙烯亚胺和活化后的硫辛酸提供良好的反应介质，且能够有利于后期除去即可。在本发明中，所述有机溶剂优选为无水氯仿。在本发明中，所述G₄砂芯漏斗即为本领域技术人员熟知的孔径为3μm～4μm的过滤用砂芯漏斗。在本发明中，所述聚乙烯亚胺与上述技术方案所述硫辛酸的质量比优选为（10～5000）:（1～500），更优选为（50～2000）:（20～300）；所述聚乙烯亚胺与所述活化的硫辛酸反应的时间优选为12h～24h，更优选为15h～21h；

本发明在完成所述聚乙烯亚胺与所述活化的硫辛酸的反应后，优选除去得到的反应液中的有机溶剂，将得到的固体用水溶解、过滤、冻干，得到连接有硫辛酸的聚乙烯亚胺（PEI-Lip）。本领域技术人员可根据上述技术方案中采用的有机溶剂的种类而选择合适的去除有机溶剂的方法，本发明对此没有特殊的限制。如采用无水氯仿作为有机溶剂，则可以采用真空泵抽去反应液中的氯仿，然后将得到的固体用水溶解，过滤、冻干后，得到连接有硫辛酸的聚乙烯亚胺。本发明对所述过滤和冻干的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的过滤和冻干的技术方案即可，本发明优选采用G4砂芯漏斗对得到的水溶液进行过滤。

得到连接有硫辛酸的聚乙烯亚胺后，本发明将所述连接有硫辛酸的聚乙烯亚胺与硝酸银、氯金酸和还原剂混合，反应后得到非病毒基因载体。本发明优选将所述连接有硫辛酸的聚乙烯亚胺用二次水溶解，并向其中加入与水等体积的二甲基亚砜，得到连接有硫辛酸的聚乙烯亚胺溶液；将硝酸银溶液加入到所述连接有硫辛酸的聚乙烯亚胺溶液中，室温下进行反应；再向其中加入氯金酸溶液，室温下进行反应；最后再向其中加入还原剂溶液，在室温下进行反应，得到非病毒基因载体；

本发明对溶解所述连接有硫辛酸的聚乙烯亚胺二次水和二甲基亚砜的用量没有特殊的限制，能够将所述连接有硫辛酸的聚乙烯亚胺完全溶解，并且为后续反应提供良好的反应介质即可。在本发明中，所述硝酸银溶液中的溶剂优选为水和二甲基亚砜中的一种或两种；所述氯金酸溶液中的溶剂优选为水和二甲基亚砜中的一种或两种；所述还原剂溶液中的溶剂优选为水和二甲基亚砜中的一种或两种。所述氯金酸与所述硝酸银的摩尔比优选为1:100～100:1，更优选为5:90～90:5，最优选为10:80～80:10；所述氯金酸中的金元素与所述硝酸银中的银元素的总质量与上述技术方案所述的聚乙烯亚胺的质量比优选为1:100～100:1，更优选为5:95～95:5，最优选为15:85～85:15。所述还原剂优选为硼氢化钠、水合肼和抗坏血酸中的一种或几种，更优选为硼氢化钠；本发明对所述硝酸银溶液的质量浓度、氯金酸溶液的质量浓度和还原剂的质量浓度没有特殊的限制，能够将硝酸银、氯金酸和还原剂溶解即可；

在本发明中，所述连接有硫辛酸的聚乙烯亚胺与硝酸银反应的时间优选为20分钟～40分钟，更优选为25分钟～35分钟，最优选为30分钟；接着与氯金酸反应的时间优选为20分钟～40分钟，更优选为25分钟～35分钟，最优选为30分钟；再接着与还原剂反应的时间优选为18小时～36小时，更优选为21小时～33小时，最优选为24小时～30小时；

完成与还原剂的反应后，本发明优选将得到的反应产物采用透析袋透析，然后进行冻干，得到非病毒基因载体。本发明对所述透析和冻干的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的透析和冻干的技术方案即可。在本发明中，所述透析袋的截留分子量优选为3000Da～4000Da，更优选为3500Da。

本发明提供的制备方法简单，通过还原氯金酸、硝酸银和聚乙烯亚胺的聚合物直接得到非病毒基因载体，而且得到的非病毒基因载体的发光性能稳定，发光强度较高。

本发明为了能够实现基因转染，提供一种非病毒基因载体复合物，包括上述技术方案所述的非病毒基因载体或上述技术方案所述制备方法得到的非病毒基因载体和基因物质。基因物质能够与本发明提供的非病毒基因载体良好的复合，实现对基因物质的负载，有利于后续的基因转染过程的进行。本发明对所述基因物质没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的基因物质即可，如可以为质粒DNA，也可以为RNA。本发明对所述质粒DNA或RNA的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的质粒DNA或RNA即可，如所述质粒DNA可以采用在真核细胞表达的质粒DNA。在本发明中，所述非病毒基因载体与所述基因物质的质量比优选为0.1:1～100:1，更优选为0.5:1～90:1，最优选为1:1～50:1。

在本发明中，所述非病毒基因载体复合物的制备方法优选包括以下步骤：

将非病毒基因载体与基因物质在水溶液中混合，静置后得到非病毒基因载体复合物。

本发明优选先将非病毒基因载体用二次水溶解，再用孔径为0.22μm的微孔滤膜对得到的水溶液过滤除菌，得到非病毒基因载体水溶液；将基因物质用二次水溶解，得到基因物质水溶液；将所述非病毒基因载体水溶液与所述基因物质水溶液混合，将得到的混合溶液在室温下静置，促进非病毒基因载体与所述基因物质的复合，得到非病毒基因载体复合物。在本发明中，所述静置的时间优选为20分钟～40分钟，更优选为25分钟～35分钟，最优选为30分钟。本发明对溶解所述非病毒基因载体和基因物质的二次水的用量没有特殊的限制，能够将非病毒基因载体和基因物质充分溶解即可。

本发明检测了得到的非病毒基因载体复合物在体内和体外转染的结果，所述体外转染的具体过程如下所示：

转染前24小时内，取对数生长期的转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系（293T细胞），胰酶消化后用DMEM(GIBCO)稀释，按每孔4×10⁵细胞的密度接种于每孔含2mL培养液的6孔培养板，将293T细胞置于含有体积百分数为5%的CO₂、温度为37℃的孵箱中继续培养至80～90%融合，转染时，弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤一次后，向其中加入上述技术方案所述的非病毒基因载体复合物溶液以及含有质量百分数为10%的小牛血清的DMEM培养基至终体积2mL，继续培养48小时；本发明采用市售的DMEM培养基，如可以采用gibco出售的DMEM培养基的市售商品，按照产品说明书中的配置方法进行配制，其中加了10%(v/v)heat-inactivatedFBS（热灭火优级胎牛血清）和1%的penicillin–streptomycin（青链霉素双抗溶液）

完成培养过程后，本发明按照下述过程进行体外转染效率的测定：

取出培养板，用PBS清洗细胞一次，然后向其中加入胰酶消化，离心除去上清，然后加入PBS重悬，用流式细胞仪测定细胞转染效率；

或者取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤一次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，用光度计测定转染效率。

在本发明中，所述体内转染的具体过程如下所示：

取5周的巴比赛裸鼠，在腹侧皮下接种人宫颈癌上皮细胞的细胞株，待肿瘤直径长至0.4cm后，将巴比赛裸鼠随机分为两组，每组6只，分别在肿瘤内注射含5μg荧光素酶质粒的基因组转染的复合物颗粒溶液100μL，所述荧光素酶质粒的基因组转染复合物颗粒包括上述技术方案所述的非病毒基因载体和荧光素酶质粒，所述非病毒基因载体和荧光素酶质粒的质量比为10:1；第二天重复注射一次，注射后48小时，用精诺真活体成像仪观测体内转染效果，在进行活体成像观察之前，将小鼠麻醉。麻醉5分钟后，向小鼠体内注入200μL荧光素酶底物，10分钟后，用活体成像系统观察体内转染效果。

实验结果表明，本发明提供的非病毒基因载体与基因物质能够很好的复合，负载上基因物质后，在体外的转染效率可达3.976×10⁶RLU/mg Protein，体内转染的转染效率可达到2.321×10⁴RLU/mg Protein。

本发明提供的非病毒基因载体具有较强的发光性能与光稳定性，能够用于荧光标记，具体过程如下：

取人宫颈癌细胞（HeLa细胞），在CO₂体积百分含量为5%、温度为37℃孵箱中，用含质量百分数为10%的小牛血清培养液连续培养；

将上述技术方案所述的非病毒基因载体加水溶解，配置成质量浓度为10mg/mL的溶液，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌；用去离子水配制质量浓度为0.1mg/mL的质粒DNA水溶液；按照非病毒基因载体与质粒DNA的质量比为0.1:1～100:1，将非病毒基因载体水溶液和质粒DNA水溶液混合，将得到的混合溶液在室温放置30分钟，使它们有效复合，得到非病毒基因载体-质粒DNA复合物；

在六孔板中种细胞，每孔1.0×10⁶个，在37℃孵箱中培养24小时，向其中加入复合好的非病毒基因载体-质粒DNA溶液，使质粒DNA的量为每孔50μg，继续培养5小时后，取出细胞，用磷酸缓冲溶液轻轻冲洗5遍，然后用质量浓度为0.5μg/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核避光标记12分钟，再用磷酸缓冲溶液冲洗5遍，用甘油封片，进行激光共聚焦扫描。结果表明，本发明提供的非病毒基因载体用于荧光标记时，其发光性能更强，更好的起到了标记作用。是一种良好的荧光材料。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种非病毒基因载体及其制备方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将103mg Lip、69.1mg NHS和124mg DCC混合，在冰浴条件下向其中加入约15mL无水CHCl₃反应2小时，然后在室温下反应24小时，得到活化后的Lip溶液；

将900mg数均分子量为1.8K的PEI溶于10mL无水CHCl₃中，将活化后的Lip溶液用G₄漏斗过滤到上述PEI溶液中，反应24小时，再用真空泵抽去氯仿，将得到的固体用水溶解、G₄漏斗过滤冻干，得到PEI-Lip复合物；

将1g冻干好的PEI-Lip用水溶解，再向其中加入与水等体积的DMSO，混合均匀；把用水和DMSO溶解好的5.7mg AgNO₃溶液加入PEI-Lip溶液中，反应30分钟，再向其中加入用水和DMSO溶解好的27.5mg HAuCl₄反应30分钟，最后加入用水和DMSO溶解的NaBH₄反应24小时；反应后将得到的反应溶液用透析袋透析，透析后冻干，得到非病毒基因载体。

本发明将得到的产物进行X-射线光电子能谱（XPS）检测，结果如图1和图2所示，图1为本发明实施例1得到的非病毒基因载体中Au的4f能级的XPS谱图，图2为本发明实施例1得到的非病毒基因载体中Ag的3d能级的XPS谱图。

由图1和图2计算得到，在得到的非病毒基因载体包含的金属中，Au的质量含量为68.83%，Ag的质量含量为31.17%，金属与PEI的质量比为1:5，金属中Ag和Au的质量比为1:2。

实施例2

将103mg Lip、69.1mg NHS和124mg DCC混合，在冰浴条件下加入约15mL无水CHCl₃反应2小时，然后在室温下再反应24小时，完成对Lip的活化；

将900mg数均分子量为1.8K的PEI溶于15mL无水CHCl₃中，将活化后的Lip溶液用G₄漏斗过滤到上述PEI溶液中，反应24小时，再用真空泵抽去氯仿，将得到的固体用水溶解、G₄漏斗过滤冻干，得到PEI-Lip复合物；

将2g冻干好的PEI-Lip用水溶解，再向其中加入与水等体积的DMSO，混合均匀；把用水和DMSO溶解好的5.7mg AgNO₃溶液加入PEI-Lip溶液中，反应30分钟，再向其中加入用水和DMSO溶解好的27.5mg HAuCl₄反应30分钟，最后加入用水和DMSO溶解的NaBH₄反应24小时；反应后将得到的反应溶液用透析袋透析，透析后冻干，得到非病毒基因载体。

本发明将得到的非病毒基因载体进行检测，结果如图3和图4所示，图3为本发明实施例2得到的非病毒基因载体中Au的4f能级的XPS谱图；图4为本发明实施例2得到的非病毒基因载体中Ag的3d能级的XPS谱图；根据图3和图4计算得到，在得到的非病毒基因载体包含的金属中，Au的质量含量为69.73%，Ag的质量含量30.27%；金属与PET的质量比为1:10，金属中Ag和Au的质量比为1:2。

实施例3

将103mg Lip、69.1mg NHS和124mg DCC混合，在冰浴条件下向其中加入约15mL无水CHCl₃反应2小时，然后在室温条件下反应24小时，完成对Lip的活化；

将1g冻干好的PEI-Lip用水溶解，且加入与水等体积的DMSO，混合均匀；把用水和DMSO溶解好的11.313mg AgNO₃溶液加入PEI-Lip溶液中，反应30分钟，再向其中加入用水和DMSO溶解好的13.72mg HAuCl₄反应30分钟，最后加入用水和DMSO溶解的NaBH₄反应24小时；反应后将得到的反应产物用透析袋透析，透析后冻干，得到非病毒基因载体。

本发明将得到的非病毒基因载体进行检测，结果如图5和图6所示，图5为本发明实施例3得到的非病毒基因载体中Au的4f能级的XPS谱图；图6为本发明实施例3得到的非病毒基因载体中Ag的3d能级的XPS谱图；根据图5和图6计算得到，在得到的非病毒基因载体包含的金属中，Au的质量含量为57.42%，Ag的质量含量为42.58%；金属与PET的质量比为1:3，金属中Ag和Au的质量比为1:1。

实施例4

将实施例1非病毒基因载体加水溶解，得到非病毒基因载体的水溶液，用孔径为0.22μm的微孔滤膜将得到的水溶液过滤除菌；

用二次水配制质粒DNA水溶液，所述质粒DNA采用在真核细胞表达的质粒DNA；

分别按照非病毒基因载体：质粒DNA的质量比为0.1:1、0.2:1、0.4:1、0.6:1、0.8:1和1:1，将非病毒基因载体的水溶液和质粒DNA水溶液混合，将得到的混合溶液置于室温放置30分钟，进一步促进非病毒基因载体与质粒DNA复合物颗粒的形成，得到非病毒基因载体-质粒DNA复合物颗粒。

本发明将得到的非病毒基因载体-质粒DNA复合物颗粒进行电泳实验，结果如图7所示，图7为本发明实施例4得到的复合物颗粒的电泳实验结果，由左至右依次为质量为0.1:1、0.2:1、0.4:1、0.6:1、0.8:1和1:1的非病毒基因载体和质粒DNA得到的复合物颗粒，由图7可以看出，在非病毒基因载体与质粒DNA的质量比为0.6:1时，非病毒基因载体与质粒DNA完全复合。

实施例5～7

分别将实施例1～3制备的非病毒基因载体加水溶解，按照实施例4所述的技术方案进行非病毒基因载体-质粒DNA复合颗粒的制备，在本实施例中，质粒DNA为荧光素酶质粒，非病毒基因载体与荧光素酶质粒的质量比为10:1。

实施例8～10

取对数生长期的B16F10细胞，胰酶消化后用DMEM稀释成每毫升含5×10⁴个细胞的细胞溶液；按每孔1×10⁴细胞的密度接种于每孔含0.2mL培养液的孔96孔培养板；

将B16F10细胞置于含有体积百分数为5%的CO₂、温度为37℃的孵箱中继续培养至80%～90%融合，放置一天后进行转染，弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤一次后，分别向其中加入实施例5～7得到的非病毒基因载体-质粒DNA复合物颗粒溶液，以及含有质量百分数为10%的小牛血清的DMEM培养基至终体积0.2mL，继续培养48小时；

体外转染效率的测定：

取出培养板，用PBS清洗细胞一次，然后加入胰酶消化，离心除去上清，然后加入PBS重悬，取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤一次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物（Promega，E1501），用光度计测定转染效率，结果如表1所示，表1为本发明实施例8～10得到的体外转染效率测试结果。

表1本发明实施例8～10得到的体外转染效率测试结果

由表1可以看出，本发明实施例1～3所合成的非病毒基因载体与荧光素酶质粒复合后得到的的复合物对B16F10细胞具有较高的的体外转染效率。

实施例11～13

取5周的巴比赛裸鼠，在腹侧皮下接种人宫颈癌上皮细胞的细胞株，待肿瘤直径长至0.4cm后，将巴比赛裸鼠随机分为两组，每组6只；分别在瘤内注射实施例6～7制备的含5μg荧光酶质粒（pGL3）的非病毒基因载体-质粒DNA复合颗粒100μL；第二天重复注射一次，注射后48小时，用精诺真活体成像仪观测体内转染效果，具体测试过程如下：

在进行活体成像观察之前，将小鼠麻醉，麻醉5分钟后，向小鼠体内注入200μL荧光素酶底物（Promega，E1501）。10分钟后，用活体成像系统观察体内转染效果，结果如表2所示，表2为本发明实施例11～13得到的体内转染效率测试结果。

表2本发明实施例11～13得到的体内转染效率测试结果

由表1可以看出，本发明实施例1～3所合成的非病毒基因载体与荧光素酶质粒复合后得到的的复合物对人宫颈癌细胞具有较高的的体内转染效率。

实施例14～16

取人宫颈癌细胞（HeLa细胞），在CO₂体积百分含量为5%、温度为37℃的孵箱中，用含质量百分数为10%的小牛血清培养液连续培养；

分别将实施例1～3制备的非病毒基因载体加水溶解，配置成质量浓度为10mg/mL的水溶液，用孔径为0.22μm的微孔滤膜将得到的水溶液过滤除菌；用去离子水配制浓度为0.1mg/mL的质粒DNA水溶液；按照非病毒基因载体与质粒DNA的质量比为0.1:1～160:1，将非病毒基因载体水溶液和质粒DNA水溶液等体积混合，将得到的混合溶液在室温放置30分钟，使非病毒基因载体和质粒DNA有效复合；

取六孔板，在六孔板中种细胞，每孔1.0×10⁶个，在37℃孵箱中培养24小时，加入复合好的非病毒基因在-质粒DNA溶液，使质粒DNA的量为每孔50μg，继续培养5小时后，取出细胞，用磷酸缓冲溶液轻轻冲洗5遍，然后用0.5μg/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（以后简称DAPI）对细胞核避光标记12分钟，再用磷酸缓冲溶液冲洗5遍，用甘油封片，进行激光共聚焦扫描。

结果如图8～10所示，其中图8为本发明实施例14得到的共聚焦结果，图9为本发明实施例15得到的共聚焦结果，图10为本发明实施例16得到的共聚焦结果，由图8～10可以看出，本发明提供的非病毒基因载体材料都可以进入细胞并且发红色荧光，但比例不同发光强度不同，在图8～10中，图8中的荧光强度最低，图9中的荧光强度最高，图10中的荧光强度居中。

实施例17

把实施例1制备的非病毒基因载体加水溶解，配置成质量浓度分别为10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL的水溶液，用孔径为0.22μm的微孔滤膜将得到的水溶液过滤除菌；

取5周的巴比赛裸鼠进行皮下注射，用活体成像系统观察体内荧光效果。

结果如图11所示，图11为本发明实施例17得到的体内标记结果，在图11中，上部为质量浓度为10mg/mL的非病毒基因载体荧光标记结果，中部为质量浓度为5mg/mL的非病毒基因载体荧光标记结果，下部为质量浓度为2.5mg/mL的非病毒基因载体荧光标记结果，由图11可以看出，本发明提供的非病毒基因载体具有很好的体内荧光标记性能。

由以上实施例可知，本发明提供了一种非病毒基因载体，包括超支化聚乙烯亚胺和金银合金纳米颗粒；所述金银合金纳米颗粒以硫金键和硫银键与超支化聚乙烯亚胺结合。本发明提供的非病毒基因载体能够与基因物质较好的复合，将基因物质导入细胞进行表达，并实现治疗的目的。在本发明中，超支化聚乙烯亚胺与基因物质能够良好的复合，且金银合金纳米颗粒能够促进基因的转染，提高了基因的转染效率，且毒性较低，使用安全。而且，本发明提供的非病毒基因载体具有较强的发光性能与光稳定性能，能够用于荧光标记，有利于对基因物质在体内的示踪。实验结果表明，本发明提供的非病毒基因载体用于基因转染时的体外转染效率可达到3.976×10⁶RLU/mgProtein，体内转染的转染效率可达到2.321×10⁴RLU/mg Protein。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种非病毒基因载体，包括超支化聚乙烯亚胺和金银合金纳米颗粒；

2.根据权利要求1所述的非病毒基因载体，其特征在于，所述超支化聚乙烯亚胺的数均分子量为300～30000。

3.根据权利要求1所述的非病毒基因载体，其特征在于，所述金银合金纳米颗粒的质量与所述超支化聚乙烯亚胺的质量比为1:100～100:1。

4.根据权利要求1所述的非病毒基因载体，其特征在于，所述金银合金纳米颗粒中金银的摩尔比为1:100～100:1。

5.根据权利要求1所述的非病毒基因载体，其特征在于，所述金银合金纳米颗粒的粒径为1nm～20nm。

6.一种非病毒基因载体的制备方法，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述硫辛酸、N-羟基琥珀酰亚胺、N,N’-二环己基碳二亚胺与聚乙烯亚胺的质量比为（1～500）:（1～300）:（1～500）:（10～5000）。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a）中在20℃～45℃下反应的时间为12h～24h。

9.一种非病毒基因载体复合物，包括权利要求1～5任意一项所述的非病毒基因载体或权利要求6～8任意一项所述制备方法得到的非病毒基因载体和基因物质。

10.根据权利要求9所述的非病毒基因载体复合物，其特征在于，所述非病毒基因载体与基因物质的质量比为0.1:1～100:1。