CN105209619B - miR-204和miR-211及其用途 - Google Patents

miR-204和miR-211及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及能够提高对象的细胞中一种或多种miRNA水平的至少一种试剂、相关药物组合物、核酸、载体和宿主细胞，所述miRNA包含序列UUCCCUU，所述试剂用于治疗和/或预防视网膜营养不良，特别是以感光细胞退化为特征的那些。

Description

miR-204和miR-211及其用途
技术领域
本发明涉及至少一种能够提高对象的细胞中一种或多种miRNA水平的试剂、相关药物组合物、核酸、载体和宿主细胞，所述miRNA包含序列UUCCCUU，所述试剂用于治疗和/或预防视网膜营养不良，特别是以感光细胞退化为特征的那些。
背景技术
微小RNA(miRNA)是基因表达的转录后调控因子，其在生理和病理状态中的基础生物过程的控制方面起关键作用。越来越多的证据表明，miRNA可通过靶向功能上相关基因的基因网络来控制特定的功能通路。在人中，miRNA本身或其靶基因中突变导致的miRNA表达失调已与多种病理病症(如糖尿病、神经退行性疾病、心力衰竭和遗传性耳聋(1，2)等)相关。最近，miRNA也开始作为多种疾病的治疗性介入的新靶标。miRNA的治疗性功能已描述于多种癌症模型(3，4)、心脏病(5，6)、肌肉萎缩症(7)和肝疾病(8，9)中。miR-122的应用已进入临床，其中在以治疗丙型肝炎感染为目的方面处于I期试验(10)。因此，miRNA的治疗性应用代表现代医学中理想的研究领域，但其广泛应用需要正确了解由miRNA控制的基因表达变化。
视网膜是一种层状结构，由六个神经元和一个神经胶质细胞类型组成，其构成为三个细胞层：神经节细胞层(包含视网膜神经节(RGC)和移动性无长突细胞)、内核层(INL)(含有双极、水平和无长突中间神经原和穆勒胶质细胞(Müller glial cells))以及外核层(ONL)(其中有视杆细胞和视锥细胞)。视网膜紧邻视网膜色素上皮细胞(RPE)(一种滋养视网膜视细胞的色素细胞层)，并牢固连接下方的脉络膜和上方的视网膜视细胞(图20)。
遗传性视网膜营养不良(IRD)是西方遗传学眼盲的最常见病因之一。该类疾病的潜在主要病症是感光细胞(即将光信息转化为化学和电信号并随后通过视觉回路传输至脑的细胞)的退化。在人视网膜中存在两种类型的感光细胞：视杆细胞和视锥细胞。视杆细胞代表人视网膜中约95％的感光细胞并负责感知对比度、亮度和移动，而高分辨率、空间分辨率和色觉由视锥细胞感知。
IRD可细分为不同的疾病组，即色素性视网膜炎(RP)、莱伯先天性黑朦(LCA)、视锥细胞-视杆细胞营养不良和视锥细胞营养不良。
RP是遗传学视网膜营养不良的最常见形式，近似频率为约4000名个体中存在一名患者(11)。在其临床发作阶段，RP的特征是夜盲和进行性感光细胞退化，伴随骨针样色素沉积和降低或缺失的视网膜电图(ERG)。RP可以是分离的或综合征的，即与眼外表现(如在亚瑟综合征(Usher syndrome)和巴尔得-别德尔综合征(Bardet-Biedle syndrome)中)相关。从遗传观点来看，RP是高度异质性的，具有常染色体显性、常染色体隐性和X连锁的遗传模式。然而，很大百分比的RP患者是明显分散的。迄今为止，已发现约50个致病基因/基因座负责非综合征形式的RP并发现超过25个致病基因/基因座负责综合征RP(RETnet网站：http://www.sph.uth.tmc.edu/RetNet/)。
LCA的发病率为每100000个体中约2-3人，且特征为生命的第一个月/年开始的严重视觉缺陷(12)。LCA具有视网膜、眼睛和眼外特征，且偶尔是系统性相关联的。LCA在大部分患者中以常染色体隐性性状继承，而仅在少数病例中报道了常染色体显性继承。LCA具有遗传异质性，且迄今为止已在15种不同基因中鉴定到突变：GUCY2D(基因座名称LCA1)、RPE65(LCA2)、SPATA7(LCA3)、AIPL1(LCA4)、LCA5(LCA5)、RPGRIP1(LCA6)、CRX(LCA7)、CRB1(LCA8)、CEP290(LCA10)、IMPDH1(LCA11)、RD3(LCA12)、NMNAT1(LCA9)、LRAT(LCA14)、TULP1(LCA15)和RDH12(LCA13)。LCA的诊断由临床发现结果建立。对于目前已知与LCA相关的15种基因，分子遗传学测试是临床上可行的。总的来说，预测这些基因中的突变导致所有LCA病例中的约40％-50％，这依赖于征询工作。
视锥细胞-视杆细胞营养不良(CRD)发病率为1/40000个体，且特征为眼底检查时可见的视网膜色素沉积，其主要位于黄斑区。与典型的RP不同(其特征为先发生视杆感光细胞损失，随后发生视锥感光细胞损失)，CRD中事件顺序相反。CRD的特征为，主要涉及视锥细胞，或有时伴随视锥细胞和视杆细胞的共同损失，这解释了CRD的主要症状：视力减弱、色觉缺陷、厌光(photo-aversion)和中心视野灵敏度降低，随后是周边视野的进行性损失和夜盲(13)。已有至少20种不同基因中的突变与CRD相关(RETnet网址：http://www.sph.uth.tmc.edu/RetNet/)。
视锥细胞营养不良(CD)是其中视锥感光细胞显示选择性功能障碍且该选择性功能障碍不延伸至视杆细胞的病症。其特征为视觉缺陷、色觉异常、视野损失和不同程度的眼球震颤和畏光。在CD中，视锥功能在视网膜电图(ERG)和心理物理测试中缺失或严重受损(14)。与其他形式的遗传性视网膜营养不良类似，CD是异质性病症，可由至少10种不同基因中的突变导致(RETnet网址：http://www.sph.uth.tmc.edu/RetNet/)。
同样如上文所述，IRD归因于感光细胞的退化和随后的死亡，所述感光细胞在RP和LCA中主要是视杆细胞，而在CRD和CD中主要是视锥细胞。感兴趣的是，在RP和大多数形式的LCA中，视杆细胞退化之后是视锥细胞的继发性退化。大多数负责IRD的基因主要表达在感光细胞(视杆细胞或视锥细胞)中。一些IRD基因普遍表达在视网膜色素上皮细胞中。然而，同样在后一种情况中，这些基因失调的主要后果是感光细胞功能的损伤，其随后转化为感光细胞退化和死亡。对于大多数形式的上述疾病，目前没有有效的治疗方法。
作者目前正在研究miRNA用作遗传性视网膜营养不良中的治疗工具的可能性。作者最近研究了哺乳动物眼部发育的主要阶段期间miRNA的表达模式，并生成了迄今为止最具综合性的哺乳动物眼中miRNA的表达图谱(15，16)。
结果是，作者鉴定到了一个miRNA亚组，其显示在哺乳动物眼中具有显著的表达水平，其中有miR-204和miR-211。作者开始对后者miRNA进行详细的功能表征，大部分使用体内模型。具体而言，通过在青鳉鱼(Oryziaslatipes(ol))模式生物中使用功能获得和功能丧失方法，作者已于先前证明，miR-204活性的变化显著影响了眼分化和功能的多个方面。具体而言，吗啉代介导的miR-204表达消融导致特征为小眼畸形和改变的视网膜的背-腹(D-V)模式的眼表型，其导致视缺损(17)。
有趣的是，miR-204和miR-211是哺乳动物中密切相关的旁系同源物，其共有相同的种子区序列和相同的预测靶标组(TargetScan)(18)。其在小鼠中仅相差一个核苷酸且在人中仅相差两个核苷酸。
最近，已表明miR-204和miR-211对作为阻隔物的视网膜色素上皮细胞(RPE)的完整性和防止其异常增殖具有保护性作用(23)。
基于此，已提出向RPE递送这两种miRNA可对RPE分化和增殖异常导致的眼部疾病(包括玻璃体视网膜营养不良、黄斑变性和糖尿病视网膜营养不良)产生有益作用。
申请WO2010027838涉及通过给予miR-204、miR-211或miR-204和miR-211的混合物来预防或治疗有害视网膜上皮细胞增殖、视网膜上皮细胞分化丧失、年龄相关黄斑变性和/或增殖性玻璃体视网膜营养不良的方法。
文献WO2009137807涉及通过给予miR-211的抑制剂来诊断和/或治疗眼的血管疾病(特别是眼或视网膜/脉络膜新生血管疾病)的方法和组合物。这些方法涉及检测患者样品中一种或多种miRNA的水平，并使用测试结果诊断和/或预测针对该患者的最佳治疗方案。据称使用miR-211导致血管生成增加。
仍需要对遗传性视网膜营养不良的主要病症感光细胞退化和死亡具有保护性作用的疗法。在这类疾病中，异常RPE分化和增殖不起关键的致病性作用。
发明内容
本发明涉及miRNA miR-204和/或miR-211用于保护视网膜不发生神经元变性的应用。本发明的作者发现，视网膜内给予miR-204和/或miR-211(特别是在感光细胞内)对于感光细胞退化具有有益作用，且特别是在IRD中，包括视网膜色素变性(单独的和综合征形式)、莱伯先天性黑朦、视锥细胞-视杆细胞营养不良和视锥细胞营养不良。应注意，这表明通过体内给予感光细胞单种miRNA获得的疗效。
miRNA与一种或多种mRNA的部分或片段互补。此外，miRNA无需以绝对序列互补性来结合mRNA，这使得其能够调控大范围的靶转录本。miRNA通常以匹配的核苷酸之间具有缺口的形式结合靶序列。本文中，术语“绝对序列互补(性)”旨在描述需要各核苷酸对沿两条序列(如miRNA和靶基因或转录本)的长度结合且不存在缺口。术语“互补(性)”旨在描述两条序列中至少约50％的核苷酸从一条序列反式结合至另一条序列。
miRNA通常与mRNA转录本的3'UTR互补，然而，本发明的miRNA可结合靶mRNA的任何区域。或者或此外，miRNA靶向甲基化基因组位点，其对应于编码靶向的mRNA的基因。基因组DNA的甲基化状态部分决定了DNA对转录因子的可及性。同样地，DNA甲基化和去甲基化分别调控基因沉默和表达。
本发明的miRNA包括表1中的序列(SEQ ID NO.1-5)及其同源物和类似物、miRNA前体分子和编码所述miRNA的DNA分子。
表1
存在两种形式的成熟小鼠miR-204序列：5'-UUCCCUUUGUC AUCCUAUGCCU-3'(SEQID NO:1；miRBase登录号MIMAT0000237)和5'-UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCUG-3'(SEQ ID NO:2；GenBank登录号AJ560745)。基于对紧密连续成对物(closely run doublet)的观察，两种miRNA都存在于小鼠中。人成熟miR-204的序列为5'-UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU-3'(SEQ IDNO:3；miRBase登录号MIMAT0000265)。成熟小鼠miR-211的序列为5'-UUCCCUUUGUCAUCCUUUGCCU-S'；SEQ ID NO:4(miRBase登录号MIMAT0000668)。人成熟miR-211的序列为5'-UUCCCUUUGUC AUCCUUCGCCU-3'(SEQ ID NO:5；miRBase登录号MIMAT0000268)。
优选地，同源物与SEQ ID NO 1-5的序列的相同性可以是至少90％，更优选至少95％相同。
因此，本发明的一个目的是提供能够提高对象的一种或多种细胞中一种或多种miRNA水平的至少一种试剂，所述miRNA包含序列UUCCCUU，所述试剂用于治疗和/或预防视网膜营养不良。
序列UUCCCUU是种子序列。种子区与靶mRNA形成紧密的双链体。大多数miRNA与靶mRNA的3’非翻译区(UTR)具有不完美碱基配对，且miRNA的5'近端“种子”区提供了大多数的配对特异性。不受任何理论的约束，认为前九个miRNA核苷酸(包括种子序列)具有较高的特异性，而该区域的3’侧的miRNA核糖核苷酸序列允许较低的序列特异性并因此耐受较高程度的错配碱基配对，其中2-7位是最重要的。
在本发明中，该试剂优选选自miRNA、miRNA前体、成熟miRNA、miRNA模拟物或miRNA模拟物的混合物，编码所述miRNA、所述miRNA前体、所述成熟miRNA、所述miRNA模拟物或miRNA模拟物的混合物的RNA或DNA分子，或其任意组合。
优选地，所述试剂包含序列UUCCCUU或编码包含序列UUCCCUU的核苷酸序列。
优选地，包含序列UUCCCUU的至少一种miRNA是miR-204的成熟序列或miR-211的成熟序列。
应注意，成熟miRNA的长度通常是约19-24个核苷酸(及其间任何范围)，特别是21、22或23个核苷酸。然而，可以长度为约70至约100个核苷酸的前体形式提供miRNA(前体-miRNA)。应注意，可通过加工长度超过约100个核苷酸的初级转录本(初级-miRNA)来生成前体。
这样的miRNA通常是单链分子，而miRNA前体通常是至少部分自我互补的分子，其能够形成双链部分，例如茎和环结构。编码miRNA、前体-miRNA和初级-miRNA的DNA分子也包括在本发明中。这些核酸可选自RNA、DNA或核酸类似物分子，例如糖或主链修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。然而，应注意，其他核酸类似物(如肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA))也是合适的。
本发明的核酸分子可获自化学合成方法或重组方法，例如通过从合成的DNA模板中或分离自重组生物体的DNA质粒中酶促转录。通常，噬菌体RNA聚合酶用于转录，例如T7、T3或SP6RNA聚合酶。
本发明还涉及一种重组表达载体，其包含与表达控制序列可操作连接的重组核酸，其中，表达(即转录)和任选的进一步加工导致形成上文所述的miRNA分子或miRNA前体(初级-或前体-miRNA)分子。该载体可以是适用于真核细胞(更具体是哺乳动物细胞)中核酸表达的表达载体。所述载体中含有的重组核酸可以是导致上述miRNA分子、其前体或初级转录本转录的序列，其可进一步加工以得到miRNA分子。
所述试剂优选包含miR-204的成熟序列或miR-211的成熟序列。
在优选的实施方式中，所述试剂在递送载剂中提供，任选地，所述递送载剂选自病毒载体、微球、脂质体、胶体金颗粒、脂多糖、多肽、多糖或PEG化病毒载剂。
在优选的实施方式中，该视网膜营养不良的特征是感光细胞退化。优选地，该视网膜营养不良是遗传性视网膜营养不良。更优选地，遗传性视网膜退化选自：色素性视网膜炎(RP)、莱伯先天性黑朦(LCA)、视锥细胞-视杆细胞营养不良和视锥细胞营养不良。
本发明的另一个目的是提供一种用于治疗和/或预防视网膜营养不良的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种试剂和药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂，所述至少一种试剂能够提高一种或多种miRNA的水平，所述miRNA包含序列UUCCCUU，如上文所定义。
所述试剂优选选自：miRNA、miRNA前体、成熟miRNA、miRNA模拟物或miRNA模拟物的混合物，编码所述miRNA、所述miRNA前体、所述成熟miRNA、所述miRNA模拟物或miRNA模拟物的混合物的RNA或DNA分子，或其任意组合，所述试剂优选包含序列UUCCCUU或编码包含序列UUCCCUU的核苷酸序列，所述试剂优选包含miR-204的成熟序列或miR-211的成熟序列。
本发明的另一个目的是提供一种用于治疗和/或预防视网膜营养不良的核酸序列，所述核酸序列编码上文定义的试剂。
本发明的另一个目的是提供一种用于治疗和/或预防视网膜营养不良的重组表达载体，所述重组表达载体包含合适启动子控制下的上文所定义试剂的编码序列。
优选地，该合适的启动子是视紫红质启动子序列。
更优选地，上文所定义的重组表达载体还包含合适启动子控制下的负责视网膜营养不良的编码序列的一种或多种野生型。优选地，该合适的启动子是视紫红质启动子序列或驱动RPE表达的启动子。
优选地，负责视网膜营养不良的编码序列的一种或多种野生型选自SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:414。
SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:414的任意组合都适用于本发明。
优选地，该编码序列的野生型是AIPL1的编码序列。
在优选的实施方式中，上文定义的重组表达载体是AAV衍生物。
本发明的另一个目的是提供一种由上文所述重组病毒载体转化的宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供一种用于治疗和/或预防视网膜营养不良的药物组合物，其包含上文定义的核酸序列或上文定义的重组表达载体或上文定义的宿主细胞，和药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。
优选地，该药物组合物还包含合适启动子控制下的负责视网膜营养不良的编码序列的一种或多种野生型。
优选地，所述负责视网膜营养不良的编码序列的野生型插入其他分离或独立的重组表达载体中。
优选地，在上文定义的药物组合物中，负责视网膜营养不良的编码序列的一种或多种野生型选自SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:414。
优选地，该编码序列的野生型是AIPL1的编码序列。
优选地，上文定义的药物组合物用于眼内给药。
本发明的另一个目的是提供一种用于治疗和/或预防对象中视网膜营养不良的方法，包括向所述对象给予上文定义的试剂或上文定义的药物组合物或上文定义的核酸或上文定义的重组表达载体或上文定义的宿主细胞。
优选地，该视网膜营养不良的特征是感光细胞退化。
考虑本发明的治疗方法可与治疗视网膜营养不良的其他方法联用。其他治疗剂可包括神经保护性分子，如：生长因子如睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质源性神经营养因子(GDNF)、心肌营养素1、脑源性神经营养因子(BDNF)和基本成纤维细胞生长因子(bFGF)或视杆细胞源性视锥活力因子(如RdCVF和RdCVF2)。
在本发明中，负责视网膜营养不良(特别是以感光细胞退化为特征的视网膜营养不良，特别是遗传性视网膜营养不良)的编码序列的野生型选自以下基因：ABHD12、ACBD5、ADAM9、ADAMTS18、AIPL1、ARL2BP、ARL6、BBIP1、BBS1、BBS10、BBS12、BBS2、BBS4、BBS5、BBS7、BBS9、C21orf2、C2orf71、C8orf37、CACNA2D4、CDH23、CDH3、CDHR1、CEP290、CERKL、CIB2、CLRN1、CNGA1、CNGB1、CNNM4、CRB1、DFNB31、DHDDS、EMC1、EYS、FAM161A、GPR125、GPR98、GUCY2D、HARS、IDH3B、IMPG2、IQCB1、KCNJ13、KCNV2、KIAA1549、LCA5、LRAT、MAK、MERTK、MKKS、MKS1、MVK、MYO7A、NEK2、NMNAT1、OFD1、OTX2、PCDH15、PDE6A、PDE6B、PDE6C、PDE6G、PRCD、PROM1、RAB28、RAX2、RBP3、RD3、RDH12、RGR、RLBP1、RP2、RPE65、RPGR、RPGRIP1、SAG、SDCCAG8、SPATA7、TRIM32、TTC8、TTPA、TULP1、UNC119、USH1A、USH1C、USH1G、USH2A、ZNF513。相对编码序列是由SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:414组成的序列。
遗传性视网膜营养不良(IRD)是西方遗传学眼盲的最常见病因之一。该类疾病的潜在主要病症是感光细胞(即将光信息转化为化学和电信号并随后通过视觉回路传输至脑的细胞)的退化。IRD可细分为不同的疾病组，即色素性视网膜炎(RP)、莱伯先天性黑朦(LCA)、视锥细胞-视杆细胞营养不良和视锥细胞营养不良。本发明的试剂治疗和/或预防一种或多种这类疾病。
在本发明中，所考虑的能够提高一种或多种miRNA水平的试剂包括miRNA分子、单链或双链RNA或DNA多核苷酸、肽核酸(PNA)、蛋白质、小分子、离子、聚合物、化合物、抗体、胞内抗体、拮抗剂或其任意组合。该试剂可增大miRNA表达水平、活力和/或功能。
在一些方面中，能够提高一种或多种miRNA水平的试剂可以是RNA或DNA分子，其可含有至少一种修饰的核苷酸类似物，即天然产生的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸被非天然产生的核苷酸取代。修饰的核苷酸类似物可位于例如核酸分子的5’端和/或3’端处。
核苷酸类似物可选自糖或主链修饰的核糖核苷酸。但应注意，核碱基修饰的核糖核苷酸(即含有非天然产生的核碱基代替天然产生的核碱基的核糖核苷酸，如5位处具有修饰的尿苷和胞苷，如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；8位处具有修饰的腺苷和鸟苷，如8-溴鸟苷；去氮核苷酸，如7-去氮-腺苷；O-和N-烷基化的核苷酸，如N6-甲基腺苷)也是合适的。在糖修饰的核糖核苷酸中，2'-OH-基团被选自下组的基团取代：H、OR、R、卤素、SH、SR、NH 2、NHR、NR 2或CN，其中R是C 1-C 6烷基、烯基或炔基，且卤素是F、CI、Br或I。在优选的主链修饰的核糖核苷酸中，与相邻核糖核苷酸连接的磷酸酯基团被修饰的基团取代，例如硫代磷酸基团。应注意，上述修饰可联用。
在本发明中，“miR模拟物或类似物”是小双链RNA寡核苷酸，其可经化学修饰并模拟内源性miRNA，并能够通过上调miRNA活性来促进miRNA功能分析。该模拟或类似序列对应于miRNA成熟序列。
在本发明中，感光细胞退化是感光细胞的进行性恶化且最终死亡。
感光细胞退化和死亡是遗传性感光细胞退化的主要病症，特别是遗传性视网膜营养不良中的遗传性感光细胞退化。在感光细胞退化中，异常RPE分化和增殖不起关键的致病性作用。
本发明的试剂对于感光细胞退化具有治疗性活性，该作用不同于对于上皮细胞分化或增殖的作用。
在本发明中，miR-204/211表示miR-204和/或miR-211。大多数miRNA不完美地与靶mRNA的3’非翻译区(UTR)碱基配对，且miRNA的5’近端“种子”区具有大部分的配对特异性。不受任何理论的约束，认为前九个miRNA核苷酸(包括种子序列)具有较高的特异性，而该区域的3’侧的miRNA核糖核苷酸序列允许较低的序列特异性并因此耐受较高程度的错配碱基配对，其中2-7位是最重要的。可通过许多本领域已知的技术来生成miR-204、miR-211的模拟物或类似物。核糖的2’羟基可被烷基化，例如甲基化，以提高分子的稳定性。同样地，可通过使用氢取代2’位的羟基来修饰核糖，从而生成DNA主链。同样地，RNA序列的任何尿嘧啶碱基都可被胸腺嘧啶取代。这些仅仅是本领域技术人员能够完成的可能的修饰中的一些非限制性示例。
在本发明中，可通过视网膜下注射AAV构建体将miR-204和/或miR-211递送至视网膜。然而，重要的是指出成熟形式的miRNA也可以双链RNA寡核苷酸的形式(微小RNA模拟物)递送至视网膜，其递送可通过与其他分子结构联用或使用运载体(如脂质体或纳米颗粒)包封来得到增强(24)。此外，miR-204/211AAV构建体或miR-204/211模拟物都可以可注射悬浮剂、眼洗剂或眼用软膏的形式制备，其可使用非侵入性方法递送至视网膜。
可通过已知方法进行本发明的寡核苷酸的给药，其中在以体外或体内方式将核酸导入所需靶细胞中。
本发明的一个方面包括包含在递送载剂内的核酸构建体。递送载剂是可将核苷酸序列从至少一种介质运输至另一种介质的实体。递送载剂可通常用于核酸构建体内编码序列的表达和/或细胞内递送构建体。在本发明的范围内，该递送载剂可以是选自下组的载剂：基于RNA的载剂、基于DNA的载剂/载体、基于脂质的载剂、基于病毒的载剂和基于细胞的载剂。这类递送载剂的示例包括：生物可降解聚合物微球、基于脂质的制剂如脂质体运载体、在胶体金颗粒上包覆构建体、脂多糖、多肽、多糖、PEG化病毒载剂。
在本发明的一个实施方式中，可包括病毒作为递送载剂，该病毒可选自：腺病毒、反转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、泡沫病毒、巨细胞病毒、塞姆利基森林病毒、痘病毒、RNA病毒载体和DNA病毒载体。此类病毒载体为本领域熟知。
通常使用的基因转移技术包括磷酸钙、DEAE-右旋糖酐、转染、电穿孔和微注射以及病毒方法(30-34)。用于将DNA导入细胞的另一种技术是使用阳离子脂质体(35)。市售可得的阳离子液体制剂是例如Tfx 50(普洛麦格公司(Promega))或Lipofectamin 2000(生命技术公司(Life Technologies))。
本发明的组合物可以是溶液剂的形式，例如可注射溶液剂、乳膏剂、油膏剂、片剂、悬浮剂等。该组合物可以任何合适的方法给予，例如通过注射，特别是通过眼内注射、通过口服、局部、经鼻、直肠施用等。该运载体可以是任何合适的药物运载体。优选地，可以使用运载体，其能够提高RNA分子进入靶细胞的效率。这类运载体的合适示例是脂质体，特别是阳离子脂质体。
本发明的一个方面还包括含有一种或多种miRNA的药物组合物，其用于以适用于体内给药的生物相容的形式给予对象。本发明的miRNA可在上述表达载体内提供，其在合适的药物组合物中配制。
“适用于体内给药的生物相容的形式”指待给予的物质形式的治疗效果抵消任何毒性作用。给予治疗活性量的本发明的组合物或“有效量”定义为在一定剂量和作用时间下，有效于实现提高/降低蛋白质生成的所需结果的量。物质的治疗有效量可根据一些因素而变化，所述因素包含，例如疾病状态/健康、接受者的年龄、性别和体重、特定多肽、编码其的核酸或重组病毒引发所需应答的固有能力。可调节剂量方案以提供最佳治疗响应。例如，可每天或采取其它合适的时间间隔给予数个分开的剂量，或者该剂量可按治疗情况危急程度的指示按比例减少。用于给药的miRNA或miRNA调节剂的量可取决于给药途径、给药时间，并根据个体对象应答变化。合适的给药途径是肌内注射、皮下注射、静脉内注射或腹膜内注射、口服和鼻内给药。在IRD的情况下，优选将基于miRNA和/或miRNA调节剂的组合物注射至对象的视网膜中。本发明的组合物还可通过植入物提供，其可用于使该组合物随时间缓释。
在感光细胞退化的情况下，例如在IRD中(具体而言是色素性视网膜炎(RP)、莱伯先天性黑朦(LCA)、视锥细胞-视杆细胞营养不良和视锥细胞营养不良)，可以有效体积将本发明的基于miRNA和/或miRNA调节剂的组合物局部给予至眼，所述有效体积是约5微升至约75微升，例如约7微升至约50微升，优选约10微升至约30微升。本发明的miRNA在水性溶液中高度可溶。在眼中局部滴注体积大于75微升的miRNA可能会导致miRNA通过溢出和排出从眼中损失。因此，优选通过以约5微升至约75微升的体积局部滴注至眼的方式来给予高浓度的miRNA(例如1nM至100μM，优选范围为10至1000nM)。
在一个方面中，胃肠外给药途径可以是眼内给药。本发明的基于miRNA的组合物的眼内给药可通过注射或直接(如局部)给予至眼来实现，前提是给药途径允许miRNA进入眼。除上述对眼给药的局部途径外，合适的眼内给药途径还包括玻璃体内、视网膜内、视网膜下、眼筋膜囊下、眼球周边和眼球后、跨角膜和跨巩膜给药。这类眼内给药途径是本领域公知常识(36-39)。
本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并可用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计为用于增殖或扩增或用于表达或用于以上两种目的的那些，例如质粒和病毒。可使用标准DNA技术制备本发明的重组表达载体，参见例如Sambrook等同上和Ausubel等同上。环形或线形表达载体构建体可制备为含有在原核或真核宿主细胞中发挥功能的复制系统。
复制系统可来源于例如CoIEl、2μ质粒、λ、S V40、牛乳头瘤病毒等。
优选地，该重组表达载体包含调节序列，如转录和翻译起始和终止密码子，其是宿主类型(如细菌、真菌、植物或动物)特异性的，可在适当时并根据该载体是基于DNA还是基于RNA以将该载体导入宿主。该重组表达载体可包含一个或多个标志物基因，其允许选择转化或转染的宿主。标志物基因包括杀生物剂抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性，其在营养缺陷型宿主中互补以提供原养型，等等。用于本发明的表达载体的合适的标志物基因包括，例如，新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和青霉素抗性基因。该重组表达载体可包含天然或非天然启动子，其可操作地连接编码miR204、miR 211和/或其模拟物(包括其功能性部分和功能性变体)，或者连接与编码RNA的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列。启动子的选择(例如强、弱、可诱导、组织特异性和发育特异性)是在本领域公知常识的范围内。类似地，将核苷酸序列与启动子合并也在本领域公知常识的范围内。该启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、S V40启动子、RSV启动子和鼠干细胞病毒的长末端重复中发现的启动子。优选的启动子是视紫红质启动子。
本发明的重组表达载体可设计为瞬时表达、稳定表达或上述两种表达。同样地，这些重组表达载体可制备为用于组成型表达或可诱导表达。
本发明还提供了包含本发明所述重组表达载体中任一种的宿主细胞。本文中，术语“宿主细胞”指能够含有本发明的重组表达载体的任何类型的细胞。该宿主细胞可以是真核细胞(如植物、动物、真菌或藻类)，或者可以是原核细胞(如细菌或原生动物)。该宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即直接从生物体(如人)中分离。该宿主细胞可以是粘附性细胞或悬浮的细胞，即在悬浮液中生长的细胞。合适的宿主细胞是本领域已知的且包括例如DH5α、大肠杆菌细胞、中华仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。出于扩增或复制重组表达载体的目的，该宿主细胞优选是原核细胞，例如DH5α细胞。
本文中，术语“治疗”和“预防”及其衍生词不必表示100％或完全治疗或预防。而是，存在不同程度的治疗或预防，其被本领域技术人员认为具有潜在益处或疗效，在这一方面，本发明的方法可提供对例如哺乳动物中miR 204和/或miR 211相关病症的任何量或任何水平的治疗或预防。此外，本发明的方法提供的治疗或预防可包括待治疗或预防的疾病的一种或多种病症或症状。同样，出于本发明所述目的，“预防”可包括延迟疾病或其相关症状或病症的发生。“有效量”指适用于预防或治疗个体中以感光细胞退化为特征的疾病或病症的剂量。治疗或预防性应用的有效量取决于例如待治疗疾病或病症的阶段和严重程度，患者的年龄、体重和总体健康状态，以及主治医师的判断。剂量的大小还可由以下因素确定：所选择的化合物、给药方法、给药时机和频率以及伴随给予特点化合物和所需生理效果的任何不良副作用的存在、本质和程度。本领域技术人员应理解，多种疾病或病症可能需要涉及多次给药的延长的治疗，可能是在各轮或多轮给药中使用miR 204、miR 211和/或其模拟物。miR及其模拟物可在组合物(如药物组合物)中给予，所述组合物可包含至少一种赋形剂(如药学上可接受的赋形剂)以及其他治疗剂(例如其他miR和/或其模拟物)。该组合物可通过任意合适的途径给予，包括胃肠道外、外敷、口服或局部给药。
药学上可接受的赋形剂优选在使用条件下对miR和/或其模拟物是化学上惰性的且具有没有或几乎没有副作用。这类药学上可接受的运载体包括但不限于：水、盐水、Cremophor EL(西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.)，密苏里州圣路易斯)、丙二醇、聚乙二醇、醇及其组合。运载体的选择可部分由具体miR和/或其模拟物决定，以及由给予组合物的具体方法确定。因此，存在多种合适的组合物制剂。
在本发明的实施方式中，该药物组合物可以是例如丸剂、胶囊剂或片剂的形式，各自含有预定量的一种或多种活性化合物并优选经包衣以易于吞服，粉末剂或颗粒剂的形式，或溶液剂或混悬剂的形式。对于口服给药，细粉末或颗粒剂可含有稀释、分散和或表面活性剂且可存在于例如水中或糖浆中，以干燥状态存在于胶囊或小袋中，或存在于其中可包含助悬剂的非水溶液或悬浮液中，或存在于其中可包含粘合剂和润滑剂的片剂中。该药物组合物还可存在某些组分，例如甜味剂、调味剂、防腐剂(如抗微生物防腐剂)、助悬剂、增稠剂和/或乳化剂。在以液体溶液剂或混悬剂给予时，该制剂可含有一种或多种活性化合物和纯化的水。液体溶液剂或混悬剂中任选的组分包括合适的防腐剂(如抗微生物防腐剂)、缓冲剂、溶剂及其混合物。制剂中的组分可具有超过一种功能。
可以使用防腐剂。合适的防腐剂可包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。任选可使用两种或多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物的存在量通常是约0.0001％至约2％(以组合物总重量计)。合适的缓冲剂可包括，例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和多种其他酸和盐。任选可使用两种或多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物的存在量通常是约0.001％至约4％(以组合物总重量计)。以下用于口服、气溶胶、胃肠道外(例如皮下、静脉内、动脉内、肌内、皮内、腹膜内和鞘内)以及直肠给药的制剂仅是示例性的而不是限制性的。
适用于口服给药的制剂可由以下成分组成：(a)液体溶液，如溶解于稀释剂(如水、盐水或橙汁)中的有效量的化合物；(b)胶囊剂、小袋剂、片剂、锭剂和糖锭剂，其各自含有预定量的活性成分，如固体或颗粒形式；(c)粉末；(d)适当液体中的悬浮液；以及(e)合适的乳液。液体制剂可包含稀释剂，如水和醇，例如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇，其中科添加或不添加药学上可接受的表面活性剂、助悬剂或乳化剂。胶囊剂形式可以是普通的硬或软壳明胶类型，含有例如表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂，例如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。片剂形式能包含一种或多种乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和药学上相容的运载体。锭剂形式能包含调味料(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)中的活性成分，以及含有惰性基料(如明胶和甘油)或蔗糖中活性成分的软锭剂，和阿拉伯胶、乳液、凝胶等，其除活性成分以外还含有本领域已知的运载体。miR及其模拟物(单独或与其他合适组分联用)可配置为气溶胶制剂以通过吸入给予。可将这些气溶胶制剂置于加压可接受推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。其还可配制为非加压制剂的药物，例如在喷雾器或雾化器中。适于胃肠道外给予的制剂包括水性和非水性、等渗无菌注射溶液，能包含使该制剂与预期接受者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质，以及含有助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌混悬剂。miR及其模拟物可在药物运载体中的生理上可接受的稀释剂中给予，例如无菌液体或液体混合物，包括水、盐水、水性右旋糖和相关糖溶液、醇(如乙醇、异丙醇或十六醇)、二醇(如丙二醇或聚乙二醇)、甘油缩酮(如2,2-二甲基-1,3-二氧环戊烷-4-甲醇)、醚(如聚(乙二醇)400)、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯、或添加或不添加药学上可接受的表面活性剂(如皂或去垢剂)的乙酰化脂肪酸甘油酯、助悬剂(如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)或乳化剂和其他药学佐剂。
可用于胃肠道外制剂的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体示例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉花籽油、玉米油、橄榄油、凡士林油和矿物油。可用于胃肠道外制剂的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的示例。
用于胃肠道外制剂的合适的皂可包括脂肪碱金属、铵和三乙胺盐，且合适的去垢剂包括(a)阳离子型去垢剂，例如二甲基二烷基卤化铵和卤化烷基吡啶嗡，(b)阴离子型去垢剂，例如烷基、芳基和烯烃磺酸盐，烷基、烯烃、醚和单甘油磺酸盐，以及磺基琥珀酸酯，(c)非离子型去垢剂，例如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺和聚氧乙烯-聚丙烯共聚物，(d)两性去垢剂，例如烷基-β-氨基丙酸盐/酯和2-烷基-咪唑啉季铵盐，以及(3)其混合物。
合适的防腐剂或缓冲剂可用于这类制剂。为最小化或消除注射位点处的刺激，这类组合物可含有一种或多种非离子型表面活性剂，其具有约12至约17的亲水亲油平衡值(HLB)。这类制剂中表面活性剂的量为约5重量％至约15重量％。合适的表面活性剂包括聚乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯，例如脱水山梨醇单油酸酯和环氧乙烷与疏水性碱的高分子量加合物，其由环氧丙烷与丙二醇的浓缩形成。这些胃肠道外制剂可存在于单位剂量或多重剂量密封容器中，例如安瓿和小瓶，并可储存于冷冻干燥(冻干)状态下，仅需要在使用前加入无菌液体运载体，例如注射用水。可由无菌粉末剂、颗粒剂和片剂制备临时注射溶液剂和混悬剂。
miR及其模拟物可以可注射制剂的形式给予。用于可注射组合物的有效药物运载体的要求是本领域技术人员熟知的。参见Pharmaceutics and Pharmacy Practice(《药理学和药剂学实践》)，JBL公司(J.B.Lippincott Co.)，宾夕法尼亚州费城，Banker和Chalmers编，第238-250页(1982)，以及ASHP Handbook on Injectable Drugs(《可注射药物的ASHP手册》)，Toissel，第4版，第622-630页(1986)。局部制剂(包括可用于透皮药物释放的那些)是本领域技术人员熟知的并可适用于本发明的实施方式以用于向皮肤施用。
药物制剂中本发明的实施方式的化合物的粘度可以变化，例如，根据所选的具体给药方式，从小于约1重量％(通常是或至少约10重量％)至多达20重量％至50重量％或更多，并可主要通过流体体积或粘度选择。用于制备可给药(如可胃肠道外给药)的组合物的方法对本领域技术人员而言是已知和显而易见的并更详细地描述于例如Remington'sPharmaceutical Science(《雷明顿药物科学》)(第17版，马克出版公司(Mack PublishingCompany)，宾夕法尼亚州伊斯顿，1985)。除了前述药物组合物外，miR及其模拟物还可配制为包合配合物，例如环糊精包合配合物或脂质体。脂质体可用于将miR及其模拟物靶向至特定组织。脂质体还可用于提高miR及其模拟物的半衰期。许多方法可用于制备脂质体，例如参见Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9:467(1980)和美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369。
当本发明的试剂(如miR、miR模拟物)与一种或多种其他治疗剂一起给予时，可向哺乳动物共同给予一种或多种其他治疗剂。“共同给予”指给予一种或多种其他治疗剂和miR和/或其模拟物在时间上足够接近，使得miR和/或其模拟物能够增强一种或多种其他治疗剂的效果。在这一方面，可首先给予miR和/或其模拟物并其次给予一种或多种其他治疗剂，反之亦然。或者，可同时给予一种或多种其他治疗剂和miR和/或其模拟物。其他治疗剂可以是重组表达载体，所述重组表达载体包含适当启动子的控制下的负责遗传性视网膜营养不良的编码序列的野生型形式。其他治疗剂可包括神经保护性分子，如：生长因子如睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质来源的神经营养因子(GDNF)、心肌营养素1、脑来源的神经营养因子(BDNF)和基本成纤维细胞生长因子(bFGF)或视杆细胞来源的视锥活力因子(如RdCVF和RdCVF2)。
用于本发明的实施方式的递送系统可包括时释、迟释和缓释递送系统，使得本发明的组合物的递送先于(或有足够时间导致)待治疗位点的敏化。本发明的组合物可与其他治疗剂或治疗联用。这类系统可避免重复给予本发明的组合物，从而提高对象和医师的便利性，并可特别适用于本发明的某些组合物实施方式。许多类型的释放递送系统是本领域技术人员可以获得和已知的。包括基于聚合物的系统，例如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯(copolyoxalate)、聚己内酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、多羟基丁酸和聚酐。含前述聚合物的药物的微胶囊描述于例如美国专利5,075,109。递送系统还包括是脂质的非聚合物系统，包括固醇如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪如单、双或三甘油酯；水凝胶递送系统；硅橡胶(sylastic)系统；基于肽的系统；蜡包衣；使用常规粘合剂和赋形剂的压缩的片剂；部分融合的植入物；等。具体的示例包括但不限于：(a)侵蚀系统，其中活性组合物以基质内的形式包含在内，例如参见美国专利4,452,775、4,667,014、4,748,034和5,239,660以及(b)扩散系统，其中活性组分以受控速率从聚合物向外弥漫，例如参见美国专利3,832,253和3,854,480。此外，可以使用基于泵的硬件递送系统，其中一些适用于植入。
通过参考下图非限制性实施例阐述本发明。
图1.使用AAV.CMV.前体miR204注射的眼的ONL中的miR-204表达水平。(A)激光捕获显微切割(LCM)之前(左图)和之后(右图)的视网膜切片。将含有外核层(ONL)的显微切割样品收集起来用于RNA提取。(B)对三只动物的LCM收集的ONL的miRNA表达谱分析，对这些动物在6周龄时使用AAV进行视网膜下注射并在3周后处死。对使用AAV.CMV.前体miR204(204inj)和AAV.CMV.EGFP(EGFP)注射的视网膜中提取的总RNA进行RT-qPCR以测定表达水平。个体miRNA的表达水平针对sno234的水平标准化，该sno234用作对照。视网膜下给予AAV.CMV.前体miR204载体使miR-204与内源性水平相比提高1.5至2倍。miR-124的水平不显著变化。缩写：GCL，神经节细胞层；INL，内核层；ONL，外核层；RPE，视网膜色素上皮细胞。
图2.P4时视网膜下递送AAV.CMV.EGFP和AAV.CMV.前体miR204载体后来自Aipl1–/–小鼠的视网膜的组织学分析。(A)P21时视网膜切片的DAPI染色。使用AAV.CMV.EGFP对照载体注射的Aipl1–/–眼的ONL中仅存在一排细胞核(A中方图)。而使用AAV.CMV.前体miR204载体注射的对侧眼的ONL处细胞核的排数和密度都增加(B中方图)。其他视网膜层(INL、IPL和GCL)似乎未受影响。(C)该图显示与对侧眼(使用对照载体注射)相比经治疗的眼(n＝11)中感光细胞细胞核的平均排数。缩写：ONL，外核层；INL，内核层；IPL，内网层；GCL，神经节细胞层。
图3.出生后第4天(P4)时视网膜下递送AAV.CMV.EGFP和AAV.CMV.前体miR204载体后来自Aipl1–/–小鼠的视网膜的免疫组织学分析。P21时视网膜切片上视杆细胞标志物视紫红质(A，B)和视锥细胞标志物视锥抑制蛋白(C，D)免疫标记的共聚焦显微图像。与使用EGFP对照载体注射的对侧眼相比，在使用AAV.CMV.前体miR204载体注射的眼的ONL处观察到视杆细胞和视锥细胞标志物的染色增加。这些切片的DAPI染色示于E或F。缩写：ONL，外核层；INL，内核层；IPL，内网层；GCL，神经节细胞层。
图4.出生后第4天(P4)时视网膜下递送AAV.CMV.EGFP和AAV.CMV.前体miR204载体后来自Aipl1–/–小鼠的视网膜的M视蛋白免疫标记。P21时视网膜切片上视锥细胞标志物M-视蛋白(A，B)的共聚焦显微图像。与使用EGFP对照载体注射的对侧眼相比，在使用AAV.CMV.前体miR204载体注射的眼的ONL处观察到M-视蛋白的染色增加。这些切片的DAPI染色示于C或D。缩写：ONL，外核层；INL，内核层；IPL，内网层；GCL，神经节细胞层。
图5.AAV介导的miR-204和hAIPL1基因的组合递送后Aipl1–/–小鼠中视网膜结构的部分保持。P30时视网膜切片的DAPI染色显示，与仅注射AAV.CMV.hAIPL1的对侧眼(A)相比，在P4时视网膜下同时注射两种不同载体(AAV.CMV.前体miR204以及AAV.CMV.hAIPL1)后(B)，Aipl1–/–小鼠中视网膜厚度(感光细胞细胞核数目)的部分保留。
图6.出生后第4天AAV介导的miR-204递送后P347S视紫红质转基因小鼠的视网膜功能。在P347S小鼠中，AAV.CMV.前体miR204的视网膜下注射(n＝16)导致注射后一个月视网膜功能的改善，表示为与使用对照构建体AAV.CMV.EGFP注射的对侧眼相比(n＝16)，b波ERG振幅统计学上显著地增加(P<0.05)。
图7.出生后第4天AAV介导的miR-204递送后视紫红质P347S转基因小鼠的视网膜功能。P347S小鼠中AAV.CMV.前体miR204的视网膜下递送后获得的视网膜功能的改善持续长达注射后至少2个月，表示为与使用对照AAV.CMV.EGFP注射的对侧眼相比，经治疗的眼中b波ERG振幅增加(n＝7)。
图8.AAV介导的miR-204递送后P347S小鼠中感光细胞标志物的免疫组化分析。P40视网膜切片上视锥标记物M-视蛋白(A,B)和S-视蛋白(E,F)的共聚焦显微图像。与对侧的对照眼相比，在使用AAV.CMV.前体miR204载体注射的眼中观察到这些标志物的染色增加。这些切片的DAPI染色分别示于C、D、G或H。缩写：ONL，外核层；INL，内核层；IPL，内网层；RPE，视网膜色素上皮细胞。
图9.AAV介导的miR-204递送后P347S小鼠中视网膜细胞死亡的减少。(A,B)来自使用AAV.CMV.前体miR204(B)和对照载体(A)注射的眼的TUNEL染色的视网膜切片的共聚焦显微图像。这些切片的DAPI染色示于C或D。缩写：ONL，外核层；INL，内核层；IPL，内网层。(E)通过对来自连续切片、定向的眼的相应切片进行计数来定量TUNEL阳性感光细胞的数目。与使用对照载体注射的对侧眼相比，注射AAV.CMV.前体miR204后P347S小鼠的视网膜中凋亡的感光细胞数目显著减少(70％,P<0.001)(n＝5个视网膜；误差线是SEM；***p<0,001)。
图10：AAV介导的miR-204递送后P347S小鼠中视网膜胶质细胞增生的减少。P40视网膜切片上抗谷氨酰胺合成酶(GS6)免疫标记的共聚焦显微图像(A,B)。与对侧对照眼相比，在使用AAV.CMV.前体miR204载体注射的眼中观察到活化的视网膜小胶质细胞数目的减少(由GS6的染色检测)。这些切片的DAPI染色示于C或D。缩写：ONL，外核层；INL，内核层；IPL，内网层。
图11.出生后第4天时AAV介导的视紫红质(感光细胞特异性)启动子控制下miR-204过表达后P347S视紫红质转基因小鼠的视网膜功能。在P347S小鼠中，视网膜下注射AAV.RHO.前体miR204(n＝5)，其中前体miR-204在感光细胞特异性(视紫红质)启动子控制下，导致视网膜功能的改善，表示为与注射对照AAV.CMV.EGFP(n＝5)的对侧眼相比，治疗的眼中b波ERG振幅统计学显著地增加。
图12.出生后第4天AAV介导的miR-211递送后P347S视紫红质转基因小鼠中视网膜功能的改善。在P347S小鼠中，视网膜下注射AAV.CMV.前体miR204(n＝4)和AAV.CMV.前体miR211(n＝9)都导致与注射对照AAV.CMV.EGFP(n＝7)的对侧眼相比，治疗的眼中b波ERG振幅出现高度类似的增加。
图13.AAV介导的miR-211递送后P347S小鼠中视锥细胞标志物的免疫组化分析。P40视网膜切片上视锥标志物M-视蛋白(A,B)和S-视蛋白(E,F)的荧光显微图像。与对侧的对照眼相比，在使用AAV.CMV.前体miR211载体注射的眼中观察到这些标志物的染色增加。这些切片的DAPI染色分别示于C、D、G或H。缩写：ONL，外核层；INL，内核层；IPL，内网层；GCL，神经节细胞层。
图14.AAV介导的miR-204递送后的成年阶段野生型C57/BL6小鼠的视网膜功能。在成年野生型小鼠中，视网膜下注射AAV.CMV.前体miR204不会损害视网膜功能，表示为治疗的眼(n＝35)中的b波ERG响应与注射对照AAV.CMV.EGFP的对侧眼(n＝35)类似。
图15.在出生后第4天AAV介导的miR-204递送后野生型C57/BL6小鼠的视网膜功能。在野生型幼鼠中，出生后第4天(P4)视网膜下注射AAV.CMV.前体miR204不会显著损害视网膜功能，表示为治疗的眼(n＝13)中的b波ERG响应与注射对照AAV.CMV.EGFP的对侧眼(n＝12)类似。
图16.出生后第4天AAV介导的miR-204递送后P347S视紫红质转基因小鼠的视网膜功能。在P347S小鼠中，AAV.CMV.前体miR204的视网膜下注射(n＝39)导致注射后一个月视网膜功能的改善，表示为与使用对照构建体AAV.CMV.EGFP注射的对侧眼相比(n＝56)，b波ERG振幅统计学上显著地增加(P<0.05)。
图17.AAV介导的miR-204/211递送后的成年阶段野生型C57/BL6小鼠的视网膜功能。在成年野生型小鼠中，视网膜下注射AAV.CMV.前体miR204/miR211不会损害视网膜功能，表示为治疗的眼(n＝11)中的b波ERG响应与注射对照AAV.RHO.EGFP的对侧眼(n＝11)类似。
图18.来自成年野生型小鼠的视网膜切片中的miR-204/211表达。使用miRCURYTMLNA检测探针(Exiqon)对miR-204进行RNA ISH。在神经视网膜中，miR-204/211强力表达于INL和GCL而在感光层(ONL和OS)未检测到表达。缩写：GCL，神经节细胞层；INL，内核层；IPL，内网层；ONL，外核层。
图19.3个月时miR-211敲除小鼠中的视网膜功能。与野生型(WT)相比，观察到miR-211纯合(OMO)和杂合(HET)KO小鼠中b波ERG振幅的统计学显著降低(P<0.05)。
图20.人眼。a)人眼的示意图。b)人视网膜的截面图，显示其分层结构，由以下层组成：(1)神经节细胞层，其轴突形成视神经，其将视网膜与脑连接；(2)内核层，其含有二级神经元，例如双极、无长突和水平细胞；(3)感光细胞(PR)的外核层，其含有视杆细胞和视锥细胞的细胞体和细胞核；(4)PR外节，其与含视蛋白的盘致密堆积且由狭窄的200–500nm长衔接纤毛(不可见)与内节和细胞体隔开；以及(5)视网膜色素上皮细胞(RPE)，含有紧密连接的单层细胞，其将神经视网膜与脉络膜隔开，后者向RPE和PR(外视网膜)供血。应注意，感光细胞存在于层(3)和(4)且与RPE(5)显著不同。修改自：Photoreceptor degeneration:genetic and mechanistic dissection of a complex trait(感光细胞退化：复杂性状的遗传和机械解析).Wright AF,Chakarova CF,Abd El-Aziz MM,Bhattacharya SS.Nat RevGenet.2010年4月；11(4):273-84。
发明详述
材料与方法
序列
>hsa-mir-204SEQ ID NO:6
-成熟序列(粗体)从碱基33至碱基54
-种子序列(下划线)从碱基33至碱基39
>mmu-mir-204SEQ ID NO:7
-成熟序列(粗体)从碱基6至碱基27
-种子序列(下划线)从碱基6至碱基12
>hsa-mir-211SEQ ID NO:8
-成熟序列(粗体)从碱基26至碱基47
-种子序列(下划线)从碱基26至碱基32
>mmu-mir-211SEQ ID NO:9
-成熟序列(粗体)从碱基26至碱基47
-种子序列(下划线)从碱基26至碱基32
>pAAV.CMV.前体miR204SEQ ID NO:10
下划线序列是前体-miR204的序列
AGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTAT
TTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCAGGCGGCCGCCTGTTCAGGACTTGGCTAAGCATTGCTTTGAACAAAATAT CAAACAAGGACTCAAGGGGCAGAGAATGCTGGTCAGTGGCTAAGATGCCGGAGAATCAAGATGAGCAGGAAATGAAG AGGTTGGCTAAGAGGGGCAGAGGAGGCAGGCGGAGGAGCTCCTGACCGTGTACCATGGCTACAGTCCTTCTTCATGT GACTCGTGGACTTCCCTTTGTCATCCTATGCCTGAGAATATATGAAGGAGGCTGGGAAGGCAAAGGGACGTTCAATT GTCATCACTGGCATCTTTTTTGATCATTACACCATCATCAAAAGCATTTGGATAACCATAACATGAAAATTACCATC ATTGAGCCCATAACTTTCCTAAGACAAGGGTGACAATTTGAAACATCAAAGAACCTTACCCAGGGAATTCAAGAAGT GAGAAGAGTGAATCAGATTCTCCCAGATTAACAACCCCATGTTGGATCCAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGAGATCTGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGACTCGAGTTAAGGGCGAATTCCCGATTAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCCGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGCTGGAGTTCACGTTCCTCAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAATAGTGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGCGGTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAG
>pAAV.CMV.前体miR211SEQ ID NO:11
下划线序列是前体-miR211的序列
AGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTAT
TTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCAGGCGGCCGCTCTGACCATGCAATCACAGGTGTGGGGGCATC CACTAGAGTGTGGTCAACCTATCAGGGCCGCACACTTAAAAAAAAAAACTGACTCCCTTCCCACAGAAGGGAATTTG TCAACTCCTCCCCACCCTCATGCTGGAATACTGACCGGCTTGATCCTGTGCAGCCAGCCACACTGTGAGTTCATGAG TGCGGAGGTCCTAAGAATCAGATCTTGGTGGATAAATCAGTTTGATTTAGTGTTTTTGGACTTGTAAATTCTGCTTG GACCTGTGACCTGTGGGCTTCCCTTTGTCATCCTTTGCCTAGGCCTCTGAGTGAGGCAAGGACAGCAAAGGGGGGCT CAGTGGTCACCTCTACTGCAGAGAGTTCAGAAGCCTAGCCTGAGCCAAGAGCAAGTTCTTCTCTGCTTCTGGAAATG AAGTCGCCATGATCCTGACGATGTAAAAATCCCAAGCACGCTTGGATGGAAATCTCAGAGACAGACGATGCCACCCT GATCCATTGGATCCAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGAGATCTGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGACTCGAGTTAAGGGCGAATTCCCGATTAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCCGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGCTGGAGTTCACGTTCCTCAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAATAGTGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGCGGTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAG
pAAV.RHO.前体miR204SEQ ID NO:12
下划线序列是前体-miR204的序列
粗体序列是人RHO启动子的序列
pAAV.RHO.前体miR211SEQ ID NO:13
下划线序列是前体-miR211的序列
AGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCAGATCTTCCCCACCTAGCCACCTGGCAAACTGCTCCTTCTCTCAAAGGCCCAAACATGGCCTCCCAGACTGCAACCCCCAGGCAGTCAGGCCCTGTCTCCACAACCTCACAGCCACCCTGGACGGAATCTGCTTCTTCCCACATTTGAGTCCTCCTCAGCCCCTGAGCTCCTCTGGGCAGGGCTGTTTCTTTCCATCTTTGTATTCCCAGGGGCCTGCAAATAAATGTTTAATGAACGAACAAGAGAGTGAATTCCAATTCCATGCAACAAGGATTGGGCTCCTGGGCCCTAGGCTATGTGTCTGGCACCAGAAACGGAAGCTGCAGGTTGCAGCCCCTGCCCTCATGGAGCTCCTCCTGTCAGAGGAGTGTGGGGACTGGATGACTCCAGAGGTAACTTGTGGGGGAACGAACAGGTAAGGGGCTGTGTGACGAGATGAGAGACTGGGAGAATAAACCAGAAAGTCTCTAGCTGTCCAGAGGACATAGCACAGAGGCCCATGGTCCCTATTTCAAACCCAGGCCACCAGACTGAGCTGGGACCTTGGGACAGACAAGTCATGCAGAAGTTAGGGGACCTTCTCCTCCCTTTTCCTGGATCCTGAGTACCTCTCCTCCCTGACCTCAGGCTTCCTCCTAGTGTCACCTTGGCCCCTCTTAGAAGCCAATTAGGCCCTCAGTTTCTGCAGCGGGGATTAATATGATTATGAACACCCCCAATCTCCCAGATGCTGATTCAGCCAGGAGCTTAGGAGGGGGAGGTCACTTTATAAGGGTCTGGGGGGGTCAGAACCCAGAGTCATCCGCCTGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCT 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TGGAAATCTCAGAGACAGACGATGCCACCCTGATCCATTGGATCCAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGAGATCTGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGACTCGAGTTAAGGGCGAATTCCCGATTAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCCGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGCTGGAGTTCACGTTCCTCAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAATAGTGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGCGGTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAG
pAAV.RHO.EGFPSEQ ID NO:14
AGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCAGATCTTCCCCACCTAGCCACCTGGCAAACTGCTCCTTCTCTCAAAGGCCCAAACATGGCCTCCCAGACTGCAACCCCCAGGCAGTCAGGCCCTGTCTCCACAACCTCACAGCCACCCTGGACGGAATCTGCTTCTTCCCACATTTGAGTCCTCCTCAGCCCCTGAGCTCCTCTGGGCAGGGCTGTTTCTTTC
CATCTTTGTATTCCCAGGGGCCTGCAAATAAATGTTTAATGAACGAACAAGAGAGTGAATTCCAATTCCATGCAACAAGGATTGGGCTCCTGGGCCCTAGGCTATGTGTCTGGCACCAGAAACGGAAGCTGCAGGTTGCAGCCCCTGCCCTCATGGAGCTCCTCCTGTCAGAGGAGTGTGGGGACTGGATGACTCCAGAGGTAACTTGTGGGGGAACGAACAGGTAAGGGGCTGTGTGACGAGATGAGAGACTGGGAGAATAAACCAGAAAGTCTCTAGCTGTCCAGAGGACATAGCACAGAGGCCCATGGTCCCTATTTCAAACCCAGGCCACCAGACTGAGCTGGGACCTTGGGACAGACAAGTCATGCAGAAGTTAGGGGACCTTCTCCTCCCTTTTCCTGGATCCTGAGTACCTCTCCTCCCTGACCTCAGGCTTCCTCCTAGTGTCACCTTGGCCCCTCTTAGAAGCCAATTAGGCCCTCAGTTTCTGCAGCGGGGATTAATATGATTATGAACACCCCCAATCTCCCAGATGCTGATTCAGCCAGGAGCTTAGGAGGGGGAGGTCACTTTATAAGGGTCTGGGGGGGTCAGAACCCAGAGTCATCCGCCTGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGC
CATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCG
ATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATAAGCTTGGATCCAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGAGATCTGCCTCGACTGTGCCTTCT
AGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGACTCGAGTTAAGGGCGAATTCCCGATTAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCG
CTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCCGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGCTGGAGTTCACGTTCCTCAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGA
GTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAATAGTGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGT
TATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGC
TATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGCGGTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAG
pAAV 2.1CMV hAIPL1(粗体CMV启动子；双下划线)SEQ ID NO:15
pAAV2.1CMV-eGFP(CMV启动子；绿色)SEQ ID NO:16
质粒构建
通过两步克隆方案构建含有巨细胞病毒(CMV)启动子控制下的miR-204和miR-211的鼠前体序列的重组AAV载体。最初，使用以下两组寡核苷酸从小鼠基因组DNA中扩增含有miR-204和miR-211的前体的盒：5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTGTTCAGGACTTGGCTAAG-3’(SEQ IDNO:17)和5’-CGCGGATCCAACATGGGGTTGTTAATCTG-3’(SEQ ID NO:18)用于miR-204；5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCTGACCATGCAATCACAG-3’(SEQ ID NO:19)和5’-CGCGGATCCAATGGATCAGGGTGGCATC-3’(SEQ ID NO:20)用于miR-211。将所得的扩增子亚克隆至TA载体(英杰公司)并通过Not I和BamH I消化后释放。随后将片段克隆至pAAV2.1-CMV-EGFP质粒(25)的Not I-BamH I位点并用于生成AAV2/8载体。
通过交换pAAV.CMV.前体miR204的CMV启动子与视紫红质(RHO)启动子序列来生成载体，其中前体miR-204的表达在感光细胞特异性启动子(pAAV.RHO.前体miR-204)的控制下。简言之，通过使用Nhe I和Not I限制性酶切从pAAV2.1-RHO-EGFP质粒(25)中释放对应于人视紫红质启动子的序列并将其克隆于先前使用相同酶消化的pAAV.CMV.前体miR204主链。
为生成表达hAIPL1的载体(pAAV2.1-CMV-hAIPL1)，使用引物hAIPL1-NotI-正向(5’-ATATGCGGCCGCCATGGATGCCGCTCTGCTCCT-3’)SEQ ID NO:21和hAIPL1-HindIII-反向(5’-ACGCGTAAGCTTTTATCAGTGCTGCAGCGAGTGCC-3’)SEQ ID NO:22从人视网膜cDNA(生物链公司(BioChain)，加利福尼亚州海沃德)中扩增hAIPL1基因的编码序列并将其在使用Not I和Hind III消耗后克隆至pAAV2.1-CMV-EGFP。
AAV病毒生产
根据他处所述方法(26)，通过TIGEM AAVInjection Core生成重组AAV2/8病毒。对于各病毒制剂，使用Taqman(27)通过PCR定量来测定物理效价(每毫升的基因组拷贝(GC/ml))。
动物方法
所有小鼠研究都严格遵循动物研究的研究所指南和眼科和视觉研究中动物使用的视觉和眼科研究协会(ARVO)声明。所有手术都在麻醉下进行，且做出了最小化痛苦的所有努力。
在4℃下通过降低体温2分钟对出生后小鼠进行麻醉并使用对应于1x109个基因组拷贝(GC)的1μl AAV载体在背侧视网膜区域中进行视网膜下注射。对相同个体进行全部手术过程以最小化注射技术中的差异性。通过颈脱位法处死动物。
以2ml/100g体重通过腹膜内注射阿佛丁(1.25％w/v的2,2,2-三溴乙醇和2.5％v/v的2-甲基-2-丁醇；西格玛奥德里奇公司(Sigma–Aldrich)，密苏里州圣路易斯)来麻醉成年小鼠，并通过经巩膜经脉络膜方法递送病毒载体，如先前所述(28)。使用1ul包含9:1v/vAAV.CMV.前体miR204/211和AAV.CMV.EGF的混合物在一个眼中对小鼠进行注射。使用1ul的AAV.CMV.EGFP注射对侧眼病用作对照。注射后(17-30天后)通过检眼镜检查评估转导程度并收获眼。
激光捕获显微切割
使用LMD 6500显微镜对PEN膜切片上的冷冻视网膜截面进行显微切割。将切片在含预冷的75％乙醇(EtOH)的DEPC水中固定2小时，随后用DEPC水清洗两次每次30秒并在迈耶苏木精7μM中染色1分钟。在细胞核苏木精染色后，将切片用DEPC水清洗两次每次30秒并在EtOH 70％、EtOH 80％、EtOH 90％、EtOH 100％(两次)中脱水(每次30秒)并空气干燥15分钟。用于显微切割的激光参数是：功率(Power)60、光圈(Aperture)7、速度(Speed)7、试样平衡(Specimen balance)46和补偿(Offset)25。
miRNA表达分析
在分别来自整个视网膜和视杯的样品上对给予AAV.CMV.EGFP和AAV.CMV.前体miR204/211的小鼠进行miRNA表达分析。根据生产商的说明书使用miRNeasy试剂盒(凯杰公司(Qiagen,Inc.)，德国希尔登)提取全RNA并使用NanoDrop 1000(塞默飞科学公司(ThermoFischer Scientific)，马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行定量。通过凝胶电泳评估RNA质量。
使用微小RNA试验(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，加利福尼亚州福斯特城)进行成熟miR-204、miR-124a和sno234的基于定量(q)反转录(RT-)PCR的检测。所有反应都重复三次。记录为循环数目阈值(Ct)的qRT-PCR结果对sno234参考小RNA标准化并使用2-ddCT方法计算表达的相对倍数变化。所有实验都重复二次进行。
视网膜电图
为进行电生理学记录，使小鼠适应黑暗3小时，在昏暗的红光下使之适用于立体定位装置中，使用一滴托品酰胺(埃孔实验室公司(Alcon Laboratories,Inc.)，德克萨斯州沃思堡)扩张其瞳孔并将体温维持在37.5℃。通过不同光强度的10-毫秒闪光引发ERG，这些光强度范围为10-4至20cd.s/m2，通过Ganzfeld刺激器(CSO公司，意大利佛罗伦萨)生成。为最小化噪音，对各发光步骤取三次不同的光引发的响应的平均值(光刺激之间的时间间隔是4-5分钟)。使用插入与角膜接触的下眼睑下方的金板电极来记录电生理信号。各眼中的电极表示在相应额叶区域的水平皮下插入的针电极。不同的连接与双通道放大器相连。a-和b-波的振幅以递增的光强度的函数形式作图。完成获自暗适应条件(暗光适应)响应后，继续记录以解析介导光响应(光适应)的视锥细胞通路。为此，在连续背景光存在的情况下(背景光设为50cd/m2)记录对20cd.s/m2的光的响应的ERG。对于各组，在暗光适应和光适应条件下，平均b-波振幅以发光的函数形式作图。
组织学分析
处死小鼠，随后收集其眼球并通过浸没在4％多聚甲醛(PFA)中固定过夜。收获眼球前，通过烧灼标记的巩膜的颞部以在包含时相对于注射位点对眼进行定向。使用30％蔗糖浸润眼以用于冷冻保存并将其成对(即左眼和右眼)包埋在冷冻介质(O.C.T.基质，卡尔特克公司(Kaltek)，意大利帕多瓦)中以促进比较分析。对于各眼，沿水平面切割150-200个连续切片(10μm厚)并使切片进行性分布在10张载玻片上，使得各载玻片含有10-15个切片，各自代表不同水平的整个眼。使用4’,6’-二眯基-2-苯基吲哚(载体实验室公司(VectorLab Inc.)，英国彼得堡)这些切片并在不同放大倍数下使用Zeiss Axiocam(卡尔蔡司公司(Carl Zeiss)，德国上科亨)监测EGFP。
免疫荧光染色
将冷冻的视网膜切片用PBS清洗依次，随后在4％PFA中固定10分钟。随后将对切片进行透化处理，在含有1％NP-40的PBS中15分钟(用于抗视紫红质、抗视锥抑制蛋白、抗谷氨酰胺合成酶)或在柠檬酸缓冲液中15分钟(用于抗M-和S-视蛋白)。施用含有10％正常山羊血清的封闭溶液(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，密苏里州圣路易斯)，持续1小时。在PBS中稀释一抗并在4℃下孵育过夜。将二抗(Alexa 594，抗兔或抗鼠，1:1000；分子克隆公司(Molecular Probes)，英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)孵育45分钟。使用的一抗是抗-hCAR(28)、Opn1mw(AB5405；密理博公司(Millipore))、Opn1sw(AB5407；密理博公司)、视紫红质(阿柏堪穆公司(Abcam))和抗谷氨酰胺合成酶(MAB302；密理博公司)。使用Vectashield(载体实验室公司，英国彼得堡)观察细胞核。使用Zeiss(LSM 710)共聚焦显微镜对切片进行拍照。
TUNEL试验
根据生产商的说明书通过TdT介导的dUTP末端缺口标记试剂盒检测冷冻的视网膜切片中凋亡的细胞核(原位细胞死亡检测试剂盒，TMR红；罗氏公司(Roche))。
结果
本发明中，作者提出使用两种miRNA(即miR-204和miR-211)来保护视网膜免于发生神经元退化。在该研究中，作者旨在确定将miR-204/211递送至视网膜细胞对于神经退化进展的效果。
为此，作者决定在野生型小鼠或视网膜退化的小鼠模型的视网膜中(即视网膜下空间中)递送miR-204的前体形式(前体miR-204)和miR-211的前体形式(前体miR-211)。具体而言，作者使用了以下注射方案：使用含有miR-204或miR-211的前体序列的腺相关病毒(AAV)构建体在一个眼中注射各分析的小鼠(详细情况参见方法)。使用相同策略，用仅含有报告基因盒(增强的绿色荧光蛋白，EGFP)的AAV构建体注射各动物的对侧眼并用作实验对照。对于这些实验，作者决定使用AAV血清型2/8，其之前被证明有效地转导哺乳动物视网膜，主要是视网膜色素上皮细胞和感光细胞(19)。为驱动注射的视网膜中前体-miR-204/211或EGFP的表达，作者最初是由组成型巨细胞病毒(CMV)启动子。
感光细胞中合适的miRNA加工和过表达的评估
在感光细胞退化的小鼠模型中进行实验前，作者首先试图确定AAV介导的miR-204和miR-211前体序列的递送是否是在转导的感光细胞中miR-204和miR-211成熟形式的适当miRNA加工和形成之后进行的。为此，作者使用AAV.CMV.前体miR204病毒构建体对三只野生型动物的一只眼中进行注射，并使用对照AAV.CMV.EGFP构建体在对侧眼中进行注射。作者随后对所有注射的眼进行激光捕获显微切割(LCM)以特异性收集含有感光细胞的外核层(图1A)。作者从收集的样品中提取了总RNA并使用TaqMan微小RNA试验试剂盒通过定量(q)反转录酶(RT)PCR测量成熟形式的miR-204的表达水平。作者发现，与内源性水平相比，给予AAV.CMV.前体miR204载体使成熟miR-204提高了1.5至2倍(图1B)。
这些结果证明，给予AAV.CMV.前体miR204载体诱导了正确加工的miR-204的水平增加。为排除前体miR-204的递送和加工会干扰视网膜中的miRNA加工机制并因此影响其他miRNA的生理内源性水平，作者还在注射的眼中测量了不相关miRNA(miR-124)的表达，其在视网膜中大量表达(16)。作者发现，在注射的眼的感光细胞中，miR-124表达水平未产生显著变化(图1B)。因此，作者总结，AAV介导的前体miR-204递送导致感光细胞中成熟形式的该miRNA的正确加工和提高的表达水平且不改变视网膜中表达的其他miRNA的正确加工和表达。使用AAV介导的前体miR-211递送获得了类似结果。
AAV介导的miR-204/211递送导致感光细胞退化的小鼠模型中视网膜形态和功能的改善
为评估IRD中miR-204/211的有益效果，作者使用了以下两种小鼠模型：
1)芳基烃相互作用蛋白样1(Aipl1)基因中纯合无效突变导致的常染色体隐性形式IRD的模型(Aipl1敲除小鼠)(20)。AIPL1基因中的突变负责人中严重形式的LCA。在Aipl1–/–小鼠中，在出生后第12天(P12)前视网膜发育正常。该阶段后，视杆和视锥感光细胞开始快速退化，导致感光细胞外节的解体、片段化和显著的尺寸减小以及ONL厚度的减少。光传导受损或所经历退化导致的视杆细胞和视锥细胞功能丧失反映为Aipl1–/–小鼠中视网膜电图(ERG)的完全缺失(20，21)。
2)常染色体显性形式IRD的模型(P347S视紫红质转基因小鼠)。该转基因小鼠系携带一种人视紫红质基因的拷贝，其在蛋白质的347位处具有脯氨酸至丝氨酸取代。该突变负责人患者中的RP形式。与Aipl1-/-小鼠相比，该小鼠模型中的视网膜表型较不严重，且ERG响应虽然严重受损但可在长达出生后2-3个月时获得(22)。
作者发现，前体miR-204转基因的递送导致，与注射EGFP的对侧眼相比，Aipl1–/–和视紫红质P347S模型的经注射眼中明显保持视网膜结构。
具体而言，作者获得了以下结果：
a)Aipl1–/–模型
作者使用上述方法在出生后第4天(P4)注射Aipl1–/–小鼠并在P21时处死小鼠。在该阶段处，仅单排感光细胞细胞核存在于EGFP注射的眼中(图2A)。相反地，作者在使用AAV.CMV.前体miR204构建体注射的上述动物的对侧眼中观察到维持的排数和感光细胞细胞核密度的显著增加(图2B-C)。这些结果清楚地显示miR-204注射的眼中较慢的视网膜退化进展。此外，作者观察到，如同免疫荧光分析所评估的那样，与使用对照载体注射的对侧眼相比，使用AAV.CMV.前体miR204载体注射的眼的ONL中视杆细胞标志物(视紫红质)和视锥细胞标志物(视锥抑制蛋白和M-视蛋白)的染色增加(图3和4)。最后，如使用视锥抑制蛋白进行的免疫标记所示，与对侧眼相比，视锥细胞结构和外节在使用miR-204载体注射的眼中得到更好维持(图3C或3D)。使用AAV介导的前体miR-211递送获得了类似结果。
为评估miR-204/211赋予视网膜的保护性作用是否可与基因替换方法联用，作者合并AAV.CMV.前体miR204载体与驱动CMV控制下的人AIPL1cDNA表达的AAV载体，在Aipl1–/–小鼠中进行了上述注射方法(即在P4时视网膜下注射)。该策略使我们能够评价视网膜神经保护(由递送miR-204/211所赋予)与Aipl1基因(人Aipl1)缺陷的替换的组合是否能够具有协同疗效。如图5所示，P30时的视网膜组织学分析显示，与使用单独的Aipl1注射的对侧眼相比，miR-204与人Aipl1的组合更有效地维持了视网膜厚度。这些初步数据表明，miR-204注射与人Aipl1基因递送的组合可生成叠加疗效，即延缓视网膜退化的进程(miR-204效果)和增强AIPL1活性的潜在恢复(人Aipl1基因补充)。
使用AAV介导的前体miR-211递送获得了类似结果。
b)视紫红质P347S小鼠模型。
作者根据与上文所述相同的过程对Aipl1–/–小鼠在P4时注射P347S转基因小鼠并在两个不同的时间点(即P30和P60)处死动物。首先，作者检测到，与对侧EGFP注射的眼相比，P30时P347S小鼠的miR-204注射的眼中ERG响应的显著提高(图6)。作者发现，这一提高在P60(即注射后两个月)时也持续(图7)。在两个阶段处(即P30和P60)，增强的ERG响应都在反映视锥细胞活性的适应光的条件下稳定，显示视锥感光细胞是miR-204注射所提供的有益效果的主要靶标。与上述发现一致的是，免疫荧光分析显示，与EGFP注射的眼不同，在miR-204注射的眼中，视锥感光细胞标志物(例如Opn1mw(M-视蛋白)和Opn1sw(S-视蛋白)蛋白)的表达存在显著的保持(图8)。
在上述结果的进一步支持中，作者还发现，注射前体miR-204AAV构建体决定了与EGFP注射的眼相比感光细胞层中凋亡细胞数目的统计学显著的减少，如TUNEL染色所示(图9)。此外，作者确定，miR-204注射导致视网膜胶质增生的显著减少，其代表对感光细胞损伤的生理响应，如使用抗谷氨酰氨合成酶(抗GS6)抗体的免疫荧光染色所评估的那样(图10)。
作者通过增加分析的鼠视网膜数目扩展了这些观察并进一步确定了结果(图16)。
总之，这些发现强有力地表明，视网膜下递送miR-204/211载体延缓P347S中的视网膜退化并维持视网膜功能，特别是在适应暗光和适应光的条件下。
所有上述注射实验都是有含有CMV组成型启动子的AAV构建体进行，该启动子驱动所有转导的细胞中的转基因表达。为验证感光细胞中miR-204/211的限制性表达是否足以确保IRD模型中这两种miRNA的有益效果，作者制备了一种AAV构建体，其中miR-204的表达处于驱动感光细胞中特异性转基因表达的视紫红质启动子的控制下(Allocca等，J ofVirology,2007和Mussolino等，Gene Therapy2011)。作者随后遵循与AAV.CMV.前体miR204构建体相同的策略在P4时使用该构建体(AAV.RHO.前体miR204)注射了一组P347S转基因小鼠。作者获得了以下结果：与对侧EGFP注射的对照相比，在P30时RHO.miR204注射的眼中ERG响应显著提高(图11)。作者通过增加分析的鼠视网膜数目扩展了这些观察并进一步确定了结果(图17)。与使用CMV启动子时所示结果类似(图14)，注射RHO.miR204构建体也不会导致与野生型小鼠的对侧注射EGFP的对照眼相比注射miR-204/211的眼的视网膜中‘b’波振幅的任何显著变化(图17)。上述数据清楚地表明，感光细胞中miR-204转基因的受限制表达足以确保体内IRD病症中这两种miRNA的保护性作用。
重要的是，所有上述试验也都使用前体miR-204或前体miR-211序列进行，其注射在所有分析的模型中都产生了非常类似的结果(参见图12或13中的实施例)。因此，作者归纳得出，他们在体内的IRD病症中都施加了相同的有益效果。
所有上述数据都显示，在IRD的体内模型中，在视网膜(且特别是感光细胞)中注射miR-204/211通过增强细胞存活对感光细胞(特别是视锥细胞)施加保护性作用。特别出乎意料的是以下事实，即miR-204/211在感光细胞中无法检测(图18)。
以下证据进一步加强了miR-204/211对于感光细胞的强力作用：作者目前确定，在敲除miR-211的小鼠的视网膜中观察到感光细胞功能的显著缺陷(图19)。
向野生型小鼠的视网膜递送miR-204/miR-211的安全性评估
为评估miR-204/211递送在视网膜生理学方面的安全性，作者使用与上文所述相同的方案在一大群成年C56BL/6小鼠中进行miR-204的视网膜下AAV介导的递送。如图14所示，视网膜电图(ERG)分析显示，与对侧注射EGFP的对照眼相比，注射后一个月时注射miR-204的眼中‘b’波未变化。此外，作者在P4时注射的野生型小鼠中进行了类似的分析且作者在P30时进行ERG分析。同样地，在这种情况中，与对侧注射EGFP的对照眼相比，作者在注射miR-204的眼中无法检测到‘b’波振幅的任何显著性变化(图15)。使用AAV介导的前体miR-211递送获得了类似的结果。
这些数据支持miR-204/211递送对健康视网膜的安全性。
作者提出，视网膜内给予miR-204/211(特别是在感光细胞中)对感光细胞退化施加了有益作用，且特别是在IRD中，包括色素性视网膜炎(分离的和综合征形式)、先天性黑朦、视锥细胞-视杆细胞营养不良和视锥细胞营养不良。应注意，这表明向感光细胞中体内给予个体miRNA所获得的治疗性效果。
在本发明中，作者证明，miR-204/211在感光细胞退化或死亡(其是造成遗传性视网膜营养不良的主要病症)的过程中具有保护性效果。在这类疾病中，异常的RPE分化和增殖没有关键的致病性作用。
参考文献
1.J.Couzin,Science319,1782(2008年3月28日).
2.N.Meola,V.A.Gennarino,S.Banfi,Pathogenetics2,7(2009).
3.R.Garzon,G.Marcucci,C.M.Croce,Nat Rev Drug Discov9,775(2010年10月).
4.J.Kota等，Cell137,1005(2009年6月12日).
5.A.Care等，Nat.Med.13,613(2007年5月).
6.T.Thum等，Nature456,980(2008年12月18日).
7.D.Cacchiarelli等，EMBO Rep12,136(2011年2月1日).
8.J.Elmen等，Nature452,896(2008年4月17日).
9.R.E.Lanford等，Science327,198(2010年1月8日).
10.A.G.Seto,Int.J.Biochem.Cell Biol.42,1298(2010年8月).
11.E.L.Berson,Invest Ophtalmol Vis Sci34,1659(1993).
12.F.P.Cremers等，Hum.Mol.Genet.11,1169(2002年5月15日).
13.C.P.Hamel,Orphanet J Rare Dis2,7(2007).
14.M.Michaelides等.Surv.Ophthalmol.51,232(2006年5月-6月).
15.M.Karali等，BMC Genomics11,715(2010).
16.M.Karali等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.48,509(2007年2月).
17.I.Conte等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107,15491(2010年8月31日).
18.B.P.Lewis,C.B.Burge,D.P.Bartel,Cell120,15(2005年1月14日).
19.C.Mussolino等，Gene Ther.18,637(2011年7月).
20.V.Ramamurthy等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101,13897(2004年9月21日).
21.X.Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101,13903(2004年9月21日).
22.T.Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93,14176(1996年11月26日).
23.F.E.Wang等，FASEB journal 24,1552(2010年5月).
24.S.Wang,K.M.Koster,Y.He,Q.Zhou,Future Med Chem4,277(2012年3月).
25.M.Allocca等，J.Virol.81,11372(2007年10月).
26.M.Hildinger等，J.Virol.75,6199(2001年7月).
27.G.Gao等，Hum.Gene Ther.11,2079(2000年10月10日).
28.F.Q.Liang,V.Anand,A.M.Maguire,J.Bennett，刊于：Methods in MolecularMedicine(《分子医学中的方法》)，P.E.Rakoczy编(休曼出版公司(Humana Press Inc.)，2000)，卷47，第125-39页.
29.A.Li,X.Zhu,C.M.Craft,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.43,1375(2002年5月).
30.Graham,F.L.和van der Eb,A.J.,Virology 52:456-467,1973.
31.McCutchan,J.H.和Pagano,J.S.,Natl.Cancer Inst.41:351-357,1968.
32.Chu G,Hayakawa H,Berg P Nucleic Acids Research 15(3):1311-1326,1987.
33.Fraley,R.等，(1980),J.Biol.Chem.255,10431.
34.Capecchi,M.R.(1980).Cell 22:479-488.
35.Felgner,P.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,卷84,第7413-7417页,1987.
36.Acheampong A A等，2002,Drug Metabol.and Disposition 30:421-429.
37.Bennett J,Pakola S,Zeng Y,Maguire A M.Hum Gene Ther.1996；7:1763-1769.
38.Ambatia,J.,和Adamis,A.P.,Progress in Retinal and Eye Res.2002；21:145-151.
39.Cheng Y,Ji R,Yue J等，Am J Pathol 2007；170:1831-1840.

Claims (40)

1.以下所述试剂用于制备药物的用途，所述药物用于治疗和/或预防视网膜营养不良，所述试剂选自：miRNA、编码所述miRNA的DNA分子、或其任意组合，所述试剂包含种子序列UUCCCUU或编码含种子序列UUCCCUU的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的用途，所述miRNA选自：miRNA前体、成熟miRNA、miRNA模拟物、miRNA模拟物的混合物、或其任意组合。
3.如权利要求1所述的用途，其中，包含序列UUCCCUU的miRNA包含miR-204的成熟序列或miR-211的成熟序列。
4.如权利要求1所述的用途，所述试剂是miR-204的成熟序列或miR-211的成熟序列。
5.如权利要求1所述的用途，所述试剂在递送载剂中提供，任选地，所述递送载剂选自病毒载体、微球、脂质体、胶体金颗粒、脂多糖、多肽、多糖。
6.如权利要求1所述的用途，所述病毒载体是PEG化病毒载剂。
7.如权利要求1所述的用途，所述视网膜营养不良的特征是感光细胞退化。
8.如权利要求1所述的用途，所述视网膜营养不良是遗传性视网膜营养不良。
9.如权利要求8所述的用途，其中，遗传性视网膜退化选自：莱伯先天性黑朦(LCA)、视锥细胞-视杆细胞营养不良和视锥细胞营养不良。
10.如权利要求8所述的用途，其中，遗传性视网膜退化是色素性视网膜炎(RP)。
11.一种组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗和/或预防视网膜营养不良，所述药物组合物包含至少一种试剂和药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂，所述至少一种试剂选自：miRNA、编码所述miRNA的DNA分子、或其任意组合，所述试剂包含种子序列UUCCCUU或编码含种子序列UUCCCUU的核苷酸序列。
12.如权利要求11所述的用途，所述miRNA选自：miRNA前体、成熟miRNA、miRNA模拟物、miRNA模拟物的混合物、或其任意组合。
13.一种核酸序列用于制备药物的用途，所述药物用于治疗和/或预防视网膜营养不良，所述核酸序列编码一种如下所述的试剂，所述试剂选自：miRNA、编码所述miRNA的DNA分子、或其任意组合，所述试剂包含种子序列UUCCCUU或编码含种子序列UUCCCUU的核苷酸序列。
14.如权利要求13所述的用途，所述miRNA选自：miRNA前体、成熟miRNA、miRNA模拟物、miRNA模拟物的混合物、或其任意组合。
15.一种重组表达载体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗和/或预防视网膜营养不良，所述重组表达载体包含合适的启动子控制下的编码序列，所述编码序列编码如下所述的试剂，所述试剂选自：miRNA、编码所述miRNA的DNA分子、或其任意组合，所述试剂包含种子序列UUCCCUU或编码含种子序列UUCCCUU的核苷酸序列。
16.如权利要求15所述的用途，所述miRNA选自：miRNA前体、成熟miRNA、miRNA模拟物、miRNA模拟物的混合物、或其任意组合。
17.一种宿主细胞用于制备药物的用途，所述药物用于治疗和/或预防视网膜营养不良，所述宿主细胞由一种重组表达载体转化，所述重组表达载体包含合适的启动子控制下的编码序列，所述编码序列编码如下所述的试剂，所述试剂选自：miRNA、编码所述miRNA的DNA分子、或其任意组合，所述试剂包含种子序列UUCCCUU或编码含种子序列UUCCCUU核苷酸序列。
18.如权利要求17所述的用途，所述miRNA选自：miRNA前体、成熟miRNA、miRNA模拟物、miRNA模拟物的混合物、或其任意组合。
19.一种包含核酸序列和药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗和/或预防视网膜营养不良，所述核酸序列编码如下所述的试剂，所述试剂选自：miRNA、编码所述miRNA的DNA分子、或其任意组合，所述试剂包含种子序列UUCCCUU或编码含种子序列UUCCCUU的核苷酸序列。
20.如权利要求19所述的用途，所述miRNA选自：miRNA前体、成熟miRNA、miRNA模拟物、miRNA模拟物的混合物、或其任意组合。
21.一种包含重组表达载体和药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗和/或预防视网膜营养不良，所述重组表达载体包含合适的启动子控制下的编码序列，所述编码序列编码如下所述的试剂，所述试剂选自：miRNA、编码所述miRNA的DNA分子、或其任意组合，所述试剂包含种子序列UUCCCUU或编码含种子序列UUCCCUU的核苷酸序列。
22.如权利要求21所述的用途，所述miRNA选自：miRNA前体、成熟miRNA、miRNA模拟物、miRNA模拟物的混合物、或其任意组合。
23.一种包含宿主细胞和药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗和/或预防视网膜营养不良，所述宿主细胞由一种重组表达载体转化，所述重组表达载体包含合适的启动子控制下的编码序列，所述编码序列编码如下所述的试剂，所述试剂选自：miRNA，编码所述miRNA的DNA分子，或其任意组合，所述试剂包含种子序列UUCCCUU或编码含种子序列UUCCCUU的核苷酸序列。
24.如权利要求23所述的用途，所述miRNA选自：miRNA前体、成熟miRNA、miRNA模拟物、miRNA模拟物的混合物、或其任意组合。
25.如权利要求15、16、17、18、21、22、23或24所述的用途，所述合适的启动子是视紫红质启动子序列。
26.如权利要求15、16、17、18、21、22、23或24所述的用途，所述重组表达载体还包含合适的启动子控制下的负责视网膜营养不良的突变编码序列的一种或多种野生型。
27.如权利要求26所述的用途，所述负责视网膜营养不良的突变编码序列的一种或多种野生型选自下组：SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:414。
28.如权利要求15、16、17、18、21、22、23或24所述的用途，所述重组表达载体是AAV衍生物。
29.如权利要求11-24中任一项所述的用途，其中，包含序列UUCCCUU的试剂包含miR-204的成熟序列或miR-211的成熟序列。
30.如权利要求11-24中任一项所述的用途，所述试剂是miR-204的成熟序列或miR-211的成熟序列。
31.如权利要求11-24中任一项所述的用途，所述试剂在递送载剂中提供，任选地，所述递送载剂选自病毒载体、微球、脂质体、胶体金颗粒、脂多糖、多肽、多糖。
32.如权利要求31所述的用途，所述病毒载体是PEG化病毒载剂。
33.如权利要求11-24中任一项所述的用途，所述视网膜营养不良的特征是感光细胞退化。
34.如权利要求11-24中任一项所述的用途，所述视网膜营养不良是遗传性视网膜营养不良。
35.如权利要求34所述的用途，其中，遗传性视网膜营养不良选自：莱伯先天性黑朦(LCA)、视锥细胞-视杆细胞营养不良和视锥细胞营养不良。
36.如权利要求34所述的用途，其中，遗传性视网膜营养不良是色素性视网膜炎(RP)。
37.如权利要求19-24中任一项所述的用途，所述药物组合物还包含合适的启动子控制下的负责视网膜营养不良的突变编码序列的一种或多种野生型。
38.如权利要求37所述的用途，所述负责视网膜营养不良的突变编码序列的野生型插在其他重组表达载体中。
39.如权利要求37所述的用途，所述负责视网膜营养不良的突变编码序列的一种或多种野生型选自下组：SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:414。
40.如权利要求11、12、19、20、21、22、23或24所述的用途，所述药物组合物是用于眼内给药的药物组合物。
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3185909B1 (en) * 2014-08-27 2024-04-03 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Methods and compositions for treating leber congenital amaurosis
US10646588B2 (en) * 2015-03-11 2020-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services RP2 and RPGR vectors for treating X-linked retinitis pigmentosa
EP3294890A4 (en) 2015-05-08 2018-10-03 Children's Medical Research Institute Promoters for expression of heterologous genes
EP3413928B1 (en) 2016-02-12 2022-04-20 University of Massachusetts Anti-angiogenic mirna therapeutics for inhibiting corneal neovascularization
EP3210632B1 (en) * 2016-02-23 2022-09-28 EyeServ GmbH Gene therapy for the treatment of a retinal degeneration disease
EP3589738A4 (en) * 2017-03-01 2021-01-06 The Trustees of The University of Pennsylvania GENE THERAPY FOR EYE DISORDERS
GB201707212D0 (en) * 2017-05-05 2017-06-21 Ucl Business Plc Gene therapy for ciliopathies
KR20210057720A (ko) * 2018-06-25 2021-05-21 아카우오스, 인크. Clrn1 관련된 청력 손실 및/또는 시력 손실의 치료 방법
WO2020005341A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anc80 encoding sphingolipid-metabolizing proteins
US20220125948A1 (en) * 2019-03-04 2022-04-28 Duke University Compositions and methods for the diagnosis and treatment of retinopathies
SG11202110607WA (en) 2019-04-01 2021-10-28 Tenaya Therapeutics Inc Adeno-associated virus with engineered capsid
WO2020214796A1 (en) * 2019-04-19 2020-10-22 University Of Massachusetts Gene therapies for usher syndrome (ush2a)
CN112921085B (zh) * 2019-12-06 2022-06-10 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） Circ-NOLC1作为卵巢癌诊断标志物及其应用
WO2021202817A1 (en) * 2020-04-01 2021-10-07 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Dual aav-myo7a vectors with improved safety for the treatment of ush1b
CN112063625A (zh) * 2020-09-24 2020-12-11 武汉纽福斯生物科技有限公司 编码arl2bp的核酸及其应用
US11781156B2 (en) 2020-10-09 2023-10-10 Tenaya Therapeutics, Inc. Plakophillin-2 gene therapy methods and compositions
EP4090752A4 (en) * 2020-10-09 2023-08-30 Tenaya Therapeutics, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR PLAKOPHILIN 2-BASED GENE THERAPY
WO2023049931A1 (en) * 2021-09-27 2023-03-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and systems for modifying the crumbs homologue-1 (crb1) gene
CN113999873B (zh) * 2021-12-31 2022-05-20 北京市疾病预防控制中心 一种基因修饰的非人动物的构建方法及其应用
WO2024188321A1 (zh) * 2023-03-14 2024-09-19 上海交通大学医学院 Ofd1蛋白或基因作为靶点在肿瘤预防与治疗中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010027838A1 (en) * 2008-08-27 2010-03-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mir 204, mir 211, their anti-mirs, and therapeutic uses of same

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US593053A (en) * 1897-11-02 Cable grip and take-up
US7517870B2 (en) * 2004-12-03 2009-04-14 Fondazione Telethon Use of compounds that interfere with the hedgehog signaling pathway for the manufacture of a medicament for preventing, inhibiting, and/or reversing ocular diseases related with ocular neovascularization
EP2140004B1 (en) * 2007-04-12 2022-01-12 The Provost, Fellows, Foundation Scholars, & the other members of Board, of the College of the Holy & Undiv. Trinity of Queen Elizabeth near Dublin Genetic suppression and replacement
AU2009308380B2 (en) * 2008-10-22 2015-05-28 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Methods for treating eye disorders
CN106074591B (zh) * 2010-03-24 2020-01-14 菲奥医药公司 眼部症候中的rna干扰
BR112013027070A2 (pt) * 2011-04-20 2019-09-24 J Smith Larry métodos e composições para diminuir expressão de gene utilizando componentes que auto montam em células e produzem atividade de rnai

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010027838A1 (en) * 2008-08-27 2010-03-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mir 204, mir 211, their anti-mirs, and therapeutic uses of same

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AAV-mediated photoreceptor transduction of the pig cone-enriched retina;C Mussolino 等;《Gene Therapy》;20110317;第18卷(第7期);第637-645页 *
Albert M Maguire 等.Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber’s congenital amaurosis: a phase 1 dose-escalation trial.《Lancet》.2009,第374卷(第9701期),第1597-1605页. *
Microphthalmia-associated Transcription Factor (MITF) Promotes Differentiation of Human Retinal Pigment Epithelium (RPE) by Regulating microRNAs-204/211 Expression;Jeffrey Adijanto 等;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20120608;第287卷(第24期);第20491-20503页 *
STUDIO DEL RUOLO DEI MICRORNA MIR-204/211 NELLA FUNZIONE OCULARE IN CONDIZIONI FISIOLOGICHE E PATOLOGICHE;I.Conte 等;《www.biomedia.net》;20121122;第C056页第1段 *

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