CN108273056A - 一种改性金纳米材料/核酸探针纳米体系及其制备方法、应用 - Google Patents
一种改性金纳米材料/核酸探针纳米体系及其制备方法、应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料,包括阳离子聚合物改性金纳米材料和复合在所述阳离子聚合物改性金纳米材料上的核酸探针;所述核酸探针通过静电作用复合在所述阳离子聚合物改性金纳米材料上。该改性金纳米颗粒/核酸探针纳米体系具有多种功能,可以通过肿瘤特异高表达的核酸分子microRNA‑21有效的区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞;而且通过瘤内注射后进入肿瘤细胞,可以通过金纳米颗粒的光声成像实时监测肿瘤的位置,还可以通过荧光成像灵敏检测高表达核酸分子microRNA‑21类型的肿瘤;最后,在光声成像和荧光成像的双重指导下,利用金纳米颗粒良好的光热转换效率进行光热治疗,从而实现精准的光热治疗。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物材料合成技术领域,涉及一种改性金纳米材料/核酸探针纳米体系及其制备方法、应用,尤其涉及一种阳离子聚合物改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料及其制备方法、成像材料、应用。
背景技术
Au是一种贵金属材料,化学性质非常稳定,Au纳米材料沿袭了其体相材料的这个性质,因此具有相对稳定,却具有非常丰富的化学物理性质。金纳米材料的表面等离子体共振波长从可见(550nm)到近红外(1550nm)连续可调,极高的表面电场强度增强效应(高至10e7倍),极大的光学吸收和散射截面,以及从50%到100%连续可调的光热转换效率。由于这些独特的光学、光电、光热、光化学、以及分子生物学性质,Au纳米材料在材料科学界正受到强烈的关注,并引发众多科研工作者对之进行广泛和深入的研究,在生命科学、催化领域、传感器方面、光学元件、薄膜太阳能电池、纳米标准物、防伪、光信息存储和纳米光电子学等领域内有着广泛的应用,尤其是在生物标记、传感器构建、光学探针、电化学探针、组织修复、DNA、葡萄糖传感器等具体方面。
光热治疗是一种利用近红外(NIR)光照射发热进行治疗的一种方法,有望代替传统的肿瘤治疗方法。NIR光的照射可以实现较深的组织穿透能力和较低的副作用(参见Z.Zhang,J.Wang,C.Chen,Adv.Mater.2013,25,3869.)。目前,文献报道有多种材料可用于光热治疗的材料包括金纳米材料、硫化铜纳米粒、碳纳米材料和钯纳米片等。金纳米材料作为一种常见的光热纳米材料,主要包括金纳米壳、金纳米粒、金纳米笼和金纳米棒等纳米结构。光声成像是一种将光转换为超声波的成像方法,具有穿透深度深、空间分辨率高等优点。
肿瘤的精确诊断是肿瘤有效治疗的关键步骤和必要前提。通过肿瘤细胞异常表达的microRNA来区分肿瘤细胞和正常细胞近年来广受关注,因为microRNA的异常表达与肿瘤的发生和发展密切相关(参见Bartels CL1,Tsongalis GJ.Clin Chem.2009,55(4):623-31.)。其中,microRNA是一种长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子。目前,通用的microRNA检测方法包括:实时荧光聚合酶链式反应(参见N.Rosenfeld,R.Aharonov,et al,Nat.Biotechnol.2008,26,462.)、Northern印迹法(参见G.S.Pall,C.Codony-Servat,etal,Nucleic Acids Res.2007,35,60.)、微阵列法(参见J.M.Thomson,J.Parker,et al,Nat.Methods 2004,1,47.)等。
但是这些方法基于细胞裂解物,无法实现原位(in situ)检测。然而,in situ检测更接近细胞中的真实水平,有利于研究microRNA在细胞内发挥作用的真实情况。
因此,如何能够原位检测microRNA,实现多模式成像诊疗,为后续的肿瘤精准诊断提供可能,已成领域内诸多前沿学者在纳米生物材料合成技术领域的进行突破性探索的方向之一。
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供一种改性金纳米材料/核酸探针纳米体系及其制备方法、应用,特别是一种阳离子聚合物改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料,本发明提供的复合纳米材料可以实现荧光成像、光声成像功能,在此双模式成像的指导下,可以实现更灵敏的检测和更高效的治疗,为肿瘤的多模式成像的精准诊疗一体体系提供了重要的前提条件。
本发明提供了一种改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料,包括阳离子聚合物改性金纳米材料和复合在所述阳离子聚合物改性金纳米材料上的核酸探针;
所述阳离子聚合物改性金纳米材料带正电,所述核酸探针带负电,所述核酸探针通过静电作用复合在所述阳离子聚合物改性金纳米材料上。
优选的,所述阳离子聚合物的分子量为600~35000Da;
所述核酸探针为针对核酸分子microRNA-21类型肿瘤设计的核酸探针;
所述金纳米材料和所述核酸探针的质量比为(1~100):1。
优选的,所述阳离子聚合物改性金纳米材料为阳离子聚合物与金通过硫金键键连后得到;
所述金纳米材料包括金纳米颗粒和/或金纳米棒;
所述核酸探针由双链DNA分子和单链DNA分子组成。
优选的,所述金纳米棒的长径比为2~10;
所述金纳米颗粒的粒径为100~200nm;
所述阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和壳聚糖中的一种或两种。
优选的,所述双链DNA和单链DNA的摩尔比为1:(0.1~100);
所述双链DNA分子由标记荧光分子的第一单链DNA和标记淬灭团的第二单链DNA组成;
所述单链DNA的序列包括CTTATCAGACTGATGTTGATTGG、CTTATCAGACTGATGTTGATTGGT、CTTATCAGACTGATGTTGATTGGA、CTTATCAGACTGATGTTGATTGGAT和CTTATCAGACTGATGTTGATTGGTA中的一种或多种。
优选的,所述第一单链DNA的序列包括TATCAGACTGATGTTGATTGG、TATCAGACTGATGTTGATTGGT、TATCAGACTGATGTTGATTGGA、TATCAGACTGATGTTGATTGGAT和TATCAGACTGATGTTGATTGGTA中的一种或多种;
所述第二单链DNA的序列包括CCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA、ACCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA、TCCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA、ATCCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA和TACCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA中的一种或多种;
所述双链DNA分子的组成方式包括碱基互补配对。
本发明提供了一种改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料的制备方法,包括以下步骤:
1)将阳离子聚合物改性金纳米材料与缓冲液混合后,再加入核酸探针,再次混合后,得到改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料。
优选的,所述阳离子聚合物改性金纳米材料由金纳米材料、硫源、阳离子聚合物、表面活性剂、活化剂和水进行反应后得到;
所述阳离子聚合物改性金纳米材料和所述核酸探针的质量比为(1~100):1;
所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸-氯化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸-氯化镁缓冲液和三羟甲基氨基甲烷-盐酸-氯化钠-氯化镁缓冲液中的一种或多种;
所述缓冲液的pH值为7.0~8.0;
所述再次混合后还包括静置步骤;
所述静置的时间为10~60分钟。
本发明提供了一种成像材料,包括上述技术方案任意一项所述的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料或上述技术方案任意一项所述的制备方法制备的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料;
所述成像材料包括光声成像造影剂和/或荧光成像造影剂。
本发明还提供了上述技术方案任意一项所述的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料、上述技术方案任意一项所述的制备方法制备的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料或上述技术方案所述的成像材料在肿瘤监测和/或治疗领域中的应用;
所述治疗包括光热治疗、超声治疗剂或光热超声联合治疗。
本发明提供了一种改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料,包括阳离子聚合物改性金纳米材料和复合在所述阳离子聚合物改性金纳米材料上的核酸探针;所述阳离子聚合物改性金纳米材料带正电,所述核酸探针带负电,所述核酸探针通过静电作用复合在所述阳离子聚合物改性金纳米材料上。与现有技术相比,本发明针对现有的肿瘤的检测诊断方法,多是基于细胞裂解物,无法实现原位(in situ)检测的缺陷。本发明提供的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料,含有相应的核酸探针,能够通过肿瘤特异高表达的核酸分子microRNA-21有效的区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞,从而实现肿瘤细胞的原位检测。
本发明更针对现有的单一诊断过程和单一治疗手段相互之间缺少有效关联,缺乏有效的多模式成像诊疗的现状。本发明将提供的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料,通过静电作用,使得带有负电的核酸探针搭载在带有正电的阳离子聚合物改性金纳米材料上,形成具有多种功能的复合纳米材料。该改性金纳米颗粒/核酸探针纳米体系可以通过肿瘤特异高表达的核酸分子microRNA-21有效地区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞;而且通过瘤内注射后,一方面,纳米颗粒进入肿瘤细胞,可以通过金纳米颗粒的光声成像实时监测肿瘤的位置;另一方面,纳米颗粒还可以通过荧光成像灵敏地检测高表达核酸分子microRNA-21类型的肿瘤;最后,在光声成像和荧光成像的双重指导下,利用金纳米颗粒良好的光热转换效率进行光热治疗,从而实现精准的光热治疗。
本发明提供的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料,不仅能够通过荧光成像、光声成像原位检测监测microRNA,在此双模式成像的指导下,还能进行更加精准的光热治疗,从而为后续能够实现更灵敏的检测和更高效的治疗一体的多模式成像诊疗体系,提供了重要的前提条件,具有良好的应用前景和重要的现实意义。而且制备方法简单,条件温和,适于大规模推广应用。
实验结果表明,注射了本发明提供的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米颗粒的小鼠肿瘤部位有明显的荧光和光声信号,在近红外光照射后,有效地实现肿瘤的抑制。
附图说明
图1为本发明实施例9制备的阳离子聚合物改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料的透射电镜图;
图2为本发明实施例9得到的阳离子聚合物改性金纳米材料/核酸探针复合纳米体系分别与HEK-293细胞和MCF-7细胞共培养后的共聚焦荧光图像。
具体实施方式
为了进一步了解本发明,下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描述,但是应当理解,这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
本发明所有原料,对其来源没有特别限制,在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
本发明所有原料,对其纯度没有特别限制,本发明优选采用分析纯、医药领域或其应用领域常规的纯度。
本发明所有名词表达和简称均属于本领域常规名词表达和简称,每个名词表达和简称在其相关应用领域内均是清楚明确的,本领域技术人员根据名词表达和简称,能够清楚准确唯一的进行理解。
本发明提供了一种改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料,包括阳离子聚合物改性金纳米材料和复合在所述阳离子聚合物改性金纳米材料上的核酸探针;
所述阳离子聚合物改性金纳米材料带正电,所述核酸探针带负电,所述核酸探针通过静电作用复合在所述阳离子聚合物改性金纳米材料上。
本发明对所述复合没有特别限制,以本领域技术人员熟知的复合的概念即可,可以是搭载、掺杂、吸附、包裹或生长中的一种或多种,本发明优选为搭载或吸附。本发明所述改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料自身不带电,由带正电的阳离子聚合物改性金纳米材料和带负电的核酸探针,通过静电吸附作用,使得核酸探针搭载在所述阳离子聚合物改性金纳米材料上。
本发明对所述阳离子聚合物改性金纳米材料没有特别限制,以本领域技术人员熟知的阳离子聚合物改性金纳米材料即可,本领域技术人员可以根据熟知的方法制备或从市场上购买,本发明为提高复合纳米材料的稳定性和性能,所述阳离子聚合物改性金纳米材料为带正电的阳离子聚合物改性金纳米材料,优选为阳离子聚合物带正电。
本发明对所述阳离子聚合物改性金纳米材料的结构没有特别限制,以本领域技术人员熟知的此类阳离子聚合物改性金纳米材料的常规结构即可,本领域技术人员可以根据熟知的方法制备或从市场上购买,本发明为提高复合纳米材料的稳定性和性能,所述阳离子聚合物改性金纳米材料优选是由阳离子聚合物与金通过硫金键键连后得到,即所述金纳米材料是由巯基改性阳离子聚合物通过硫金键修饰得到。
本发明对所述阳离子聚合物的具体选择没有特别限制,以本领域技术人员熟知的常规阳离子聚合物即可,本领域技术人员可以根据应用情况、应用需求或产品性能要求进行调整,本发明为提高复合纳米材料的稳定性和性能,所述阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和壳聚糖中的一种或多种,更优选为聚乙烯亚胺、聚赖氨酸或壳聚糖,最优选为聚乙烯亚胺或聚赖氨酸。
本发明对所述阳离子聚合物的参数没有特别限制,以本领域技术人员熟知的阳离子聚合物参数即可,本领域技术人员可以根据应用情况、应用需求或产品性能要求进行调整,本发明所述阳离子聚合物的分子量优选为600~35000Da,更优选为1800~30000Da,更优选为5000~25000Da,更优选为10000~20000Da。
本发明对所述金纳米材料的参数没有特别限制,以本领域技术人员熟知的常规Au纳米材料的参数即可,本领域技术人员可以根据应用情况、应用需求或产品性能要求进行调整,本发明为提高复合纳米材料的稳定性和性能,所述金纳米材料优选包括金纳米颗粒和/或金纳米棒,更优选为金纳米颗粒或金纳米棒,最优选为金纳米棒。本发明所述金纳米棒的长径比优选为2~10,更优选为3~9,更优选为4~8,更优选为5~7,具有可以为2~5。本发明所述金纳米颗粒的粒径优选为100~200nm,更优选为120~180nm,更优选为140~160nm,具体可以为100~150nm。
本发明对所述核酸探针的具体选择没有特别限制,以本领域技术人员熟知的常规核酸探针即可,本领域技术人员可以根据应用情况、应用需求或产品性能要求进行调整,本发明为提高复合纳米材料的稳定性和性能,提高针对性,所述核酸探针优选为针对核酸分子microRNA-21类型肿瘤设计的核酸探针。
本发明所述核酸探针优选由双链DNA分子和单链DNA分子组成。其中,所述双链DNA分子优选由标记荧光分子的第一单链DNA和标记淬灭团的第二单链DNA组成,更优选由标记荧光分子的第一单链DNA和标记淬灭团的第二单链DNA通过碱基互补配对后得到。本发明中双链DNA分子优选作为荧光检测信号的报告部分。本发明对上述双链DNA分子的来源没有特别限制,以本领域技术人员熟知的此类双链DNA分子的制备方法制备即可,或从市场上购买均可。本发明所述第一单链DNA的序列优选包括TATCAGACTGATGTTGATTGG、TATCAGACTGATGTTGATTGGT、TATCAGACTGATGTTGATTGGA、TATCAGACTGATGTTGATTGGAT和TATCAGACTGATGTTGATTGGTA中的一种或多种,更优选为TATCAGACTGATGTTGATTGG、TATCAGACTGATGTTGATTGGT、TATCAGACTGATGTTGATTGGA、TATCAGACTGATGTTGATTGGAT或TATCAGACTGATGTTGATTGGTA,更优选为TATCAGACTGATGTTGATTGG、ATCAGACTGATGTTGATTGGT或TATCAGACTGATGTTGATTGGA。所述第二单链DNA的序列优选包括CCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA、ACCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA、TCCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA、ATCCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA和TACCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA中的一种或多种,更优选为CCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA、ACCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA、TCCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA、ATCCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA或TACCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA,更优选为CCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA、ACCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA或TCCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA。
其中,本发明所述单链DNA分子优选作为荧光检测信号的增强部分。本发明对上述所述单链DNA分子的来源没有特别限制,以本领域技术人员熟知的此类所述单链DNA分子的制备方法制备即可,或从市场上购买均可。本发明所述单链DNA的序列优选包括CTTATCAGACTGATGTTGATTGG、CTTATCAGACTGATGTTGATTGGT、CTTATCAGACTGATGTTGATTGGA、CTTATCAGACTGATGTTGATTGGAT和CTTATCAGACTGATGTTGATTGGTA中的一种或多种,更优选为CTTATCAGACTGATGTTGATTGG、CTTATCAGACTGATGTTGATTGGT、CTTATCAGACTGATGTTGATTGGA、CTTATCAGACTGATGTTGATTGGAT或CTTATCAGACTGATGTTGATTGGTA,更优选为CTTATCAGACTGATGTTGATTGG、CTTATCAGACTGATGTTGATTGGT或CTTATCAGACTGATGTTGATTGGA。
本发明对所述双链DNA分子和单链DNA分子的比例没有特别限制,以本领域技术人员熟知的此类材料的常规比例即可,本领域技术人员可以根据应用情况、应用需求或产品性能要求进行调整,本发明为提高复合纳米材料的稳定性和性能,所述双链DNA分子和单链DNA分子的摩尔比优选为1:(0.1~100),更优选为1:(0.5~80),更优选为1:(1~50),更优选为1:(5~30)。
本发明对改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料中,所述金纳米材料和所述核酸探针的比例没有特别限制,以本领域技术人员熟知的此类材料的常规比例即可,本领域技术人员可以根据应用情况、应用需求或产品性能要求进行调整,本发明为提高复合纳米材料的稳定性和性能,所述金纳米材料和所述核酸探针的质量比优选为(1~100):1,更优选为(5~80):1,更优选为(10~50):1,更优选为(20~40):1,具体可以为(2~50):1。
本发明对改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料的其他参数没有特别限制,以本领域技术人员熟知的此类材料的常规参数即可,本领域技术人员可以根据应用情况、应用需求或产品性能要求进行调整,本发明所述改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料的粒径优选为110~200nm,更优选为130~180nm,更优选为150~160nm,具体可以为110~150nm。
本发明还提供了一种改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料的制备方法,包括以下步骤:
1)将阳离子聚合物改性金纳米材料与缓冲液混合后,再加入核酸探针,再次混合后,得到改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料。
本发明所述制备方法中所述原料的性质、结构以及比例等优选原则或具体优选方案与前述改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料的性质、结构以及比例等优选原则或具体优选方案,优选一一对应,在此不再一一赘述。
本发明对所述阳离子聚合物改性金纳米材料的制备没有特别限制,以本领域技术人员熟知的阳离子聚合物改性金纳米材料的制备方法制备即可,本领域技术人员可以根据熟知的方法制备或从市场上购买,本发明为提高复合纳米材料的稳定性和性能,所述阳离子聚合物改性金纳米材料优选是由阳离子聚合物与金通过硫金键键连后得到,即所述阳离子聚合物改性金纳米材料是由巯基改性阳离子聚合物通过硫金键修饰得到,更优选由金纳米材料、硫源、阳离子聚合物、表面活性剂、活化剂和水进行反应后得到。
本发明对上述阳离子聚合物改性金纳米材料制备步骤中的参数和具体选择没有特别限制,以本领域技术人员熟知的此类反应的常规参数和选择即可,本领域技术人员可以根据熟知的方法制备或从市场上购买,本发明为提高复合纳米材料的稳定性和性能,所述硫源优选包括巯基丙酸、巯基乙胺和巯基十一酸中的一种或多种,更优选为巯基丙酸、巯基乙胺或巯基十一酸,更优选为巯基丙酸。所述表面活性剂优选包括十六烷基三甲基溴化铵、油酸钠、十二烷基二甲基苄基氯化铵、四辛基溴化铵和十六烷基三甲基氯化铵中的一种或多种,更优选为十六烷基三甲基溴化铵、油酸钠、十二烷基二甲基苄基氯化铵、四辛基溴化铵或十六烷基三甲基氯化铵,更优选为十六烷基三甲基溴化铵、油酸钠极片十六烷基三甲基氯化铵。所述活化剂优选包括N-羟基琥珀酰亚胺和/或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,更优选为N-羟基琥珀酰亚胺和/或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
本发明上述阳离子聚合物改性金纳米材料的制备过程,具体优选为先采用表面活性剂的方法制备出金纳米材料,然后采用改性阳离子聚合物对金纳米才进行修饰,制备出表面修饰的金纳米材料。更具体可以为:
先制备金纳米材料:
优选采用本领域技术人员熟知的晶种生长法制备,具体包括:采用氯金酸、CTAB和HAuCl4和硼氢化钠配制金纳米种;而后采用硝酸银、氯金酸、盐酸、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)和抗坏血酸混合制备种子生长液;最后将金纳米种与种子生长液混和,得到金纳米棒。
更具体操作过程如下:
1)金纳米种的配制:
室温搅拌条件下,将氯金酸(HAuCl4)溶液加入到CTAB溶液中。并快速加入预冷的硼氢化钠(NaBH4)溶液,加速搅拌后停止搅拌,置于恒温油浴锅中,避光静置后,得到褐色澄清的金纳米种溶液。
2)种子生长液的制备:在室温搅拌下,按照顺序依次将硝酸银(AgNO3)溶液;氯金酸(HAuCl4)溶液;盐酸(HCl)溶液加入到CTAB溶液中。稍后停止搅拌,然后快速加入新配制的抗坏血酸(AA)溶液,晃动摇匀,此时溶液由黄色迅速变为无色。抗坏血酸(AA)的作用是可以将氯金酸(HAuCl4)还原为金纳米粒子,得到的无色澄清的溶液即为种子生长液。
3)将金纳米种与种子生长液混合:取一定量的金种溶液加入到配制好的种子生长液中,震荡摇匀,避光恒温油浴。最后将得到的溶液离心除去上清液中过量的CTAB,用MilliQ水分散,反复多次,最后将得到的金纳米棒分散于MilliQ水中,得到金纳米棒。
得到金纳米材料后,修饰改性的具体步骤优选为:
采用阳离子聚合物对制备得到的金纳米材料进行修饰;
具体可以为:采用N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和阳离子聚合物同时与巯基丙酸(MPA)溶液混合,而后与金纳米棒混合避光搅拌反应,得到阳离子聚合物修饰的金纳米棒。
具体操作过程可以如下:
取一定量的巯基丙酸加入的MilliQ水中,按比例配置巯基丙酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,分别取巯基丙酸、NHS和EDC·HCl分别溶于MilliQ水中,取一定量的阳离子聚合物溶于MilliQ水中。将NHS、EDC·HCl溶液同时加入巯基丙酸溶液中,在恒温油浴条件下,进行活化羧基反应,再加入阳离子聚合物溶液搅拌反应,然后加入配制好的金纳米材料,避光条件下搅拌反应,最后离心,用MilliQ水洗3次,并超声分散,得到阳离子聚合物修饰的金纳米材料。
本发明对所述核酸探针的制备方法没有特别限制,以本领域技术人员熟知的此类核酸探针的制备方法制备即可,或从市场上购买均可。本领域技术人员可以根据应用情况、应用需求或产品性能要求进行调整,本发明所述核酸探针的制备方法具体可以为:
将第一单链和第二单链溶解后,以摩尔比为1:1的比例,同时置于缓冲液中,升温至90℃后保持5分钟,然后自然降温至室温,得到双链DNA分子,而单链DNA分子直接溶解即可。
本发明所述核酸探针优选由双链DNA分子和单链DNA分子组成。其中,所述双链DNA分子优选由标记荧光分子的第一单链DNA和标记淬灭团的第二单链DNA组成,更优选由标记荧光分子的第一单链DNA和标记淬灭团的第二单链DNA通过碱基互补配对后得到。本发明中双链DNA分子优选作为荧光检测信号的报告部分,所述单链DNA分子优选作为荧光检测信号的增强部分。
本发明首先将阳离子聚合物改性金纳米材料与缓冲液混合。
本发明对所述阳离子聚合物改性金纳米材料和所述核酸探针的比例没有特别限制,以本领域技术人员熟知的常规比例即可,本领域技术人员可以根据应用情况、应用需求或产品性能要求进行调整,本发明所述阳离子聚合物改性金纳米材料和所述核酸探针的质量比优选为(1~100):1,更优选为(2~50):1,更优选为(5~40):1,更优选为(10~30):1。
本发明对所述缓冲液的选择和参数没有特别限制,以本领域技术人员熟知的常规缓冲液和参数即可,本领域技术人员可以根据应用情况、应用需求或产品性能要求进行调整,本发明所述缓冲液优选包括三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸-氯化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸-氯化镁缓冲液和三羟甲基氨基甲烷-盐酸-氯化钠-氯化镁缓冲液中的一种或多种,更优选为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸-氯化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸-氯化镁缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸-氯化钠-氯化镁缓冲液,更优选为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸-氯化钠-氯化镁缓冲液。本发明所述缓冲液的pH值优选为7.0~8.0,更优选为7.2~7.8,更优选为7.4~7.6,具体可以为7.2~7.5。
本发明随后再加入核酸探针,再次混合后,得到改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料。
本发明为进一步提高最终产品的性能,完整和优化制备方案,所述再次混合后优选还包括静置步骤。本发明对所述静置的具体参数没有特别限制,本领域技术人员可以根据应用情况、应用需求或产品性能要求进行调整,本发明所述静置的时间优选为10~60分钟,更优选为20~50分钟,更优选为30~40分钟。
本发明上述制备改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料的步骤具体可以为:
首先采用表面活性剂的方法制备出金纳米材料,然后采用改性阳离子聚合物对金纳米材料进行修饰,制备出表面修饰的金纳米材料。同时制备核酸探针分子。
将修饰的金纳米材料用水分散,将核酸探针用一定pH值的缓冲液稀释;在一定pH值的缓冲液中先加入金纳米颗粒,再加入核酸探针,充分混合,静置一段时间后得到改性金纳米材料/核酸探针复合纳米体系。
本发明上述步骤制备了改性金纳米材料/核酸探针复合纳米体系,其具有多种功能,该金纳米颗粒/核酸探针纳米体系可以通过肿瘤特异高表达的核酸分子microRNA-21有效地区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞;通过瘤内注射后,一方面,纳米颗粒进入肿瘤细胞,可以通过金纳米颗粒的光声成像实时监测肿瘤的位置;另一方面,纳米颗粒还可以通过荧光成像灵敏地检测高表达核酸分子microRNA-21类型的肿瘤;最后,在光声成像和荧光成像的双重指导下,利用金纳米颗粒良好的光热转换效率进行光热治疗,从而实现精准的光热治疗。
本发明还提供了一种成像材料,包括上述技术方案任意一项所述的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料或上述技术方案任意一项所述的制备方法制备的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料。
本发明对所述成像材料没有特别限制,本领域技术人员可以根据应用情况、应用需求或产品性能要求进行调整,本发明所述成像材料优选包括成像剂,更优选包括光声成像造影剂和/或荧光成像造影剂。本发明对所述成像材料(成像剂)中的其他成分没有特别限制,以本领域技术人员熟知的用于此类成像剂的常规辅助成分即可。
本发明还提供了上述技术方案任意一项所述的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料、上述技术方案任意一项所述的制备方法制备的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料或上述技术方案所述的成像材料在肿瘤监测和/或治疗领域中的应用。
本发明对所述监测方面没有特别限制,本领域技术人员可以根据应用情况、应用需求或产品性能要求进行调整,本发明所述监测方面,即检测或诊断方面,优选包括荧光成像和/或光声成像监测。所述治疗优选包括光热治疗、超声治疗剂或光热超声联合治疗。
本发明上述步骤提供了一种改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料及其制备方法、成像材料、应用,本发明提供的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料,含有相应的核酸探针,能够通过肿瘤特异高表达的核酸分子microRNA-21有效的区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞,从而实现肿瘤细胞的原位检测。而且通过瘤内注射后,一方面,纳米颗粒进入肿瘤细胞,可以通过金纳米颗粒的光声成像实时监测肿瘤的位置;另一方面,纳米颗粒还可以通过荧光成像灵敏地检测高表达核酸分子microRNA-21类型的肿瘤;最后,在光声成像和荧光成像的双重指导下,利用金纳米颗粒良好的光热转换效率进行光热治疗,从而实现精准的光热治疗。
本发明提供的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料,不仅能够通过荧光成像、光声成像原位检测监测microRNA,在此双模式成像的指导下,还能进行更加精准的光热治疗,从而为后续能够实现更灵敏的检测和更高效的治疗一体的多模式成像诊疗体系,提供了重要的前提条件,具有良好的应用前景和重要的现实意义。而且制备方法简单,条件温和,适于大规模推广应用。
实验结果表明,注射了本发明提供的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米颗粒的小鼠肿瘤部位有明显的荧光和光声信号,在近红外光照射后,有效地实现肿瘤的抑制。
为了进一步说明本发明,以下结合实施例对本发明提供的一种改性金纳米材料/核酸探针纳米体系及其制备方法、应用进行详细描述,但是应当理解,这些实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,只是为进一步说明本发明的特征和优点,而不是对本发明权利要求的限制,本发明的保护范围也不限于下述的实施例。
检测方案
1)细胞培养:选用MCF-7、HeLa、HEK-293等细胞系,所需所有细胞的培养方法,根据本领域技术人员熟知的方法即可。本发明中,优选含10%胎牛血清的培养基对细胞进行培养,所述培养条件优选为体积含量为5%的二氧化碳培养箱中进行连续培养,培养温度优选为37℃。
2)细胞内吞实验:首先取对数生长期的细胞,胰蛋白酶消化后,按照每孔10×104个细胞的密度接种于12孔板中,置于37℃培养箱中过夜培养。分别将以Cy5为荧光团、以BHQ2为淬灭团的双链DNA和单链DNA依次以不同的质量比与修饰后的金纳米颗粒进行静电复合后,加入12孔板中,与细胞共同培养6小时后,用胰蛋白酶消化,PBS离心洗两次,采用流式细胞仪进行分析平均荧光强度。将最优质量比例进行0h、6h、12h、24h不同时间的内吞,通过流式细胞仪进行分析。
3)肿瘤细胞和非肿瘤细胞的区分:所制备的金纳米颗粒/核酸探针纳米体系可以通过荧光成像,有效地区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞。以MCF-7肿瘤细胞和HEK-293非肿瘤细胞为例,采用含有10%胎牛血清的培养基中、置于37℃培养箱中进行培养。取对数生长期的细胞,按照每孔5×104细胞的密度接种于35mm直径的激光共聚焦培养皿中,置于37℃培养箱中培养过夜。将金纳米颗粒/核酸探针纳米体系加入,与细胞共培养6h后,通过共聚焦荧光显微镜进行分析。
4)荧光活体成像:本发明中,实验选用MCF-7肿瘤模型,采用20g左右的Balb/C裸鼠,进行肿瘤接种。取对数生长期的MCF-7细胞,采用胰蛋白酶进行消化,用PBS悬浮细胞,按照每只小鼠6×106的细胞总量接种于小鼠腿部,待瘤体积长至200~500mm3时,将金纳米颗粒/核酸探针纳米体系瘤内注射,采用荧光活性成像仪器检测0h、6h、12h、24h时,肿瘤区域的荧光信号情况。荧光成像测试方法选用本领域技术人员熟知的方法即可,并无特殊限制。设定测试激发波长为635nm,发射波长范围为670~900nm。测试之前,采用腹部注射1%的戊巴比妥钠的方法进行麻醉,测试过程中,小鼠处于麻醉状态。
5)光声成像:本发明所述光声成像实验采用体外假体和体内实验来验证,所述假体是模拟老鼠用来进行体外光声实验,制备方法按照本领域技术人员熟知的方法即可,并无特殊限制。体内验证时,选用MCF-7肿瘤模型,采用20g左右的Balb/C裸鼠,进行肿瘤接种。取对数生长期的MCF-7细胞,采用胰蛋白酶进行消化,用PBS悬浮细胞,按照每只小鼠6×106的细胞总量接种于小鼠腿部,待瘤体积长至200~500mm3时,将最优比金纳米颗粒/核酸探针纳米体系瘤内注射,采用光声成像仪器检测6h时,肿瘤区域的信号情况。光声成像测试方法选用本领域技术人员熟知的方法即可,并无特殊限制。设定测试波长范围为680~980nm,优选为805nm,背景吸收波长设置为850nm。测试过程中,采用异氟烷将老鼠进行气体麻醉,并不停供给氧气和异氟烷,用于维持老鼠生命体征和使老鼠处于麻醉状态。
6)光热治疗:本发明所述的光热治疗包括体外和体内光热治疗。体外光热治疗选用MCF-7、HeLa等细胞系。将细胞按照每孔1×104的密度接种于96孔板中,置于培养箱中培养过夜。将不同浓度的金纳米颗粒/核酸探针纳米体系加入细胞中,培养6h后,采用近红外激光器(808nm)进行照射,激光器功率优选为0.5~1.5W/cm2,更优选为1.0~1.2W/cm2;照射时间优选为5~20min,更优选为8~10min。照射完后,继续置于培养箱中继续培养24h。然后,通过四唑盐(MTT)比色法来计算细胞存活率:
细胞存活率(%)=(A样品/A空白)×100。
在本发明中,体内光热实验选用MCF-7肿瘤模型,采用20g左右的Balb/C裸鼠,进行肿瘤接种。取对数生长期的MCF-7细胞,采用胰蛋白酶进行消化,用PBS悬浮细胞,按照每只小鼠6×106的细胞总量接种于小鼠腿部,待瘤体积长至200~500mm3时,将最优比金纳米颗粒/核酸探针纳米体系瘤内注射,当肿瘤蓄积量达到最大时,进行光热治疗,采用近红外激光器照射肿瘤,激光器功率优选为0.5~1.5W/cm2,更优选为1.0~1.2W/cm2;照射时间优选为5~20min,更优选为8~10min。照射完成后,跟踪肿瘤体积大小和小鼠体重的变化,整个实验过程共跟踪14天。
实施例1~6
表面修饰的金纳米棒的制备
1)金纳米种的配制:室温搅拌条件下,将氯金酸(HAuCl4)溶液加入到CTAB溶液中。并快速加入0℃预冷的新配制的硼氢化钠(NaBH4)溶液,加速搅拌1min后停止搅拌,取出搅拌子,置于30℃的恒温油浴锅中,避光静置2h后,得到褐色澄清的金纳米种溶液。
2)种子生长液的制备:在室温搅拌下,按照顺序依次将硝酸银(AgNO3)溶液;氯金酸(HAuCl4)溶液;盐酸(HCl)溶液加入到CTAB溶液中。2min后停止搅拌,取出搅拌子,然后快速加入新配制的抗坏血酸(AA)溶液,晃动摇匀,此时溶液由黄色迅速变为无色。抗坏血酸(AA)的作用是可以将氯金酸(HAuCl4)还原为金纳米粒子,得到的无色澄清的溶液即为种子生长液。
3)将金纳米种与种子生长液混合:取一定量的金种溶液加入到配制好的种子生长液中,震荡摇匀,取出搅拌子,避光30℃的恒温油浴12h。将得到的溶液离心15min除去上清液中过量的CTAB,用MilliQ水分散,反复3次,最后将得到的金纳米棒分散于MilliQ水中,得到金纳米棒。
将NHS、EDC、聚乙烯亚胺同时加入巯基丙酸(MPA)水溶液中,在30℃恒温油浴下搅拌反应过夜,然后将上述得到的溶液加入配制好的金纳米棒,在30℃恒温油浴下搅拌避光反应24h。
最后将得到的溶液6000rpm/min离心15min,去掉上层溶液,并将沉淀用MilliQ水洗3遍,最后将沉淀分散于10mL的MilliQ水中。得到聚乙烯亚胺修饰的金纳米棒。
其中,巯基丙酸用量、阳离子聚合物的用量及分子量、金纳米棒的用量参见表1。表1为实施例1~6中不同原料的用量
表1
实施例7~16
将实施例5制备出的阳离子聚合物修饰的金纳米棒,与核酸探针静电复合,得到改性金纳米棒/核酸探针纳米体系。
将实施例5制备出的阳离子聚合物修饰的金纳米棒用水分散,将核酸探针用pH为7.4的缓冲液稀释。
在缓冲液中先加入金纳米颗粒,再加入核酸探针,充分混合,静置10~60分钟后得到改性金纳米棒/核酸探针纳米体系。
其中,金纳米颗粒和核酸探针的种类、质量比和用量见表2。表2为实施例7~16中不同原料的用量。
表2
其中实施例7~11中,所用双链DNA序列为TATCAGACTGATGTTGATTGG和CCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA,所用单链序列为CTTATCAGACTGATGTTGATTGG。
实施例12~16中,所用双链DNA序列为TATCAGACTGATGTTGATTGGT和ACCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA,所用单链序列为CTTATCAGACTGATGTTGATTGGT。
对本发明实施例9制备的阳离子聚合物改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料进行表征。
参见图1,图1为本发明实施例9制备的阳离子聚合物改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料的透射电镜图。
由图1可知,本发明制备的阳离子聚合物改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料中,颜色较浅的外层为核酸探针分子,表明核酸探针被紧紧地担载在修饰后的金纳米颗粒上,形成了金纳米颗粒/核酸探针纳米体系。
实施例17
所制备的金纳米颗粒/核酸探针纳米体系可以通过荧光成像,有效地区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞。以MCF-7肿瘤细胞和HEK-293非肿瘤细胞为例,采用含有10%胎牛血清的培养基中、置于37℃培养箱中进行培养。取对数生长期的细胞,按照每孔5×104细胞的密度接种于35mm直径的激光共聚焦培养皿中,置于37℃培养箱中培养过夜。
将实施例9得到的纳米颗粒加入,与细胞共培养6h后,在共聚焦荧光显微镜下观察并拍照,参见图2。
图2为本发明实施例9得到的阳离子聚合物改性金纳米材料/核酸探针复合纳米体系分别与HEK-293细胞和MCF-7细胞共培养后的共聚焦荧光图像。
由图2可知,培养一段时间后,在以MCF-7为代表的肿瘤细胞中,荧光较亮;而在以HEK-293为代表的非肿瘤细胞中,荧光十分微弱,从而表明本发明的纳米体现可以区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞。
实施例18
选用MCF-7肿瘤模型,采用20g左右的Balb/C裸鼠,进行肿瘤接种。取对数生长期的MCF-7细胞,采用胰蛋白酶进行消化,用PBS悬浮细胞,按照每只小鼠6×106的细胞总量接种于小鼠腿部,待瘤体积长至200~500mm3时,将将实施例9得到的纳米颗粒进行瘤内注射,采用荧光活性成像仪器检测0h、6h、12h、24h时,肿瘤区域的荧光信号情况。荧光成像测试方法选用本领域技术人员熟知的方法即可,并无特殊限制。设定测试激发波长范围为586~601nm。测试之前,采用腹腔注射1%的戊巴比妥钠的方法进行麻醉,测试过程中,小鼠处于麻醉状态。
实验结果表明,注射纳米颗粒6h后,小鼠肿瘤部位的荧光明显增强;而没有注射纳米颗粒的小鼠,肿瘤部位几乎没有荧光。
实施例19
采用20g左右的Balb/C裸鼠,进行肿瘤接种。取对数生长期的MCF-7细胞,采用胰蛋白酶进行消化,用PBS悬浮细胞,按照每只小鼠6×106的细胞总量接种于小鼠腿部,待瘤体积长至200~500mm3时,将将实施例9得到的纳米颗粒进行瘤内注射,采用荧光活性成像仪器检测0h、6h、12h、24h时,肿瘤区域的光声信号情况。
设定测试波长范围为680~980nm,优选为805nm,背景吸收波长设置为850nm。测试过程中,采用异氟烷将老鼠进行气体麻醉,并不停供给氧气和异氟烷,用于维持老鼠生命体征和使老鼠处于麻醉状态。
实验结果表明,随着注射时间的延长,肿瘤区域的光声信号逐渐增强,6h时,光声信号达到最强,然后逐渐减弱。说明实施例9制备出的金纳米颗粒/核酸探针纳米体系具有光声成像功能,且检测到当纳米颗粒注射至老鼠体内6h时,光声信号最强,可以指导进一步的光热治疗实验。
实施例20
体外光热治疗选用HeLa细胞。将细胞按照每孔1×104的密度接种于96孔板中,置于培养箱中培养过夜。将不同浓度的金纳米颗粒/核酸探针纳米体系加入细胞中,培养6h后,采用近红外激光器(808nm)进行照射,激光器功率为1.0W/cm2;照射时间为10min。照射完后,继续置于培养箱中继续培养24h。然后,通过四唑盐(MTT)比色法来计算细胞存活率:
细胞存活率(%)=(A样品/A空白)×100。
体内光热实验选用MCF-7肿瘤模型,采用20g左右的Balb/C裸鼠,进行肿瘤接种。取对数生长期的MCF-7细胞,采用胰蛋白酶进行消化,用PBS悬浮细胞,按照每只小鼠6×106的细胞总量接种于小鼠腿部,待瘤体积长至200~300mm3时,将实施例9得到的金纳米颗粒/核酸探针纳米体系瘤内注射,当肿瘤蓄积量达到最大时,采用近红外激光器照射肿瘤,进行光热治疗,激光器功率为1.0W/cm2;照射时间为10min。照射完成后,跟踪肿瘤体积大小和小鼠体重的变化,整个实验过程共跟踪14天。
体外光热治疗的实验结果表明,随着纳米颗粒浓度的增加,其光热治疗的效果增强,细胞杀伤率增加。在荧光成像和光声成像的双模式指导下,进行体内光热治疗。在肿瘤蓄积6h时,进行光热治疗。
结果表明,治疗组的肿瘤大小基本没有增加。未治疗组的肿瘤在14天后,生长至大于2000mm3。因此得出,本发明制备的阳离子聚合物改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料具有显著抑制肿瘤生长的作用。
以上实施例表明阳离子聚合物改性金纳米材料/核酸探针复合纳米体系具有多种功能。该改性金纳米材料/核酸探针纳米体系在细胞水平上可以实现区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞的功能。通过瘤内注射后,纳米颗粒进入肿瘤细胞后,小鼠肿瘤部位的荧光明显增强;而没有注射纳米颗粒的小鼠,肿瘤部位几乎没有荧光;随着注射时间的延长,肿瘤区域的光声信号逐渐增强,然后逐渐减弱。
最后,在光声成像和荧光成像的双重指导下,利用金纳米颗粒良好的光热转换效率进行精准的光热治疗,与未治疗组相比,治疗组的肿瘤大小基本没有增加,这说明改性金纳米材料/核酸探针复合纳米体系具有显著抑制肿瘤生长的作用。
以上对本发明提供的一种阳离子聚合物改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料及其制备方法、成像材料、应用进行了详细的介绍,本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想,包括最佳方式,并且也使得本领域的任何技术人员都能够实践本发明,包括制造和使用任何装置或系统,和实施任何结合的方法。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。本发明专利保护的范围通过权利要求来限定,并可包括本领域技术人员能够想到的其他实施例。如果这些其他实施例具有不是不同于权利要求文字表述的结构要素,或者如果它们包括与权利要求的文字表述无实质差异的等同结构要素,那么这些其他实施例也应包含在权利要求的范围内。
Claims (10)
1.一种改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料,其特征在于,包括阳离子聚合物改性金纳米材料和复合在所述阳离子聚合物改性金纳米材料上的核酸探针;
所述阳离子聚合物改性金纳米材料带正电,所述核酸探针带负电,所述核酸探针通过静电作用复合在所述阳离子聚合物改性金纳米材料上。
2.根据权利要求1所述的复合纳米材料,其特征在于,所述阳离子聚合物的分子量为600~35000Da;
所述核酸探针为针对核酸分子microRNA-21类型肿瘤设计的核酸探针;
所述金纳米材料和所述核酸探针的质量比为(1~100):1。
3.根据权利要求1所述的复合纳米材料,其特征在于,所述阳离子聚合物改性金纳米材料为阳离子聚合物与金通过硫金键键连后得到;
所述金纳米材料包括金纳米颗粒和/或金纳米棒;
所述核酸探针由双链DNA分子和单链DNA分子组成。
4.根据权利要求3所述的复合纳米材料,其特征在于,所述金纳米棒的长径比为2~10;
所述金纳米颗粒的粒径为100~200nm;
所述阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和壳聚糖中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的复合纳米材料,其特征在于,所述双链DNA和单链DNA的摩尔比为1:(0.1~100);
所述双链DNA分子由标记荧光分子的第一单链DNA和标记淬灭团的第二单链DNA组成;
所述单链DNA的序列包括CTTATCAGACTGATGTTGATTGG、CTTATCAGACTGATGTTGATTGGT、CTTATCAGACTGATGTTGATTGGA、CTTATCAGACTGATGTTGATTGGAT和CTTATCAGACTGATGTTGATTGGTA中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的复合纳米材料,其特征在于,所述第一单链DNA的序列包括TATCAGACTGATGTTGATTGG、TATCAGACTGATGTTGATTGGT、TATCAGACTGATGTTGATTGGA、TATCAGACTGATGTTGATTGGAT和TATCAGACTGATGTTGATTGGTA中的一种或多种;
所述第二单链DNA的序列包括CCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA、ACCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA、TCCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA、ATCCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA和TACCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA中的一种或多种;
所述双链DNA分子的组成方式包括碱基互补配对。
7.一种改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将阳离子聚合物改性金纳米材料与缓冲液混合后,再加入核酸探针,再次混合后,得到改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述阳离子聚合物改性金纳米材料由金纳米材料、硫源、阳离子聚合物、表面活性剂、活化剂和水进行反应后得到;
所述阳离子聚合物改性金纳米材料和所述核酸探针的质量比为(1~100):1;
所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸-氯化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸-氯化镁缓冲液和三羟甲基氨基甲烷-盐酸-氯化钠-氯化镁缓冲液中的一种或多种;
所述缓冲液的pH值为7.0~8.0;
所述再次混合后还包括静置步骤;
所述静置的时间为10~60分钟。
9.一种成像材料,其特征在于,包括权利要求1~6任意一项所述的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料或权利要求7~8任意一项所述的制备方法制备的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料;
所述成像材料包括光声成像造影剂和/或荧光成像造影剂。
10.权利要求1~6任意一项所述的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料、权利要求7~8任意一项所述的制备方法制备的改性金纳米材料/核酸探针复合纳米材料或权利要求9所述的成像材料在肿瘤监测和/或治疗领域中的应用;
所述治疗包括光热治疗、超声治疗剂或光热超声联合治疗。
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