CN113966342A - TGF-β疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新的衍生自TGFb1的多肽。本发明还涉及该多肽的用途，编码肽的多核苷酸及其用途，以及包含该多肽的组合物及其用途。

Description

TGF-β疫苗

技术领域

本发明涉及衍生自转化生长因子β1(TGFβ1；TGFb1)的新的多肽，以及编码这种多肽的多核苷酸和包含这种肽的组合物。本发明还涉及该多肽、多核苷酸和组合物的用途和使用方法。

背景技术

TGFb为一种多功能细胞因子，在免疫系统的调节中起关键作用。有四种亚型，其中亚型1(TGFb1)在T细胞免疫中特别重要。在癌症的情况下，TGFb1解除各种免疫细胞，如细胞毒性T细胞(CTL)、肿瘤相关的中性粒细胞和自然杀伤(NK)细胞的戒备。它还有助于肿瘤血管化和转移。因此，TGFb1为肿瘤微环境(TME)中的关键抑制分子，有助于下调免疫系统的抗肿瘤机制并使癌细胞能够逃避免疫。

在对转移性肝癌小鼠模型的最近研究中，TGFb1也已被认为有助于降低诸如PD-L1阻滞剂的免疫检查点阻滞剂(ICB)的癌症治疗效率。

发明内容

本发明的多肽预期在刺激针对表达TGFb1的细胞的有益免疫应答方面特别有效。新的癌症免疫疗法的开发需要对参与发病机理的分子以及被免疫系统识别的特定蛋白质的透彻了解。在临床环境中，TGFb1特异性免疫应答的诱导可以直接杀死表达TGFb1的癌细胞，但更重要的是它通常通过抑制TGFb1的免疫抑制功能支持抗癌免疫应答。例如通过用本发明的多肽进行疫苗接种，靶向TGFb1和表达TGFb1的细胞将因此与另外的抗癌免疫疗法(如免疫检查点阻滞剂(ICB))具有高度的协同作用。

TGFb1为一种二聚的细胞因子，其共享一个通过分子内二硫键连接在一起的半胱氨酸结结构。TGFb1合成为单体的390个氨基酸的前体蛋白，其可互换地称为：TGFb1前蛋白(pre-protein)；TGFb1前体；全长TGFb1；前-原-TGFb1。TGFb1前蛋白的全长序列作为SEQ IDNO:1提供。

TGFb1前蛋白单体具有约25kDa的分子量。TGFb1蛋白单体具有三个不同的结构域：信号肽(SP：氨基酸1-29；SEQ ID NO:2)、潜在相关肽(LAP：氨基酸30-278；SEQ ID NO:3)和成熟肽(成熟TGFb1：氨基酸279-390；SEQ ID NO:4)，如图1E所示。

TGFb1 SP将蛋白质靶向分泌途径；SP在粗面内质网中被裂解。包含LAP和成熟TGFb1的TGFb1单体可以在内质网中通过LAP中半胱氨酸残基(例如Cys 223和Cys 225)和成熟TGFb1肽中半胱氨酸残基(例如Cys 356)之间的二硫键二聚化，形成TGFb1同源二聚体。这种TGFb1同源二聚体被称为小潜在复合体(SLC)。SLC可以与所谓的潜在TGF-β结合蛋白(LTBP)结合以形成更大的复合物，其称为大潜在复合物(LLC)。LLC可以分泌到细胞外培养基(ECM)中。然而，LAP和LTBP的存在阻止TGFb1结合至并激活其细胞外受体。活性TGFb1由成熟TGFb1肽的同源二聚体组成。成熟TGFb1同源二聚体从LAP和LTBP释放的机制有多种，包括蛋白酶降解LAP，通过与血小板反应蛋白相互作用诱导LAP中的构象变化，以及LAP和TGFβ-1之间的非共价键断裂。

本发明的目的是开发用于从TME中去除TGFb1的T细胞介导机制。本发明人通过筛选来自健康供体和癌症患者的PBMC研究了体内自发性TGFb1特异性T细胞应答的存在。然后分离、扩增TGFb1特异性T细胞群体，并且通过有关HLA限制、细胞因子产生和细胞毒性的各种测定进行表征。

本发明人已经鉴定了具有最大免疫原性的人TGFb1区域。令人惊讶的是，这些免疫原性“热点”区域位于整个人类TGFb1前蛋白，包括在SP和LAP结构域以及成熟的TGFb1肽内。本发明人还鉴定了人TGFb1 LAP内的亚区域，即SEQ ID NO:1的第121-160位(对应于SEQ IDNO:65的序列)，其含有更高频率的免疫原性肽序列。

因此，本发明提供了一种多肽，其为人TGFb1(SEQ ID NO:1)的免疫原性片段，并且其包含SEQ ID NO:1的至少9个连续氨基酸的序列，或由SEQ ID NO:1的至少9个连续氨基酸的序列组成。SEQ ID NO:1的至少9个连续氨基酸的序列可以对应于SEQ ID NO:2或65的至少9个连续氨基酸的序列。所述多肽可以包含SEQ ID NO:1的多达9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个连续氨基酸，或由SEQID NO:1的多达9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个连续氨基酸组成。所述多肽可以包含SEQ ID NO:6、42、12、23、28、49、55、63、7-9、43-45、13-15、24-26、29-31、50-52、56-58、64、65、2、66、67或5中任一个的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:6、42、12、23、28、49、55、63、7-9、43-45、13-15、24-26、29-31、50-52、56-58、64、65、2、66、67或5中任一个的氨基酸序列组成；优选地，所述多肽包含SEQ IDNO:6、42、12、23、28、49、55、63、66、67或5中任一个的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:6、42、12、23、28、49、55、63、66、67或5中任一个的氨基酸序列组成。所述多肽可以包含SEQ ID NO:66、28-31、67、5-9、42-45、12-15、55-58、23-26、49-52、63、64、65或2中任一个的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:66、28-31、67、5-9、42-45、12-15、55-58、23-26、49-52、63、64、65或2中任一个的氨基酸序列组成；优选地，所述多肽包含SEQ ID NO:66、28、67、5、6、42、12、55、23、49或63中任一个的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:66、28、67、5、6、42、12、55、23、49或63中任一个的氨基酸序列组成。

所述多肽可以具有9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个氨基酸的最大长度。所述多肽的C端氨基酸可以被相应的酰胺替换。所述多肽可以包含HLA-A2限制性表位。所述HLA-A2限制性表位可以包含SEQ IDNO:66或67的氨基酸序列或由SEQ ID NO:66或67的氨基酸序列组成。

本发明还提供了一种编码本发明的多肽的多核苷酸。所述多核苷酸可以是分离的。本发明还提供了包含所述多核苷酸的媒介(vector)。

本发明还提供了一种组合物，包含：本发明的多肽和/或本发明的多核苷酸，以及任选的佐剂。所述组合物还可以包含：至少一种不同的本发明的多肽；至少一种不同的本发明的多核苷酸；和/或至少一种药学上可接受的稀释剂、载体(carrier)或防腐剂。所述佐剂可以选自由基于细菌DNA的佐剂、基于油/表面活性剂的佐剂、基于病毒dsRNA的佐剂、咪唑喹啉(imidazochiniline)和Montanide ISA佐剂组成的组。

本发明还提供了一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：向受试者施用本发明的多肽、本发明的多核苷酸、和/或本发明的组合物。所述方法还可以包括同时或依次施用另外的癌症疗法，优选抗体。

本发明还提供了本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的组合物或它们的组合在治疗或预防疾病或病症中的用途。本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的组合物或它们的组合可以与另外的癌症疗法，优选抗体联合使用。

本发明还提供了本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的组合物或它们的组合在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物中的用途。

所述疾病或病症可以至少部分地以表达TGFb1的细胞的不适当的或过度的免疫抑制功能为特征，和/或其中所述疾病或病症为癌症。所述疾病或病症可以至少部分地以白细胞介素-4(IL-4)和/或白细胞介素-13(IL-13)的不适当的或过度的表达为特征。所述疾病或病症可以是癌症。所述癌症可以是乳腺癌、宫颈癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌(如非小细胞肺癌(NSCLC))、黑色素瘤、白血病(如急性骨髓性白血病(AML))或前列腺癌。

本发明还提供了一种刺激TGFb1特异性T细胞的方法，所述方法包括将T细胞与本发明的多肽和/或包含至少一种本发明的多肽的本发明的组合物接触。所述T细胞可以存在于取自健康受试者或癌症患者的样本中，任选地为肿瘤样本。

附图说明

图1A-C.通过体外IFNγELISPOT测定(设置在三个重复孔中)，针对衍生自TGFb1前蛋白的38个重叠的20聚体肽的阵列评估了来自6个健康供体的PBMC中的肽特异性免疫应答。每个斑点代表减去相应背景信号后分泌IFNγ的细胞的平均数，并且灰色水平条表示测试的供体的均值。星号表示导致最强和基于DFRx2的统计学上最显著应答的肽，并且它们被选择用于进一步的筛选实验(总结在图1D中)。

图1D.总结了基于图1A–1C的筛选的最具免疫原性的TGFβ肽及其各自的平均IFNγELISPOT计数的表格。选择了前八种表现最佳的肽进行进一步研究。

图1E.上图：TGFb1前蛋白的一级序列。突出显示的是选择用于进一步筛选的八种免疫原性TGFb1肽的氨基酸序列。下划线的氨基酸位置1-29表示蛋白质(SP)的信号序列的位置，而下划线的氨基酸位置279-390表示成熟TGFb1单体蛋白质。下图：TGFb1前蛋白结构域与八种选择的TGFb1衍生肽的位置的示意图。数字(1、29、279和390)表示标记TGFb1前蛋白的三个主要结构域的关键氨基酸位置。

图2.A.通过体外IFNγELISPOT测定，通过评估另外的健康供体的应答，针对图1A-C中鉴定的八种免疫原性TGFb1衍生肽验证了PBMC中的肽特异性免疫应答。每个斑点代表减去各自背景信号后个体供体中分泌IFNγ的细胞的平均数，并且黑色水平条表示测试的供体的均值。B.热图描绘了来自健康受试者的PBMC中针对先导表位的应答的幅度(顶部)；代表性的ELISPOT应答(底部)。

图3.A.通过体外IFNγELISPOT测定，通过评估应答，针对图1A-C中鉴定的八种免疫原性TGFb1肽验证了PBMC中的肽特异性免疫应答，但这次检查癌症患者。每个斑点代表减去各自背景信号后个体癌症患者中分泌IFNγ的细胞的平均数，并且黑色水平条表示测试的患者的均值。B.热图描绘了来自癌症患者的PBMC中针对先导表位的应答的幅度。

图4.建立细胞内细胞因子染色(ICS)分析以进一步表征响应于TGFb1表位的T细胞的功能性。在此实施例中，在测定前13天，来自健康供体(BC-M-41)的PBMC被解冻并用TGFb-02(SEQ ID NO:6)刺激。在培养建立后一天(120U/mL)和ICS建立前三天(60U/mL)添加IL-2。在每个流式细胞术图中，每个细胞都表示为一个点，并且基于一次两个标记的表达来分析细胞的功能表型，每个轴一个标记。基于CD3⁺CD4⁺T细胞部分或CD3⁺CD8⁺T细胞部分对活细胞群体进行门控，并对细胞因子表达(IFNγ和TNFα)的表达以及细胞毒性标记物(CD107a)进行量化。各个群体的百分比总结于右侧的层次结构表中。

图5.A.FACS图显示使用ICS确定的针对TGFβ表位的CD4⁺T细胞应答。B.FACS图显示使用ICS确定的针对TGFb1表位的CD8⁺T细胞应答。

图6.通过特异性T细胞的MACS CD137富集生成特异于若干TGFb1衍生的表位的大量培养物。富集的细胞在富集后扩增，并对其表位显示出不同的反应性。对于A-D中的每一个，针对以下表位：TGFb-02(A)、TGFb-05(B)、TGFb-26(C)和TGFb-38(D)，顶部的FACS图显示特异性CD4⁺门控的细胞的数量，且底部的FACS图显示特异性CD8⁺门控的细胞的数量。

图7.A.左图：通过离体ELISPOT测量的来自癌症患者和健康受试者的PBMC中的应答的幅度。将PBMC静置过夜，然后直接铺在ELISPOT孔中，并在ELISPOT孔中用表位刺激48小时。右图：针对若干TGFb1先导表位的离体ELISPOT应答的示例。B.使用ICS刺激仅5小时后，针对表位TGFb-15鉴定出的CD8⁺T细胞应答。

图8.A.预先用肽体外刺激14天，然后用TGFb-15表位刺激18小时后，来自前列腺癌患者的PBMC显示针对该TGFb-15表位的CD8⁺T细胞应答。B.将来自供体UR1121.14的TGFb15特异性T细胞在用TGFb-15刺激后富集两次，在体外培养14天后重新刺激，然后在第二天使用MACS CD137富集方法富集。CD4⁺T细胞(A和B各自顶部的FACS图)和CD8⁺T细胞(A和B各自底部的FACS图)都对用TGFb-15的刺激有应答。

图9.FACS图显示用TGFb-15刺激的TGFb-15特异性CD8⁺T细胞克隆的ICS分析结果。

图10.TGFb-15特异性CD8⁺T细胞克隆以HLA限制性方式杀死靶细胞并杀死表达TGFb1的癌细胞系。A.TGFb-15特异性CD8⁺T细胞有效裂解用TGFb-15肽脉冲的T2细胞。B.为确保TGFb-15应答受HLA-A2限制，已证明用肽脉冲的HLA-A2⁺靶细胞而非HLA-A3⁺靶细胞被裂解。C.用HLA-A2⁺癌细胞系UKE-1和THP-1刺激克隆激活了TGFb-15特异性CD8⁺T细胞克隆。其它的HLA-A2⁺癌细胞没有激活T细胞。D.TGFb-15特异性T细胞很容易杀死THP-1和UKE-1癌细胞系。E.用细胞因子处理的THP-1细胞刺激后，TGFb-15特异性T细胞的激活增强。F.用Th2细胞因子IL-4或TGFb1刺激THP-1细胞增加了被TGFb-15特异性细胞杀死的THP-1细胞的数量。

图11.用于分析针对TGF九聚体文库跨越(library spanning)的应答的IFN-γ(A)和TNF-α(B)ELISPOT测定的结果。

图12.特异于TGFb1信号肽序列中结合HLA-A2的十聚体表位的CD8⁺T细胞容易以HLA-A2限制的方式杀死表达TGFb1的癌细胞系。A.在体外培养14天后，健康供体PBMC在用结合HLA-A2的十聚体表位TGFb-A2-01肽刺激后显示出分泌的IFN-γ。B.健康供体PBMC的细胞内细胞因子染色显示出针对TGFb-A2-01的CD8⁺T细胞应答，因为受刺激的CD8⁺细胞除了显示在用TGFb-A2-01刺激后CD107a表达增强外(右图)，还显示增强的IFN-γ和TFN-α表达(左图)。C.来自健康供体的TGFb-A2-01特异性CD8⁺T细胞杀死了TGFb-A2-01脉冲的HLA-A2⁺靶细胞，而未脉冲的细胞和肽脉冲的HLA-A3⁺靶细胞没有被杀死。D.CD8⁺T细胞杀死了表达TGFb1的HLA-A2⁺UKE-1靶细胞，而MARIMO和WM852细胞没有被杀死。E.HLA-A2⁺THP-1细胞容易被TGFb-A2-01特异性T细胞杀死，并且在测定被杀死的靶细胞的增强部分之前48小时，通过用不同的细胞因子刺激调节TGF-1细胞的TGFb1表达。

图13.FACS图显示用TGFb-A2-01刺激的TGFb-A2-01特异性T细胞克隆的ICS分析结果。

图14.TGFβ文库中二十聚体肽的氨基酸序列。重叠的氨基酸序列标有下划线。

序列的简要说明

SEQ ID NO:1为人TGFb1的全长前体(也称为TGFb1前蛋白)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2为人TGFb1的信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3为人TGFb1的LAP肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4为成熟人TGFb1的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5-64各自为衍生自人TGFb1的多肽片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO:65为包含高频率的免疫原性序列的LAP亚区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO:66为TGFb-15肽序列(SEQ ID NO:28)中最小表位序列的氨基酸序列。SEQ ID NO:66在本文中也称为“TGFb-15短”。

SEQ ID NO:67为TGFb-A2-01的氨基酸序列。

具体实施方式

应当理解，所公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的具体需要进行定制。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述本发明的特定实施方式的目的，并且不旨在进行限制。

此外，在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数形式，除非内容另有明确规定。因此，例如，提及“多肽”包括“多种多肽”等。

“多肽”在本文中以其最广泛的含义使用，以指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或其它肽模拟物的化合物。因此，术语“多肽”包括短肽序列以及更长的多肽和蛋白质。如本文所使用的，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。

术语“患者”和“受试者”可以互换使用，并且通常指人类。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上文还是下文，均通过引用其整体并入本文。

“免疫原性”在本文中是指多肽能够引发对TGFb1蛋白的免疫应答，优选当所述蛋白存在于表达TGFb1蛋白的细胞中或细胞上时。换言之，所述多肽可以描述为对TGFb1是免疫原性的。可替代地，多肽可以描述为TGFb1的免疫原性片段。免疫应答优选为T细胞应答，因此所述多肽可以描述为包含T细胞表位的TGFb1的免疫原性片段。在将多肽施用至所述个体(或所述样本)后，可以在至少一个个体(或在取自个体的样本中)中检测免疫应答。

可以使用任何合适的方法，包括体外方法，将多肽鉴定为免疫原性的。例如，如果肽具有以下特征中的至少一个，则可以将肽鉴定为免疫原性的：

i.它能够在健康受试者和/或癌症患者的PBL群体中引发产生IFN-γ的细胞，如通过ELISPOT分析确定的那样；和/或

ii.它能够在肿瘤组织样本中原位检测与TGFb1反应的CTL；和/或

iii.它能够诱导特异性T细胞的体外生长。

适用于确定多肽是否具有免疫原性的方法也描述于以下实施例部分。

本发明的多肽为人TGFb1(SEQ ID NO:1)的免疫原性片段，其包含SEQ ID NO:1的至少9个连续氨基酸的序列或由SEQ ID NO:1的至少9个连续氨基酸的序列组成。

SEQ ID NO:1的至少9个连续氨基酸的序列可以对应于TGFb1的SP结构域的至少9个连续氨基酸的序列，例如SEQ ID NO:2的至少95个连续氨基酸的序列。

SEQ ID NO:1的至少9个连续氨基酸的序列可以对应于TGFb1的LAP结构域的至少9个氨基酸的序列，例如SEQ ID NO:3的至少9个连续氨基酸。

SEQ ID NO:1的至少9个连续氨基酸的序列可以对应于位于由SEQ ID NO:1的氨基酸位置121和160界定的LAP亚区域内的至少9个连续氨基酸的序列，例如SEQ ID NO:65的至少9个连续氨基酸的序列。

SEQ ID NO:1的至少9个连续氨基酸的序列可以对应于成熟TGFb1多肽的至少9个连续氨基酸的序列，例如SEQ ID NO:4的至少9个连续氨基酸的序列。

该多肽可以包含SEQ ID NO:1的多达9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个连续氨基酸，或由SEQ ID NO:1的多达9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个连续氨基酸组成。

该多肽可以包含SEQ ID NO:2和5-67中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2和5-67中任一个的氨基酸序列组成。

该多肽可以包含SEQ ID NO:6、42、12、23、28、49、55、63、5、7-9、43-45、13-15、24-26、29-31、50-52、56-58、64、65、2、66、6或5中任一个的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:6、42、12、23、28、49、55、63、5、7-9、43-45、13-15、24-26、29-31、50-52、56-58、64、65、2、66、6或5中任一个的氨基酸序列组成。优选地，该多肽包含SEQ ID NO:6、42、12、23、28、49、55、63、66、67或5中任一个的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:6、42、12、23、28、49、55、63、66、67或5中任一个的氨基酸序列组成。

该多肽可以包含SEQ ID NO:66、28-31、67、5-9、42-45、12-15、55-58、23-26、49-52、63、64、65或2中任一个的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:66、28-31、67、5-9、42-45、12-15、55-58、23-26、49-52、63、64、65或2中任一个的氨基酸序列组成。特别优选地，该多肽包含SEQ ID NO:66、28、67、5、6、42、12、55、23、49或63的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:66、28、67、5、6、42、12、55、23、49或63的氨基酸序列组成。

该多肽可以具有9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个氨基酸的最大长度。该多肽的C端氨基酸可以用相应的酰胺替换。该多肽可以是分离的。

特别优选地，多肽包含SEQ ID NO:6、42、12、23、28、49、55或63中任一个的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:6、42、12、23、28、49、55或63中任一个的氨基酸序列组成。特别优选地，多肽包含SEQ ID NO:66、28、67、5、6、42、12、55、23、49或63中任一个的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:66、28、67、5、6、42、12、55、23、49或63中任一个的氨基酸序列组成。SEQ ID NO:1的包含这些序列的更长多肽片段也是优选的。

该多肽可以包含HLA-A2限制性表位。优选地，该HLA-A2限制性表位包含SEQ IDNO:66的氨基酸序列或由SEQ ID NO:66的氨基酸序列组成。包含由SEQ ID NO:66的氨基酸序列组成的HLA-A2限制性表位的优选肽为包含SEQ ID NO:28-31或65中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:28-31或65中任一个的氨基酸序列组成的肽。可替代地，HLA-A2限制性表位优选包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列或由SEQ ID NO:67的氨基酸序列组成。包含由SEQID NO:67的氨基酸序列组成的HLA-A2限制性表位的优选肽为包含SEQ ID NO:5、8、9或2中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:5、8、9或2中任一个的氨基酸序列组成的肽。

在本文所描述的任何多肽中，与具有未修饰序列的多肽相比，氨基酸序列可以通过一个、两个、三个、四个或五个(最多五个)添加、缺失或替换来修饰，只要具有修饰序列的多肽对TGFb1表现出相同或增加的免疫原性。“相同”应理解为与未修饰序列的多肽相比，修饰序列的多肽不表现出对TGFb1的显著降低的免疫原性。序列之间免疫原性的任何比较都将使用相同的测定进行。除非另有说明，否则对多肽序列的修饰优选为保守氨基酸替换。保守替换用相似化学结构的、相似化学性质的或相似侧链体积的其它氨基酸来替换氨基酸。引入的氨基酸可以与它们替换的氨基酸具有相似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。可替代地，保守替换可以引入代替预先存在的芳香族或脂肪族氨基酸的另一种芳香族或脂肪族氨基酸。保守氨基酸改变是本领域公知的，并且可以根据下表A1中定义的20种主要氨基酸的性质进行选择。当氨基酸具有相似的极性时，这可以参考表A2中氨基酸侧链的亲水性等级来确定。

表A1——氨基酸的化学性质

Ala(A)	脂肪族的，疏水的，中性的	Met(M)	疏水的，中性的
				Cys(C)	极性的，疏水的，中性的	Asn(N)	极性的，亲水的，中性的
Asp(D)	极性的，亲水的，带电的(-)	Pro(P)	疏水的，中性的
				Glu(E)	极性的，亲水的，带电的(-)	Gln(Q)	极性的，亲水的，中性的
Phe(F)	芳香族的，疏水的，中性的	Arg(R)	极性的，亲水的，带电的(+)
				Gly(G)	脂肪族的，中性的	Ser(S)	极性的，亲水的，中性的
His(H)	芳香族的，极性的，亲水的，带电的(+)	Thr(T)	极性的，亲水的，中性的
				Ile(I)	脂肪族的，疏水的，中性的	Val(V)	脂肪族的，疏水的，中性的
Lys(K)	极性的，亲水的，带电的(+)	Trp(W)	芳香族的，疏水的，中性的
				Leu(L)	脂肪族的，疏水的，中性的	Tyr(Y)	芳香族的，极性的，疏水的

表A2——亲水性等级

在本文公开的任何多肽中，可以进行以下任何一种或多种修饰以改善理化性质(例如稳定性)，只要与具有未修饰序列的多肽相比，该多肽对TGFb1表现出相同或增加的免疫原性：

用相应的酰胺替换C端氨基酸(可以增加对羧肽酶的抗性)；

用相应的酰化氨基酸替换N端氨基酸(可以增加对氨肽酶的抗性)；

用相应的甲基化氨基酸替换一个或多个氨基酸(可以提高蛋白水解抗性)；和/或

用相应的D构型的氨基酸替换一个或多个氨基酸(可以提高蛋白水解抗性)。

本文公开的任何多肽可以在N端和/或C端连接至少一个另外的部分(moiety)以提高溶解性、稳定性和/或协助制造/分离，只要与缺乏该另外的部分的多肽相比，该多肽对TGFb1表现出相同或增加的免疫原性。合适的部分包括亲水性氨基酸。例如，氨基酸序列KK、KR或RR可以添加在N端和/或C端。其它合适的部分包括白蛋白(Albumin)或PEG(聚乙二醇(Polyethylene Glycol))。

本文公开的多肽可以通过任何合适的方式产生。例如，多肽可以使用本领域已知的标准技术直接合成，如Fmoc固相化学、Boc固相化学或通过溶液相肽合成。可替代地，多肽可以通过用编码所述多肽的核酸分子或媒介转化细胞(通常为细菌细胞)来产生。本发明提供编码本发明的多肽的核酸分子和媒介。本发明还提供包含这种核酸或媒介的宿主细胞。

术语“多核苷酸”和“核酸分子”在本文中可以互换使用，并且是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物)的聚合形式。多核苷酸的非限制性示例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、质粒、媒介、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。本发明的多核苷酸可以以分离的或基本上分离的形式提供。基本上分离的是指，多肽可以从任何周围介质中基本上分离，但不是完全分离。多核苷酸可以与不会干扰它们的预期用途的载体或稀释剂混合，并且仍被认为是基本上分离的。“编码”选择的多肽的核酸序列为：当置于合适的调控序列控制下，例如在表达媒介中时，在体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在RNA的情况下)成多肽的核酸分子。编码序列的边界由5'(氨基)端的起始密码子和3'(羧基)端的翻译终止密码子确定。出于本发明的目的，这种核酸序列可以包括但不限于：来自病毒的、原核的或真核的mRNA的cDNA，来自病毒的或原核的DNA或RNA的基因组序列，和甚至合成的DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3'。

可以根据本领域公知的方法合成多核苷酸，如Sambrook等人的示例所述(1989，分子克隆-实验室手册(Molecular Cloning-a laboratory manual)；冷泉港出版社(ColdSpring Harbor Press)。本发明的核酸分子可以以表达盒的形式提供，该表达盒包括与插入的序列可操作地连接的控制序列，从而允许本发明的多肽在体内表达。反过来，这些表达盒通常在媒介(例如，质粒或重组病毒媒介)中提供。这种表达盒可以直接施用于宿主受试者。可替代地，可以将包含本发明的多核苷酸的媒介施用于宿主受试者。优选地，使用遗传媒介制备和/或施用该多核苷酸。合适的媒介可以是能够携带足够量的遗传信息并允许本发明的多肽表达的任何媒介。

本发明因此包括包含这种多核苷酸序列的表达媒介。这种表达媒介为分子生物学领域中常规构建的，并且可以例如涉及使用质粒DNA和适当的起始子、启动子、增强子和其它元件(例如聚腺苷酸化信号)，其可以是必要的，并且其以正确的方向定位，以允许本发明的肽的表达。其它合适的媒介对本领域技术人员而言是显而易见的。作为这方面的进一步示例，我们参考Sambrook等人(1989，分子克隆-实验室手册；冷泉港出版社)。

本发明还包括已被修饰以表达本发明的多肽的细胞。这种细胞通常包括原核细胞，如细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli.)。可以使用常规方法培养这种细胞以产生本发明的多肽。

本发明的多肽可以是基本上分离的形式。它可以与不会干扰预期用途的载体、防腐剂或稀释剂混合，和/或与佐剂混合，并且仍被视为是基本分离的。它也可以是基本上纯化的形式，在这种情况下，它通常占制备中的蛋白质的至少90％，例如至少95％、98％或99％。

包含多肽的组合物

本发明提供了一种组合物，其包含本发明的多肽和/或本发明的多核苷酸。例如，本发明提供了一种组合物，包含：一种或多种本发明的多肽和/或一种或多种本发明的多核苷酸，以及任选的至少一种佐剂、药学上可接受的载体、防腐剂和/或赋形剂。

该组合物可以包含至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种不同的本发明的多肽，和任选的至少一种佐剂、药学上可接受的载体、防腐剂和/或赋形剂。

该组合物可以包含至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种不同的本发明的多核苷酸，和任选的至少一种佐剂、药学上可接受的载体、防腐剂和/或赋形剂。

载体、防腐剂和赋形剂在与该组合物的其它成分相容并且对该组合物的施用对象无害的意义上必须是“可接受的”。通常，所有组分和最终组合物均为无菌的和无热原的。该组合物可以是药物组合物。该组合物可以优选包含佐剂。佐剂为添加到该组合物中增加或以其它方式改变由该组合物引发的免疫应答的任何物质。佐剂广义上为促进免疫应答的物质。佐剂还可以优选地具有贮藏效应，因为它们还导致活性剂从施用部位缓慢而持续的释放。Goding的单克隆抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies:Principles&Practice)(第2版，1986)的第61-63页中提供了佐剂的一般性论述。

佐剂可以选自由以下组成的组：AlK(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH4(SO4)、二氧化硅、明矾、Al(OH)3、Ca3(PO4)2、高岭土、碳、氢氧化铝、胞壁酰二肽、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-DMP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP11687，也称为nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1'2'-二棕榈酰基-sn-丙三氧基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，也称为MTP-PE)、在2％鲨烯/吐温-80.RTM.乳液中的RIBI(MPL+TDM+CWS)、脂多糖及其各种衍生物(包括脂质A)、弗氏完全佐剂(Freund's Complete Adjuvant，FCA)、弗氏不完全佐剂(Freund'sIncomplete Adjuvants)、默克佐剂65(Merck Adjuvant 65)、多核苷酸(例如聚IC和聚AU酸)、来自结核分枝杆菌(Mycobacterium)的蜡D，在短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)和布鲁氏菌属(Brucella)成员中发现的物质、Titermax、ISCOMS、Quil A、ALUN(参见US 58767和5,554,372)、脂质A衍生物、霍乱毒素衍生物、HSP衍生物、LPS衍生物、合成肽基质或GMDP、白细胞介素1、白细胞介素2、MontanideISA-51与QS-21。各种皂苷提取物也已被建议用作免疫原性组合物中的佐剂。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)也可以用作佐剂。

本发明优选使用的佐剂包括基于油/表面活性剂的佐剂，如Montanide佐剂(可从比利时Seppic获得)，优选Montanide ISA-51。其它优选的佐剂为基于细菌DNA的佐剂，如包括CpG寡核苷酸序列的佐剂。其它优选的佐剂为基于病毒dsRNA的佐剂，如聚I:C.GM-CSF，并且咪唑喹啉也为优选的佐剂的例子。

该佐剂最优选为Montanide ISA佐剂。该Montanide ISA佐剂优选为MontanideISA 51或Montanide ISA 720。

在Goding的单克隆抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies:Principles&Practice)(第2版，1986)的第61-63页中，还应注意的是，当感兴趣的抗原的分子量低或免疫原性较差时，建议将其与免疫原性载体偶联。因此，本发明的多肽可以偶联至载体。载体可以独立于佐剂存在。例如，载体的功能可以是增加多肽片段的分子量以增加活性或免疫原性、赋予稳定性、增加生物活性或增加血清半衰期。此外，载体可以协助将其多肽或其片段呈递给T细胞。因此，在组合物中，多肽可以与如下面列出的那些载体结合。该载体可以是本领域技术人员已知的任何合适的载体，例如，蛋白质或抗原呈递细胞，如树突细胞(DC)。载体蛋白包括匙孔血蓝蛋白、血清蛋白(如转铁蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵清蛋白)、免疫球蛋白或激素(如胰岛素或棕榈酸)。可替代地，该载体蛋白可以是破伤风类毒素或白喉类毒素。可替代地，载体可以是葡聚糖，如琼脂糖。载体必须是人类生理上可接受的和安全的。

如果组合物包含赋形剂，那么在与该组合物的其它成分相容并且对其接受者无害的意义上，它必须是“药学上可接受的”。辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可以存在于赋形剂中。这些赋形剂和辅助物质通常为在接受该组合物的个体中不引起免疫应答的药剂，并且其可以在没有过度毒性的情况下施用。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体，如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、丙三醇和乙醇。药学上可接受的盐也可以包括在其中，例如，无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸的盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中提供了对药学上可接受的赋形剂、载体和辅助物质的深入论述。

合适的组合物的配制可以使用标准药物制剂化学和方法来进行，所有这些对于技术熟练的人员来说都是容易获得的。这种组合物可以以适合于推注施用或连续施用的形式制备、包装或销售。可注射组合物可以以单位剂量形式制备、包装或销售，如在安瓿中或在任选含有防腐剂的多剂量容器中。组合物包括但不限于油性或水性载体中的悬浮液、溶液、乳液，糊剂和可植入的缓释制剂或可生物降解的制剂。在组合物的一个实施方式中，活性成分以干的(例如粉末或颗粒)形式提供，用于在施用重构的组合物之前用合适的载体(例如无菌无热原的水)进行重构。该组合物可以以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售。该悬浮液或溶液可以根据已知技术配制，并且除了包含活性成分外，还可以包含另外的成分，如本文所描述的佐剂、赋形剂和辅助物质。例如，可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(如，水或1,3-丁二醇)来制备这种无菌可注射制剂。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和固定油，如合成的甘油单酯或甘油二酯。其它有用的组合物包括包含微晶形式、脂质体制剂中的活性成分或作为可生物降解聚合物系统的组分的那些组合物。用于缓释或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合的或疏水的材料，如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。可替代地，组合物的活性成分可以被包封、吸附到微粒载体上或与微粒载体结合。合适的微粒载体包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的那些，以及衍生自聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)的PLG微粒。例如参见Jeffery等(1993)Pharm.Res.10:362-368。还可以使用其它微粒系统和聚合物，例如诸如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺的聚合物，以及这些分子的偶联物。

使用方法

本发明的多肽、多核苷酸或组合物或其组合可以用于治疗或预防受试者的疾病或病症的方法。本发明的多肽、多核苷酸或组合物或其组合可以用于制备一种用于治疗或预防受试者的疾病或病症的方法的药物。该方法包括：向所述受试者施用所述多肽、所述多核苷酸、所述组合物或所述组合。可以向有需要的受试者施用治疗或预防有效量的所述多肽、所述多核苷酸、所述组合物或所述组合。

该疾病或病症可以至少部分地以TGFb1的不适当的或过度的免疫抑制功能为特征。该疾病或病症至少部分地以IL-4和/或IL-13的不适当的或过度的表达为特征。该疾病或病症可以是癌症，优选表达TGFb1和/或与TGFb1的不适当的或过度的免疫抑制功能和/或IL-4和/或IL-13的不适当的或过度的表达相关的癌症。该癌症可以是乳腺癌、宫颈癌、胃癌、肝癌、卵巢癌或胰腺癌、肺癌(如非小细胞肺癌(NSCLC))、黑色素瘤、白血病(如急性骨髓性白血病(AML))或前列腺癌。该癌症可以是以TGFb1的不适当的或过度的免疫抑制功能和/或IL-4和/或IL-13的不适当的或过度的表达为特征的AML。该癌症可以是以TGFb1的不适当的或过度的免疫抑制功能和IL-4和/或IL-13的不适当的或过度的表达为特征的AML。

该方法可以包括与另外的癌症疗法同时或依次施用。该另外的癌症疗法可以是TGFb(例如TGFb1)和PD-L1的双特异性抑制剂。所述双特异性抑制剂可能能够同时结合至TGFb和PD-L1和/或抑制TGFb和PD-L1的活性。所述双特异性抑制剂可以是包含抗TGFb部分和抗PD-L1部分的融合蛋白，任选地，其中该抗PD-L1部分包含抗PD-L1抗体或由抗PD-L1抗体组成，和/或该抗TGFb部分包含TGFb受体或其一部分或者由TGFb受体或其一部分组成，如TGFb受体II或其一部分。

该另外的癌症疗法可以选自细胞因子疗法、T细胞疗法、NK疗法、免疫系统检查点抑制剂、化学疗法、放射疗法、免疫刺激物质、基因疗法或抗体。

该抗体可以是阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿昔单抗(Abciximab)、阿克托舒单抗(Actoxumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿德木单抗(Adecatumumab)、阿非莫单抗(Afelimomab)、阿夫土珠(Afutuzumab)、培戈-阿拉赛珠单抗(Alacizumab pegol)、ALD518、阿仑单抗(Alemtuzumab)、阿利库单抗(Alirocumab)、喷替酸阿妥莫单抗(Altumomabpentetate)、阿麦妥单抗(Amatuximab)、马安莫单抗(Anatumomab mafenatox)、安芦组单抗(Anrukinzumab)、阿泊珠单抗(Apolizumab)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿塞珠单抗(Aselizumab)、阿替奴单抗(Atinumab)、托珠单抗(Atlizumab)(＝妥珠单抗(tocilizumab))、阿托木单抗(Atorolimumab)、巴皮纽阻单抗(Bapineuzumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、巴维昔单抗(Bavituximab)、贝妥莫单抗(Bectumomab)、贝利单抗(Belimumab)、苯拉组单抗(Benralizumab)、柏替木单抗(Bertilimumab)、贝索单抗(Besilesomab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、贝洛托舒单抗(Bezlotoxumab)、比西单抗(Biciromab)、比玛卢单抗(Bimagrumab)、美登素-比伐珠单抗(Bivatuzumab mertansine)、博纳吐单抗(Blinatumomab)、布索组单抗(Blosozumab)、维汀-本妥昔单抗(Brentuximabvedotin)、布雷奴单抗(Briakinumab)、布罗达单抗(Brodalumab)、康纳单抗(canakinumab)、美登素-坎妥珠单抗(Cantuzumab mertansine)、雷坎妥组单抗(Cantuzumab ravtansine)、卡拉西单抗(Caplacizumab)、喷地肽-卡罗单抗(Capromabpendetide)、卡芦单抗(Carlumab)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、CC49、西利珠单抗(Cedelizumab)、培戈-塞妥珠单抗(Certolizumab pegol)、西妥昔单抗(Cetuximab)、Ch.14.18、泊西他组单抗(Citatuzumab bogatox)、西妥木单抗(Cixutumumab)、克拉扎珠单抗(Clazakizumab)、克立昔单抗(Clenoliximab)、泰坦-克利妥珠单抗(Clivatuzumabtetraxetan)、可那木单抗(Conatumumab)、康赛珠单抗(Concizumab)、克瑞组单抗(Crenezumab)、CR6261、达西珠单抗(Dacetuzumab)、达昔单抗(Daclizumab)、达罗托组单抗(Dalotuzumab)、达妥木单抗(Daratumumab)、登赛珠单抗(Demcizumab)、迪诺苏单抗(Denosumab)、地莫单抗(Detumomab)、阿托度单抗(Dorlimomab aritox)、曲齐妥单抗(Drozitumab)、杜利妥单抗(Duligotumab)、度普利尤单抗(Dupilumab)、度司妥单抗(Dusigitumab)、依美昔单抗(Ecromeximab)、依库珠单抗(Eculizumab)、埃巴单抗(Edobacomab)、依决洛单抗(Edrecolomab)、依法珠单抗(Efalizumab)、依芬古单抗(Efungumab)、Elotuzumab(埃罗妥珠单抗)、艾西莫单抗(Elsilimomab)、依那妥组单抗(Enavatuzumab)、培戈-恩莫单抗(Enlimomab pegol)、依诺凯组单抗(Enokizumab)、依诺苏单抗(Enoticumab)、恩妥昔单抗(Ensituximab)、西依匹莫单抗(Epitumomab cituxetan)、依帕珠单抗(Epratuzumab)、厄利珠单抗(Erlizumab)、厄妥索单抗(Ertumaxomab)、埃达组单抗(Etaracizumab)、依曲利组单抗(Etrolizumab)、依洛尤单抗(Evolocumab)、艾韦单抗(Exbivirumab)、法索单抗(Fanolesomab)、法拉莫单抗(Faralimomab)、法妥组单抗(Farletuzumab)、法司努单抗(Fasinumab)、FBTA05、泛维珠单抗(Felvizumab)、非扎奴单抗(Fezakinumab)、非拉妥组单抗(Ficlatuzumab)、芬妥木单抗(Figitumumab)、法兰妥单抗(Flanvotumab)、芳妥珠单抗(Fontolizumab)、福雷芦单抗(Foralumab)、福拉韦单抗(Foravirumab)、非苏木单抗(Fresolimumab)、福拉奴单抗(Fulranumab)、伏妥昔单抗(Futuximab)、加利昔单抗(Galiximab)、加尼妥单抗(Ganitumab)、更汀芦单抗(Gantenerumab)、加维莫单抗(Gavilimomab)、奥唑米星-吉妥珠单抗(Gemtuzumabozogamicin)、吉伏组单抗(Gevokizumab)、吉妥昔单抗(Girentuximab)、维汀-格巴妥木单抗(Glembatumumab vedotin)、戈利木单抗(Golimumab)、鲁昔单抗(Gomiliximab)、GS6624、伊巴珠单抗(Ibalizumab)、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、艾芦库单抗(Icrucumab)、伊戈伏单抗(Igovomab)、英西单抗(Imciromab)、伊马曲单抗(Imgatuzumab)、英拉苏单抗(Inclacumab)、雷-英妥昔单抗(Indatuximab ravtansine)、英夫利昔单抗(Infliximab)、英妥木单抗(Intetumumab)、伊诺莫单抗(Inolimomab)、奥英妥珠单抗(Inotuzumab ozogamicin)、伊匹木单抗(Ipilimumab)、伊妥木单抗(Iratumumab)、伊利组单抗(Itolizumab)、伊卡组单抗(Ixekizumab)、凯利昔单抗(Keliximab)、拉贝珠单抗(Labetuzumab)、兰帕利珠单抗(Lampalizumab)、来瑞组单抗(Lebrikizumab)、来马索单抗(Lemalesomab)、乐德木单抗(Lerdelimumab)、来沙木单抗(Lexatumumab)、利韦单抗(Libivirumab)、利戈组单抗(Ligelizumab)、林妥珠单抗(Lintuzumab)、利瑞鲁单抗(Lirilumab)、洛迪赛珠单抗(Lodelcizumab)、莫星-洛沃妥珠单抗(Lorvotuzumabmertansine)、卢卡木单抗(Lucatumumab)、鲁昔单抗(Lumiliximab)、马帕木单抗(Mapatumumab)、马司莫单抗(Maslimomab)、玛弗利木单抗(Mavrilimumab)、马妥珠单抗(Matuzumab)、美泊利单抗(Mepolizumab)、美替木单抗(Metelimumab)、米拉组单抗(Milatuzumab)、明瑞莫单抗(Minretumomab)、米妥莫单抗(Mitumomab)、莫格利组单抗(Mogamulizumab)、莫罗木单抗(Morolimumab)、莫维组单抗(Motavizumab)、鲁磨西替单抗(Moxetumomab pasudotox)、莫罗单抗-CD3(Muromonab-CD3)、他那可单抗(Nacolomabtafenatox)、那美芦单抗(Namilumab)、埃托-那普妥莫单抗(Naptumomab estafenatox)、那呐妥单抗(Narnatumab)、那他珠单抗(Natalizumab)、奈巴库单抗(Nebacumab)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、奈瑞莫单抗(Nerelimomab)、奈伐苏单抗(Nesvacumab)、尼妥组单抗(Nimotuzumab)、纳武单抗(Nivolumab)、巯诺莫单抗(Nofetumomab merpentan)、奥滨尤妥珠单抗(Obinutuzumab)、奥卡妥珠单抗(Ocaratuzumab)、奥瑞组单抗(Ocrelizumab)、奥度莫单抗(Odulimomab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥拉妥单抗(Olaratumab)、奥洛组单抗(Olokizumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、奥那妥组单抗(Onartuzumab)、莫妥组单抗(Oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(Oregovomab)、奥替苏单抗(Orticumab)、奥昔组单抗(Otelixizumab)、奥塞芦单抗(Oxelumab)、奥扎尼珠单抗(Ozanezumab)、奥利组单抗(Ozoralizumab)、帕吉昔单抗(Pagibaximab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、帕巴库单抗(Panobacumab)、帕萨妥珠单抗(Parsatuzumab)、帕考珠单抗(Pascolizumab)、帕替组单抗(Pateclizumab)、帕曲妥单抗(Patritumab)、佩图莫单抗(Pemtumomab)、培拉凯珠单抗(Perakizumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、培克珠单抗(Pexelizumab)、匹地利珠单抗(Pidilizumab)、维汀-匹那妥珠单抗(Pinatuzumabvedotin)、平妥单抗(Pintumomab)、普拉鲁单抗(Placulumab)、维汀-珀拉妥珠单抗(Polatuzumab vedotin)、泊奈组单抗(Ponezumab)、普立昔单抗(Priliximab)、瑞托萨昔单抗(Pritoxaximab)、普托木单抗(Pritumumab)、PRO 140、奎利珠单抗(Quilizumab)、雷妥莫单抗(Racotumomab)、雷曲妥单抗(Radretumab)、雷韦单抗(Rafivirumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、雷尼株单抗(Ranibizumab)、雷昔库单抗(Raxibacumab)、瑞加韦单抗(Regavirumab)、瑞利珠单抗(Reslizumab)、利妥木单抗(Rilotumumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、罗妥木单抗(Robatumumab)、罗来度单抗(Roledumab)、洛莫索珠单抗(Romosozumab)、隆利组单抗(Rontalizumab)、罗维珠单抗(Rovelizumab)、卢利珠单抗(Ruplizumab)、沙马组单抗(Samalizumab)、Sarilumab、喷地肽-沙妥莫单抗(Satumomabpendetide)、司库奴单抗(Secukinumab)、瑟瑞妥单抗(Seribantumab)、瑟托萨昔单抗(Setoxaximab)、司韦单抗(Sevirumab)、西罗珠单抗(Sibrotuzumab)、西法木单抗(Sifalimumab)、塞妥昔单抗(Siltuximab)、辛妥珠单抗(Simtuzumab)、西利珠单抗(Siplizumab)、西鲁库单抗(Sirukumab)、苏兰组单抗(Solanezumab)、索利托单抗(Solitomab)、Sonepcizumab、松妥组单抗(Sontuzumab)、司他芦单抗(Stamulumab)、硫索单抗(Sulesomab)、舒维组单抗(Suvizumab)、他贝芦单抗(Tabalumab)、泰坦-替组单抗(Tacatuzumab tetraxetan)、他度组单抗(Tadocizumab)、他利珠单抗(Talizumab)、他尼组单抗(Tanezumab)、帕他莫单抗(Taplitumomab paptox)、替非组单抗(Tefibazumab)、阿替莫单抗(Telimomab aritox)、替妥莫单抗(Tenatumomab)、替奈昔单抗(Teneliximab)、替利组单抗(Teplizumab)、替妥木单抗(Teprotumumab)、TGN1412、替西木单抗(Ticilimumab)(＝曲美木单抗(tremelimumab))、替曲吉珠单抗(Tildrakizumab)、替加组单抗(Tigatuzumab)、TNX-650、妥珠单抗(Tocilizumab)(＝托珠单抗(atlizumab))、托利珠单抗(Toralizumab)、托西莫单抗(Tositumomab)、曲罗芦单抗(Tralokinumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、TRBS07、曲利组单抗(Tregalizumab)、曲美木单抗(Tremelimumab)、西莫白介素单抗(Tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗(Tuvirumab)、乌妥昔单抗(Ublituximab)、乌瑞芦单抗(Urelumab)、乌珠单抗(Urtoxazumab)、优特克单抗(Ustekinumab)、伐利昔单抗(Vapaliximab)、伐利组单抗(Vatelizumab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、维妥组单抗(Veltuzumab)、维帕莫单抗(Vepalimomab)、维森库单抗(Vesencumab)、维西珠单抗(Visilizumab)、伏洛昔单抗(Volociximab)、玛汀-沃瑟妥珠单抗(Vorsetuzumab mafodotin)、伏妥莫单抗(Votumumab)、扎芦木单抗(Zalutumumab)、扎木单抗(Zanolimumab)、扎妥昔单抗(Zatuximab)、齐拉木单抗(Ziralimumab)或阿佐莫单抗(Zolimomab aritox)。

优选的抗体包括那他珠单抗(Natalizumab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、贝利单抗(Belimumab)、阿塞西普(Atacicept)、阿来西普(Alefacept)、奥昔组单抗(Otelixizumab)、替利组单抗(Teplizumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥瑞组单抗(Ocrelizumab)、依帕珠单抗(Epratuzumab)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、阿巴西普(Abatacept)、依库珠单抗(Eculizumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、康纳单抗(Canakinumab)、美泊利单抗(Meplizumab)、瑞利珠单抗(Reslizumab)、妥珠单抗(Tocilizumab)、优特克单抗(Ustekinumab)、布雷奴单抗(Briakinumab)、英利昔单抗(Etanercept)、英夫利昔单抗(Infliximab)、阿达木单抗(Adalimumab)、培戈-塞妥珠单抗(Certolizumab pegol)、戈利木单抗(Golimumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、吉妥珠单抗(Gemtuzumab)、奥唑米星(Ozogamicin)、替伊莫单抗(Ibritumomab)、Tiuxetan、托西替莫单抗(Tostitumomab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、迪诺苏单抗(Denosumab)、伊匹木单抗(Ipilimumab)、本妥昔单抗(Brentuximab)和维汀(Vedotin)。

可用于本发明的方法的特别优选的抗体包括：达妥木单抗(daratumumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、利妥昔单抗(rituximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、托西莫单抗(tositumomab)和奥法木单抗(ofatumumab)。

该另外的癌症疗法可以选自由辅酶B12(Actimide)、阿扎胞苷(Azacitidine)、硫唑嘌呤(Azathioprine)、博来霉素(Bleomycin)、卡铂(Carboplatin)、卡培他滨(Capecitabine)、顺铂(Cisplatin)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、道诺霉素(Dauno-rubicin)、多西他赛(Docetaxel)、去氧氟尿苷(Doxifluridine)、阿霉素(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、依托泊苷(Etoposide)、氟达拉滨(Fludarabine)、氟尿嘧啶(Fluor-ouracil)、吉西他滨(Gemcitabine)、羟基脲(Hydroxyurea)、伊达比星(Idarubicin)、伊立替康(Irinotecan)、来那度胺(Lenalidomide)、甲酰四氢叶酸(Leucovorin)、氮芥(Mechlorethamine)、美法仑(Melphalan)、巯嘌呤(Mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、培美曲塞(Pemetrexed)、来那度胺(Revlimid)、替莫唑胺(Temozolomide)、替尼泊苷(Teniposide)、硫鸟嘌呤(Thioguanine)、戊柔比星(Valrubicin)、长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春地辛(Vindesine)和长春瑞滨(Vinorelbine)组成的组。

本发明的多肽和/或包含至少一种本发明的多肽的本发明组合物也可以用于一种刺激TGFb1特异性T细胞(如CD4⁺和/或CD8⁺T细胞)的方法，包括：将细胞与所述多肽和/或所述组合物接触。该方法可以离体(ex vivo)进行。该细胞可以存在于取自健康受试者或癌症患者的样本中，例如存在于肿瘤样本中。

通过以下实施例进一步说明本发明，然而，这些实施例不应被解释为限制保护范围。在前面的描述中和在下面的实施例中公开的特征可以以单独地和以其任意组合的方式，作为以其多种形式实现本发明的材料。

实施例

实施例1——材料与方法

患者和供体

匿名献血者的血沉棕黄层从在丹麦哥本哈根(Copenhagen)Rigshospitalet的血库获得。癌症患者的血沉棕黄层从丹麦Herlev的海莱乌(Herlev)的海莱乌医院(HerlevHospital)肿瘤科(Department of Oncology)获得。依照Helsinki声明，所有参与者在进入研究前都提供了知情同意书。用淋巴细胞分离剂(Lymphoprep)(Axis Shield，奥斯陆(Oslo)，挪威)分离PBMC，并且将其冷冻在具有10％二甲亚砜(DMSO；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)的胎牛血清中。

肽

肽由Pepscan(Lelystadt，荷兰)提供，并以10mM的浓度溶解在DMSO中。鉴定TGFβ1先导表位之后，由KJ Ross-Petersen(Klampenborg，丹麦)提供了更高纯度(>90％)的这些肽。这些实验中使用的肽的序列显示在标题为“序列”的部分中。肽通过SEQ ID NO、名称或参考人TGFb1全长前体的氨基酸序列内每个肽序列的起始和结束位置来描述。每个名称可以互换使用，如下面序列部分中列出的表格所示。例如，SEQ ID NO:6的肽可替代地称为名称TGFb-02(或TGFB02)，或可替代地称为TGFb1_11-30(假设起始位置为11且结束位置为30)。从上下文中可以清楚地看出每种情况下的预期参考。

体外酶联免疫斑点试验(ELISPOT)分析

对于体外ELISPOT，来自癌症患者和健康供体的PBMC在24孔板中用20μM的TGFβ衍生肽(或不用肽而作为对照)和120U/ml IL-2脉冲7-10天，然后用于ELISPOT分析。将细胞置于预先涂有IFNγ捕获抗体(Mabtech)的96孔硝化纤维素ELISPOT板(MultiScreen IP过滤板，MSIPN4W50；Millipore)中。添加TGFβ肽至终浓度为5μM，将对照刺激物(DMSO、HIV或乱序肽)加入对照孔中，并将板在37℃孵育16-20小时。孵育后洗去细胞并在室温加入二级生物素化的抗体(Mabtech，目录号3420-6-1000)，持续2小时。洗去未结合的二抗，并在室温加入链霉亲和素偶联的碱性磷酸酶(AP)(Mabtech，目录号3310-10)，持续1小时。洗去未结合的偶联酶，并通过添加BCIP/NBT底物(Mabtech，目录号3650-10)进行测定。使用Immunospot软件v5.1在CTL ImmunoSpot S6 Ultimate-V分析仪上分析显色的ELISPOT板。应答报告为用TGFβ肽刺激的孔与没有添加肽的孔中点的平均数之差。除非另有说明，否则所有实验均使用体外IFN-γELISPOT测定进行，并且所有实验均重复三次。使用无分布重采样(distribution free resampling，DFR)方法和更保守的DFR 2×方法进行统计分析，如Moodie等人所述(Cancer Immunol Immunother 2010；59:1489–1501)。

离体ELISPOT分析

来自癌症患者或健康供体的PBMC在X-VIVO培养基的24孔板中解冻并静置过夜。(可选：添加1μg/ml DNase I)。第二天对细胞进行计数并将其转移到预先涂有IFNγ捕获抗体(Mabtech)的96孔硝化纤维素ELISPOT板(MultiScreen IP过滤板，MSIPN4W50；Millipore)。添加TGFβ肽至终浓度为5μM，将对照刺激物(DMSO、HIV或乱序肽)加入对照孔中，并将板在37℃孵育24-72小时。用二抗和显色方案进行的板染色遵循上述体外ELISPOT方案。细胞内细胞因子染色(ICS)和荧光激活细胞分选(FACS)

在BD GolgiPlug^TM(在肽刺激的第一小时后添加)存在下，用TGFβ衍生肽刺激PBMC(或不用肽孵育而作为对照)刺激PBMC 5小时后，对细胞培养物进行细胞内染色。孵育开始时添加CD107a-PE(目录号555801，BD Biosciences)抗体。根据制造商的说明，将受刺激的细胞用表面标记物(CD3、CD4、CD8)的荧光标记抗体染色，然后使用固定/透化浓缩物和稀释剂(eBioscience，目录号00-5123-43和00-5223-56)的混合物进行透化。然后将透化细胞用荧光染料标记的IFNγ和TNFα抗体染色。在FACSCantoTM II(BD Biosciences)上进行流式细胞术分析。使用的抗体：IFNγ-APC(目录号341117)，TNFα-455BV421(目录号562783)，CD4-FITC(目录号347413)或CD4-PerCP(目录号345770)，CD8-PerCP(目录号345774)或CD8-FITC(目录号345772)，CD3-APC-H7(目录号560275)(均来自BD Biosciences)。死细胞用Fixable Viability Stain 510(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)染色。另一种鉴定激活的T细胞的方法为用抗原或靶细胞过夜刺激T细胞。刺激18-24小时后，细胞用上述表面抗原特异性抗体和可固定活力染色剂(fixable viability stain)染色，同时用抗CD107a-PE和抗CD137-BV421(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)染色。利用适当同种型对照，通过用抗HLA-A2-FITC(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)染色，分析供体PBMC的HLA-A2。

快速扩增方案

在一些试验中，利用来自至少三个不同健康供体的同种异体的辐照的外周血单核细胞(PBMC)、30ng/mL抗CD3抗体(OKT3，来自Janssen-Cilag或Miltenyi Biotec)和高剂量IL-2(6,000IU/mL IL2；来自诺华公司的Proleukin)，使用快速扩增方案(REP)扩增T细胞。

活细胞的FACS

为了从原代PBMC培养物中富集特异性T细胞，遵循用于在ELISPOT中分析的细胞培养物的体外培养方法(见上文)。接着，将细胞用抗原刺激过夜，并且第二天在FACS缓冲液中洗涤两次，然后用以下物质染色30分钟：活/死可固定近红外死细胞染色试剂盒(LIVE/DEADFixable Near-IR Dead Cell Stain Kit)(Waltham，MA，USA)，抗CD4-FITC、抗CD8-PerCP、抗CD107a-PE和抗CD137-BV421(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)。然后将细胞洗涤两次并重悬于FACS缓冲液中。接着，在具有适当应用设置和补偿控制的FACSARIA流式细胞仪上对细胞进行分选。使用纯度设置进行细胞分选。分选后，细胞被分成两个部分——一半富集的细胞使用快速扩增方案进行扩增，而另一半细胞则使用有限稀释进行克隆，接种三个细胞/孔。使用快速扩增方案扩增克隆的细胞。

磁激活细胞分选(MACS)

MACS用于从原代培养物和已经富集的培养物中富集抗原特异性T细胞。来自原代PBMC培养物的特异性T细胞的富集遵循用于在ELISPOT中分析的细胞培养物的体外培养方法(见上文)。接着，根据制造商的方案，将细胞用抗原刺激过夜并在第二天使用MACSCD137富集试剂盒(Miltenyi Biotech，Bergisch Gladbach，德国)富集。使用快速扩增方案扩增富集的细胞。如所述，一些富集的细胞通过有限稀释进行克隆。使用快速扩增方案扩增克隆的细胞。铬-51细胞毒性测定与靶细胞的细胞因子刺激

如Andersen MH等人所述(J Immunol 1999；163:3812–3818)，使用铬-51细胞毒性测定以评估特异性T细胞的杀伤潜力。为了在几种癌细胞系中操控TGFβ的表达，在分析之前，用IL-4(100U/mL)、IL-13(20U/mL)和TGFβ1(2.e5 ng/mL)(均来自Peprotech，RockyHill，新泽西州，USA)单独或组合刺激癌细胞系48小时。

实施例2——20聚体肽的体外ELISPOT筛选

如上所述设计并生产了衍生自全长TGFb1前体的一批38个重叠的20聚体(20mer)肽。20聚体肽中的每一个都重叠有10个氨基酸(见图14)。

使用体外IFNγELISPOT测定(设置在三个重复孔中)，针对20聚体肽阵列的自发免疫应答，评估了来自6个健康供体的PBMC中的肽特异性免疫应答。这些测定的结果显示在图1A-C中。选择引起最强和最具统计学显著性的应答的肽用于进一步筛选实验。图1D总结了表现最佳的肽的特性，而图1E指出了全长序列中所述肽的位置。令人惊讶的是，观察到免疫原性肽位于TGFb1前体蛋白的整个全长序列中，而不是聚集在单个免疫原性“热点”内或位于成熟TGFb1肽的氨基酸序列内。值得注意的是，免疫原性表位肽用TGFb1前体的信号肽区域和LAP肽鉴定，信号肽区域和LAP肽不存在于TGFb1的成熟活性形式中。此外，鉴定了具有高频率的免疫原性肽的LAP亚区域，即SEQ ID NO:1的氨基酸121-160(对应于SEQ ID NO:65)。该区域包含免疫原性肽：TGFb-13和TGFb-15。

选择了八种最具免疫原性的肽，即TGFb-02、TGFb-26、TGFb-05、TGFb-13、TGFb-15、TGFb-30、TGFb-33和TGFb-38(分别对应于SEQ ID NO:6、42、12、23、28、49、55和63)，用于进一步研究。

实施例3——肽特异性免疫应答的验证

建立另外的体外IFNγELISPOT测定以验证另外健康受试者对初始筛选(见实施例2)中鉴定的八种选择的表位肽的反应。这些测定的结果在图2中示出。针对所有测试的表位肽的强烈而频繁的应答，其中TGFb-02、TGFb-26、TGFb-33，尤其是TGFb-15表现出强烈而频繁的应答(图2B)。

健康受试者和癌症患者可以对表位表现出不同模式的免疫应答，因此也研究了选择的表位在癌症患者中的免疫原性潜力。PBMC中针对8种免疫原性TGFb1衍生肽的肽特异性免疫应答也通过检查癌症患者，再次通过体外IFNγELISPOT测定评估应答，得到验证。这些测定的结果在图3中示出。观察到TGFb-02、TGFb-15、TGFb-26和TGFb-33在患者体内为高度免疫原性的(图3B)。

实施例4——细胞因子分析

实施细胞内细胞因子染色(ICS)分析以进一步表征响应于TGFb1表位的T细胞的功能性。在此实施例中，在测定前13天，来自健康供体(BC-M-41)的PBMC被解冻并用TGFb-02(SEQ ID NO:6)刺激。在培养建立后一天(以120U/mL)和ICS建立前三天(以60U/mL)添加IL-2。进行FACS分析，并基于CD3⁺CD4⁺T细胞部分或CD3⁺CD8⁺T细胞部分对活细胞群进行门控。对细胞因子表达(IFNγ和TNFα)以及细胞毒性的标记物(CD107a)的表达进行了量化。细胞因子分析的FACS图显示在图4的左侧，而各个群体的百分比总结于图4右侧的层次结构表中。

发现CD3⁺CD4⁺T细胞部分(而不是CD3⁺CD8⁺T细胞部分)对TGFb-02(SEQ ID NO：6)有反应性，如表示为分泌TNFα(单独地或与IFNg结合)，且没有/低表达CD107a。

ICS还用于显示，表位TGFb-05(SEQ ID NO：12)和TGFb-26(SEQ ID NO：42)触发了CD4⁺(图5A)和CD8⁺T细胞应答(图5B)。在通过磁激活细胞分选(MACS)富集特异性细胞后，还检测到针对若干先导表位的强烈的CD4⁺和CD8⁺T细胞应答(图6)，证明了TGFβ中若干表位的高免疫原性潜力。

实施例5——对TGFβ表位的离体应答的鉴定

来自健康受试者和癌症患者的PBMC对若干表位的离体应答。在铺板前将细胞解冻并静置过夜，然后刺激48小时。健康细胞和患者细胞均释放大量IFN-γ(图7A)，证明来自健康受试者和癌症患者的细胞含有大量自由循环的TGFβ特异性T细胞。最令人惊讶的是，在用表位TGFb-15刺激仅5小时后，在来自前列腺癌患者的离体铺板的PBMC中检测到CD8⁺T细胞应答(图7B)。这一发现表明该患者具有高比例的循环TGFβ特异性细胞毒性T细胞。鉴于对TGFb-15的这种强烈应答，使用来自该患者的PBMC建立了针对TGFb-15的特异性T细胞培养物。首先，已确定CD137可以用作从该供体中分选特异性T细胞的激活标记物。然后，用TGFb-15刺激患者PBMC并将细胞在培养物中保持14天，此后用TGFb-15重新刺激PBMC18小时，然后使用荧光激活细胞分选(FACS)分析CD137和CD107a的表达。这个实验证明，考虑到在用肽刺激后16.6％的CD8⁺T细胞为CD137⁺，CD137为富集特异性T细胞的合适标记物(图8A)。

使用MACS CD137富集试剂盒富集TGFb-15特异性T细胞，并用于建立含有特异于TGFb-15的CD4⁺和CD8⁺T细胞的培养物(图8B)。使用该培养物评估TGFβ特异性T细胞应答。

实施例6——TGFb-15特异性T细胞能够识别并杀死癌细胞

使用有限稀释，从实施例5中描述的TGFβ建立CD8⁺TGFb-15特异性T细胞克隆。CD8⁺TGFb-15特异性克隆显示出对TGFb-15的高反应性(图9)。来自该患者的PBMC用HLA-A2⁺特异性抗体染色显示供体为HLA-A2⁺(数据未显示)。接着，进行标准铬-51细胞毒性测定以检查特异性T细胞是否可以裂解肽脉冲的HLA-A2⁺靶细胞。肽脉冲的HLA-A2⁺T2细胞容易被特异性T细胞裂解，而未脉冲的T2细胞没有被杀死(图10A)。

T2细胞不仅是HLA-A2⁺，所以这些细胞的杀伤可能是由另一个HLA等位基因的匹配介导的。出于这个原因，使用K562细胞作为靶标进行进一步的实验。最初的K562系为HLA缺陷的，但这些实验是用两种经过基因修饰以稳定表达HLA-A2或HLA-A3的系进行。这确保这些是相应细胞表达的唯一HLA等位基因。只有肽脉冲的HLA-A2⁺K562细胞被TGFb-15特异性克隆杀死，而未脉冲的HLA-A2⁺K562细胞和肽脉冲的HLA-A3⁺K562细胞未被识别(图10B)。

几乎所有细胞都可以分泌TGFβ，这在很大程度上参与了创建肿瘤抑制环境。出于这个原因，研究了TGFb-15特异性T细胞是否能够识别HLA-A2⁺癌细胞系。均来源于急性骨髓性白血病(AML)患者的细胞系UKE-1、SET-2和THP-1与两种HLA-A2⁺黑色素瘤细胞系(WM852和FM88)以及K562和HLA-A2⁺K562细胞一起用作靶细胞。TGFb-15特异性T细胞用各自的靶细胞以3:1的效应子：靶标比刺激过夜。特异性T细胞识别两种癌细胞系THP-1和UKE-1，而其它细胞系则没有激活T细胞(图10C)。进一步地，铬-51细胞毒性实验表明，TGFb-15特异性T细胞杀死了UKE-1和THP-1细胞(图10D)。

THP-1细胞系为相对未分化的细胞系，用不同细胞因子的处理会影响这些细胞中的基因表达。白细胞介素(IL)-4为Th2应答发展中的基石细胞因子。因此，推测用IL-4处理THP-1细胞可能会增加这些细胞的TGFβ表达。另外，因为TGFβ生成用于其细胞内产生的正反馈回路，所以推测用TGFβ处理THP-1细胞也会诱导TGFβ表达。值得注意的是，目标表位TGFb-15在TGFβ前体蛋白的LAP肽部分中表达，而不是以TGFβ的成熟活性形式表达(见图1E)。因此，用活性TGFβ预处理THP-1细胞不会将识别的表位添加到THP-1细胞，而只会增加细胞内TGFβ的产生。

用IL-4或TGFβ处理48小时的THP-1细胞用于刺激TGFb-15特异性CD8+T细胞18小时。证明与未刺激的THP-1细胞相比，细胞因子处理的THP-1细胞诱导了TGFb-15特异性T细胞的更大活化(图10E)。最终，显示用IL-4或TGFβ对THP-1细胞的细胞因子刺激增加了裂解的细胞的数量(图10F)。

实施例7——最小TGFβ表位序列的鉴定

由于TGFb-15表位为20聚体，它不能以全长形式呈现在HLA-I分子上。因此，进行了进一步的实验以确定被TGFb-15特异性T细胞识别的最小表位序列。具体地，将TGFb-15表位序列分割成九聚体肽库，有8个重叠氨基酸，从而产生12个九聚体肽。将来自用于产生TGFb-15特异性CD8⁺T细胞克隆的TGFb-15特异性大量培养物的T细胞铺板在ELISPOT中，并用9聚体肽中的每一种进行刺激。结果表明，TGFb-15序列内的最小表位为序列VLLSRAELRL(TGFb-15短；SEQ ID NO：66)(见图11)。

实施例8——TGFβ的信号肽中的十聚体表位为特异性T细胞的靶标

鉴于针对TGFβ序列中针对若干20聚体表位的高频率的CD8⁺T细胞应答，发明人试图鉴定其它HLA-A2限制性十聚体表位。使用MHC配体和肽基序的SYFPEITHI数据库，Rammensee等人(SYFPEITHI:database for MHC ligands and peptide motifs；www.syfpeithi.de.；2014年10月30日访问)，在整个TGFβ序列中搜索对HLA-A2具有高结合亲和力的十聚体表位。肽序列LLLLLPLLWL(TGFb-A2-01；SEQ ID NO:67)作为最靠前的结合十聚体表位出现，结合亲和力评分为30。然后研究了来源于健康受试者的HLA-A2⁺PBMC针对TGFb-A2-01表位的自发T细胞应答。令人惊讶的是，大多数PBMC显示出针对TGFb-A2-01表位的应答(图12A)。使用ICS，确认了这些应答来自CD8⁺T细胞(图12B)。

然后，通过对来自所述受试者的PBMC进行一次体外刺激，然后培养14天，从对TGFb-A2-01有固定(solid)反应的健康受试者(BC363)中分离TGFb-A2-01特异性T细胞。接着，PBMC用TGFb-A2-01刺激过夜。然后对CD3⁺、CD8⁺、CD137⁺细胞进行门控，使用FACS富集特异性T细胞。如实施例1中所述扩增富集的细胞。培养14天后，若干细胞系显示出对TGFb-A2-01肽的高度特异性(图13)。

在标准Cr51细胞毒性测定中测试了TGFb-A2-01特异性T细胞裂解肽脉冲的HLA-A2⁺K562靶细胞的能力。肽脉冲的HLA-A2⁺K562细胞被裂解，而未脉冲的HLA-A2⁺和肽脉冲的HLA-A3⁺靶细胞没有被裂解(图12C)。

因为上述TGFb-15特异性T细胞杀死了AML细胞系UKE-1和THP-1，所以测试了TGFb-A2-01特异性克隆是否也能够杀死这些靶癌细胞。UKE-1和THP-1癌细胞容易被TGFb-A2-01特异性T细胞杀死(见图12D和E)。此外，用IL-13、TGFβ、或IL-13和TGFβ两者联合刺激THP-1细胞提高了杀死靶细胞的比例(图12E)。

结论

TGFb1为免疫稳态和耐受的关键执行者，抑制免疫系统的许多组件的扩展和功能。TGFb1信号传导的扰动为炎症性疾病的起因并促使肿瘤出现。TGFb1也为肿瘤微环境中免疫抑制的核心，最近的研究揭示了其在肿瘤免疫逃避和对癌症免疫治疗不良反应中的作用。TGFb1的表达为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和髓源性抑制细胞两者的主要特征。表达TGFb1的细胞也在免疫抑制微环境的发展中发挥重要作用，这是因为它们防止在肿瘤部位的效应子淋巴细胞增殖。例如，通过疫苗接种激活TGFb1特异性T细胞因此应导致在肿瘤部位的T细胞浸润。

首次发现了可以利用TGFb1特异性效应子T细胞特异性靶向表达TGFb1的细胞。特别地，本发明人通过筛选覆盖TGFb1的整个氨基酸序列的肽库，鉴定了天然存在于癌症患者和健康供体中的外周TGFb1特异性T细胞。有趣的是，已经发现TGFb1含有多个表位，这些表位经常被分布在TGFb1序列上不同区域中的外周T细胞识别。

观察到针对TGFb1的频繁T细胞应答，这强调了TGFb1具有高度免疫原性的惊人发现。特别出乎意料的是，考虑到TGFb1对免疫抑制如此重要，TGF1b将具有本发明人观察到的程度的高度免疫原性。此外，已经确定了能够生成特别强的免疫应答的TGFb1区域，并且这些区域用于基于肽的疫苗接种方法会是理想的选择。

鉴于TGFb1在抑制免疫系统中(例如在TME中)的作用，本发明人的令人惊讶的发现表明：在大多数患有实体瘤和血液学恶性肿瘤的患者中，有可能增强TGFb1特异性的免疫应答。

许多不同的治疗策略集中于靶向免疫抑制性肿瘤微环境(TME)，旨在耗尽或重新安排(reprogram)免疫抑制性细胞或靶向这些细胞分泌的功能介质。上面讨论的令人惊讶的结果表明，靶向TGFb1的免疫调节疫苗接种会是靶向TME中免疫抑制细胞的有效方法。与其它临床策略相比，这种独特的方法将免疫抑制细胞的耗尽，包括癌细胞(通过细胞毒性T细胞的直接杀伤)，与免疫抑制细胞群体的重新安排(通过将促炎细胞因子引入免疫抑制微环境)相结合。由于TGFb1表达为免疫抑制细胞表型的主要因素，因此TGFb1特异性T细胞可以与免疫抑制细胞发生特异性反应。重新平衡微环境的TGFb1疫苗应当会增加T细胞增强药物(如抗PD1抗体等检查点阻滞剂)的作用。因此，TGFb1疫苗和检查点阻断抗体的联合疗法应当会增加对疗法有反应的患者的数量。

总之，上述讨论的结果提供了一种有价值的方法，用于直接靶向在大多数癌症患者中缺乏免疫应答的主要因素：TGFb1。

序列

在下表1中，除非另有说明，否则“起始位置”和“结束位置”表示全长人TGFb1前蛋白(SEQ ID NO：1)内的位置。

表1

序列表

<110> IO生物技术公司

<120> TGF-β疫苗

<130> N415362WO

<150> GB1908012.6

<151> 2019-06-05

<160> 67

<170> PatentIn版本 3.5

<210> 1

<211> 390

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(390)

<223> 全长人TGFb1前蛋白 (NP_000651.3)

<400> 1

Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr

20 25 30

Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala

35 40 45

Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser

50 55 60

Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu

85 90 95

Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu

100 105 110

Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr

115 120 125

His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val

130 135 140

Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu

145 150 155 160

Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn

165 170 175

Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser

180 185 190

Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu

195 200 205

Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser

210 215 220

Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr

225 230 235 240

Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro

245 250 255

Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln

260 265 270

Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser

275 280 285

Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys

290 295 300

Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn

305 310 315 320

Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr

325 330 335

Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala

340 345 350

Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr

355 360 365

Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val

370 375 380

Arg Ser Cys Lys Cys Ser

385 390

<210> 2

<211> 29

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(29)

<223> TGFb1信号肽

<400> 2

Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly

20 25

<210> 3

<211> 249

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(249)

<223> TGFb1 LAP

<400> 3

Leu Ser Thr Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg

1 5 10 15

Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser

20 25 30

Pro Pro Ser Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val

35 40 45

Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala

50 55 60

Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr

65 70 75 80

Arg Val Leu Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys

85 90 95

Gln Ser Thr His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg

100 105 110

Glu Ala Val Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu

115 120 125

Leu Arg Leu Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys

130 135 140

Tyr Ser Asn Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro

145 150 155 160

Ser Asp Ser Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg

165 170 175

Gln Trp Leu Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala

180 185 190

His Cys Ser Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn

195 200 205

Gly Phe Thr Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met

210 215 220

Asn Arg Pro Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln

225 230 235 240

His Leu Gln Ser Ser Arg His Arg Arg

245

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(112)

<223> 成熟TGFb1

<400> 4

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys

1 5 10 15

Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp

20 25 30

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys

35 40 45

Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu

50 55 60

Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro

85 90 95

Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser

100 105 110

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-01

<400> 5

Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Trp Leu Leu Val

20

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-02

<400> 6

Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro

1 5 10 15

Ala Ala Gly Leu

20

<210> 7

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(25)

<223> TGFb-02.1

<400> 7

Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro

1 5 10 15

Ala Ala Gly Leu Ser Thr Cys Lys Thr

20 25

<210> 8

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(25)

<223> TGFb-02.2

<400> 8

Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu

20 25

<210> 9

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(30)

<223> TGFb-02.3

<400> 9

Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr Cys Lys Thr

20 25 30

<210> 10

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-03

<400> 10

Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr Cys Lys Thr Ile

1 5 10 15

Asp Met Glu Leu

20

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-04

<400> 11

Ser Thr Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile

1 5 10 15

Glu Ala Ile Arg

20

<210> 12

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-05

<400> 12

Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ala

20

<210> 13

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(25)

<223> TGFb-05.1

<400> 13

Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly

1 5 10 15

Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala

20 25

<210> 14

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(25)

<223> TGFb-05.2

<400> 14

Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser Gln

20 25

<210> 15

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(30)

<223> TGFb-05.3

<400> 15

Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly

1 5 10 15

Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser Gln

20 25 30

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-06

<400> 16

Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser Gln Gly

1 5 10 15

Glu Val Pro Pro

20

<210> 17

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-07

<400> 17

Ser Pro Pro Ser Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala

1 5 10 15

Val Leu Ala Leu

20

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-08

<400> 18

Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Thr Arg Asp

1 5 10 15

Arg Val Ala Gly

20

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-09

<400> 19

Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu

1 5 10 15

Pro Glu Pro Glu

20

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-10

<400> 20

Glu Ser Ala Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys

1 5 10 15

Glu Val Thr Arg

20

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-11

<400> 21

Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu Met Val Glu Thr

1 5 10 15

His Asn Glu Ile

20

<210> 22

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-12

<400> 22

Val Leu Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln

1 5 10 15

Ser Thr His Ser

20

<210> 23

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-13

<400> 23

Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn

1 5 10 15

Thr Ser Glu Leu

20

<210> 24

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(25)

<223> TGFb-13.1

<400> 24

Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr His Ser Ile

1 5 10 15

Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu

20 25

<210> 25

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(25)

<223> TGFb-13.2

<400> 25

Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn

1 5 10 15

Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val Pro

20 25

<210> 26

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(30)

<223> TGFb-13.3

<400> 26

Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr His Ser Ile

1 5 10 15

Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val Pro

20 25 30

<210> 27

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-14

<400> 27

Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val Pro Glu

1 5 10 15

Pro Val Leu Leu

20

<210> 28

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-15

<400> 28

Arg Glu Ala Val Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg

1 5 10 15

Leu Leu Arg Leu

20

<210> 29

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(25)

<223> TGFb-15.1

<400> 29

Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser

1 5 10 15

Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu

20 25

<210> 30

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(25)

<223> TGFb-15.2

<400> 30

Arg Glu Ala Val Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg

1 5 10 15

Leu Leu Arg Leu Lys Leu Lys Val Glu

20 25

<210> 31

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(30)

<223> TGFb-15.3

<400> 31

Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser

1 5 10 15

Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu Lys Leu Lys Val Glu

20 25 30

<210> 32

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-16

<400> 32

Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu Lys Leu Lys Val Glu Gln

1 5 10 15

His Val Glu Leu

20

<210> 33

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-17

<400> 33

Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn

1 5 10 15

Asn Ser Trp Arg

20

<210> 34

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-18

<400> 34

Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu

1 5 10 15

Leu Ala Pro Ser

20

<210> 35

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-19

<400> 35

Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser Pro Glu Trp Leu

1 5 10 15

Ser Phe Asp Val

20

<210> 36

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-20

<400> 36

Asp Ser Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln

1 5 10 15

Trp Leu Ser Arg

20

<210> 37

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-21

<400> 37

Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly

1 5 10 15

Phe Arg Leu Ser

20

<210> 38

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-22

<400> 38

Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser Cys Asp

1 5 10 15

Ser Arg Asp Asn

20

<210> 39

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-23

<400> 39

Ala His Cys Ser Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile

1 5 10 15

Asn Gly Phe Thr

20

<210> 40

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-24

<400> 40

Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr Thr Gly Arg Arg Gly Asp

1 5 10 15

Leu Ala Thr Ile

20

<210> 41

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-25

<400> 41

Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro

1 5 10 15

Phe Leu Leu Leu

20

<210> 42

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-26

<400> 42

His Gly Met Asn Arg Pro Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu

1 5 10 15

Arg Ala Gln His

20

<210> 43

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(25)

<223> TGFb-26.1

<400> 43

Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro Phe Leu Leu Leu Met

1 5 10 15

Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His

20 25

<210> 44

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(25)

<223> TGFb-26.2

<400> 44

His Gly Met Asn Arg Pro Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu

1 5 10 15

Arg Ala Gln His Leu Gln Ser Ser Arg

20 25

<210> 45

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(30)

<223> TGFb-26.3

<400> 45

Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro Phe Leu Leu Leu Met

1 5 10 15

Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln Ser Ser Arg

20 25 30

<210> 46

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-27

<400> 46

Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln Ser Ser Arg His

1 5 10 15

Arg Arg Ala Leu

20

<210> 47

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-28

<400> 47

Leu Gln Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe

1 5 10 15

Ser Ser Thr Glu

20

<210> 48

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-29

<400> 48

Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg

1 5 10 15

Gln Leu Tyr Ile

20

<210> 49

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-30

<400> 49

Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu

1 5 10 15

Gly Trp Lys Trp

20

<210> 50

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(25)

<223> TGFb-30.1

<400> 50

Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp

1 5 10 15

Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp

20 25

<210> 51

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(25)

<223> TGFb-30.2

<400> 51

Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu

1 5 10 15

Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys

20 25

<210> 52

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(30)

<223> TGFb-30.3

<400> 52

Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp

1 5 10 15

Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys

20 25 30

<210> 53

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-31

<400> 53

Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly

1 5 10 15

Tyr His Ala Asn

20

<210> 54

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-32

<400> 54

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys

1 5 10 15

Pro Tyr Ile Trp

20

<210> 55

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-33

<400> 55

Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Lys Val Leu

20

<210> 56

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(25)

<223> TGFb-33.1

<400> 56

Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser

1 5 10 15

Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu

20 25

<210> 57

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(25)

<223> TGFb-33.2

<400> 57

Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln

20 25

<210> 58

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(30)

<223> TGFb-33.3

<400> 58

Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser

1 5 10 15

Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln

20 25 30

<210> 59

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-34

<400> 59

Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His

1 5 10 15

Asn Pro Gly Ala

20

<210> 60

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-35

<400> 60

Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys

1 5 10 15

Val Pro Gln Ala

20

<210> 61

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-36

<400> 61

Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile

1 5 10 15

Val Tyr Tyr Val

20

<210> 62

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-37

<400> 62

Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val

1 5 10 15

Glu Gln Leu Ser

20

<210> 63

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(20)

<223> TGFb-38

<400> 63

Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser

1 5 10 15

Cys Lys Cys Ser

20

<210> 64

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(25)

<223> TGFb-38.1

<400> 64

Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn

1 5 10 15

Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser

20 25

<210> 65

<211> 40

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(40)

<223> TGFb1 LAP亚区域

<400> 65

Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn

1 5 10 15

Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg

20 25 30

Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu

35 40

<210> 66

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(10)

<223> TGFb-15短

<400> 66

Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu

1 5 10

<210> 67

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(10)

<223> TGFb-A2-01

<400> 67

Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Leu

1 5 10

Claims (15)

1.一种多肽，其为人转化生长因子1(TGFb1)的免疫原性片段，并且其包含SEQ ID NO:1的至少9个连续氨基酸的序列或由SEQ ID NO:1的至少9个连续氨基酸的序列组成。

2.根据权利要求1所述的多肽，其包含SEQ ID NO:1的多达9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个连续氨基酸，或由SEQ IDNO:1的多达9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个连续氨基酸组成。

3.根据权利要求1或2所述的多肽，其包含SEQ ID NO:66、28-31、67、5-9、42-45、12-15、55-58、23-26、49-52、63、64、65或2中任一个的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:66、28-31、67、5-9、42-45、12-15、55-58、23-26、49-52、63、64、65或2中任一个的氨基酸序列组成。

4.根据权利要求3所述的多肽，其包含SEQ ID NO:66、28、67、5、6、42、12、55、23、49或63中任一个的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:66、28、67、5、6、42、12、55、23、49或63中任一个的氨基酸序列组成。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽，其具有9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个氨基酸的最大长度和/或其中C端氨基酸被相应的酰胺替换。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽，其包含HLA-A2限制性表位，任选地其中，所述HLA-A2限制性表位包含SEQ ID NO:66或67的氨基酸序列或由SEQ ID NO:66或67的氨基酸序列组成。

7.一种编码根据权利要求1-6中任一项所述的多肽的多核苷酸，任选地包含在媒介内。

8.一种组合物，包含：根据权利要求1-6中任一项所述的多肽和/或根据权利要求7所述的多核苷酸；以及任选的佐剂。

9.根据权利要求8所述的组合物，还包含：至少一种不同的根据权利要求1-6中任一项所述的多肽；至少一种不同的根据权利要求7所述的多核苷酸；和/或至少一种药学上可接受的稀释剂、载体或防腐剂。

10.根据权利要求8或9所述的组合物，其包含佐剂，所述佐剂选自由基于细菌DNA的佐剂、基于油/表面活性剂的佐剂、基于病毒dsRNA的佐剂、咪唑喹啉和Montanide ISA佐剂组成的组。

11.一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：向所述受试者施用根据权利要求1-6中任一项所述的多肽、根据权利要求7所述的多核苷酸、和/或根据权利要求8-10中任一项所述的组合物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述疾病或病症为：

(i)癌症，其任选地选自由乳腺癌、宫颈癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌(如非小细胞肺癌(NSCLC))、黑色素瘤、白血病(如急性骨髓性白血病)或前列腺癌组成的组；和/或

(ii)至少部分地以表达TGFb1的细胞的不适当的或过度的免疫抑制功能和/或IL-4和/或IL-13的不适当的或过度的表达为特征。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述疾病或病症为癌症，并且所述方法还包括同时或依次施用另外的癌症疗法，优选抗体。

14.一种刺激TGFb1特异性T细胞的方法，所述方法包括将T细胞与根据权利要求1-6中任一项所述的多肽和/或根据权利要求8-10中任一项所述的组合物接触，其中，所述组合物包含至少一种如权利要求1-6中任一项所定义的多肽。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述T细胞存在于取自健康受试者或癌症患者的样本中，任选地为肿瘤样本。

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