CN105999396A - 诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料及其制备方法,其解决了现有材料生物性能不理想的技术问题，骨修复复合材料由石墨烯薄膜和生物活性玻璃构成，生物活性玻璃均匀负载于石墨烯薄膜表面；生物活性玻璃为均匀球形形貌。本发明可用于骨修复复合材料及其制备领域。

Description

诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及骨组织工程支架材料及其制备方法，具体地说是一种诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料及其制备方法。
背景技术
理想的骨组织工程支架材料，不仅可以为成骨细胞生长提供三维空间，而且具有骨引导活性及骨诱导活性，引导成骨细胞粘附、增殖，诱导干细胞成骨分化。纳米材料的众多独特的优良的性质使得其在众多领域都有广泛的应用前景，而具有导电性能的纳米材料更因其特殊的导电性能，受到了前所未有的重视。通过一系列加工，它可成为具有可视效果的刺激响应性材料、带有生物传感器和神经修复功能的生物识别薄膜材料、具有电刺激的药物释放器件以及具有生物相容性的柔性储能材料等诸多材料体系。
作为导电纳米材料中的一种，氧化石墨烯(GO)因其独特的结构和优异的力学、电学、热学及化学特征,对其研究和应用备受关注。以GO作为填充材料来增强复合材料的力学强度或者利用其它生物材料作为GO的修饰材料对GO进行功能化是复合材料领域的研究热点。
生物玻璃(BG)与天然的骨及牙齿有着相似的组成，是较为重要的人工合成类骨无机成分，为含有硅、钠、钙、磷等多种元素氧化物的活性材料，最新的研究表明生物活性玻璃中释放的Si、Ca等物质对于调节诱发成骨细胞周期开始和进程的基因具有激活作用，从而促进了细胞的分化和增殖，促进了新骨形成，具有良好的骨诱导作用，是一类重要的骨修复材料，然而较低的断裂韧性以及耐磨性阻碍了它的广泛应用。
发明内容
本发明就是为了解决现有材料生物性能不理想的技术问题，提供一种生物性能理想、加工方法简单的诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料及其制备方法。
为此，本发明提供一种诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料，骨修复复合材料由石墨烯薄膜和生物活性玻璃构成，生物活性玻璃均匀负载于石墨烯薄膜表面；生物活性玻璃为均匀球形形貌。
优选的，石墨烯薄膜为氧化石墨烯经多巴胺改性而成。多巴胺为在改性过程中其表面的酚羟基与石墨烯表面官能团发生了反应，且多巴胺对氧化石墨烯产生了部分的还原作用。
优选的，生物活性玻璃的材质为正硅酸四乙酯、磷酸三乙酯和四水硝酸钙。
优选的，复合材料为薄膜材料，石墨烯薄膜层间距为0.39nm，生物活性玻璃的直径为50nm～100nm。
优选的，复合材料中，石墨烯质量百分数为0.5％～10％，其余为所述生物活性玻璃。
本发明同时提供一种诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料的制备方法，氧化石墨烯合成通过优化的Hummers法合成；复合材料的制备采用溶胶-凝胶法结合热处理的方法完成。
优选的，得氧化石墨、超声得到分散均匀的单层或少层氧化石墨烯、盐酸多巴胺溶液的配制、搅拌过夜、离心、烘干。
优选的，溶胶-凝胶法结合热处理的方法合成复合材料的制备包括如下步骤：正硅酸乙酯-磷酸三乙酯-四水硝酸钙溶胶-凝胶溶液的配制、多巴胺改性的氧化石墨烯悬液的配制、多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃混合液配制、烧结、碳化。
优选的，本发明提供的诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)氧化石墨烯的制备
采用优化的Hummers法成功获得氧化石墨，并通过超声得到分散均匀的单层或少层氧化石墨烯：天然鳞片石墨与硝酸钠按2:1的比例混合后加入230ml浓硫酸，之后冰浴条件下加入高锰酸钾，搅拌，保持反应温度低于20℃；移走冰浴，在35℃水浴中保温30分钟后缓慢加入460ml去离子水，待反应温度下降到70℃，同样温度水浴10分钟；随后加入700ml双氧水，使反应终止；抽滤，将得到的黄褐色过滤物反复清洗、离心，至上清ph为7左右，烘干，得到氧化石墨；
超声分离：以1mg：1ml的比例将氧化石墨与去离子水混合，将超声波细胞粉碎机功率调至800W，超声2h，得到分散均匀的氧化石墨烯；
(2)氧化石墨烯的还原
还原：基于步骤(1)中制备的氧化石墨烯，将氧化石墨烯、水合肼、氨水、去离子水以100mg：10ml：0.1ml：100ml的比例混合后在95℃水浴中保持2h，反应结束后抽滤，清洗，最后烘干得到还原的氧化石墨烯；
(3)氧化石墨烯的改性
按照步骤(1)中超声的方法将氧化石墨烯与去离子水按照165mg：100ml进行超声，之后加入盐酸多巴胺，配成浓度为0.25mmol/L的溶液，搅拌过夜，离心，烘干，得到多巴胺改性的氧化石墨烯；
(4)溶胶-凝胶法制备氧化石墨烯/生物活性玻璃复合材料
采用溶胶-凝胶法制备0.5wt.％～10wt.％多巴胺改性的氧化石墨烯的/生物活性玻璃复合材料，制备过程为：实验采用正硅酸乙酯、磷酸三乙酯、四水硝酸钙，通过溶胶-凝胶法来制备生物活性玻璃；首先，将磷酸三乙酯溶解于蒸馏水、无水乙醇与氨水的混合液体中，80℃充分搅拌24h，获得水解的磷酸三乙酯溶液；然后将正硅酸乙酯与四水硝酸钙加入磷酸三乙酯水解溶液中，室温搅拌120h，形成溶胶-凝胶溶液；事先将步骤(3)中制备好的多巴胺改性的氧化石墨烯溶解于二甲基甲酰胺，超声2h，形成均匀的多巴胺改性的氧化石墨烯悬液；将溶胶-凝胶溶液按比缓慢加入多巴胺改性的氧化石墨烯悬液中，控制多巴胺改性的氧化石墨烯的质量分数为0.5wt.％～10wt.％，室温搅拌2h，随后将多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃混合液在80℃烧结12h，得到多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃固体；多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃固体在氮气保护环境下通过系列升温碳化方式进一步碳化，最终形成多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃复合物，具体程序为：300℃保持1h,750℃保持2h，1000℃保持3h，随后自然降温至室温；
(5)多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃基底材料制备
以盖玻片作为基底，通过旋涂的方法形成有利于后期细胞生长的基底材料；将直径为14㎜的盖玻片置于体积比1：3的过氧化氢/浓硫酸的混合溶液中，在120℃保持10分钟，然后用无水乙醇和去离子水清洗，氮气保护吹干，得到表面清洁的盖玻片；随后，将清洁的盖玻片浸入3％的硅烷溶液中30分钟，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，冲洗，氮气保护下干燥；将多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃溶于无水乙醇中配制成质量体积百分比为0.5％的悬液，通过旋涂仪上，使30μl悬液在功能化盖玻片上均匀覆盖，室温下晾干，以备后期实验使用。
本发明具有以下效果：
(1)本发明中多巴胺的改性在对氧化石墨烯(GO)有部分还原的基础之上增加了氧化石墨烯在溶液中的分散性，减少了团聚效应，并为后续生物活性玻璃(BG)功能化提供了充裕的表面官能团。通过溶胶-凝胶法可以在改性氧化石墨烯/生物活性玻璃复合材料(DGO/BG)加载比例可控的条件下制备出具有独特纳米拓扑结构的DGO/BG导电支架材料，且BG与DGO的混合比例以及DGO/BG表面形貌都可以进行精确的调控。
(2)本发明所制得DGO/BG复合材料因具有合适的表面硬度、活性功能团、生物分子吸附功能而具有良好的生物相容性，可促进成骨细胞的粘附、增殖和分化；为石墨烯在生物医学领域的应用提供了一个新的途径。
(3)本发明所采用的制备和加工方法简单，可控性强，能用于工业化生产。
综上所述，本发明所提供的复合材料在具有良好的理化性能，精确控制合适配比的DGO/BG因具有理想的表面硬度、活性功能团、生物分子吸附功能而可以较好地调控rBMSCs进行成骨分化。
附图说明
图1为本发明实施例2所述DGO透射电子显微镜照片；
图2a为本发明实施例2所述石墨烯在改性前后的Raman图谱；图2b本发明实施例2所述石墨烯在改性前后的FTIR图谱；
图3为本发明实施例2所述1wt.％DGO/BG复合材料的扫描电子显微镜照片；
图4为本发明实施例2所述1wt.％DGO/BG复合材料的FTIR图；
图5为本发明实施例2所述1wt.％DGO/BG修复材料的成骨细胞培养1天的激光共聚焦显示细胞骨架图片；
图6为本发明实施例2所述修复材料的成骨细胞培养7天的激光共聚焦显示BMP2蛋白表达图片。
具体实施方式
本发明提供了一种诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料及其制备方法，下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。
实施例1
(1)氧化石墨烯(GO)的制备
采用优化的Hummers法成功获得氧化石墨，并通过超声得到分散均匀的单层或少层氧化石墨烯。具体方法为：
天然鳞片石墨与硝酸钠按2:1的比例混合后加入230ml浓硫酸，之后冰浴条件下加入高锰酸钾，搅拌，保持反应温度低于20℃。移走冰浴，在35℃水浴中保温30分钟后缓慢加入460ml去离子水，待反应温度下降到70℃，同样温度水浴10分钟。随后加入700ml双氧水，使反应终止。抽滤，将得到的黄褐色过滤物反复清洗、离心，至上清ph为7左右，烘干，得到氧化石墨。
超声分离：以1mg：1ml的比例将氧化石墨与去离子水混合，将超声波细胞粉碎机功率调至800W，超声2h，得到分散均匀的氧化石墨烯。
(2)氧化石墨烯(GO)的还原
还原：基于(1)中制备的GO，将GO、水合肼、氨水、去离子水以100mg：10ml：0.1ml：100ml的比例混合后在95℃水浴中保持2h，反应结束后抽滤，清洗，最后烘干得到还原的氧化石墨烯(G)。
(3)氧化石墨烯(GO)的改性
按照(1)中超声的方法将GO与去离子水按照165mg：100ml进行超声，之后加入盐酸多巴胺，配成浓度为0.25mmol/L的溶液，搅拌过夜，离心，烘干，得到多巴胺改性的氧化石墨烯(DGO)。
(4)溶胶-凝胶法制备氧化石墨烯/生物活性玻璃复合材料(DGO/BG)
采用溶胶-凝胶法制备0.5wt.％DGO的DGO/BG复合材料，制备过程为：实验采用正硅酸乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸钙(CN)等，通过溶胶-凝胶法来制备58S的生物活性玻璃(BG)。首先，将0.36ml TEP溶解于蒸馏水、无水乙醇与氨水的混合液体中，80℃充分搅拌24h，获得水解的TEP溶液。然后将0.65ml TEOS与0.35g CN加入TEP水解溶液中，室温搅拌120h，形成溶胶-凝胶溶液。事先将(3)中制备好的DGO称取0.0067g溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，超声2h，形成均匀的DGO悬液。将溶胶-凝胶溶液按比缓慢加入DGO悬液中，室温搅拌2h，随后将DGO/BG混合液在80℃烧结12h，得到0.5wt.％DGO/BG固体。0.5wt.％DGO/BG固体在氮气保护环境下通过系列升温碳化方式进一步碳化，最终形成0.5wt.％DGO/BG复合物，具体程序为：300℃保持1h，750℃保持2h，1000℃保持3h，随后自然降温至室温。
(5)DGO/BG基底材料制备
以盖玻片作为基底，通过旋涂的方法形成有利于后期细胞生长的基底材料。将直径为14㎜的盖玻片置于体积比1：3的过氧化氢/浓硫酸的混合溶液中，在120℃保持10分钟，然后用无水乙醇和去离子水清洗，氮气保护吹干，得到表面清洁的盖玻片。随后，将清洁的盖玻片浸入3％的硅烷(3-APTES)溶液中30分钟，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，冲洗，氮气保护下干燥。将0.5wt.％DGO/BG溶于无水乙醇中配制成0.5％(w/v)的悬液，通过旋涂仪上，使30μl悬液在功能化盖玻片上均匀覆盖，室温下晾干，以备后期实验使用。
通过以上步骤所得的复合材料含有多巴胺改性的氧化石墨烯和生物活性玻璃，其为薄膜状材料，改性石墨烯在复合材料中的质量分数为0.5wt.％。
实施例2
步骤(1)、(2)、(3)与实施例1相同。
(4)溶胶-凝胶法制备氧化石墨烯/生物活性玻璃复合材料(DGO/BG)
采用溶胶-凝胶法制备1wt.％DGO的DGO/BG复合材料，制备过程为：实验采用正硅酸乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸钙(CN)等，通过溶胶-凝胶法来制备58S的生物活性玻璃(BG)。首先，将0.36mlTEP溶解于蒸馏水、无水乙醇与氨水的混合液体中，80℃充分搅拌24h，获得水解的TEP溶液。然后将0.65ml TEOS与0.35g CN加入TEP水解溶液中，室温搅拌120h，形成溶胶-凝胶溶液。事先将(3)中制备好的DGO称取0.0136g溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，超声2h，形成均匀的DGO悬液。将溶胶-凝胶溶液按比缓慢加入DGO悬液中，室温搅拌2h，随后将DGO/BG混合液在80℃烧结12h，得到1wt.％DGO/BG固体。1wt.％DGO/BG固体在氮气保护环境下通过系列升温碳化方式进一步碳化，最终形成1wt.％DGO/BG复合物，具体程序为：300℃保持1h，750℃保持2h，1000℃保持3h，随后自然降温至室温。
(5)DGO/BG基底材料制备
以盖玻片作为基底，通过旋涂的方法形成有利于后期细胞生长的基底材料。将直径为14㎜的盖玻片置于体积比1：3的过氧化氢/浓硫酸的混合溶液中，在120℃保持10分钟，然后用无水乙醇和去离子水清洗，氮气保护吹干，得到表面清洁的盖玻片。随后，将清洁的盖玻片浸入3％的硅烷(3-APTES)溶液中30分钟，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，冲洗，氮气保护下干燥。将1wt.％DGO/BG溶于无水乙醇中配制成0.5％(w/v)的悬液，通过旋涂仪上，使30μl悬液在功能化盖玻片上均匀覆盖，室温下晾干，以备后期实验使用。
通过以上步骤所得的复合材料含有多巴胺改性的氧化石墨烯和生物活性玻璃，其为薄膜状材料，改性石墨烯在复合材料中的质量分数为1wt.％。
实施例3
步骤(1)、(2)、(3)与实施例1相同。
(4)溶胶-凝胶法制备氧化石墨烯/生物活性玻璃复合材料(DGO/BG)
采用溶胶-凝胶法制备3wt.％DGO的DGO/BG复合材料，制备过程为：实验采用正硅酸乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸钙(CN)等，通过溶胶-凝胶法来制备58S的生物活性玻璃(BG)。首先，将0.36mlTEP溶解于蒸馏水、无水乙醇与氨水的混合液体中，80℃充分搅拌24h，获得水解的TEP溶液。然后将0.65ml TEOS与0.35g CN加入TEP水解溶液中，室温搅拌120h，形成溶胶-凝胶溶液。事先将(3)中制备好的DGO称取0.0415g溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，超声2h，形成均匀的DGO悬液。将溶胶-凝胶溶液按比缓慢加入DGO悬液中，室温搅拌2h，随后将DGO/BG混合液在80℃烧结12h，得到3wt.％DGO/BG固体。3wt.％DGO/BG固体在氮气保护环境下通过系列升温碳化方式进一步碳化，最终形成3wt.％DGO/BG复合物，具体程序为：300℃保持1h，750℃保持2h，1000℃保持3h，随后自然降温至室温。
(5)DGO/BG基底材料制备
以盖玻片作为基底，通过旋涂的方法形成有利于后期细胞生长的基底材料。将直径为14㎜的盖玻片置于体积比1：3的过氧化氢/浓硫酸的混合溶液中，在120℃保持10分钟，然后用无水乙醇和去离子水清洗，氮气保护吹干，得到表面清洁的盖玻片。随后，将清洁的盖玻片浸入3％的硅烷(3-APTES)溶液中30分钟，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，冲洗，氮气保护下干燥。将3wt.％DGO/BG溶于无水乙醇中配制成0.5％(w/v)的悬液，通过旋涂仪上，使30μl悬液在功能化盖玻片上均匀覆盖，室温下晾干，以备后期实验使用。
通过以上步骤所得的复合材料含有多巴胺改性的氧化石墨烯和生物活性玻璃，其为薄膜状材料，改性石墨烯在复合材料中的质量分数为3wt.％。
实施例4
步骤(1)、(2)、(3)与实施例1相同。
(4)溶胶-凝胶法制备氧化石墨烯/生物活性玻璃复合材料(DGO/BG)
采用溶胶-凝胶法制备5wt.％DGO的DGO/BG复合材料，制备过程为：实验采用正硅酸乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸钙(CN)等，通过溶胶-凝胶法来制备58S的生物活性玻璃(BG)。首先，将0.36mlTEP溶解于蒸馏水、无水乙醇与氨水的混合液体中，80℃充分搅拌24h，获得水解的TEP溶液。然后将0.65ml TEOS与0.35g CN加入TEP水解溶液中，室温搅拌120h，形成溶胶-凝胶溶液。事先将(3)中制备好的DGO称取0.0706g溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，超声2h，形成均匀的DGO悬液。将溶胶-凝胶溶液按比缓慢加入DGO悬液中，室温搅拌2h，随后将DGO/BG混合液在80℃烧结12h，得到5wt.％DGO/BG固体。5wt.％DGO/BG固体在氮气保护环境下通过系列升温碳化方式进一步碳化，最终形成5wt.％DGO/BG复合物，具体程序为：300℃保持1h，750℃保持2h，1000℃保持3h，随后自然降温至室温。
(5)DGO/BG基底材料制备
以盖玻片作为基底，通过旋涂的方法形成有利于后期细胞生长的基底材料。将直径为14㎜的盖玻片置于体积比1：3的过氧化氢/浓硫酸的混合溶液中，在120℃保持10分钟，然后用无水乙醇和去离子水清洗，氮气保护吹干，得到表面清洁的盖玻片。随后，将清洁的盖玻片浸入3％的硅烷(3-APTES)溶液中30分钟，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，冲洗，氮气保护下干燥。将5wt.％DGO/BG溶于无水乙醇中配制成0.5％(w/v)的悬液，通过旋涂仪上，使30μl悬液在功能化盖玻片上均匀覆盖，室温下晾干，以备后期实验使用。
通过以上步骤所得的复合材料含有多巴胺改性的氧化石墨烯和生物活性玻璃，其为薄膜状材料，改性石墨烯在复合材料中的质量分数为5wt.％。
实施例5
步骤(1)、(2)、(3)与实施例1相同。
(4)溶胶-凝胶法制备氧化石墨烯/生物活性玻璃复合材料(DGO/BG)
采用溶胶-凝胶法制备10wt.％DGO的DGO/BG复合材料，制备过程为：实验采用正硅酸乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸钙(CN)等，通过溶胶-凝胶法来制备58S的生物活性玻璃(BG)。首先，将0.36mlTEP溶解于蒸馏水、无水乙醇与氨水的混合液体中，80℃充分搅拌24h，获得水解的TEP溶液。然后将0.65ml TEOS与0.35g CN加入TEP水解溶液中，室温搅拌120h，形成溶胶-凝胶溶液。事先将(3)中制备好的DGO称取0.1491g溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，超声2h，形成均匀的DGO悬液。将溶胶-凝胶溶液按比缓慢加入DGO悬液中，室温搅拌2h，随后将DGO/BG混合液在80℃烧结12h，得到10wt.％DGO/BG固体。10wt.％DGO/BG固体在氮气保护环境下通过系列升温碳化方式进一步碳化，最终形成10wt.％DGO/BG复合物，具体程序为：300℃保持1h，750℃保持2h，1000℃保持3h，随后自然降温至室温。
(5)DGO/BG基底材料制备
以盖玻片作为基底，通过旋涂的方法形成有利于后期细胞生长的基底材料。将直径为14㎜的盖玻片置于体积比1：3的过氧化氢/浓硫酸的混合溶液中，在120℃保持10分钟，然后用无水乙醇和去离子水清洗，氮气保护吹干，得到表面清洁的盖玻片。随后，将清洁的盖玻片浸入3％的硅烷(3-APTES)溶液中30分钟，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，冲洗，氮气保护下干燥。将10wt.％DGO/BG溶于无水乙醇中配制成0.5％(w/v)的悬液，通过旋涂仪上，使30μl悬液在功能化盖玻片上均匀覆盖，室温下晾干，以备后期实验使用。
通过以上步骤所得的复合材料含有多巴胺改性的氧化石墨烯和生物活性玻璃，其为薄膜状材料，改性石墨烯在复合材料中的质量分数为10wt.％。

Claims (9)

1.一种诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料，其特征是所述骨修复复合材料由石墨烯薄膜和生物活性玻璃构成，所述生物活性玻璃均匀负载于所述石墨烯薄膜表面；所述生物活性玻璃为均匀球形形貌。
2.根据权利要求1所述的诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料，其特征在于所述石墨烯薄膜为氧化石墨烯经多巴胺改性而成。
3.根据权利要求1所述的诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料，其特征在于所述生物活性玻璃的材质为正硅酸四乙酯、磷酸三乙酯和四水硝酸钙。
4.根据权利要求1所述的诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料，其特征在于所述复合材料为薄膜材料，所述石墨烯薄膜层间距为0.39nm，所述生物活性玻璃的直径为50nm～100nm。
5.根据权利要求1所述的诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料，其特征在于所述复合材料中，所述石墨烯质量百分数为0.5％～10％，其余为所述生物活性玻璃。
6.如权利要求1～5之一项所述的诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料的制备方法，其特征是所述氧化石墨烯合成通过优化的Hummers法合成；所述复合材料的制备采用溶胶-凝胶法结合热处理的方法完成。
7.根据权利要求6所述的诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料的制备方法，其特征在于所述多巴胺改性的氧化石墨烯的制备包括如下步骤：采用优化的Hummers获得氧化石墨、超声得到分散均匀的单层或少层氧化石墨烯、盐酸多巴胺溶液的配制、搅拌过夜、离心、烘干。
8.根据权利要求6所述的诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料的制备方法，其特征在于所述溶胶-凝胶法结合热处理的方法合成复合材料的制备包括如下步骤：正硅酸乙酯-磷酸三乙酯-四水硝酸钙溶胶-凝胶溶液的配制、多巴胺改性的氧化石墨烯悬液的配制、多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃混合液配制、烧结、碳化。
9.根据权利要求6所述的诱导间充质干细胞分化的骨修复复合材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)氧化石墨烯的制备
采用优化的Hummers法成功获得氧化石墨，并通过超声得到分散均匀的单层或少层氧化石墨烯：天然鳞片石墨与硝酸钠按2:1的比例混合后加入230ml浓硫酸，之后冰浴条件下加入高锰酸钾，搅拌，保持反应温度低于20℃；移走冰浴，在35℃水浴中保温30分钟后缓慢加入460ml去离子水，待反应温度下降到70℃，同样温度水浴10分钟；随后加入700ml双氧水，使反应终止；抽滤，将得到的黄褐色过滤物反复清洗、离心，至上清ph为7左右，烘干，得到氧化石墨；
超声分离：以1mg：1ml的比例将氧化石墨与去离子水混合，将超声波细胞粉碎机功率调至800W，超声2h，得到分散均匀的氧化石墨烯；
(2)氧化石墨烯的还原
还原：基于步骤(1)中制备的氧化石墨烯，将氧化石墨烯、水合肼、氨水、去离子水以100mg：10ml：0.1ml：100ml的比例混合后在95℃水浴中保持2h，反应结束后抽滤，清洗，最后烘干得到还原的氧化石墨烯；
(3)氧化石墨烯的改性
按照步骤(1)中超声的方法将氧化石墨烯与去离子水按照165mg：100ml进行超声，之后加入盐酸多巴胺，配成浓度为0.25mmol/L的溶液，搅拌过夜，离心，烘干，得到多巴胺改性的氧化石墨烯；
(4)溶胶-凝胶法制备氧化石墨烯/生物活性玻璃复合材料
采用溶胶-凝胶法制备0.5wt.％～10wt.％多巴胺改性的氧化石墨烯的/生物活性玻璃复合材料，制备过程为：实验采用正硅酸乙酯、磷酸三乙酯、四水硝酸钙，通过溶胶-凝胶法来制备生物活性玻璃；首先，将磷酸三乙酯溶解于蒸馏水、无水乙醇与氨水的混合液体中，80℃充分搅拌24h，获得水解的磷酸三乙酯溶液；然后将正硅酸乙酯与四水硝酸钙加入磷酸三乙酯水解溶液中，室温搅拌120h，形成溶胶-凝胶溶液；事先将步骤(3)中制备好的多巴胺改性的氧化石墨烯溶解于二甲基甲酰胺，超声2h，形成均匀的多巴胺改性的氧化石墨烯悬液；将溶胶-凝胶溶液按比缓慢加入多巴胺改性的氧化石墨烯悬液中，控制多巴胺改性的氧化石墨烯的质量分数为0.5wt.％～10wt.％，室温搅拌2h，随后将多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃混合液在80℃烧结12h，得到多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃固体；多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃固体在氮气保护环境下通过系列升温碳化方式进一步碳化，最终形成多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃复合物，具体程序为：300℃保持1h,750℃保持2h，1000℃保持3h，随后自然降温至室温；
(5)多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃基底材料制备
以盖玻片作为基底，通过旋涂的方法形成有利于后期细胞生长的基底材料；将直径为14㎜的盖玻片置于体积比1：3的过氧化氢/浓硫酸的混合溶液中，在120℃保持10分钟，然后用无水乙醇和去离子水清洗，氮气保护吹干，得到表面清洁的盖玻片；随后，将清洁的盖玻片浸入3％的硅烷溶液中30分钟，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，冲洗，氮气保护下干燥；将多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃溶于无水乙醇中配制成质量体积百分比为0.5％的悬液，通过旋涂仪上，使30μl悬液在功能化盖玻片上均匀覆盖，室温下晾干，以备后期实验使用。
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