CN109536583A

CN109536583A - 一种基于金-碳纳米球构建的microRNA检测探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109536583A
Application number: CN201811290701.8A
Authority: CN
Inventors: 王征; 王琳; 肖珩; 范慧玲; 徐鲁明
Original assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology; Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2019-03-29
Anticipated expiration: 2038-10-31
Also published as: CN109536583B

Abstract

本发明涉及一种基于金‑碳纳米球构建的microRNA检测探针及其制备方法和应用。本发明使用透明质酸修饰的金‑碳空心纳米球来搭载修饰有FAM荧光基团的DNA单链，DNA单链的序列与目标microRNA互补配对，进而制备出具有良好检测效率和选择性的microRNA探针体系，可在体外检测microRNA，或用于细胞内microRNA的荧光成像。而且制备方法简单易行。

Description

一种基于金-碳纳米球构建的microRNA检测探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学和核酸化学领域，具体指一种microRNA检测探针及其制备方法和应用，该探针对细胞内microRNA具有很好的检测效率，在microRNA相关研究方面具有良好的应用前面。

背景技术

成熟的微RNA（microRNA；miRNA，又译小分子RNA）是真核细胞中发现的一类可以对基因表达进行调控的单链非编码RNA。通常来说，microRNA由大约22个核苷酸组成（核苷酸个数在18-25个不等），在动物、植物和病毒中广泛地通过转录调控基因的表达。microRNA通过与靶标信使核糖核酸(mRNA)特异结合，从而抑制转录后基因表达。研究表明，microRNA调控着一半以上的人类基因，一种microRNA可以拥有上百种目标基因。

由于microRNA在疾病预测中的重要性，microRNA已经成为了新一代的疾病诊断和预测方面的标志物。程序化地定量检测细胞、组织和血液中的microRNA受到了科学家们的极大重视。目前为止，已经发展出了很多检测方法，但都或多或少存在着一些不足。传统的northern杂交方法灵敏度十分有限，而芯片检测等方法虽然具有通量高的优点，但存在着成本昂贵且依赖大型仪器的配套使用。因此发展新型的microRNA检测方法，能够方便快捷、灵敏有效地检测microRNA，具有十分重要的意义。

目前，许多纳米材料被应用到microRNA的检测和成像方面，常见的材料包括：纳米金、石墨烯、量子点和上转换发光材料等。理想的microRNA成像纳米材料不仅需要良好的光学性能，能够满足实验的需要，还需具有一定的生物相容性。金-碳空心纳米球作为一种新兴的纳米材料，具有着优良的光热性能。我们的研究结果表明金-碳空心纳米球具备良好的荧光猝灭能力，能够用于microRNA的检测和细胞成像，基于此，我们发明了一种金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针，用于细胞内microRNA的荧光成像。

本发明构建的microRNA检测探针包括透明质酸修饰的金-碳空心纳米球和修饰有FAM荧光基团的DNA单链。通过π-π堆积作用，DNA单链能够吸附在透明质酸修饰的金-碳空心纳米球表面上。同时，由于荧光共振能量转移效应，DNA单链上的FAM基团的荧光能够被金-碳空心纳米球猝灭。当检测体系中存在目标microRNA时，DNA单链能够与目标microRNA结合，形成互补的双链，进而从金-碳空心纳米球表面游离下来，进而产生荧光增强。我们的研究结果表明该探针在溶液体系中对目标microRNA具有良好的检测效率和选择性，具有很低的检出限。在细胞内microRNA荧光成像方面，相较于对照组，该探针可以对细胞中的目标microRNA进行有效地荧光成像。该探针的研发为microRNA的生物学研究和临床检测提供了新的研究方向，具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于金-碳纳米球构建的microRNA检测探针及其制备方法和其在细胞内microRNA荧光成像方面的应用，所制备的检测探针对目标microRNA具有良好的检测效率和选择性，具有很低的检出限，可用于microRNA的临床检测和荧光成像研究等方面。

本发明提供了一种基于金-碳纳米球构建的microRNA检测探针的制备方法，该方法是使用透明质酸修饰的金-碳空心纳米球来搭载修饰有FAM荧光基团的DNA单链，DNA单链的序列与目标microRNA互补配对，进而制备出具有良好检测效率和选择性的microRNA探针体系，制备方法简单易行。

本发明制备的基于金-碳纳米球构建的microRNA检测探针，具有良好的检测效率和选择性，具有很低的检出限，能够对活细胞中的目标microRNA进行荧光成像。

本发明还提供了所述金-碳纳米球构建的microRNA检测探针在体外microRNA检测方面的应用。

本发明还提供了一种基于金-碳纳米球构建的新型microRNA检测探针的制备方法，主要包括以下步骤：

1．制备二氧化硅球模板（即SiO₂）

称取100 mL乙醇，于150 mL烧杯中，加入1.5 mL ddH₂O和5 mL氨水（25-28%），用磁力搅拌器搅拌；

搅拌均匀后，以很慢的速度逐滴加入1.5mL正硅酸乙酯，室温搅拌反应4h，得到SiO₂球；

洗涤SiO₂球：使用ddH₂O分散得到的SiO₂球，高速离心洗涤，重复三次，得到纯化后的SiO₂球。

．制备聚多巴胺包裹的二氧化硅球（即SiO₂@PDA）

将步骤1得到的200 mg SiO₂球于10 mL 10 mM的Tris缓冲液（pH=8.2）中，超声30 min，呈絮状，在室温下搅拌反应48 h；

称取180 mg盐酸聚多巴胺，加入上述反应体系，在室温下搅拌反应48h；

反应完成后，使用抽滤的方法收集反应产物SiO₂@PDA，使用ddH₂O洗涤后，冻干，得到SiO₂@PDA纳米复合物。

．制备表面有金纳米颗粒的SiO₂@PDA纳米复合物（SiO₂@PDA@Au）

称取25 mg KAuCl₄（预先溶解到2 mL ddH₂O中，用2 min时间缓慢加到步骤2得到的SiO₂@PDA体系中），加入到以上体系中，在冰浴中快速搅拌约30 min；

反应完成后，立刻用抽滤的方法收集反应产物SiO₂@PDA@Au，使用ddH₂O洗涤后冻干，得到SiO₂@PDA@Au纳米复合物。

．制备表面分散有金纳米颗粒的中空碳纳米壳（AuHCNs）

将步骤3中得到的SiO₂@PDA@Au高温碳化3h；碳化后将获得的含有SiO₂模板的金-碳纳米球置于塑料反应器中，加入浓度约为4%的氢氟酸，搅拌反应，将SiO₂模板消化掉，最终得到AuHCNs；

5．制备表面修饰透明质酸的AuHCNs（AuHCNs-HA）

将步骤4中得到的10 mg AuHCNs，分散于20 mL 1×PBS缓冲液，超声20 min，加入PDA-HA，搅拌反应24 h；

反应完成后，12000 rpm离心15 min，使用ddH₂O洗涤3次后，冻干，储存, 得到AuHCNs-HA。

．制备基于金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针

将步骤5中得到的AuHCNs-HA按照30 ug/mL的浓度，与50 nM Probe-miR21在PBS缓冲液中混合均匀，在摇床上猝灭30 min后，用于检测microRNA。

．体外检测miR21

在步骤6得到的探针体系中，加入不同浓度的miR21链，置于摇床中反应2h，使用多功能酶标仪检测荧光强度。激发光为488 nm，检测发射波长为520 nm。。

．检测特异性

在步骤6得到的探针体系中，分别加入50nM的miR21、miR21-1、miR21-5P和miR141，置于摇床中反应2h后检测荧光强度。激发光为488nm，检测发射波长为520nm。

．细胞内microRNA成像

将LoVo与SW48细胞更换培养液后，加入步骤6得到的探针体系，使Probe-miR21终浓度为50 nM，AuHCNs-HA终浓度为30 ug/mL。孵育20 h后，弃去培养基，PBS冲洗2次后，使用共聚焦荧光显微镜观察荧光强度与分布。另外，将SW48细胞分为三组，均更换培养液，加入步骤6得到的探针体系，使Probe-miR21终浓度为50 nM，AuHCNs-HA终浓度为30 ug/mL。分别在0、8h和24 h时，弃去一组中的培养基，PBS冲洗2次后，使用共聚焦荧光显微镜观察荧光强度与分布。

表1：本发明所使用到的所有引物的序列

本发明的方案具有以下优点：

1）本发明首次报道了透明质酸修饰的金-碳空心纳米球能够吸附修饰有FAM荧光基团的DNA单链，并猝灭荧光。当检测体系中存在目标microRNA时，DNA单链能够与目标microRNA结合，形成互补的双链，进而从金-碳空心纳米球表面游离下来，进而产生荧光增强。因此，使用透明质酸修饰的金-碳空心纳米球搭载修饰有FAM荧光基团的DNA单链来组装构成microRNA检测探针体系可以用于microRNA检测方面的研究。

2）本发明通过使用透明质酸修饰的金-碳空心纳米球搭载修饰有FAM荧光基团的DNA单链来组装构成microRNA检测探针，制备方法简单可行。可以根据目标microRNA的序列来个性化地设计不同的DNA单链，来构建相应的检测探针体系，检测目标microRNA，本方法具备通用性。

3）本发明构建的透明质酸修饰的金-碳空心纳米球/FAM荧光基团的DNA单链的microRNA检测探针体系可以对溶液体系中的microRNA 的含量进行检测，通过体系荧光强度来反映microRNA的浓度，对目标microRNA具备很好的检测特异性和检测灵敏度，可以用于各种体外的溶液体系中的microRNA检测。

4）本发明构建的透明质酸修饰的金-碳空心纳米球/FAM荧光基团的DNA单链的microRNA检测探针体系可以有效地进入细胞内，能够通过荧光成像的方式来反映细胞中microRNA的定位和含量，可以用于细胞中microRNA定位和含量的实时检测。

附图说明

图1为探针检测细胞中microRNA的示意图。

图2为金-碳纳米球猝灭FAM荧光基团的DNA单链的荧光光谱图。

图3为探针在体外检测不同浓度梯度的microRNA的荧光光谱图。

图4为探针的检测特异性。

图5为探针对不同细胞中miR-21的荧光成像图。

图6为探针对同一细胞中不同时段miR-21的荧光成像图。

具体实施方式

实施例1 本发明提供的基于金-碳纳米球构建的新型microRNA检测探针的制备

步骤1：二氧化硅球模板的制备

1）量取100 mL无水乙醇，于150 mL干净烧杯中，加1.5 mL ddH₂O和5 mL氨水（25-28%），用磁力搅拌器搅拌均匀，转速为600 rpm；

2) 将步骤1）中得到反应体系，量取1.5 mL正硅酸乙酯，以5秒钟一滴的速度逐滴加入反应体系中，室温搅拌反应4 h，得到二氧化硅球；

3）将步骤2）中得到的SiO₂球溶液均分到4个50 mL离心管中8000 rpm离心15 min，弃上清，每管分别加入30 mL ddH₂O，用超声清洗机超声2 min使其充分分散，重复三次，最终用3mL ddH₂O重悬，超声清洗机超声2 min，得到纯二氧化硅球模板；

4）将步骤3）中得到的二氧化硅球模板置于液氮速冻3 min，转入冻干机内冻干。

5）将步骤4）中得到的二氧化硅球模板粉末，置于-20 ℃冰箱保存。

步骤2：聚多巴胺包裹的二氧化硅球的制备

1）称取200 mg 二氧化硅球模板粉末，分散于10 mL 10 mM的Tris缓冲液（pH=8.2）中，超声清洗机超声30 min，呈絮状；

2）称取180 mg盐酸聚多巴胺，加入到步骤1）的反应体系中，用磁力搅拌器以600 rpm，在室温下搅拌反应48 h；

3）将步骤2）中得到的溶液，置于抽滤装置中，抽滤、收集反应产物聚多巴胺包裹的二氧化硅球，使用30 mL ddH₂O分散、超声清洗机超声2 min后，再次抽滤，重复2遍，得到纯的聚多巴胺包裹的二氧化硅球；

4）将步骤3）中得到的多巴胺包裹的二氧化硅球置于液氮速冻3min，转入冻干机内冻干，得到多巴胺包裹的二氧化硅球粉末。

5）将步骤4）中得到的多巴胺包裹的二氧化硅球粉末，置于-20 ℃冰箱保存。

步骤3：表面有金纳米颗粒的SiO₂@PDA纳米复合物的制备

1）量取50 mL ddH₂O于干净的200 mL圆底烧瓶中，置于冰上冰浴20 min；

2）称取200 mg多巴胺包裹的二氧化硅球粉末，加入到步骤1）的体系中，在超声清洗机中超声2 min使其充分分散；

3) 称取25 mg KAuCl₄于2 mL eppendorf管中，加入2 mL ddH₂O溶解；

4）以5秒一滴的速度，将步骤3）得到的溶液，逐滴滴入步骤2）的反应瓶中，同时在冰浴中用磁力搅拌器以800 rpm快速搅拌30 min；

5）将步骤4）中得到的溶液，迅速转移到抽滤装置中，抽滤收集反应产物SiO₂@PDA@Au，再使用30mL ddH₂O分散、超声清洗机超声2min后，再次抽滤，重复2遍，得到纯的SiO₂@PDA@Au纳米复合物；

6）将步骤5）中得到的SiO₂@PDA@Au纳米复合物置于液氮速冻3 min，转入冻干机内冻干，得到SiO₂@PDA@Au纳米复合物粉末。

7）将步骤6）中得到的SiO₂@PDA@Au纳米复合物粉末，置于-20 ℃冰箱保存。

步骤4：制备表面分散有金纳米颗粒的空心碳纳米球

1）SiO₂@PDA@Au纳米复合物粉末在氩气保护下，500℃，碳化3h，得到含有SiO₂模板的金-碳纳米球；

2）将步骤1）中得到的产物，转入干净塑料反应杯中，加入浓度为4%的氢氟酸，用磁力搅拌器以600rpm搅拌反应4 h，得到表面分散有金纳米颗粒的空心碳纳米球；

3）向步骤2）中加入饱和NaHCO₃溶液终止反应；

4）将步骤3）中得到的溶液，转移到抽滤装置中，抽滤收集反应产物中空金-碳纳米壳，再使用30 mL ddH₂O分散、超声清洗机超声2 min后，再次抽滤，重复2遍，得到纯的空心金-碳纳米球；

5）将步骤4）中得到的空心金-碳纳米球置于液氮速冻3 min，转入冻干机内冻干。

6）将步骤5）中得到的空心金-碳纳米球粉末，置于-20 ℃冰箱保存。

步骤5：制备表面修饰透明质酸的AuHCNs

1）称取10 mg 空心金-碳纳米球于干净100mL圆底烧瓶中，加入20 mL 1×PBS缓冲液，超声清洗机超声20 min；

2）向步骤1）的反应体系中加入10mg PDA-HA，用磁力搅拌器以600 rpm的速度，搅拌24h，得到包裹透明质酸的空心金-碳纳米球；

3）将步骤2）得到的包裹透明质酸的空心金-碳纳米球，转入50 mL圆底离心管，以12000rpm的转速，室温离心15 min后，使用30 mL ddH₂O重悬，超声清洗机超声2 min，再次离心，重复2次后，得到纯的包裹透明质酸的空心金-碳纳米球AuHCNs-HA；

4）将步骤3）中得到的包裹透明质酸的空心金-碳纳米球置于液氮速冻3 min，转入冻干机内冻干得到包裹透明质酸的空心金-碳纳米球粉末。

5）将步骤4）中得到的包裹透明质酸的空心金-碳纳米球粉末，置于-20 ℃冰箱保存。

步骤6：基于金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针的制备

1）称取5 mg空心金-碳纳米球粉末于15 mL干净离心管中，加入10 mL的1×PBS缓冲液，得到浓度为500 μg/mL的空心金-碳纳米球母液；

2）取一个干净15 mL离心管，加入25 uL浓度为10 μM的Probe-miR21；

3) 取步骤1）中的空心金-碳纳米球母液300 μL加入到步骤2）的离心管中，再加1×PBS缓冲液补齐至5 mL，得到含有50 nM Probe-miR21与30 ug/mL AuHCNs-HA的混合溶液；

4）将步骤3）得到的混合溶液在37℃，摇床上反应30 min后，得到金-碳纳米球核酸探针，以此用于microRNA的检测。

实施例2 材料荧光猝灭的表征测试

图2 为本申请实施例1中通过步骤1-5制成的金-碳纳米球对荧光标记单链DNA进行荧光猝灭的荧光光谱图。

使用1×PBS缓冲液稀释10 μM的Probe-miR21，使其终浓度为50 nM，加入到黑色96孔板中，每孔200 μL，加入500 μg/mL的AuHCNs使其终浓度分别为：0 μg/mL，20 μg/mL，40 μg/mL，60 μg/mL，80 μg/mL；室温，避光反应30 min后，使用多功能酶标仪检测荧光强度。激发光为488nm，检测发射波长为520nm。

结果如图2所示，随着加入材料的量的增加，检测体系的荧光强度逐渐降低，实验结果可知金-碳纳米材料对荧光标记单链DNA具有良好的猝灭效果。

实施例3 在缓冲液中材料对目标microRNA进行检测

图3 为申请实施例1中通过步骤1-6制成的金-碳纳米球构建的microRNA检测探针在溶液体系中检测不同浓度microRNA的荧光谱图。

将50nM Probe-miR21与30 μg/mL AuHCNs-HA在黑色96孔板中混合均匀，在摇床上孵育30 min后，加入不同体积10 μM的miR21链，使其终浓度为0、2.5 nM、5 nM、10 nM、20nM、50 nM和100 nM，置于摇床反应2h，使用多功能酶标仪检测荧光强度。激发光为488 nm，检测发射波长为520 nm。

结果如图3所示，随着溶液体系中的microRNA浓度的升高，检测体系的荧光强度逐渐增强，并且具有良好的线性规律。实验结果可知金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针对目标microRNA具有良好的检测效果，检测限可达到2.5 nM。

图4 为申请实施例1中通过步骤1-6制成的金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针在溶液体系中与不同microRNA孵育后的荧光谱图。

50 nM Probe-miR21与30 μg/mL AuHCNs-HA在黑色96孔板中混合均匀，在摇床上孵育30 min后，分别加入50 nM的miR21、miR21-1、miR21-5p和miR141，置于摇床反应2 h，使用多功能酶标仪检测荧光强度。激发光为488 nm，检测发射波长为520 nm。

结果如图4所示，对于探针的检测目标miR21，检测体系的荧光强度明显增强，而其他3种microRNA的检测体系的荧光增强并不明显。实验结果可知金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针对目标microRNA的检测具有良好的特异性。

本发明中Probe-miR21、miR21、miR21-1、miR21-5p和miR141均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。本发明所述多巴胺修饰的透明质酸（PDA-HA）可参照公开号CN106139144A专利申请中所公开的方法制备。

实施例4 材料对细胞内microRNA进行荧光成像

图5 为申请实施例1中通过步骤1-6制成的金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针对LoVo和SW48细胞中miR21进行荧光成像的荧光成像图。

将10 μM Probe-miR21与500 μg/mL AuHCNs-HA预先混合猝灭30 min后，对LoVo与SW48人结肠癌细胞更换培养液，加入探针混合物，使Probe-miR21终浓度为50 nM，AuHCNs-HA终浓度为30 μg/mL。共孵育20 h后，弃去培养基，1×PBS冲洗2次后，使用共聚焦荧光显微镜观察荧光强度与分布。

结果如图5所示，对于miR21表达量低的LoVo细胞，在加入探针后，细胞内的荧光强度并没有明显变化，而对于miR21表达量高的SW48细胞，在加入探针后，细胞内的荧光强度显著增强，并且荧光增强的位置主要集中在细胞质中。实验结果可知金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针能够通过细胞荧光成像反映细胞内的目标microRNA的含量和分布。

图6 为申请实施例1中通过步骤1-6制成的金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针在不同时间对SW48细胞中miR21进行荧光成像的荧光成像图。

将10 μM Probe-miR21与500 μg/mL AuHCNs-HA预先混合猝灭30 min；将SW48细胞分为三组，均更换培养液，加入探针混合物，使Probe-miR21终浓度为50 nM，AuHCNs-HA终浓度为30 μg/mL。分别在0、4 h、8 h、12 h、24 h和48 h时，弃去一组中的培养基，1×PBS冲洗2次后，共聚焦荧光显微镜观察荧光强度与分布。

结果如图6所示，在探针与SW48细胞共孵育后，随着孵育时间的延长，细胞内的荧光强度逐渐增强，在12 h时达到荧光最大值，之后荧光随着时间的延长会有少许下降。实验结果可知金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针在细胞中的荧光成像的最佳观察时间为12 h。

Claims

1.一种基于金-碳纳米球构建的microRNA检测探针的制备方法，其特征是：使用透明质酸修饰的金-碳空心纳米球来搭载修饰有FAM荧光基团的DNA单链，DNA单链的序列与目标microRNA互补配对，进而制备出基于金-碳纳米球构建的microRNA探针。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

1）制备二氧化硅球模板

称取100 mL乙醇，于150 mL烧杯中，加入1.5 mL ddH₂O和5 mL质量百分比浓度为25-28%的氨水，用磁力搅拌器搅拌；搅拌均匀后，加入1.5mL正硅酸乙酯，室温搅拌反应4h，得到SiO₂球；使用ddH₂O分散得到的SiO₂球，高速离心洗涤，重复三次，得到纯化后的SiO₂球；

2）制备聚多巴胺包裹的二氧化硅球

将步骤1）得到的200 mg纯化后的 SiO₂球加入到10 mL 10 mM的pH8.2的Tris缓冲液中，超声30 min，然后在室温下搅拌反应48 h；加入180 mg盐酸聚多巴胺，在室温下搅拌反应48h；反应完成后，使用抽滤的方法收集反应产物，将收集到的反应产物使用ddH₂O洗涤后冻干，得到聚多巴胺包裹的二氧化硅球；

3）制备表面有金纳米颗粒的聚多巴胺包裹的二氧化硅球

将25 mg KAuCl₄溶解到2 mL ddH₂O中得KAuCl₄溶液，用2 min时间将KAuCl₄溶液加到步骤2）得到的聚多巴胺包裹的二氧化硅球中，在冰浴中快速搅拌30 min；用抽滤的方法收集反应产物，将收集到的反应产物使用ddH₂O洗涤后冻干，得到表面有金纳米颗粒的聚多巴胺包裹的二氧化硅球；

4）制备表面分散有金纳米颗粒的中空碳纳米壳

将步骤3）中得到的表面有金纳米颗粒的聚多巴胺包裹的二氧化硅球高温碳化3h得到含有SiO₂模板的金-碳纳米球；将获得的含有SiO₂模板的金-碳纳米球置于塑料反应器中，加入质量浓度为4%的氢氟酸，搅拌反应，将SiO₂模板消化掉，最终得到表面分散有金纳米颗粒的中空碳纳米壳；

5）制备表面修饰透明质酸的AuHCNs

将10 mg 表面分散有金纳米颗粒的中空碳纳米壳，分散于20 mL 1×PBS缓冲液，超声20 min，加入PDA-HA，搅拌反应24 h；反应完成后，12000 rpm离心15 min，使用ddH₂O洗涤3次后，冻干，储存, 得到表面修饰透明质酸的AuHCNs；

6）制备基于金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针

将步骤5）中得到的表面修饰透明质酸的AuHCNs按照30 ug/mL的浓度，与50 nM Probe-miR21在PBS缓冲液中混合均匀，在摇床上猝灭30 min后，得到基于金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针。

3.由权利要求1或2所述制备方法制备得到的基于金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针。

4.权利要求3所述基于金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针在体外检测microRNA的应用。

5.权利要求3所述基于金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针在用于细胞内microRNA的荧光成像中应用。