CN112007044B - 一种预防视网膜神经节细胞氧化应激和湿性黄斑病变的药物 - Google Patents

一种预防视网膜神经节细胞氧化应激和湿性黄斑病变的药物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种预防视网膜神经节氧化应激的药物，它是以DNA四面体为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。本发明还提供了DNA四面体在制备预防视网膜神经节细胞氧化应激、细胞凋亡的药物中的用途。将tFNA用于制备预防视网膜神经节细胞氧化应激的药物，将有助于治疗包括青光眼等视网膜神经节细胞氧化应激导致的疾病，具有十分良好的应用前景。

Description

一种预防视网膜神经节细胞氧化应激和湿性黄斑病变的药物
技术领域
本发明涉及视网膜神经药物领域。
背景技术
氧化应激(Oxidative Stress，OS)是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。
视网膜神经节细胞是位于视网膜最内层的细胞，其主要作用是接受视锥视杆细胞传导到双极细胞的电冲动，并将电冲动传递至视神经以产生视觉。视网膜神经节细胞的氧化应激参与了许多疾病的病理过程，包括青光眼，糖尿病、年龄相关性黄斑病变，视神经损伤等。当视网膜神经节细胞因为氧化应激受损时，视力必然会因此受到巨大的影响，轻则视野缺失，重则失明。
在临床上针对视网膜神经节细胞的氧化应激的预防与治疗尚且无药物可以使用。原因是视网膜神经节细胞是终末分化的神经细胞，再生能力很差。只有在疾病早期的时候预防，预防的方法只有根据相关疾病的病因进行预防。例如对于控制眼压后继续视网膜神经节细胞凋亡的青光眼患者，继续控制眼压。对持续性视野丧失的糖尿病患者，继续控制血糖。而很少针对视网膜神经节细胞进行保护。
作为近几年的研究热点，视网膜神经节细胞的保护有许多方案，包括查尔酮类似物，干细胞共培养等等，但都尚且停留在实验阶段，而未进入临床实验。
查尔酮类似物由于未有类似药物上市，其副作用尚且未知。干细胞共培养技术则过于昂贵且在临床上可操作性差，因为视网膜神病变给药一般是玻璃体注射，直接在玻璃体内注射细胞，玻璃体内的环境能否让细胞存活还是未知数。
湿性黄斑病变，也称为渗出性或新生血管性黄斑变性，多发生于老年人群，对应的疾病称为湿性年龄相关性黄斑病变(湿性AMD)。是玻璃膜疣等引起的Bruch膜损害，能诱发脉络膜的毛细血管向外层长出新生血管，可破坏脉络膜毛细血管、Bruch膜、RPE和光感受器细胞，引起严重的视力丧失。湿性黄斑病变目前只能通过注射抗血管生成的药物，以及玻璃体、黄斑部手术来治疗，价格昂贵，流程复杂。
DNA四面体(tetrahedral DNA，TDN)，又称四面体骨架核酸(tetrahedralframework nucleic acid,tFNA)、四面体DNA纳米结构，是一种由4条单链DNA通过变性和复性，进而链间碱基互补配对形成的一种四面体结构，它易于合成，生物相容性高，通常用作某些药物的载体。
miR-155(MI0000681)是一种保守的microRNA，参与体内免疫调节。免疫细胞内miR-155下调会引起免疫系统衰减。
目前尚未见DNA四面体或miR-155被用于预防视网膜神经节细胞氧化应激或湿性AMD的报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供DNA四面体在制备预防视网膜神经节细胞氧化应激或视网膜神经节细胞凋亡的药物中的用途；本发明的第二个目的是提供DNA四面体和miR-155在制备预防或治疗湿性年龄相关性黄斑病变的药物中的用途。
本发明的技术方案包括：
DNA四面体在制备预防视网膜神经节细胞氧化应激的药物中的用途。
如前述的用途，所述DNA四面体由序列如SEQ ID NO.1-4所述单链DNA经碱基互补配对形成。
如前述的用途，所述氧化应激是由过氧化氢叔丁醇导致的氧化应激。
DNA四面体在制备预防视网膜神经节细胞凋亡的药物中的用途。
如前述的用途，所述DNA四面体由序列如SEQ ID NO.1-4所述单链DNA经碱基互补配对形成。
如前述的用途，所述凋亡是由过氧化氢叔丁醇导致的凋亡。
DNA四面体和miR-155的复合物或DNA四面体在制备预防或治疗湿性黄斑病变的药物中的用途。
如前述的用途，所述药物是预防或治疗湿性年龄相关性黄斑病变的药物。
如前述的用途，所述DNA四面体由序列如SEQ ID NO.1-4所述单链DNA经碱基互补配对形成；
优选地，所述DNA四面体和miR-155的复合物是由DNA四面体和miR-155通过接头序列(粘性末端)碱基互补配对相连得到。
一种预防或治疗湿性年龄相关性黄斑病变的药物，所述药物以DNA四面体和miR-155的复合物，或单独的DNA四面体为活性成分。
如前述的药物，所述DNA四面体由序列如SEQ ID NO.1-4所述单链DNA经碱基互补配对形成。
如前述的药物，所述DNA四面体和miR-155的复合物是由DNA四面体和miR-155通过接头序列碱基互补配对相连得到。
本发明的tFNA可以有效预防氧化应激和过氧化氢叔丁醇导致的细胞凋亡，进而对RGC-5细胞起到良好的保护作用(如图1)。将tFNA用于制备预防视网膜神经节细胞氧化应激的药物，将有助于治疗包括青光眼等视网膜神经节细胞氧化应激导致的疾病，具有十分良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是tFNA发挥预防氧化应激作用的原理示意图。
图2是tFNA合成鉴定图；A，毛细管电泳检测；B，透射电镜检测；C，Zeta电位检测；D，PAGE电泳检测。
图3是tFNA与miR-155复合物的检测；TDN-155，指tFNA与miR-155的复合物；TDN，指tFNA(带接头)。
图4是tFNA细胞摄取结果以及TBHP/tFNA处理下的细胞活性检测结果；A，流式细胞仪检测tFNA(Cy5荧光标记)的摄入；B，TBHP处理下细胞的CCK-8活性检测；C，tFNA处理3h后的细胞经TBHP处理后的CCK-8活性检测；D，tFNA处理24h后的细胞经TBHP处理后的CCK-8活性检测；B～D的数据为平均值±标准差(每组样本量为4)。
图5是氧化应激相关指标的检测图；A，免疫荧光成像检测RGC-5细胞的ROS(Hoechst为蓝色，ROS为绿色)；B，125nM tFNA预处理3h再用50μMTBHP处理24h后的LDH-L水平，三组间均存在显著差异(**,p<0.01)；C，125nM tFNA预处理3h再用50μM TBHP处理24h后的ROS水平(****,p<0.0001)；B、C的数据为平均值±标准差(每组样本量为4)。
图6是细胞凋亡相关检测图；A，tFNA(125nM)预处理的凋亡流式细胞检测；B，tFNA预处理对TBHP导致的形态改变的影响；C，caspase-3相对表达量情况；**,p<0.01；****,p<0.0001；TBHP，单独用TBHP处理；F+T，先用125nM tFNA预处理3h，再用50μM TBHP处理24h。
图7是Bax基因表达情况图；A，免疫荧光检测Bax基因表达情况(细胞骨架为绿色，细胞核为蓝色，Bax为红色)；B，Bax基因表达量；C，Western blot分析Bax表达水平(β-actin为内参)；D，Bax蛋白相对表达量；B、D数据为平均值±标准差(每组样本量为4)，**,p<0.01；***,p<0.001。
图8是Bcl-2基因表达情况图。A，免疫荧光检测Bcl-2基因表达情况(细胞骨架为绿色，细胞核为蓝色，Bcl-2为红色)；B，Bcl-2基因表达量；C，Western blot分析Bcl-2表达水平(β-actin为内参)；D，Bcl-2蛋白相对表达量；B、D数据为平均值±标准差(每组样本量为4)；***,p<0.001。
图9是Akt/Nrf2信号通路相关基因表达情况图。A，免疫荧光检测HO-1表达情况(细胞骨架为绿色，细胞核为蓝色，Bcl-2为红色)；B，Western blot分析Nrf2、HO-1、Akt、pAkt表达量(β-actin为内参)；C，pAkt和Akt相对表达量；D，Nrf2相对表达量；E，HO-1相对表达量；B～E中数据为平均值±标准差(每组样本量为3)；**,p<0.01；***,p<0.001。
图10是小鼠眼底渗漏模型治疗造影图。
具体实施方式
实施例1 tFNA的合成
1.合成方法
将四条DNA单链(S1、S2、S3、S4)溶解于TM Buffer(10mM Tris-HCl,50mM MgCl2,pH＝8.0)中，四条DNA单链的终浓度为1000nM，充分混合，迅速加热至95℃保持10分钟，之后迅速降温至4℃并维持20分钟以上，即可得到tFNA。
四条单链的序列(5′→3′)如下：
S1：ATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGA
GACGAACATTCCTAAGTCTGAA(SEQ ID NO.1)；
S2：ACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACAC
GATTCAGACTTAGGAATGTTCG(SEQ ID NO.2)；
S3：ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATC
GACGGGAAGAGCATGCCCATCC(SEQ ID NO.3)；
S4：ACGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATAC
GAGGATGGGCATGCTCTTCCCG(SEQ ID NO.4)。
其中S1的5’端可选地连接一个Cy5荧光标记基团用于tFNA的示踪。
2.鉴定
使用毛细管电泳、PAGE电泳检测DNA单链与合成得到的tFNA；使用透射电镜检测tFNA的外形；使用动态光散射检测tFNA的zeta电位。
3.鉴定结果
电泳结果显示，tFNA的条带分子量显著高于单链DNA，表明单链DNA组装在一起。
透射电镜检测发现了四面体结构的颗粒，动态光散色检测到的zeta电位为8.52mV，表明tFNA合成成功。
实施例2 tFNA与miR-155的复合物(TDN-155)的合成
1.合成
在实施例1的基础上，将S3序列替换成S-S3序列，合成tFNA，S-S3序列如下：
ttgacctgtgaattACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC(SEQ ID NO.5)；小写部分为接头序列，用于与miRNA上的接头互补配对。
再将带接头的miR-155双链分子与tFNA在常温下孵育半小时。所述双链RNA分子序列为：
正义链：uucacaggucaa UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU(SEQ ID NO.6，其接头为小写部分)，
反义链：CCCUAUCACAAUUAGCAUUAAUU(SEQ ID NO.7)
2.鉴定
合成后，使用电泳对复合物进行检测，发现tFNA与miR-155的复合物相比单独的tFNA有轻微拖尾现象(图3)，表明miR-155已经结合到tFNA上，所得复合物简称TDN-155。
以下将以实验例的方式对本发明的有益效果进一步介绍，实验例中涉及的tFNA均以实施例1的方法制备得到。
实验例1细胞摄入实验
1.方法
RGC-5细胞(一种小鼠视网膜神经节细胞)分组，分别暴露于实施例1制备得到的的带有Cy5标记的tFNA(125nM)中处理1h、2h和3h，与空白组(即未用tFNA处理)对比。将所有组别均使用磷酸缓冲液洗涤3次，流式细胞仪下检测。
2.结果
如图4A所示，在处理的3h内，荧光强度随处理时间显著增加，表明tFNA容易被RGC-5细胞迅速摄入。
实验例2tFNA预防TBHP(过氧化氢叔丁醇)导致的凋亡
1.方法
1.1测试最佳造模浓度
将RGC-5细胞分组培养于96孔板中，每孔8000个细胞。各组分别加入不同浓度的TBHP处理24h，再用CCK-8实验检测细胞活性，发现50μM TBHP的抑制率为50％左右(图4B)，因此选择50μM作为最佳造模浓度。
1.2抗凋亡实验
将RGC-5细胞分组培养于96孔板中，每孔8000个细胞。向各组分别加入含有0nM、62.5nM、125nM和250nM tFNA的培养液，处理3h后，取样用CCK-8实验检测细胞活性。剩余样品于50μM TBHP下处理24h。再用CCK-8实验检测细胞活性。
2.结果
使用不同浓度tFNA处理过的RGC-5细胞的活性未见显著区别(图4C)，但tFNA预处理的RGC-5用TBHP处理后，相比直接用TBHP处理的细胞活性更高，其中使用125nM tFNA预处理的细胞活性最高(图4D)。
本实验例的结果表明，tFNA预处理可以预防TBHP导致的细胞凋亡。
实验例3 tFNA预处理预防TBHP导致的氧化损伤
1.方法
按照实验例2的方法，用125nM tFNA预处理RGC-5细胞3h，再用100μM的TBHP处理24h，进行如下检测：
1)使用DAPI(染细胞核)和DCFH-DA(指示活性氧)染料对细胞染色，显微镜下观察。
2)使用SOD(超氧化物歧化酶)检测试剂盒(Beyotime Institute ofBiotechnology)和LDH-L(乳酸脱氢酶)检测试剂盒(ChangChun HuiLi Institute ofBiotechnology)分别对细胞内SOD和LDH-L进行定量检测。
2.结果
tFNA预处理能减少TBHP导致的活性氧(图5A)，逆转TBHP导致的LDH-L活性上升(图5B)，逆转TBHP导致的SOD活性下降(图5C)。
本实验例的结果表明，tFNA预处理可降低活性氧产生，降低氧化应激，减少氧化损伤。
实验例4 tFNA对线粒体相关凋亡途径的影响
1.方法
使用125nM tFNA处理RGC-5细胞3小时，再用50μM的TBHP处理RGC-5细胞24h，进行如下检测：
1)流式细胞仪检测细胞凋亡率；
2)相差显微镜观察细胞形态；
3)qPCR检测细胞的caspase-3的表达；
4)使用免疫荧光、qPCR和Western blot检测Bax的表达；
5)使用免疫荧光、qPCR和Western blot检测BCL-2的表达。
2.结果
图6A和图6B分别显示tFNA可以预防TBHP导致的细胞凋亡和细胞外形改变。
图6C表明，tFNA预处理可减少TBHP导致的caspase-3的表达水平升高。
图7表明，tFNA预处理可减少TBHP导致的Bax表达水平上升，减少其对BCL-2的抑制。
图8表明，tFNA预处理可减少TBHP导致的BCL-2表达水平下降。
本实验例的结果表明，tFNA预处理，可以通过增加抑凋亡基因BCL-2的表达，减少促凋亡基因caspase-3和Bax的表达，进而抑制氧化应激导致的细胞凋亡。
实验例5 tFNA对Akt/Nrf2信号通路的影响
本实验例的目的是进一步确认tFNA对氧化应激的影响机制。
Akt/Nrf2信号通路在抗氧化和抗凋亡中扮演重要角色，激活Akt首先引起Nrf2和HO-1两个蛋白的级联放大反应。作为上游蛋白，Nrf2与存在于细胞质中的肌动蛋白锚定蛋白Keap1结合。当发生氧化应激时，AKT被磷酸化为pAkt，其激活Nrf2以从Keap1解离并移动至细胞核以进一步激活HO-1。作为该信号传导途径的重要组成部分，HO-1是一种具有多种功能的保护酶，包括抗氧化，抗凋亡和抗炎特性，以保护细胞。
1.方法
使用实验例4的方法处理RGC-5细胞，并做如下检测：
1)使用免疫荧光检测HO-1蛋白；
2)使用Western blot检测Nrf2、HO-1、Akt、pAkt的表达量。
2.结果
免疫荧光检测如图9A所示，tFNA预处理的细胞HO-1水平显著提高，图9B和图9C显示，tFNA预处理细胞的pAkt/Akt、Nrf2和HO-1均显著上调表达。
本实验例结果表明，tFNA可激活Akt/Nrf2信号通路，帮助细胞对抗氧化应激以及氧化应激导致的凋亡。
实验例6小鼠眼底渗漏模型实验
1.方法
1)造模
用戊巴比妥钠麻醉C57BL/6J雄性小鼠(6-8周龄)，并用1％托吡卡胺(日本大阪，Santen)扩张瞳孔，对小鼠进行激光光凝，产生四个激光点。这四个激光点是由532nm激光(Visulas 532S；Carl Zeiss Meditec，爱尔兰都柏林)以标准方式在视神经周围使用滑动灯传输系统和盖玻片作为接触玻璃放置在小鼠角膜上产生的。使用120mW的功率，50μm的光斑大小和100ms的持续时间诱发病变。只有那些产生气泡而没有出血的激光点(表明布鲁赫膜已穿孔)才被认为是有效的，并被纳入研究。
2)分组处理
造模成功后，将模型小鼠分为4组，每组6只。实验组注射TDN-155(实施例2制备)，tFNA组注射实施例1所得tFNA，155mimics组注射miR-155mimics(miR-155的人工模拟物)，对照组(CTRL)注射生理盐水。注射体积均为2μL，TDN-155、tFNA和miR-155mimics的浓度均为1μM。
注射方式：在第0天激光光凝后立即玻璃体内注射一次，在激光光凝后第4天再进行一次注射。
miR-155mimics序列同实施例2中的带接头的miR-155双链分子。
2.结果
高亮的区域代表激光击穿的视网膜引起的(血浆)渗漏区域。由图10可知，TDN-155组与其他组相比，渗漏区域明显减小。表明本发明的复合物TDN-155具有修复视网膜的作用，可用于治疗湿性AMD，效果显著优于单独使用tFNA或miR-155mimics。
综上，本发明的tFNA可以有效预防氧化应激和细胞凋亡，进而对视网膜神经节细胞起到良好的保护作用。将tFNA用于制备预防视网膜神经节细胞氧化应激的药物，将有助于治疗包括青光眼等视网膜神经节细胞氧化应激导致的疾病，具有十分良好的应用前景。
本发明的TDN-155组具有十分优良的视网膜修复功能，可用治疗湿性黄斑病变(包括湿性年龄相关性黄斑病变)。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 一种预防视网膜神经节细胞氧化应激和湿性黄斑病变的药物
<130> GYKH1118-2020P0111492CCZ
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
atttatcacc cgccatagta gacgtatcac caggcagttg agacgaacat tcctaagtct 60
gaa 63
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
acatgcgagg gtccaatacc gacgattaca gcttgctaca cgattcagac ttaggaatgt 60
tcg 63
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
actactatgg cgggtgataa aacgtgtagc aagctgtaat cgacgggaag agcatgccca 60
tcc 63
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
acggtattgg accctcgcat gactcaactg cctggtgata cgaggatggg catgctcttc 60
ccg 63
<210> 5
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
ttgacctgtg aattactact atggcgggtg ataaaacgtg tagcaagctg taatcgacgg 60
gaagagcatg cccatcc 77
<210> 6
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
uucacagguc aauuaaugcu aauugugaua ggggu 35
<210> 7
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
cccuaucaca auuagcauua auu 23

Claims (5)

1.DNA四面体和miR-155的复合物在制备预防或治疗湿性黄斑病变的药物中的用途；所述DNA四面体由序列如SEQ ID NO.1-4所述单链DNA经碱基互补配对形成。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是预防或治疗湿性年龄相关性黄斑病变的药物。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述DNA四面体和miR-155的复合物是由DNA四面体和miR-155通过接头序列碱基互补配对相连得到。
4.一种预防或治疗湿性年龄相关性黄斑病变的药物，其特征在于：所述药物以DNA四面体和miR-155的复合物为活性成分；所述DNA四面体由序列如SEQ ID NO.1-4所述单链DNA经碱基互补配对形成。
5.如权利要求4所述的药物，其特征在于：所述DNA四面体和miR-155的复合物是由DNA四面体和miR-155通过接头序列碱基互补配对相连得到。
CN202010950188.1A 2019-09-10 2020-09-10 一种预防视网膜神经节细胞氧化应激和湿性黄斑病变的药物 Active CN112007044B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

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CN2019108569386 2019-09-10
CN201910856938 2019-09-10

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CN112007044A CN112007044A (zh) 2020-12-01
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