CN107551317B

CN107551317B - 一种有序的促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN107551317B
Application number: CN201710561940.1A
Authority: CN
Inventors: 关燕清; 班晴; 陈吾雅
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2017-07-11
Filing date: 2017-07-11
Publication date: 2020-05-08
Anticipated expiration: 2037-07-11
Also published as: CN107551317A

Abstract

本发明公开了一种有序的促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架及其制备方法和应用。首先配制壳聚糖溶液和明胶溶液，将两者混合，同时加入京尼平，搅拌并超声震荡，制成凝胶；然后将四氧化三铁纳米粒子加入到凝胶中，在磁场诱导下，用胶体晶合成法制备三维多孔的胶体晶支架；最后在此支架上修饰以胶原蛋白和碱性成纤维生长因子，成功合成得到所述胶体晶仿生肺组织工程支架。此支架具有显著的促进肺细胞生长的作用，且两种生长因子共同修饰的支架促生长效果更好。此支架在肺部损伤的修复以及肺组织工程支架材料的开发方面具有很好的应用前景。

Description

一种有序的促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药材料技术领域。更具体地，涉及一种有序的促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架及其制备方法与应用。

背景技术

肺脏是人类重要的生命器官之一，然而肺部的各种疾病严重影响到人类健康。近年来肺癌的发病率显著地增高，在我国的工业大城市中，肺癌发病率在男性恶性肿瘤中已居首位，在女性恶性肿瘤中的发病率也居二、三位，成为危害人类健康的一种主要疾病。目前，肺癌的治疗方法是肺移植，然而这种方法存在着供体缺乏的缺陷，虽然每年的等待供体的时间在缩短，但每年肺移植的量超过3700万例，供体缺乏仍是一大限制因素。此外移植手术也存在着术后感染几率高、容易发生排斥等缺陷。

近年来，肺组织工程取得了很大的研究进展，为肺部疾病的治疗提供了新的技术。然而在种子细胞的选择、支架的构建等方面仍然存在着巨大的挑战。肺种子细胞进行筛选和机能调控具有重要价值，这样利于提升组织工程生物材料的支架功能并在体外更快地进行肝脏组织的培养和重建。种子细胞的来源有很多，例如可以是自体的，可以是同种异体的或异种异体的，也可以来自于一些干细胞，其中不同的细胞源有各自不同的优点和缺点。自体细胞存在着排斥小，但也存在着取材小不易达到应有的细胞数量等局限以及其他的局限；当自体细胞供应缺乏时，异体细胞就可以作为选择作为细胞源，但异体细胞存在着排斥反应大，并且存在着将异体的病原体带入患者的风险。此外，调控肺细胞与生物材料相互作用的其中一个关键问题是生物支架材料。支架材料的选用一直是肺组织工程的一项挑战，支架材料可分为天然材料和合成材料两大类。然而不同的材料来源和不同的合成方法，支架材料的性能差异也较大，因此，目前还没有找到一种具有良好细胞适应性和良好降解性的支架，所以在支架构建这个领域存在着巨大的发展潜能。

随着在支架领域的发展，肺组织工程的支架要求具备良好的生物相容性、生物可塑性、可降解性、可吸附性和多孔性等特性。有许多研究是使用的脱细胞作为肺组织工程的支架，在制备的过程中将肺细胞的细胞组分和细胞核都除去，而其中的细胞外基质被保留下来，形成一个骨架来支持细胞生长.虽然这种支架对细胞的生长有很好的促进作用，然而这种脱细胞支架在制备的过程中较为复杂。经过研究，天然生物材料或人工高分子聚合物是支架材料的主选，其中对支架修饰或改性能使其具有良好的生物学性能和生物相容性，这些修饰可为植于其上的细胞提供合适的环境因素、生长因子，形成诱导新生血管的预血管化位点或多孔结构。通过选择不同材料作为细胞培养基质，以不同结构形式承载细胞，并将各种生物活性分子固定于框架材料上，构建生物杂化系统，构建一个利于肺细胞生长分化的环境，从而达到对肺损伤部位的修复。但是，这些制备支架的方法都比较困难，应用前景很受限制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有肺组织工程支架材料的缺陷和不足，采用一种新型的方法制备支架材料，即利用壳聚糖和明胶等天然材料，以磁性Fe₃O₄纳米粒子为模板，在磁场诱导下，用胶体晶合成法制备了多孔胶体晶支架，同时，在此基础上修饰以胶原蛋白、碱性成纤维生长因子，成功合成得到的支架材料能很好的促进肺细胞的生长，在肺部损伤的修复以及肺组织工程支架材料的开发方面具有很好的应用前景。

本发明的目的是提供一种有序的促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架及其制备方法。

本发明另一目的是提供所述胶体晶仿生肺组织工程支架的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种有序的促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架的制备方法，首先配制壳聚糖溶液和明胶溶液，将两者混合，同时加入京尼平，搅拌并超声震荡，制成凝胶；然后将四氧化三铁纳米粒子加入到凝胶中，在磁场诱导下，用胶体晶合成法制备三维多孔的胶体晶支架；最后在此支架上修饰以胶原蛋白和碱性成纤维生长因子，成功合成得到所述胶体晶仿生肺组织工程支架(Collagen-bFGF-CC支架)。

具体地，所述胶体晶仿生肺组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：

S1.制备胶体支架

配制8～420g/L的壳聚糖溶液和5～100g/L的明胶溶液，将壳聚糖溶液、明胶溶液和质量分数1～3％的京尼平混合5～10min，然后超声震荡5～10min，得凝胶；

S2.制备胶体晶体多孔支架

将四氧化三铁纳米粒子加入装有步骤S1凝胶的容器中，容器下方放一块磁铁，搅拌5～10min，然后超声震荡5～10min，直到四氧化三铁与凝胶充分混合，然后置于室温下自然凝固，再将凝固的样品干燥；干燥的样品用乙酸浸泡，从而溶解去除四氧化三铁纳米粒子，得到胶体晶体多孔支架；

S3.对胶体晶体多孔支架进行修饰

S31.将含有磺基-SMCC的DPBS注射到胶体晶体多孔支架中，放置2～4h，然后用DPBS冲洗后干燥；

S32.再加入含有生长因子和胶原蛋白的DPBS，放置12～24h；最后用DPBS冲洗后干燥，得到所述胶体晶仿生肺组织工程支架。

其中，优选地，步骤S1中壳聚糖溶液、明胶溶液和京尼平的体积比为1：2：0.005～0.01。

优选地，步骤S1中壳聚糖溶液的配制方法为：先将体积比1：3～10的乙酸和PBS混合，然后加入壳聚糖，溶解完全得壳聚糖溶液。

优选地，步骤S1中明胶溶液的配制方法为：将明胶溶于加热至90～100℃的去离子水，搅拌直到完全溶解，得明胶溶液。

优选地，步骤S2所述四氧化三铁纳米粒子和凝胶的质量体积比为10～20mg：6～8mL。

优选地，步骤S2所述干燥是40℃干燥48～72h。

优选地，步骤S31所述含有磺基-SMCC的DPBS中，磺基-SMCC的浓度为10～20μg/ml。

优选地，步骤S32所述含有生长因子和胶原蛋白的DPBS中，生长因子和胶原蛋白等量，浓度均为10～20μg/ml。

优选地，步骤S3中，含有磺基-SMCC的DPBS：胶体晶体多孔支架：含有生长因子和胶原蛋白的DPBS＝20～50μl：6～8ml：40μl。

优选地，步骤S31所述干燥是40～60℃下干燥24～48h。

优选地，步骤S32所述干燥是40～60℃下干燥12～24h。

另外，由上述方法制备得到的能够促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架，以及该支架在制备肺组织工程支架材料方面的应用，都应在本发明的保护范围之内。

支架材料是组织工程关键因素之一。目前对支架的材料选择，制备方法的研究有很多，但本发明倾向于用天然的材料来制备毒性小的支架。本发明选择低成本的天然材料壳聚糖和明胶为原料，壳聚糖为碱性多糖，明胶是胶原的变性产物，二者均具有良好的生物相容性，用胶体晶合成法制备肺组织工程仿生支架，在此基础上用Fe3O4纳米粒子作为制孔剂，选择Fe3O4的意图在于它带有磁性，可以利用这一点加磁场来控制Fe3O4的排布从而制备出空隙不一的多孔支架，这也是本发明研究的创新点之一；此外Fe3O4无毒，对细胞不会产生毒副作用。

本发明对制备的支架做了一系列的表征工作，在此过程中也发现了不少问题。制备好支架后需要想办法将Fe3O4去除从而留下空隙，我们用弱酸来溶解Fe3O4，产物产生的铁盐无毒，对细胞影响不大，但是干燥之后发现制备的空隙很不均匀，其原因可能是用冷冻干燥机进行了干燥，在此干燥过程中，有一定的压力对形成的孔隙造成了一定的影响，导致形成的凸起和孔隙的排布不规则。为了避免这种情况，接下来我们在加入Fe3O4纳米粒子到凝胶中凝固的过程中加入磁场，在磁场的影响下让Fe3O4有序的排布直到凝胶凝固定型，去完粒子之后干燥的过程中我们将采取自然烘干或在40℃低温的烘箱中进行烘干干燥，从而避免外界压力对支架空隙造成影响。

通过在支架表面修饰一些生长因子，包括胶原蛋白(Collagen)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，胶原蛋白是肺部外基质的重要组成成分，对细胞的粘附有重要的作用，细胞外基质将增生成纤维细胞、间质细胞连接在一起，与生长因子形成复杂的网络，在时间和空间上相互作用，调节并促进成纤维细胞的增殖、分化和迁移以及血管的生成、组织连接，从而促进组织修复和伤口的愈合。而bFGF可稳定生长因子在组织中的生物学活性，保证其缓慢均匀的释放，起到局部刺激细胞增生和组织修复的作用。本发明将这两种生长因子同时接枝到支架上，让两者共同促进肺细胞的生长，从而达到相互促进的效果。通过细胞实验初步检测发现，本发明制备的支架以及在支架上修饰的生长因子具有促进TC-1细胞生长的作用。

本发明具有以下有益效果：

本发明用壳聚糖、明胶等天然材料作为原材料，利用胶体晶合成法成功制备了胶体晶支架，并且在此支架的基础上成功修饰了胶原蛋白(Collagen)和碱性成纤维生长因子(bFGF)，此支架具有显著的促进肺细胞生长的作用，且两种生长因子共同修饰的支架促生长效果更好。此支架在肺部损伤的修复以及肺组织工程支架材料的开发方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1为胶体晶仿生肺组织工程支架的合成图。

图2为胶体晶仿生肺组织工程支架的修饰示意图。

图3为胶体晶仿生肺组织工程支架的扫描电镜观察图；左边为空白对照组，中间为加了Fe₃O₄纳米粒子，右边为加了磁场之后所制备的支架。

图4为胶体晶仿生肺组织工程支架的红外光谱图和拉曼光谱图。

图5为对有序胶体晶支架进行生长因子修饰的红外检测结果。

图6为胶体晶仿生肺组织工程支架的热重分析图。

图7为胶体晶仿生肺组织工程支架的氮脱附吸附分析图。

图8为胶体晶体空白支架修饰的白光干涉分析图。

图9为细胞在有序和无序支架上的DAPI染色结果。

图10为细胞在有序和无序支架上计数结果。

图11为DAPI染色检测细胞在有序胶体晶支架生长情况的细胞染色结果图。

图12为MTT法检测细胞在有序胶体晶支架上的增殖。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例所涉及的材料、试剂与仪器如下：

细胞株：小鼠肺上皮细胞(TC-1)由上海赛百慷生物技术股份有限公司提供，经本实验室扩大培养并保种。

主要试剂：四氧化三铁纳米粒子、乙醇、PBS、去离子水、硼硅玻璃壳瓶、玻璃管、壳聚糖、明胶、乙酸、超纯水、京尼平、DPBS、磺基-SMCC、胶原蛋白、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。

仪器：超声波清洗机、Sigma 32184高速冷冻离心机、冷冻干燥机、Nikon显微镜、Thermo CO₂培养箱、HV-85高压灭菌器、无菌操作台、广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅等。

另外，统计学分析方法：本实验采用spss19.0统计软件进行方差分析，平均值表示，分析函数为LSD和Duncan，P<0.05表示差异显著。

实施例1胶体晶仿生肺组织工程支架的制备

1、制备方法如下：

(1)胶体支架的制备

取10～20ml乙酸用70～100ml PBS稀释，然后加入1～5g壳聚糖溶解完全，得壳聚糖溶液；取50～200ml去离子水并加热至90～100℃，将1～5g明胶溶解进去，搅拌直到完全溶解，得明胶溶液。然后壳聚糖溶液和明胶溶液以1：2的比例混合，同时加入0.005～0.01ml质量分数为2％的京尼平，混合5～10min，然后超声震荡5～10min，混合成凝胶。

(2)胶体晶体多孔支架的制备

称取10～20mg四氧化三铁纳米粒子，在盛有6～8ml凝胶的烧杯下放一块磁铁，将四氧化三铁纳米粒子倒入烧杯中，搅拌5～10min，然后超声震荡5～10min，直到四氧化三铁与凝胶充分混合，然后将烧杯放在室温下让其自然凝固，凝固的速度与京尼平的浓度有关，一般2～3天就会凝固，将凝固的样品小心的从烧杯壁上取下，放在40℃烘箱中干燥48～72h，干燥后用乙酸来浸泡样品从而溶解四氧化三铁纳米粒子，将样品放在摇床上可以加速去粒子。

(3)对胶体晶体支架的修饰

将20～50μl含有10～20μg/ml的磺基-SMCC的DPBS注射到胶体晶中，放置2～4h；将这种激活的磺基-SMCC支架用DPBS冲洗，然后在40～60℃下干燥24～48h；然后加入40μl的DPBS(其中含有等量的需要修饰的生长因子和胶原蛋白，浓度为10～20μg/ml)放置12～24h；接着将支架用DPBS冲洗，然后在40～60℃下干燥12～24h，其中修饰的示意图如图2所示。

2、胶体晶仿生肺组织工程支架的合成和修饰示意图如附图1和图2所示。

图1是支架制备过程的示意图，在制备的过程中我们也发现了许多存在的问题，例如在混合溶液中加入交联剂京尼平时，凝胶的速度取决于京尼平的浓度，浓度太小时，胶体凝固的速度就非常慢，这时可以适当加大京尼平的浓度。另一方面，在加入京尼平凝固的过程中，胶体会变成蓝色，随着京尼平浓度的增大，颜色也由淡蓝色变成深蓝色，因此要控制好京尼平的浓度，我们采用的是10mg京尼平溶于5ml超纯水中所制备的浓度，比较适中。

实施例2胶体晶仿生肺组织工程支架的表征

1、扫描电镜检测

(1)将空白支架及修饰后的支架进行自然风干，将风干后的支架样品黏贴固定于样品台上并做喷金处理，将样品置于扫描电镜样品室内，将样品室抽成真空，进行扫描电镜观察。

(2)结果如图3所示，左边空白对照组和中间加了Fe₃O₄纳米粒子所做出的支架的差别还是很大的，左边支架的表面较为平整，表面有褶皱凸起就像裂缝，此外还有轻微的凹陷，说明壳聚糖和明胶用京尼平混匀凝固干燥之后形成的表面并不是光滑的平面，中间图中我们可以看到支架表面有很多突起的结构，此外还有很多空隙，但是表面的结构并没有规则，我们采用Fe₃O₄纳米粒子作为支架孔隙的模板，同时因为Fe₃O₄纳米粒子带有磁性，本身会自动发生团聚，所以我们看到的支架的表面的凸起结构并没有规则可言。

图3最右侧的图片是我们后来加了磁场之后所制备的支架的电镜图，从图中我们可以看到与没有加磁场的支架相比，加了磁场的支架的表面较为平整和均匀，并且表面的凸起和孔隙也较为均匀，因此所制备的支架从形态上来看较为可观，至于支架的其他性能还要做进一步的研究和检测。

2、有序胶体晶红外光谱检测和拉曼光谱检测

(1)红外光谱检测：取一块去好粒子制备好的支架用去离子水清洗去酸，浸泡2h，为保证支架空隙的正常形态，我们在室温下或者低温40℃烘箱中干燥，将干燥好的试样和KBr在干燥机中进行干燥处理，将1～2mg支架试样与200mg纯KBr混合并研磨均匀，并将混合物研磨到粒度小于2μm，以避免散射光影响。将混合物置于模具中，在油压机上用5～10MPa压力将混合物压成透明薄片，上机待定；同时，将空白支架与进行干燥处理，上机测定。

拉曼光谱检测：取一块去好粒子制备好的支架用去离子水清洗去酸，浸泡2h，为保证支架空隙的正常形态，我们在室温下或者低温40℃烘箱中干燥，待样品干燥后作标签，寄样检测。

(2)结果如图4所示。图4中A图是两种支架的红外光谱图，图4中B图是两种支架的拉曼光谱图，图片的上方是没有加粒子的支架是对照组支架，下方是加了粒子的倒胶体支架，A图中可以看见所制备的两种支架的波峰还是有很大的差距的，加了粒子的支架的波峰在1554cm^-1、1415cm^-1、1073cm^-1、658cm^-1附近的波峰更明显，说明加了粒子的支架形成了新的键，但是从B图中只看到加了粒子的支架在1105cm^-1处形一个小峰，说明形成了一个小基团，从理论上来看这是比较理想的状态。

(3)对有序胶体晶支架进行生长因子修饰的红外检测

另外，我们用Suflo-SMCC作为修饰的连接剂，将蛋白和生长因子修饰到支架表面，修饰的结果如图5所测的红外光谱图所示，从对照组和修饰组的结果来看，光谱发生了变化，有些特征峰消失并出现一些新的特征峰，例如3269.61nm处的-OH和2928.33nm处的-CH键消失，在2136.23nm处出现了C≡C和719.70nm处出现了-NH，这些结果表明，我们的修饰是成功的。

3、热重(TGA)检测分析

(1)将没加粒子的1号样品和加了粒子的2号样品置于控制环境下，改变其温度或着保持一固定温度去观察样品的质量变化。

(2)图6是两种支架的热重分析图，其中灰色线条是没有加磁铁的对照组支架，黑色线条是加了磁铁的胶体晶体支架。从图中我们可以看到在0～200℃之间，随着温度的升高，黑色是缓慢的下降，并且位于灰线之上；而灰线在0～100℃之间有一个陡降，但是在100℃～200℃之间较为平稳，但总体来说在0～200℃之间确实是胶体晶体支架的热稳定性比对照组支架的热稳定性要好。在大约200℃～320℃之间，黑线稍位于灰线下方，大约320℃～500℃之间我们又可以看到黑线明显高于灰线。因此从图片整体分析来看，我们所制备的胶体晶体支架相对于对照组支架的热稳定性高。

4、氮脱附吸附(N₂-BET)检测

(1)将制备好的加了粒子没加磁场的支架1号样品和加粒子加了磁场的2号样品送到检测公司进行检测。

(2)如图7，此实验结果是对支架N₂脱附吸附以及孔径分布所做的一个检测，N₂脱附吸附图中，正值是有吸附作用的，负值是没有吸附作用的，从图中我们可以看出，随着相对压强的增大，吸附作用越来越小，N₂吸附作用不明显，这可能与材料的性质有关。

另外，孔径分布图中，横坐标表示的是孔的直径，纵坐标表示的是孔的体积，其中图表中有峰的地方代表有对应直径大小孔径的孔，峰值越高代表此孔径的数量越多，从图中我们可以看出，支架的孔隙直径主要分布在0～20nm之间，其中位于9nm左右的孔径最多，以及孔径分布主要集中在0.05cm³g^-1和0.3cm³g^-1左右，我们支架上的孔隙大小，分布较为均匀。

5、对促生长因子修饰的支架做白光干涉检测

(1)射线光电子能谱仪分析其元素构成及化学键的形成情况。分别取适空白支架、对空白支架做修饰的支架、没做修饰的胶体晶支架以及做了修饰的胶体晶支架用X射线光电子能谱仪扫描各样品组成成分元素分析。

支架表面总粗糙度，用Ra和Ry表示，计算公式如下：

Ry＝Z_max-Z_min；

Ry的计算为每一层的最大值减去每一层的最小值，然后所有值的平均值，Ra的计算为每一层的每个值减去这一层的平均值然后除以200最后所得的总和，用这两个参数代表平面整体粗糙度。

(2)经过前面对修饰支架的红外检测的初步分析证明修饰是成功的，我们便对修饰的空白支架做了白光干涉的分析，白光干涉主要用来测支架表面形貌，如图8中所示，整个图片都是对未加四氧化三铁纳米粒子的支架所做的检测。

图中，a1表示未被修饰的空白支架表面形貌，a2表示用胶原蛋白修饰的空白支架，a3表示用生长因子b-FGF修饰的空白支架，a4表示用胶原蛋白和生长因子b-FGF共同修饰的空白支架。从整体来看，不管是经修饰过的支架还是未经修饰的支架表面都是较为平整的，对比四张图，a1图中未经修饰的支架表面最为平整，没有凸起的峰，a2和a3图是经过一种因子修饰过的表面形貌图，两者中都有少量的峰，其中a4图经过两种因子共同修饰的表面形貌图中，峰的数量都比只用一种因子修饰支架的表面峰数量要多，从而也可以初步判定支架修饰是成功的。接下来需要测支架修饰的接枝率，从而进一步定性的确定接枝成功与否。

b图和c图是对支架表面粗糙度的一个计算，b图表示4种支架中随机任取其中一层，在这一层当中支架表面的一个平整起伏的形态，从这4个曲线当中我们明显可以看到有高低海拔的起伏，但是曲线当中波峰的起伏不大。但对比4条曲线来看，曲线一海波由低到高，波峰较少也较不明显；曲线二海拔由高到低，波峰也是相对较少；曲线三海拔由高到低，波峰也相对较多和明显，曲线四海拔由低到高，波峰相比于其他最多，波峰也相对明显，初步判断出表面修饰过的支架比没有修饰过的支架表面要粗糙，表面修饰多的比表面修饰少的相对要粗糙。

c图表示的是支架表面总粗糙度，所得的数据如c图所示其中A、B、C、D分别代表四中不同修饰的支架，其中A为对照组，我们从结果中可以看到支架的粗糙度呈一个变小的趋势，原因是支架表面修饰的生长因子填充了表面的空隙，使支架表面粗糙度趋于降低。

实施例3体外促进TC-1细胞生长实验

1、细胞培养

间充质干细胞(MSC细胞系)由。细胞的培养一般包括复苏、传代和冻存。细胞的复苏主要过程为：把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中轻微摇动。液体都融化后(大概1～1.5分钟)，拿出来喷点酒精放到超净工作台里；把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中(用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来)，1000转离心5分钟；把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布；标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到37℃的5％CO₂培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基；根据细胞增长速度2～3天换一次培养基。

细胞的传代步骤为：培养皿中的细胞覆盖率达到80％～90％时要传代；把原有培养基倒掉；先用PBS清洗掉一些杂质和代谢物；加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行)，消化1～2分钟；细胞都变圆后加入等体积的含血清的培养基终止消化；用移液枪吹打细胞，让细胞悬浮起来；根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中，继续培养。

冻存的步骤为：把细胞消化下来并离心(同上)。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃30min，-20℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。

细胞在在培养瓶中贴壁培养至80％后，胰酶消化，以1.75×10⁴/孔的密度接种至24孔板上，培养24h，进行后续实验。其它细胞培养条件为：含10％新生牛血清培养基，37℃，5.0％CO₂。

2、DAPI染色检测有序和无序支架的细胞促生长状况

(1)DAPI是一种可以透过细胞膜，与DNA特异性结合的蓝色荧光染料。它可以穿过正常的细胞质膜，进入细胞核中，从而将细胞核然为蓝色。待细胞生长到0.8～0.9×10⁶时，将TC-1细胞接种到用生长因子修饰的支架上，其过程主要为：接种细胞至24孔板中，等待细胞生长至80％～90％；用PBS清洗3次；加1～2ml的4％多聚甲醛固定细胞20～30min(样品可保存在-4℃)；PBS清洗3次；用0.2％Triton X-100透化30～40min；用PBS清洗3次；在避光条件下用10μg/ml的DAPI染核1～5min；用PBS清洗3次；PBS润湿，在显微镜下拍照。

(2)我们用加了磁场有序的支架和没加磁场无序的支架分别对细胞的生长状况做了检测，结果如图9所示，结果表示加了Fe₃O₄纳米粒子的支架比没有加粒子的对照组支架对细胞生长促进作用要明显。相比有序和无序的支架，可以看出有序的支架对无序的支架对细胞的生长促进作用要明显一点。说明孔的规则分布对细胞的生长有一定的影响的，本发明制备的有序的胶体晶支架对细胞的生长是起促进作用的。

图10是细胞在有序和无序支架上的一个计数结果图，从图片中可以看出细胞在有序孔支架上的数量是多于无序孔支架上的细胞的，这与图9所示的DAPI染色的结果一致。

(3)DAPI染色检测细胞在有序胶体晶支架生长情况

待细胞密度长到90％，先将细胞接到分别用胶原蛋白和bFGF修饰的支架上，培养3天，用DAPI对支架上的细胞进行染色观察，其结果如图11所示，可以看见两者支架上都有细胞，但比较有意思的是用bFGF修饰的支架上的细胞有些排列成脉络状，原因可能是bFGF生长因子促进细胞脉络状生长。

3、MTT法检测细胞的增殖

为了检测分别用胶原蛋白、bFGF以及胶原蛋白-bFGF修饰的支架对TC-1细胞生长状况的检测，在48h，用MTT作用于TC-1细胞，通过MTT实验分析细胞的存活率。具体是细胞在培养瓶中贴壁培养至80％后，以4×10³/孔的密度接种至96孔板中，在细胞培养箱中培养12h，加支架培养48h，提前4h加20μl MTT，孵育4h，吸取废液，PBS洗两遍，加100μl DMSO，处理10min，使用酶标仪检测吸光度。

结果如图12所示。在激光波长570nm的激发下，TC-1细胞的存活率在不同因子修饰的支架上发生的显著地变化，可以看到对照组、胶原蛋白、bFGF以胶原蛋白-bFGF修饰的支架对细胞活力程一个上升的状态，说明用胶原蛋白和bFGF共修饰的支架能更好的促进TC-1细胞的生长。

综上所述，本发明以明胶和壳聚糖作为原材料，以京尼平作为交联剂，成功合成了胶体晶体支架。然后用Fe₃O₄纳米粒子作为制孔剂成功在支架表面形成空隙，并且在磁场的作用下空隙更为均匀，支架稳定性同时得到提高。制备的有序的胶体晶支架相比于无序的胶体晶支架对TC-1细胞的生长促进作用更明显。另外用胶原蛋白，bFGF以及胶原蛋白-bFGF生长因子修饰的胶体晶支架能促进肺细胞的生长，并且用胶原蛋白-bFGF修饰的支架效果最好。

Claims

1.一种有序的促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架的制备方法，其特征在于，首先配制壳聚糖溶液和明胶溶液，将两者混合，同时加入京尼平，搅拌并超声震荡，制成凝胶；然后将四氧化三铁纳米粒子加入到凝胶中，在磁场诱导下，用胶体晶合成法制备三维多孔的胶体晶支架；最后在此支架上修饰以胶原蛋白和碱性成纤维生长因子，成功合成得到所述胶体晶仿生肺组织工程支架；其中，所述胶体晶合成法制备三维多孔的胶体晶支架的过程中，制得样品需去除四氧化三铁纳米粒子，得三维多孔的胶体晶支架。

2.根据权利要求1所述胶体晶仿生肺组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.制备胶体支架

S2.制备胶体晶体多孔支架

将四氧化三铁纳米粒子加入装有步骤S1凝胶的容器中，容器下方放一块磁铁，搅拌5～10min，然后超声震荡5～10min，直到四氧化三铁与凝胶充分混合，然后置于室温下自然凝固，再将凝固的样品干燥；干燥的样品用乙酸浸泡去除四氧化三铁纳米粒子，得到胶体晶体多孔支架；

S3.对胶体晶体多孔支架进行修饰

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中壳聚糖溶液、明胶溶液和京尼平的体积比为1：2：0.005～0.01。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中壳聚糖溶液的配制方法为：先将体积比1：3～10的乙酸和PBS混合，然后加入壳聚糖，溶解完全得壳聚糖溶液；明胶溶液的配制方法为：将明胶溶于加热至90～100℃的去离子水，搅拌直到完全溶解，得明胶溶液。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述四氧化三铁纳米粒子和凝胶的质量体积比为10～20mg：6～8mL。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S31所述含有磺基-SMCC的DPBS中，磺基-SMCC的浓度为10～20μg/ml。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S32所述含有生长因子和胶原蛋白的DPBS中，生长因子和胶原蛋白等量，浓度均为10～20μg/ml。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，含有磺基-SMCC的DPBS：胶体晶体多孔支架：含有生长因子和胶原蛋白的DPBS＝20～50μl：6～8ml：40μl。

9.根据权利要求1～8任一所述的方法制备得到的能够促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架。

10.权利要求9所述胶体晶仿生肺组织工程支架在制备肺组织工程支架材料方面的应用。