CN105366730B - 一种使用dna纳米结构对疏水性纳米粒子相转换的方法 - Google Patents
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Abstract
疏水性纳米粒子在生物分析以及生物医学应用上具有巨大的潜能，本发明提供了一个简易的方法，使用DNA纳米结构作为相转换试剂，该DNA纳米结构是由四条单链DNA自组装而形成的DNA四面体结构，其中三条链末端修饰羧基，另外一条单链DNA含有适配体，该适配体可以特异性结合癌细胞膜表面高表达的核仁蛋白，从而增加了纳米粒子的靶向能力并且提高了细胞的摄取能力。使用DNA四面体作为相转换试剂，不仅无毒，方便，而且只需进行简单的分离，便可制得稳定性高和分散性好的亲水性纳米粒子。
Description
技术领域
本发明属于生物分析以及生物医学应用领域，具体涉及合成一种含有适配体的DNA纳米结构，并将该DNA纳米结构用于疏水性纳米粒子的相转换。
背景技术
疏水性纳米颗粒具有特殊的物理和化学性质，随着纳米科学与技术的发展，它们在生物医生上的潜在应用价值，引起了各相关领域研究者的关注，例如生物传感，细胞成像和癌症治疗等。氧化铁纳米颗粒的高磁敏性、化学稳定性和低毒性已被深入研究，这些特性使得它不仅可以用作磁共振成像的T 2造影剂，而且在药物递送，细胞追踪以及磁热疗等方面也得到广泛应用。
当前，商业化的纳米粒子通常是在水介质中通过共沉淀的方法合成，但是由于水的沸点低，导致这种条件合成的纳米粒子尺寸范围分布较广且结晶性能较差。为了制备高质量且颗粒尺寸分布均匀的纳米粒子，很多高沸点的非极性溶剂被用作制备纳米颗粒的反应介质。但是，纳米粒子用非极性溶剂合成常常包裹疏水性配体，这些配体不溶于水，导致氧化铁纳米粒子在生物应用上受到限制。
一般方法合成的纳米粒子水溶性和生物相容性都较差，且容易团聚，这就使得它们需要进行表面修饰和功能化之后，才能满足生物医学应用上的要求。最近，很多相转换试剂通过配体交换的方法来进行疏水性纳米粒子的相转换，比如二巯基丁二酸，硅烷等。通过相转换方法将疏水性纳米粒子转换成亲水性纳米粒子，一般都是单功能的，它们必须与生物基团结合进行进一步的表面功能化修饰才具有分子识别的功能，这样就使整个过程变得繁琐费时。因此，发展一种温和而通用的疏水性纳米粒子的相转换方法，并且实现纳米粒子表面生物功能化成为一个迫切的需求。本发明提供的相转换方法在进行疏水性纳米粒子转换成亲水性纳米粒子的同时也对纳米粒子进行表面生物功能化，方法快速简便。
1990年，Seeman 和Mirkin等首先合成功能化的DNA纳米结构，很快就掀起了人们对DNA功能化的兴趣。通过DNA自组装可以形成不同形状和结构的分子，其中，三维的DNA四面体纳米结构具有极好的机械硬度和结构稳定性。DNA四面体结构类似金字塔，四个面均为三角形，六条边由双链DNA组成，可以通过四条单链DNA 退火而迅速自组装起来，而且每个顶点都可以用化学基团或者生物分子进行功能化修饰。利用这些特性，DNA四面体在传感构建器，药物递送以及分子逻辑学上有着广泛的应用范围。本发明将DNA纳米结构作为相转换试剂进行疏水性纳米粒子的相转换，在国内外有关DNA纳米结构方面的文献和专利中，还未有用DNA纳米结构进行疏水性纳米粒子相转换的报道。
发明内容
本发明目的在于制备高质量且颗粒尺寸分布均匀的纳米粒子，提供了一种使用DNA纳米结构对疏水性纳米粒子相转换的方法。本发明克服了现有相转换试剂单功能的不足，成功对疏水性纳米粒子进行表面生物功能化，转换后的亲水性纳米粒子具有靶向功能，可以提高被细胞摄取的能力，用于细胞成像。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种使用DNA纳米结构对疏水性纳米粒子进行相转换的简易方法的具体步骤为：
（1）制备含有适配体的DNA四面体溶液：用缓冲液将等量的DNA链A，B，C，D混合，加热到95°C，然后迅速冷却到4°C，制得DNA四面体溶液。
其中，所述DNA链A、B、C、D序列如SEQ ID NO.1-4所示；所述缓冲液为TM缓冲液。DNA包括三条具有羧基修饰的DNA链（链A，B，C）和一条含有适配体序列的DNA链（链D）（具体序列见表1）。链D含有的适配体序列可以特异性结合在癌细胞膜表面高表达的核仁蛋白，从而提高了被细胞摄取的能力，并使带有磁性纳米粒子功能化的DNA四面体对癌细胞具有靶向能力。
（2）合成DNA四面体功能化的亲水性纳米粒子：步骤（2）所述合成DNA四面体功能化的亲水性纳米粒子具体操作为：将0.2ml 100µg/mL疏水性纳米粒子与步骤（1）制得的0.2mL10µM DNA四面体溶液混合，放在4℃下剧烈震荡12h后，移去有机溶剂，离心洗涤，即得到分散在水溶液中的亲水性纳米粒子。所述的疏水性纳米粒子为氧化铁纳米粒子或稀土上转换发光纳米粒子。所述的疏水性纳米粒子是分散在有机溶剂中的，其中：氧化铁纳米粒子分散在氯仿中，稀土上转换发光纳米粒子分散在环乙烷中。
（3）以分散在氯仿中被油酸包裹的氧化铁纳米粒子为例，推测机理为：DNA四面体的三个顶点存在羧基，羧基对氧化铁纳米粒子表面的三价铁粒子具有强亲和力，因此，DNA四面体纳米结构可以通过配体交换与油酸包裹的氧化铁纳米粒子牢牢结合，从而使颗粒具有水溶性。
本发明的显著优点在于：
本发明将DNA纳米结构作为相转换试剂，不仅无毒高效，而且在进行相转换的同时也完成了对纳米粒子的表面功能修饰，快速简便，转换后的亲水性纳米粒子不仅具有靶向功能，而且提升了被细胞摄取的能力。
本发明使用DNA纳米结构发展了一种简易而普遍的方法用于相转换的同时也将疏水性纳米粒子进行了表面生物功能化。所设计的DNA四面体纳米结构不仅可以将氧化铁纳米粒子从有机相拖到水相，而且给予了它们特殊的靶向性。值得关注的是，该方法基本上可以适用于不同类型的疏水性纳米粒子，比如上转换稀土纳米粒子。此外，功能核酸比如适配体，DNAzymes，siRNA，或反义DNA都可以很容易被修饰到所要的四面体DNA纳米结构中去构建多功能的相转换试剂。基于这些显著的优点，本发明提供的相转换方法将为扩大疏水性纳米粒子在生物医学上的应用提供一个新的机遇。
附图说明
图1为12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图。
图2（a）为相转换之前氧化铁纳米粒子分散在氯仿中的透射电镜图；（b）为相转换之后氧化铁纳米粒子分散在水中的透射电镜图；（c）相转换前后氧化铁纳米粒子在溶剂中的分散性。（d）相转换后亲水性氧化铁纳米粒子的磁分离现象。
具体实施方式
为了验证设计的可行性，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明应用不仅限于此。
实施例1
合成功能化的DNA四面体
将DNA链A，B，C和D在TM缓冲液（10 mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH 8.0）中等摩尔混合，终浓度为10 µM。将DNA混合后加热到95°C再迅速冷却到4°C，即可得到含有适配体的DNA四面体溶液。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可验证已形成DNA四面体纳米结构（见图1）。
表1本发明所用到的DNA序列详细信息
实施例2
分散在氯仿中的氧化铁磁性纳米粒子的相转换
将含有100µg/mL氧化铁纳米粒子的0.2 mL氯仿溶液（从美国大洋纳米科技公司(Springdale, AR, USA)购买）缓慢加入0.2 mL含有10 µM DNA四面体溶液中，混合液剧烈震荡反应12 h之后，氧化铁纳米粒子就从氯仿层转到水层。然后将水溶液移到微型管中，用TM缓冲液离心分离洗涤后，重新分散在TM缓冲液中即得水溶性氧化铁纳米粒子。
附图2a、2b是相转换前后氧化铁纳米颗粒的透射电子显微镜图。附图2c是相转换前后的氧化铁纳米粒子在氯仿中和在水中的分散图，附图2d是相转换后氧化铁纳米粒子在水溶液中的磁性分离现象图。
实施例3
分散在环己烷中的稀土上转换发光纳米粒子的相转换
将含有100µg/mL稀土上转换发光纳米粒子的0.2 mL环乙烷溶液缓慢加入0.2 mL包含10 µM DNA四面体的水溶液中，混合液剧烈搅拌12 h之后，稀土上转换发光纳米粒子就从环乙烷层转到水层了，将水层溶液转移到微型管中。多余的DNA四面体通过离心分离和洗涤后，从亲水性稀土上转换发光纳米粒子水溶液中移出。最后，将亲水性稀土上转换发光纳米粒子重新分散在TM缓冲液中即得分散在水溶液中的稀土上转换发光纳米粒子。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种使用DNA纳米结构对疏水性纳米粒子相转换的方法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<212> DNA
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ggtggtggtg gttgtggtgg tggtggtttt ttacattcct aagtctgaaa cattacagct 60
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Claims (3)
1.一种使用DNA纳米结构对疏水性纳米粒子相转换的方法，其特征在于：将DNA四面体纳米结构作为相转换试剂，与不能在水溶液中分散的疏水性纳米粒子充分混合震荡后，即将疏水性纳米粒子转换成亲水性纳米粒子；
具体步骤为：
（1）制备含有适配体的DNA四面体溶液；
（2）合成DNA四面体功能化的亲水性纳米粒子；
步骤（1）所述制备含有适配体的DNA四面体溶液，具体操作为：用缓冲液将等摩尔的DNA链A、B、C、D混合，加热到95℃，然后迅速冷却到4°C，制得DNA四面体溶液；
所述DNA链A、B、C、D序列如SEQ ID NO.1-4所示；所述缓冲液为TM缓冲液；
所述的疏水性纳米粒子为氧化铁纳米粒子或稀土上转换发光纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的使用DNA纳米结构对疏水性纳米粒子相转换的方法，其特征在于：步骤（2）所述合成DNA四面体功能化的亲水性纳米粒子具体操作为：将0.2ml 100µg/mL疏水性纳米粒子与步骤（1）制得的0.2mL 10µM DNA四面体溶液混合，放在4℃下剧烈震荡12h后，移去有机溶剂，离心洗涤，即得到分散在水溶液中的亲水性纳米粒子。
3.根据权利要求1所述的使用DNA纳米结构对疏水性纳米粒子相转换的方法，其特征在于：所述的疏水性纳米粒子是分散在有机溶剂中的，其中：氧化铁纳米粒子分散在氯仿中，稀土上转换发光纳米粒子分散在环乙烷中。
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