ES2423382B1 - Inhibidor de la produccion de endoglina soluble y su aplicacion en patologias donde la endoglina soluble tiene un efecto patogenico - Google Patents

Abstract

Inhibidor de la producción de endoglina soluble y su aplicación en patologías donde la endoglina soluble tiene un efecto patogénico.#La presente invención hace referencia a un péptido aislado derivado de la endoglina caracterizado porque su secuencia aminoacídica comprende un sitio de corte GL para la metaloproteinasa de matriz extracelular 14 (MMP-14 o MT1-MMP), y por ser capaz de bloquear el corte proteolítico de la endoglina por parte de la MMP-14.#Así mismo, la presente invención hace referencia a una composición farmacéutica caracterizada por comprender como ingrediente activo al menos un péptido derivado de la endoglina definido anteriormente.#La presente invención también se refiere al uso de al menos un péptido derivado de la endoglina definido anteriormente o una composición farmacéutica definida anteriormente, para el tratamiento de un desorden o una enfermedad asociada a la endoglina soluble (sEng), o a la MMP-14.

Description

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención pertenece al sector de la biomedicina y la biotecnologia, en particular a la obtención de un medicamento útil para ellratamiento de patologías causadas por la endoglina soluble yfo la MMP-14 (o MT1MMP), así como al diseño de un modelo animal para el estudio de dichas patologías.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El incremento de los niveles de expresión o actividad biológica de la endoglina soluble (sEng) se ha asociado a numerosos desórdenes y enfermedades. Se han encontrado niveles altos de sEng en pacientes con cáncer de mama y cáncer de colon metaslálicos, también en desórdenes hipertensos asociados al embarazo (como preeclampsia (PE), eclampsia, hipertensión gestacional, hipertensión crónica, Sindrome HELLP, y embarazos con niños SGA), hipertensión pulmonar, y malaria. También se identifican altos niveles de endoglina soluble en pacientes con la enfermedad del Alzheimer, pacientes con malformaciones cerebrales arteriovenosas, e individuos problemas de disfunción del ventriculo izquierdo, o en pacientes que sufren diabetes e hipertensión.

Existen numerosos ejemplos de tratamientos de patologias, preferentemente cáncer, que comprenden la administración de endoglina, o de sEng o un fragmento biológicamente activo de las mismas.

Por ejemplo W02010018207A1 (Univ Wuerzburg J Maximilians) describe unos péptidos artificiales derivados de endoglina para el tratamiento del cáncer. Además, también define el uso de dichos péptidos artificiales para la fabricación de un medicamento y/o una vacuna para el tratamiento y/o la prevención del cáncer o de un trastomo inmunológico.

Otro ejemplo es W02007143023A1 (Belh Israel Hospital), donde se define un polipéptido de endoglina soluble o un fragmento biológicamente activo de la misma, para su uso en el tratamiento de una enfermedad angiogénica, preferentemente cáncer, mediante la administración de endoglina soluble, sola o en combinación con un agente quimioterapéutico, un inhibidor de la angiogénesis, o un compuesto antiproliferativo.

Los desórdenes y enfermedades causadas por un incremento en los niveles de sEng, se han caracterizado por un aumento de la expresión o de la actividad biológica de TGF-¡3.

US6015693A (Telios Pharmaceuticals INC) describe un método para tratar condiciones patológicas mediadas por TGF-¡3, mediante la administración de endoglina o un fragmento de la misma con capacidad de unión a TGF

13. El estudio de la función del correceptor de TGF-13 endoglina en la carcinogénesis de piel de ratón ha permitido demostrar que durante la progresión a carcinomas indiferenciados malignos, se libera la endoglina asociada a la membrana plasmática en forma de sEng.

Asi mismo, W02011088047A1 (Beth Israel Hospital) describe métodos para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de pacientes que presentan enfermedades asociadas a sEng (por un aumento de los niveles de expresión o actividad de TGF-beta) o bien eventos que contribuyen a la patologia de dicha enfermedad y/o que puede ser inhibida o modulada mediante la administración de sEng (como fibrosis, angiogénesis, activación inmunológica). También incluyen como enfermedades asociadas a sEng, desórdenes fibróticos de órganos internos y de cicatrización de la piel, donde TGF-beta contribuye significativamente; o desórdenes caracterizados por un exceso de angiogénesis (como hemangiomas, o hemangiomatosis de los capilares pulmonares); o crecimiento anormal de los vasos sanguineos como en cáncer (cáncer de mama, próstata, colon, pulmón, cerebro y cuello, higado, riñón, sistema renal y endometrio); o desórdenes inflamatorios e inmunes.

También se ha encontrado que pacientes con pre-eclampsia (PE) producen altas cantidades de sEng y que estos niveles altos de sEng contribuyen a la patogénesis de la PE. La PE es una de las complicaciones más graves del embarazo. Es responsable de las tasa de mortalidad más altas tanto en la mujer embarazada como en el neonato. A pesar de que durante los últimos 20 años se han acumulado un gran número de evidencias sobre la fisiopatologia de la PE, el mecanismo exacto subyacente permanece por ser elucidado. Se acepta comúnmente que su patogenicidad está asociada a la placenta hip6xica. La placenta hipóxica es responsable de la disfunción de la vasculatura matema mediante el aumento de la liberación placentaria de factores antiangiogénicos tales como sFlt-1 y endoglina soluble (sEng). Estos receptores solubles unen VEGF, PLGF y miembros de la superfamilia del TGF-13 en la circulación materna, contribuyendo a la disfunción endotelial en los tej idos matemos (Powe el al., 2011). El embarazo normal también se caracteriza por inflamación sistémica, estrés oxidativo y alteraciones en los niveles de factores angiogénicos y reactividad vascular. Tanto la placenta como la vasculatura matema son fuentes principales de especies reactivas de oxigeno y nitrógeno, las cuales

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pueden producir potentes compuestos pro-oxidantes que modifican las proteínas de forma covalente y alteran la función vascular en PE. Estudios recientes han demostrado que la reducción en la periusión uteroplacentaria que causa isquemia placentaria resulta en un incremento de los niveles de 5fll-1 y sEng en el suero, conectando por tanto de forma solida la isquemia placentaria con el aumento de estos factores anli-angiogénicos (Foidart el al., 2009). Sin embargo, estos estudios no han elucidado el mecanismo subyacente del aumento de estos factores anti-angiogénicos inducido por la isquemia. Por otra parte, hasta ahora no se dispone de un modelo animal de hipertensión similar al que ocurre en PE y que implique la inducción de la expresión de endoglina soluble endógena.

US2007104707 (Beth Israel Hospital), describe un método para tratar o prevenir un trastomo hipertensivo durante el embarazo, preferentemente preeclampsia, mediante la administración de un compuesto capaz de disminuir o bien los niveles de expresión de la endoglina soluble o bien su actividad biológica. Dicho compuesto puede ser capaz de inhibir una enzima proteolitica como una metaloproteinasa de matriz (MMP). US20071 04707 identifica un posible sitio de corte para una MMP en el dominio extracelular de la endoglina, responsable de la liberación de la endoglina soluble, indicando de forma preferente, que la MMP puede ser MMP-9 o MT1-MMP.

Sin embargo, Hawinkels L. J. et al., indican que la MMP responsable del mecanismo de liberación de la sEng en el medio extracelular es la MMP-14, y describen el sitio de corte G-L de la MMP-14 en la posición 586-587 de la secuencia aminoacídica de la endoglina (Hawinkels L. J. et al., 2010). Estas evidencias han sido recientemente confirmadas mediante el estudio de la inhibición de la expresión de MMP-14 en la placenta mediante el empleo de un inhibidor de MMP de amplio espectro (GM6001) y siRNA de MMP-14 (Kaitu'u-Lino T. J. efa/., 2012).

Actualmente existe la necesidad de identificar un método para bloquear in vitro e in vivo el corte proteolitico de la endoglina por parte de MMP-14 para tratar desórdenes y enfermedades asociadas a la sEng o a la MMP-14 (Lopez-Novoa y Bernabeu, 2010; Powe et al., 2011; Arroyo et al., 2007). Así mismo, también existe la necesidad de desarrollar un modelo animal que permita estudiar desórdenes y enfermedades asociadas a la endoglina soluble y/o la MMP-14.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención hace referencia a un péptido aislado derivado de la endoglina caracterizado porque su secuencia aminoacidica comprende un sitio de corte GL para la metaloproteinasa de matriz extracelular 14 (MMP-14 o MT1-MMP), y por ser capaz de bloquear el corte proteolitico de la endoglina por parte de la MMP-14.

Así mismo, la presente invención hace referencia a una composición farmacéutica caracterizada por comprender como ingrediente activo al menos un péptido derivado de la endoglina definido anteriormente.

La presente invención también se refiere al uso de al menos un péptido derivado de la endoglina definido anteriormente o una composición farmacéutica definida anteriormente, para el tratamiento de un desorden o una enfermedad asociada a la endoglina soluble (sEng), o a la MMP-14.

Otro aspecto de la presente invención es un método de tratamiento de un desorden o una enfermedad asociada a la sEng o a la MMP-14, caracterizado por comprender la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente activa de un péptido derivado de la endoglina definido anteriormente o una composición farmacéutica definida anteriormente.

La presente invención hace referencia también a un kit para el tratamiento de un desorden o una enfermedad asociada a sEng, o a la MMP-14, caracterizado por comprender un péptido derivado de la endoglina definido anteriormente o una composición farmacéutica definida anteriormente.

Un último aspecto de la presente invención, hace referencia a un modelo animal para el estudio de un desorden

o una enfermedad asociada a la sEng o a la MMP-14, caracterizado porque se pueden inducir niveles de expresión de sEng endógena de al menos 7ng/mL mediante la administración de al menos un agonista de LXR. Preferentemente, el agonista de LXR es un oxisterol.

El presente modelo animal es preferentemente un modelo murino, en concreto un ratón, en el que la presencia del péptido inhibe la liberación de endoglina soluble debido a que inhibe la actividad de MMP-14. Por tanto, el mecanismo de acción es común con otras patologias como cáncer o inflamación, donde la sEng o MMP-14 pueden jugar un papel en la patogenia.

La presente invención también hace referencia al método de obtención del modelo animal definido anteriormente para el estudio de un desorden o una enfermedad asociada a la sEng o a la MMP-14, caracterizado porque el protocolo de inducción de sEng in vivo comprende administrar diariamente al animal una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agonista de LXR como primer ingrediente activo, durante un periodo de tiempo de al menos 4-6 días.

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En concreto, en la presente invención hace referencia a los efectos de la hipoxia y sus vías corriente abajo en la liberación de sEng en la linea celular JAR parecida a los lrofoblaslos. En condiciones de hipoxia, se produce un aumento de la liberación de sEng al medio de cultivo de las células JAR en paralelo a una elevada formación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Debido a que este aumento de los niveles de ROS generalmente se asocia con la formación de oxisleroles, probamos el 22-(R)-hidroxicolesterol (22-R), descrito como un ligando natural de LXR. El tratamiento de las células JAR con 22-(R) o el agonista sintético de LXR, T0901317 (T09), provocó un claro aumento de la liberación de sEng. Además, la endoglina humana de transfectantes estables sufria corte proteolitico cuando se sometían a hipoxia. El tratamiento de las células JAR con T09 provoca un aumento de la expresión de MMP-14 y de su actividad, asi como una reducción significativa de los niveles de mARN Y proteina de su inhibidor endógeno TIMP-3. La implicación de la via MMP-14fT1MP-3 en la liberación de sEng se confirmó utilizando siARN especifico para TIMP-3, TIMP-3 recombinante y MMP-14 recombinante. Algunos péptidos relacionados con endoglina que contienen la secuencia consenso de corte para MMP-14, GL, son capaces de bloquear la actividad de MMP-14 y la liberación de sEng en células JAR. Además, cuando se tratan ratones con T09 o 22-R se produce un aumento de los niveles plasmáticos de sEng, junto con un aumento de la presión arterial sistólica (SAP). Por otro lado, ratones que sobre-expresan sEng muestran un aumento de sus valores de SAPo Finalmente, cuando se administra un péptido de endoglina que contiene el sitio de corte para MMP-14 se evita el aumento de los niveles de sEng y de la SAP dependiente de los oxisteroles en los ratones. Estos estudios sugieren la posible utilidad terapéutica de los péptidos de endoglina en aquellas patologias donde sEng o MMP-14 juegan un papel patogénico.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN

En una realización preferente de la presente invención, el péptido aislado derivado de la endoglina cuya secuencia aminoacidica comprende un sitio de corte GL para la MMP-14, y que es capaz de bloquear el corte proteolitico de la endoglina por parte de la MMP-14, se caracteriza por que su secuencia aminoacidica tiene el extremo N-terminal acetilado y el extremo e-terminal amidado.

En otra realización de la presente invención, el péplidO aislado derivado de la endoglina definido anteriormente se caracteriza por que comprende al menos de 8 a 10 residuos aminoacidicos.

Otra realización preferente de la presente invención hace referencia al péptido aislado derivado de la endoglina cuya secuencia aminoacidica comprende un sitio de corte GL para la MMP-14, y que es capaz de bloquear el corte proteolitico de la endoglina por parte de la MMP-14, caracterizado por que su secuencia aminoacidica presenta un porcentaje de homologia de al menos el 95% respecto a una secuencia aminoacidica seleccionada entre: SEa ID No: 1 y SEa ID No: 2.

Otra realización preferente de la presente invención hace referencia al peptido aislado derivado de la endoglina cuya secuencia aminoacidica comprende un sitio de corte GL para la MMP-14, y que es capaz de bloquear el corte proteolitico de la endoglina por parte de la MMP-14, caracterizado por que su secuencia aminoacidica es SEQ ID No: 1 o SEO ID No: 2, y más preferentemente su secuencia aminoacidica es SEQ ID No: 1.

La presente invención también hace referencia a una secuencia nucleolídica aislada caracterizada por codificar para uno cualquiera de los péptidos derivados de la endoglina definidos anteriormente. Dicha secuencia nucleotidica puede encontrarse contenida dentro de una estructura genética o vector.

En una realización preferente de la presente invención, la composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo al menos un péptido derivado de la endoglina definido anteriormente y/o una secuencia nucleotidica definida anteriormente, caracterizada por comprender un segundo ingrediente activo que más preferentemente es L-o-fosfatidilcolina.

Otra realización preferente de la presente invención hace referencia a la composición farmacéutica anteriormente definida caracterizada por administrarse en forma de mezda liposomal.

En una realización preferente de la presente invención, el uso de al menos un péptido derivado de la endoglina definido anteriormente o una composición farmacéutica definida anteriormente, para el tratamiento de un desorden o una enfermedad asociada a la sEng, o a la MMP-14, caracterizado por que la enfermedad asociada a la sEng o a la MMP-14 se selecciona de entre el siguiente grupo: preeclampsia, cáncer, hipertensión, enfermedades inflamatorias y diabetes. Más preferentemente dicha enfermedad asociada a la sEng o a la MMP14 es preeclampsia.

Otra realización preferente de la presente invención hace referencia al uso definido anteriormente, caracterizado por que la composición farmacéutica comprende un segundo ingrediente activo, el cual más preferentemente es L -o-fosfatidilcolina.

Otra realización preferente de la presente invención hace referencia al uso definido anteriormente, caracterizado

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por que el péplido derivado de la endoglina o la composición farmacéutica se administra en forma de mezcla liposomal, la cual más preferentemente se administra en forma de inyección intravenosa o parenleral, o bien se suministra en forma oral.

La presente invención hace referencia al uso de un péptido derivado de la endoglina definido anteriormente o una composición farmacéutica definida anteriormente, en el tratamiento y/o prevención de un aumento de la presión arterial sistémica (PAS) ylo en la regulación de la homeostasis vascular.

La presente invención también hace referencia al uso de al menos un péplido derivado de la endoglina definido anteriormente o una composición farmacéutica definida anteriormente, en la fabricación de un medicamento o una composición farmacéutica para el tratamiento de un desorden o una enfermedad asociada a la sEng o a la MMP-14.

En otra realización preferente de la presente invención, el método de tratamiento de un desorden o una enfermedad asociada a la sEng o a la MMP-14, que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente activa de un péptido derivado de la endoglina definido anteriormente o una composición farmacéutica definida anteriormente, caracterizado por que la enfermedad asociada a la sEng o a la MMP-14 se selecciona de entre el siguiente grupo: preeclampsia, cáncer, hipertensión, enfermedades inflamatorias y diabetes, y más preferentemente dicha enfermedad asociada a la sEng o a la MMP-14 es preeclampsia.

En otra realización preferente de la presente invención, el método de tratamiento definido anteriormente se caracteriza por que la composición farmacéutica comprende un segundo ingrediente activo, el cual más preferentemente es L-o-fosfatid ilcolina.

En otra realización preferente de la presente invención, el método de tratamiento definido anteriormente se caracteriza por que el péptido derivado de la endoglina o la composición farmacéutica se administra en forma de mezcla liposomal, la cual se suministra en forma de inyección intravenosa o parenteral, o bien se suministra en forma oral.

En una realización preferente de la presente invención, el método de obtención del modelo animal definido anteriormente para el estudio de un desorden o una enfermedad asociada a la sEng o a la MMP-14, que comprende administrar diariamente al animal una cantidad farmacológicamente eficaz de al menos un agonista de LXR, preferentemente un oxislerol, y más preferentemente 22(R}-hidroxicolesterol (22-R), como primer ingrediente activo, durante un periodo de tiempo de al menos 4-6 dias, caracterizado por que dicho método comprende administrar un segundo ingrediente activo, que más preferentemente puede ser L-o-fosfatidilcolina, a una relación molar de of 1 :2. Aún más preferentemente, ambos ingredientes se administran en forma de mezcla liposomal, pudiéndose administrar al animal a través de una inyección intravenosa o parenteral, o bien de forma oral.

En el ejemplo de la presente invención, como realización particular aunque no limitante para la invención, se describe dicho método caracterizado por que el modelo es murino, en concreto ralones, y la mezcla liposomal se suministra en forma de inyección intravenosa en la vena de la cola, administrándose como primer ingrediente activo 40-50mg/kg de 22(R)-hidroxicolesterol (22-R) y como segundo ingrediente activo L-a-fosfatid ilcolina a una relación molar de of 1 :2, respectivamente.

En la presente invención el término: "péptido derivado de la endaglina", se refiere a la secuencia de aminoácidos que incluya la secuencia GL y cualquier combinación de los aminoácidos presentes en las secuencias SEO ID No: 1 y SEO ID No: 2, combinada o no con cualquier adición de otros aminoácidos o compuestos sintéticos artificiales .

En la presente invención el término: "sitio de corte GL para la MMP-14", se refiere a una secuencia de aminoácidos donde MMP-14 sea capaz de romper el enlace peptidico entre glicina y leucina, estando la glicina en el extremo amino y la leucina en el extremo cartloxilo.

En la presente invención el término: "un desorden o una enfermedad asociada a fa sEng, o a fa MMP-14", se refiere a aquellas patologías que muestran niveles elevados de sEng y/o aumento de la actividad de MMP-14, incluyendo enfermedades como el cáncer, patologías asociadas a inflamación, patologías asociadas a la neoangiogénesis o con disfunción endotelial como la hipertensión y la diabetes.

En la presente invención el término: "agonistas de LXf?' se refiere a aquellos compuestos naturales o artificiales capaces de unirse a los receptores nucleares LXR, activando asi su vía de señalización.

En la presente invención el término: "axisteroles" se refiere a derivados del colesterol formados por oxidación del mismo.

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La presente invención hace referencia al mecanismo de liberación de sEng, diseccionando la vía implicada en el mismo (Fig. 8). Nuestros datos sugieren que los niveles elevados de sEng son consecuencia de la hipoxia, como se demuestra en los experimentos con las células JAR y los transfectantes estables que expresan endoglina humana, así como en los experimentos de silenciamiento de HIF-1 (Fig. 1). El desarrollo de la hipoxia implica la generación de ROS (Fig. 1E,F). Todo esto encaja bien con los niveles elevados de ROS postulados en la preeclampsia (AI-Gubory et al., 2010). Ya que el colesterol es una diana natural de ROS dando lugar a los oxisteroles, investigamos la posible imp licación de estos oxisteroles y sus receptores LXR en la generación de sEng. Así, encontramos que los oxisteroles son capaces de aumentar la concentración de sEng actuando a tres niveles distintos. Los oxisteroles: i) aumentan los niveles de endoglina de superficie celular de acuerdo con lo descrito anterionnente (Henry-Berger et al., 2008); ii) aumentan la expresión en superficie de MMP-14, una proteasa unida a membrana que puede cortar la endoglina de superficie (Hawinkels el aJ., 2010); y iii) inhibe la expresión de TIMP-3, inhibidor de MMP-14. Estos datos indican que la liberación de sEng es provocada por oxisteroles, los cuales actúan específicamente via LXR. Además, sugieres que LXR juega un papel muy importante en la liberación de sEng. Puesto que los embarazos normales se asocian con un aumento de la oxidación de partículas LoL y en embarazos con preeclampsia existe evidencia d una producción anormal de peróxidos lipídicos en la sangre matema, se puede especular que un aumento de la internalización de oxisteroles por parte de los trofoblastos podría activar los receptores LXR y aumentar los niveles de endoglina de membrana y soluble. En este sentido, los trofoblastos humanos expresan niveles muy elevados de endoglina de superficie (Gougos el al., 1992). Además, existen evidencias que demuestran la implicación de la vía de LXR en la biología de los trofoblastos. De hecho, los oxisteroles inhiben la diferenciación y la fusión de trofoblastos a través de la vía de LXR (Aye el al., 2011). Los lipidos y las lipoproteínas oxidadas de baja densidad y otros agonistas de LXR modulan la invasión de los trofoblastos (Pavan el al., 2004; Fournier el al., 2008). Ya que la expresión de endoglina regula la diferenciación y la invasión de los trofoblastos (Caniggia et al., 1997; Mano et al., 2011), sería interesante estudiar la contribución específica de la fonna soluble de endoglina inducida por LXR en estos procesos.

Aunque la activación de la vía de LXR produce aumento transcripcional, y por lo tanto, aumenta la expresión de endoglina de superficie (Henry-Berger el al., 2008), nuestros datos indican que la sEng inducida por los oxisteroles no solo se debe a un aumento de los niveles de endoglina de superficie, sino también a un aumento en la actividad de MMP-14. De hecho, en los transfectantes estables de endoglina, que carecen del promotor de la misma y por lo tanto, de los elementos de respuesta a LXR presentes en él (Henry-Berger el al., 2008), también se induce la liberación de sEng en respuesta a la activación de LXR (Fig. 2C). Un gen diana de LXR es TIMP-3 (Fig. 3), un miembro de una familia de cuatro proteinas secretadas (TIMP-1 -TIMP-4) que son inhibidores endógenos de metaloproteasas de matriz (MMPs). Puesto que TIMP-3 es un inhibidor de MMP-14, la disminución de la expresión de TIMP-3, prooucida por LXR, puede llevar a la activación de MMP-14. Nuestros datos no solo apoyan esta hipótesis, sino que proporcionan pruebas del aumento de la expresión de MMP-14 debido a la activación de LXR (Figs. 3 y 4), sugiriendo que la expresión tanto de TIMP-3 como de MMP-14 está coordinada en el tiempo para regular la liberación de sEng. Los resultados in vitro se confinnaron mediante experimentos in vivo. Así, la administración de T09 o del oxisterol 22-R a los ratones produce un aumento de los niveles de sEng (Fig. 5). Basándonos en esta capacidad del péptido P583, que contiene el motivo de corte GL, para interferir la actividad de MMP-14 y el proceso de corte proteolitico de la endoglina de membrana in vitro, decidimos estudiar los efectos de este péptido in vivo. La ca-inyección intravenosa del péptido P583 con el oxisterol 22R es capaz de impedir la liberación de sEng que se produce debido a la activación de LXR, sugiriendo que este péptido podría servir para uso terapéutico.

Los experimentos demostraron que la administración del agonista T09 o el oxisterol 22-R producen no solo un aumento de los niveles de sEng sino también un aumento marcado de la presión arterial sistólica. Todo esto está en acuerdo con: í) la asociación entre un polímorfismo común del gen de LXRbeta y la preeclampsía (Mouzat el al. , 2011); ii) el aumento de sEng en la preeclampsia; y iii) el papel patogénico de sEng en la hipertensión. De acuerdo con esta hipótesis, se observó que los ratones transgenicos que sobre-expresan sEng humana mostraban un aumento claro de la presión arterial sistólica junto con altos niveles de sEng circulante (Fig. BC). Estos datos subrayan la importancia de la via de oxisterol/LXR en la modificación de la presión arterial.

Tratar la hipertensión es muy importante en la preeclampsia debido a la ausencia de terapias efectivas. Sin embargo, los estudios in vivo del péptido P583 dan algo de esperanza en esta patología. De hecho, la coinyección intravenosa de of P583 con el oxisterol 22-R producen una inhibición del aumento de la presión arterial sistólica inducida por LXR. Puesto que la secuencia de P583, que es SEQ ID No: 1 (aminoácidos 583-590 de endoglina) incluye el sitio de corte GL para MMP-14, el mecanismo más probable por el que actúa P583 es la competición por MMP-14 con la endoglina de membrana. Una aplicación potencial de estos estudios es el uso terapéutico de este tipo de péptidOS en mujeres con preedampsia para contrarrestar el efecto patogénico de los niveles elevados de sEng en estas pacientes. Serian necesarios más estudios para confirmar el efecto antihipertensivo de este péptido en modelos experimentales de preeclampsia yen ensayos clínicos.

Finalmente, además de la preeclampsia, se han observado niveles elevados de sEng en el suero, plasma y otros fluidos de pacientes que sufren otras enfermedades, como el cáncer y patologías asociadas a inflamación o con

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disfunción endotelial como la hipertensión y la diabetes (Bemabeu el al., 2009; Blazquez-Medela el al, 2010 ; Fonsatti el al., 2010; Lopez-Novoa y Bernabeu, 2010). Puesto que los niveles elevados de sEng se asocian con un mal pronóstico en pacientes con tumores sólidos con metástasis y con mayor daño en órganos diana en pacientes con hipertensión o diabetes (Blazquez-Medela el al, 2010), estos estudios podrían servir también para modular la función de sEng en dichas patologías.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra ~comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técn icas , aditivos , componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Efecto de la hipoxia en la liberación de sEng. A. Las células JAR se incubaron con OFO o 1% de oxígeno durante 24 horas y los niveles de sEng se midieron mediante ELlSA. B. Los transfectantes estables de mioblastos de rata (L6E9) y fibroblastos de ratón (L929) que expresan endoglina humana se incubaron en condiciones de hipoxia (1% oxigeno) durante 24 horas y los niveles de sEng se midieron mediante ELlSA. C y O. Las cé lulas JAR se transfectaron con tres RNA interferentes (siRNA) para si lenciar HJF-1 . Después de 24 horas, se realizó una RT-PCR a tiempo real para medir la expresión de HIF-1 (C), y los niveles de sEng se determinaron mediante HISA (D). Un siRNA aleatorio (siSC) se transfectó como control. También se emplearon células control sin tratar (CTL). E y F. Las células JAR se sometieron a condiciones de hipoxia (1% oxigeno) en presencia o ausencia del antioxidante TROLOX®. Después de 24 horas, se recogió el medio y se analizaron los niveles de sEng mediante HISA (F). A continuación, las células JAR se incubaron con CM-H20CFoA, un indicador permeable a la célula para especies reactivas de oxígeno, y se determinó la formación de ROS med iante citometría de flujo (E).

Figura 2. Efecto de los ligandos de LXR sobre la producción de sEng. Las células se trataron con diferentes combinaciones de T09, RA y 22-R durante 24 horas y se analizaron los niveles de sEng en los sobrenadantes mediante ELlSA. A. Células JAR. B. Células endoteliales de vena de cordón umbi lical (HUVECs). C. Los transfectantes estables de mioblastos de rata (L6E9) y fibroblastos de ratón (L929) que expresan endoglina humana se incubaron con los ligandos de LXR, como se indica .

Figura 3. Implicación de TIMP-3 en la vía LXRloxisterol. A. Las células JAR se trataron con T09 durante 24 horas y se extrajo el ARN total. El análisis por RT-PCR semicuantitativa muestra que los niveles de mARN de TIMP-3 se redujeron después del tratamiento. Como control, se utilizó GAPoH, cuyos niveles de mARN no cambiaron. B. Las células JAR se trataron con T09, RA, 22-R, DFO o 1% de oxígeno durante 2 horas, como se indica. Los medios condicionados se recogieron y los niveles de TIMP-3 se analizaron mediante ELlSA. C y O. Las células JAR se transfectaron con tres ARNs interferentes (siRNA) para silenciar T/MP-3. Después de 24 horas, se realizó una RT-PCR a tiempo real para medir la expresión de TIMP-3 (C), mientras que los niveles de sEng se determinaron por ELlSA (O). Un siARN (siSC) aleatorio se transfectó como control. E. Las células JAR se trataron con las proteinas TIMP-1, -2 Y -3 recombinantes durante 24 horas y los niveles de sEng se analizaron med iante ELlSA.

Figura 4. Implicación de MMP-14 en la liberación de sEng. A. Las células JAR se transfectaron de manera transitoria con un vector que codifica MMP-14 o un vector vacio (EV) y se midieron los niveles de sEng mediante ELlSA. B. Células COS se co-transfectaron de manera transitoria con un vector que codifica endoglina o un vector vacio (EV) en presencia o ausencia de un vector que codifica MMP-14. Los niveles de sEng en el medio de cultivo se midieron mediante ELlSA. C. Las células JAR se cultivaron en presencia o ausencia de T09 o el inhibidor de MMPs doxiciclina (Dox) durante 24 horas. A continuación, el sustrato fluorogénico de MMP-14 McaPLGL-Opa-AR-NHl se añadió al cultivo y se determinó la fluorescencia (FU). O. Efecto de los péptidos de endoglina en la actividad de MMP-14. En un sistema libre de células, MMP-14 humana recombinante se activó con APMA y se añadió el sustrato fluorogénico Mca-PLGL-Opa-AR-NH2(Fluo) en presencia o ausencia de los péptidos de endoglina P230 (SEO ID No: 3), P447 (SEO ID No: 2) o P583 (SEO 10 No: 1) o la versión recombinante del dominio extracelular de endoglina P26-586 (SEO ID No: 4). Como controles negativos se emplearon MMP-14, el péptido fluorogénico (Fluo) y MMP-14 inactiva (iMMP-14). Después de una incubación de una hora a 37°C, se añadió una solución para detener la reacción y se determinó la fluorescencia. E. Efecto de los péptidos de endoglina en la liberación de sEng. Las células JAR se cultivaron durante 48 horas en presencia de los péptidos de endoglina P583 (Diana de la actividad de MMP-14) y P230 (control negativo) o ooxiciclina (Dox). Los medios de cultivo se recogieron y los niveles de sEng se analizaron mediante ELlSA. F. Efecto de los ligandos de LXR en la expresión de MMP-14. Las células JAR se incubaron con T09, RA, 22-R o vehículo (CTL) durante 24 horas. A continuación, se analizó la MMP-14 de superficie mediante citometria de flujo de inmunofluorescencia con un anticuerpo anti-MMP-14 (Fig. 11) Y se representó el indice de expresión (El) de la MMP-14 unida a membrana.

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Figura 5. Efecto dios ligandos de LXR en la preslon arterial. A los ratones se les inyectó intraperitonealmente de forma diaria T0901317 (A y el, 22-R (B Y D) o vehículo (Control) durante 5 días. Durante el tratamiento, la presión arterial sistólica se midió diariamente con un esfingomanómetro de cola (NIPREM 546). El ultimo día de tratamiento, se sacrificaron los ratones, se recogieron muestras de suero y los niveles de sEng se determinaron mediante ELlSA (C y D). El número de animales (n) empleado en cada experimento se indica en las figuras .

Figura 6. Efecto de la sobre-expresión de sEng en la presión arterial. La presión arterial sistólica se midió con un esfingomanómetro (NIPREM 546) en ratones de 3 meses de edad salvajes (WT) y transgénicos para endoglina soluble (soI.Eng+).

Figura 7. Efeclo de los peplidos de endoglina en la presión arterial elevada inducida por oxisleroles. A. A los ratones se les inyectó de forma intravenosa diariamente vehículo (CTl) o 22-R en ausencia o presencia de los péptidos P230 o P583. Durante el tratamiento, la presión arterial sistólica se midió diariamente con un equipo NIPREM (A). El último dia de tratamiento, los ratones fueron sacrificados, se recogieron muestras de suero y se analizaron los niveles de sEng med iante ELlSA (8 ). El número de animales (n=4) empleados en cada experimento se indica en la figura.

Figura 8. Modelo hipotetico de la generación y el papel de sEng en la homeostasis vascular. la hipoxia induce ROS, que convierte el colesterol en oxisteroles. Dichos oxisteroles se unen especificamente a los heterodimeros lXR/RXR provocando un aumento de los niveles del inhibidor de MMP-14, TIMP-3. Como consecuencia, hay un aumento de la actividad de MMP-14 que corta proteolilicamente la región yuxtamembrana de la endoglina de membrana y genera así, la endoglina soluble (sEng ). Niveles elevados de sEng producen un aumento de la presión arterial sistólica en los ratones. El tratamiento con un péptido de endoglina que es sustrato de MMP-14 contrarresta la hipertensión inducida por los oxisteroles in vivo.

Figura 9. Efeclo de los ligandos de LXR sobre la expl'"esión de endoglina. las células JAR se incubaron con T09, RA, 22-R o vehiculo (0.1"/" de etanol en medio de cultivo), durante 24 horas. A continuación, se mide la endoglina de superficie de las células mediante citometria de flujo (A y B), mientras que los medios condicionados se almacenaron adecuadamente para medir los niveles de sEng (ver Fig. 2). A. Análisis por citometria de flujo. Las células se analizaron por citometria de flujo por inmunofluorescencia con el anticuerpo P4A4, empleando como control negativo mAb X63. El porcentaje de células positivas y la intensidad de fluorescencia promedio se indican en la figura. B. El indice de expresión de endoglina de membrana (mEng) se calculó empleando los datos del panel A, multiplicando el porcentaje de células positivas por la intensidad de fluorescencia promedio de cada muestra. C. Comparativa de la inducción de endoglina soluble (sEng) por lXR frente a la inducción de la endoglina de membrana (mEng). El indice de expresión de mEng (8) y sEng (Fig. 2) se calculó y se dio un valor arbitrario de 1 a la muestra sin tratar (CTL). Se observó un marcado aumento de la relación sEng/mEng debido al tratamiento con los ligandos.

Figura 10. Análisis de colesterol y 22-R-hidroxicolesterol en los extractos celulares. los lipidos se analizaron por cromatografia de gases acoplada a espectrometria de masas (GC-MS) empleando el equipo Agilent 7890A (Agilent Technologies). En los paneles A-O el eje horizontal representa el tiempo de elución, mientras que el eje vertical representa la intensidad de la señal en picoamperios (pA). El panel A muestra el perfil del disolvente (Vehiculo), mientras el panel 8 muestra los dos marcadores control, colesterol y 22-R purificados. En los paneles e y O los extractos lipidicos de las células JAR, incubadas en hipoxia o normoxia durante 24 horas, se analizaron por GC-MS. El tiempo de elución y posición de los picos de colesterol y 22-R se indican en la figura. El área de estos picos se midió en tres experimentos diferentes y la media d ellos se representa en el panel E. Los niveles de 22(R)OH en las células JAR sometidas a hipoxia mostraron un marcado aumento(-4-veces de inducción) respecto a las células sometidas a normoxia. La identificación de los picos obtenidos en GC-MS se confirmó con la información disponible en las bases de datos de espectrometria de masas.

Figura 11. Efecto de los ligandos de LXR sobre la expresión de MMP-14. Las células JAR se incubaron con T09, RA, 22-R o el vehiculo (0.1% de etanol en el medio de cultivo), durante 24 horas. Las células se emplearon para medir la MMP-14 de la superficie celular mediante citometria de flujo de inmunofluorescencia con un anticuerpo de ratón anti-MMP-14 mAb (EP1264Y), empleando otro anticuerpo como control negativo. El porcentaje de células positivas y la intensidad de la fluorescencia promedio se indican en la figura. Se observó un aumento de la expresión de MMP-14 debido al tratamiento con los ligandos de l XR.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos especificos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invenciÓn. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aqui se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

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La presente invención demuestra que la vía inducida por la preeclampsia que implica a las ROS y los oxisteroles activa el corte proteolítico de endoglina por parte de MMP-14 dando lugar a su forma soluble, proceso que puede ser bloqueado in vitro e in vivo por péptidos derivados de endoglina que contiene el sitio de corte de MMP-14. Es más, los ratones tratados con oxisteroles o agonistas sintéticos de LXR como el T09 sufren un aumento de los niveles de sEng en plasma junto con un aumento de su PASoTambién se observa un aumento de la PAS en ratones que sobreexpresan endoglina soluble en plasma, sugiriendo un papel de la vía de LXR en la liberación de endoglina soluble y su contribución a la regulación de la homeostasis vascular.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo Celular

La linea celular de coriocarcinoma humano JAR se cultivó en RPMI-1640 (Letamendia el al. , 1998a). Los transfectantes estables de mioblastos de rata L6E9 (Letamendia et al., 1998b) y fibroblastos de ratón L929 (Bellon el al., 1993) que expresan endoglina humana se cultivaron en ~Dulbecco's modified Eagle's medium" (DMEM) con 0.4 mg/ml de geneticina (Calbiochem, San Diego, CA, USA). Las células humanas endoteliales de vena umbilical (HUVEC) se cultivaron en medio EBM2 suplementado con EGM2 (Lonza, Walkersville, MD, USA). Todos los medios se suplementaron con un 10% de suero fetal inactivado por calor (FCS), 2 mM de L-glutamina y100 U/mi de penicilina-estreptomicina. Las células se crecieron en una atmósfera al 5% C02 a 37°C. Para los estudios de activación de LXR, las células se incubaron durante 24 horas con 1-51JM del agonista sintético de LXR, T0901317 (Calbiochem), 5IJM 22(R)-hidroxicolesterol (22-R), 10IJM de ácido 9-cis-Retinoico (RA), ambos de Sigma-Aldrich (L'lsle D'Abeau, France). Para los ensayos de inhibición de metaloproteasas, las células se incubaron durante 24 horas con 10lJg/ml de rhTIMP-1, rhTIMP-2 o rhTIMP-3 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 50IJM de doxiciclina (Sigma-Aldrich, L'lsle D'Abeau, France) o 15~M de péptidos derivados de endoglina (descritos más adelante). Para los tratamientos de hipoxia, las células JAR se incubaron en condiciones hipóxicas a 1%,02 utilizando un incubador modular MIC-101 (Billups-Rothenberg Inc., CA) o en presencia de 100IJM de DFO (deferoxiamine mesylate salt; Sigma-Aldrich, L'lsle D'Abeau, France) durante 24 horas.

Plásmidos y transfecciones celulares

El vector Que codifica endoglina humana marcada con el epítopo de hemaglutinina (HA) en el vector pDisplay ha sido descrito (Guerrero-Esleo et al., 2002). El vector de expresión que codifica MMP-14 humana controlada por el promotor de CMV en pCI-neo fue amablemente cedido por la Dra. Alicia Garcia-Arroyo (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, Madrid, España). Las transfecciones celulares de llevaron a cabo con el reactivo SuperFect Reagent (Qiagen, Crawley, UK), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Citometría de flujo

Los análisis por citometría de flujo se realizaron con un aparato EPICS XL (Beckman Coulter). Para los estudios de inmunofluorescencia por citometria de flujo, las célu las se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios: monoclonal de ralón anti-endoglina P4A4, monoclonal de conejo anti-MMP-14 (clone #EP1264Y; Abcam, Cambridge. UK) o con un anticuerpo monoclonal conlrol durante 60 minutos a 4°C. Después de 2 lavados con PBS, se añadieron un anticuerpo anti-ratón marcado con Alexa 488 o anti-conejo marcado con Alexa 647 y se incubó durante otros 60 minutos a 4°C. Finalmente las células se lavaron 2 veces con PBS y se determinó la fluorescencia. Para la detección de ROS. las células JAR se sometieron a hipoxia/normoxia durante 24 horas en presencia o ausencia de 1mM de TROLOX® (6-hidroxi-2,5,7,B-ácido de tetrametilcroman-2-carboxílico) (Calbiochem), un derivado soluble en agua de la vitamina E permeable a la célula y con propiedades antioxidantes. Después de 24 horas, se quitó el medio y las células se incubaron con 10IJM 2',T-diacetato de diciorodihidrofluoresceina (CM-H2DCFDA; Invitrogen, Carlsbad, CA) y se mantuvieron a 37°C en oscuridad durante 60 minutos. A continuación, se lavaron las células 2 veces con PBS y se determinó la fluorescencia.

ElISA

Las concentraciones de sEng humana en medio condicionado o plasma de ratones transgénicos de sEng humana se analizaron con el kit Quantikine Human Endoglin/CD105 (R&D Systems, Minneapolis, MN). La sensibilidad del kit permite la detección de endoglina humana en un rango de 0.001 a 0.030 ng/mL. Las muestras de sangre de ratón se centrifugaron después de su recolección y se guardaron a _70DC hasta su análisis. Las concentraciones de sEng de ratón se analizaron mediante el kit DuoSet Mouse Endoglin/CD105 (R&D Systems, Minneapolis, MN). La sensibilidad de dicho kit de EUSA permite la detección de una concentración mínima de endoglina de ratón de 0.05 ng/mL. Las concentraciones de TIMP-3 en el medio condicionado se determinaron mediante el kit TIMP-3 human EUSA (Abnova. Taiwan). La sensibilidad de dicho kit permite la detección de una concentración minima de TIMP-3 humana de 156 pg/mL. Todos los inmunoensayos se analizaron utilizando el equipo Varioskan Flash spectral scanning multimode reader (Thermo Scientific). Las concentraciones se determinaron mediante interpolación de ta curva estándar siguiendo las instrucciones del fabricante.

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Análisis de lipidos y preparación de liposomas

La extracción lipidica se realizó siguiendo el método de Bligh y Dyer (1959). En resumen, las células JAR adherentes se levantaron mediante rascado y se resuspendieron en PBS. A oontinuación, 0.8 volúmenes de homogeneizado celular acuoso se mezclaron vigorosamente con 3 volúmenes de una mezcla 1:2 (vlv) clorofonno/metanol y la muestras de mantuvo durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. Después, la muestra se mezcló con 1 volumen de una mezcla 1:1 (vlv) cloroformofagua, se agitó mediante vortex y se centrifugó a alta velocidad (3,000 rpm) durante 15 minutos a temperatura ambiente hasta que se formó un sistema de dos fases. La fase que contiene cloroformo (que se encuentra en la parte de abajo), y contiene los lipidos, se aisló y sometió a análisis por cromatografia de gases-espectrometria de masas (GC-MS). Antes de su análisis por GC-MS, los lipidos se derivatizaron a éteres de trimetilsi lil (TMS) con bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA). Para ello, la muestra se transfirió a un vial de GC y se mezcló con 2sIJL de BSTFA y 25 IJL de pirid ina. El vial se tapó adecuadamente y se calentó a 60°C durante -45 minutos. La muestra se enfrió hasta temperatura ambiente y se inyectó en el equipo de GC-MS (Agilent 7890A, Agilent Tedlnologies). Como control para la GCMS, se emplearon colesterol y 22-R pu rificados.

Los liposomas que contienen L-o-fosfatidilcolina (Sigma) y 22-R se prepararon a una concentración molar de 2:1 , respectivamente. Los lipidos se disolvieron en cloroformo, se mezclaron vigorosamente en un tubo cónico y se desecaron mediante vacio. El residuo viscoso resultante se resuspendió en PBS (pH 7.4). Cuando fue necesario se añadieron los péptidos de endoglina a la mezda. La suspensión acuosa resultante se sometió a sonicación durante 1 hora antes de inyectarlo a los ratones.

Análisis de los niveles de ARNm mediante PCR semicuantitativa y a tiempo real RT-PCR

El ARN total se aisló de las células con el kit RNeasy (Oiagen) y se sometió a transcripción reversa utilizando el kit iScript ONAc Synthesis (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Para los análisis cuantitativos, el ADNc resultante se empleó como muestra para la PCR a tiempo real utilizando el reactivo iO SyBR-Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Los aligas utilizados para amplificar TIMP-3 humano fueron: SEO ID No: 5 (Directo) y SEO ID No: 6 (Reverso). Los oligos empleados para amplificar HIF-10 humano fueron: SEO ID No: T (Directo) y SEO ID No: 8 (Reverso). Los amplicones fueron detectados utilizando el sistema de detección iOs real time. Los niveles de los transcritos se normalizaron con los niveles de 18S. Se realizaron triplicados de cada experimento.

Para la RT-PCR semicuantitativa, el ADNc se sometió a amplificación por PCR empleando el kit HolMasler Taq ONA Polymerase (5 Prime Inc., Gaithersburg, MO) utilizando los oligos para TIMP-3 humano descritos anteriormente y, como control, se emplearon aligas para gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH): SEO ID No: 9 (Directa) y SEO ID No: 10 (Reversa). Los productos de la PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Los geles se documentaron con un aparato Gel Ooc XR System (Bio-Rad, Hercules, CA) y las bandas se cuantificaron utilizando el software Ouantity One.

Experimentos de interferencia de ARN

Los ácidos ribonucleicos interferentes pequeños (siRNA) para TIMP-3 y HIF-1a humanos se obtuvieron de Ambion Inc. (Austin, USA; ref.# AM16708A). Se emplearon 3 siRNA diferentes para HIF-1a (144736, 106499 Y 3187) Y TIMP-3 (s14146, s14148 y s14147) y un siRNA de secuencia al azar como control. Las células JAR se transfectaron con 5 pmoles del siRNA especifico o control, empleando lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Los análisis cuantitativos de los transcritos de HIF-1a y TIMP-3 se realizaron como se describió anteriormente.V

Monitorización de la actividad de la metaloproteasa mediante un sustrato sintético f1uorogénico

Para activar la metaloproteasa, las células JAR se cultivaron en una placa de 96 pocillos en presencia o ausencia de slJM T09, slJM 22-R, 10IJM RA o sOIJM doxicidina durante 24 horas. A continuación, se eliminó el medio y se añadió una mezcla de 1001J1 de TNC buffer (50 mM Tris, 0.1sM NaCI, 10 mM CaCI2 and 0.002% NaN3; pH 7.5) Y 1001J1 de 3IJM de péptido fluorogénico Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2 (R&D Systems, Minneapolis, MN) por pocillo. El péptido fluorogénico Mca-PLGL-Opa-AR-NH2 identifica una secuencia proteinica reconocida por MMP-14, por lo que se usa para detectar la actividad proteolitica de MMP14, donde Mca es acetil (7-Methoxicoumarin-4-yl) y Opa en N-3-(2,4-Dinitrifenil}-L-2,3-diaminopropionil, y NH2 indica el extremo amino terminal. Después de una incubación de 1 hora a 37°C, se añadieron 20fJI de solución de parada 10X (100 nM EOTA and 0.02% NaN3; pH 7.5) por poCillO. Las muestras se transfirieron a una placa negra de 96 POCillOS y la fluorescencia se determinó utilizando una longitud de onda de excitación de 325 nm y una longitud de onda de emisión de 393 nm, segun las instrucciones del fabricante en un aparato Varioskan Flash spectral scanning multimode reader (Thermo Scientific). Para los ensayos sin células, se activó MMP-14 recombinante humana que contiene el prodominio y los dominios catalitico y hemopexina (Millipore) incubándola con 1 mM de APMA (4-Aminophenylmercuric acetate; Sigma) durante 2-3 horas a 37°C. Una mezcla de 101J1 de 200nM de MMP-14 y 90 IJI de TNC buffer se

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añadió a cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos. Después de 10 minutos a 37°C, se añadieron 1001-11 de 3IJM deMca-PLGL-Dpa-AR-NH2. Tras una incubación de una hora a 37°C se añadieron 201-11 de solución de parada 1QX y se determinó la fluorescencia como se describió anteriormente. Cuando fue necesario la actividad de la metaloprOleasa se determinó en presencia de 30l-'M de péptidos de endoglina o 50l-'M de doxiciclins.

PéptidoS bloqueantes y proteína recombinante

Péptidos cortos relacionados con endoglina con acetilación en N-terminal y amidación en e-terminal se sintetizaron y purificaron hasta una pureza >90% (Biomedal SL, Sevilla, Spain). los péptidos P583 (SEO ID No: 1) Y P230 (SEO ID No: 3), corresponden a las posiciones de endoglina humana 583-590 y 230-237, respectivamente, y se disolvieron en agua destilada. El péptido P447 (SEO ID No: 2) corresponde a las posiciones de endoglina humana 447-456 y se disolvió en 1.6% dimetil sulfóxido (OMSO). La endoglina humana recombinante (SEO ID No: 4) que corresponde al dominio extracelular (Glu26-Gly586) se obtuvo de R&O Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA; 1097EN).

Experimentos con ratones

Los ratones C57BU6J (machos de 8-12 semanas de edad) se obtuvieron de The Jackson Laboratory (Bar Harbar, ME, USA). Un grupo de cuatro ratones fue inyectado intraperitonealmente con T09 (40-50mg/kg), 22-R (40-50mglkg), o el vehiculo correspondiente (etanol-solución salina 1:1) diariamente durante 4-6 dias. Los tratamientos más prolongados en el tiempo resultan tóxicos para los animales. Alternativamente, a los ratones se les inyectó de forma intravenosa en la vena de la cola una mezcla de liposomas que contiene 22-R (40-50mg/kg) y L-o-fosfatidilcolina a una relación molar de of 1 :2, respectivamente, diariamente durante 4-6 dias. La mezcla de liposomas inyectada también contiene 60IJg/g peso ratón/dia de péptidos, como se indica. La presión arterial sistólica (PAS) se midió diariamente con un esfingomanómetro de cola (NIPREM 546). Al finalizar el tratamiento, los ratones fueron sacrificados, se extrajo el plasma y se determinaron los niveles de sEng de ratón mediante el kit de ELlSA descrito anteriormente.

A continuación se describe el procedimiento para la generación y caracterización de los ratones transgénicos C57BU6J que expresan constitutivamente altos niveles de sEng humana (ratones sol.Eng+), se empleó un fragmento de cONA de endoglina humana que codifica para los amino ácidos 26-437, incluyendo el dominio huérfano y el subdominio lP-N (Lopez-Novoa & Bernabeu, 2010), seguido de un sitio de poliadenilación estándar, y toda la secuencia fue clonada bajo el control de un promotor ubicuo (actina de pollo). Los fragmentos de DNA para microinyección fueron obtenidos mediante digestión con Sall/Kpnl y a continuación fueron inyectados en oocitos ferti lizados procedentes del cruce de ratones CBA x C57BU6J , usando un protocolo estándar. Los ratones transgénicos fueron identificados mediante análisis por PCR del ONA de su cola. Los ratones transgénicos fundadores se cruzaron con híbridos CBA x C57BU6J para perpetuar las lineas transgénicas sol.Eng+.

En estos ratones transgénicos y en los animales salvajes (WT), se extrajo plasma de un corte en la cola y se determinaron los niveles de sEng humana mediante ELlSA. Todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités de Uso y Cuidado Animal de la Universidad de Salamanca y los ratones se cuidaron de acuerdo con los estándares de los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos (National Institutes of Health) para el cuidado y empleo de animales de laboratorio.

Estadísticas

Los datos se sometieron a análisis estadistico y los resultados se presentaron como promedio±SEM. Las diferencias entre los valores promedios se analizaron mediante el test t de Studenl. En las figuras, la significación estadística se indica mediante asteriscos (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.005; ns = no significativo).

RESULTADOS

La hipoxia induce la liberación de endoglina soluble

Ya que la hipoxia es clave en el desarrollo de la preeclampsia (AI-Gubory et al. , 2010) y el aumento de los niveles de sEng es un marcador de la evolución de esta patología (Ventakatesha et al., 2006), decidimos evaluar si la hipoxia estaba implicada en la liberación de sEng. Para ello, las células JAR se incubaron con 1% de oxigeno o bien se trataron con OFO durante 24 horas. A continuación, se recogió el medio condicionado y se analizó mediante ELlSA. Como se muestra en la Fig. 1A, ambos tipos de estimulos hipóxicos indujerOn significativamente la liberación de sEng al medio. De manera parecida, sEng también aumentó en los sobrenadantes de los transfectantes estables (de mioblastos y fibroblastos) de endoglina cuando se sometieron a hipoxia (Fig. 1 B). Puesto que la expresión de endoglina humana en estos Iransfectantes está controlada por un promotor viral, estos resultados excluyen la posibilidad de una regulación transcripcional de la misma o de un procesamiento alternativo del RNA mensajero y sugieren la existencia de un mecanismo proteolitico responsable

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de la liberación de sEng durante la hipoxia. la implicación de la hipoxia en la liberación de sEng se confirmó mediante estudios de silenciamienlo del ARN de HIF-1a, factor dave en el mecanismo de funcionamiento de la hipoxia. Para ello, se si lenció HIF-10 en las células JAR empleando siARN, y sometiéndolas o no a hipoxia; se utilizaron Ires siARNs distintos y el silenciamiento se monitorizó mediante qRT-PCR (Fig. 1C). los sobrenadanles de estas células se analizaron por ELlSA y se observó un marcado descenso de la liberación de sEng (Fig. 10).

Existen muchas evidencias que asocian los altos niveles de sEng en la preeclampsia con un aumento del estrés oxidativo y un descenso de las defensas antioxidantes (AI-Gubory el al., 2010). Por ello, nos preguntamos si la hipoxia podria ser capaz de inducir no solo la liberación de sEng sino también la formación de ROS en las células JAR. Para ello, se sometieron a estas células a hipoxia durante 24 horas y a continuación se incubó con la sonda para detectar ROS CM-H2DCFDA. Como se muestra en la citometria de flujo, la formación de ROS se indujo en las células JAR sometidas a hipoxia (Fig. 1 E). Además, este aumento de las ROS fue bloqueado mediante el tratamiento con 6-hidroxi-2,5,7,B-ácido de tetrametilcroman-2-carboxilico, un potente antioxidante derivado de la vitamina E (Fig. 1E). El 6-hidroxi-2,5,7,8-ácido de tetrametilcroman-2-carboxílico también indujo una clara reducción de los niveles de sEng en condiciones de hipoxia (Fig. 1 F). Estos resultados sugieren que las ROS son un componente de la via de la hipoxia co rriente abajo, y conducen a la liberación de cantidades crecientes de sEng.

Los oxisteroles, están implicados en la liberación de sEng, a través de la vía de LXR

Uno de los efectos de la inducción de la formación de ROS en condiciones de hipoxia es la generación de oxisteroles en la célula (Murphy y Johnson, 200B). De hecho, cuando las células JAR se sometieron a hipoxia se observó un aumento de la formación de 22(R}-hidroxicolesterol (22-R) en comparación con las células que se cultivaron en normoxia (Fig. 9). Puesto que los oxisteroles señalizan a través de los receptores lXR (A-González y Castrillo, 2011; Repa y Mangelsdorf, 2000) Y la expresión de endoglina se induce por la activación de la via de LXR mediante la unión del agonista sintético T09 (Henry-8erger et al., 2008), decidimos comprobar su implicación en la liberación de sEng. Como se esperaba, el tratamiento de las célula JAR con T09 provocó un aumento de la endoglina de superficie celular (Fig. 10). Además, no sólo el tratamiento con T09, sino también con el ligando fisiológico de lXR, 22-R y el ligando de RXR RA indujeron fuertemente la liberación de sEng (Fig. 2A). Se observó una fuerte cooperación sinérgica entre el 22-R y el RA en lo que a la liberación de sEng se refiere. Es más, usando cultivos primarios de células endoteliales humanas (HUVECs) tratadas con el agonista sintético de lXR, T09, se observó un claro aumento de los niveles de sEng liberados (Fig. 28). Como ya se mencionó con anterioridad, los transfectantes estables de endoglina humana (mioblastos y fibroblastos) mostraban un aumento de la liberación de sEng en presencia de T09 (Fig. 2C). Puesto que la expresión de endoglina en dichos transfectantes está controlada por un promotor viral, estos resultados excluyen una posible regulación transcripcional responsable de la liberación de sEng y por lo tanto confirman la hipótesis de un corte proteolitico de la endoglina de membrana activado mediante la via de lXR.

Los LXR modulan el corte proteolítico de endoglina a través del inhibidor de MMP-14, TIMP-3

Puesto que la metaloproteasa MMP-14 es responsable del corte de endoglina (Hawinkels et al, 2010) y el inhibidor de MMP-14, TIMP-3, es un gen diana de la via de lXR (Hoe el al., 2007), decidimos comprobar si la expresión de TIMP-3 estaba modulada por lXR en las células JAR. la Figura 3A muestra los resultados de una RT-PCR semicuantitativa, que incluyen una disminución significativa de los niveles de mARN de TIMP-3 cuando las células se sometieron a tratamiento con T09. los niveles de proteina de TIMP-3 también disminuyeron como consecuencia del tratamiento de las células JAR con T09 y 22-R (Fig. 38). Para confirmar la implicación de TIMP-3 s decidió silenciar dicha proteina utilizando tres siARN distintos y monitorizando el silenciamiento mediante qRT-PCR (Fig. 3C). Los medios condicionados de las células sometidas al silenciamiento se analizaron mediante ElISA y se observó un aumento de los niveles de sEng en las células en las que se había silenciado parcialmente TIMP-3 (Fig. 3D). Por otro lado, cuando se incubaron células JAR con TIMP-3 recombinante humana se observó una drástica disminución de los niveles de sEng inducidos por T09 (Fig. 3E). En el mismo experimento, se observó el débil poder inhibitorio de TIMP-1, mientras que TIMP-2 fue capaz de reducir considerablemente los niveles de sEng liberados (Fig. 3E), sugiriendo que la proteasa implicada en la liberación de sEng debe ser diana comun de TIMP-3 y TIMP-2.

MMP-14 está implicada en la liberación de endoglina soluble en células JAR

TIMP-2 Y TIMP-3 son inhibidores de MMP-14, que ha sido descrita recientemente como proteasa implicada en el corte de endoglina (Hawinkels el al., 2010). Por lo tanto, decidimos estudiar el papel de MMP-14 en la liberación de sEng en células JAR. Como se muestra en la Figura 4A, los niveles de sEng en el medio condicionado de células JAR que sobre-expresan MMP-14 son mayores que en las células control. Por otro lado, se observó que la co-expresión de MMP-14 y endoglina humana en células COS-7 indujo claramente la liberación de sEng (Fig. 48). Puesto que T09 disminuye la expresión de los inhibidores de MMP-14 TIMP-2 Y TIMP-3 (Fig. 3), nos preguntamos si el tratamiento de células JAR con agonistas de LXR provocaria un aumento de la actividad de

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MMP-14. Para comprobarlo, se empleó el péptido f1uorogénico Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2 que es sustrato de MMP-14. Como se observa en la Fig. 4C, la actividad de MMP-14 aumentó significativamente en respuesta a T09. Como control, se empleó doxiciclina, que es un inhibidor general de amplio espectro de proteasas. Fue interesante observar que el sitio de corte de MMP-14, G-L, presente en el péplido f1uorogénico, se encuentra en dos péptidos yuxtamembrana del dominio extracelular de endoglina. Todo esto nos llevó a postular un posible efecto modulador de estos péptidos en la liberación de sEng. Para comprobarlo, se sintetizaron tres péptidos de endoglina (Fig. 4D). Se incubó MMP-14 recombinante con el sustrato fluorogénico en presencia de los péptidos P447 y P583 Yse comprobó que dichos péptidos por si solos o la combinación de los mismos, eran capaces de inhibir significativamente la actividad de MMP-14, sugiriendo que dichas secuencias de endoglina eran dianas para MMP-14. Como control negativo, se incubó con el péptido P230, que no posee el motivo GL, y se observó que no tenia ningun efecto sobre la actividad de MMP-14. Puesto que el péptido P583 mostraba el mayor efecto inhibitorio y debido también a que la posición de su motivo GL encaja con el tamaño descrito de endoglina soluble (Hawinkels el al., 2010), se empleó este para los demás estudios. Para comprobar que el péptido P583 podia competir con el proceso de corte proteolitico de endoglina de membrana, se midieron los niveles de sEng de las células JAR en presencia de dichos péptidos. El péptido P583 fue capaz de disminuir significativamente los niveles basales de sEng, a diferencia del P230, sugiriendo que esta secuencia de endoglina mimetiza la secuencia natural de la endoglina de membrana, interfiriendo con la actividad proteolitica de MMP-14 (Fig. 40). Como control, se incubó con el inhibidor de proteasas doxiciclina y se observaron niveles de inhibición similares que con el péptido P583. Puesto que la actividad de MMP-14 se induce por los ligandos de LXR (Fig. 4C), decidimos comprobar si la expresión de MMP-14 también estaba modulada por la via de LXR. Para ello, se incubaron células JAR con diferentes combinaciones de ligandos del heterodimero LXRJRXR (l 09, RA Y 22R) Y se observó un aumento de MMP-14 en la superficie celular (Fig. 4E YFig. 11).

La activación de la vía de LXR in vivo aumenta los niveles de of sEng y la presión arterial sistólica

A continuación, quisimos ver si nuestros resultados con células cultivadas se reproducían en un modelo animal. Para ello, Jos ratones fueron tratados con el agonista sintético de lXR l 09 o el ligando fisiológico 22-R durante 5 dias. Las figuras 5A y 58 muestran que la presión arterial sistólica aumento considerablemente durante el tratamiento con ambos ligandos. Además, los niveles de sEng de los ratones tratados con l09 o 22-R también aumentaron significativamente (Figs. 5e y 50). El posible papel patogénico de sEng (producto proteolitico MMP14) en la respuesta hipertensiva se comprobó utilizando un modelo de ratón en el que se sobre-expresa sEng. De hecho, los ratones transgénicos que sobre-expresan sEng humana, que además tenian altos niveles en plasma de sEng (2,050±618 ng/ml; no detectable en ratones WT) mostraban un aumento de la presión arterial sistólica respecto a los animales salvajes (Fig. 6). Estos resultados sugieren que tanto sEng como la proteasa MMP-14 responsable de su generación, pueden contribuir al fenotipo hipertenso.

El peptido de endoglina puede inhibir la liberación de sEng inducida por oxisteroles y la presión arterial sistólica

Puesto que se habia observado que el péptido P583 puede interferir la actividad de MMP-14 y el proceso de corte proteolitico de la endoglina de membrana in vitro, quisimos comprobar sus efectos in vivo. Para ello, se inyectó de forma intravenosa el oxisterol 22-R y se observó que el aumento de presión arterial sistólica podia ser inhibido por la co-administración del péptido P583 (Fig. 7A). Además, dicho péptido, también disminuia los niveles de sEng (Fig. 7B), sugiriendo que el efecto hipertensor dependiente de oxisterol en este modelo animal esta mediado por sEng. En contraste, la co-inyección de 22-R y el péptido P230 no afectó ni a la presión arterial sistólica ni a los niveles de sEng.

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Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Péptido aislado derivado de la endoglina caracterizado porque su secuencia aminoacidica comprende un sitio de corte Gly-Leu para la metaloproleinasa de matriz extracelular 14, MMP-14, porque su secuencia aminoacídica presenta un porcentaje de homologia de al menos el 95% respecto a una secuencia aminoacidica seleccionada entre: SEO ID No: 1 y SEO ID No: 2, y por ser capaz de bloquear de forma competitiva el corte proteolílico Gly-Leu de la endoglina por parte de la MMP-14.
2. 2.-Péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque su secuencia aminoacidica tiene el extremo N· terminal acetilado y el extremo e-terminal amidado.
3. 3.-Péptido segun las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque comprende al menos de 8 a 10 residuos aminoacidicos.
4. 4.-Peptido según las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizado porque su secuencia aminoacidica es SEO 10 No: 1 o SEO 10 No: 2.
5. 5.-Secuencia nucleoUdica aislada caracterizada por codificar para un péptido aislado derivado de la endoglina definido en las reivindicaciones 1 a la 4.
6. 6.-Composición farmacéutica útil para el tratamiento de un desorden o una enfermedad asociada a la sEng o a la MMP-14 caracterizada porque comprende como ingrediente activo al menos un péptido aislado derivado de la endoglina definido en las reivindicaciones 1 a la 4.
7. 7.-Composición farmacéutica según la reivindicación 6, caracterizada por comprender un segundo ingrediente activo.
8. 8 .-Composición farmacéutica según las reivindicaciones 6 y 7, caracterizada porque el segundo ingrediente activo es L-a-fosfatiditcolina.
9. 9.-Composición farmacéutica según las reivindicaciones 6 a la 8, caracterizada porque se administra en forma de mezcla liposomal.
10. 10.-Uso de al menos un péptido derivado de la endoglina definido en las reivindtcaciones 1 a 4 o de una composición farmacéutica definida en las reivindicaciones 6 a 9, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un desorden o una enfermedad asociada a la sEng o a la MMP-14.