CN109369912A - 在聚多巴胺纳米粒子表面密度可控地接枝dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在聚多巴胺纳米粒子表面密度可控地接枝DNA的方法，所述方法为：通过在反应体系中加入金属阳离子来控制DNA在聚多巴胺纳米粒子表面的接枝密度。本发明提供的方法可以得到接枝密度可控的DNA接枝聚多巴胺纳米粒子，其中，DNA在粒径为250nm的聚多巴胺纳米粒子表面的接枝密度最高可达34.60pmol/cm²，远高于DNA在粒径为250nm的金纳米粒子表面的最高接枝密度(21pmol/cm²)。

Description

在聚多巴胺纳米粒子表面密度可控地接枝DNA的方法

技术领域

本发明属于纳米生物技术领域，涉及一种在聚多巴胺纳米粒子表面密度可控地接枝DNA的方法。

背景技术

脱氧核糖核酸(DNA)是最重要的生物大分子，从材料学的角度来看，DNA分子具有可程序化设计、生物功能丰富、生物相容性好等优点。而金纳米粒子、氧化铁纳米粒子、量子点等诸多纳米材料往往具有特殊的电学、光学、热学及磁学性质。将DNA结合于纳米粒子表面形成DNA纳米粒子可极大扩展DNA的应用空间；同时，DNA也可以大幅改善这些外源性粒子的水分散性和生物相容性，使其具有更大的生物学应用潜力。目前，DNA纳米粒子已在纳米器件构建，疾病诊疗以及传感等领域得到了广泛的应用。

基于共价接枝方式制备的DNA纳米粒子在生物体内的稳定性大幅优于以物理吸附方法制备的DNA纳米粒子，在生物学应用中更具备实际意义(Anal.Chem.,2017,89,5445-5452)。目前，对基于Au-S键的DNA-金纳米粒子的研究已经十分成熟，而相对于金纳米，其他类型的纳米粒子与DNA结合制备DNA纳米粒子的研究则较少，其中一个重要原因是这些纳米粒子的表面接枝复杂且效率难以保证。可以说，表面接枝问题限制了DNA纳米粒子的进一步发展和更为广泛深入的应用，发展一种具有广泛适用性的新型纳米粒子表面接枝方法具有非常的必要性和紧迫性。

多巴胺是生物体内天然存在的分子，其在弱碱性水相环境中可氧化形成聚多巴胺(polydopamine,PDA)并强力附着于多种固体材料的表面。PDA生物相容性优良，且其表面富含邻苯二酚、氨基等活性基团，极其有利于进一步的功能化修饰(Chem.Rev.,2014,114,5057-5115)。通过PDA对各种纳米粒子进行包被并进一步接枝DNA是一种极具可行性的DNA纳米粒子普适性制备方法。目前，PDA包裹各种纳米粒子并功能化修饰的研究已有很多，但是对PDA纳米粒子表面接枝DNA的研究还十分缺乏。

南洋理工大学Duan Hongwei教授课题组将金纳米粒子用PDA包裹后，通过PDA表面的邻苯二酚基团与巯基的Michael加成反应将巯基化的DNA接枝到了PDA@Au复合纳米粒子表面，所接枝的DNA完全保持了其功能性，且接枝密度达到了与同尺寸金纳米粒子相当的程度。同时，他们发现，相对于DNA金纳米粒子，这种DNA-PDA@Au复合纳米粒子具有更好的化学稳定性和热稳定性。这项研究证明了通过PDA包被进行纳米粒子的表面DNA化是完全可行的，但其并没有对PDA纳米粒子表面DNA接枝密度可控化进行研究，目前对这些DNA与PDA纳米粒子共价结合中的关键问题的研究尚为空白。

因此，需要研究一种DNA接枝密度可控地接枝方法以满足目前生物科学领域的应用要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在聚多巴胺纳米粒子表面密度可控地接枝DNA的方法。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种在聚多巴胺纳米粒子表面密度可控地接枝DNA的方法，所述方法为：通过在反应体系中加入金属阳离子来控制DNA在聚多巴胺纳米粒子表面的接枝密度。

本发明中，在制备聚多巴胺纳米粒子表面接枝DNA的过程中，在反应体系中加入金属阳离子，以此可以达到控制DNA在聚多巴胺纳米粒子表面的接枝密度。

聚多巴胺纳米粒子可强力粘附于多种纳米离子表面，因此，本发明提供的可控密度的接枝方法相比于传统的金纳米离子表面DNA接枝技术具有更为广阔的应用空间。

由于聚多巴胺可通过氧化自聚包覆在各种纳米材料表面，并且聚多巴胺并不会因为所包覆的纳米粒子不同而改变其性质，因此在聚多巴胺表面进行的共价接枝和所包覆的纳米粒子无关，只与本身性质有关，鉴于此，本发明并不限定聚多巴胺纳米粒子是否包覆有其他纳米粒子，也可以为纯聚多巴胺纳米粒子。

优选地，所述方法为：通过控制反应体系中所述金属阳离子的浓度来控制DNA在聚多巴胺纳米粒子表面的接枝密度。

优选地，所述金属阳离子的浓度C的对数与所述DNA的接枝密度D满足一次线性关系。

金属阳离子的浓度的对数与DNA的接枝密度满足一次线性关系，因此，本发明可以通过控制反应体系中金属阳离子的浓度来达到控制DNA接枝密度的目的。

优选地，所述金属阳离子为一价阳离子和/或二价阳离子。

优选地，所述金属阳离子为钠离子和/或镁离子。

优选地，在反应体系中，所述金属阳离子的浓度≤2.0mol/L，例如1.8mol/L、1.5mol/L、1.2mol/L、1.0mol/L、0.8mol/L、0.5mol/L、0.1mol/L、0.05mol/L、0.025mol/L、0.001mol/L等。

优选地，所述DNA的碱基或碱基对数目为25-45，例如26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44等。

当DNA为单链DNA时，用碱基数目表示，当DNA为双链DNA时，利用碱基对数目表示。

优选地，所述DNA为单链DNA和/或双链DNA。

优选地，所述单链DNA为spacer为寡核苷酸的单链DNA和/或spacer为不带电荷的寡聚物的单链DNA。

优选地，所述双链DNA为spacer为寡核苷酸的双链DNA和/或spacer为不带电荷的寡聚物的双链DNA。

本领域技术人员均知，在DNA接枝反应中，不同spacer对接枝反应过程的影响均远远大于DNA的长度。因此，在本发明中，我们选择了spacer为寡核苷酸或spacer为不带电荷的寡聚物的DNA，并没有具体限定DNA的长度。本发明选择下列DNA序列作为列举，进行本发明的说明以及解释：

所述DNA序列包括ssDNA1、ssDNA2、dsDNA1和dsDNA2。

其中，dsDNA1为ssDNA1与其互补序列杂交得到，dsDNA2为ssDNA2与其互补序列杂交得到。

ssDNA1：FAM-GGA GTG GAG TGT GGA AGA TGA ACA AGA GTG AAA GTG TTT TTTTTT T-SH。

ssDNA2：FAM-GGA GTG GAG TGT GGA AGA TGA ACA AGA GTG AAA GTG-3[(CH₂-CH₂O)₆]-SH。

优选地，所述金属阳离子为钠离子，所述spacer为寡核苷酸的单链DNA的接枝密度D1与钠离子的浓度C1满足如下关系式：

D1＝21.28×lgC1+16.89；

所述金属阳离子为钠离子，所述spacer为不带电荷的寡聚物的单链DNA的接枝密度D2与钠离子的浓度C1满足如下关系式：

D2＝24.96×lgC1+23.99；

所述金属阳离子为钠离子，所述spacer为寡核苷酸的双链DNA的接枝密度D3与钠离子的浓度C1满足如下关系式：

D3＝10.41×lgC1+11.41；

所述金属阳离子为钠离子，所述spacer为不带电荷的寡聚物的双链DNA的接枝密度D4与钠离子的浓度C1满足如下关系式：

D4＝11.71×lgC1+13.78；

所述金属阳离子为镁离子，所述spacer为寡核苷酸的单链DNA的接枝密度D5与镁离子的浓度C2满足如下关系式：

D5＝3.32×lgC2+20.36；

所述金属阳离子为镁离子，所述spacer为不带电荷的寡聚物的单链DNA的接枝密度D6与钠离子的浓度C2满足如下关系式：

D6＝3.42×lgC2+23.07；

所述金属阳离子为镁离子，所述spacer为寡核苷酸的双链DNA的接枝密度D7与镁离子的浓度C2满足如下关系式：

D7＝9.1×lgC2+30.33；

所述金属阳离子为镁离子，所述spacer为不带电荷的寡聚物的双链DNA的接枝密度D8与钠离子的浓度C2满足如下关系式：

D8＝5.84×lgC2+21.56。

优选地，所述聚多巴胺纳米粒子的粒径为250nm。

优选地，所述接枝DNA的方法包括利用Michael加成反应将DNA接枝到聚多巴胺纳米粒子表面。

DNA易于功能化修饰，本发明使用巯基化的DNA，利用巯基与聚多巴胺纳米粒子表面丰富的邻苯二酚基团的Michael加成反应将DNA接枝到聚多巴胺纳米粒子表面，并通过调节反应体系中Na⁺/Mg⁺等金属阳离子的浓度来达到控制聚多巴胺纳米粒子表面DNA接枝密度的目的。

优选地，在反应体系中，所述聚多巴胺纳米粒子的浓度为50.0-60.0μg/mL，例如52μg/mL、54μg/mL、55μg/mL、56μg/mL、58μg/mL等。

优选地，在反应体系中，所述DNA的浓度为1.0-1.5μmol/L，例如1.1μmol/L、1.2μmol/L、1.3μmol/L、1.4μmol/L等。

优选地，所述反应在pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液中进行。

优选地，所述反应的时间为8-10h，例如8.5h、9h、9.5h等。

优选地，所述聚多巴胺纳米粒子的制备方法为：将盐酸多巴胺加入混合溶剂中，室温密闭反应24-28h(例如25h、26h、27h等)后离心，得到所述聚多巴胺纳米粒子。

优选地，所述混合溶剂为超纯水、乙醇和氨水以体积比100:40:1形成的混合溶剂。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)金属阳离子的浓度的对数与DNA的接枝密度满足一次线性关系，因此，本发明可以通过控制反应体系中金属阳离子的浓度来达到控制DNA接枝密度的目的；

(2)本发明提供的方法可以得到接枝密度可控的DNA接枝聚多巴胺纳米粒子，其中，DNA在粒径为250nm的聚多巴胺纳米粒子表面的接枝密度最高可达34.60pmol/cm²，远高于DNA在粒径为250nm的金纳米粒子表面的最高接枝密度(21pmol/cm²)。

附图说明

图1是实施例1提供的聚多巴胺纳米粒子的扫描电镜图。

图2是实施例1提供的DNA接枝聚多巴胺纳米粒子的结构示意图。

图3是实施例1-6以及对比例1提供的ssDNA1接枝聚多巴胺纳米粒子经过酶解处理后的荧光光谱图。

图4是实施例7-12以及对比例2提供的ssDNA2接枝聚多巴胺纳米粒子经过酶解处理后的荧光光谱图。

图5是实施例13-18以及对比例3提供的ssDNA1接枝聚多巴胺纳米粒子经过酶解处理后的荧光光谱图。

图6是实施例19-24以及对比例4提供的ssDNA2接枝聚多巴胺纳米粒子经过酶解处理后的荧光光谱图。

图7是实施例25-30以及对比例5提供的dsDNA1接枝聚多巴胺纳米粒子经过酶解处理后的荧光光谱图。

图8是实施例31-36以及对比例6提供的dsDNA1接枝聚多巴胺纳米粒子经过酶解处理后的荧光光谱图。

图9是实施例37-42以及对比例7提供的dsDNA1接枝聚多巴胺纳米粒子经过酶解处理后的荧光光谱图。

图10是实施例43-48以及对比例8提供的dsDNA2接枝聚多巴胺纳米粒子经过酶解处理后的荧光光谱图。

图11是对比例1和实施例1-6的钠离子浓度的对数和DNA接枝密度进行一次线性关系拟合图。

图12是对比例2和实施例7-12的钠离子浓度的对数和DNA接枝密度进行一次线性关系拟合图。

图13是对比例3和实施例13-18的镁离子浓度的对数和DNA接枝密度进行一次线性关系拟合图。

图14是对比例4和实施例19-24的镁离子浓度的对数和DNA接枝密度进行一次线性关系拟合图。

图15是对比例5和实施例25-32的钠离子浓度的对数和DNA接枝密度进行一次线性关系拟合图。

图16是对比例6和实施例33-36的钠离子浓度的对数和DNA接枝密度进行一次线性关系拟合图。

图17是对比例7和实施例37-42的镁离子浓度的对数和DNA接枝密度进行一次线性关系拟合图。

图18是对比例8和实施例43-48的镁离子浓度的对数和DNA接枝密度进行一次线性关系拟合图。

图19是HeLa细胞对DNA-PDA纳米粒子的摄入情况的激光共聚焦显微照片。

图20是MCF-7细胞对DNA-PDA纳米粒子的摄入情况的激光共聚焦显微照片。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1-6

一种DNA接枝聚多巴胺纳米粒子，制备方法如下：

(1)制备粒径为250nm的聚多巴胺纳米粒子

向100.0mL超纯水、40.0mL乙醇以及1.0mL氨水的混合溶液中加入500.0mg盐酸多巴胺，密封室温搅拌24小时后离心(48000RCF)并用超纯水洗涤三次，其中，所得的聚多巴胺纳米粒子表面Zeta电位为-15.43±1.61mV。

(2)制备ssDNA1接枝聚多巴胺纳米粒子

控制聚多巴胺纳米粒子的浓度为50.0μg/mL，DNA的浓度为1.0μM，反应在pH＝8.5的Tris-HCl(10.0mM)缓冲液中进行，加入氯化钠，控制反应体系总体积为100μL，反应进行时间为8小时；之后离心(48000RCF)并用超纯水洗涤三次，得到ssDNA1接枝聚多巴胺纳米粒子。

在反应体系中，分别控制氯化钠的浓度为0.025mol/L(实施例1)、0.50mol/L(实施例2)、0.75mol/L(实施例3)、1.0mol/L(实施例4)、2mol/L(实施例5)、3.0mol/L(实施例6)。

实施例7-12

与实施例1-6的区别仅在于，在本实施例中，将ssDNA1替换为ssDNA2。

实施例13-18

与实施例1的区别仅在于，在本实施例中，将氯化钠替换为氯化镁，并分别控制氯化镁的浓度为0.001mol/L(实施例13)、0.005mol/L(实施例14)、0.025mol/L(实施例15)、0.1mol/L(实施例16)、0.5mol/L(实施例17)、2mol/L(实施例18)。

实施例19-24

与实施例13-18的区别仅在于，在本实施例中，将ssDNA1替换为ssDNA2。

实施例25-30

与实施例1-6的区别仅在于，在本实施例中，将ssDNA1替换为dsDNA1，并分别控制氯化钠的浓度为0.1mol/L(实施例25)、0.3mol/L(实施例26)、0.5mol/L(实施例27)、1.0mol/L(实施例28)、2.0mol/L(实施例29)、3.0mol/L(实施例30)。

实施例31-36

与实施例25-30的区别仅在于，在本实施例中，将dsDNA1替换为dsDNA2。

实施例37-42

与实施例13-18的区别仅在于，在本实施例中，将ssDNA1替换为dsDNA1。

实施例43-48

与实施例13-18的区别仅在于，在本实施例中，将ssDNA1替换为dsDNA2。

对比例1

与实施例1的区别仅在于，在本对比例中，不添加氯化钠。

对比例2

与实施例7的区别仅在于，在本对比例中，不添加氯化钠。

对比例3

与实施例13的区别仅在于，在本对比例中，不添加氯化镁。

对比例4

与实施例19的区别仅在于，在本对比例中，不添加氯化镁。

对比例5

与实施例25的区别仅在于，在本对比例中，不添加氯化钠。

对比例6

与实施例31的区别仅在于，在本对比例中，不添加氯化钠。

对比例7

与实施例37的区别仅在于，在本对比例中，不添加氯化镁。

对比例8

与实施例43的区别仅在于，在本对比例中，不添加氯化镁。

为了确保结果准确性，上述每个实施例和对比例，均重复三次进行，在性能测试中，计算结果取平均值。

性能测试1

对实施例1-48和对比例1-8提供的DNA接枝聚多巴胺纳米粒子进行性能测试，方法如下：

(1)扫描电镜照片：对实施例1提供的聚多巴胺纳米粒子进行扫描电镜分析；

图1为实施例1提供的聚多巴胺纳米粒子的扫描电镜图，由图可知，本发明实施例1制备得到的聚多巴胺纳米粒子粒径较均匀，平均粒径为250nm。

(2)DNA接枝密度检测

鉴于ssDNA与聚多巴胺纳米粒子会基于疏水作用力及DNA上碱基与聚多巴胺分子中芳香环的π-π相互作用而存在一定的物理吸附，因此，我们选用两种不含巯基，其余部分与ssDNA1和ssDNA2一致的DNA序列将作为对照序列，以与实施例1-24相同的过程进行与聚多巴胺纳米粒子的相互作用，用于聚多巴胺纳米粒子表面DNA接枝密度定量计算中排除物理吸附的影响。

两种DNA分别命名为ssDNA1-control和ssDNA2-control，其序列为：

ssDNA1-control：FAM-GGA GTG GAG TGT GGA AGA TGA ACA AGA GTG AAA GTGTTT TTT TTT T；

ssDNA2-control：FAM-GGA GTG GAG TGT GGA AGA TGA ACA AGA GTG AAA GTG-3[(CH2-CH2O)6]。

dsDNA的碱基部分被其磷酸骨架包裹在内部，其与PDA纳米粒子的物理吸附可忽略不计，因此在dsDNA共价接枝实验中不引入类似于ssDNA实验中的对照序列，计算接枝密度时认为未通过离心洗涤步骤除去的均为已成功接枝于聚多巴胺纳米粒子表面的dsDNA。

通过脱氧核糖核酸酶I(DNase1)将DNA-聚多巴胺纳米粒子表面接枝的DNA从聚多巴胺纳米粒子表面解离下来，再通过荧光标准曲线法进行DNA的定量。

酶解反应过程：反应产品离心沉淀分散于含30UDNase1的50μL DNase1缓冲液中(缓冲液成分为10mM pH＝7.6Tris-HCl缓冲液，含2.5mM MgCl₂及0.5mM CaCl₂)，在37℃孵育30min后转入25℃继续孵育1h，离心并用pH＝7.4的PBS缓冲液(10mM，本专利中所用PBS缓冲液一致，下文简写为PBS缓冲液)洗涤三次，收集所有离心上清液共计200μL，合并上清液进行荧光光谱测试(激发光波长：488nm)。

图3是实施例1-6以及对比例1提供的ssDNA1接枝聚多巴胺纳米粒子经过酶解处理后的荧光光谱图；图4是实施例7-12以及对比例2提供的ssDNA2接枝聚多巴胺纳米粒子经过酶解处理后的荧光光谱图。图5是实施例13-18以及对比例3提供的ssDNA1接枝聚多巴胺纳米粒子经过酶解处理后的荧光光谱图；图6是实施例19-24以及对比例4提供的ssDNA2接枝聚多巴胺纳米粒子经过酶解处理后的荧光光谱图。

图7是实施例25-30以及对比例5提供的dsDNA1接枝聚多巴胺纳米粒子经过酶解处理后的荧光光谱图；图8是实施例31-36以及对比例6提供的dsDNA2接枝聚多巴胺纳米粒子经过酶解处理后的荧光光谱图。图9是实施例37-42以及对比例7提供的dsDNA1接枝聚多巴胺纳米粒子经过酶解处理后的荧光光谱图；图10是实施例43-48以及对比例8提供的dsDNA2接枝聚多巴胺纳米粒子经过酶解处理后的荧光光谱图。

DNA浓度标准曲线绘制：取一定量的DNA，加入含30UDNase1的50μL DNase1缓冲液，在37℃孵育30min后转入25℃继续孵育1h，后加入150μL PBS缓冲液使总体积达到200μL；将此溶液用DNase1缓冲液:PBS缓冲液＝1:3的混合液(下文写作缓冲液A)稀释到不同浓度并分别测其荧光光谱(激发光波长：488nm)，以光谱中516nm处荧光强度值作为DNA浓度的函数做标准曲线。

ssDNA1、ssDNA2、ssDNA1-control和ssDNA2-control分别绘制标准曲线，由于dsDNA来源于对应的ssDNA，且酶解后其状态一致，故其标准曲线与对应的ssDNA可通用。

DNA表面接枝密度计算：按照标准曲线计算得到上清液中的DNA浓度后，按以下公式即可得到：

其中，V₁为反应液体积(μL)；V₂为上清液的体积(mL)；C为按照标准曲线得到的DNA浓度(nM)；1.1371×10⁶为反应液中聚多巴胺纳米粒子的颗粒浓度(个/μL)。

由上述公式计算的DNA接枝密度结果见表1和表2：

表1

ssDNA的表面接枝密度是巯基DNA的接枝密度减去对照ssDNA-control的物理吸附的接枝密度之后得到的结果。

以对比例1和实施例1-6的钠离子浓度的对数和DNA接枝密度进行一次线性关系拟合，结果见图11；以对比例2和实施例7-12的钠离子浓度的对数和DNA接枝密度进行一次线性关系拟合，结果见图12；以对比例3和实施例13-18的镁离子浓度的对数和DNA接枝密度进行一次线性关系拟合，结果见图13；以对比例4和实施例19-24的镁离子浓度的对数和DNA接枝密度进行一次线性关系拟合，结果见图14。

表2

以对比例5和实施例25-32的钠离子浓度的对数和DNA接枝密度进行一次线性关系拟合，结果见图15；以对比例6和实施例33-36的钠离子浓度的对数和DNA接枝密度进行一次线性关系拟合，结果见图16；以对比例7和实施例37-42的镁离子浓度的对数和DNA接枝密度进行一次线性关系拟合，结果见图17；以对比例8和实施例43-48的镁离子浓度的对数和DNA接枝密度进行一次线性关系拟合，结果见图18。

由图可知，钠离子和镁离子的浓度的对数与DNA的接枝密度为一次线性关系，通过调节反应体系中钠离子和镁离子的浓度，可以实现对聚多巴胺纳米粒子表面DNA接枝密度的调控，钠离子和镁离子浓度越大，接枝密度一般越高，推测可能的原因是：DNA因其磷酸骨架而含有负电荷，而聚多巴胺表面因为邻苯二酚等基团的存在也表现为负电性，同性电荷之间的排斥力对DNA与PDA纳米粒子的共价结合会产生极大的影响，而该排斥力可通过在反应体系中加入不同浓度的Na⁺、Mg²⁺等阳离子被不同程度的屏蔽，从而会直接影响PDA纳米粒子表面的DNA接枝密度。在实际应用中，0.0M-2.0M范围内是比较准确的。另外由以上结果可见，对于ssDNA，Na⁺比Mg²⁺对其与PDA纳米粒子的静电斥力的屏蔽效果更好；但对于dsDNA，则是Mg²⁺更强。

对于ssDNA，接枝密度可高达34.60pmol/cm²，远高于250nm粒径的金纳米粒子表面最高ssDNA接枝密度。同时，NaCl和MgCl₂在实验过程中可在反应起始直接按量加入反应体系，不必逐步加入，简化了反应步骤同时节省了反应时间。

性能测试2

(3)细胞摄入实验：用一段Cy3荧光基团修饰的无规巯基DNA序列与其互补序列杂交后进行聚多巴胺纳米粒子表面修饰并以HeLa和MCF-7细胞为模型进行细胞摄入实验。

所用Cy3荧光基团修饰的DNA序列为：Cy3-GGA GTG GAG TGT GGA AGA TGA ACAAGA GTG AAA GTG TTT TTT TTT T-SH；其互补DNA序列为：CAC TTT CAC TCT TGT TCA TCTTCC ACA CTC CAC TC。

反应按实施例5提供的接枝反应过程进行，以NaCl作为屏蔽剂，反应体系中NaCl浓度为2.0M。

在细胞摄入实验中，两种细胞首先被接种于激光共聚焦显微镜(CLSM)专用96孔板并培养24h，之后将DNA-PDA纳米粒子分散于DMEM培养基并分别和两种细胞共培养6h，DNA-PDA纳米粒子实验浓度为25μg/mL；在CLSM观察前，用PBS洗涤细胞三次以除去未进入细胞的纳米粒子；CLSM观察时激发激光为552nm，荧光为黄色。

图19为激光共聚焦显微照片表征HeLa细胞对DNA-PDA纳米粒子的摄入情况图；图20为激光共聚焦显微照片表征MCF-7细胞对DNA-PDA纳米粒子的摄入情况图。由图可知，两种细胞均可摄入DNA-PDA纳米粒子。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种在聚多巴胺纳米粒子表面密度可控地接枝DNA的方法，其特征在于，所述方法为：通过在反应体系中加入金属阳离子来控制DNA在聚多巴胺纳米粒子表面的接枝密度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法为：通过控制反应体系中所述金属阳离子的浓度来控制DNA在聚多巴胺纳米粒子表面的接枝密度。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述金属阳离子的浓度C的对数与所述DNA的接枝密度D满足一次线性关系。

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其特征在于，所述金属阳离子为一价阳离子和/或二价阳离子；

优选地，所述金属阳离子为钠离子和/或镁离子；

优选地，在反应体系中，所述金属阳离子的浓度≤2.0mol/L。

5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA的碱基或碱基对数目为25-45；

优选地，所述DNA为单链DNA和/或双链DNA；

优选地，所述单链DNA为spacer为寡核苷酸的单链DNA和/或spacer为不带电荷的寡聚物的单链DNA；

优选地，所述双链DNA为spacer为寡核苷酸的双链DNA和/或spacer为不带电荷的寡聚物的双链DNA。

6.根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其特征在于，所述金属阳离子为钠离子，所述spacer为寡核苷酸的单链DNA的接枝密度D1与钠离子的浓度C1满足如下关系式：

D1＝21.28×lgC1+16.89；

或所述金属阳离子为钠离子，所述spacer为不带电荷的寡聚物的单链DNA的接枝密度D2与钠离子的浓度C1满足如下关系式：

D2＝24.96×lgC1+23.99；

或所述金属阳离子为钠离子，所述spacer为寡核苷酸的双链DNA的接枝密度D3与钠离子的浓度C1满足如下关系式：

D3＝10.41×lgC1+11.41；

或所述金属阳离子为钠离子，所述spacer为不带电荷的寡聚物的双链DNA的接枝密度D4与钠离子的浓度C1满足如下关系式：

D4＝11.71×lgC1+13.78；

或所述金属阳离子为镁离子，所述spacer为寡核苷酸的单链DNA的接枝密度D5与镁离子的浓度C2满足如下关系式：

D5＝3.32×lgC2+20.36；

或所述金属阳离子为镁离子，所述spacer为不带电荷的寡聚物的单链DNA的接枝密度D6与钠离子的浓度C2满足如下关系式：

D6＝3.42×lgC2+23.07；

或所述金属阳离子为镁离子，所述spacer为寡核苷酸的双链DNA的接枝密度D7与镁离子的浓度C2满足如下关系式：

D7＝9.1×lgC2+30.33；

或所述金属阳离子为镁离子，所述spacer为不带电荷的寡聚物的双链DNA的接枝密度D8与钠离子的浓度C2满足如下关系式：

D8＝5.84×lgC2+21.56。

7.根据权利要求1-6中的任一项所述的方法，其特征在于，所述聚多巴胺纳米粒子的粒径为250nm。

8.根据权利要求1-7中的任一项所述的方法，其特征在于，所述接枝DNA的方法包括利用Michael加成反应将DNA接枝到聚多巴胺纳米粒子表面。

9.根据权利要求1-8中的任一项所述的方法，其特征在于，在反应体系中，所述聚多巴胺纳米粒子的浓度为50.0-60.0μg/mL；

优选地，在反应体系中，所述DNA的浓度为1.0-1.5μmol/L；

优选地，所述反应在pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液中进行；

优选地，所述反应的时间为8-10h。

10.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，其特征在于，所述聚多巴胺纳米粒子的制备方法为：将盐酸多巴胺加入混合溶剂中，室温密闭反应24-28h后离心，得到所述聚多巴胺纳米粒子；

优选地，所述混合溶剂为超纯水、乙醇和氨水以体积比100:40:1形成的混合溶剂。