CN114984032B - Dna四面体框架核酸-绿原酸复合物及其在制备治疗肝纤维化的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种DNA四面体框架核酸和绿原酸复合而成的复合物，以及上述复合物在制备治疗肝纤维化和/或器官损伤的药物中的新用途。本发明复合物能够有效抑制体外肝星状细胞的激活，减轻CCl₄诱导的肝纤维化，并可通过减轻机体的氧化应激水平，增加抗氧化酶的生成，从而有效减轻CCl₄诱导的肝脏、脾脏、肾脏和肺的器官损伤。DNA四面体框架核酸与绿原酸发挥协同增效作用，具有很好的应用前景。

Description

DNA四面体框架核酸-绿原酸复合物及其在制备治疗肝纤维化 的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及DNA四面体框架核酸-绿原酸复合物及其制备方法和在制备治疗肝纤维化的药物中的用途。

背景技术

肝纤维化是肝脏慢性损伤下的持续、动态的组织修复结果，以细胞外基质的过度沉积为主要表现。多种病因包括慢性病毒感染、酒精损伤、代谢障碍、化学物质损伤等长期作用于肝脏的损伤因素可导致慢性肝炎，并随着时间推移在无干预措施的情况下进展为肝纤维化，出现肝脏功能一定程度的损伤。虽然早期的肝纤维化可以在损伤因素消失后表现为好转，但是上述慢性损伤的彻底控制是很难的。控制不良的慢性损伤因素将导致肝纤维化继续进展为肝硬化，出现明显的肝脏形态和功能的异常，并导致严重的全身并发症，严重威胁患者健康。

绿原酸(CGA)是一种多酚类单体，目前已报道其具有抗氧化和抗纤维化的双重功效，然而其生物利用度低，易被蛋白质灭活，体内应用有效剂量大，这使得长期绿原酸的长期应用受到局限。

DNA四面体框架核酸(tFNAs)，一种由DNA单链通过自组装合成的具有三维结构的DNA纳米材料，具有良好的生物相容性、可编辑性和生物安全性。一方面，其具有作为药物载体的潜能，另一方面，也有报道显示DNA四面体本身具有一定的药理活性；例如中国专利CN112587544B，即公开了DNA四面体框架核酸对肺纤维化有一定的治疗效果。

然而，肺纤维化以上皮间充质转化为主要机制，与肺纤维化不同，实验性和人类肝损伤肝纤维化的主要驱动因素是肝星状细胞(HSC)活化为增殖性成纤维肌纤维母细胞。受损肝脏中几乎80％的I型胶原来源于活化的肝星状细胞。静止的肝星状细胞位于窦周间隙，被肝细胞和内皮细胞包围。当肝脏受到慢性损伤时，静止的肝星状细胞激活为肌成纤维细胞并迁移至受损部位分泌细胞外基质，形成纤维瘢痕。肝星状细胞的激活受多种细胞因子的调控，包括TGF-β,PDGF,Ang II等，激活的肝星状细胞通过自分泌和旁分泌的方式又进一步促进其他静止肝星状细胞的激活，不断放大损伤效果。

因此，肺纤维化和肝纤维化的病因病机、治疗手段等存在有诸多差异。DNA四面体框架核酸对肝纤维化的作用，以及DNA四面体框架核酸与绿原酸复合后的效果变化、影响目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA四面体框架核酸-绿原酸复合物及其制备方法和用途。

本发明提供了一种复合物，它是DNA四面体框架核酸和绿原酸复合而成；所述DNA四面体框架核酸是由序列分别如SEQ ID NO.1～4所示的4条单链DNA分子经过碱基互补配对形成。

进一步地，上述DNA四面体框架核酸和绿原酸的质量比为100:(20～60)。

进一步地，上述复合物是将DNA四面体框架核酸和绿原酸的混合溶液在20～30℃下振荡、超滤后制得；

优选地，所述DNA四面体框架核酸和绿原酸的摩尔比为0.25:(25～100)；更优选地，所述DNA四面体框架核酸和绿原酸的摩尔比为0.25:75。

本发明还提供了上述的复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)分别配制DNA四面体框架核酸的溶液和绿原酸溶液；

(2)绿原酸溶液添加到DNA四面体框架核酸的溶液中震荡，离心，超滤，即得。

进一步地，上述震荡时间为4～8小时，所述超滤为：转速3000～5000rpm超滤5～15min；优选地，所述震荡时间为6小时，所述超滤为：4000rpm超滤为10min。

进一步地，上述DNA四面体框架核酸的溶液是通过如下方法制成：将4条单链DNA分子加入TM缓冲液中，置于足以使其变性的温度下维持至少10min，再将温度降低到2～8℃维持至少20min；

优选为将4条单链DNA分子加入TM缓冲液中，置于95℃维持10min，再将温度降低到4℃维持20min。

本发明还提供了上述的复合物在制备治疗肝纤维化和/或治疗器官损伤的药物中的用途。

进一步地，上述治疗肝纤维化的药物是抑制肝星状细胞激活治疗肝纤维化的药物；

所述治疗器官损伤的药物是减轻氧化应激所致肝脏、肾脏、脾脏、肺损伤的药物。

本发明还提供了DNA四面体框架核酸在制备治疗肝纤维化的药物中的用途；所述DNA四面体框架核酸是由序列分别如SEQ ID NO.1～4所示的4条单链DNA分子经过碱基互补配对形成。

进一步地，上述治疗肝纤维化的药物是抑制肝星状细胞激活和/或减轻氧化应激所致损伤从而治疗肝纤维化的药物。

本发明的有益效果：本发明提供了DNA四面体框架核酸与绿原酸的复合物及其在制备治疗肝纤维化和/或器官损伤的药物中的新用途。本发明DNA四面体框架核酸及其与绿原酸的复合物能够有效抑制体外肝星状细胞的激活，减轻CCl₄诱导的肝纤维化；同时，本发明复合物可通过减轻机体的氧化应激水平，增加抗氧化酶的生成，从而有效减轻CCl₄诱导的肝脏、脾脏、肾脏和肺的器官损伤；DNA四面体框架核酸与绿原酸发挥协同增效作用，具有很好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为聚丙烯酰氨凝胶电泳对tFNAs与tFNAs-CGA的表征结果。

图2为tFNAs-CGA的合成表征：A为CGA、tFNAs、tFNAs-CGA紫外吸收峰图；B为不同浓度tFNAs-CGA与Hoechst竞争DNA沟槽位点形成荧光相对荧光强度结果。

图3为不同浓度CGA的包封率和载药量。

图4为各组处理后体外肝星状细胞激活和细胞外基质生成的抑制结果：A为各组处理后α-SMA表达的荧光免疫成像结果；B为各组处理后α-SMA免疫荧光统计图；C为各组处理后Collagen I表达的荧光免疫成像结果；D为各组处理后Collagen I免疫荧光统计图；图C、D中，*表示指定的两组相比下出现的统计学差异程度，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图5为各组处理后小鼠肝纤维化的减轻结果：A为时间流程图；B为小鼠肝脏大体观、HE染色、天狼星红染色及Masson染色结果图；C为天狼星红染色阳性面积的统计图；D为Masson染色胶原容积分数统计图；E为6周内小鼠体重变化的结果；F为小鼠肝脏指数(肝脏重量/体重)的统计图；G小鼠血清中反应肝功能的生化指标统计图；图C、D、E、F、G中，*表示指定的两组相比下出现的统计学差异程度，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图6为各组处理后小鼠多器官保护作用：A为小鼠脾脏、肾脏和肺的HE染色结果；B为小鼠脾脏指数(脾脏重量/体重)的统计图；C为小鼠血清中抗氧化酶等生化指标的检测统计结果；图B、C中，*表示指定的两组相比下出现的统计学差异程度，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

实施例1、DNA四面体框架核酸的制备

等摩尔浓度四种单链DNA(S1，S2，S3，S4，序列如表1)添加至TM缓冲溶液(50mMMgCl₂和10mM Tris-HCl(pH 8.0)中，经加热(95°，10min)、降温(4°、20min)合成tFNAs溶液。

表1：本发明四条单链的具体序列

实施例2、本发明复合物DNA四面体框架核酸-绿原酸的制备

将实施例1中获得的tFNAs浓度控制为250nM。随后将CGA预先溶解在PBS中(浓度10mM)，然后将不同体积10mM CGA添加至tFNA溶液中室温下震荡6h，随后将复合物溶液放入30Kda大小的超滤管中，以4000rpm的转速离心超滤10min后获得不同绿原酸浓度(25μM、50μM、75μM、100μM)的本发明复合物DNA四面体框架核酸-绿原酸(tFNAs-CGA)溶液。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、本发明DNA四面体框架核酸及其与绿原酸的复合物的表征

成功合成的DNA四面体框架核酸tFNAs(实施例1)和DNA四面体框架核酸-绿原酸复合物tFNAs-CGA(实施例2)通过非变形的8％聚丙烯酰氨凝胶电泳检测验证，按照设计(1：tFNAs；2：S1；3：S1+S2；4：S1+S2+S2；5：25μM tFNAs-CGA；6：50μM tFNAs-CGA；7：75μM tFNAs-CGA；8：100μM tFNAs-CGA)上样后，恒定电压80V进行60min，随后Gel-Red染料染色进行曝光观察。显示tFNAs的成功合成及tFNAs-CGA的稳定存在(图1)。

进一步对成功合成的tFNAs-CGA通过紫外分光光度计测定吸收峰大小(图2A)，并通过不同浓度tFNAs-CGA(I：tFNAs；II：25μM tFNAs-CGA；III：50μM tFNAs-CGA；IV：75μMtFNAs-CGA V：100μM tFNAs-CGA；VI：100μM CGA)与Hoechest竞争DNA沟槽位点测定其相对荧光光谱(图2B)，显示tFNAs-CGA复合物的成功合成。

实验例2、复合体DNA四面体框架核酸-绿原酸复合物投料比的筛选

采用实施例2中的方法制备不同绿原酸浓度的tFNAs-CGA。根据以下公式计算复合物中CGA的包封效率(EE)和载药量(LE)：

EE：(总绿原酸物质的量-剩余绿原酸物质的量)/总绿原酸物质的量×100％

LE：(总绿原酸的质量-剩余绿原酸的质量)/总四面体框架核酸质量

结果如图3所示，在绿原酸浓度为75μM时，能获得最大包封效率和较高的载药量，因此DNA四面体框架核酸和绿原酸的投料摩尔比为0.25:75时，是最优选的方案。

实验例3、体外实验

1、试验分组

1组(对照组)：无血清培养基中不添加其他溶液培养24h

2组(TGF-β组)：无血清培养基中添加10ng/ml TGF-β培养24h

3组(TGF-β+CGA组)：无血清培养基中添加10ng/ml TGF-β培养24h，同时加入100μM的绿原酸溶液进行治疗。

4组(TGF-β+tFNAs组)：无血清培养基中添加10ng/ml TGF-β培养24h，同时加入250nM的DNA四面体框架核酸溶液进行治疗。

5组(TGF-β+tFNAs-CGA组)：无血清培养基中添加10ng/ml TGF-β培养24h，同时加入75μM tFNAs-CGA复合物进行治疗。

2、试验步骤

A：将肝星状细胞接种于共聚焦小皿上，培养24h贴壁；随后更换无血清培养基饥饿2h。吸去组分为1640+10％血清+1％双抗的培养基，PBS洗3次，每次5分钟，按分组加入处理因素继续培养24h后，PBS清洗3次；

B：4％多聚甲醛固定25分钟后，吸去多聚甲醛，PBS洗3次，每次5分钟；

C：0.5％Triton-100处理20-25分钟，吸去Triton-100，PBS洗3次，每次5分钟；

D：羊血清处理1小时，吸去羊血清，PBS洗3次，每次5分钟；

E：一抗(抗nestin抗体)处理，4℃，过夜。第二天，37℃复温0.5小时，回收一抗，PBS洗3次，每次5分钟。携带荧光的二抗处理，避光，37℃，1小时，吸去二抗，PBS洗3次，每次5分钟；

F：鬼笔环肽处理，避光，10-30分钟，吸去鬼笔环肽，PBS洗3次，每次5分钟；

G：DAPI处理，避光，10分钟，吸去DAPI，PBS洗3次，每次5分钟。10％甘油封样，避光，4℃保存。上机检测。

3、试验结果

在肝星状细胞中，TGF-β处理后表现出明显的相对于对照组α-SMA蛋白表达量增加，tFNAs、CGA处理后α-SMA蛋白表达量下降，而tFNAs-CGA治疗后α-SMA蛋白表达量显著明显下降(图4A、4B)；TGF-β处理后表现出明显的相对于对照组Collagen I蛋白表达量增加，tFNAs、CGA处理后Collagen I蛋白表达均有下降，而tFNAs-CGA治疗后Collagen I蛋白表达量明显下降(图4C、4D)。

因此，上述结果表明，本发明DNA四面体框架核酸本身具有减少肝星状细胞在TGF-β刺激下的激活并减少一型胶原的生成的作用；进一步与绿原酸复合后的复合物tFNAs-CGA后，能够与绿原酸协同增效，能更为显著地减少肝星状细胞在TGF-β刺激下的激活，并减少一型胶原的生成。

实验例4、体内实验

1、主要实验材料：

动物：雄性Balb/c小鼠(20±2g)

2、试验分组

2.1试验共分为5组，每组7只小鼠

1组(对照组)：腹腔内注射橄榄油50UL/只，每周两次。

2组(CCl₄组)：腹腔内以5μl/g的量注射20％CCl₄(v/v，CCl₄溶于橄榄油中)，每周2次。注射2周后，每天腹腔注射200ul生理盐水。

3组(CCl₄+CGA组)：腹腔内以5μl/g的量注射20％CCl₄(v/v，CCl₄溶于橄榄油中)，每周2次。注射2周后，每天腹腔注射200ul 100μM的绿原溶液。

4组(CCl₄+tFNAs组)：腹腔内以5μl/g的量注射20％CCl₄(v/v，CCl₄溶于橄榄油中)，每周2次。注射2周后，每天腹腔注射200ul 250nM的tFNAs溶液。

5组(CCl₄+tFNAs-CGA组)：腹腔内以5μl/g的量注射20％CCl₄(v/v，CCl₄溶于橄榄油中)，每周2次。注射2周后，每天腹腔注射200ul 100μM的tFNAs-CGA溶液。

2.2标本采集和处理

最后一次注射CCl₄两天后将小鼠采用眼眶取血方式处死，收集小鼠血清进行生化分析；收集小鼠肝脏组织进行HE染色、天狼星红染色和Masson染色；收集小鼠脾脏、肾脏和肺组织进行HE染色。

3、试验结果

3.1肝纤维化的减轻效果：试验流程如图5A所示。试验结果如图5B、5C、5D所示，与未经CCl₄暴露的小鼠(对照组)相比，CCl₄暴露小鼠(模型组，即CCl₄组)肝脏大体观表现出明显的结节状小突起，组织病理学检测见明显的天狼星红和Masson染色的胶原面积增加至对照组的3-4倍，在HE染色中已经能看到CCl₄组出现假小叶，肝索结构紊乱，肝细胞中空泡变性明显。经过tFNAs、CGA治疗后，肝索结构改善；而使用tFNAs-CGA治疗后，小鼠肝脏大体观呈较光滑的改变，未见明显结节或颗粒状，与对照组小鼠肝脏表面的光滑程度类似，天狼星红及Masson染色后胶原的增加降至对照组的1倍左右，HE染色也未见明显假小叶的出现，肝索结果趋于正常。

此外，CCl₄暴露后小鼠体重相比对照组出现明显下降(图5E)，tFNAs、CGA、tFNAs-CGA治疗后小鼠体重有所回升。肝脏指数(图5F)在CCl₄暴露后出现明显的增加，这是细胞外基质堆积和肝脏纤维化的直观表现，在tFNAs、CGA治疗后，肝脏指数降低，而tFNAs-CGA治疗后，肝脏指数恢复至对照组水平。肝纤维化的另一表现为肝功能的减退(图5G)，血清生化学检测表现出CCl₄组小鼠谷丙转氨酶和谷草转氨酶出现明显上升，超过对照组的3倍，tFNAs、CGA治疗后有所下降，而在tFNAs-CGA治疗后指数明显下降至对照组的1-2倍。

以上试验结果说明，tFNAs能够改善CCl₄引起的肝纤维化改变，其与绿原酸复合后协同增效，复合物tFNAs-CGA能有效改善CCl₄引起的肝纤维化改变，并有保护肝脏功能的作用。

3.2多器官损伤的减轻效果：

试验结果如图6A所示，在脾脏HE切片中，我们发现CCl₄组小鼠的红白髓结构消失，脾岛结构不明显，脾脏内可见大量巨核细胞(黑色箭头处)，在经过tFNAs-CGA治疗后脾岛结构恢复，巨核细胞浸润减少。CCl₄从肾脏排泄，由于脂质过氧化和膜结构的破坏，其引起的肾毒性通常表现为肾小球和肾小管结构的异常，即CCl₄组小鼠出现肾小球萎缩、肾小管上皮的空泡性变及肾小管的扩张(黑色三角形处)。相比之下，tFNAs-CGA治疗后的肾小球和肾小管结构有所改善，炎性浸润水平下降。对于肺来说，CCl₄的腹腔注射会导致慢性间质性肺炎和弥漫性肺泡损伤，具体表现为肺泡间隔的增厚、断裂、肺泡腔内的炎性渗出等(黑色五角星处)，tFNAs-CGA的处理能有效改善异常的肺泡结构，降低肺泡间隔的厚度。如图6B所示，tFNAs-CGA能减轻异常的脾脏增大。此外，我们发现如图6C所示，在应用tFNAs-CGA后小鼠血清中抗氧化酶包括谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX),SOD表现为较CCl₄组升高，机体的氧化应激在tFNAs-CGA组小鼠中处于低水平。同时反应膜脂过氧化的指标丙二醛(MDA)呈现CCl₄组升高而tFNAs-CGA组显著下降的趋势，与抗氧化物的测定结果一致，证明tFNAs-CGA在小鼠体内具有抗氧化活性。试验结果说明，tFNAs-CGA能有效改善机体氧化应激水平，在一定程度上缓解CCl₄引起的多器官毒性损伤。

综上，本发明提供了DNA四面体框架核酸与绿原酸的复合物及其在制备治疗肝纤维化和/或器官损伤的药物中的新用途。本发明DNA四面体框架核酸及其与绿原酸的复合物能够有效抑制体外肝星状细胞的激活，减轻CCl₄诱导的肝纤维化；同时，本发明复合物可通过减轻机体的氧化应激水平，增加抗氧化酶的生成，从而有效减轻CCl₄诱导的肝脏、脾脏、肾脏和肺的器官损伤；DNA四面体框架核酸与绿原酸发挥协同增效作用，具有很好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> DNA四面体框架核酸-绿原酸复合物及其在制备治疗肝纤维化的药物中的用途

<130> GYKH1118-2022P0115446CC

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> S1

<400> 1

atttatcacc cgccatagta gacgtatcac caggcagttg agacgaacat tcctaagtct 60

gaa 63

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> S2

<400> 2

acatgcgagg gtccaatacc gacgattaca gcttgctaca cgattcagac ttaggaatgt 60

tcg 63

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> S3

<400> 3

actactatgg cgggtgataa aacgtgtagc aagctgtaat cgacgggaag agcatgccca 60

tcc 63

<210> 4

<211> 63

<212> DNA

<213> S4

<400> 4

acggtattgg accctcgcat gactcaactg cctggtgata cgaggatggg catgctcttc 60

ccg 63

Claims (8)

1.一种治疗肝纤维化的复合物，其特征在于，它是DNA四面体框架核酸和绿原酸复合而成；所述DNA四面体框架核酸是由序列分别如SEQ ID NO.1~4所示的4条单链DNA分子经过碱基互补配对形成；所述DNA四面体框架核酸和绿原酸的质量比为100:(20~60)；

所述复合物是将DNA四面体框架核酸和绿原酸的混合溶液在20~30℃下振荡、超滤后制得；所述DNA四面体框架核酸是将4条单链DNA分子加入TM缓冲液中，置于95℃维持10min，再将温度降低到4℃维持20min制得。

2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述DNA四面体框架核酸和绿原酸的投料摩尔比为0.25:(25~100)。

3.如权利要求2所述的复合物，其特征在于，所述DNA四面体框架核酸和绿原酸的投料摩尔比为0.25:75。

4.权利要求1~3任一项所述的复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）分别配制DNA四面体框架核酸的溶液和绿原酸溶液；

（2）绿原酸溶液添加到DNA四面体框架核酸的溶液中震荡，离心，超滤，即得。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述震荡时间为4~8小时，所述超滤为：转速3000~5000rpm超滤5~15min。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述震荡时间为6小时，所述超滤为：4000rpm超滤为10min。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述DNA四面体框架核酸的溶液是通过如下方法制成：将4条单链DNA分子加入TM缓冲液中，置于95℃维持10min，再将温度降低到4℃维持20min。

8.权利要求1~3任一项所述的复合物在制备治疗肝纤维化和/或治疗器官损伤的药物中的用途；所述治疗肝纤维化的药物是抑制肝星状细胞激活治疗肝纤维化的药物；

所述治疗器官损伤的药物是减轻氧化应激所致肝脏、肾脏、脾脏、肺损伤的药物。

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