CN104073516A - 一种基因载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因载体及其制备方法和应用。该基因载体包括作为核心的金属纳米颗粒以及连接在金属纳米颗粒表面的阳性聚合物，该阳性聚合物为多聚赖氨酸。本发明还公开了基因载体的制备方法及其在表皮干细胞转染中的应用。本发明的基因载体通过多聚赖氨酸、穿膜肽与金属纳米颗粒的连接，提高了基因载体的转染效率、降低了其对细胞毒性的影响，有效地利用了多聚赖氨酸的低毒特性，并成功优化了多聚赖氨酸的低转染效率特性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种含金属纳米材料和阳离子聚合物的基因载体及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，随着人类基因组计划的进展及对功能基因的不断探索，基因治疗的研究受到越来越多人的关注，基因治疗自20世纪八十年代进入临床试验以来，其应用已从遗传性病症的治疗扩展到获得性疾病的防治，如组织工程与再生医学等。对于基因重组及基因转染而言，安全性好且能产生基因高效、定位表达的载体是构建载体的关键所在。
目前常用的基因转染载体有病毒型和非病毒型两种。病毒载体有高效传递和表达基因的能力，但存在制备复杂、生物安全性低和非导向性的特点。对于创伤、烧伤、辐射等非内源性疾病导致的急性皮肤损伤，病毒载体转染后，目标基因在宿主体内长时间的高效表达在组织修复以后会给机体带来不利的影响和潜在的致癌风险。相比之下，非病毒载体介导外源性基因瞬时表达的特点更适于急性创伤的基因给药。此外，低毒、低免疫原性、相对靶向性和制备简单等优点也使非病毒载体的应用越来越广。但与病毒载体不同，结构简单的非病毒载体很难帮助基因穿过从细胞外到细胞内的所有屏障从而实现基因的高效表达。传递效率低，基因表达不稳定是非病毒载体应用过程中亟待解决的问题。
公布号为CN103320471A的专利文献公开了一种非病毒基因载体，包括超支化乙烯亚胺、金银合金纳米颗粒；所述金银合金纳米颗粒以硫金键和硫银键与超支化聚乙烯亚胺结合。本发明提供的非病毒基因载体能够与基因物质较好的复合，将基因物质导入细胞进行表达，并实现治疗的目的。该发明中的超支化聚乙烯亚胺与基因物质能够良好的复合，且金银合金纳米颗粒能够促进基因的转染，提高了基因的转染效率。
上述专利文献所公开的非病毒基因载体虽然能够提高基因的转染效率，但其生物毒性却较高。以聚乙亚胺为材料合成的载体虽然能够显著提高转染效率，但由于该材料容易被细胞内的酶类分解产生有毒物质，所以具有较高细胞毒性。因此如何能够在保证基因载体具有高转染率的同时降低细胞毒性是一个非常重要的研究课题。
发明内容
本发明的目的在于针对目前现有技术中的不足之处，提供一种转染效率高、毒性低的基因载体。
本发明提供了一种基因载体，包括作为核心的金属纳米颗粒以及连接在金属纳米颗粒表面的阳性聚合物，所述阳性聚合物为多聚赖氨酸。
多聚赖氨酸(PLL)是一种阳离子聚合物材料，其作为基因载体组成部分，能够在正负电荷相互吸引的静电作用下，与带负电荷的DNA分子结合，可以将质粒由几百纳米的松散线性分子压缩成直径数十纳米的致密颗粒。并且，与其它基因转染试剂相比，多聚赖氨酸拥有较高的生物相容性、具有较低的细胞毒性。
所述基因载体的粒径为13～37nm，表面电荷为23～30mV。
多聚赖氨酸的分子量影响基因载体及DNA复合物的粒径，分子量过大会导致复合物无法穿过细胞膜，所述多聚赖氨酸的分子量选用60000～300000道尔顿较为适宜。
穿膜肽(TAT)是一些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽，可携带比其分子量大100倍的外源性疏水大分子进入细胞，毒副作用小。因此优选的，所述金属纳米颗粒表面连接有穿膜肽。
穿膜肽的分子量及数量影响基因载体的转染效率，所述穿膜肽的分子量优选为100～10000道尔顿；所述穿膜肽与金属纳米颗粒的质量比优选为0.5～100。
所述穿膜肽的氨基酸序列为CCYGRKKRRQRRR，该氨基酸序列的穿膜肽能够高效地帮助基因载体穿透细胞膜，从而提高整个基因载体的转染效率。
所述金属纳米颗粒为金纳米颗粒或银纳米颗粒；金纳米颗粒(Au)和银纳米颗粒(Ag)，具有独特的物理化学特性，如粒径小、光学特性、比表面积和表面电荷高、易于修饰等优势，以它们作为核心，与阳性聚合物连接，能够显著提高基因载体的转染效率。
本发明还提供了一种基因载体的制备方法，包括：
将多聚赖氨酸加入金属离子溶液中混合均匀，然后在搅拌条件下加入还原剂进行氧化还原反应，反应完成后从反应液中分离获得所述基因载体。
所述的还原剂为NaBH4；所述的金属离子溶液分别为HAuCl4溶液或AgNO3溶液。
所述制备方法中多聚赖氨酸与HAuCl4溶液或AgNO3溶液的反应时间为0.5-100h，反应温度为10-200℃。
所述制备方法中分离纯化的方法为超滤管离心分离反应液，去除游离的多聚赖氨酸与穿膜肽，得到纯化的基因载体。此外，也可采用透析袋进行基因载体的分离纯化。
所述超滤管的分子量为1-100万；所述离心的转速为100-10000rpm，离心时间为10-1000分钟。
本发明还提供了一种基因载体与DNA形成的复合物。
所述复合物中基因载体和DNA的质量比为1∶1～10∶1，其中，Au-PLL基因载体和Au-PLL-TAT基因载体与DNA的质量比为10∶1时转化效率最高；Ag-PLL基因载体和Ag-PLL-TAT基因载体与DNA的质量比为7∶1时转化效率最高。
所述复合物的粒径为100～170nm，表面电荷为20～40mV。
本发明还提供了一种所述复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别配制基因载体溶液和DNA溶液；
(2)基因载体溶液和DNA溶液等体积涡旋混匀，室温放置后，加入等体积5％蔗糖溶液。
所述DNA为任何可在真核细胞表达的质粒DNA。
本发明还提供了所述的基因载体在表皮干细胞转染中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明使用阳离子聚合物多聚赖氨酸与金属纳米颗粒连接，利用多聚赖氨酸生物相容性好的特点，显著降低了基因载体的毒性，并且通过将多聚赖氨酸连接在金属纳米颗粒表面，克服了多聚赖氨酸单独作为基因载体转染效率低的缺陷。
(2)本发明中金属纳米颗粒除连有多聚赖氨酸外，还连接了穿膜能力强的穿膜肽，大大的提高了基因载体的穿膜能力，进而提高了基因载体的转染效率。
(3)本发明将金属纳米材料、多聚赖氨酸和穿膜肽三者有效连接，显著提高了基因载体在表皮干细胞中的转染效率，降低了其对细胞的毒性影响。
附图说明
图1为本发明的基因载体的透射电子显微镜结构示意图；
a：Au-PLL基因载体；b：Ag-PLL基因载体；c：Au-PLL-TAT基因载体；d：Ag-PLL-TAT基因载体。
具体实施方式
表皮干细胞的制备
1)取下大鼠背部、头部皮肤，去除脂肪、血丝，剪成长1.5cm、宽2mm的大鼠皮条；
2)用普通D-Hanks(无钙镁离子的磷酸缓冲盐溶液，北京弘博康医药科技有限公司)，清洗3次，20mL/次，每次清洗3分钟；
3)再用高抗D-Hanks(高抗D-Hanks由普通D-Hanks溶液与双抗溶液混合得到，其中，混合时，普通D-Hanks溶液与双抗溶液的体积比为100∶4，双抗为青霉素和链霉素这两种抗生素，双抗溶液购自于Gibico，Brl，USA)浸泡150分钟；
4)放入含dispaseII中性蛋白酶(购自于Gibico，Brl，USA)重量百分含量为0.25％的中性蛋白酶水溶液，中性蛋白酶水溶液的体积为浸没大鼠皮条，在4℃过夜放置15小时；
5)过夜放置后，用镊子轻轻将表皮剥离下来；
6)用含胎牛血清的DMEM低糖/F12培养液(含胎牛血清的DMEM低糖/F12培养液由重量百分含量为60％的DMEM低糖培养液、重量百分含量为30％的F12培养液和重量百分含量为10％的胎牛血清混合得到，其中，DMEM低糖培养液、F12培养液和胎牛血清均购自于Gibico，Brl，USA)将含胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)重量百分含量为0.25％的胰酶细胞消化液(胰酶细胞消化液由胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶解于pH＝7.4的磷酸缓冲液得到)稀释至0.02％，得到含Trypsin-EDTA重量百分含量为0.02％的胰酶细胞消化液；
向含Trypsin-EDTA重量百分含量为0.05％的胰酶细胞消化液中加入步骤5)中剥离下来的表皮，含Trypsin-EDTA重量百分含量为0.05％的胰酶细胞消化液浸没剥离下米的表皮，在37℃消化分离表皮5分钟；
7)用15mL离心管轻轻震荡5分钟，反复吹打；
8)用PBS溶液反复冲洗4次，并依次过200目和300目筛选，在1000rpm离心3分钟；
9)用细胞计数器(北京卓川电子科技有限公司)计数细胞密度；
10)用DMEM低糖/F12培养液(DMEM低糖/F12培养液由重量比为2∶1的DMEM低糖培养液和F12培养液组成，DMEM低糖培养液和F12培养液均购自于Gibico，Brl，USA)将细胞重悬，调整细胞密度至5×105个/mL，并注入培养瓶(培养瓶采用含IV型胶原蛋白和醋酸的水溶液预包被，含IV型胶原蛋白和醋酸的水溶液中IV型胶原蛋白的重量百分含量为0.01％，含IV型胶原蛋白和醋酸的水溶液中醋酸的重量百分含量为0.1％)；静置10分钟后，弃去上清液，换新鲜DMEM低糖/F12培养液，在细胞培养箱中培养，每一天换一次液，第8天时细胞达到80％的融合，形成消化细胞，用于细胞毒性试验与细胞转染试验。
实施例1：含金纳米颗粒和多聚赖氨酸(Au-PLL)的基因载体
一、Au-PLL基因载体的制备
将PLL加入10mL1mM(410μg/mL)的HAuCl4溶液中，使PLL浓度达到5mg/mL，室温下搅拌20min，使其充分混合。在剧烈搅拌下，加入40μL的NaBH4(0.1M4mg/mL)直至溶液立即变红色，再继续搅拌30min。采用分子量为10万的超滤离心管将所得胶体溶液在3000rpm条件下离心30min，即得Au-PLL基因载体。所制备的Au-PLL基因载体粒径为12.25±0.3nm，表面电荷为23±1.5mV。
二、Au-PLL基因载体与质粒DNA结合的复合物(Au-PLL-DNA)的制备
将Au-PLL基因载体与DNA以不同质量比(详见表1)等体积(载体溶液与DNA溶液各10μL)混合，共孵育15分钟，再加入等体积的5％蔗糖溶液，过0.8μm滤膜即得Au-PLL-DNA复合物。所得Au-PLL-DNA复合物的粒径与表面电荷如下：
表1 基因载体与DNA的不同质量比下Au-PLL-DNA复合物的粒径大小和表面电荷值。
| 载体∶DNA(w/w) | 粒径(nm) | 表面电荷(mV) |
| 1∶1 | 137±3.2 | 11.5±0.3 |
| 3∶1 | 130±1.4 | 18.5±0.6 |
| 5∶1 | 121±3.2 | 19.1±0.5 |
| 7∶1 | 124±2.1 | 20.3±0.7 |
| 10∶1 | 122±2.2 | 21.4±0.3 |
三、Au-PLL-DNA复合物的细胞毒性试验
将表皮干细胞接种到96孔板上，每孔5000个细胞，100μL含10％小牛血清的DMEM/F12培养液，37℃培养24小时。吸去旧培养液，加入100μL不含血清的DMEM/F12培养液。将Au-PLL基因载体与eGFP-DNA按不同质量比(详见表2)等体积混溶后，室温孵育20分钟。每孔加入以上配制的不同质量比Au-PLL-DNA复合物10μL。培养6h后，洗去旧培养液，每孔加入100μL含小牛血清的DMEM/F12培养液，培养18小时。吸去培养液，每孔加入80μL含血清DMEM，20μLMTT溶液(5mg/mL)，37℃培养4小时，吸去培养液，加入150μL DMSO，轻微震动平板30秒。孔内液体呈紫蓝色后，酶标检测仪上570nm波长处测定OD值。对照组除不加Au-PLL-DNA复合物外，其余步骤相同。表皮干细胞在Au-PLL-DNA复合物共孵育24小时后的细胞成活率如下：
表2 基因载体与DNA的不同质量比下Au-PLL-DNA复合物的细胞成活率。
| 载体∶DNA(w/w) | 细胞成活率(％) |
| 1∶1 | 120±3.1 |
| 3∶1 | 138±4.6 |
| 5∶1 | 131±4.9 |
| 7∶1 | 128±5.6 |
| 10∶1 | 123±5.5 |
四、Au-PLL-DNA复合物的干细胞转染试验
将表皮干细胞接种到24孔板上，每孔50000个细胞，500μL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，37℃培养24小时。吸去旧培养液，加入500μL不含血清培养液。每孔加入Au-PLL-DNA复合物40μL，将Au-PLL与DNA设置成不同质量比(详见表3)。培养6h后，吸去转染液，每孔加0.5mL含10％胎牛血清的培养液，继续培养至48小时。细胞的平均荧光强度与转染效率呈正相关，收集转染后干细胞然后用PBS重悬，过200目筛网后，采用流式细胞仪测定EGFP转染后每个干细胞的平均荧光强度，每个样品测定一万个细胞。Au-PLL-DNA复合物转染表皮干细胞48小时后的平均荧光强度如下：
表3 基因载体与DNA的不同质量比下Au-PLL-DNA复合物的平均荧光强度。
| 载体∶DNA(w/w) | 平均荧光强度 |
| 1∶1 | 5.9±0.4 |
| 3∶1 | 7.6±1.1 |
| 5∶1 | 10.5±1.5 |
| 7∶1 | 13.7±0.7 |
| 10∶1 | 19.8±1.2 |
由表1-3可知，Au-PLL-DNA复合物对细胞没有任何毒性，且在基因载体与DNA质量比为10∶1时，基因载体在表皮干细胞上的转染效率最高。
实施例2：含银纳米颗粒和多聚赖氨酸(Ag-PLL)的基因载体
一、Ag-PLL基因载体的制备
将PLL加入10mL1mM(170μg/mL)的AgNO3溶液中，使PLL浓度达到5mg/mL，室温下搅拌20min，使其允分混合。在剧烈搅拌下，加入40μL的NaBH4(0.1M4mg/mL)直至溶液立即变亮黄色，再继续搅拌30min。采用分子量为10万的超滤离心管将所得胶体溶液在3000rpm条件下离心30min，即得Ag-PLL基因载体。所制备的Ag-PLL基因载体粒径为35±1.2nm，表面电荷为29±1.7mV。
二、Ag-PLL基因载体与质粒DNA结合的复合物(Ag-PLL-DNA)的制备
按照实施例1中的基因载体与质粒DNA结合的复合物的制备方法，获得Ag-PLL-DNA复合物的粒径与表面电荷如下：
表4 基因载体与DNA的不同质量比下Ag-PLL-DNA复合物的粒径大小和表面电荷值。
| 载体∶DNA(w/w) | 粒径(nm) | 表面电荷(mV) |
| 1∶1 | 144±2.1 | 21±0.9 |
| 3∶1 | 133±3.1 | 23±0.7 |
| 5∶1 | 129±2.5 | 24±0.9 |
| 7∶1 | 128±4.6 | 29±0.6 |
| 10∶1 | 121±4.2 | 30±0.4 |
一、Ag-PLL-DNA复合物的细胞毒性试验
按照实施例1中的细胞毒性试验，得到表皮干细胞在Ag-PLL-DNA复合物共孵育24小时后的细胞成活率如下：
表5 基因载体与DNA的不同质量比下Ag-PLL-DNA复合物的细胞成活率。
| 载体∶DNA(w/w) | 细胞成活率(％) |
| 1∶1 | 122±7.7 |
| 3∶1 | 120±8.3 |
| 5∶1 | 118±3.9 |
| 7∶1 | 109±5.7 |
| 10∶1 | 103±6.0 |
四、Ag-PLL-DNA复合物的干细胞转染试验
按照实施例1中的细胞毒性试验，得到Ag-PLL-DNA复合物转染皮干细胞48小时后的平均荧光强度如下：
表6 基因载体与DNA的不同质量比下Ag-PLL-DNA复合物的平均荧光强度。
| 载体∶DNA(w/w) | 平均荧光强度 |
| 1∶1 | 8.4±1.7 |
| 3∶1 | 14.8±1.15 |
| 5∶1 | 17.0±1.5 |
| 7∶1 | 21.7±1.0 |
| 10∶1 | 15.8±0.7 |
由表4-6可知，Ag-PLL-DNA复合物对细胞没有任何毒性，且在基因载体与DNA质量比为7∶1时，基因载体在表皮干细胞的转染效率最高。
实施例3：含金纳米颗粒、穿膜肽和多聚赖氨酸(Au-PLL-TAT)的基因载体
一、Au-PLL-TAT基因载体的制备
将PLL加入10mL1mM(410μg/mL)的HAuCl4溶液中，使PLL浓度达到5mg/mL，室温下搅拌20min，使其充分混合。在剧烈搅拌下，加入40μL的NaBH4(0.1M4mg/mL)直至溶液立即变红色，再继续搅拌30min。采用分子量为10万的超滤离心管将所得胶体溶液在3000rpm条件下离心30min，即得Au-PLL基因载体。再将Au-PLL基因载体与不同质量浓度的穿膜肽共孵育过夜后，采用分子量为1万的超滤管在3000转速下离心20分钟，即得Au-PLL-TAT基因载体。所制备的Au-PLL-TAT基因载体粒径为15.3±0.1nm，表面电荷为27±2.4mV。
二、Au-PLL-TAT基因载体与质粒DNA结合的复合物(Au-PLL-TAT-DNA)的制备
按照实施例1中的基因载体与质粒DNA结合的复合物的制备方法，获得Au-PLL-TAT-DNA复合物的粒径与表面电荷如下：
表7 基因载体与DNA的不同质量比下Au-PLL-TAT-DNA复合物的粒径大小和表面电荷值。
| 载体∶DNA(w/w) | 粒径(nm) | 表面电荷(mV) |
| 1∶1 | 120±2.1 | 19±0.7 |
| 3∶1 | 133±2.0 | 20±1.4 |
| 5∶1 | 130±3.5 | 21±1.2 |
| 7∶1 | 149±3.0 | 23±0.3 |
| 10∶1 | 137±3.4 | 25±0.6 |
一、Au-PLL-TAT-DNA复合物的细胞毒性试验
按照实施例1中的细胞毒性试验，得到表皮干细胞在Au-PLL-TAT-DNA复合物共孵育24小时后的细胞成活率如下：
表8 基因载体与DNA的不同质量比下Au-PLL-TAT-DNA复合物的细胞成活率。
| 载体∶DNA(w/w) | 细胞成活率(％) |
| 1∶1 | 139±7.9 |
| 3∶1 | 135±7.7 |
| 5∶1 | 120±9.8 |
| 7∶1 | 127±8.4 |
| 10∶1 | 117±9.1 |
四、Au-PLL-TAT-DNA复合物的干细胞转染试验
按照实施例1中的干细胞转染试验，得到Au-PLL-TAT-DNA复合物转染皮干细胞48小时后的平均荧光强度如下：
表9 基因载体与DNA的不同质量比下Au-PLL-TAT-DNA复合物的平均荧光强度。
| 载体∶DNA(w/w) | 平均荧光强度 |
| 1∶1 | 16.2±1.6 |
| 3∶1 | 15.7±1.7 |
| 5∶1 | 17.3±0.3 |
| 7∶1 | 21.9±0.9 |
| 10∶1 | 29.3±3.3 |
由表7-9可知，Au-PLL-TAT-DNA复合物对细胞没有任何毒性，且在基因载体与DNA质量比为10∶1时，基因载体在表皮干细胞的转染效率最高。
实施例4：含银纳米颗粒、穿膜肽和多聚赖氨酸(Ag-PLL-TAT)的基因载体
一、Ag-PLL-TAT基因载体的制备
将PLL加入10mL1mM(170μg/mL)的AgNO3溶液中，使PLL浓度达到5mg/mL，室温下搅拌20min，使其允分混合。在剧烈搅拌下，加入40μL的NaBH4(0.1M4mg/mL)直至溶液立即变亮黄色，再继续搅拌30min。采用分子量为10万的超滤离心管将所得胶体溶液在3000rpm条件下离心30min，即得Ag-PLL基因载体。再将Ag-PLL基因载体与不同质量浓度的穿膜肽共孵育过夜后，采用分子量为1万的超滤管在3000转速下离心20分钟，即得Ag-PLL-TAT基因载体。所制备的Ag-PLL-TAT基因载体粒径为39±3.7nm，表面电荷为33±2.6mV。
一、Ag-PLL-TAT基因载体与质粒DNA结合的复合物(Ag-PLL-TAT-DNA)的制备
按照实施例1中的基因载体与质粒DNA结合的复合物的制备方法，获得Ag-PLL-TAT-DNA复合物的粒径与表面电荷如下：
表10 基因载体与DNA的不同质量比下Ag-PLL-TAT-DNA复合物的粒径大小和表面电荷值。
| 载体∶DNA(w/w) | 粒径(nm) | 表面电荷(mV) |
| 1∶1 | 142±4.6 | 23.4±0.5 |
| 3∶1 | 131±3.8 | 25.5±0.6 |
| 5∶1 | 132±4.1 | 28.4±1.1 |
| 7∶1 | 122±5.3 | 31.1±1.2 |
| 10∶1 | 110±3.9 | 33.6±1.4 |
三、Ag-PLL-TAT-DNA复合物的细胞毒性试验
按照实施例1中的细胞毒性试验，得到表皮干细胞在Ag-PLL-TAT-DNA复合物共孵育24小时后的细胞成活率如下：
表11 基因载体与DNA的不同质量比下Ag-PLL-TAT-DNA复合物的细胞成活率。
| DNA∶载体(w/w) | 细胞成活率(％) |
| 1∶1 | 116±7.8 |
| 3∶1 | 117±7.5 |
| 5∶1 | 111±8.4 |
| 7∶1 | 109±8.6 |
| 10∶1 | 115±9.5 |
四、Ag-PLL-TAT-DNA复合物的干细胞转染试验
按照实施例1中的干细胞转染试验，得到Ag-PLL-TAT-DNA复合物转染皮干细胞48小时后的平均荧光强度如下：
表12 基因载体与DNA的不同质量比下Ag-PLL-TAT-DNA复合物的平均荧光强度。
| 载体∶DNA(w/w) | 平均荧光强度 |
| 1∶1 | 19.8±1.1 |
| 3∶1 | 21.9±2.5 |
| 5∶1 | 20.8±1.7 |
| 7∶1 | 31.6±2.9 |
| 10∶1 | 22.5±2.4 |
由表10-12可知，Ag-PLL-TAT-DNA复合物对细胞没有任何毒性，且在基因载体与DNA质量比为7∶1时，基因载体在表皮干细胞的转染效率最高。
从上述实施例1-4可以看出，当Ag-PLL-TAT基因载体与DNA的质量比为7∶1时，与其他基因载体相比，Ag-PLL-TAT基因载体在表皮干细胞中的转染效率最高，且此时Ag-PLL-TAT基因载体的表面电荷较高，而粒径偏小。虽然Ag-PLL-TAT基因载体转染表皮干细胞时细胞成活率低于其他类型基因载体，但其成活率仍然大于100％。因此，Ag-PLL-TAT基因载体与实施例中其他类型基因载体相比，在能够保证成活率不低于100％的情况下，实现了细胞转染效率的提高。
实施例5
PEI作为一种经典的，市售的非病毒转染试剂，其转染效率较高，但细胞毒性也较大。PEI常被选作新载体构建的阳性对照，以验证新载体的转染效率和细胞毒性。
实验步骤如下：
一、PEI-DNA复合物的细胞毒性试验
将表皮干细胞接种到96孔板上，每孔5000个细胞，100μL含10％小牛血清的DMEM/F12培养液，37℃培养24小时。吸去旧培养液，加入100μL不含血清的DMEM/F12培养液。将PEI(25K)基因载体与eGFP-DNA按不同质量比(详见表13)等体积混溶后，室温孵育20分钟。每孔加入以上配制的不同质量比PEI-DNA复合物10μL。培养6h后，洗去旧培养液，每孔加入100μL含小牛血清的DMEM/F12培养液，培养18小时。吸去培养液，每孔加入80μL含血清DMEM，20μLMTT溶液(5mg/mL)，37℃培养4小时，吸去培养液，加入150μL DMSO，轻微震动平板30秒。孔内液体呈紫蓝色后，酶标检测仪上570nm波长处测定OD值。对照组除不加PEI-DNA复合物外，其余步骤相同。表皮干细胞在PEI-DNA复合物共孵育24小时后的细胞成活率如下：
表13 基因载体与DNA的不同质量比下PEI-DNA复合物的细胞成活率。
| 载体∶DNA(w/w) | 细胞成活率(％) |
| 1∶1 | 88±3.7 |
| 3∶1 | 76±2.5 |
| 5∶1 | 71±2.1 |
| 7∶1 | 62±4.8 |
| 10∶1 | 58±3.2 |
二、PEI-DNA复合物的干细胞转染试验
将表皮干细胞接种到24孔板上，每孔50000个细胞，500μL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，37℃培养24小时。吸去旧培养液，加入500μL不含血清培养液。每孔加入PEI-DNA复合物40μL，将PEI与DNA设置成不同质量比(详见表14)。培养6h后，吸去转染液，每孔加0.5mL含10％胎牛血清的培养液，继续培养至48小时。细胞的平均荧光强度与转染效率呈正相关，收集转染后干细胞然后用PBS重悬，过200目筛网后，采用流式细胞仪测定EGFP转染后每个干细胞的平均荧光强度，每个样品测定一万个细胞。PEI-DNA复合物转染表皮干细胞48小时后的平均荧光强度如下：
表14 基因载体与DNA的不同质量比下PEI-DNA复合物的平均荧光强度。
| 载体∶DNA(w/w) | 平均荧光强度 |
| 1∶1 | 11.9±3.4 |
| 3∶1 | 10.5±2.7 |
| 5∶1 | 7.7±1.1 |
| 7∶1 | 6.4±2.3 |
| 10∶1 | 6.1±0.7 |
由实施例1-5可知，PEI基因载体对细胞具有毒性，而Au-PLL、Ag-PLL、Au-PLL-TAT和Ag-PLL-TAT四种基因载体对细胞均无毒性。并且，PEI基因载体在表皮干细胞上的最高转染效率显著低于Au-PLL、Ag-PLL、Au-PLL-TAT和Ag-PLL-TAT四种基因载体的最高转染效率。
综上所述，在以金属纳米颗粒为核心的基因载体上连接多聚赖氨酸能够显著降低基因载体对表皮干细胞的细胞毒性，与此同时，在上述基因载体的基础上连接穿膜肽能够显著提高基因载体在表皮干细胞上的转染效率。该类基因载体结构能够明显改善现有基因载体在表皮干细胞上细胞毒性大和转染效率低的问题。
Claims (10)
1.一种基因载体，包括作为核心的金属纳米颗粒以及连接在金属纳米颗粒表面的阳性聚合物，其特征在于，所述阳性聚合物为多聚赖氨酸。
2.如权利要求1所述的基因载体，其特征在于，所述基因载体的粒径为13～37nm，表面电荷为23～30mV。
3.如权利要求1所述的基因载体，其特征在于，所述多聚赖氨酸的分子量为60000～300000道尔顿。
4.如权利要求1所述的基因载体，其特征在于，所述金属纳米颗粒表面连接有穿膜肽。
5.如权利要求1所述的基因载体，其特征在于，所述金属纳米颗粒为金纳米颗粒或银纳米颗粒。
6.一种如权利要求1所述基因载体的制备方法，包括：
将多聚赖氨酸加入金属离子溶液中混合均匀，然后在搅拌条件下加入还原剂进行氧化还原反应，反应完成后从反应液中分离获得所述基因载体。
7.一种如权利要求1所述的基因载体与DNA形成的复合物。
8.如权利要求7所述的复合物，其特征在于，所述复合物中基因载体和DNA的质量比为1∶1～10∶1。
9.如权利要求7所述的复合物，其特征在于，所述复合物的粒径为100～170nm，表面电荷为20～40mV。
10.如权利要求1～9所述的基因载体在表皮干细胞转染中的应用。
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