CN102791283A - 转化生长因子-β1(TGF-β1)抑制剂肽治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的应用 - Google Patents

转化生长因子-β1(TGF-β1)抑制剂肽治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102791283A
CN102791283A CN2011800104876A CN201180010487A CN102791283A CN 102791283 A CN102791283 A CN 102791283A CN 2011800104876 A CN2011800104876 A CN 2011800104876A CN 201180010487 A CN201180010487 A CN 201180010487A CN 102791283 A CN102791283 A CN 102791283A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
peptide
tgf
polynucleotide
carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011800104876A
Other languages
English (en)
Inventor
哈维尔·多特德拉斯埃雷里亚斯
米格尔何塞·马尔多纳多洛佩斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Proyecto de Biomedicina CIMA SL
Digna Biotech SL
Original Assignee
Proyecto de Biomedicina CIMA SL
Digna Biotech SL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Proyecto de Biomedicina CIMA SL, Digna Biotech SL filed Critical Proyecto de Biomedicina CIMA SL
Publication of CN102791283A publication Critical patent/CN102791283A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1841—Transforming growth factor [TGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents

Abstract

本发明涉及转化生长因子-β1(TGF-β1)抑制剂肽或编码所述肽的多核苷酸在预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊中的应用。

Description

转化生长因子-β1(TGF-β1)抑制剂肽治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的应用
技术领域
本发明大体上涉及预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的产品、组合物和方法。本发明的方法包括使用转化生长因子-β1(TGF-β1)抑制剂肽或编码所述肽的多核苷酸。
技术背景
眼表面，即，角膜，由分层的上皮和底层结缔组织覆盖。其作为眼结构的外层，阻止化学组分、微生物侵袭或机械性创伤的外界刺激的干扰。角膜无血管、透明且正常弯曲，这对于适当的光线折射是必要的，因此，对视力也是必要的。
角膜浑浊是正常清晰的眼睛前表面的模糊，且其发展被认为是属于角膜先天伤口愈合机制的副作用。一旦组织被损伤，间充质细胞和渗透的炎症细胞（即，巨噬细胞）分泌各种生长因子/细胞因子，包括转化生长因子-TGF-β1(TGF-β1)，TGF-β1是最重要的致纤维生长因子之一。尽管TGF-β1对于维持组织完整是至关重要的，但它也促进了愈合上皮下组织的纤维增生反应。
角膜组织修复所涉及的主要成分与皮肤修复所涉及的主要成分极其相似；分层的上皮和位于其下面的含有间充质细胞(角膜成纤维细胞)的胶原基质。I、III和V型胶原纤维和纤维之间的蛋白聚糖的有序的细胞外基质结构对于维持角膜透明度和常规形状是必要的。角膜纤维化导致透明度损失、组织收缩及疤痕转变，因此导致角膜浑浊。
目前，治疗角膜浑浊广泛使用局部消炎类固醇药物（诸如地塞米松、氟米龙或强的松龙）和抗代谢物（诸如丝裂霉素C）。然而这些药物可能伴有严重的并发症。使用局部类固醇可能导致眼压升高，导致视神经损伤和视野改变。使用丝裂霉素C是因为其能阻止某些类型细胞的增殖或增长，例如那些在眼内产生疤痕或浑浊的细胞；然而，在某些环境下丝裂霉素C具有非常强大且潜在的毒性。使用丝裂霉素C后，据报道会出现一些眼相关并发症，包括但不限于结膜充血（眼睛发红）、永久干细胞缺乏症、需要角膜移植的角膜或巩膜变薄或穿孔、角膜代偿失调、白内障、视网膜血管闭塞。
TGF-β1已成为角膜和其他组织浑浊和疤痕的重要调节剂。事实上，在成人组织中TGF-β1和TGF-β2表达增加。类似地，添加外源性TGF-β1治疗角膜伤口引起夸张的疤痕和纤维化。使用不同方法的TGF-β1抑制作用已证明可成功地应用于体内或体外，诸如通过使用特异性中和抗体[参见，例如，Jester等，Cornea 1997;16(2):177-87;Moller-Pedersen等，Current Eye Research 1998 Jul.;17(7):736-47;Bühren等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.2009February;50(2):634-43]、阻断TGF-β1表达的编码TGF-β1的基因的反义寡核苷酸[Cordeiro等，Gene Therapy 2003;10:59-71]。尽管用抗TGF-β1抗体抑制TGF-β1加速了角膜的上皮重新形成，同时通过角膜细胞减少了基质的细胞再增殖[Carrington等，Invest.Ophthalmol Vis Sci 2006;47:1886-1894]，但是抗体的使用提供了这种细胞因子(TGF-β1)的全部和特定阻断，然而血液中外源性免疫球蛋白的存在和TGF-β1的系统性阻断所产生的影响，促进了某些副作用。此外，随着时间的推移，免疫球蛋白的稳定性不能立即控制这种细胞因子的活性。反义寡核苷酸在基因表达水平抑制TGF-β1的产生，事实上，其可导致所有这种细胞因子参与的过程的重要的反调节。
为防止屈光手术后的浑浊，已提出其他TGF-β1抑制剂，诸如甘露糖-6-磷酸酯[Angunawela & Marshall,J.Cataract.Refract.Surg.2010;36:121-126]。然而，甘露糖-6-磷酸酯在加速分裂的厚皮移植供区愈合的第二阶段临床试验中失败了，未提供临床抗肝纤维化疗效的证据。
US 6,399,107公开了使用粘多糖合成的抑制剂治疗角膜浑浊。US2004/0001821公开了使用纤溶酶原激活剂防止激光视力矫正手术后的角膜和上皮下浑浊，但未报道角膜浑浊改善的临床数据。
尽管有不同的方法预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊，然而，本领域仍需要开发新的治疗方法减少角膜纤维化和/或角膜浑浊，最小化或避免副作用。
现在已发现TGF-β1抑制剂肽能够用于预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊。之前已公开了使用所述肽(WO 2005/019244)和免疫调节剂(WO 2007/048857)治疗肝纤维化。
发明内容
本发明涉及预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的产品、组合物和方法。该组合物包含至少一种TGF-β1抑制剂肽或编码所述肽的多核苷酸。
因此，一方面，本发明涉及选自由如下物质组成的组中的产品：
a)TGF-β1抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，
b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白，
c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，
d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体，
e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及
f)a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合，
所述产品用于预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊。
可选地，本发明涉及一种产品在制备用于预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的药物组合物中的用途，所述产品选自由如下物质组成的组中：
a)TGF-β1抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，
b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白，
c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，
d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体，
e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及
f)a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合，
另一方面，本发明涉及用于预防和/或治疗角膜纤维化或角膜浑浊的方法，其包含向需要治疗的受试者施用治疗有效量的选自由如下物质组成的组中的产品：
a)TGF-β1抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，
b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白，
c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，
d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体，
e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及
f)a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合。
另一方面，本发明涉及用于眼部的药物组合物，其包含治疗有效量的选自由如下物质组成的组中的产品：
a)TGF-β1抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，
b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白，
c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，
d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体，
e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及
f)a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合；以及
所述化合物的药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体是适用于眼部施用的载体。
在一个特定的实施方式中，所述产品是组合物的形式，其中所述组合物包含所述产品a)至e)的一种或多种。在另一个特定的实施方式中，所述组合物还包含药学上可接受的载体和/或治疗性化合物。
在一个特定的实施方式中，所述TGF β1抑制剂肽选自由p144(SEQID NO：6)、p17(SEQ ID NO：17)及其组合构成的肽的组中。
附图说明
图1示出了TGF-β1抑制剂肽(p17和p144)对于角膜浑浊的效果的进展。
图2示出了肽p17和p144对于上皮闭合的效果的进展。
图3示出了应用p17后角膜浑浊的发展，其中：
***p<0.001；对照组vs.p17在第五周高度显著；
Figure BDA00002041895400051
第五周的对照组vs.第0天的对照组高度显著；以及
###p<0.001；第五周的治疗组vs.第0天的治疗组高度显著。
图4示出了应用p17后上皮闭合的发展，其中：
**p<0.01；对照组vs.p17在第五周非常显著；
第五周的对照组vs.第0天的对照组非常显著；以及
###p<0.001；第五周的治疗组vs.第0天的治疗组高度显著。
图5示出了应用p144后角膜浑浊的发展，其中：
***p<0.001；对照组vs.p17在第五周高度显著；
*p<0.05；对照组vs.p17在第二周和第四周显著；
Figure BDA00002041895400053
第五周的对照组vs.第0天的对照组高度显著；以及
###p<0.001；第五周的治疗组vs.第0天的治疗组高度显著。
图6示出了应用p144后上皮闭合的发展，其中：
***p<0.001；对照组vs.p17在第五周高度显著；
*p<0.05；对照组vs.p17在第四周显著；
Figure BDA00002041895400061
p<0.01；第五周的对照组vs.第0天的对照组非常显著；以及
###p<0.001；第五周的治疗组vs.第0天的治疗组高度显著。
图7示出了p17和p144对于p-Smad 2、总Smad2和β-激动蛋白(加样对照)的免疫印迹的结果。
图8示出了在兔角膜成纤维细胞中对于Smad2/3的免疫印迹的结果。
图9示出了在TGF-β与p17和p144治疗的兔角膜成纤维细胞中对于Smad7的免疫印迹的结果。
图10示出了在无TGF-β1治疗的和用3ng/ml与5ng/ml的TGF-β1治疗后的兔角膜成纤维细胞上关于p-Smad2的免疫荧光研究的结果。
图11示出了在无TGF-β1与p17或p144治疗的和用不同浓度的这些物质治疗后的兔角膜成纤维细胞上关于p-Smad2的免疫荧光研究的结果。
具体实施方式
本发明人已公开向角膜纤维化的实验动物模型施用TGF-β1抑制剂肽，所述角膜纤维化由化学物(NaOH)损伤角膜后导致，所述施用意外地减少了所述动物中的角膜纤维化和/或角膜浑浊，从而提供了一种预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的新的治疗窗口。
因此，本发明涉及一种用于治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的TGF-β1抑制剂肽，然而本发明还考虑使用多种不同的TGF-β1抑制剂肽用于治疗所述疾病的可能性。同样地，本领域技术人员将理解TGF-β1抑制剂肽可以多种形式存在，例如，肽、融合蛋白、多核苷酸、载体、细胞等。
因此，在第一发明方面，本发明涉及一种产品，下文中被称为本发明的产品，其选自由如下物质组成的组中，
a)TGF-β1抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，
b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白，
c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，
d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体，
e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及
f)a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合，
所述产品用于预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊。
可选地，本发明涉及一种产品(本发明的产品)在用于预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的药物组合物的制造中的用途，所述产品选自由如下物质组成的组中，
a)TGF-β1抑制剂肽，或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，
b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白，
c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，
d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体，
e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及
f)a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合。
a)本发明的TGF-β1抑制剂肽
根据本发明，在一个特定的实施方式中，本发明的产品是TGF-β1抑制剂肽（以下被称为本发明的TGF-β1）、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段。
在本发明中，术语“TGF-β1抑制剂肽”涉及能够抑制TGF-β1生物活性的肽；TGF-β1生物活性的抑制例如可以通过与TGF-β1的活性形式相互作用。在特定的实施方式中，TGF-β1抑制剂肽直接与TGF-β1结合并抑制所述TGF-β1的生物活性。
TGF-β1是属于结构相关的调节蛋白（细胞因子）超家族的糖蛋白，是哺乳动物中所述的三种异构体(TGF β1、2和3)之一。最高丰度的异构体是TGF β1，其由25kDa的同源二聚体组成，所述同源二聚体由通过二硫键连接的两个亚基组成。几个动物种类的所述生长因子的序列是众所周知的。Derynck等已公开人TGF-β1的氨基酸序列[Derynck K等，“Human transforming growth factor-beta complementary DNA sequenceand expression in normal and transformed cells”.Nature 316(6030),701-705(1985)]。人类序列的GenBank登录号对应于：TGF-β1和TGF-β1前体：NP_000651(蛋白质)和NM_000660(cDNA)，TGF-β2和TGF-β2前体：NP_003229(蛋白质)和NM_003238(cDNA)及TGF-β3和TGF-β3前体：NP_003230(蛋白质)和NM_003239(cDNA)。登录号GenBank：AAL27646.2示出了TGF β1的其他氨基酸序列。TGF β1是在进化上具有高度保守序列的分子。尽管最初由在大鼠成纤维细胞中诱导独立于增殖和形态变化的粘结的能力定义TGF TGF-β1，但随后的调查表明TGF-β1是广泛的细胞类型的增殖的普遍抑制剂。分子由多种细胞类型在细胞分化的所有阶段在不同组织中产生。其具有许多的生物效应，且产生与发展、生理和免疫应答有关的强力的且非常频繁的相反的效应。许多疾病或病理变化与TGF-β1的过度表达或抑制表达相关，例如，与器官或组织功能丧失相关的纤维化，或手术或美容并发症，例如肝纤维化或肺间质纤维化。
TGF-β1抑制剂肽分子本质上是肽，意味着其包含通过酰胺键（即，肽键）相连接的α-氨基酸。术语“肽”不限于短氨基酸链；其可以包括长度超过50个氨基酸的链。因此，本文中使用的术语肽一般包括多肽和蛋白质。TGF-β1抑制剂肽的说明性、非限制的例子包括WO 00/31135或US 7,528,226(表2-6)以及WO 2005/019244中公开的肽，它们的全部内容通过引用纳入本文中。
在一个特定的实施方式中，TGF-β1抑制剂肽优选为具有与下文表1所示的SEQ ID NO：1-23的氨基酸序列中的任何一个氨基酸序列至少70%、有利地至少80%、优选至少90%、更优选至少95%序列同一性的肽。
表1
TGF-β1抑制剂肽
Figure BDA00002041895400101
本发明的TGF-β1抑制剂肽可通过常规技术获得；例如，它们可通过化学合成方法合成，包括但不限于，固相肽合成(参见，例如，WO00/31135或WO 2005/019244)，以及，如果需要，使用高效液相色谱(HPLC)纯化，并通过常规技术分析，例如通过测序和质谱分析法、氨基酸分析、核磁共振技术等。可选地，本发明的所述TGF-β1抑制剂肽可以通过重组DNA技术从合成所述肽的多种细胞来源中获得，其包括，例如，能够指导所述肽的合成和分泌的重组DNA分子转染的细胞。可以容易地从TGF-β1抑制剂肽的氨基酸序列推断编码所述肽的核苷酸序列。此外，所述肽还可以是市售的，比如Sigma-Genosys,Ltd.(Cambridge,UK)提供的P144。
如本领域所知，两个肽或蛋白质之间的“序列同一性”或“同一度”通过将肽或蛋白质的氨基酸序列与另一个肽或蛋白质的氨基酸序列比较而测定。如本文中所讨论的，一特定肽与另一肽是否具有至少约70%、80%、90%或95%的同一性可使用本领域已知的方法和计算机程序或软件测定，诸如，但不限于，BESTFIT程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group)、GCG包(GAPversion 8,Genetics Computer Group,USA)。BESTFIT使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics2:482-489(1981))，以找到两个序列之间的最佳同源片段。GCG包使用蛋白质的标准罚：GAP加权3.00，长度加权0.100，以及Gribskov andBrugess,Nucl.Acids Res.(1986)14(16),6745-6763中所述的矩阵。可选地，两个肽或蛋白质因子间的同一度可通过使用BLASTP算法测定[BLAST Manual,Altschul,S.,等，NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894,Altschul,S.,等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)]。
本领域技术人员将认识到本发明不仅涉及特定TGF-β1抑制剂肽，即，TGF β1抑制剂肽的特定氨基酸序列，还涉及其功能相等的衍生物、变体、类似物和/或片段。因此，特定TGF-β1抑制剂肽的氨基酸序列的功能相等的衍生物、变体、类似物或片段是优选保存至少一个所述特定TGF-β1抑制剂肽的生物活性或功能的序列，在本发明的情况下，所述活性或功能是抑制TGF-β1的能力。
在一个特定的实施方式中，TGF-β1抑制剂肽是一个选自序列如SEQID NO：1-23所示的肽组的肽、或其功能相等的盐、衍生物、变体、类似物或片段(即，能够抑制TGF-β1的所述TGF-β1抑制剂肽的衍生物、变体、类似物或片段)。因此，在一个特定的实施方式中，TGF-β1抑制剂肽是氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23所示的肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段(例如，能够抑制TGF-β1的所述TGF-β1抑制剂肽的衍生物、变体类似物或片段)。
在另一特定的实施方式中，TGF-β1抑制剂肽选自与SEQ ID NO：1-23的氨基酸序列具有至少70%、有利地至少80%、优选至少90%、更优选至少95%序列同一性的肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段。
因此，在一个特定的实施方式中，TGF-β1抑制剂肽是氨基酸序列与如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列具有至少70%、有利地至少80%、优选至少90%序列同一性的肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段。
在本发明一个特定的实施方式中，TGF-β1抑制剂肽选自肽p144(SEQ ID NO：6)、肽p17(SEQ ID NO：17)、其组合物、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段；优选地，所述TGF-β1抑制剂肽选自肽p144(SEQ ID NO：6)、肽p17(SEQ ID NO：17)及其组合物。
因此，本发明的TGF-β1抑制剂肽的功能相等的衍生物在本发明的范围内。本文中使用的术语“衍生物”涵盖通过本领域已知的方法由以残基侧链形式出现的官能团或N-末端基团或C-末端基团制备的衍生物，且只要它们仍然是药学上可接受的就包括在本发明中，即，他们不破坏如上所述的肽的生物活性(即，抑制TGF-β1的生物活性的能力)并且不会使包含其的组合物具有毒性。衍生物可能具有化学部分，诸如糖类或磷酸盐残基，提供了保留TGF-β1抑制剂肽生物活性并仍然是药学上可接受的衍生物。例如，衍生物可包括羧基脂肪酯，与氨或伯胺或仲胺反应形成的羧基酰胺，N-酰基衍生物或具有酰基部分的氨基酸残基的游离氨基(例如，烷酰基或碳环芳酰基)，或具有酰基部分的游离羟基的O-酰基衍生物(例如，丝氨酰基或苏氨酰基残基)。这些衍生物还可包括，例如，聚乙二醇侧链，其能掩盖抗原位点并延长分子在体液中的停留。
本发明的TGF-β1抑制剂肽的功能相等的变体也在本发明的范围内。作为在本文中所使用的术语，功能相等的“变体”涉及这样的任意肽，该肽的氨基酸序列可通过从TGF-β1抑制剂肽的原始序列插入、置换或消除一种或多种氨基酸而获得[关于氨基酸变化可能是表型沉默的指导准则可在Bowie,J.U.等(Science 1990,vol.247:1306-1310)中发现]且该肽至少部分保留抑制TGF-β1生物活性的能力。
肽抑制TGF-β1的能力可通过任何测量TGF-β1活性的合适的常规生物测试测定，例如Meager所描述的测试[Meager A.Journal ofImmunological Methods(1991)141:1-14]。在这些方法中，Mv-1-Lu细胞生长抑制试验是特别合适的。Mv-1-Lu细胞系是源于水貂肺上皮细胞的细胞系，TGF-β1抑制其增殖。WO2005/019244中提供了所述Mv-1-Lu细胞生长抑制试验的说明。通常，本发明的TGF-β1抑制剂肽在Mv-1-Lu细胞生长抑制试验中具有10%或更高、有利地15%或更高、优选20%或更高的抑制活性。更优选地，本发明的TGF-β1抑制剂肽在Mv-1-Lu细胞生长抑制试验中具有至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%或至少50%的抑制活性。此外，可评估肽体内抑制TGF-β1生物活性的能力，且如果需要，通过例如施用四氯化碳(CCl4)诱导的急性肝损伤的动物模型中的试验可对其定量。WO2005/019244中还提供了用于测定肽体内抑制TGF-β1能力的所述试验的说明。
肽初级结构的变体，以及更高水平结构组织的变体，例如，共价键连接氨基酸残基或在肽末端残基添加基团的类型的变体，它们都在本发明的范围内。
在一个特定的实施方式中，功能相等的变体可以是这样一种变体，其中一种或多种氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基(优选为保守的氨基酸残基)所置换，且这种置换的氨基酸残基可能是或可能不是遗传密码编码的。因此，变体可包括氨基酸序列中保守的或非保守的变化，其导致保持分子功能的沉默变化，包括，例如，缺失、添加和置换。这种改变的分子可能是有利的，在使用时其提供某些优势。如本文中所使用的，保守置换涉及相应肽序列内的一种或多种氨基酸与其他具有相似极性和疏水/亲水性特点的氨基酸置换，产生功能相等的分子。这种保守置换包括但不限于以下组氨基酸内的置换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天门冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸；和甲硫氨酸、正亮氨酸。本领域技术人员将理解的是，编码TGF-β1抑制剂肽的核苷酸序列的突变，其在对肽的功能起非关键作用的位置上产生保守氨基酸置换，是进化上的中性突变，不影响其整体结构或功能。
使用本领域众所周知的方法可通过直接化学合成变体肽而方便地制备变体。可选地，可通过相应DNA序列的突变制备限定的TGF-β1抑制剂肽的变体。这些变体包括，例如，氨基酸序列内残基的缺失或插入或置换。明显地，发生在编码变体的DNA的突变不能改变阅读框且优选不产生可生成mRNA二级结构的互补区域。在基因水平上，所述变体通常通过编码限定的TGF-β1抑制剂肽分子的DNA中的核苷酸的定点突变制备，从而产生编码变体的DNA，然后在重组细胞培养物中表达该DNA。该变体通常表现出与非变体肽相同性质的生物活性。
本发明的TGF-β1抑制剂肽的功能相等的类似物也在本发明的范围内。根据本发明，如上所限定的TGF-β1抑制剂肽的“类似物”涉及非天然分子，其大体上与整个分子或其活性片段相似。这种类似物将表现出与相应的TGF-β1抑制剂肽相同的活性。
本发明的TGF-β1抑制剂肽的功能相等的片段也在本发明的范围内。根据本发明，“片段”可以包含TGF-β1抑制剂肽的氨基酸序列，但缺少连续的包括氨基端的残基系列(即，连续的区域、局部或部分)，或连续的包括羧基端的残基系列，或在双截尾突变中，缺失两个连续的残基系列，一个包括氨基端且另一个包括羧基端。再次，这些截尾突变保留至少一个完整TGF-β1抑制剂肽的生物活性，也就是，抑制TGF-β1的能力。TGF-β1抑制剂肽的氨基酸序列的片段可通过肽合成用来生产相应的全长度肽；因此，片段可用作生产全长度肽的中间产物。可通过在分子一端移除氨基酸并检测生成物的作为TGF-β1抑制剂肽的性质而容易地制备片段。用于从多肽的N-末端或C-末端一次移除一个氨基酸的蛋白酶在本领域是已知的。
在一个特定的实施方式中，所述片段是包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、或14个SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23的保守氨基酸残基的片段，其中所述片段保持抑制TGF-β1的能力。
本领域技术人员将明白本发明的TGF-β1抑制剂肽的功能相等的盐也在本发明的范围内。本文中使用的术语“盐”涉及TGF-β1抑制剂肽的羧基盐和氨基的酸加成盐。可通过本领域已知方法形成羧基盐，其包括无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐等，及与有机碱形成的盐，例如，与胺形成的那些，例如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等。酸加成盐包括，例如，与无机酸形成的盐，例如，与盐酸、溴酸、硫酸、磷酸等，及与有机酸形成的盐类，例如，醋酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、延胡索酸、草酸、甲磺酸、苯磺酸、马来酸等。当然，任何的此类盐必须保留TGF-β1抑制剂肽的生物活性。为了治疗应用，TGF-β1抑制剂肽的盐是这样的盐，其中反离子是药学上可接受的。药学上可接受的盐的性质不是关键考虑因素，只要它是药学上可接受的。非药学上可接受的盐类也包括在本发明的范围内，因为它们可用于生产药学上可接受的终产物。
b)包含本发明TGF-β1抑制剂肽的融合蛋白
根据本发明,在另一特定的实施方式中，本发明的产品是融合蛋白（以下称为本发明的融合蛋白），包含本发明的TGF-β1抑制剂肽。事实上，在一实施方式中，本发明的TGF-β1抑制剂肽可与其他分子结合，例如，赋予TGF-β1抑制剂肽相对于天然TGF-β1抑制剂肽的性质和优势的其他肽，以生成融合蛋白。
在本发明中，术语“融合蛋白”涉及具有至少两个共价结合在一起的部分的多肽，其中每个部分源于不同的蛋白质，一个部分是如上所限定的本发明的TGF-β1抑制剂肽。本领域技术人员将明白，此处描述的融合蛋白具有抑制TGF-β1的生物活性的能力。
可与TGF-β1抑制剂肽融合的肽的说明性而非限制性的例子，例如，促进融合蛋白提取和纯化的分子，诸如聚组氨酸标签(His-标签)(例如H6和H10等)或其他用于IMAC系统的标签，例如，Ni2+亲和柱等，GST融合蛋白，MBP融合蛋白，链霉亲和素标签，BIRA细菌酶的BSP生物素标记靶序列，及抗体主导的标签表位(例如c-myc标签、FLAG标签等)。本领域技术人员将观察到，所述标记肽可用于纯化、检查、选择和/或观察本发明的融合蛋白。此外，除了增强实验条件中的稳定性的分子，例如DNA或GAL4基因转录激活区域的结合等，荧光、放射性或酶部分也是合适的标签。
本发明的TGF-β1抑制剂肽可通过包括双功能接头的众所周知的方法与其他肽连接，形成融合多肽，以及通过生物素或链霉亲和素/抗生物素与互补分子的结合形成生物素/链霉亲和素或生物素/抗生物素复合物。根据TGF-β1抑制剂肽与其他化合物中反应基团的性质，可形成接头，同时或顺序地使反应基团与另一个基团反应。例如,被选作靶标的试剂可在例如羧基端具有巯基，其随后与衍生剂耦合以形成载体分子。然后载体分子通过其巯基与肽结合。此外，可通过TGF-β1抑制剂肽的反应基团和形成融合蛋白的分子，使用本领域技术人员已知的耦合化学形成优选的共价键来形成该键。可使用本领域接受的许多方法形成共价键[参见，例如,March,J.,Advanced Organic Chemistry,4th ed.,New York,N.Y.,Wiley and Sons,1985,pp.326-1120]。本领域技术人员熟悉许多其他可能的接头。
此外，形成本发明的融合蛋白一部分的肽可通过单肽键或含有一种或多种氨基酸残基的肽接头直接连接。通常，该部分和接头在相同阅读框内且使用重组技术生产。可能的弹性接头序列的说明性而非限制性的例子包括SGGTSGSTSGTGST (SEQ ID NO：24)、AGSSTGSSTGPGSTT(SEQ ID NO：25)、GGSGGAP(SEQ ID NO：26)[Muller,K.M.,Arndt,K.M.and Alber,T.,Meth.Enzymology,2000,328:261-281]，GGGVEGGG(SEQ ID NO：27)或GSGGS(SEQ ID NO：28)。连接物或接头肽的优选例子包括用于连接肽或蛋白质且本质上不损伤相连接的肽或蛋白质的功能或至少本质上不损伤相连接的肽或蛋白质之一的功能的连接物或接头肽。
接头的本质优选为肽。接头肽优选地包含至少2个氨基酸，诸如至少3个氨基酸，例如至少5个氨基酸，诸如至少10个氨基酸，例如至少15个氨基酸，诸如至少20个氨基酸，例如至少30个氨基酸，诸如至少40个氨基酸，例如至少50个氨基酸，诸如至少60个氨基酸，例如至少70个氨基酸，诸如至少80个氨基酸，诸如至少90个氨基酸，诸如大约100个氨基酸。
如果需要，可包括融合蛋白部分（肽-伴侣）之间的蛋白水解切割位点，以允许融合蛋白的伴侣（肽）分离。如果融合蛋白活性降低，所述伴侣（肽）之间的接头可选择为非常不稳定的(例如，通过靶组织存在的酶用于酶裂解)，以使其容易裂解，从而释放分子。
c)编码本发明的TGF-β1抑制剂肽或本发明的融合蛋白的多核苷酸
在另一实施方式中，本发明的产品包含多核苷酸，以下称为本发明的多核苷酸，其编码一种或多种不同的本发明的TGF-β1抑制剂肽，和/或包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸。本发明的多核苷酸包含在编码TGF-β1抑制剂肽或融合蛋白的核苷酸序列之前的表达调控序列，所述表达调控序列与所述编码TGF-β1抑制剂肽或融合蛋白的核苷酸序列有效地结合，即，在所述调控序列的控制下，所述TGF-β1抑制剂肽或融合蛋白在用于其表达的正确阅读框内。
用于本发明的调控序列可以是核启动子序列，或可选地，增强子序列和/或增加核苷酸序列表达的调控序列。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。如果需要多核苷酸的恒定表达，使用组成型启动子。众所周知的组成型启动子的例子包括真核细胞病毒（诸如多瘤病毒、腺病毒、SV40、CMV、鸟类肉瘤病毒、乙型肝炎病毒）基因组的衍生物、金属硫蛋白基因启动子、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因启动子、逆转录病毒的LTR区域、免疫球蛋白基因启动子、肌动蛋白基因启动子、EF-1α基因启动子，以及诱导型启动子，其中肽或蛋白质的表达取决于分子或外源信号的添加，诸如四环素系统、NFkappaB/UV光系统、Cre/Lox系统和热休克基因启动子。组成型启动子的其他几种例子在本领域是众所周知的且可用于实施本发明。
如果需要编码TGF-β1抑制剂肽或融合蛋白的核苷酸的可控表达，必须使用诱导型启动子。在非诱导状态，诱导型启动子可以是“沉默的”。“沉 默”理解为无诱导剂时，检测到很少或检测不到本发明多核苷酸的表达；然而，存在诱导剂时，出现本发明多核苷酸的表达。可通过改变诱导剂的浓度经常地控制表达水平。通过控制表达，例如，改变诱导剂的浓度，以更强或更弱地刺激诱导型启动子，可影响本发明多核苷酸的转录产物的浓度，从而控制合成的肽或融合蛋白的数量。因此可能改变治疗产物的浓度。众所周知的诱导型启动子的例子有：雄激素或雌激素敏感型启动子、强力霉素敏感型启动子、金属硫蛋白启动子或响应蜕皮激素的启动子。其他多种例子在本领域是众所周知的且可用于实施本发明。除了组织型和诱导型启动子(其通常在大多数细胞或组织类型中作用)，可使用组织特异性启动子以实现在特定细胞或组织中多核苷酸序列的特定表达。众所周知的眼组织特异性启动子的例子包括角蛋白12和角膜蛋白基因的角膜-特异性启动子、IRBP(间质性视黄醇结合蛋白)(也称为视黄醇结合蛋白3(RBP3))和视紫红质激酶(Rk或GRK1)基因的视网膜特异性启动子等。
d)包含本发明的多核苷酸的载体
在另一实施方式中，本发明的产品包含载体，以下称为本发明的载体，其包含如上所述的本发明的多核苷酸，即，编码一种或多种不同TGF-β1抑制剂肽或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段的多核苷酸，或编码包含所述TGF-β1抑制剂肽的融合蛋白的多核苷酸。在一个特定的实施方式中，所述本发明的多核苷酸的前面是表达调控序列。
适用于容纳本发明的所述多核苷酸的载体包括质粒或载体，当其被引入宿主细胞时，整合到或不整合到所述细胞的基因组。可通过本领域技术人员已知的常规方法获得所述本发明的载体，且其可在例如<Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press,third edition,2001>中找到。
然而，在本发明的范围内，本发明的载体优选为适用于治疗的病毒或非病毒载体。所述载体的说明性而非限制性的例子包括基于逆转录病毒、腺病毒、甲病毒等的病毒载体，或在非病毒载体情况下，载体可以是DNA-脂质体、DNA-聚合物、DNA-聚合物-脂质体复合物、聚合物纳米颗粒、脂质纳米颗粒、树状高分子等[参见“Nonviral Vectors for GeneTherapy”,edited by Huang,Hung and Wagner,Academic Press(1999)]。可通过常规方法将包含本发明的多核苷酸的所述病毒和非病毒载体直接施用于人体或动物体。病毒载体可以是，例如，甲病毒，诸如塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒或委内瑞拉马脑炎病毒(EEV)；高容量腺病毒；条件复制型腺病毒；腺相关病毒等。
e)包含本发明载体的细胞
本发明的载体可选地可用于例如体外转化、转染或感染细胞，优选包括人类细胞的哺乳动物细胞，并随后将其移植到人或动物体内从而获得需要的治疗效果。为了向受试者施用，所述细胞将在合适的介质中配置，不会对其活性有不利影响。同样地，所述载体此外可以包含多克隆位点、表达调控序列、适用于载体引入其中的宿主细胞的复制起点、选择标记等。
因此，本领域技术人员应当理解的是，在一个实施方式中，本发明的产品包含细胞（以下也称为本发明的细胞），所述细胞包含TGF-β1抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段、本发明的融合蛋白、本发明的多核苷酸或本发明的载体，它们分别如本发明的第一发明方面的a)、b)和c)所限定。所述TGF-β1抑制剂肽、融合蛋白、多核苷酸和载体的特征已经在上文中进行解释。
适用于容纳本发明的TGF-β1抑制剂肽、本发明的融合蛋白、本发明的多核苷酸或本发明的载体的细胞可以是真核细胞或原核细胞。在本发明中，实际上可以使用任何能够被本发明的多核苷酸转化或可以被本发明的载体转化、转染或感染的宿主细胞，例如动物细胞（例如，哺乳动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞等）、植物细胞、酵母等。
任何可以被基因改性以表达本发明的TGF-β1抑制剂肽、本发明的融合蛋白、本发明的多核苷酸和/或本发明的载体的真核细胞都可以用于本发明，然而优选的是小鼠、大鼠、灵长类和人类的细胞。因此，适用于进行本发明的细胞是心肌细胞、内皮细胞、上皮细胞、淋巴细胞（B细胞和T细胞）、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、血管内膜细胞、从不同的器官、优选从朗格汉斯胰岛中分离的细胞的原代培养物、肝细胞、白细胞（包括单核白细胞）、胚胎干细胞、间质干细胞、脐带干细胞或成人（皮肤、肺、肾脏和肝）干细胞、破骨细胞、软骨细胞和其他结缔组织细胞。已经有的细胞系，诸如Jurkat T细胞、NH-3T3细胞、CHO细胞、Cos细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞、C2C12成肌细胞以及W138细胞同样也是合适的。本发明的细胞可以通过本领域技术人员已知的常规方法获得[Sambrook等，2001，如上所述]。
f)组合
在另一实施方式中，本发明考虑到了使用所述产品a)到e)的两种或两种以上的组合的可能性。上文提到过所述产品a)到e)的详情。
本发明的组合物
在另一实施方式中，本发明的产品是组合物的形式，其中所述组合物包含所述产品a)到e)中的一种或多种。因此，在特定的实施方式中，本发明提供了包含如本发明的第一发明方面在a）、b）、c）、d）、e）部分所分别限定的本发明的TGF-β1抑制剂肽、本发明的融合蛋白、本发明的多核苷酸、本发明的载体和/或本发明的细胞的一种或多种的组合。因此，本发明提供的组合物同样考虑到可能包含：
-至少两个不同的TGF-β1抑制剂肽，单独或与诸如那些在本发明的第一发明方面的b)、c)和d)部分中分别限定的融合蛋白、多核苷酸和载体组合；
-至少两种多核苷酸，每种编码不同的TGF-β1抑制剂肽，单独或与如本发明的第一发明方面中的a)和d)部分中分别限定的TGF-β1抑制剂肽或载体组合；
-至少两种载体，每种包含一种或多种如本发明的第一发明方面的c)部分所限定的多核苷酸，其编码不同的TGF-β1抑制剂肽，单独或与如本发明的第一发明方面中的a)部分中限定的TGF-β1抑制剂肽组合；
-至少两种细胞，其包含如本发明的第一发明方面a)到d)部分中分别限定的TGF-β1抑制剂肽、融合蛋白、多核苷酸或载体；等等。
如在本发明的开头所提到的，对角膜纤维化或角膜浑浊模型大鼠施用TGF-β1抑制剂肽，令人吃惊地使角膜纤维化和/或浑浊度降低，从而开辟了一个治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的新的治疗窗口。本领域技术人员将理解的是，为了使本发明的TGF-β1抑制剂肽、或本发明的任何其他产品能够用于治疗目的，其必须为了其施用而适当的配制。
因此，在一个特定的实施方式中，本发明提供的组合物是药物组合物并进一步包含药学上可接受的载体，以及任选地（如果需要）其他旨在治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的治疗化合物。
因此，本发明还提供了包含治疗有效量的根据本发明的产品或组合物的药物组合物。
在本发明中，“治疗有效量”应被理解为本发明的TGF-β1抑制剂肽的量，该量使得后者足以能够延迟、减少或消除与角膜纤维化和/或浑浊或其严重度有关的症状。如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”涉及任何安全的制剂，其将有效量的本发明的至少一种产品有效的递送到靶组织。
根据本发明的产品或本发明提供的组合物的组分的性质，即，如上限定的肽、融合蛋白、多核苷酸、载体或细胞，药物组合物的量可以改变。例如，如果组合物包含病毒载体，取决于使用的病毒载体，本发明提供的组合物中的载体的量可以为每剂量105至1013病毒颗粒。另一方面，如果载体是非病毒载体，例如质粒，本发明提供的组合物中的载体的量可以为每剂量100ng至5mg。
在一个特定的实施方式中，本发明的药物组合物包含两种或多种组分；在该实施方式中，所述组分可以配制成单独、同时或连续使用。
本发明的产品可包含在根据本领域技术人员已知的制药技术的各种类型的药物组合物中。施用途径（例如，局部或眼内）和给药方案将由熟练的医师决定，基于诸如待治疗疾病的确切性质、疾病的严重度、患者的年龄和一般身体状况、本发明使用的特定产品和个体的药代动力学性质等。
本发明的产品或本发明的组合物可以通过不同的方法施用，例如局部、眼内等等，并且可以局部地、全身性地或直接地施用于靶点。施用活性成分的不同方法的综述、使用的赋形剂及其制备方法可以在Tratadode Farmacia Galénica,C.Faulíi Trillo,Luzán 5,S.A.de Editions,1993和Remington’s Pharmaceutical Sciences(A.R.Gennaro,Ed.),20th edition,Williams & Wilkins PA,USA.(2000)中找到。
在一个特定的实施方式中，在本发明的范围内，本发明的产品或本发明的组合物施用到眼部，从而TGF-β1抑制剂肽能够在眼内抑制TGF-β1，尽管其也可以以其他水平施用。
施用本发明的产品或本发明的药物组合物的方法将依赖于待治疗的疾病以及其他因素，诸如治疗时间以及本发明的产品或药物组合物是预防性的施用还是在急性阶段施用（例如，外科手术后）。本发明的产品和药物组合物可以用作眼科手术的辅助物，诸如在眼科手术后通过玻璃体或结膜下注射。化合物可用于临时症状的急性治疗，或者可慢性施用，特别是在退行性疾病的情况下。可同样预防性地使用该化合物，特别是在眼部手术或非侵入性眼科程序或其它类型的手术之前使用。
因此，在一个实施方式中，本发明提供的药物组合物是用于眼部的药物组合物，即，一种药物组合物，包含治疗有效量的根据本发明的产品或组合物以及用于所述化合物的药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体适用于眼部施用。如本文所使用的，术语“用于眼部的药物组合物”是指意图在眼内应用或旨在处理与眼睛接触的设备（诸如隐形镜片）的组合物。因此，在一个特定的实施方式中，本发明涉及一种用于眼部的药物组合物，其包含治疗有效量的产品，该产品选自以下物质组成的组中：
a)TGF-β1抑制剂肽，或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，
b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白，
c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，
d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体，
e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及
f)a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合；以及
所述化合物的药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体适用于眼部施用。
在一个特定的实施方式中，药物组合物将为了局部应用而制备并施用。局部制剂通常是水性的，并被缓冲到生理上可接受的pH值，并且典型的保存用于多分散。因此，在一个特定的实施方式中，本发明还提供了局部的用于眼部的药物组合物，其包含治疗有效量的根据本发明的产品或组合物以及用于所述化合物的药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体是适用于局部眼睛施用的载体。如本领域技术人员众所周知的，可以使用各种类型的载体。通常来说载体的本质是水性的。基于制剂容易，以及患者能够通过在感染的眼睛中滴入一至两滴这种溶液而容易地施用这种组合物，通常水溶液是优选的。然而，本发明的产品可同样轻松地结合到其他类型的组合物中，诸如悬浮液、粘性凝胶或半粘性凝胶或其他类型的固体或半固体组合物。本发明的产品优选的是悬浮液，其相对不溶于水。本发明的眼部用组合物还可包括各种其他成分，诸如缓冲剂、防腐剂、共溶剂和粘度建立剂。
可以添加合适的缓冲系统（例如，碳酸氢钠、磷酸钠、醋酸钠、柠檬酸钠、抗酸血酸钠或硼酸钠）以防止pH值在储存条件下改变。
用于眼部的产品典型地以多剂量形式包装。因此使用过程中需要防腐剂以预防微生物污染。合适的防腐剂包括，例如：苯扎氯铵、硫柳汞、氯代丁醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙基醇、乙二胺四乙酸二钠、山梨酸、聚季铵盐-1或其他本领域技术人员已知的防腐剂。这些防腐剂典型的以0.001到1.0wt%的水平应用，以上基于组合物的总重量计（wt.%）。
本发明的一些产品在水中具有有限的溶解度，因此组合物中需要表面活性剂或其他适当的共溶剂。这种共溶剂包括，例如：聚氧乙烯蓖麻油、聚山梨醇酯20、60和80；
Figure BDA00002041895400251
F-68、F-84和P-103(BASF Corp.,Parsippany N.J.,USA)；环糊精；或其他本领域技术人员已知的共溶剂。这些共溶剂典型的以0.01到2wt%的水平应用。
需要大于单一的水溶液的粘度，由此增加活性化合物(本发明的产品)的眼部吸收，降低分散在制剂中的变异性，降低制剂的悬浮液或乳液的成分的物理分离和/或另外改进用于眼部的制剂。这种粘度建立剂包括，例如，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟基丙基纤维素或其它本领域已知的粘度建立剂。这些粘度建立剂典型地以0.01到2wt%的水平应用。
在另一特定的实施方式中，本发明的产品配制成用于眼内使用。因此，在一个特定的实施方式中，本发明还提供了用于眼内的眼部药物组合物，其包含治疗有效量的根据本发明的产品或组合物以及用于所述化合物药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体是适用于眼内眼部施用的载体。如本领域技术人员众所周知的，可以使用各种类型的载体。用于眼内使用的制剂通常包含手术灌洗液，诸如氟化烃的BSS
Figure BDA00002041895400252
无菌灌洗液的溶液或单独的BSS无菌灌洗液，如下所述。当所述产品眼内施用时，优选的是使用生理平衡的灌洗液作为本发明的产品的药物载体。如本文所使用的，术语“生理上平衡的灌洗液”是指在侵入性或非侵入性医疗步骤中，适于维持生理结构和组织功能的溶液。该类型的溶液将典型地含有电解质，诸如钠、钾、钙、镁和/或氯化物；能量来源，诸如葡聚糖；以及将溶液的pH维持在处于或近似于生理水平的缓冲液。该类型的各种溶液是已知的（例如，乳酸林格溶液）。
Figure BDA00002041895400261
无菌灌洗液和BSS
Figure BDA00002041895400262
无菌眼内灌洗液(Alcon Laboratories,Inc.,FortWorth,Tex.,USA)是生理上平衡的眼内灌洗液的例子。后一种类型的溶液在美国专利4,550,022中进行描述，其全部内容通过引入纳入本说明书。
在一个特定的实施方式中，TGF-β1抑制剂肽以适用于眼部应用的局部药物组合物的形式施用，诸如滴眼液、软膏、乳膏等。在一个特定的实施方式中，所述局部药物组合物包含适用于眼部施用的透明质酸或其药学上可接受的盐，诸如透明质酸钠。
用于上述任意目的的局部、眼周或眼内施用的剂量通常为约0.01至约100mg/kg体重(mg/kg)，每天施用一次至多次，例如四次、六次、八次甚至更多次。
可选地，本发明的药物组合物能够以固体药物剂型（例如，片剂、胶囊等等）、液体药物剂型（例如，溶液、悬浮液等等）或半固体药物剂型（例如，凝胶等）配制。包含所述载体的该组合物能够通过本领域已知的常规方法配制。
在一个特定的实施方式中，除了本发明的产品，本发明的药物组合物还包含其他旨在治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的化合物。实际上，可以使用任何旨在治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的化合物。用于角膜纤维化和/或角膜浑浊的治疗剂的示例性但非限制的例子包括局部抗炎的类固醇类药物，诸如地塞米松、氟米龙、强的松等，抗代谢药物诸如丝裂霉素C等，及其类似物。
本发明的产品以及本发明提供的组合物可以是试剂盒的形式。在本发明中，“试剂盒”应理解为含有不同活性成分或如本发明的第一发明方面中的a)至e)部分所限定的产品和/或另外的形成打包组合物的治疗化合物，从而允许运输、储存以及同时或连续施用。因此，本发明的试剂盒可含有一种或多种悬浮液、注射器等，其含有本发明的活性成分，并且其可以制备成单剂量的或多剂量的。该试剂盒还可额外地含有适用于重悬本发明的产品的载体，诸如水性介质，诸如盐溶液、林格溶液、葡萄糖和氯化钠，水溶性介质诸如乙醇、聚乙二醇、丙基乙二醇，以及必要时的水不溶性载体。试剂盒中可能存在的其他的组分是包装，其使得本发明的组合物维持在特定限制中。适用于制备这种包装的物质包括玻璃、塑料（聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等）、瓶子、小瓶、纸、小袋等。
本发明的试剂盒还额外地包含用于同时、连续或单独施用存在于试剂盒中的不同药物制剂的说明书。因此，本发明的试剂盒进一步包含用于同时、连续或单独施用不同组分的说明书。所述说明书可以是打印材料的形式或是使用者可以阅读且能够存储说明书的电子支持的形式，诸如电子存储介质（磁盘、磁带等）、光学介质(CD-ROM、DVD)等。该介质还额外或可选地包含提供所述说明书的因特网网页。
如上所述，本发明描述的发现对于治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊十分有用。角膜中的纤维化(角膜纤维化)导致透明度丧失、组织收缩以及疤痕转化，从而引起角膜浑浊。实施例1示出了在动物模型中，两种TGF-β1抑制剂肽[p144(SEQ ID NO：6)和p17(SEQ ID NO：17)]能够完全或部分降低由化学攻击导致的角膜纤维化和角膜浑浊。
在本发明中，“角膜纤维化”应理解为这样一种疾病，其特征在于眼球（角膜）的涂层的中央或周边地区正常的清澈透明的部分浑浊或混浊，继发性的发炎、由于暴露于外源体或化学药物引发的感染或刺激。该角膜病症包括任何由疤痕组织导致的角膜组织改变（胶原过度沉积和/或胶原蛋白的改变方向）以响应损伤或慢性疾病。这使得角膜在损坏的区域变成灰白色，通常的透明度变成不同等级的不透明度。
类似地，本发明使用的术语“角膜浑浊”是指角膜上皮下的浑浊，并涉及角膜透明度紊乱，这使得视觉朦胧或不清楚。由于没有结构化的胶原纤维的存在引发浑浊，该胶原纤维由激活的角膜细胞分泌并感染细胞外基质。当存在时，激光眼科手术后几周至几个月，浑浊出现，通常在第一个月内出现，在手术后的3-6个月内其强度最高。解决前，浑浊可持续最多一年。在本发明一个特定的实施方式中，激光屈光手术后出现的角膜浑浊或混浊，其原因在于前基质片层的结构被破坏。直到手术后几周至几个月，角膜浑浊才不明显。持续时间可能从几周到几个月，有一些持续出现超过一年，在一些情况中不可逆。严重度可以从轻到重。在报道的浑浊发病率中，变化很大。
另一方面，本发明涉及一种用于预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的方法，包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的产品，该产品选自以下物质组成的组中：
a)TGF-β1抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，
b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白，
c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，
d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体，
e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及
f)a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合。
在一个特定的实施方式中，所述产品是组合物的形式，其中所述组合物包含所述产品a)到e)中的一种或多种。在另一特定的实施方式中，所述组合物还包含药学上可接受的载体和/或旨在治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的治疗化合物。
在一个特定的实施方式中，通过对受影响的眼睛的表面应用治疗有效量的一种或多种本发明的产品，上述方法可以用于预防或降低激光手术后的术后角膜上皮下浑浊。本发明的方法特别设计用于预防屈光性角膜切削术（PRK）和激光原位角膜切削术（LASIK）后的角膜浑浊，无论如何该方法预防或降低了任何可能引起浑浊的眼部损伤导致的浑浊，包括任何眼科手术中的角膜光挥发、眼部表面感染（细菌、病毒、任何其他的微生物剂、寄生虫）、机械磨损、化学损伤等。
在一个特定的实施方式中，TGF-β1抑制剂肽是选自序列在SEQ IDNO：1-23中示出的肽组的肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段(即，具有抑制TGF-β1能力的所述TGF-β1抑制剂肽的衍生物、变体、类似物或片段)。因此，在一个特定的实施方式中，TGF-β1抑制剂肽是这样的一个的肽，该肽的氨基酸的序列在SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23中示出,或TGF-β1抑制剂肽是所述肽的功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，其诸如包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23中的5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续氨基酸残基，或其药学可接受的盐，其中所述片段保持了抑制TGF-β1的能力。
在另一特定的实施方式中，TGF-β1抑制剂肽是选自由p144(SEQ IDNO：6)、p17(SEQ ID NO：17)构成的组的一个肽或包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：17的9、10、11、12、13或14个连续氨基酸残基的片段,或其药学可接受的盐，其中所述片段保持了抑制TGF-β1的能力。
在一个优选的实施方式中，所述TGF β1抑制剂肽选自由p144(SEQID NO：6)、p17(SEQ ID NO：17)和其组合组成的组中。
以下实施例仅用于解释本发明而不限制本发明的范围。
实施例1
角膜纤维化和角膜浑浊的治疗
TGF-β1是主要的纤维化诱导介质之一。角膜中的纤维化导致透明度丧失，组织收缩以及疤痕变异，从而引起角膜浑浊。该实施例着重研究了在实验动物中的角膜纤维化并研究了在局部施用TGF-β1抑制剂肽：p144(SEQ ID NO：6)和p17(SEQ ID NO：17)之后，角膜纤维化完全或部分降低。
1.1材料和方法
1.1.1角膜损伤诱导
动物纤维化模型
在该研究中，起初使用12-16月龄的本土母鸡（Gallus gallusdomesticus）作为实验动物，但是由于该模型的困难，特别是关于动物的获得和处理，所以决定使用Long-Evans大鼠。此外，业已有文献证实Long-Evans大鼠可用作研究角膜纤维化的体内模型，因为它们允许更精确的观察损伤的进展，原因在于它们是有颜色的大鼠，像人类一样，具有前弹性膜。
实验组
使用10周龄的雄性Long-Evans大鼠，将其分为5组：
-组1：12只大鼠，6只用地塞米松治疗，6只用丝裂霉素C治疗。
-组2：12只大鼠，6只用第一制剂的p17处理（参见1.1.2.b），6只用第一制剂的p144处理（参见1.1.2.b）
-组3：12只大鼠，6只用第二制剂的p17处理（参见1.1.2.b），6只用第二制剂的p144处理（参见1.1.2.b）。
-组4：12只大鼠，6只用第三制剂的p 17处理（参见1.1.2.b），6只用第三制剂的p144处理（参见1.1.2.b）。
-组5：12只大鼠，6只用第四制剂的p17处理（参见1.1.2.b），6只用第四制剂的p144处理（参见1.1.2.b）。
-组6：12只大鼠，6只用第五制剂的p17处理（参见1.1.2.b），6只用第五制剂的p144处理（参见1.1.2.b）。
为了损伤角膜，使用异氟烷麻醉动物，在1N NaOH中浸润30秒的5mm Whatman纸片施用到大鼠的眼部中央。角膜损伤后，用充足的生理盐水血清清洗，并向它们施加抗生素软膏以防止受影响区域可能的感染。
在用上述动物组进行了几次体内研究后，可以得出结论，在应用NaOH 30秒之后出现的化学损伤导致了对于需要进行的研究来说过度的损伤。因此，决定进行新的实验，其中时间缩短为15秒。
1.1.2治疗
首先，进行实验以确定通常用于治疗角膜纤维化的药物：地塞米松和丝裂霉素C的疗效。在上述第一实验中，观察到获得的结果实际上与科学文献中已经描述的那些对应。为此，从那以后，进行了以下研究，其中动物组只使用p17和p144治疗。因此也可能使用更多数量的动物，从而获得更显著的结果。
a)剂量学总结：
第一周
Figure BDA00002041895400311
第二至六周
Figure BDA00002041895400321
随机确定每只动物的左眼作为对照，右眼作为治疗眼，从而相同的动物除了进行治疗还用作对照。必须指出的是，仅在研究的第一周，所有的动物双眼每天都接受抗生素治疗，从而避免细菌性角膜炎。
b)滴眼液制剂：
该研究的目的之一在于获得最合适的制剂，从而获得与使用地塞米松和丝裂霉素C所获得的相类似的临床效果。为此，测试了以下列出的不同制剂：
第一制剂
-2%聚羧乙烯(1g溶于50ml)在60°C加热并在用0.45μm过滤器过滤的MQ水中超声处理
-p144和p17的终浓度为1mg/ml
-称重10mg并在5ml的2%的聚羧乙烯中超声处理
-在4°C下度过周末，直到星期二使用时为止
注意：在整个研究中，制剂都保持在4°C的温度下。
第二制剂
-按如下方法制备聚羧乙烯溶液：超声处理40ml的1.5%聚羧乙烯-2001并以2000rpm离心5分钟（起泡），加入400μl三乙醇胺(99%)和1.2ml 1N HCl（搅拌并离心）
-p144：1ml的碳酸盐+10mg的p144。超声处理。加入9ml的聚羧乙烯溶液并超声处理
-p144对照：相同的样品但是不含p144
-p17：10ml的聚羧乙烯溶液+10mg的p17。超声处理
-p17对照：聚羧乙烯溶液(即，不含p17)
注意：碳酸盐使聚羧乙烯溶液的pH值升高，增加了粘度。所有的溶液为水凝胶。在整个研究中，制剂都保持在4°C的温度下。
第三制剂
-按如下方法制备聚羧乙烯溶液：超声处理40ml的1.5%聚羧乙烯-2001并以2000rpm离心5分钟（起泡）
-p144：1ml的碳酸盐+10mg的p144。超声处理。加入9ml的聚羧乙烯溶液并超声处理
-p144对照：相同的样品但是不含p144
-p17：10ml的聚羧乙烯溶液+10mg的p17。超声处理
-p17对照：聚羧乙烯溶液(即，不含p17)
注意：通过添加三乙醇胺(10-20μl)和HCl(32%)(2-10μL)调节粘度，直到获得了合适的粘度。在整个研究中，制剂都保持在4°C的温度下。
第四制剂
从在磷酸盐缓冲液（PBS）中的23mg/ml Healon 5TM(AMO)透明质酸钠开始，进行稀释直到获得终浓度为1mg/ml的透明质酸盐。0.6ml注射23mg/ml透明质酸盐(HLNC)，直到14ml的PBS和碳酸盐：
-p144：14mg溶解于7ml具有1mg/ml HLNC的碳酸盐中。超声处理
-p17：4mg溶解于7ml具有1mg/ml的HLNC的PBS
注意：在整个研究中，制剂都保持在4°C的温度下。
第五制剂
从0.15%的没有防腐剂的透明质酸钠(Hyabak 10mL，Thea)开始：
-p144：20mg溶解于5ml的滴眼液中，并加入40μl饱和浓缩的NaOH，搅拌并以每次5μl加入。超声处理直到溶解。调整pH，加入500μl的1M HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基乙磺酸)，从而pH值从10.5变成7。
-p144对照：40μl饱和的NaOH和500μl的1M HEPES(HEPES的终浓度为50mM)
-p17：20mg溶解于5ml的滴眼液中，超声处理直到完全溶解，用10ml注射器加入到小瓶中，并用蓝针刺穿所包含的过滤器（终浓度为2mg/ml）
-p17对照：非操控的滴眼液
注意：在整个研究中，制剂都保持在4°C的温度下。
在不同组中进行完所有体内研究后（第1.1.1节），确定企图缓解由1N NaOH造成的损伤的最合适的制剂为第五制剂。因此所有示出的与体内有关的结果将涉及该治疗类型。
1.1.3角膜病变的每周追踪
a)通过角膜生物显微镜的半定量分析
损伤24小时后开始治疗给药。之后，进行损伤追踪，在第0、7、14、21、28和35天拍照。为了拍照，使用异氟烷麻醉动物。用荧光和不用荧光给对照眼（左眼）和治疗眼（右眼）都进行拍照。具有荧光的照片允许观察发生损伤的上皮闭合的进展，而没有荧光的照片显示了损伤区域的浑浊的进展。首先拍摄没有荧光的照片。使用相机的白色过滤器拍摄这些照片。然后，用一滴商用荧光素（ColircusíFluorescein）滴加到眼睛上60秒，拍摄具有荧光的照片。之后，用生理盐水清洗该区域，在暗处给眼睛拍照并使用相机的蓝色过滤器。
b)角膜浑浊的定量分析
该分析允许从在第1.1.3a）节中进行的研究获得数字面积值。为此，使用ImageJ程序，其中测量了每只动物眼睛的所有面积以及损伤面积。为了能够进行比较测量，用损伤面积除以总的面积，因此，由于不同动物的眼睛尺寸之间的差异或与照片拍摄角度有关的差异导致的误差被降到最低。所有获得的数据都与第0天照片获得的原始值进行比较，认为所有动物的初始损伤为100%。
1.1.4处死动物并摘除眼球
使用异氟烷麻醉后，用颈椎脱臼法处死动物。处死后，进行摘除，并将眼球于戴维森溶液中放置24小时以使其固定。之后，动物的眼球从戴维森溶液中转移到4%的甲醛中，24小时后，将其转移到70%的乙醇中，其中动物的眼球最多可存放一个月。
1.1.5将组织包埋在石蜡中
在70%乙醇中的固定的组织脱水，从而它们可以包埋在石蜡中。一旦包埋，在超薄切片机中将样品切成3-5μm，随后进行相应的组织学和免疫化学分析。
1.1.6部分的组织学分析
起初，决定通过使用纤维化标记物(诸如α-SMA或纤连蛋白)，在免疫组织化学水平研究样品，用天狼猩红染色后定量胶原的量，并定量炎性细胞的数量。然而，这些技术的大部分都不可能开展，因为选择合适的抗体存在一定问题，没有很多特定的抗大鼠抗体。此外，通过咨询其他的研究中心（IOVA,Valladolid）（西班牙），可以看出，通过分子信号研究，可以方便地以更精确的方式量化肽在抑制角膜纤维化的效力。
因此，进行免疫印迹和免疫荧光研究，从体内研究中提取的细胞，测定局部施用的肽使用的信号途径。应当强调的是所述研究在来自兔角膜的成纤维细胞上进行，而不是在大鼠的角膜上进行。之所以这么做是因为从啮齿类动物的眼睛中分离成纤维细胞是十分困难的。
1.1.7数据的统计研究
使用SPSS 15.0软件，对相关的样品，通过Student t检验对获得的结果进行比较。
1.2.结果
1.2.1体内结果
以下示出了不同组的动物中获得的结果。可以看出，相对于对照，使用p17和p144肽治疗的眼睛中的浑浊（图1）和上皮闭合（图2）明显降低。
用ImageJ程序分析图像后，获得了一系列的面积数据，由此制成图3、4、5和6所示的图表。所述图表示出了在第0、7、14、21、28和35天时，每组所有动物（n=12）的平均值±标准偏差。
1.2.2生化结果
a)免疫印迹研究
由于科学文献反复描述了TGF-β1的信号途径，所以决定通过方法学章节描述的技术深入研究该途径。所述途径涉及Smad蛋白家族，特别是Smad2、2/3和7的研究。
为此，以0、3和5ng/ml浓度的TGF-β1和50和200μg/ml的肽p17和p144处理从兔成纤维细胞的原代培养物中获得的蛋白提取物。
p-Smad2的表达
应用抑制肽p17(图7)后，没有观察到p-Smad2的活化降低，而用50μg/ml的p144处理后，观察到p-Smad2的表达被轻微抑制。使用200μg/ml处理后，抑制更明显，达到了对照的值（图7）。
Smad 2/3的表达
在原代培养物中的Smad 2/3的表达没有受到TGF-β1处理或抑制肽p17和144(图8)处理的影响。图8中首先示出了抑制肽p17，其次是p144的作用。
Smad 7的表达
兔成纤维细胞的原代培养物中的Smad 7的表达没有受到TGF-β1处理或抑制肽处理的影响（图9）。
b)免疫荧光研究
用TGF-β1处理
应用3ng和5ng的TGF-β1诱导p-Smad2向细胞核（染为绿色）转移（图10）。
用TGF-β1抑制剂肽(p17和p144)处理
用p17处理没有抑制p-Smad2向细胞核的转移，但是用p144处理抑制了其转移，这表明该肽抑制兔角膜成纤维细胞的原代培养物中的TGF-β1信号途径（图11）。
1.3结论
在用p17和p144处理后，在不同实验组中，使用1N NaOH损伤角膜后诱导的化学损害的治疗显著降低，这毫无疑问的具有非凡的临床重要性。
此外，得到的结果表明：
-用于治疗1N NaOH造成的损伤的最合适的制剂为第五制剂(包含透明质酸钠)；
-在为期六周的实验过程中，使用p17或p144治疗，显著缓解了用NaOH造成的与角膜浑浊和上皮闭合相关的原始损伤；
-在兔角膜成纤维细胞的原代培养物中，TGF-β1激活Smad2的磷酸化作用，但是没有改进Smad2/3和Smad7的水平。使用p17或p144处理后，后者也没有改进；
-在兔角膜成纤维细胞的原代培养物中，用p17处理没有影响TGF-β1的信号级联作用，其与体内研究获得的结果不一致；一个非约束性的解释认为通过p17使用的信号途径不是由该研究中研究的蛋白质介导的，而是由不同于Smad2、Smad2/3的Smad7的其他蛋白质介导的，其中所述p17在研究的动物模型研究中显示出了极大的有效性；以及
-使用p144处理，以50μg/ml和200μg/ml的浓度，阻止了TGF-β1转导信号，抑制Smad2的磷酸化作用，因此随后抑制了向细胞核转移；这些发现完美地与在体内研究中发现的结果相对应，并表明细胞内效应通过Smad2途径介导。
序列表
 
<110>  西马生物医学计划公司
       迪格纳生物技术公司.
 
<120>  转化生长因子-β1 (TGF-β1) 抑制剂肽治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的应用
 
<130>  FP12ES1648
 
<150>  US12/709895
<151>  2010-02-22
 
<160>  28   
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  1
 
His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu
1               5                   10                  15 
 
 
<210>  2
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  2
 
Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr
1               5                   10                 
 
 
<210>  3
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  3
 
Thr Ser Leu Asp Ala Thr Met Ile Trp Thr Met Met
1               5                   10         
 
 
<210>  4
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  4
 
Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Ile Val Asp Ile
1               5                   10                  15 
 
 
<210>  5
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  5
 
Thr Ser Leu Met Ile Trp Thr Met Met
1               5                  
 
 
<210>  6
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  6
 
Thr Ser Leu Asp Ala Ser Ile Ile Trp Ala Met Met Gln Asn
1               5                   10                 
 
 
<210>  7
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  7
 
Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Thr Ile Asp
1               5                   10                 
 
 
<210>  8
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  8
 
Glu Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro Tyr Val Ser Trp Leu
1               5                   10                  15 
 
 
<210>  9
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  9
 
Leu Asp Ser Leu Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro His
1               5                   10                  15 
 
 
<210>  10
<211>  23
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  10
 
His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro
1               5                   10                  15     
 
 
Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr
            20             
 
 
<210>  11
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  11
 
Trp His Lys Tyr Phe Leu Arg Arg Pro Leu Ser Val Arg Thr Arg
1               5                   10                  15 
 
 
<210>  12
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  12
 
Arg Phe Phe Thr Arg Phe Pro Trp His Tyr His Ala Ser Arg Leu
1               5                   10                  15 
 
 
<210>  13
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  13
 
Arg Lys Trp Phe Leu Gln His Arg Arg Met Pro Val Ser Val Leu
1               5                   10                  15 
 
 
<210>  14
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  14
 
Ser Gly Arg Arg His Leu His Arg His His Ile Phe Ser Leu Pro
1               5                   10                  15 
 
 
<210>  15
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  15
 
Arg Leu Ala His Ser His Arg His Arg Ser His Val Ala Leu Thr
1               5                   10                  15 
 
 
<210>  16
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  16
 
Pro Pro Tyr His Arg Phe Trp Arg Gly His Arg His Ala Val Gln
1               5                   10                  15 
 
 
<210>  17
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  17
 
Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala
1               5                   10                  15 
 
 
<210>  18
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  18
 
Met Pro Leu Ser Arg Tyr Trp Trp Leu Phe Ser His Arg Pro Arg
1               5                   10                  15 
 
 
<210>  19
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  19
 
Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg
1               5                   10                 
 
 
<210>  20
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  20
 
Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr
1               5                   10         
 
 
<210>  21
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  21
 
Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp
1               5                   10     
 
 
<210>  22
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  22
 
Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp
1               5                   10     
 
 
<210>  23
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  TGF-β1 抑制剂肽
 
<400>  23
 
Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp
1               5                   10     
 
 
<210>  24
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  接头
 
<400>  24
 
Ser Gly Gly Thr Ser Gly Ser Thr Ser Gly Thr Gly Ser Thr
1               5                   10                 
 
 
<210>  25
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  接头
 
<400>  25
 
Ala Gly Ser Ser Thr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Gly Ser Thr Thr
1               5                   10                  15 
 
 
<210>  26
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  接头
 
<400>  26
 
Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro
1               5          
 
 
<210>  27
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  接头
 
<400>  27
 
Gly Gly Gly Val Glu Gly Gly Gly
1               5               
 
 
<210>  28
<211>  5
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  接头
 
<400>  28
 
Gly Ser Gly Gly Ser
1               5

Claims (10)

1.一种用于预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的产品，其选自由以下物质组成的组中：
a)  TGF-β1抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，
b)  包含如a)中限定的肽的融合蛋白，
c)  编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，
d)  包含如c)中限定的多核苷酸的载体，
e)  包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如 c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及
f)  a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合。
2.根据权利要求1所述的产品，其以包含一种或多种所述产品a) 到 e)的组合物的形式存在。
3.根据权利要求1 或 2所述的产品，其中所述TGF-β1抑制剂肽是与SEQ ID NO：1-23所示的任一氨基酸序列具有至少70%序列同一性的肽。
4.根据权利要求1或2所述的产品, 其中所述TGF-β1抑制剂肽是这样的一个肽或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段或盐，所述肽选自其氨基酸序列如SEQ ID NO： 1、SEQ ID NO： 2、SEQ ID NO： 3、SEQ ID NO： 4、SEQ ID NO： 5、SEQ ID NO： 6、SEQ ID NO： 7、SEQ ID NO： 8、SEQ ID NO： 9、SEQ ID NO： 10、SEQ ID NO： 11、SEQ ID NO： 12、SEQ ID NO： 13、SEQ ID NO： 14、SEQ ID NO： 15、SEQ ID NO： 16、SEQ ID NO： 17、SEQ ID NO： 18、SEQ ID NO： 19、SEQ ID NO： 20、SEQ ID NO： 21、SEQ ID NO： 22、或SEQ ID NO： 23所示的肽组。
5.根据权利要求4所述的产品，其中所述片段包含SEQ ID NO： 1、SEQ ID NO： 2、SEQ ID NO： 3、SEQ ID NO： 4、SEQ ID NO： 5、SEQ ID NO： 6、SEQ ID NO： 7、SEQ ID NO： 8、SEQ ID NO： 9、SEQ ID NO： 10、SEQ ID NO： 11、SEQ ID NO： 12、SEQ ID NO： 13、SEQ ID NO： 14、SEQ ID NO： 15、SEQ ID NO： 16、SEQ ID NO： 17、SEQ ID NO： 18、SEQ ID NO： 19、SEQ ID NO： 20、SEQ ID NO： 21、SEQ ID NO： 22、或SEQ ID NO： 23的5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续氨基酸残基，并维持了抑制 TGF-β1的能力。
6.根据权利要求1或2所述的产品，其中所述TGF-β1抑制剂肽选自肽 p144 (SEQ ID NO： 6)、p17 (SEQ ID NO：17) 、包含SEQ ID NO： 6或 SEQ ID NO：17的9、10、11、12、13或14个连续氨基酸残基的片段、或它们的药学上可接受的盐，其中所述片段维持了抑制TGF-β1的能力。
7.根据权利要求1 或2所述的产品，其中所述TGF β1抑制剂肽选自p144 (SEQ ID NO：6)、p17 (SEQ ID NO：17) 及其组合。
8.一种产品在制备用于预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的药物组合物中的应用，所述产品选自以下物质组成的组中：
a)  TGF-β1抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，
b)  包含如a)中限定的肽的融合蛋白，
c)  编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，
d)  包含如c)中限定的多核苷酸的载体，
e)  包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如 c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及
f)  a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合。
9.一种预防和/或治疗角膜纤维化或角膜浑浊的方法，其包含向需要治疗的受试者施用治疗有效量的选自以下物质组成的组中的产品：
a)  TGF-β1抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，
b)  包含如a)中限定的肽的融合蛋白，
c)  编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，
d)  包含如c)中限定的多核苷酸的载体，
e)  包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及
f)  a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合。
10.一种用于眼部的药物组合物，其包含治疗有效量的选自以下物质组成的组中的产品：
a)  TGF-β1抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，
b)  包含如a)中限定的肽的融合蛋白，
c)  编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，
d)  包含如c)中限定的多核苷酸的载体，
e)  包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如 c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及
f)   a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合； 
以及所述化合物的药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体是适用于眼部施用的载体。
CN2011800104876A 2010-02-22 2011-02-21 转化生长因子-β1(TGF-β1)抑制剂肽治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的应用 Pending CN102791283A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/709,895 US8158589B2 (en) 2003-08-22 2010-02-22 Peptides with the capacity to bind to transforming growth factor β1 (TGF-β1)
US12/709,895 2010-02-22
PCT/EP2011/052543 WO2011101478A1 (en) 2010-02-22 2011-02-21 USE OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR - BETA 1 (TGF-β1) INHIBITOR PEPTIDES FOR THE TREATMENT OF CORNEAL FIBROSIS AND/OR HAZE

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102791283A true CN102791283A (zh) 2012-11-21

Family

ID=43757920

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011800104876A Pending CN102791283A (zh) 2010-02-22 2011-02-21 转化生长因子-β1(TGF-β1)抑制剂肽治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的应用

Country Status (10)

Country Link
US (2) US8158589B2 (zh)
EP (1) EP2538962A1 (zh)
JP (1) JP2013520405A (zh)
CN (1) CN102791283A (zh)
AU (1) AU2011217181A1 (zh)
BR (1) BR112012020953A2 (zh)
CA (1) CA2790625A1 (zh)
MX (1) MX2012009748A (zh)
RU (1) RU2012140704A (zh)
WO (1) WO2011101478A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110862434A (zh) * 2019-10-28 2020-03-06 中山大学 一种可促进TGF-β1蛋白靶向降解的化合物及其制备方法与应用
WO2021037290A3 (zh) * 2019-08-27 2021-04-15 南京安吉生物科技有限公司 一种融合多肽及其应用
CN113966342A (zh) * 2019-06-05 2022-01-21 Io生物技术公司 TGF-β疫苗

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130158103A1 (en) * 2011-11-23 2013-06-20 The Curators Of The University Of Missouri Method of Tissue-Selective Targeted Gene Transfer
ES2423382B1 (es) * 2012-02-16 2014-07-15 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Inhibidor de la produccion de endoglina soluble y su aplicacion en patologias donde la endoglina soluble tiene un efecto patogenico
WO2013148155A1 (en) * 2012-03-26 2013-10-03 Digna Biotech Usa, Llc Compositions and methods for the treatment of dry eye disease
WO2014028862A1 (en) 2012-08-17 2014-02-20 Cornell University Use of dna in circulating exosomes as a diagnostic marker for metastasic disease
BR112016002015A2 (pt) * 2013-07-30 2017-08-01 Kyoto Prefectural Public Univ Corp medicamentos terapêuticos para ecm em endotélio da córnea
JPWO2015064768A1 (ja) * 2013-10-31 2017-03-09 京都府公立大学法人 角膜内皮の小胞体細胞死関連疾患治療薬
WO2015072580A1 (ja) 2013-11-14 2015-05-21 学校法人同志社 細胞増殖促進または細胞障害抑制による角膜内皮治療薬
US10844436B2 (en) 2014-04-01 2020-11-24 Cornell University Use of double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection
WO2016057702A2 (en) 2014-10-07 2016-04-14 Cornell University Methods for prognosing and preventing metastatic liver disease
US11971402B2 (en) 2015-04-24 2024-04-30 Cornell University Methods and reagents for determination and treatment of organotropic metastasis
EP3368512B1 (en) * 2015-10-27 2023-12-06 Taipei Medical University Indoline derivatives for treatment and/or prevention of fibrosis diseases
US10980787B2 (en) 2015-12-24 2021-04-20 The Doshisha Drug for treating or preventing disorder caused by TGF-B signals, and application thereof
CA3070938A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 The Doshisha Drug for treating or preventing disorder caused by tgf-.beta. signalling, and application thereof
WO2019234221A1 (en) 2018-06-08 2019-12-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for stratification and treatment of a patient suffering from chronic lymphocytic leukemia
RU2700941C1 (ru) * 2019-07-05 2019-09-24 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр реабилитации и курортологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ РК" Минздрава России) Способ предупреждения развития помутнения роговицы при ее механических травмах
RU2701178C1 (ru) * 2019-07-10 2019-09-25 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр реабилитации и курортологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ РК" Минздрава России) Способ ускорения заживления роговицы при ее механических травмах
JP2020073483A (ja) * 2019-10-30 2020-05-14 京都府公立大学法人 角膜内皮ｅｃｍ治療薬
CN115040535B (zh) * 2022-08-15 2022-12-16 华南理工大学 硫酸化透明质酸在制备预防角膜纤维化、角膜瘢痕滴眼液中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1669367A1 (en) * 2003-08-22 2006-06-14 Proyecto de Biomedicina Cima, S.L. Peptides which can bind to transforming growth factor beta 1 (tgf-beta1)
US20070207965A1 (en) * 2006-03-01 2007-09-06 Digna Biotech, S.L. Method for the treatment of skin fibrosis and suitable compositions for such treatment

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4550022A (en) 1981-10-05 1985-10-29 Alcon Laboratories, Inc. Tissue irrigating solution
JPH08151396A (ja) 1994-11-28 1996-06-11 Teijin Ltd Ｈｌａ結合性オリゴペプチド及びそれを含有する免疫調節剤
AU5593398A (en) * 1996-12-05 1998-06-29 Alcon Laboratories, Inc. The use of inhibitors of tgf-beta's functions to ameliorate ocular pathology
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
ES2146552B1 (es) 1998-11-24 2001-04-16 Inst Cientifico Tecnol Navarra Peptidos inhibidores de tgf/31
WO2000037072A1 (en) 1998-12-22 2000-06-29 Alcon Laboratories, Inc. Use of inhibitors of gag synthesis for the treatment of corneal haze
US7179461B2 (en) 2000-10-13 2007-02-20 The Johns Hopkins University Plasminogen activator to prevent corneal and subepithelial haze after laser vision correction surgery
AU2005337776B2 (en) * 2005-10-24 2013-01-31 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Use of TGF-Beta1 inhibitor peptides in the preparation of an immune response modulating agent

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1669367A1 (en) * 2003-08-22 2006-06-14 Proyecto de Biomedicina Cima, S.L. Peptides which can bind to transforming growth factor beta 1 (tgf-beta1)
US20070207965A1 (en) * 2006-03-01 2007-09-06 Digna Biotech, S.L. Method for the treatment of skin fibrosis and suitable compositions for such treatment

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113966342A (zh) * 2019-06-05 2022-01-21 Io生物技术公司 TGF-β疫苗
WO2021037290A3 (zh) * 2019-08-27 2021-04-15 南京安吉生物科技有限公司 一种融合多肽及其应用
GB2600594A (en) * 2019-08-27 2022-05-04 Nanjing Anji Biological Tech Co Ltd Fused polypeptide and use thereof
CN110862434A (zh) * 2019-10-28 2020-03-06 中山大学 一种可促进TGF-β1蛋白靶向降解的化合物及其制备方法与应用
CN110862434B (zh) * 2019-10-28 2021-07-06 中山大学 一种可促进TGF-β1蛋白靶向降解的化合物及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20100222280A1 (en) 2010-09-02
AU2011217181A1 (en) 2012-09-06
US20120315256A1 (en) 2012-12-13
BR112012020953A2 (pt) 2017-02-07
MX2012009748A (es) 2012-12-05
RU2012140704A (ru) 2014-03-27
WO2011101478A1 (en) 2011-08-25
EP2538962A1 (en) 2013-01-02
JP2013520405A (ja) 2013-06-06
US8158589B2 (en) 2012-04-17
CA2790625A1 (en) 2011-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102791283A (zh) 转化生长因子-β1(TGF-β1)抑制剂肽治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的应用
US8957043B2 (en) Methods of treating retinitis pigmentosa using nucleic acids encoding RDCVF1 or RDCVF2
US9353162B2 (en) Disease-associated proteins
CZ149998A3 (cs) Použití proteinového produktu neurotrofického faktoru (GDNF) odvozeného od gliální buněčné linie pro výrobu farmaceutické kompozice
US20030166537A1 (en) Use of GDNF for treating corneal defects
AU2002312794A1 (en) Disease-associated protein
WO2015133459A1 (ja) 角膜疾患若しくは角膜損傷の予防、抑制又は治療剤、細胞シート、細胞培養補助剤、並びに細胞培養方法
CN105017406B (zh) 一类新的具有神经保护功能的多肽
CA3196342A1 (en) Peptide formulations and ophthalmic uses thereof
Wang Development of protein polymer therapeutics for the eye

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
AD01 Patent right deemed abandoned

Effective date of abandoning: 20121121

C20 Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned