CN110684727A - 一种氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底及其制备方法与应用 - Google Patents

一种氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底及其制备方法与应用。本发明将铝箔包裹的导电衬底置于六水合硝酸锌‑六次甲基四胺的水溶液中通过水浴法生长得到氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底，制备方法简单，成本低廉，无需在衬底上预先制备氧化锌籽晶层，通过水浴法在多衬底上制备的氧化锌纳米棒，直径为50～500nm，长度为0.5～5μm，这种大尺寸氧化锌纳米棒不易被细胞摄取溶解，可以长时间持续生效，并且提供了更好的细胞粘附性；本发明制备的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底对于体外长期培养1～30天或传代的条件下维持干/祖细胞干性效果良好。

Description

一种氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底及其制备方法与应用，尤其涉及一种维持细胞干性的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底及其制备方法与应用，属于生物材料技术领域。
背景技术
在现代医学中，干/祖细胞研究是最有潜力的领域之一，并且极大地推动了生命科学和生物医学的进步。不断增长的组织再生以及其他干/祖细胞治疗方面的需求，需要由大量具有自我更新能力的干/祖细胞来实现。然而，在长时间体外培养和多次传代的条件下，干/祖细胞的干性会逐渐降低，即增殖速率逐渐降低，并逐渐失去多向或单向定向分化的能力。作为组织工程重要的种子细胞，如何维持干/祖细胞在体外培养条件下的干性，是组织工程面临的重要问题之一。
目前，维持细胞干性的传统手段是通过加入生长因子来实现的，比如成纤维生长因子(bFGF)、上皮细胞生长因子(EGF)和白血病抑制因子(LIF)等。虽然这些生长因子维持细胞干性的效果显著，但是由于其价格昂贵、储存过程中容易降解失效等不足，临床应用受到了限制。
近些年来随着纳米科学的发展，作为一种新兴手段，纳米材料由于成本低廉，渐渐被用于生物医学领域，其中包括维持干/祖细胞的干性。在各种纳米材料中，氧化锌具有独特的光电、压电等物理性质以及可控的纳米形貌，因而引起了广泛关注。作为用途广泛的材料，氧化锌纳米材料对干/祖细胞的增殖，以及行为和命运具有重要的调控作用。
目前，中国专利文献CN109675100A和CN109647298A分别公开了聚乳酸-氧化锌微米纳米多级结构复合微球、聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料在干细胞扩增和维持干细胞干性方面的应用，但是制备过程中需要使用二氯甲烷、聚乙烯醇等刺激性有机物，材料制备步骤包括预先制备籽晶，周期较长，疏水微球不利于细胞的粘附。其中，氧化锌纳米棒的长度为10-50nm，由于干/祖细胞对周围纳米颗粒的摄取作用很强，在这个尺寸范围内，氧化锌纳米棒易被细胞吞噬溶解从而快速失效，不易实现长期的细胞扩增和干性维持。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底及其制备方法与应用，本发明的制备方法简单，成本低廉，无需在衬底上预先制备氧化锌籽晶层；在体外长期培养条件下，该细胞培养衬底具有良好的维持干/祖细胞干性的效果。
本发明的技术方案如下：
一种氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底，是将铝箔包裹的导电衬底置于六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液中通过水浴法生长得到的，所述氧化锌纳米棒的直径为50～500nm，长度为0.5～5μm。
本发明中，所述的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底，无需预先制备籽晶层，利用原电池原理在导电衬底上通过水浴法生长氧化锌纳米棒阵列，所述氧化锌纳米棒的直径为50～500nm，长度为0.5～5μm，这种大尺寸氧化锌纳米棒不易被细胞摄取，可以长时间持续生效，并且提供了更好的细胞粘附性，通过将干/祖细胞接种在这种纳米棒阵列细胞培养衬底上，维持细胞干性。
上述氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底的制备方法，步骤如下：
(1)用铝箔将导电衬底包裹起来，露出导电面，所述导电面用于生长氧化锌纳米棒阵列；
(2)在20～40℃下，配制六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液，所述六水合硝酸锌和六次甲基四胺在水溶液中的浓度均为10～100mM，六水合硝酸锌与六次甲基四胺的摩尔比为1:1；
(3)将步骤(1)中包裹好铝箔的导电衬底放置在步骤(2)配置的六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液中，在60～95℃下水浴反应0.5～12h，即得氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底。
根据本发明，步骤(1)中所述铝箔的尺寸大于导电衬底的尺寸，优选的，所述铝箔的尺寸为1cm×1cm～5cm×5cm。
根据本发明，步骤(1)中所述导电衬底的活性弱于金属铝；优选的，所述导电衬底为氧化铟锡导电玻璃、氧化铟锡导电薄膜、掺氟的二氧化锡导电玻璃、锌片或多孔泡沫钛，均为普通市售产品或通过现有技术制备得到。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述六水合硝酸锌和六次甲基四胺在水溶液中的浓度均为25～80mM。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述水浴反应的温度为70～90℃，水浴反应时间为4～10h。
上述氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底在维持干/祖细胞干性中的应用，所述应用的操作步骤如下：
1)将氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底放置于细胞培养孔板中，加入75％酒精浸泡3～12h，同时在无菌操作台中用紫外灯照射30～120min进行灭菌消毒，用PBS缓冲液将残余酒精清洗干净，将氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底用细胞培养基浸泡过夜，再用PBS缓冲液清洗2～3遍备用；
2)将干/祖细胞接种在步骤1)处理后的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上，接种的干/祖细胞悬液的体积为0.02～1mL，包含的细胞个数为3×103～1×106个，静置10～90min后，补充细胞培养基，所需补充的细胞培养基体积为0～2mL，将细胞置于体外培养1～30天，且每2-3天更换一次细胞培养基。
根据本发明优选的，步骤2)中所述体外培养的条件为37℃含5％CO2的饱和湿度环境下培养。
根据本发明优选的，所述细胞培养基为α-MEM培养基，高糖或低糖DMEM培养基，或1640培养基，并在上述细胞培养基中添加10％新生牛血清或胎牛血清和1％双抗。
根据本发明优选的，所述干/祖细胞为人脂肪来源间充质干细胞、大鼠骨髓间充质干细胞或小鼠胚胎成骨细胞前体细胞。
本发明中，对所述培养在氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上的干/祖细胞进行基因检测，发现干性基因表达水平与细胞爬片相比有明显提高；将培养在氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上的干/祖细胞消化下来，发现其仍具有较强的增殖能力和定向分化能力。
有益效果：
1、本发明首次发现并公开了多衬底制备的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底维持干/祖细胞干性的方法，相比于传统的氧化锌纳米棒制备方法，本发明提供一种更简便的无籽晶层法，通过水浴法在多衬底上制备氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底，需要的温度低、周期短，无需预先制备氧化锌籽晶层，制备的氧化锌纳米棒直径为50～500nm，长度为0.5～5μm，这种大尺寸氧化锌纳米棒不易被细胞摄取，可以持续生效，并且提供了更好的细胞粘附性。
2、本发明公开的维持干/祖细胞干性的方法，相比于传统的生物化学方法，无需昂贵的生长因子和抗体以及大规模培养专用仪器，利用本发明制备的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底，能够通过简单的细胞接种的方法有效维持干/祖细胞干性；实验证实，本发明中多衬底制备的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底对于体外长期培养或传代的条件下维持干/祖细胞干性效果良好。
3、氧化锌是生物相容性良好的材料，价格低廉，易于生产，同时由于该维持干/祖细胞干性的方法简便高效，因而本发明中的方法可以大批量维持干/祖细胞干性，并对干/祖细胞进行体外大批量扩增，这将为大量干/祖细胞的生产和满足细胞治疗市场不断增长的需求开辟新的途径。
附图说明
图1为氧化铟锡导电玻璃上生长的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底的扫描电子显微镜(SEM)照片；
图2为人脂肪来源间充质干细胞在细胞爬片和氧化铟锡导电玻璃上生长的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上干性基因OCT-4的表达水平柱状图；
图3为大鼠骨髓来源间充质干细胞在细胞爬片和氧化铟锡导电薄膜上生长的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上干性基因Sox2的表达水平柱状图；
图4为多孔泡沫钛上生长的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底的扫描电子显微镜(SEM)照片；
图5为人脂肪来源间充质干细胞在氧化锌薄膜和氧化铟锡导电玻璃上生长的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上干性基因OCT-4的表达水平柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
同时下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂、材料和设备，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下列实施例中所使用的细胞培养基均为α-MEM培养基添加10％新生牛血清或胎牛血清和1％双抗。
实施例1：
一种氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底的制备方法，步骤如下：
(1)剪下一块2cm×2cm的铝箔，将尺寸为1.5cm×1.5cm的氧化铟锡导电玻璃包裹起来，露出用于生长氧化锌纳米棒阵列的导电氧化铟锡面；
(2)在25℃下，配制六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液，六水合硝酸锌与六次甲基四胺的摩尔比为1:1，六水合硝酸锌与六次甲基四胺在水溶液中的浓度均为25mM；
(3)将步骤(1)中包裹好铝箔的氧化铟锡导电玻璃放置在步骤(2)配置的六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液中，在90℃下水浴反应4h，得到氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底。
将上述制备得到的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底采用扫描电子显微镜观察其形貌特征，其扫描电子显微镜照片如图1所示，形貌为六方纳米棒，直径为50～200nm。
将上述制备得到的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底应用于干/祖细胞的培养，步骤如下：
1)将上述制备得到的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底放置于细胞培养孔板中，加入75％酒精浸泡6h，同时在无菌操作台中用紫外灯照射60min进行灭菌消毒，用PBS缓冲液将残余酒精清洗干净；将氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底用细胞培养基浸泡过夜，再用PBS缓冲液清洗2-3遍备用；
2)将人脂肪来源间充质干细胞接种在步骤1)处理后的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上，接种的细胞悬液的体积为0.2mL，包含的细胞个数为1×104个，静置20min后，补充细胞培养基，所需补充的细胞培养基体积为0.8mL，将细胞置于37℃含5％CO2的饱和湿度环境下体外培养14天，且每2天更换一次细胞培养基。
将上述培养在氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上14天的人脂肪来源间充质干细胞进行基因检测，检测细胞中干性基因OCT-4的表达水平，结果如图2所示，发现培养在氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上14天的人脂肪来源间充质干细胞的干性基因OCT-4表达水平与细胞爬片相比有明显提高，培养在氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上的细胞干性基因OCT-4表达水平是爬片细胞的2.2倍。
实施例2：
一种氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底的制备方法，步骤如下：
(1)剪下一块2cm×2cm的铝箔，将尺寸为1.5cm×1.5cm的氧化铟锡导电玻璃包裹起来，露出用于生长氧化锌纳米棒阵列的导电氧化铟锡面；
(2)在25℃下，配制六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液，六水合硝酸锌与六次甲基四胺的摩尔比为1:1，六水合硝酸锌与六次甲基四胺在水溶液中的浓度均为30mM；
(3)将步骤(1)中包裹好铝箔的氧化铟锡导电玻璃放置在步骤(2)配置的六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液中，在90℃下水浴反应4h，得到氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底。
将上述制备得到的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底应用于干/祖细胞的培养，步骤如下：
1)将上述制备得到的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底放置于细胞培养孔板中，加入75％酒精浸泡6h，同时在无菌操作台中用紫外灯照射60min进行灭菌消毒，用PBS缓冲液将残余酒精清洗干净；将氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底用细胞培养基浸泡过夜，再用PBS缓冲液清洗2-3遍备用；
2)将小鼠胚胎成骨细胞前体细胞接种在步骤1)处理后的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上，接种的细胞悬液的体积为0.2mL，包含的细胞个数为1×104个，静置20min后，补充细胞培养基，所需补充的细胞培养基体积为0.8mL，将细胞置于37℃含5％CO2的饱和湿度环境下体外培养21天，且每2天更换一次细胞培养基。
将上述培养在氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞进行基因检测，检测细胞中成骨基因的表达水平，发现培养在氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞中成骨基因表达水平与细胞爬片相比有明显抑制，细胞形态有明显区别。
实施例3：
一种氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底的制备方法，步骤如下：
(1)剪下一块2cm×2cm的铝箔，将尺寸为1.5cm×1.5cm的氧化铟锡导电薄膜包裹起来，露出用于生长氧化锌纳米棒阵列的导电氧化铟锡面；
(2)在25℃下，配制六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液，六水合硝酸锌与六次甲基四胺的摩尔比为1:1，六水合硝酸锌与六次甲基四胺在水溶液中的浓度均为25mM；
(3)将步骤(1)中包裹好铝箔的氧化铟锡导电薄膜放置在步骤(2)配置的六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液中，在85℃下水浴反应4h，得到氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底。由于导电薄膜是柔性衬底，反应温度略有降低。
将上述制备得到的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底应用于干/祖细胞的培养，步骤如下：
1)将上述制备得到的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底放置于细胞培养孔板中，加入75％酒精浸泡6h，同时在无菌操作台中用紫外灯照射60min进行灭菌消毒，用PBS缓冲液将残余酒精清洗干净；将氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底用细胞培养基浸泡过夜，再用PBS缓冲液清洗2-3遍备用；
2)将大鼠骨髓来源间充质干细胞接种在步骤1)处理后的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上，接种的细胞悬液的体积为0.4mL，包含的细胞个数为2×104个，静置30min后，补充细胞培养基，所需补充的细胞培养基体积为0.6mL，将细胞置于37℃含5％CO2的饱和湿度环境下体外培养21天，且每2天更换一次细胞培养基。
将上述培养在氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上21天的大鼠骨髓来源间充质干细胞进行基因检测，检测细胞中干性基因Sox2的表达水平，结果如图3所示，发现培养在氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上21天的大鼠骨髓来源间充质干细胞的干性基因Sox2表达水平与细胞爬片相比有明显提高，培养在氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上的细胞干性基因Sox2的表达水平是爬片细胞的4.7倍。
实施例4：
一种氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底的制备方法，步骤如下：
(1)剪下一块2cm×2cm的铝箔，将尺寸为1.5cm×1.5cm的氧化铟锡导电薄膜包裹起来，露出用于生长氧化锌纳米棒阵列的导电氧化铟锡面；
(2)在25℃下，配制六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液，六水合硝酸锌与六次甲基四胺的摩尔比为1:1，六水合硝酸锌与六次甲基四胺在水溶液中的浓度均为35mM；
(3)将步骤(1)中包裹好铝箔的氧化铟锡导电薄膜放置在步骤(2)配置的六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液中，在85℃温度下水浴反应4h，得到氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底。由于导电薄膜是柔性衬底，反应温度略有降低。
将上述制备得到的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底应用于干/祖细胞的培养，步骤如下：
1)将上述制备得到的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底放置于细胞培养孔板中，加入75％酒精浸泡6h，同时在无菌操作台中用紫外灯照射60min进行灭菌消毒，用PBS缓冲液将残余酒精清洗干净；将氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底用细胞培养基浸泡过夜，再用PBS缓冲液清洗2-3遍备用；
2)将小鼠胚胎成骨细胞前体细胞接种在步骤1)处理后的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上，接种的细胞悬液的体积为0.4mL，包含的细胞个数为2×104个，静置30min后，补充细胞培养基，所需补充的细胞培养基体积为0.6mL，将细胞置于37℃含5％CO2的饱和湿度环境下体外培养21天，且每2天更换一次细胞培养基。
将上述培养在氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞进行基因检测，检测细胞中成骨基因的表达水平，发现培养在氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞中成骨基因表达水平与细胞爬片相比有明显抑制，细胞形态有明显区别。
实施例5：
一种氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底的制备方法，步骤如下：
(1)剪下一块1.5cm×1.5cm的铝箔，将尺寸为1cm×1cm的多孔泡沫钛包裹起来，露出用于生长氧化锌纳米棒阵列的部分；
(2)在25℃下，配制六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液，六水合硝酸锌与六次甲基四胺的摩尔比为1:1，六水合硝酸锌与六次甲基四胺在水溶液中的浓度均为50mM；
(3)将步骤(1)中包裹好铝箔的多孔泡沫钛放置在步骤(2)配置的六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液中，在90℃下水浴反应6h，得到氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底。
将上述制备得到的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底采用扫描电子显微镜观察其形貌特征，其扫描电子显微镜照片如图4所示，形貌为六方纳米棒，直径为150～500nm，长度为0.5～5μm，多个纳米棒组合成纳米花形貌。由于衬底是三维结构，反应时间略有延长，三维结构提供了更大的比表面积和细胞与氧化锌纳米棒的接触面积，有利于细胞的粘附和增殖。
将上述制备得到的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底应用于干/祖细胞的培养，步骤如下：
1)将上述制备得到的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底放置于细胞培养孔板中，加入75％酒精浸泡6h，同时在无菌操作台中用紫外灯照射60min进行灭菌消毒，用PBS缓冲液将残余酒精清洗干净；将氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底用细胞培养基浸泡过夜，再用PBS缓冲液清洗2-3遍备用；
2)将人脂肪来源间充质干细胞接种在步骤1)处理后的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上，接种的细胞悬液的体积为0.2mL，包含的细胞个数为1×104个，静置20min后，补充细胞培养基，所需补充的细胞培养基体积为0.8mL，将细胞置于37℃含5％CO2的饱和湿度环境下体外培养28天，且每2天更换一次细胞培养基。
将上述培养在氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上28天的人脂肪来源间充质干细胞进行基因检测，检测细胞中干性基因OCT-4的表达水平，发现培养在氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上28天的人脂肪来源间充质干细胞中干性基因OCT-4表达水平与细胞爬片和纯泡沫钛相比有明显提高。
实施例6：
一种氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底的制备方法，步骤如下：
(1)剪下一块1.5cm×1.5cm的铝箔，将尺寸为1cm×1cm的多孔泡沫钛包裹起来，露出用于生长氧化锌纳米棒阵列的部分；
(2)在25℃下，配制六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液，六水合硝酸锌与六次甲基四胺的摩尔比为1:1，六水合硝酸锌与六次甲基四胺在水溶液中的浓度均为70mM；
(3)将步骤(1)中包裹好铝箔的多孔泡沫钛放置在步骤(2)配置的六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液中，在90℃下水浴反应6h，得到氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底。
将上述制备得到的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底应用于干/祖细胞的培养，步骤如下：
1)将上述制备得到的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底放置于细胞培养孔板中，加入75％酒精浸泡6h，同时在无菌操作台中用紫外灯照射60min进行灭菌消毒，用PBS缓冲液将残余酒精清洗干净；将氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底用细胞培养基浸泡过夜，再用PBS缓冲液清洗2-3遍备用；
2)将大鼠骨髓来源间充质干细胞接种在步骤1)处理后的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上，接种的细胞悬液的体积为0.5mL，包含的细胞个数为2×104个，静置15min后，补充细胞培养基，所需补充的细胞培养基体积为0.5mL，将细胞置于37℃含5％CO2的饱和湿度环境下体外培养30天，且每2天更换一次细胞培养基。
将上述培养在氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上30天的大鼠骨髓来源间充质干细胞进行基因检测，检测细胞中干性基因的表达水平，发现培养在氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上30天的大鼠骨髓来源间充质干细胞中干性基因表达水平与细胞爬片和纯泡沫钛相比有明显提高。
对比例1：
一种脉冲激光沉积制备氧化锌薄膜的方法，包括如下步骤：
背景气压2.4×10-5Pa，激光能量300mJ，使用高纯氧化锌靶材，在掺氟的二氧化硅导电玻璃生长14400脉冲后，薄膜呈浅灰色，为去除氧空位，在空气中450℃退火1h后，制备得到的氧化锌薄膜变透明。
将上述制备得到的氧化锌薄膜应用于干/祖细胞的培养，步骤如下：
1)将上述制备得到的氧化锌薄膜放置于细胞培养孔板中，加入75％酒精浸泡6h，同时在无菌操作台中用紫外灯照射60min进行灭菌消毒，用PBS缓冲液将残余酒精清洗干净；将氧化锌薄膜用细胞培养基浸泡过夜，再用PBS缓冲液清洗2-3遍备用；
2)将人脂肪来源间充质干细胞接种在步骤1)处理后的氧化锌薄膜上，接种的细胞悬液的体积为0.2mL，包含的细胞个数为1×104个，静置20min后，补充细胞培养基，所需补充的细胞培养基体积为0.8mL，将细胞置于37℃含5％CO2的饱和湿度环境下体外培养21天，且每2天更换一次细胞培养基。
将上述培养在氧化锌薄膜上21天的人脂肪来源间充质干细胞进行基因检测，检测细胞中干性基因OCT-4的表达水平，结果如图5所示，与实施例2中培养在氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上21天的人脂肪来源间充质干细胞的干性基因OCT-4表达水平相比，对比例1中培养在氧化锌薄膜上21天的人脂肪来源间充质干细胞的干性基因OCT-4表达水平明显降低，培养在氧化锌纳米棒陈列细胞培养衬底上的细胞干性基因OCT-4表达水平是培养在氧化锌薄膜上细胞的1.2倍。
综上，本发明制备的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底与其他氧化锌薄膜材料相比，具有更好的维持干/祖细胞干性的效果，可以有效抑制干/祖细胞的分化。

Claims (10)

1.一种氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底，其特征在于，所述氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底是将铝箔包裹的导电衬底置于六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液中通过水浴法生长得到的，所述氧化锌纳米棒的直径为50～500nm，长度为0.5～5μm。
2.权利要求1所述的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)用铝箔将导电衬底包裹起来，露出导电面，所述导电面用于生长氧化锌纳米棒阵列；
(2)在20～40℃下，配制六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液，所述六水合硝酸锌和六次甲基四胺在水溶液中的浓度均为10～100mM，六水合硝酸锌与六次甲基四胺的摩尔比为1:1；
(3)将步骤(1)中包裹好铝箔的导电衬底放置在步骤(2)配置的六水合硝酸锌-六次甲基四胺的水溶液中，在60～95℃下水浴反应0.5～12h，即得氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底。
3.如权利要求2所述的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述铝箔的尺寸大于导电衬底的尺寸，所述铝箔的尺寸为1cm×1cm～5cm×5cm。
4.如权利要求2所述的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述导电衬底为氧化铟锡导电玻璃、氧化铟锡导电薄膜、掺氟的二氧化锡导电玻璃、锌片或多孔泡沫钛。
5.如权利要求2所述的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述六水合硝酸锌和六次甲基四胺在水溶液中的浓度均为25～80mM。
6.如权利要求2所述的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述水浴反应的温度为70～90℃，水浴反应时间为4～10h。
7.权利要求1所述的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底在维持干/祖细胞干性中的应用，所述应用的操作步骤如下：
1)将氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底放置于细胞培养孔板中，加入75％酒精浸泡3～12h，同时在无菌操作台中用紫外灯照射30～120min进行灭菌消毒，用PBS缓冲液将残余酒精清洗干净，将氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底用细胞培养基浸泡过夜，再用PBS缓冲液清洗2～3遍备用；
2)将干/祖细胞接种在步骤1)处理后的氧化锌纳米棒阵列细胞培养衬底上，接种的干/祖细胞悬液的体积为0.02～1mL，包含的细胞个数为3×103～1×106个，静置10～90min后，补充细胞培养基，所需补充的细胞培养基体积为0～2mL，将细胞置于体外培养1～30天，且每2-3天更换一次细胞培养基。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述体外培养的条件为37℃含5％CO2的饱和湿度环境下培养。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述细胞培养基为α-MEM培养基，高糖或低糖DMEM培养基，或1640培养基，并在细胞培养基中添加10％新生牛血清或胎牛血清和1％双抗。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述干/祖细胞为人脂肪来源间充质干细胞、大鼠骨髓间充质干细胞或小鼠胚胎成骨细胞前体细胞。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112029725A (zh) * 2020-09-21 2020-12-04 山东大学 一种利用压电效应促进巨噬细胞向m1型极化的方法及应用
CN113720827A (zh) * 2021-08-31 2021-11-30 安徽大学 纳米银修饰的氧化钛纳米管阵列及其制备方法和用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014178670A1 (ko) * 2013-04-30 2014-11-06 고려대학교산학협력단 나노구배패턴을 포함하는 배양용기를 이용한 줄기세포 배양에 적합한 표면구조의 스크리닝 방법
CN105349421A (zh) * 2015-12-11 2016-02-24 武汉纺织大学 氧化锌纳米棒阵列的微粒释放芯片、制备方法及释放方法
CN109647298A (zh) * 2019-01-31 2019-04-19 济南大学 聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料及应用
CN109675100A (zh) * 2019-01-31 2019-04-26 济南大学 聚乳酸-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014178670A1 (ko) * 2013-04-30 2014-11-06 고려대학교산학협력단 나노구배패턴을 포함하는 배양용기를 이용한 줄기세포 배양에 적합한 표면구조의 스크리닝 방법
CN105349421A (zh) * 2015-12-11 2016-02-24 武汉纺织大学 氧化锌纳米棒阵列的微粒释放芯片、制备方法及释放方法
CN109647298A (zh) * 2019-01-31 2019-04-19 济南大学 聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料及应用
CN109675100A (zh) * 2019-01-31 2019-04-26 济南大学 聚乳酸-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
REBECCA J. MCMURRAY ET AL.: "Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency", 《NATURE MATERIALS》 *
ZHAOKE ZHENG ET AL.: "General Route to ZnO Nanorod Arrays on Conducting Substrates via Galvanic-cell-based approach", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112029725A (zh) * 2020-09-21 2020-12-04 山东大学 一种利用压电效应促进巨噬细胞向m1型极化的方法及应用
CN113720827A (zh) * 2021-08-31 2021-11-30 安徽大学 纳米银修饰的氧化钛纳米管阵列及其制备方法和用途

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