CN110577942A - 一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽及其应用，属于视网膜神经退行性疾病药物制备技术领域。本发明所述用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述活性肽具有与Gas6全长蛋白相似生物特性，具有提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的作用。

Description

一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽及其 应用

技术领域

本发明涉及视网膜神经退行性疾病药物制备技术领域，具体涉及一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽及其应用。

背景技术

随着炎性眼病和光学相关眼病逐渐得到有效控制，视网膜神经退行性疾病已成为当今世界不可逆致盲的主要原因，影响着数以千万人的视力健康。如视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa，RP)、年龄相关性黄斑变性(Age-related MacularDegeneration，AMD)及leber氏黑曚(Leber Congenital Amaurosis，LCA)等。

此类疾病目前尚无有效治疗办法，影响数以千万人的视力健康和生活质量，是导致我国视力残疾和盲的主要因素。因此，迫切需要探索新颖有效的治疗方式，恢复和重建视觉系统的结构与功能。上述疾病中，视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)是主要的起始损害因素。RPE是位于神经视网膜与Bruch’s膜之间的单层细胞，具有吞噬感光细胞外节、分泌营养因子、参与视循环代谢和形成血—视网膜屏障等功能，对于维持视网膜正常生理功能十分重要。视网膜色素上皮细胞的吞噬功能受损将导致AMD、RP及LCA等视网膜退行疾病的发生。

Gas6蛋白具有改善视网膜微环境，促进基因治疗或细胞治疗发挥作用的治疗潜能。但Gas6蛋白在临床转化应用中仍存在以下问题：单次注射的干预方式导致生物效应比较短暂，而反复多次的视网膜下腔注射会带来众多并发症以及患者的依从性问题等。因此，如何实现Gas6蛋白的有效临床干预，并在视网膜微环境长期发挥作用，从而上调RPE吞噬等功能，延缓疾病损害，成为本领域着重解决的技术问题。

近年，缓释给药技术及纳米包被技术为蛋白缓释给药提供了较好的技术途径，但在制作过程中蛋白等大分子物质极易受到物理、化学因素影响而失去活性，Gas6蛋白并不能实现有效临床干预。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽及其应用。本发明所述活性肽具有与Gas6全长蛋白相似生物特性，分子量小，不易失活，具有提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的作用。

本发明提供了一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽，所述活性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的是，所述活性肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的药物，所述药物包括上述技术方案所述活性肽。

优选的是，所述药物还包括MerTK。

本发明还提供了上述技术方案所述活性肽在制备预防或治疗视网膜退行性疾病的药物中的应用。

本发明提供了一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽。本发明所述活性肽具有与Gas6全长蛋白相似生物特性，具有提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的作用；且同时由于分子量小，具有较好的生物稳定性，更适用于缓释给药材料的包被制作；适用于视网膜退行疾病治疗中长效缓释作用，改善病变微环境，辅助细胞治疗、基因治疗等技术提供治疗效果。

附图说明

图1为本发明提供的用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽的三级结构图；

图2为本发明实施例1提供的Gas6不同功能片段活性肽的构建表达结果；

图3为本发明实施例1提供的Gas6不同片段活性肽处理RPE细胞后，AKT磷酸化水平变化结果；

图4为本发明实施例1提供的RPE吞噬3h后激光共聚焦结果；

图5为本发明实施例1提供的Mer^-/-小鼠经不同干预后ERG的b波反应结果。

具体实施方式

本发明提供了本发明提供了一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽，所述活性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：dqc tpnpcdrkgtqacqdlmgnffclckagwgg rlcdkdvnec sqenggclqi chnkpgsfhc schsgfelss dgrtcqdidecadseacgea rcknlpgsys clcdegfays sqekacrdvd eclqgrceqv cvnspgsytc hcdgrgglklsqdmdtcedi lpcvpfsvak svkslylgrm fsgtpvirlr fkrlqptrlv aefdfrtfdp egillfagghqdstwivlal ragrlelqlr yngvgrvtss gpvinhgmwq tisveelarn lvikvnrdav mkiavagdlfqperglyhln ltvggipfhe kdlvqpinpr ldgcmrswnw lngedttiqe tvkvntrmqc fsvtergsfypgsgfafysl dymrtpldvg testwevevv ahirpaadtg vlfalwapdl ravplsvalv dyhstkklkkqlvvlaveht alalmeikvc dgqehvvtvs lrdgeatlev dgtrgqsevs aaqlqerlav lerhlrspvltfagglpdvp vtsapvtafy rgcmtlevnrrlldldeaay khsditahsc ppvepaaa。用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽的三级结构图如图1所示。

Gas6蛋白在临床转化应用中存在以下问题：单次注射的干预方式导致生物效应比较短暂，而反复多次的视网膜下腔注射会带来众多并发症以及患者的依从性问题等；由于Gas6蛋白属于蛋白质大分子，具有脆弱易变的高级结构，在缓释材料包被过程中极易导致蛋白变性失活而不再适用，Gas6蛋白并不能实现有效临床干预，并在视网膜微环境长期发挥作用，从而上调RPE吞噬等功能，延缓疾病损害。

本发明根据Gas6蛋白功能域，分段克隆，其中EGF-LamininG功能域序列为主要活性肽序列(命名为Gas6-LamininG活性肽，G3，即本发明活性肽)，Gas6-LamininG活性肽与Gas6全长蛋白相比，分子量小，但具有相似的作用，都可显著上调Akt磷酸化水平，可以促进RPE细胞吞噬功能的发挥，并辅助延缓视网膜退行病变。本发明所述Gas6-LamininG活性肽在缓释制剂的制备过程中能够保持蛋白的自然形态和生物活性，能够提高药效学特性及给药便捷性。

本发明通过构建分子量相对较小的Gas6功能活性肽的体外表达和纯化系统获得本发明所述活性肽。本发明对所述体外表达和纯化方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规蛋白表达和纯化系统即可。

在本发明中，所述活性肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

本发明还提供了一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的药物，所述药物包括上述技术方案所述活性肽。

在本发明中，所述药物优选还包括MerTK。本发明所述药物通过将活性肽联合mertk基因治疗，或联合细胞移植替代治疗，进一步协同促进视网膜色素上皮细胞吞噬功能，改善病变。

本发明还提供了上述技术方案所述活性肽在制备预防或治疗视网膜退行性疾病的药物中的应用。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

根据Gas6蛋白功能域，分段克隆，其中EGF-LamininG功能域序列为主要活性肽序列(G3，命名为Gas6-LamininG活性肽)。构建Gas6基因各功能域序列真核、原核表达系统，进行了体外表达和纯化(Gas6不同功能片段活性肽的构建表达结果如图2所示，其中，A:构建的EGF质粒在真核细胞的表达，10倍物镜；B:构建的LamininG质粒在真核细胞的表达，10倍物镜；C:构建的EGF-LamininG质粒在真核细胞的表达，10倍物镜；D-F:对应的20倍物镜观察)。由图2可知，构建的几种短肽都能在细胞正常表达。将不同浓度(200ng/ml、800ng/ml)纯化得到的Gas6-LamininG活性肽处理体外培养的RPE细胞，检测MerTK下游AKT磷酸化水平(提示细胞吞噬通路的启动)，结果显示Gas6-LamininG活性肽与Gas6全长蛋白具有相似的作用，都可显著上调Akt磷酸化水平(Gas6不同片段活性肽处理RPE细胞后，AKT磷酸化水平变化结果如图3所示，其中，横坐标:C30min:空白对照组(正常培养基处理30分钟)；G3(200)30min：含200ng/ml的Gas6-LamininG活性肽培养基处理细胞30分钟组；G3(800)30min：含800ng/ml的Gas6-LamininG活性肽培养基处理细胞30分钟组；G(200)30min：含200ng/ml的Gas6全长蛋白培养基处理细胞30分钟组；G(2800)30min：含800ng/ml的Gas6全长蛋白培养基处理细胞30分钟组；纵坐标：蛋白印记检测结果，pAKT/GAPDH(内参)的灰度值相对值)。

在体外RPE细胞吞噬模型中，可见在不同干预后，对照组RPE细胞吞噬能力较强，吞入盘膜较多且完整，MerTK/Gas6-LamininG活性肽联合干预组吞噬的盘膜内容虽少于野生对照组，但多于Mertk单独干预组，各组间统计差异显著(p<0.05)(RPE吞噬3h后激光共聚焦结果如图4所示，其中，A-D:对照组，E-H:mertk干预组，I-L:mertk+Gas6-LamininG活性肽组，绿色的A、E、I：盘膜-FITC，红色的B、F、J：actin，紫色的C、G、K，tublin，蓝色的D、H、L:DAPI.bar＝30um)。结果证实：Gas6-LamininG活性肽具有分子量小，生物性稳定的特点，并与Gas6全长蛋白生物学特性相似，具有提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的作用。

连续选取P17Mer^-/-小鼠作为实验动物，将外源MerTK/Gas6LamininG活性肽植入视网膜下腔(MerTK单独干预组，MerTK/Gas6LamininG活性肽联合干预组以及空白对照组)。术后第八周利用视觉电生理检测视功能的改善能力，各组间对比，分析改变的差异。电生理检查结果显示，代表视杆细胞和RPE功能的b波(暗适应0.01ERG)，MerTK/Gas6LamininG活性肽联合移植组和Mertk单独移植组波幅都显著高于对照组；且联合干预组提高最为显著(p<0.01，图5为Mer^-/-小鼠经不同干预后ERG的b波反应(暗适应0.01ERG))。证明MerTK/Gas6LamininG活性肽联合干预能够提高Mer^-/-小鼠视觉功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 首都医科大学附属北京同仁医院

<120> 一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 561

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Gln Cys Thr Pro Asn Pro Cys Asp Arg Lys Gly Thr Gln Ala Cys

1 5 10 15

Gln Asp Leu Met Gly Asn Phe Phe Cys Leu Cys Lys Ala Gly Trp Gly

20 25 30

Gly Arg Leu Cys Asp Lys Asp Val Asn Glu Cys Ser Gln Glu Asn Gly

35 40 45

Gly Cys Leu Gln Ile Cys His Asn Lys Pro Gly Ser Phe His Cys Ser

50 55 60

Cys His Ser Gly Phe Glu Leu Ser Ser Asp Gly Arg Thr Cys Gln Asp

65 70 75 80

Ile Asp Glu Cys Ala Asp Ser Glu Ala Cys Gly Glu Ala Arg Cys Lys

85 90 95

Asn Leu Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Leu Cys Asp Glu Gly Phe Ala Tyr

100 105 110

Ser Ser Gln Glu Lys Ala Cys Arg Asp Val Asp Glu Cys Leu Gln Gly

115 120 125

Arg Cys Glu Gln Val Cys Val Asn Ser Pro Gly Ser Tyr Thr Cys His

130 135 140

Cys Asp Gly Arg Gly Gly Leu Lys Leu Ser Gln Asp Met Asp Thr Cys

145 150 155 160

Glu Asp Ile Leu Pro Cys Val Pro Phe Ser Val Ala Lys Ser Val Lys

165 170 175

Ser Leu Tyr Leu Gly Arg Met Phe Ser Gly Thr Pro Val Ile Arg Leu

180 185 190

Arg Phe Lys Arg Leu Gln Pro Thr Arg Leu Val Ala Glu Phe Asp Phe

195 200 205

Arg Thr Phe Asp Pro Glu Gly Ile Leu Leu Phe Ala Gly Gly His Gln

210 215 220

Asp Ser Thr Trp Ile Val Leu Ala Leu Arg Ala Gly Arg Leu Glu Leu

225 230 235 240

Gln Leu Arg Tyr Asn Gly Val Gly Arg Val Thr Ser Ser Gly Pro Val

245 250 255

Ile Asn His Gly Met Trp Gln Thr Ile Ser Val Glu Glu Leu Ala Arg

260 265 270

Asn Leu Val Ile Lys Val Asn Arg Asp Ala Val Met Lys Ile Ala Val

275 280 285

Ala Gly Asp Leu Phe Gln Pro Glu Arg Gly Leu Tyr His Leu Asn Leu

290 295 300

Thr Val Gly Gly Ile Pro Phe His Glu Lys Asp Leu Val Gln Pro Ile

305 310 315 320

Asn Pro Arg Leu Asp Gly Cys Met Arg Ser Trp Asn Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Glu Asp Thr Thr Ile Gln Glu Thr Val Lys Val Asn Thr Arg Met Gln

340 345 350

Cys Phe Ser Val Thr Glu Arg Gly Ser Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Phe

355 360 365

Ala Phe Tyr Ser Leu Asp Tyr Met Arg Thr Pro Leu Asp Val Gly Thr

370 375 380

Glu Ser Thr Trp Glu Val Glu Val Val Ala His Ile Arg Pro Ala Ala

385 390 395 400

Asp Thr Gly Val Leu Phe Ala Leu Trp Ala Pro Asp Leu Arg Ala Val

405 410 415

Pro Leu Ser Val Ala Leu Val Asp Tyr His Ser Thr Lys Lys Leu Lys

420 425 430

Lys Gln Leu Val Val Leu Ala Val Glu His Thr Ala Leu Ala Leu Met

435 440 445

Glu Ile Lys Val Cys Asp Gly Gln Glu His Val Val Thr Val Ser Leu

450 455 460

Arg Asp Gly Glu Ala Thr Leu Glu Val Asp Gly Thr Arg Gly Gln Ser

465 470 475 480

Glu Val Ser Ala Ala Gln Leu Gln Glu Arg Leu Ala Val Leu Glu Arg

485 490 495

His Leu Arg Ser Pro Val Leu Thr Phe Ala Gly Gly Leu Pro Asp Val

500 505 510

Pro Val Thr Ser Ala Pro Val Thr Ala Phe Tyr Arg Gly Cys Met Thr

515 520 525

Leu Glu Val Asn Arg Arg Leu Leu Asp Leu Asp Glu Ala Ala Tyr Lys

530 535 540

His Ser Asp Ile Thr Ala His Ser Cys Pro Pro Val Glu Pro Ala Ala

545 550 555 560

Ala

<210> 3

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaccagtgca cgcccaaccc ctgcgatagg aaggggaccc aagcctgcca ggacctcatg 60

ggcaacttct tctgcctgtg taaagctggc tgggggggcc ggctctgcga caaagatgtc 120

aacgaatgca gccaggagaa cgggggctgc ctccagatct gccacaacaa gccgggtagc 180

ttccactgtt cctgccacag cggcttcgag ctctcctctg atggcaggac ctgccaagac 240

atagacgagt gcgcagactc ggaggcctgc ggggaggcgc gctgcaagaa cctgcccggc 300

tcctactcct gcctctgtga cgagggcttt gcgtacagct cccaggagaa ggcttgccga 360

gatgtggacg agtgtctgca gggccgctgt gagcaggtct gcgtgaactc cccagggagc 420

tacacctgcc actgtgacgg gcgtgggggc ctcaagctgt cccaggacat ggacacctgt 480

gaggacatct tgccgtgcgt gcccttcagc gtggccaaga gtgtgaagtc cttgtacctg 540

ggccggatgt tcagtgggac ccccgtgatc cgactgcgct tcaagaggct gcagcccacc 600

aggctggtag ctgagtttga cttccggacc tttgaccccg agggcatcct cctctttgcc 660

ggaggccacc aggacagcac ctggatcgtg ctggccctga gagccggccg gctggagctg 720

cagctgcgct acaacggtgt cggccgtgtc accagcagcg gcccggtcat caaccatggc 780

atgtggcaga caatctctgt tgaggagctg gcgcggaatc tggtcatcaa ggtcaacagg 840

gatgctgtca tgaaaatcgc ggtggccggg gacttgttcc aaccggagcg aggactgtat 900

catctgaacc tgaccgtggg aggtattccc ttccatgaga aggacctcgt gcagcctata 960

aaccctcgtc tggatggctg catgaggagc tggaactggc tgaacggaga agacaccacc 1020

atccaggaaa cggtgaaagt gaacacgagg atgcagtgct tctcggtgac ggagagaggc 1080

tctttctacc ccgggagcgg cttcgccttc tacagcctgg actacatgcg gacccctctg 1140

gacgtcggga ctgaatcaac ctgggaagta gaagtcgtgg ctcacatccg cccagccgca 1200

gacacaggcg tgctgtttgc gctctgggcc cccgacctcc gtgccgtgcc tctctctgtg 1260

gcactggtag actatcactc cacgaagaaa ctcaagaagc agctggtggt cctggccgtg 1320

gagcatacgg ccttggccct aatggagatc aaggtctgcg acggccaaga gcacgtggtc 1380

accgtctcgc tgagggacgg tgaggccacc ctggaggtgg acggcaccag gggccagagc 1440

gaggtgagcg ccgcgcagct gcaggagagg ctggccgtgc tcgagaggca cctgcggagc 1500

cccgtgctca cctttgctgg cggcctgcca gatgtgccgg tgacttcagc gccagtcacc 1560

gcgttctacc gcggctgcat gacactggag gtcaaccgga ggctgctgga cctggacgag 1620

gcggcgtaca agcacagcga catcacggcc cactcctgcc cccccgtgga gcccgccgca 1680

gcc 1683

Claims (5)

1.一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽，其特征在于，所述活性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的活性肽，其特征在于，所述活性肽的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1或2所述活性肽。

4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述药物还包括MerTK。

5.权利要求1或2所述活性肽在制备预防或治疗视网膜退行性疾病的药物中的应用。