CN109536583B - 一种基于金-碳纳米球构建的microRNA检测探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于金‑碳纳米球构建的microRNA检测探针及其制备方法和应用。本发明使用透明质酸修饰的金‑碳空心纳米球来搭载修饰有FAM荧光基团的DNA单链,DNA单链的序列与目标microRNA互补配对,进而制备出具有良好检测效率和选择性的microRNA探针体系,可在体外检测microRNA,或用于细胞内microRNA的荧光成像。而且制备方法简单易行。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和核酸化学领域,具体指一种microRNA检测探针及其制备方法和应用,该探针对细胞内microRNA具有很好的检测效率,在microRNA相关研究方面具有良好的应用前面。
背景技术
成熟的微RNA(microRNA;miRNA,又译小分子RNA)是真核细胞中发现的一类可以对基因表达进行调控的单链非编码RNA。通常来说,microRNA由大约22个核苷酸组成(核苷酸个数在18-25个不等),在动物、植物和病毒中广泛地通过转录调控基因的表达。microRNA通过与靶标信使核糖核酸(mRNA)特异结合,从而抑制转录后基因表达。研究表明,microRNA调控着一半以上的人类基因,一种microRNA可以拥有上百种目标基因。
由于microRNA在疾病预测中的重要性,microRNA已经成为了新一代的疾病诊断和预测方面的标志物。程序化地定量检测细胞、组织和血液中的microRNA受到了科学家们的极大重视。目前为止,已经发展出了很多检测方法,但都或多或少存在着一些不足。传统的northern杂交方法灵敏度十分有限,而芯片检测等方法虽然具有通量高的优点,但存在着成本昂贵且依赖大型仪器的配套使用。因此发展新型的microRNA检测方法,能够方便快捷、灵敏有效地检测microRNA,具有十分重要的意义。
目前,许多纳米材料被应用到microRNA的检测和成像方面,常见的材料包括:纳米金、石墨烯、量子点和上转换发光材料等。理想的microRNA成像纳米材料不仅需要良好的光学性能,能够满足实验的需要,还需具有一定的生物相容性。金-碳空心纳米球作为一种新兴的纳米材料,具有着优良的光热性能。我们的研究结果表明金-碳空心纳米球具备良好的荧光猝灭能力,能够用于microRNA的检测和细胞成像,基于此,我们发明了一种金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针,用于细胞内microRNA的荧光成像。
本发明构建的microRNA检测探针包括透明质酸修饰的金-碳空心纳米球和修饰有FAM荧光基团的DNA单链。通过π-π堆积作用,DNA单链能够吸附在透明质酸修饰的金-碳空心纳米球表面上。同时,由于荧光共振能量转移效应,DNA单链上的FAM基团的荧光能够被金-碳空心纳米球猝灭。当检测体系中存在目标microRNA时,DNA单链能够与目标microRNA结合,形成互补的双链,进而从金-碳空心纳米球表面游离下来,进而产生荧光增强。我们的研究结果表明该探针在溶液体系中对目标microRNA具有良好的检测效率和选择性,具有很低的检出限。在细胞内microRNA荧光成像方面,相较于对照组,该探针可以对细胞中的目标microRNA进行有效地荧光成像。该探针的研发为microRNA的生物学研究和临床检测提供了新的研究方向,具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于金-碳纳米球构建的microRNA检测探针及其制备方法和其在细胞内microRNA荧光成像方面的应用,所制备的检测探针对目标microRNA具有良好的检测效率和选择性,具有很低的检出限,可用于microRNA的临床检测和荧光成像研究等方面。
本发明提供了一种基于金-碳纳米球构建的microRNA检测探针的制备方法,该方法是使用透明质酸修饰的金-碳空心纳米球来搭载修饰有FAM荧光基团的DNA单链,DNA单链的序列与目标microRNA互补配对,进而制备出具有良好检测效率和选择性的microRNA探针体系,制备方法简单易行。
本发明制备的基于金-碳纳米球构建的microRNA检测探针,具有良好的检测效率和选择性,具有很低的检出限,能够对活细胞中的目标microRNA进行荧光成像。
本发明还提供了所述金-碳纳米球构建的microRNA检测探针在体外microRNA检测方面的应用。
本发明还提供了一种基于金-碳纳米球构建的新型microRNA检测探针的制备方法,主要包括以下步骤:
1.制备二氧化硅球模板(即SiO2)
称取100 mL乙醇,于150 mL烧杯中,加入1.5 mL ddH2O和5 mL氨水(25-28%),用磁力搅拌器搅拌;
搅拌均匀后,以很慢的速度逐滴加入1.5mL正硅酸乙酯,室温搅拌反应4h,得到SiO2球;
洗涤SiO2球:使用ddH2O分散得到的SiO2球,高速离心洗涤,重复三次,得到纯化后的SiO2球。
.制备聚多巴胺包裹的二氧化硅球(即SiO2@PDA)
将步骤1得到的200 mg SiO2球于10 mL 10 mM的Tris缓冲液(pH=8.2)中,超声30min,呈絮状,在室温下搅拌反应48 h;
称取180 mg盐酸聚多巴胺,加入上述反应体系,在室温下搅拌反应48h;
反应完成后,使用抽滤的方法收集反应产物SiO2@PDA,使用ddH2O洗涤后,冻干,得到SiO2@PDA纳米复合物。
.制备表面有金纳米颗粒的SiO2@PDA纳米复合物(SiO2@PDA@Au)
称取25 mg KAuCl4(预先溶解到2 mL ddH2O中,用2 min时间缓慢加到步骤2得到的SiO2@PDA体系中),加入到以上体系中,在冰浴中快速搅拌约30 min;
反应完成后,立刻用抽滤的方法收集反应产物SiO2@PDA@Au,使用ddH2O洗涤后冻干,得到SiO2@PDA@Au纳米复合物。
.制备表面分散有金纳米颗粒的中空碳纳米壳(AuHCNs)
将步骤3中得到的SiO2@PDA@Au高温碳化3h;碳化后将获得的含有SiO2模板的金-碳纳米球置于塑料反应器中,加入浓度约为4%的氢氟酸,搅拌反应,将SiO2模板消化掉,最终得到AuHCNs;
5.制备表面修饰透明质酸的AuHCNs(AuHCNs-HA)
将步骤4中得到的10 mg AuHCNs,分散于20 mL 1×PBS缓冲液,超声20 min,加入PDA-HA,搅拌反应24 h;
反应完成后,12000 rpm离心15 min,使用ddH2O洗涤3次后,冻干,储存, 得到AuHCNs-HA。
.制备基于金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针
将步骤5中得到的AuHCNs-HA按照30 ug/mL的浓度,与50 nM Probe-miR21在PBS缓冲液中混合均匀,在摇床上猝灭30 min后,用于检测microRNA。
.体外检测miR21
在步骤6得到的探针体系中,加入不同浓度的miR21链,置于摇床中反应2h,使用多功能酶标仪检测荧光强度。激发光为488 nm,检测发射波长为520 nm。。
.检测特异性
在步骤6得到的探针体系中,分别加入50nM的miR21、miR21-1、miR21-5P和miR141,置于摇床中反应2h后检测荧光强度。激发光为488nm,检测发射波长为520nm。
.细胞内microRNA成像
将LoVo与SW48细胞更换培养液后,加入步骤6得到的探针体系,使Probe-miR21终浓度为50 nM,AuHCNs-HA终浓度为30 ug/mL。孵育20 h后,弃去培养基,PBS冲洗2次后,使用共聚焦荧光显微镜观察荧光强度与分布。另外,将SW48细胞分为三组,均更换培养液,加入步骤6得到的探针体系,使Probe-miR21终浓度为50 nM,AuHCNs-HA终浓度为30 ug/mL。分别在0、8 h和24 h时,弃去一组中的培养基,PBS冲洗2次后, 使用共聚焦荧光显微镜观察荧光强度与分布。
表1:本发明所使用到的所有引物的序列
本发明的方案具有以下优点:
1)本发明首次报道了透明质酸修饰的金-碳空心纳米球能够吸附修饰有FAM荧光基团的DNA单链,并猝灭荧光。当检测体系中存在目标microRNA时,DNA单链能够与目标microRNA结合,形成互补的双链,进而从金-碳空心纳米球表面游离下来,进而产生荧光增强。因此,使用透明质酸修饰的金-碳空心纳米球搭载修饰有FAM荧光基团的DNA单链来组装构成microRNA检测探针体系可以用于microRNA检测方面的研究。
2)本发明通过使用透明质酸修饰的金-碳空心纳米球搭载修饰有FAM荧光基团的DNA单链来组装构成microRNA检测探针,制备方法简单可行。可以根据目标microRNA的序列来个性化地设计不同的DNA单链,来构建相应的检测探针体系,检测目标microRNA,本方法具备通用性。
3)本发明构建的透明质酸修饰的金-碳空心纳米球/FAM荧光基团的DNA单链的microRNA检测探针体系可以对溶液体系中的microRNA 的含量进行检测,通过体系荧光强度来反映microRNA的浓度,对目标microRNA具备很好的检测特异性和检测灵敏度,可以用于各种体外的溶液体系中的microRNA检测。
4)本发明构建的透明质酸修饰的金-碳空心纳米球/FAM荧光基团的DNA单链的microRNA检测探针体系可以有效地进入细胞内,能够通过荧光成像的方式来反映细胞中microRNA的定位和含量,可以用于细胞中microRNA定位和含量的实时检测。
附图说明
图1为探针检测细胞中microRNA的示意图。
图2为金-碳纳米球猝灭FAM荧光基团的DNA单链的荧光光谱图。
图3为探针在体外检测不同浓度梯度的microRNA的荧光光谱图。
图4为探针的检测特异性。
图5为探针对不同细胞中miR-21的荧光成像图。
图6为探针对同一细胞中不同时段miR-21的荧光成像图。
具体实施方式
实施例1 本发明提供的基于金-碳纳米球构建的新型microRNA检测探针的制备
步骤1:二氧化硅球模板的制备
1)量取100 mL无水乙醇,于150 mL干净烧杯中,加1.5 mL ddH2O和5 mL氨水(25-28%),用磁力搅拌器搅拌均匀,转速为600 rpm;
2) 将步骤1)中得到反应体系,量取1.5 mL正硅酸乙酯,以5秒钟一滴的速度逐滴加入反应体系中,室温搅拌反应4 h,得到二氧化硅球;
3)将步骤2)中得到的SiO2球溶液均分到4个50 mL离心管中8000 rpm离心15 min,弃上清,每管分别加入30 mL ddH2O,用超声清洗机超声2 min使其充分分散,重复三次,最终用3 mL ddH2O重悬,超声清洗机超声2 min,得到纯二氧化硅球模板;
4)将步骤3)中得到的二氧化硅球模板置于液氮速冻3 min,转入冻干机内冻干。
5)将步骤4)中得到的二氧化硅球模板粉末,置于-20 ℃冰箱保存。
步骤2:聚多巴胺包裹的二氧化硅球的制备
1)称取200 mg 二氧化硅球模板粉末,分散于10 mL 10 mM的Tris缓冲液(pH=8.2)中,超声清洗机超声30 min,呈絮状;
2)称取180 mg盐酸聚多巴胺,加入到步骤1)的反应体系中,用磁力搅拌器以600rpm,在室温下搅拌反应48 h;
3)将步骤2)中得到的溶液,置于抽滤装置中,抽滤、收集反应产物聚多巴胺包裹的二氧化硅球,使用30 mL ddH2O分散、超声清洗机超声2 min后,再次抽滤,重复2遍,得到纯的聚多巴胺包裹的二氧化硅球;
4)将步骤3)中得到的多巴胺包裹的二氧化硅球置于液氮速冻3min,转入冻干机内冻干,得到多巴胺包裹的二氧化硅球粉末。
5)将步骤4)中得到的多巴胺包裹的二氧化硅球粉末,置于-20 ℃冰箱保存。
步骤3:表面有金纳米颗粒的SiO2@PDA纳米复合物的制备
1)量取50 mL ddH2O于干净的200 mL圆底烧瓶中,置于冰上冰浴20 min;
2)称取200 mg多巴胺包裹的二氧化硅球粉末,加入到步骤1)的体系中,在超声清洗机中超声2 min使其充分分散;
3) 称取25 mg KAuCl4于2 mL eppendorf管中,加入2 mL ddH2O溶解;
4)以5秒一滴的速度,将步骤3)得到的溶液,逐滴滴入步骤2)的反应瓶中,同时在冰浴中用磁力搅拌器以800 rpm快速搅拌30 min;
5)将步骤4)中得到的溶液,迅速转移到抽滤装置中,抽滤收集反应产物SiO2@PDA@Au,再使用30mL ddH2O分散、超声清洗机超声2min后,再次抽滤,重复2遍,得到纯的SiO2@PDA@Au纳米复合物;
6)将步骤5)中得到的SiO2@PDA@Au纳米复合物置于液氮速冻3 min,转入冻干机内冻干,得到SiO2@PDA@Au纳米复合物粉末。
7)将步骤6)中得到的SiO2@PDA@Au纳米复合物粉末,置于-20 ℃冰箱保存。
步骤4:制备表面分散有金纳米颗粒的空心碳纳米球
1)SiO2@PDA@Au纳米复合物粉末在氩气保护下,500℃,碳化3h,得到含有SiO2模板的金-碳纳米球;
2)将步骤1)中得到的产物,转入干净塑料反应杯中,加入浓度为4%的氢氟酸,用磁力搅拌器以600rpm搅拌反应4 h,得到表面分散有金纳米颗粒的空心碳纳米球;
3)向步骤2)中加入饱和NaHCO3溶液终止反应;
4)将步骤3)中得到的溶液,转移到抽滤装置中,抽滤收集反应产物中空金-碳纳米壳,再使用30 mL ddH2O分散、超声清洗机超声2 min后,再次抽滤,重复2遍,得到纯的空心金-碳纳米球;
5)将步骤4)中得到的空心金-碳纳米球置于液氮速冻3 min,转入冻干机内冻干。
6)将步骤5)中得到的空心金-碳纳米球粉末,置于-20 ℃冰箱保存。
步骤5:制备表面修饰透明质酸的AuHCNs
1)称取10 mg 空心金-碳纳米球于干净100mL圆底烧瓶中,加入20 mL 1×PBS缓冲液,超声清洗机超声20 min;
2)向步骤1)的反应体系中加入10mg PDA-HA,用磁力搅拌器以600 rpm的速度,搅拌24 h,得到包裹透明质酸的空心金-碳纳米球;
3)将步骤2)得到的包裹透明质酸的空心金-碳纳米球,转入50 mL圆底离心管,以12000 rpm的转速,室温离心15 min后,使用30 mL ddH2O重悬,超声清洗机超声2 min,再次离心,重复2次后,得到纯的包裹透明质酸的空心金-碳纳米球AuHCNs-HA;
4)将步骤3)中得到的包裹透明质酸的空心金-碳纳米球置于液氮速冻3 min,转入冻干机内冻干得到包裹透明质酸的空心金-碳纳米球粉末。
5)将步骤4)中得到的包裹透明质酸的空心金-碳纳米球粉末,置于-20 ℃冰箱保存。
步骤6:基于金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针的制备
1)称取5 mg空心金-碳纳米球粉末于15 mL干净离心管中,加入10 mL的1×PBS缓冲液,得到浓度为500 μg/mL的空心金-碳纳米球母液;
2)取一个干净15 mL离心管,加入25 uL浓度为10 μM的Probe-miR21;
3) 取步骤1)中的空心金-碳纳米球母液300 μL加入到步骤2)的离心管中,再加1×PBS缓冲液补齐至5 mL,得到含有50 nM Probe-miR21与30 ug/mL AuHCNs-HA的混合溶液;
4)将步骤3)得到的混合溶液在37℃,摇床上反应30 min后,得到金-碳纳米球核酸探针,以此用于microRNA的检测。
实施例2 材料荧光猝灭的表征测试
图2 为本申请实施例1中通过步骤1-5制成的金-碳纳米球对荧光标记单链DNA进行荧光猝灭的荧光光谱图。
使用1×PBS缓冲液稀释10 μM的Probe-miR21,使其终浓度为50 nM,加入到黑色96孔板中,每孔200 μL,加入500 μg/mL的AuHCNs使其终浓度分别为:0 μg/mL,20 μg/mL,40 μg/mL,60 μg/mL,80 μg/mL;室温,避光反应30 min后,使用多功能酶标仪检测荧光强度。激发光为488nm,检测发射波长为520nm。
结果如图2所示,随着加入材料的量的增加,检测体系的荧光强度逐渐降低,实验结果可知金-碳纳米材料对荧光标记单链DNA具有良好的猝灭效果。
实施例3 在缓冲液中材料对目标microRNA进行检测
图3 为申请实施例1中通过步骤1-6制成的金-碳纳米球构建的microRNA检测探针在溶液体系中检测不同浓度microRNA的荧光谱图。
将50nM Probe-miR21与30 μg/mL AuHCNs-HA在黑色96孔板中混合均匀,在摇床上孵育30 min后,加入不同体积10 μM的miR21链,使其终浓度为0、2.5 nM、5 nM、10 nM、20nM、50 nM和100 nM,置于摇床反应2h,使用多功能酶标仪检测荧光强度。激发光为488 nm,检测发射波长为520 nm。
结果如图3所示,随着溶液体系中的microRNA浓度的升高,检测体系的荧光强度逐渐增强,并且具有良好的线性规律。实验结果可知金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针对目标microRNA具有良好的检测效果,检测限可达到2.5 nM。
图4 为申请实施例1中通过步骤1-6制成的金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针在溶液体系中与不同microRNA孵育后的荧光谱图。
50 nM Probe-miR21与30 μg/mL AuHCNs-HA在黑色96孔板中混合均匀,在摇床上孵育30 min后,分别加入50 nM的miR21、miR21-1、miR21-5p和miR141,置于摇床反应2 h,使用多功能酶标仪检测荧光强度。激发光为488 nm,检测发射波长为520 nm。
结果如图4所示,对于探针的检测目标miR21,检测体系的荧光强度明显增强,而其他3种microRNA的检测体系的荧光增强并不明显。实验结果可知金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针对目标microRNA的检测具有良好的特异性。
本发明中Probe-miR21、miR21、miR21-1、miR21-5p和miR141均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。本发明所述多巴胺修饰的透明质酸(PDA-HA)可参照公开号CN106139144A专利申请中所公开的方法制备。
实施例4 材料对细胞内microRNA进行荧光成像
图5 为申请实施例1中通过步骤1-6制成的金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针对LoVo和SW48细胞中miR21进行荧光成像的荧光成像图。
将10 μM Probe-miR21与500 μg/mL AuHCNs-HA预先混合猝灭30 min后,对LoVo与SW48人结肠癌细胞更换培养液,加入探针混合物,使Probe-miR21终浓度为50 nM,AuHCNs-HA终浓度为30 μg/mL。共孵育20 h后,弃去培养基,1×PBS冲洗2次后,使用共聚焦荧光显微镜观察荧光强度与分布。
结果如图5所示,对于miR21表达量低的LoVo细胞,在加入探针后,细胞内的荧光强度并没有明显变化,而对于miR21表达量高的SW48细胞,在加入探针后,细胞内的荧光强度显著增强,并且荧光增强的位置主要集中在细胞质中。实验结果可知金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针能够通过细胞荧光成像反映细胞内的目标microRNA的含量和分布。
图6 为申请实施例1中通过步骤1-6制成的金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针在不同时间对SW48细胞中miR21进行荧光成像的荧光成像图。
将10 μM Probe-miR21与500 μg/mL AuHCNs-HA预先混合猝灭30 min;将SW48细胞分为三组,均更换培养液,加入探针混合物,使Probe-miR21终浓度为50 nM,AuHCNs-HA终浓度为30 μg/mL。分别在0、4 h、8 h、12 h、24 h和48 h时,弃去一组中的培养基,1×PBS冲洗2次后, 共聚焦荧光显微镜观察荧光强度与分布。
结果如图6所示,在探针与SW48细胞共孵育后,随着孵育时间的延长,细胞内的荧光强度逐渐增强,在12 h时达到荧光最大值,之后荧光随着时间的延长会有少许下降。实验结果可知金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针在细胞中的荧光成像的最佳观察时间为12 h。
序列表
<110>华中科技大学同济医学院附属协和医院
<120>一种基于金-碳纳米球构建的microRNA检测探针及其制备方法和应用
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列(artificial sequence)
<400>1
FAM-tcaacatcag tctgataagc ta
<210>2
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列(artificial sequence)
<400>2
uagcuuauca tacuaaucuu ga
<210>3
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列(artificial sequence)
<400>3
ucaacaucag ucugauaagc ua
<210>4
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列(artificial sequence)
<400>4
uaacacuguc ugguaaagau gg
<210>5
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列(artificial sequence)
<400>5
uagcuuauca gacugauguu ga
序 列 表
Claims (4)
1.一种基于金-碳纳米球构建的microRNA检测探针的制备方法,其特征是:使用透明质酸修饰的金-碳空心纳米球来搭载修饰有FAM荧光基团的DNA单链,DNA单链的序列与目标microRNA互补配对,进而制备出基于金-碳纳米球构建的microRNA探针;
包括以下步骤:
1)制备二氧化硅球模板
称取100mL乙醇,于150mL烧杯中,加入1.5mL ddH2O和5mL质量百分比浓度为25-28%的氨水,用磁力搅拌器搅拌;搅拌均匀后,加入1.5mL正硅酸乙酯,室温搅拌反应4h,得到SiO2球;使用ddH2O分散得到的SiO2球,高速离心洗涤,重复三次,得到纯化后的SiO2球;
2)制备聚多巴胺包裹的二氧化硅球
将步骤1)得到的200mg纯化后的SiO2球加入到10mL 10mM的pH8.2的Tris缓冲液中,超声30min,然后在室温下搅拌反应48h;加入180mg盐酸聚多巴胺,在室温下搅拌反应48h;反应完成后,使用抽滤的方法收集反应产物,将收集到的反应产物使用ddH2O洗涤后冻干,得到聚多巴胺包裹的二氧化硅球;
3)制备表面有金纳米颗粒的聚多巴胺包裹的二氧化硅球
将25mg KAuCl4溶解到2mL ddH2O中得KAuCl4溶液,用2min时间将KAuCl4溶液加到步骤2)得到的聚多巴胺包裹的二氧化硅球中,在冰浴中快速搅拌30min;用抽滤的方法收集反应产物,将收集到的反应产物使用ddH2O洗涤后冻干,得到表面有金纳米颗粒的聚多巴胺包裹的二氧化硅球;
4)制备表面分散有金纳米颗粒的中空碳纳米壳
将步骤3)中得到的表面有金纳米颗粒的聚多巴胺包裹的二氧化硅球500℃碳化3h得到含有SiO2模板的金-碳纳米球;将获得的含有SiO2模板的金-碳纳米球置于塑料反应器中,加入质量浓度为4%的氢氟酸,搅拌反应,将SiO2模板消化掉,最终得到表面分散有金纳米颗粒的中空碳纳米壳;
5)制备表面修饰透明质酸的AuHCNs将10mg表面分散有金纳米颗粒的中空碳纳米壳,分散于20mL 1×PBS缓冲液,超声20min,加入PDA-HA,搅拌反应24h;反应完成后,12000rpm离心15min,使用ddH2O洗涤3次后,冻干,储存, 得到表面修饰透明质酸的AuHCNs;
6)制备基于金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针
将步骤5)中得到的表面修饰透明质酸的AuHCNs按照30 μ g /mL的浓度,与50nMProbe-miR21在PBS缓冲液中混合均匀,在摇床上猝灭30min后,得到基于金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针。
2.由权利要求1所述制备方法制备得到的基于金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针。
3.权利要求2所述基于金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针在体外检测microRNA的应用,所述应用用于非疾病诊断目的。
4.权利要求2所述基于金-碳纳米材料构建的microRNA检测探针在用于细胞内microRNA的荧光成像中应用,所述应用用于非疾病诊断目的。
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