CN113164545A - 免疫原性精氨酸酶2多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及衍生自精氨酸酶2的新多肽。本发明还涉及所述多肽和包括所述多肽的组合物的用途。

Description

免疫原性精氨酸酶2多肽
技术领域
本发明涉及衍生自精氨酸酶2的新多肽。本发明还涉及所述多肽和包括所述多肽的组合物的用途。
背景技术
精氨酸酶是催化氨基酸L-精氨酸转化为L-鸟氨酸和尿素的反应的酶。这消耗了精氨酸的微环境并导致肿瘤特异性细胞毒性T细胞应答的抑制。例如,在乳腺癌、肺癌、结肠癌或前列腺癌患者的癌细胞中已检测到精氨酸酶活性升高。已表明,在体外和体内,用大鼠精氨酸酶基因转染的小鼠巨噬细胞促使共培养的肿瘤细胞的增殖。此外,由巨噬细胞的精氨酸酶表达的诱导已表明通过聚胺合成而增加肿瘤血管形成。鼠肺癌模型的结果表明,存在成熟肿瘤相关骨髓细胞的亚群,其表达高水平的精氨酸酶。这些肿瘤相关骨髓细胞消耗了胞外L-精氨酸,这抑制了肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的抗原特异性增殖。在小鼠中,注入精氨酸酶抑制剂阻断了肺癌的生长。这表明在肿瘤细胞和肿瘤相关骨髓细胞中如何诱导精氨酸酶表达可以通过抑制抗肿瘤免疫应答(通过对TIL的负效应)来促使肿瘤生长。
MDSC(骨髓衍生的抑制细胞)抑制效应T细胞和天然杀伤细胞的活化、增殖和细胞毒性,以及诱导Treg分化和扩张。肿瘤细胞和MDSC都能通过经由酶——一氧化氮合酶(NOS)和精氨酸酶操控L-精氨酸代谢来抑制T细胞。许多肿瘤表现出增加的精氨酸酶和可诱导NOS(iNOS)的表达,导致从肿瘤微环境中的精氨酸消耗。若干研究强调这种改变的肿瘤精氨酸代谢在抑制肿瘤特异性T细胞应答中的重要性,并且最近研究证明,急性髓系白血病(AML)冲击显示出对抑制T细胞增殖和造血干细胞的精氨酸酶依赖性能力。此外,精氨酸酶和iNOS抑制剂降低了AML的抑制活性。
在哺乳动物中,存在两种精氨酸酶同工酶:精氨酸酶1和精氨酸酶2。这两种同功酶催化相同的生化反应(因此不能通过酶分析来区分),但在细胞表达、调节和亚细胞定位方面有所不同。
发明内容
本发明人先前已鉴定出是免疫原性“热点”的精氨酸酶1和精氨酸酶2的50个氨基酸的一个区域。该区域对应于全长人精氨酸酶1(SEQ ID NO:53)的位置161至210或全长人精氨酸酶2(SEQ ID NO:51)的位置180至229,或鼠精氨酸酶的相应位置。所述区域及衍生自它的肽描述于WO2018065563中。本发明人还鉴定出衍生自精氨酸酶1的“热点”区域的多肽的特定亚组在刺激免疫应答方面特别有效。这些肽对应于全长人精氨酸酶1的位置169至206、全长人精氨酸酶1的位置169至200、或全长人精氨酸酶1的位置169-210(或人精氨酸酶2或鼠精氨酸酶1的相应位置)。PCT/EP2019/075731及其在先申请GB1815549.9描述了所述多肽的亚组。
本发明人现在已经鉴定出衍生自人精氨酸酶2的完全不同区域的多肽在刺激免疫应答方面特别有效。令人惊讶的是,所述区域跨越人精氨酸酶2的转运肽的C端(SEQ ID NO:51的位置22,参见图7中的示意图)。在该区域与人精氨酸酶1的序列同源性相对较低。
本发明的多肽预期在刺激针对精氨酸酶2和精氨酸酶2表达细胞的有益免疫应答方面特别有效。癌症的新免疫疗法的开发需要充分理解发病机理中涉及的分子以及由免疫系统识别的特异性蛋白。在临床背景下,诱导精氨酸酶特异性免疫应答,除杀死癌细胞以外,还能通过抑制精氨酸酶表达细胞(特别是MDSC和肿瘤相关的巨噬细胞(TAM))的免疫抑制功能而在总体上支持抗癌免疫应答。因此,由于精氨酸酶表达细胞拮抗其他免疫治疗的期望效果,因此靶向骨髓树突状细胞(例如通过接种本发明的多肽)将与其他抗癌免疫治疗高度协作。
本发明提供了一种多肽,其是人精氨酸酶2(SEQ ID NO:51)的免疫原性片段,包括SEQ ID NO:51的至少9个连续氨基酸的序列或由SEQ ID NO:51的至少9个连续氨基酸的序列组成,所述连续氨基酸序列(i)包括SEQ ID NO:51的至少位置21、22和23处的氨基酸,或(ii)选自SEQ ID NO:51的位置180至229。所述多肽可以包括(i)或(ii)所定义的SEQ IDNO:51的多达15、20、25、30、35、40、45或50个连续氨基酸或由(i)或(ii)所定义的SEQ IDNO:51的多达15、20、25、30、35、40、45或50个连续氨基酸组成。所述多肽可以包括SEQ IDNO:59、58、57、54、55、56、2、3、19、20、21、60或61中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:59、58、57、54、55、56、2、3、19、20、21、60或61中任一个的氨基酸序列组成。所述多肽的最大长度为9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸和/或其中C端氨基酸被相应酰胺替换。所述多肽可以被分离。
本发明还提供了一种多肽,其是鼠精氨酸酶2(SEQ ID NO:52)的免疫原性片段,包括SEQ ID NO:52的至少9个连续氨基酸的序列或由SEQ ID NO:52的至少9个连续氨基酸的序列组成,所述连续氨基酸(i)包括SEQ ID NO:52的至少位置21、22和23处的氨基酸,或(ii)选自SEQ ID NO:52的位置180至229。所述多肽可以包括(i)或(ii)所定义的SEQ IDNO:52的多达15、20、25、30、35、40、45或50个连续氨基酸或由(i)或(ii)所定义的SEQ IDNO:52的多达15、20、25、30、35、40、45或50个连续氨基酸组成。所述多肽的最大长度是9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸,和/或其中C端氨基酸被相应的酰胺替换。所述多肽可以被分离。
本发明还提供了一种组合物,其包括本发明的多肽、至少一种药学上可接受的稀释剂、载体或防腐剂以及可选的佐剂。
本发明还提供了一种治疗或预防受试者疾病或病况的方法,所述方法包括向所述受试者施用本发明的多肽或组合物。
附图说明
图1示出了跨越人精氨酸酶1和人精氨酸酶2“热点”区域的某些多肽的设计。说明书的表X提供了序列标识符编号。
图2示出了通过来自健康捐赠者和黑色素瘤患者(AA914.30)的外周血单个核细胞(PBMC)来识别与热点区相对应的ARG2肽。斑点计数表示为用肽刺激的孔的平均值和没有肽的对照孔的平均值之间的差异。每孔接种5×105个细胞,肽和对照刺激平行进行三次。采用无分布重采样(DFR)规则分析应答。
图3示出了通过来自健康捐赠者的PBMC来识别多个ARG2库肽。斑点计数表示为用肽刺激的孔的平均值和没有肽的对照孔的平均值之间的差异。每孔接种4-4.5×105个细胞,肽和对照刺激平行进行三次。方框表示在筛选6个健康捐赠者后最高、最丰富应答的肽。
图4验证了对热点区域肽的应答。斑点计数表示为用肽刺激的孔的平均值和没有肽的对照孔的平均值之间的差异。每孔接种5×105个细胞,肽和对照刺激平行进行三次。方框显示具有几乎相同序列的肽,便于比较获得的应答。
图5示出了针对ARG2_1、ARG2_5、ARG2_8、ARG2_13和ARG2_22的应答的验证。斑点计数表示为用肽刺激的孔的平均值和没有肽的对照孔的平均值之间的差异。每孔接种3×105个细胞,肽和对照刺激平行进行三次。观察到针对ARG2_1的强烈且显著的应答。
图6A和6B显示了两个健康捐赠者对ARG2_1或不含肽的CD4+T细胞应答。用CD4抗体染色PBMC细胞,通过流式细胞术在有或无ARG2_1刺激下,在细胞内细胞因子释放试验中分析PBMC细胞。从图中可以看出,当用ARG_2衍生肽刺激时,CD4细胞释放IFN-γ(y轴)或TNF-α(x轴)。
图7示出了说明ARG2_1片段位置的精氨酸酶2的示意图。
图8示出了通过来自健康捐赠者(BC或Buf-M)和癌症患者(AA,黑色素瘤;UR,肾细胞癌)的PBMC来识别与热点区域相对应的ARG2肽。斑点计数表示为用肽刺激的孔的平均值和没有肽的对照孔的平均值之间的差异。每孔接种4×105个细胞,肽和对照刺激平行进行三次。采用无分布重采样(DFR)规则分析应答。*-p<0.05,**-p<0.01。
图9示出了一名癌症患者对ARG2_1或没有肽的CD8+T细胞应答。用CD8抗体染色PBMC细胞,通过流式细胞术在有或无ARG2-1刺激下,在细胞内细胞因子释放试验中分析PBMC细胞。从图中可以看出,当用ARG_2衍生肽刺激时,CD8+T细胞释放更多的IFN-γ(y轴)和TNF-α(x轴),即使也观察到TNF-α的一些背景释放。
图10示出了在没有预刺激,但在ELISPOT板中孵育+/-肽72小时后,针对ARG2_1的体外ELISPOT应答。每孔接种9×105个细胞,含有ARG2_1肽和不含有ARG2_1(对照)平行进行三次。斑点计数表示为用肽刺激的孔的平均值和没有肽的对照孔的平均值之间的差异。
图11示出了鼠Arg2体内测试的实验方案。每组3只小鼠皮下接种6个肽中的一个。7天后,处死小鼠,取脾脏匀浆,并且PBMC用于mIFNγELISPOT。
图12示出了图11的实验之后执行的mIFNγELISPOT的结果。斑点计数表示为用肽刺激的孔的平均值和没有肽的对照孔的平均值之间的差异。每孔接种8×105个细胞,含有肽和不含肽平行进行三次。括号表示接种了相同肽的小鼠,方框突出强调具有最强和最显著应答的小鼠。
图13示出了免疫接种mARG2_188-196对mARG2_188-196和mARG2_182-197产生强烈的mIFNγ应答。每孔接种8×105个细胞,肽和对照刺激平行进行三次。
图14示出了ARG2-1被来自健康捐赠者和患有实体瘤或AML的癌症患者的PMBC广泛地识别。(A)在来自健康捐赠者(n=33)、实体瘤癌症患者(n=19)或AML癌症患者(n=19)的PMBC中对ARG2-1肽的IFNγELISPOT应答。每孔接种3-4×105个细胞。肽和对照刺激平行进行三次。每个斑点代表一个捐赠者,并且是肽特异性IFNγ分泌细胞的数量(用肽刺激的孔的平均值和对照孔的平均值之间的差异)。(B)在健康捐赠者(HD49和HD50)和用ARG2-1刺激或无刺激对照的实体瘤的癌症患者(AA27)中用于IFNγ和TNFα产生的代表性细胞内细胞因子染色。
图15示出了在健康捐赠者和癌症患者中,长ARG2肽A2F2诱导强烈且频繁的CD4+T细胞应答。(A)在来自6名健康捐赠者的PBMC中,对长肽A2F1、A2F2和A2F3的IFNγELISPOT应答。每孔接种4×105个细胞,肽和对照刺激平行进行三次。特异性斑点计数(肽特异性IFNγ分泌细胞)表示为用肽刺激的孔的平均值和对照孔的平均值之间的IFNγ斑点数的差异。在3个实验中,对肽的应答太多难以计数(TNTC)并设置为>750个斑点。(B)在来自6名健康捐赠者的PBMC中,对A2L2和ARG2-1的IFNγELISPOT应答。每孔接种4×105个细胞。肽和对照刺激平行进行三次。特异性斑点计数(肽特异性IFNγ分泌细胞)表示为用肽刺激的孔的平均值和对照孔的平均值之间的IFNγ斑点数的差异。根据无分布重采样规则,*p<0.05或**p<0.01。(C)在来自健康捐赠者(n=30)和实体瘤患者(n=18)的PBMC中,对A2L2肽的IFNγELISPOT应答。每孔接种3-4×105个细胞。肽和对照刺激平行进行三次。每个斑点代表一个捐赠者,并且也是肽特异性IFNγ分泌细胞的数量(用肽刺激的孔的平均值和对照孔的平均值之间的差异)。(D)在健康捐赠者(HD48和HD53)和用A2L2刺激或没有刺激的对照的实体瘤患者(AA27)中用于IFNγ和TFNa产生的代表性细胞内细胞因子染色。(E)在来自健康捐赠者(n=26)和实体瘤患者(n=11)的PBMC中,对ARG2-1和A2L2的IFNγEFISPOT应答,以比较对两种肽的应答幅度。每孔接种4×105个细胞,肽和对照刺激平行进行三次。特异性斑点计数(肽特异性IFNγ分泌细胞)表示为用肽刺激的孔的平均值与对照孔的平均值之间的IFNγ斑点数的差异。ns:p=0.7038。
图16示出了ARG2特异性T细胞识别ARG2表达树突状细胞。(A)ARG2特异性T细胞是从前列腺癌患者身上扩增的。通过用于肽刺激细胞和非刺激对照中的TNFα和IFNγ产生的细胞内细胞因子染色来评估T细胞培养物的特异性。左:ARG2-1肽刺激和非刺激(对照)细胞的点图。右:响应于对照刺激(没有肽)、ARG2-1肽刺激或A2L2肽刺激,产生IFNγ、TNFα或产生两者的%CD4+T细胞。(B)通过对对照刺激(没有肽)、ARG2-1肽或A2L2肽的ELISPOT应答来评估ARG2特异性T细胞的特异性。每孔接种4×104个细胞。TNTC=太多难以计数(超过500个斑点)。(C)检测ARG2特异性T细胞的HLA限制性。在不同II类阻断剂的存在下,ARG2特异性T细胞对ARG2-1肽的IFNγELISPOT应答。(D)通过ARG2特异性T细胞对转染无关对照mRNA(模拟mRNA)或ARG2 mRNA的自体树突状细胞的IFNγELISPOT应答。效靶比为5:1,每孔接种5×104个效应细胞。根据无分布重采样规则,*p<0.05或**p<0.01。
图17示出了ARG2特异性T细胞识别ARG2表达恶性髓样细胞。(A)为了鉴定HLA匹配恶性细胞,检测ARG2特异性T细胞对用ARG2-1肽预脉冲的不同相关癌细胞系的IFNγELISPOT应答。没有肽刺激的同一肿瘤细胞系被检测作为对照。效靶比1:1,每孔接种1×104个效应细胞。根据无分布重采样规则,*p<0.05或**p<0.01。TNTC=太多难以计数(>500)。(B)ARG2特异性T细胞对用ARG2-1肽和II类阻断剂脉冲的THP-1细胞的IFNγELISPOT应答。(C)用不同细胞因子诱导的THP-1细胞孵育48小时后,通过RT-qPCR评估THP-1中的ARG2表达。数据表示为与未受刺激的THP-1细胞相比的成倍变化,平均值+SD,n=4。(D)ARG2特异性T细胞对用细胞因子混合物刺激的THP-1细胞的IFNγELISPOT应答。效靶比5:1,每孔1.5×105个效应细胞。根据无分布重采样规则**p<0.01和ns=不显著。(E)未受刺激的THP-1细胞或用细胞因子混合物预刺激的THP-1细胞孵育48小时后,从ARG2特异性T细胞培养物中的CD4+T细胞进行TNFα和IFNγ产生的细胞内染色。效靶比2:1,在每种情况下使用500,000个效应细胞。(F)用细胞因子混合物孵育48小时后,通过RT-qPCR评估THP-1细胞中的ARG1和ARG2表达。未受刺激的THP-1细胞作为对照。数据表示为对于管家基因ACTB的相对表达,平均值+SD,n=4。(G)ARG2特异性T细胞对用细胞因子混合物(THP-1+cyto)和II类阻断剂(aHLA-DR)刺激的THP-1细胞的IFNγELISPOT应答。效靶比5:1,每孔接种1.5×105个效应细胞。**根据无分布重采样规则,p<0.01和ns=不显著。(H)用细胞因子混合物或IFNγ刺激48小时后,通过RT-qPCR评估THP-1细胞中的ARG2表达。未受刺激的THP-1细胞作为对照。数据表示为对于管家基因RPLPO的相对表达,平均值+SD,n=4。(I)ARG2特异性T细胞对用细胞因子混合物(THP-1+细胞因子)或IFNγ(THP-1+IFNγ)预刺激的THP-1细胞的IFNγELISPOT应答。效靶比2.5:1,每孔接种5×104个效应细胞。根据无分布重采样规则,**p<0.01和ns=不显著。
图18示出了ARG2特异性T细胞识别若干ARG2表达恶性髓样细胞。(A)用细胞因子混合物孵育48小时后,通过RT-qPCR评估MONO-MAC-1(MM1)中的ARG2表达。数据表示为与未受刺激的MM1细胞相比的成倍变化,平均值+SD,n=4。(B)用细胞因子混合物或IFNγ孵育48小时后,通过RT-qPCR评估MM1细胞中的ARG2表达。数据表示为与未受刺激的MM1细胞相比的成倍变化,平均值+SD,n=4。(C)ARG2特异性T细胞对用细胞因子混合物(MM1+细胞因子混合物)或IFNγ(MM1+IFNγ)预刺激的MM1细胞的IFNγELISPOT应答。效靶比2.5:1,每孔接种5×104个效应细胞。根据无分布重采样规则,**p<0.01和ns=不显著。
图19示出了通过ARG2特异性T细胞的ARG2表达细胞的识别除依赖于靶细胞的抗原处理装置外,还依赖于ARG2表达水平。(A)ARG2特异性T细胞对未受刺激或经细胞因子混合物预刺激、以及模拟转染或用ARG1或ARG2mRNA转染的THP-1细胞的IFNγELISPOT应答。效靶比2.5:1,每孔接种5×104个效应细胞。根据无分布重采样规则,**p<0.01和ns=不显著。(B)在ARG2特异性T细胞培养物与未受刺激的THP-1细胞或用细胞因子混合物预刺激的THP-1细胞孵育,然后进行模拟(mock)或ARG2 mRNA(mRNA)转染时,来自ARG2特异性T细胞培养物中的CD4+T细胞的TNFα和IFNγ产生的细胞内染色。效靶比2:1,在每个情况下使用500,000个效应细胞。(C)在用ARG2特异性siRNAs转染48小时后,通过RT-qPCR评估THP-1细胞中的ARG2表达。数据表示为与模拟转染的THP-1细胞相比的成倍变化,平均值+SD,n=4。(D)在ARG2特异性T细胞培养物与模拟或siRNA转染细胞孵育时,来自ARG2特异性T细胞培养物中的CD4+T细胞的TNFα和IFNγ产生的细胞内染色在未受刺激或细胞因子混合物刺激的条件,保持48小时以进行设置。效靶比2:1,在每种情况下使用500,000个效应细胞。(E)用ARG2特异性siRNAs转染,其次细胞因子混合物刺激,48小时后通过RT-qPCR来评估THP-1细胞中的ARG2表达。数据表示为与未受刺激的模拟转染THP-1细胞相比的成倍变化,平均值+SD,n=4。
图20(A)用6个不同预测的Arg2表位之一接种的C57BL/6小鼠的脾细胞的鼠IFNγELISPOT筛选。每孔接种8×105个细胞,肽和对照刺激平行进行三次。特异性斑点计数(肽特异性IFNγ分泌细胞)表示为用肽刺激的孔的平均值和对照孔的平均值之间的IFNγ斑点数的差异。(B)用Arg2肽P4(M1-M5)或对照免疫接种(Ctrl 1-4)进行接种的C57BL/6小鼠的脾细胞的鼠IFNγELIPOT。每孔接种8×105个细胞,肽和对照刺激平行进行三次。特异性斑点计数(肽特异性IFNγ分泌细胞)表示为用肽刺激的孔的平均值和对照孔的平均值之间的IFNγ斑点数的差异。(C)在C57BL/6背景下不同来源的移植瘤中的Arg2表达。3例移植瘤均评估了其肿瘤类型。数据表示为对于管家基因Hprtl的相对表达、平均值+SD,n=3。(D)在添加或不添加抗PD-1治疗的LL2接种小鼠中进行Arg2免疫接种的两项单独疗效研究的治疗方案。第0天在右侧腹皮下注射5×105个LL2细胞,然后用以下处理:(E)对照或用Arg2肽的Arg2免疫接种(两组均为n=20)或(F)对照免疫接种、Arg2免疫接种、抗PD-1处理,或Arg2免疫接种+抗PD-1处理(所有组均为n=10)。(E-F)个体疗效研究中LL2肿瘤的平均肿瘤生长。误差条表示平均值的标准误差(SEM),***=p<0.0001。(G)在(E)所述的治疗组的单个肿瘤尺寸。误差条表示标准偏差(SD)。
序列简介
SEQ ID NO:1至38分别是衍生自人精氨酸酶2的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39和40分别是人精氨酸酶2和精氨酸酶1的相应“热点”区域。
SEQ ID NO:41至44分别是衍生自人精氨酸酶1的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45至50分别是衍生自鼠精氨酸酶2的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:51是全长人精氨酸酶2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:52是全长鼠精氨酸酶2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:53是全长人精氨酸酶1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:54至56分别是衍生自人精氨酸酶2的多肽的氨基酸序列,其对应于SEQID NO:2(Arg2_l)的多肽内的预测HLA-A2或A3表位的序列。
SEQ ID NO:57至59分别是衍生自人精氨酸酶2的另外的多肽的氨基酸序列,其包括SEQ ID NO:54至56的表位中的至少一个。
SEQ ID NO:60至61是分别衍生自人精氨酸酶2的另外的多肽的氨基酸序列,其包括来自SEQ ID NO:39的“热点”区域的序列。
SEQ ID NO:62是人精氨酸酶2的预测信号序列。
具体实施方式
应理解,所公开的产品和方法的不同应用可被改变以适应本领域的具体需求。还应理解,本文使用的术语仅以描述本发明的具体实施方案的目的,并且不意欲进行限制。
除在本说明书和所附权利要求书中使用以外,单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物,除非内容中另外明确说明。因此,例如,提及“一个多肽”包括“多个多肽”等。
本文使用的“多肽”广义上指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或其他肽模拟物的化合物。因此,术语“多肽”包括短肽序列,还包括更长的多肽和蛋白。如本文使用的,术语“氨基酸”即指天然和/或非天然或合成氨基酸,都包括D或L光学异构体,氨基酸类似物和肽模拟物。
术语“患者”和“受试者”可互换使用,通常指的是人类。
本文引用的所有公开出版物、专利和专利申请,无论是上文还是下文,均以全文引用的方式纳入本文。
本发明人已经确定跨越转运肽C端的人精氨酸酶2的区域特别具有免疫原性。转运肽的C端残基对应于SEQ ID NO:51的位置22。因此,跨越转运肽C端的区域至少包括SEQ IDNO:51的位置21、22和23的氨基酸。
通过本文的“免疫原性的”,意指多肽能够对精氨酸酶2蛋白诱发免疫应答,优选地当所述蛋白存在于表达精氨酸酶2蛋白的细胞中或细胞上时。换句话说,多肽可被描述为对精氨酸酶2是免疫原性的。该多肽可替代地被描述为是精氨酸酶2的免疫原性片段。免疫应答优选为T细胞应答,因此,多肽可被描述为是包括T细胞表位的精氨酸酶2的免疫原性片段。在给所述个体(或所述样本)施用多肽后,可在至少一个个体(或从个体中提取的样本)中检测到免疫应答。
可使用任何合适的方法(包括体外方法)来将多肽鉴定为是免疫原性的。例如,如果多肽具有以下特征中的至少一种,则多肽可被鉴定为是免疫原性的:
(i)通过ELISPOT测定,它能够在健康受试者和/或癌症患者的PBL群中诱发IFN-γ产生细胞,和/或
(ii)它能够在与精氨酸酶2反应的CTL的肿瘤组织样本中进行原位检测;和/或
(iii)它能够诱导特异性T细胞的体外生长。
以下实施例部分还描述了适于确定多肽是否具有免疫原性的方法。
本发明的多肽是人精氨酸酶2(SEQ ID NO:51)的免疫原性片段,其包含SEQ IDNO:51的至少9个连续氨基酸的序列或由SEQ ID NO:51的至少9个连续氨基酸的序列组成,所述连续氨基酸(i)包括SEQ ID NO:51的至少位置21、22和23处的氨基酸,或(ii)选自SEQID NO:51的位置180至229。多肽可以包括(i)或(ii)中所定义的SEQ ID NO:51的多达15、20、25、30、35、40、45或50个连续氨基酸或由(i)或(ii)中所定义的SEQ ID NO:51的多达15、20、25、30、35、40、45或50个连续氨基酸组成。所述多肽可以包括SEQ ID NO:59、58、57、54、55、56、2、3、19、20、21、60或61中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:59、58、57、54、55、56、2、3、19、20、21、60或61中任一个的氨基酸序列组成。多肽的最大长度是9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸和/或其中C端氨基酸被相应酰胺所替换。该多肽可以被分离。
多肽优选地包括SEQ ID NO:51的至少9个连续氨基酸或由SEQ ID NO:51的至少9个连续氨基酸组成,其包括SEQ ID NO:51的至少位置21、22和23处的氨基酸,即序列KSV。所述SEQ ID NO:51的至少9个连续氨基酸优选地包括SEQ ID NO:54(ILKKSVHSVA)、SEQ IDNO:55(ILKKSVHSV)或SEQ ID NO:56(SILKKSVHSV)的氨基酸序列。本发明的优选多肽可以包括SEQ ID NO:54、55或56的氨基酸序列或由SEQ ID NO:54、55或56的氨基酸序列组成。特别优选包括这些序列的SEQ ID NO:51的较长多肽片段。例如,本发明提供一种SEQ ID NO:51的多达50个连续氨基酸的多肽,其中连续氨基酸包括SEQ ID NO:54、55或56中任一个的氨基酸序列。此类多肽的示例是包括SEQ ID NO:2、3、57、58或59中任一个的序列或由SEQ IDNO:2、3、57、58或59中任一个的序列组成的多肽。包括SEQ ID NO:59、58和57中任一个的序列或由SEQ ID NO:59、58和57中任一个的序列组成的多肽是优选的。包括SEQ ID NO:59的序列或由其组成的序列的多肽是特别优选的。
在本文描述的任何多肽中,氨基酸序列可以通过一个、二个、三个、四个或五个(即高达五个)插入、缺失或替换来修饰,前提是具有修饰的序列的多肽与具有未修饰的序列的多肽相比,对精氨酸酶2显示出相同或增强的免疫原性。通过“相同”可以理解,与未修饰的序列的多肽相比,修饰的序列的多肽对精氨酸酶2没有表现出显著降低的免疫原性。序列之间的免疫原性的任何比较都应采用相同的试验进行。除非另有规定,对多肽序列的修饰优选为保守氨基酸替换。保守替换用具有相似化学结构、相似化学性质或相似侧链体积的其他氨基酸来代替氨基酸。对它们所取代的氨基酸,引入的氨基酸具有相似的极性、亲水性、疏水性、碱度、酸度、中性或电荷。或者,保守替换可以在在先存在的芳香或脂肪族氨基酸的地方引入芳香或脂肪族的另一个氨基酸。本领域众所周知,保守氨基酸变化可根据下表A1中定义的20种主要氨基酸的性质进行选择。如果氨基酸具有类似的极性,则可参照表A2中氨基酸侧链的亲水性等级来对此确定。
表A1-氨基酸的化学性质
Ala(A) 脂肪族、疏水性、中性 Met(M) 疏水性、中性
Cys(C) 极性、疏水性、中性 Asn(N) 极性、亲水性、中性
Asp(D) 极性、亲水性、电荷(-) Pro(P) 疏水性、中性
Glu(E) 极性、亲水性、电荷(-) Gln(Q) 极性、亲水性、中性
Phe(F) 芳香族、疏水性、中性 Arg(R) 极性、亲水性、电荷(+)
Gly(G) 脂肪族、中性 Ser(S) 极性、亲水性、中性
His(H) 芳香族、极性、亲水性、电荷(+) Thr(T) 极性、亲水性、中性
Ile(I) 脂肪族、疏水性、中性 Val(V) 脂肪族、疏水性、中性
Lys(K) 极性、亲水性、电荷(+) Trp(W) 芳香族、疏水性、中性
Leu(L) 脂肪族、疏水性、中性 Tyr(Y) 芳香族、极性、疏水性
表A2-亲水性等级
Figure BDA0003067385530000081
Figure BDA0003067385530000091
在本文公开的任何多肽中,可进行以下任一或多种修饰以改善理化性质(例如稳定性),前提是与具有未修饰的序列的多肽相比,所述多肽对精氨酸酶2表现出相同或增强的免疫原性:
a)用相应的酰胺替换C端氨基酸(可增加对羧肽酶的抗性);
b)用相应的酰化氨基酸替换N端氨基酸(可增加对氨肽酶的抗性);
c)用相应的甲基化氨基酸替换一个或多个氨基酸(可提高蛋白水解抗性);
d)用相应的D构型氨基酸替换一个或多个氨基酸(可提高蛋白水解抗性);
本文所公开的任何多肽可在N端和/或C端处连接至少一个额外的部分以提高溶解性、稳定性和/或有助于制造/分离,前提是该多肽与缺乏该额外的部分的多肽相比,表现出对精氨酸酶2相同或增加的免疫原性。适合的部分包括亲水性氨基酸。例如,氨基酸序列KK、KR或RR可添加在N端和/或C端处。其他适合的部分包括白蛋白或PEG(聚乙二醇)。
本文所公开的多肽可通过任何适合的方法制备。例如,可使用本领域已知的标准技术(例如Fmoc固相化学(Fmoc solid phase chemistry)、Boc固相化学(Boc solid phasechemistry)或通过液相肽合成)直接合成多肽。或者,可以通过用编码所述多肽的核酸分子或载体转化细胞(通常是细菌细胞)来产生多肽。
本发明提供了编码本发明多肽的核酸分子和载体。本发明还提供包括这种核酸或载体的宿主细胞。
术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中互换使用,并指任何长度的核苷酸的聚合形式,脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸的非限制性示例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。本发明的多核苷酸可以以分离的或基本上分离的形式提供。通过基本上分离,意味着可以有从任何周围介质的基本的(而不是全部的)多肽的分离。多核苷酸可与不会干扰其预期用途的载体或稀释剂混合,但仍被视为基本上分离的。“编码”所选多肽的核酸序列是这样的核酸分子:当其置于适当调控序列的控制下(例如在表达载体中)在体内被转录(DNA的情况下)并被翻译(mRNA的情况下)成多肽。编码序列的边界由5'(氨基)末端处的起始密码子和3'(羧基)末端处的翻译终止密码子决定。就本发明的目的而言,此类核酸序列可包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA、来自病毒或原核DNA或RNA的基因组序列,甚至合成的DNA序列。转录终止序列可位于至编码序列的3'处。
如Sambrook等(1989,Molecular Cloning-a laboratory manual;Cold SpringHarbor Press)中示例所述,可以根据本领域已知的方法合成多核苷酸。本发明的核酸分子可以以表达盒的形式提供,该表达盒包括可操作地连接到插入序列的控制序列,从而允许本发明的多肽在体内表达。这些表达盒依次在载体(例如质粒或重组病毒载体)内提供。这种表达盒可以直接施用于宿主受试者。或者,包括本发明多核苷酸的载体可以施用于宿主受试者。优选地,利用基因载体制备和/或施用多核苷酸。适当的载体可以是能够携带足够数量遗传信息并允许本发明多肽表达的任何载体。
因此,本发明包括包含这种多核苷酸序列的表达载体。这种表达载体通常在分子生物学领域中构建,并且可以例如涉及使用质粒DNA和适当的起始因子、启动子、增强子和其他元件,诸如例如可能需要并且定位在正确方向上的聚腺苷酸化信号以允许本发明的肽表达。其他合适的载体对于本领域技术人员来说是显而易见的。作为这方面的进一步示例,我们参考Sambrook等人。
本发明还包括经修饰以表达本发明多肽的细胞。这类细胞通常包括原核细胞,例如细菌细胞,例如大肠杆菌。可使用常规方法培养此类细胞以产生本发明的多肽。
本发明的多肽可以是基本上分离的形式。它可以与不会干扰预期用途的载体、防腐剂或稀释剂(下文讨论)和/或佐剂(下文讨论)混合,但仍然被视为基本上分离的。它也可以是基本上纯化的形式,在这种情况下,它通常包括制备中的蛋白的至少90%,例如至少95%、98%或99%。
包括含多肽的组合物
在另一方面,本发明提供包括本发明多肽的组合物。例如,本发明提供一种组合物,其包括本发明的一个或多个多肽和以及至少一种药学上可接受的载体、防腐剂或赋形剂。所述载体、防腐剂和赋形剂必须从与组合物的其他成分相容,并且对施用组合物的受试者是无害的意义上是“可接受的”。通常,所有组分和最终组分都是无菌和无热原的。该组合物可以是药物组合物。该组合物可优选包括佐剂。
佐剂是任何这样的物质,即其混合到组合物中将增加或另外改变由组合物引起的免疫应答。广义上的佐剂是促进免疫应答的物质。佐剂还可优选具有储库效应,由于它们还导致活性剂从给药位点缓慢和持续释放。在Goding,Monoclonal Antibodies:Principles&Practice(2nd edition,1986)的第61-63页中提供了对佐剂的一般性讨论。
佐剂可选自由以下组成的组:AlK(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH4(SO4)2、二氧化硅、明矾、Al(OH)3、Ca3(PO4)2、高岭土、碳、氢氧化铝、胞壁酰二肽、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-DMP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰(nornuramyl)-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11687,也称为nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'2'-二棕榈酰-sn-丙三氧基-3-羟磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A,也称为MTP-PE)、于2%角鲨烯/吐温-80.RTM.乳液中的RIBI(MPL+TDM+CWS)、脂多糖及其多种衍生物(包括脂质A)、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂、Merck佐剂65、多核苷酸(例如多IC和多AU酸)、来自结核分枝杆菌(Mycobacterium,tuberculosis)的蜡D、在短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)和布鲁氏菌属(Brucella)成员中发现的物质、Titermax、ISCOMS、Quil A、ALUN(参见US 58767和5,554,372)、脂质A衍生物、霍乱毒素衍生物、HSP衍生物、LPS衍生物,合成肽基质或GMDP、白细胞介素1、白细胞介素2、蒙大拿(Montanide)ISA-51和QS-21。也已表明多种皂素(saponin)提取物适于作为免疫原性组合物中的佐剂。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)也可用作佐剂。
待用于本发明的优选佐剂包括基于油/表面活性剂的佐剂,例如Montanide佐剂(可获自比利时,Seppic),优选Montanide ISA-51。其他优选佐剂为基于细菌DNA的佐剂,例如包括CpG寡核苷酸序列的佐剂。其他优选佐剂为基于病毒dsRNA的佐剂,例如Poly I:C。GM-CSF和咪唑并喹啉(Imidazochiniline)也是优选佐剂的示例。
佐剂最优选为Montanide ISA佐剂。Montanide ISA佐剂优选为Montanide ISA 51或Montanide ISA 720。
在Goding,Monoclonal Antibodies:Principles&Practice(2nd edition,1986第61-63页中还记载了,当目的抗原分子量低或免疫原性差时,推荐偶联至免疫原性载体。因此,本发明的多肽可偶联至载体。载体可独立于佐剂存在。载体的功能可以是,例如,增加多肽片段的分子量以增加活性或免疫原性、赋予稳定性、增加生物活性,或增加血清半衰期。此外,载体可辅助将多肽或其片段呈递到T细胞。因此,在所述组合物中,所述多肽可与载体(例如下文所述的那些)联合。
载体可以是本领域技术人员已知的任何适合的载体,例如蛋白或抗原呈递细胞,例如树突状细胞(DC)。载体蛋白包括钥孔血蓝蛋白(key hole limpet hemocyanin)、血清蛋白如转铁蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵白蛋白、免疫球蛋白,或激素如胰岛素或棕榈酸。或者,载体蛋白可以是破伤风类毒素或白喉类毒素。或者,载体可以是右旋糖苷如琼脂糖。载体必须是人生理上可接受的和安全的。
如果所述组合物包括赋形剂,则所述赋形剂必须在与所述组合物的其它成分相容且对其接受者是无毒的意义上必须是“药学上可接受的”。辅助物质,例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于赋形剂中。这些赋形剂和辅助物质通常是药剂,其在接受组合物的个体中不引起免疫应答并且可被给药而不产生过度的毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体,例如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油和乙醇。其中还可包括药学上可接受的盐,例如,无机酸盐,如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等;以及有机酸盐,如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。药学上可接受的赋形剂、载体和辅助物质的充分讨论可在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中获取。
合适组合物的配置可以使用标准药物调配化学和方法学来实施,所有这些对于合理熟练的技术人员来说都是容易获得的。可以以适于推注给药或连续给药的形式制备、包装或销售这些组合物。可注射组合物可以单位剂量形式(例如以安培瓶)或以可选地包括防腐剂的多剂量容器来制备、包装或销售。组合物包括但不限于悬浮液、溶液剂、油性或水性载体中的乳剂、糊剂和可植入的缓释制剂或生物可降解制剂。在组合物的一个实施方案中,以干燥形式(例如粉末或颗粒)提供活性成分,用于使用适合的载体(例如无菌无热原的水)来复水(reconstitution),之后给予经复水的组合物。组合物可以以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式来制备、包装或销售。该悬浮液或溶液可以根据已知现有技术来配制,除活性成分以外还可包含其他成分,例如本文所述的佐剂、赋形剂和辅助物质。这种无菌可注射的制剂可以使用无毒、肠外可接受的稀释剂或溶剂(例如水或1,3-丁烷二醇)来制备。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于:林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和不易挥发的油类(例如合成的甘油单酯或甘油二酯)。可使用的其他组合物包括那些:其包含微晶形式的活性成分、脂质体制剂中的活性成分、或作为生物可降解聚合物体系组分的活性成分。用于缓释或植入的组合物可包括药学上可接受的聚合物材料或疏水材料,例如乳液、离子交换树脂、微溶性聚合物或微溶性盐。或者,组合物的活性成分可被封装、吸附至颗粒载体或与微粒载体联合。适合的颗粒载体包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的那些,以及衍生自聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)的PLG微粒。参见,例如Jeffery等人(1993)Pharm.Res.10:362-368。还可以使用其它颗粒体系和聚合物,例如,聚合物如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺,以及这些分子的缀合物。
使用方法
本发明的多肽或组合物可用于治疗或预防受试者的疾病或病况的方法中。本发明的多肽或组合物可用于制造用于治疗或预防受试者的疾病或病况的方法中的药物。该方法包括向所述受试者施用所述多肽或所述组合物。可将治疗或预防有效量的所述多肽或所述组合物施用给对其有需要的受试者。
该疾病或病况的特征至少部分是精氨酸酶2的不适当或过度免疫抑制功能。该疾病或病况可以是癌症,优选表达精氨酸酶2和/或与精氨酸酶2的不适当或过度免疫抑制功能相关的癌症。癌症可以是肾癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌或小肠癌,或者可以是结直肠癌或胃癌,或者可以是黑色素瘤,或者可以是白血病,优选急性髓系白血病(AML)或慢性淋巴细胞白血病(CLL)。该癌症可能对额外癌症治疗具有抵抗力,特别是它可能对免疫系统检查点抑制剂(例如抗PDl治疗)具有抵抗力。
该方法可包括同时或依次给予额外癌症治疗。额外癌症治疗可选自细胞因子治疗、T细胞治疗、NK治疗、免疫系统检查点抑制剂、化学治疗、放射治疗、免疫刺激物质(例如其他疫苗)或基因治疗。
免疫系统检查点抑制剂特别优选作为额外癌症治疗。针对精氨酸酶2的免疫接种当与免疫系统检查点的抑制相结合时可以具有协同效应。免疫系统检查点的示例包括:
a)吲哚胺2,3-双加氧酶(IDOl)与其底物之间的相互作用;
b)PD1与PDL1和/或PD1与PDL2之间的相互作用;
c)CTLA4与CD86和/或CTLA4与CD80之间的相互作用;
d)B7-H3和/或B7-H4与其各自配体之间的相互作用;
e)HVEM与BTLA之间的相互作用;
f)GAL9与TIM3之间的相互作用;
g)MHC I类或II类与LAG3之间的相互作用;以及
h)MHCⅠ类或Ⅱ类与KIR之间的相互作用。
检查点(a),(b),(c)的抑制特别优选作为额外癌症治疗。检测点抑制剂可以是阻断或抑制免疫系统检测点的任何免疫调节剂(例如抗体),或者它可以是包括免疫系统检查点的组分或所述组分的免疫原性片段的免疫治疗组合物,其通过免疫系统刺激检查点的靶向。
额外癌症治疗可以是抗体。
所述抗体可以是阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿昔单抗(Abciximab)、阿克托人单抗(Actoxumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿德木单抗(Adecatumumab)、阿非莫单抗(Afelimomab)、阿夫土珠单抗(Afutuzumab)、培阿组单抗(Alacizumab pegol)、ALD518、阿仑妥珠单抗(Alemtuzumab)、阿利苏单抗(Alirocumab)、喷替酸阿妥莫单抗(Altumomabpentetate)、阿麦妥单抗(Amatuximab)、马安莫单抗(Anatumomab mafenatox)、安芦组单抗(Anrukinzumab)、阿泊珠单抗(Apolizumab)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿塞珠单抗(Aselizumab)、阿替奴单抗(Atinumab)、托西利珠单抗(Atlizumab)(=托西利珠单抗(tocilizumab))、阿托木单抗(Atorolimumab)、巴匹组单抗(Bapineuzumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、巴维昔单抗(Bavituximab)、贝妥莫单抗(Bectumomab)、贝利木单抗(Belimumab)、苯拉组单抗(Benralizumab)、柏替木单抗(Bertilimumab)、贝索单抗(Besilesomab)、贝伐赛珠单抗(Bevacizumab)、贝洛托舒单抗(Bezlotoxumab)、比西单抗(Biciromab)、比玛卢单抗(Bimagrumab)、比伐珠单抗(Bivatuzumab mertansine)、兰妥莫单抗(Blinatumomab)、布索组单抗(Blosozumab)、贝伦妥单抗-维多汀(Brentuximabvedotin)、布瑞吉努单抗(Briakinumab)、布罗芦单抗(Brodalumab)、卡那奴单抗(Canakinumab)、坎妥珠单抗-默坦辛(Cantuzumab mertansine)、坎妥珠单抗-拉夫坦辛(Cantuzumab ravtansine)、卡普赛珠单抗(Caplacizumab)、卡罗单抗喷地肽(Capromabpendetide)、卡鲁单抗(Carlumab)、卡妥玛索单抗(Catumaxomab)、CC49、西利珠单抗(Cedelizumab)、培戈-瑟托利珠单抗(Certolizumab pegol)、塞妥昔单抗(Cetuximab)、Ch.14.18、柏托-西他妥珠单抗(Citatuzumab bogatox)、西舒妥木单抗(Cixutumumab)、克拉吉珠单抗(Clazakizumab)、克立昔单抗(Clenoliximab)、泰坦-克利妥珠单抗(Clivatuzumab tetraxetan)、考那妥木单抗(Conatumumab)、康赛珠单抗(Concizumab)、克瑞奈珠单抗(Crenezumab)、CR6261、达塞妥珠单抗(Dacetuzumab)、达克利珠单抗(Daclizumab)、达洛妥珠单抗(Dalotuzumab)、达雷妥木单抗(Daratumumab)、登赛珠单抗(Demcizumab)、迪诺舒单抗(Denosumab)、地莫单抗(Detumomab)、阿托度单抗(Dorlimomabaritox)、卓齐妥单抗(Drozitumab)、杜利他单抗(Duligotumab)、度匹鲁单抗(Dupilumab)、度司妥单抗(Dusigitumab)、依洛美昔单抗(Ecromeximab)、依库利珠单抗(Eculizumab)、埃巴单抗(Edobacomab)、依曲考罗单抗(Edrecolomab)、依法利珠单抗(Efalizumab)、依芬谷单抗(Efungumab)、依洛妥珠单抗(Elotuzumab)、艾西莫单抗(Elsilimomab)、依那妥珠单抗(Enavatuzumab)、培化恩莫单抗(Enlimomab pegol)、依诺吉珠单抗(Enokizumab)、依诺苏单抗(Enoticumab)、恩司妥昔单抗(Ensituximab)、西坦-依匹妥莫单抗(Epitumomabcituxetan)、依普妥珠单抗(Epratuzumab)、厄利珠单抗(Erlizumab)、厄妥玛索单抗(Ertumaxomab)、依他赛珠单抗(Etaracizumab)、依卓利珠单抗(Etrolizumab)、依沃苏单抗(Evolocumab)、埃比韦卢单抗(Exbivirumab)、法索单抗(Fanolesomab)、法拉莫单抗(Faralimomab)、法乐妥珠单抗(Farletuzumab)、法司努单抗(Fasinumab)、FBTA05、泛维珠单抗(Felvizumab)、菲扎吉努单抗(Fezakinumab)、菲拉妥珠单抗(Ficlatuzumab)、菲吉妥木单抗(Figitumumab)、夫兰妥单抗(Flanvotumab)、芳托利珠单抗(Fontolizumab)、弗雷鲁单抗(Foralumab)、弗雷韦卢单抗(Foravirumab)、夫瑞利木单抗(Fresolimumab)、伏雷努单抗(Fulranumab)、伏妥昔单抗(Futuximab)、加利昔单抗(Galiximab)、加尼妥单抗(Ganitumab)、冈特奈卢单抗(Gantenerumab)、加威利莫单抗(Gavilimomab)、吉妥珠单抗-奥佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)、格沃吉珠单抗(Gevokizumab)、吉仑妥昔单抗(Girentuximab)、格列姆巴妥木单抗-维多汀(Glembatumumab vedotin)、戈利木单抗(Golimumab)、戈利昔单抗(Gomiliximab)、GS6624、艾巴利珠单抗(Ibalizumab)、替坦-艾瑞妥莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、艾卢苏单抗(Icrucumab)、伊戈伏单抗(Igovomab)、英赛罗单抗(Imciromab)、英加妥珠单抗(Imgatuzumab)、英拉苏单抗(Inclacumab)、英达妥昔单抗-拉夫坦辛(Indatuximab ravtansine)、英利昔单抗(Infliximab)、英特妥木单抗(Intetumumab)、艾诺利莫单抗(Inolimomab)、伊诺妥珠单抗-奥佐米星(Inotuzumabozogamicin)、艾匹利木单抗(Ipilimumab)、艾雷妥木单抗(Iratumumab)、艾托利珠单抗(Itolizumab)、艾塞吉珠单抗(Ixekizumab)、凯利昔单抗(Keliximab)、拉贝妥珠单抗(Labetuzumab)、兰帕利珠单抗(Lampalizumab)、乐瑞吉珠单抗(Lebrikizumab)、乐玛来索单抗(Lemalesomab)、乐迪利木单抗(Lerdelimumab)、乐萨妥木单抗(Lexatumumab)、利比韦卢单抗(Libivirumab)、利格利珠单抗(Ligelizumab)、林妥珠单抗(Lintuzumab)、利瑞鲁单抗(Lirilumab)、洛迪赛珠单抗(Lodelcizumab)、罗伏妥珠单抗-默坦辛(Lorvotuzumabmertansine)、鲁卡妥木单抗(Lucatumumab)、鲁昔单抗(Lumiliximab)、玛帕妥木单抗(Mapatumumab)、马司莫单抗(Maslimomab)、玛弗利木单抗(Mavrilimumab)、马妥珠单抗(Matuzumab)、美珀利珠单抗(Mepolizumab)、美特利木单抗(Metelimumab)、米拉妥珠单抗(Milatuzumab)、明瑞妥莫单抗(Minretumomab)、米妥莫单抗(Mitumomab)、莫格利组单抗(Mogamulizumab)、莫罗木单抗(Morolimumab)、莫他韦珠单抗(Motavizumab)、帕舒托-莫塞妥莫单抗(Moxetumomab pasudotox)、莫罗单抗-CD3(Muromonab-CD3)、他托-那考罗单抗(Nacolomab tafenatox)、那米鲁单抗(Namilumab)、埃托-那普妥莫单抗(Naptumomabestafenatox)、纳那妥单抗(Narnatumab)、那他珠单抗(Natalizumab)、奈巴库单抗(Nebacumab)、奈西妥木单抗(Necitumumab)、奈瑞利莫单抗(Nerelimomab)、奈伐苏单抗(Nesvacumab)、尼莫妥珠单抗(Nimotuzumab)、尼沃鲁单抗(Nivolumab)、诺莫单抗-默喷坦(Nofetumomab merpentan)、奥比妥珠单抗(Obinutuzumab)、奥卡妥珠单抗(Ocaratuzumab)、奥瑞利珠单抗(Ocrelizumab)、奥度莫单抗(Odulimomab)、奥法妥木单抗(Ofatumumab)、奥拉妥单抗(Olaratumab)、奥洛吉珠单抗(Olokizumab)、奥玛利珠单抗(Omalizumab)、奥那妥珠单抗(Onartuzumab)、蒙托-奥珀妥珠单抗(Oportuzumabmonatox)、奥瑞戈沃单抗(Oregovomab)、奥替苏单抗(Orticumab)、奥特昔珠单抗(Otelixizumab)、奥塞鲁单抗(Oxelumab)、奥扎奈珠单抗(Ozanezumab)、奥佐利珠单抗(Ozoralizumab)、帕昔单抗(Pagibaximab)、帕利韦珠单抗(Palivizumab)、帕尼妥木单抗(Panitumumab)、帕诺巴库单抗(Panobacumab)、帕萨妥珠单抗(Parsatuzumab)、帕考利珠单抗(Pascolizumab)、帕特利珠单抗(Pateclizumab)、帕曲妥单抗(Patritumab)、培妥莫单抗(Pemtumomab)、珀雷吉珠单抗(Perakizumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、培塞利珠单抗(Pexelizumab)、匹地利珠单抗(Pidilizumab)、皮那妥珠单抗-维多汀(Pinatuzumabvedotin)、平妥莫单抗(Pintumomab)、普拉鲁单抗(Placulumab)、泊拉妥珠单抗-维多汀(Polatuzumab vedotin)、珀奈珠单抗(Ponezumab)、普立昔单抗(Priliximab)、瑞托萨昔单抗(Pritoxaximab)、普瑞妥木单抗(Pritumumab)、PRO 140、奎利珠单抗(Quilizumab)、雷考妥莫单抗(Racotumomab)、雷曲妥单抗(Radretumab)、雷非韦卢单抗(Rafivirumab)、雷姆赛卢单抗(Ramucirumab)、雷尼比珠单抗(Ranibizumab)、雷昔巴库单抗(Raxibacumab)、瑞加韦单抗(Regavirumab)、瑞司利珠单抗(Reslizumab)、瑞洛妥木单抗(Rilotumumab)、瑞妥昔单抗(Rituximab)、洛巴妥木单抗(Robatumumab)、洛来度单抗(Roledumab)、洛莫索珠单抗(Romosozumab)、隆他利珠单抗(Rontalizumab)、洛维利珠单抗(Rovelizumab)、卢普利珠单抗(Ruplizumab)、萨玛利珠单抗(Samalizumab)、萨瑞鲁单抗(Sarilumab)、沙妥莫单抗-喷地肽(Satumomab pendetide)、瑟库吉努单抗(Secukinumab)、瑟瑞妥单抗(Seribantumab)、瑟托萨昔单抗(Setoxaximab)、司韦单抗(Sevirumab)、西罗珠单抗(Sibrotuzumab)、司法利木单抗(Sifalimumab)、司妥昔单抗(Siltuximab)、辛妥珠单抗(Simtuzumab)、西普利珠单抗(Siplizumab)、司卢库单抗(Sirukumab)、索拉奈珠单抗(Solanezumab)、索利托单抗(Solitomab)、索耐珠单抗(Sonepcizumab)、松妥组单抗(Sontuzumab)、司达鲁单抗(Stamulumab)、苏来索单抗(Sulesomab)、苏韦珠单抗(Suvizumab)、他巴鲁单抗(Tabalumab)、泰坦-他卡妥珠单抗(Tacatuzumab tetraxetan)、他多赛珠单抗(Tadocizumab)、那他利珠单抗(Talizumab)、他奈珠单抗(Tanezumab)、帕他莫单抗(Taplitumomab paptox)、特非巴珠单抗(Tefibazumab)、阿替莫单抗(Telimomab aritox)、替妥莫单抗(Tenatumomab)、特奈利昔单抗(Teneliximab)、特普利珠单抗(Teplizumab)、特普妥木单抗(Teprotumumab)、TGN1412、曲美木单抗(Ticilimumab)(=曲美利木单抗(tremelimumab))、替曲吉珠单抗(Tildrakizumab)、替加妥珠单抗(Tigatuzumab)、TNX-650、托西利珠单抗(Tocilizumab)(=托西利珠单抗(atlizumab))、托雷利珠单抗(Toralizumab)、托司妥莫单抗(Tositumomab)、曲洛吉努单抗(Tralokinumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、TRBS07、曲加利珠单抗(Tregalizumab)、曲美利木单抗(Tremelimumab)、塞莫白介素-妥考妥珠单抗(Tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗(Tuvirumab)、乌利妥昔单抗(Ublituximab)、乌瑞鲁单抗(Urelumab)、厄托萨珠单抗(Urtoxazumab)、优特吉努单抗(Ustekinumab)、伐帕利昔单抗(Vapaliximab)、伐特利珠单抗(Vatelizumab)、维多利珠单抗(Vedolizumab)、维妥珠单抗(Veltuzumab)、维帕利莫单抗(Vepalimomab)、维森苏单抗(Vesencumab)、威司利珠单抗(Visilizumab)、沃洛赛昔单抗(Volociximab)、伏司妥珠单抗-马佛多汀(Vorsetuzumab mafodotin)、伏妥莫单抗(Votumumab)、扎鲁妥木单抗(Zalutumumab)、扎诺利木单抗(Zanolimumab)、扎妥昔单抗(Zatuximab)、齐拉木单抗(Ziralimumab)或阿托-佐利莫单抗(Zolimomab aritox)。
优选抗体包括那他利珠单抗(Natalizumab)、维多利珠单抗(Vedolizumab)、贝利木单抗(Belimumab)、阿塞西普(Atacicept)、阿来西普(Alefacept)、奥特昔珠单抗(Otelixizumab)、特普利珠单抗(Teplizumab)、瑞妥昔单抗(Rituximab)、奥法妥木单抗(Ofatumumab)、奥瑞利珠单抗(Ocrelizumab)、依普妥珠单抗(Epratuzumab)、阿仑妥珠单抗(Alemtuzumab)、阿他西普(Abatacept)、依库利珠单抗(Eculizumab)、奥玛利珠单抗(Omalizumab)、卡那奴单抗(Canakinumab)、美泊珠单抗(Meplizumab)、瑞司利珠单抗(Reslizumab)、托西利珠单抗(Tocilizumab)、优特吉努单抗(Ustekinumab)、布瑞吉努单抗(Briakinumab)、依那西普(Etanercept)、英夫利西单抗(Inlfliximab)、阿达木单抗(Adalimumab)、培戈-瑟托利珠单抗(Certolizumab pegol)、戈利木单抗(Golimumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、津妥珠单抗(Gemtuzumab)、奥加米星(Ozogamicin)、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、托西单抗(Tostitumomab)、塞妥昔单抗(Cetuximab)、贝伐赛珠单抗(Bevacizumab)、帕尼妥木单抗(Panitumumab)、迪诺舒单抗(Denosumab)、艾匹利木单抗(Ipilimumab)、贝伦妥单抗-维多汀(Brentuximab vedotin)。
可在本发明方法中使用的抗体特别优选包括:达雷妥木单抗(Daratumumab)、尼沃鲁单抗(Nivolumab)、兰洛利珠单抗(Pembrolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、瑞妥昔单抗(Rituximab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、珀妥珠单抗(Pertuzumab)、阿仑妥珠单抗(Alemtuzumab)、塞妥昔单抗(Cetuximab)、帕尼妥木单抗(Panitumumab)、托司妥莫单抗(Tositumomab)和奥法妥木单抗(Ofatumumab)。特别优选达雷妥木单抗(Daratumumab)。抗PD1抗体,例如尼沃鲁单抗(Nivolumab)和兰洛利珠单抗(Pembrolizumab),是特别优选的。
额外癌症治疗可从以下组成的组中选择:辅酶B12(Actimide)、阿扎胞苷(Azacitidine)、硫唑嘌呤(Azathioprine)、博来霉素(Bleomycin)、卡铂(Carboplatin)、卡培他滨(Capecitabine)、顺铂(Cisplatin)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、柔红霉素(Dauno-rubicin)、多西他赛(Docetaxel)、去氧氟脲苷(Doxifluridine)、阿霉素(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、依托泊苷(Etoposide)、氟达拉滨(Fludarabine)、氟尿嘧啶(Fluor-ouracil)、吉西他滨(Gemcitabine)、硫酸羟脲(Hydroxyurea)、伊达比星(Idarubicin)、伊立替康(Irinotecan)、来那度胺(Lenalidomide)、甲酰四氢叶酸(Leucovorin)、氮芥(Mechlorethamine)、美法仑(Melphalan)、巯嘌呤(Mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、培美曲塞(Pemetrexed)、瑞复美(Revlimid)、替莫唑胺(Temozolomide)、替尼泊苷(Teniposide)、硫鸟嘌呤(Thioguanine)、戊柔比星(Valrubicin)、长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春地辛(Vindesine)和长春瑞滨(Vinorelbine)。
本发明的多肽或组合物也可用于刺激精氨酸酶1特异性T细胞(例如CD4和CD8 T细胞)的方法中,包括使细胞与所述多肽或组合物接触。该方法可在体外进行。这些细胞可以存在于取自健康受试者或癌症患者的样本中,例如肿瘤样本中。
通过以下示例进一步说明本发明,然而,这些示例不应被解释为限制保护范围。在上述描述和以下示例中公开的特征可以单独地或以其任意组合的形式是用于以其各种形式实现本发明的材料。
实施例1
材料和方法
患者材料
在LymphoprepTM(STEMCELLTechnologies)上采用密度梯度分离法分离来自健康捐献者的PBMC,并在-150℃冷冻保存在补充有10%的DMSO的FBS中。在任何抗癌治疗终止后至少四周,从血液样本中分离出来自癌症患者的PBMC。所有方案经丹麦首都地区科学伦理委员会批准,并按照《赫尔辛基宣言》(Declaration of Helsinki)的规定进行。在进入研究前获得患者的书面知情同意。
通过标准方法合成肽,并将其溶解于DMSO中以获得10mM的物料浓度。用于这些实验的肽的序列显示在标题为“序列”的部分。通过SEQ ID NO、通过名称或通过称呼精氨酸酶2的全长序列内各肽序列的起始和终止位置来描述肽。每种描述可互换使用。例如,SEQ IDNO:2的肽可以通过名称Arg2_1来称呼,或者可称为Arg2 aa11-30(给出起始位置11和终止位置30)。基于上下文,每种情况下的预期的称呼将是清楚的。
酶联免疫斑点(ELISPOT)测定
对于体外ELISPOT,来自癌症患者和健康捐赠者的PBMC在被用于体外ELISPOT测定之前,在24孔板中用20μM精氨酸酶1衍生肽(或不用肽作为对照)和120U/ml IL-2脉冲7天。将细胞放置在预涂布有IFNγ捕获抗体(Mabtech)的96孔硝酸纤维素ELISPOT板(MultiScreen MAIP N45;Millopore)中。添加精氨酸酶肽至最终浓度为5μM,并且在37℃孵育板14-16小时。孵育后,洗去细胞,在室温下添加第二生物素化单抗(Ab)(Mabtech,目录号3420-6-1000)2小时。洗去未结合的第二抗体并在室温下添加链霉亲和素缀合的碱性磷酸酶(AP)(Mabtech,目录号3310-10)1小时。洗去未结合的缀合酶,并通过添加BCIP/NBT底物(Mabtech,目录号3650-10)使测定显色。使用Immunospot软件v5.1在CTL-Immunospot S6Ultimate-V分析仪上分析经显色的ELISPOT板。将应答报告为用精氨酸酶2肽刺激的孔中的斑点的平均数和没有添加肽的孔中的斑点的平均数之间的差异。
细胞内染色
在BD GolgiPlugTM II(在肽刺激的第一小时后添加)存在下,在PBMC被精氨酸酶衍生肽(或没有肽孵育作为对照)刺激5小时后,对细胞培养物进行细胞内染色。根据制造商的说明,受刺激的细胞采用用于表面标记的荧光标签抗体(CD3、CD4、CD8)进行染色,然后使用固定/透化和透化缓冲液(eBioscience,目录号00-5123-43)进行透化。然后透化的细胞被针对IFNγ和TNFα的荧光标签抗体染色。在FACSSantoTM II(BD Biosciences)上进行流式细胞分析。根据制造商的说明,使用的抗体:IFNγ-APC(目录号341117)、TNFα-455BV421(目录号562783)、CD4-FITC(目录号347413)、CD8-PerCP(目录号345774)、CD3-APC-H7(目录号560275)(全部来自BD Biosciences),死细胞染色-FVS510(564406,BD Biosciences)。
结果
基于精氨酸酶1热点用于精氨酸酶2肽的筛选
基于先前确定的精氨酸酶1的位置161-210处的50个氨基酸长的精氨酸酶1热点区域,选择覆盖精氨酸酶2中相应区域(位置180-229)的四个肽用于测试。这些肽是Arg2-E17(aal80-199)、Arg2-E18(aal 90-209)、Arg2-E19(aa200-219)和Arg2-E20(210-229)-关于精氨酸酶1和精氨酸酶2的示意图,参见图1。Arg2-E17不能用常规方法合成,因此采用剩下的三个肽进行本实验。
为了测试这些肽是否可以用于识别精氨酸酶2应答,筛选来自12名健康捐赠者和1名癌症患者的PBMC用于IFNγELISPOT中的应答。在ELISPOT前,PBMC用精氨酸酶2肽和低剂量IL-2刺激1周。
如图2所示,肽由来自至少一名受试者的PBMC全部识别。Arg2-E18表现出最高和最一致的应答。
用于其他精氨酸酶2肽的肽库筛选
整个精氨酸酶2蛋白序列被分成重叠的20个氨基酸长的肽(最后一个肽是24个氨基酸),产生了一个覆盖整个序列(SEQ ID NO:1-34)的34个肽的库。库中的每一个肽与随后的肽的前10个氨基酸重叠。使用该精氨酸酶2肽库和IFNγELISPOT测定,我们接下来从6个健康捐赠者中筛选PBMC用于自发应答。用3-4个相邻的20聚(20-mer)精氨酸酶2库肽和低剂量IL-2(120U/mL)联合刺激PBMC一周。然后将PBMC设置用于IFNγ-ELISPOT测定,以筛选用于分别针对每个20聚肽的应答。
如图3所示,以下八个肽显示出最高和最丰富的应答:
ARG2_1(aal 1-30)、ARG2_5(aa51-70)、ARG2_8(aa81-100)、ARG2_13(aal31-150)、ARG2_18(181-200)、ARG2_20(201-220)、ARG2_21(aa211-230)和ARG2_22(221-240)。
Arg2_18、Arg2_20、Arg2_21和Arg2_22都包含在先前确定的热点区域内或与之重叠。然而,其他肽(包括具有最高应答的肽,Arg2_1)来自精氨酸酶2蛋白的不同区域。
库筛选(热点区域)的验证
在IFNγELISPOT测定之前,用单一肽和低剂量IL-2(120U/mL)刺激来自两个健康捐赠者的PBMC一周,以验证在库筛选中观察到的应答。
ARG2_18、ARG2_19、ARG2_20和ARG2_21均在本验证实验中进行了测试,其中ARG2-E18、ARG2-E19和ARG2-E20也包括在内,由于它们与精氨酸酶2的相同区域重叠。Arg2-E17再次被排除在外,因为它不能用常规方法合成。
六种被测试的肽对齐示出如下:
Figure BDA0003067385530000181
如图4所示,观察到对每个被测试的肽的响应,验证了原始筛选。肽的重叠对产生了几乎完全相同的应答,除了ARG2_21和ARG2-E20,在一个健康捐赠者中观察到对ARG2_21的更强应答。用ARG2_18在该实验中获得了最强烈、最一致的应答。
库筛选(其他区域)的验证
在IFNγELISPOTT测定前,用单一肽和低剂量IL-2(120U/mL)刺激来自4个健康捐赠者的PBMC一周,以验证在库筛选中观察到的应答。在本验证中,对ARG2_1、ARG2_5、ARG2_13、ARG2_18和ARG2_22进行了测试。如图5所示,观察到了强烈和显著的应答,特别是对Arg2_l。
因此,在同一细胞上使用细胞内细胞因子染色法,以阐明是否存在CD4+或CD8+应答。对于两个健康捐赠者,观察到Buf-M-01和Buf-M-02、0.2%和0.1%双阳性(DP)CD4+细胞(参见图6A和6B中的代表图),表明在这些捐赠者中的对ARG2_1的CD4+应答。
进一步筛选癌症患者和健康捐赠者对ARG2_1的应答
采用ARG2-1以在8例黑色素瘤(AA07-AA31)、4例前列腺癌(UR07-27)和13例健康捐赠者中对应答进行筛选。在IFNγELISPOT测定前,用单一肽和低剂量IL-2(120U/mL)对来自各自的PBMC刺激一周。
如图8所示,在25名被测试的捐赠者中,有15名(60%)出现了显著应答,而在患者和健康捐赠者中,应答似乎几乎同样强烈。
在IFNγELIPOT中显示清楚应答的PBMC也用于胞内细胞因子染色。我们分析了来自两个健康捐赠者的CD4细胞,并表明在这两个捐赠者中,CD4细胞对ARG2_1有特异性反应。此外,我们发现,在前列腺癌患者(UR12)的PBMC中,也有对ARG2_1(0.9%CD8+DP细胞与0.5%用于对照)的CD8+应答,参见图9。综合来看,这些ICS结果表明,检测到的ARG2_1应答是T细胞介导的,而且可能由CD4和CD8T细胞共同介导。
因此,用于ARG2_1内的HLA-A2和HLA-A3表位的预测使用www.syfpeithi.de服务器进行。以下表位被预测为存在于ARG2_1序列内:
Figure BDA0003067385530000182
所有3个预测的表位都在SEQ ID NO:51的位置21、22和23处包含转运肽边界。
在没有预刺激的情况下也观察到对ARG2_1的应答(“体外ELISPOT”)
在先前的实验中表现出强烈的应答的一名癌症患者和三名健康捐赠者(这是体外或“间接”IFNγELISPOT)也在体外ELISPOT中进行了测试。这意味着PBMC不是预先刺激的,而是在IFNγELISPOT测定之前简单地孵育+/-Arg_2肽72小时。如图10所示,检测到对ARG2_1的应答。特别值得注意的是,特异性T细胞应答在体外可直接检测到的事实。除了极少数例外,通常不可能通过四聚体染色或通过ELISPOT直接在体外检测PBMC中的肿瘤相关抗原特异性T细胞,而无需事先进行体外肽刺激。这是非常不寻常的,在没有预先体外刺激的情况下,能够检测对非病毒性抗原的免疫应答。因此,这些结果强调了ARG2_1序列及其内包括的表位的高免疫原性。因此,这些序列是很好的免疫接种靶,因为数据表明免疫系统可以选择性地靶向精氨酸酶2表达细胞,降低了精氨酸酶表达的免疫调节作用,从而增强抗肿瘤免疫应答。此外,这些数据表明精氨酸酶2特异性T细胞(特别是识别ARG2_1内表位的那些)在免疫系统中起着天然的作用。这意味着针对这些序列的免疫接种很可能不会对患者产生毒性。
讨论
癌症中精氨酸酶2表达细胞的存在有助于防止肿瘤特异性效应淋巴细胞增殖的免疫抑制肿瘤微环境。因此,特异性靶向这种精氨酸酶2表达细胞(其可能包括肿瘤细胞以及其他调节细胞)通过降低免疫抑制效应,允许癌症特异性效应细胞的激活和增殖,而具有直接益处和间接益处。考虑到抗癌免疫治疗常常被免疫抑制细胞所拮抗,靶向精氨酸酶2表位的这种双重效应可以是高度协同的。鉴于这些实验已表明存在针对精氨酸酶2的天然CD4和CD8 T细胞介导的免疫(特别是针对Arg2_1序列内的表位),在免疫接种环境中成功靶向精氨酸酶2的可能性高。
实施例2-进一步研究人ARG2肽
材料和方法
患者材料
在LymphoprepTM(Alere)上采用密度梯度分离法分离来自健康捐赠者的PBMC,并在-150℃冷冻保存于补充有10%DMSO的FBS(Life Technologies)中。在任何抗癌治疗终止后至少四周,从血液样本中分离出来自癌症患者的PBMC。来自AML患者的PBMC是从不同疾病和治疗状态的患者的血液样本中分离出来,因此包括接受治疗的患者。所有方案均经丹麦首都地区科学伦理委员会批准,并按照《赫尔辛基宣言》(Declaration of Helsinki)的规定进行。在进入研究前获得患者的书面知情同意。PMBC维持在补充有5%人血清(Sigma-Aldrich)的X-vivo(Bio Nordika)中。
细胞培养
THP-1培养在补充有10%FBS的RPMI(Gibco)中。Set2细胞培养在含有20%FBS的RPMI中。OCI-AML-2细胞培养在含有10%FBS的Alpha-MEM(Life Technologies)中。MONO-MAC-1细胞培养在补充有10%FBS、l mM丙酮酸钠(Life Technologies)、2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)和lx非必需氨基酸(Life Technologies)的RPMI中。所有细胞系均被检测并确定支原体阴性。细胞每周传代2~3次。
通过以下进行利用IL-4(400U/ml)、IL-13(50ng/ml)、IFNγ(l00 U/ml)或细胞因子混合物(400U/ml IL-4、l00 U/ml GM-CSF和l000 U/ml TNFα)的细胞因子刺激:接种补充有相应细胞因子的0.5-0.75×l06细胞/ml培养基,孵育48小时,然后收获细胞用于各种实验。所有的细胞因子都来自Trichem。
通过PepScan合成了34个20聚肽的ARG2肽库,并将其以l0 mM溶解于DMSO中,用于免疫应答的筛选。在剩下的实验中,ARG2-1以2mM溶解于无菌水中。通过
Figure BDA0003067385530000201
合成长ARG2肽(A2L1、A2L2、A2L3(SEQ-ID-NO:58、59、57)),并以2mM溶解于无菌水中。溶解在无菌水中的肽在使用前通过0.22μm的过滤器过滤。合成肽的纯度>90%。所有肽的列表参见表1。
肽刺激和ELISPOT测定
用10μM的ARG2衍生肽体外刺激来自健康捐赠者或癌症患者的PBMC,以提高测定灵敏度。在第2天,将IL-2添加到总共为120U/ml的IL-2(Novartis)中。7天后,将4-6×l05PBMC置于预先涂布有IFNγ捕获抗体(Mabtech)的ELISPOT板的底部。来自每个捐赠者或患者的PBMC对肽(5μM ARG2衍生肽)和对照刺激平行进行三次或四次。细胞在抗原存在下在ELISPOT板中孵育14-16小时,然后将其洗掉并添加第二生物素化抗体(Mabtech)。孵育2小时后,在添加链霉亲和素缀合的碱性磷酸酶(Mabtech)之前,洗去第二抗体1小时。接下来,洗掉未结合的酶,通过添加BCIP/NBT底物(Mabtech)使测定显色。使用ImmunoSpot软件v5.1在CTL-Immunospot S6 Ultimate-V分析仪上分析经显色的ELISPOT板。将应答报告为用ARG2衍生肽刺激的孔中的斑点的平均数和对照孔中的斑点的平均数之间的差异。
通过将1-5×104效应细胞(如所示)和1-2.5×104靶细胞(如所示)放置在ELISPOT孔的底部来建立ELISPOT测定,其中ARG2特异性T细胞(效应细胞)和各种免疫或癌细胞作为靶细胞(靶细胞)。靶细胞的肽脉冲通过将细胞与20μM肽孵育1小时,然后两次洗涤以去除未结合的肽来进行。这些细胞作为阳性对照。没有靶细胞的效应细胞作为阴性对照。所有条件均平行进行三次或四次。
细胞内细胞因子染色测定
体外ARG2衍生肽刺激1周后,在PBMC上进行细胞培养物的细胞内染色。为了测定,在BD GolgiPlugTM(在肽刺激的第一个小时后添加)存在下,用ARG2衍生肽(或没有肽孵育作为对照)重新刺激9×l05个PBMC 5小时。根据制造商的说明,受刺激的细胞采用用于表面标记的荧光标签抗体(CD3、CD4、CD8)染色,然后用固定/透化和透化缓冲液(eBioscience,目录号00-5123-43)进行透化。然后透化的细胞被针对IFNγ和TNFα的荧光标签抗体染色。在FACSCantoTMII(BD Biosciences)上进行流式细胞术分析。根据制造商的说明,使用的抗体:IFNγ-APC、TNFα-BV421、CD4-PerCP、CD8-FITC、CD3-APC-H7、CD4-FITC、CD8-PerCP和死细胞染色-FVS510(均来自BD Biosciences)。对于细胞内细胞因子染色法以检测响应于靶细胞的ARG2特异性T细胞的细胞因子的产生,将5×105个ARG2特异性细胞与2.5×105靶细胞孵育5小时,其中在第一个小时后添加GolgiPlugTM
ARG2特异性T细胞培养物的建立
通过用经辐照的ARG2-1负载自体成熟树突细胞(dendritic cells,DC)来初始刺激前列腺癌患者的PMBC,以建立ARG2特异性T细胞培养物。第二天添加IL-12(20U/ml)和IL-7(40U/ml)。每8天用ARG2-1肽负载自体DC,接下来的一天再添加IL-2(120U/ml)来再次刺激PBMC。4次刺激后,使用IFNγ细胞富集试剂盒(MiltenyiBiotec)来富集ARG2特异性T细胞。细胞扩增,并且使用CD4+富集试剂盒(MiltenyiBiotec)进一步富集ARG2特异性T细胞。
体外转录的mRNA的产生
合成编码ARG2(NM_001172.4)的cDNA,并使用BamHI限制位点将该cDNA克隆到HLA-Ⅱ类靶向质粒pGEM-sig-DC.LAMP(由Brussel Vrije大学医学院K.Thielemans博士友善提供)中。该pGEM-ARG2-DC-LAMP质粒用Spel线性化,然后作为DNA模板用于体外转录(参考
Figure BDA0003067385530000212
文章**)。
总RNA提取
收获细胞,在PBS中洗涤并通过离心法制备小球。将细胞小球放在冰上或在-80℃下冷冻,直到提取RNA。根据制造商的说明,使用RNAeasy Plus迷你试剂盒(Qiagen)提取总RNA,在30μl的无RNA水中进行最后洗脱。在NanoDrop 2000分光光度计(ThermoScientific)上测量RNA浓度。RNA储存在-80℃下。
RT-qPCR
使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)反转录总RNA。对于每一个反应,l000 ng RNA被反转录。对于RT-qPCR,将cDNA稀释1:5,并在Roche Lightcycler 480仪器上使用TaqMan基因表达测定对cDNA进行RT-qPCR分析。RT-qPCR平行运行四次,采用ddCT法对数据进行分析,并对管家基因RPLPO和对照样本的表达水平进行归一化。对于未扩增的低浓度样本,Ct设置为40。没有逆转录酶对照(没有逆转录酶的cDNA反应设置)作为特异性扩增的对照。在这项研究中使用的引物列表如下:
Figure BDA0003067385530000211
电穿孔
对于mRNA,使用之前描述的电穿孔参数,将DC或癌细胞用ARG1-DC-LAMP mRNA、ARG2-DC-LAMP mRNA或编码eGFP的对照mRNA转染。简而言之,将细胞于Opti-MEM介质(Thermo Science)中清洗两次,并调节最终细胞密度为9-12×106细胞/ml。350μl细胞悬浮物,在进行10μg mRNA添加之前,在冰上预孵育5分钟。然后,将细胞悬浮物快速转移至2mm(癌细胞)或4mm(DC)空隙电穿孔杯中并进行电穿孔(参考:OM文章)。电穿孔后,将细胞迅速转移到具有预加热介质的盘上,在含5%CO2的湿润气氛中孵育,再用于不同的实验分析。将mRNA转染细胞静置1小时,然后在ELISPOT测定中对其进行设置,或者将其静置过夜,然后在细胞内细胞因子染色测定中进行设置。转染24小时后,通过GFP转染细胞的FACS分析来确定电穿孔率。
siRNA介导的ARG2沉默(silencing)
从Ambion(ARG2沉默子(Silencer)选择经验证的siRNA、ID sl571、sl572、sl573)中获得一组靶向ARG2的三个siRNA双链体。将siRNA悬浮在无核水中成为0.1nmol储备溶液,在-80℃温度下存储。对于ARG2沉默实验,按照上述制备了用于电穿孔的THP-1细胞,并且在如上所述转染前在三个siRNA中各自均加入0.02nmol siRNA溶液的10μl工作溶液。转染后,立即将细胞转移到预热介质中,并孵育1小时。然后将转染细胞分成两份,并在一半的细胞中添加细胞因子混合物(400U/ml IL-4、l,000U/ml GM-CSF和l,000U/ml TNFα)。在细胞内细胞因子染色测定建立该细胞前,将细胞在介质中或含有细胞因子的介质中孵育48h。48小时后,细胞进行RNA造粒,以通过RT-qPCR获得敲除效率。
HLA-DR表达的流式细胞分析
对被模拟(没有细胞因子)、IFNγ(l00 U/ml)或细胞因子混合物(400U/ml IL-4、l,000U/ml GM-CSF和l,000U/ml TNFα)刺激48小时的细胞进行HLA-DR表达分析。简而言之,洗涤细胞,并用7-AAD(目录号51-68981E,BD Bioscience)和FITC-偶联鼠抗人HLA-DR、DP、DQ(目录号55555 81,BD Bioscience)或FITC-偶联鼠IgGl K同种型Ctrl(FC)(目录号400109,BD Bioscience)在4℃下染色30分钟。在FACSCantoTM仪器上分析细胞之前,洗去多余的抗体。HLA-DR表达水平表示为MHCⅡ类染色活细胞与同型对照染色活细胞之间的MFI的差异。
统计分析
使用无分布重采样(DFR)方法分析ELISPOT应答。使用R-studio执行ELISPOT应答的统计分析。对ARG2-1和A2L2的应答(特异性IFNγ分泌细胞)的差异与使用Wilcoxon配对有符号秩检验(使用Prism 8)进行比较,显著性水平为0.05。通过使用Prism 8的混合效应分析来进行对照组和Arg2接种组之间的平均肿瘤生长差异的统计分析。
结果
对ARG2的自发免疫应答
如实施例1所述,ARG2-1被发现在筛选出的捐赠者中给出最高和最频繁的应答。有趣的是,ARG2-1是ARG2的转运序列(aal-22)的一部分。信号肽序列代表了一种有趣的肽表位类型,在HLA分子背景下,它们在很大程度上不依赖于蛋白质体降解或TAP用于它们的加工和呈递。此外,ARG2的这一部分与ARG1的相应序列几乎没有序列重叠-参见如下比对:ARGl MSAKS RTIGIIGAPFSKGQPRGGVEEGPTVLRKAGLLE(SEQ ID 63)ARG2 MSLRGSLSRLLQTRVH SILKKSVHSVAVIGAPFSQGQKRKGVEHGPAAIREAGLMK(SEQ ID 64)
因此,通过IFNγELISPOT分析,ARG2-1被用于在33例健康捐献者(HD)和19例实体瘤癌症患者(11例黑色素瘤、7例前列腺癌和1例乳腺癌患者)中针对ARG2免疫应答的筛选。在健康捐赠者和实体瘤癌症患者中均发现了强烈且频繁的应答,约75%的筛选的捐赠者有显著应答(参见图14A-该图中的一些数据点也显示在图8中)。
由于ARG2被报道在观察的急性髓系白血病(AML)患者的免疫抑制微环境中起重要作用,通过IFNγELISPOT还研究了被诊断患有AML的患者的PBMC中的ARG2特异性T细胞的潜在存在。为此,我们收集了9名被诊断患有AML的患者的外周血。采血和随后的PBMC分离是独立于治疗状态进行的,因此所包括的患者代表了截然不同的疾病和治疗阶段。被测试的9名患者中有3名患者观察到显著应答(参见图14A),表明AML患者中确实可以存在ARG2特异性T细胞。在健康捐赠者和实体瘤癌症患者中用于IFNγ和TFNa产生的细胞内细胞因子染色主要显示了针对ARG2-1的CD4+应答(图14B)。
长ARG2肽表位的表征
先前已经证明,与20聚和30聚ARG1肽相比,较长(38聚)的ARG1肽在刺激ARGl特异性T细胞方面更具优势。为了确定一个最佳的混杂的ARG2衍生表位以刺激独立于组织类型的个体中的ARG2特异性T细胞,因此也基于HLA预测算法(可在www.syfpeithi.de andcbs.dtu.dk获取)设计了较长ARG2肽表位,该表位跨越了ARG2-1周围较大序列部分。这些序列如下所示,与人精氨酸酶2的预测信号序列以及ARG2-0、ARG2-1和ARG2-2的20聚序列对齐。
SEQ ID NO 序列 名称 长度
62 MSLRGSLSRLLQTRVHSILKKS--------------------------- 信号序列 22
1 MSLRGSLSRLLQTRVHSILK----------------------------- ARG2-0 20
2 --------------------LQTRVHSILKKSVHSVAVIG---------- ARG2-1 20
3 ---------------------------------------KSVHSVAVIGAPFSQGQKRK ARG2-2 20
较长ARG2序列
57 -----------SLSRLLQTRVHSILKKSVHSVAVIGAPFS------ A2L3 29
58 ---SLRGSLSRLLQTRVHSILKKSVHSVAVIGA--------- A2L1 30
59 ---SLRGSLSRLLQTRVHSILKKSVHSVAVIGAPFS------ A2L2 33
为了验证这些长ARG2肽是否能用于识别ARG2应答,用三个长肽各刺激一次来自6名健康捐赠者的PBMC。随后,PBMC用于在IFNγELISPOT中筛选免疫应答。如图15A所示,三个长肽均识别免疫应答,然而,33聚A2L2在测试的捐赠者中给出了三个长肽中最强和最频繁的免疫应答。由于ARG2-1包含在A2L2中,因此较长肽A2L2被检测以确定它是否更有效地刺激ARG2特异性T细胞。因此,6名健康捐赠者用ARG2-1或A2L2刺激一次,然后建立IFNγELIPOT测定。在6名捐赠者中有5名捐赠者的A2L2免疫应答高于ARG2-1应答(图15B),尽管不显著(p=0.0625),表明这两种肽都能引起频繁的免疫应答。
为表征A2L2的免疫原性,采用IFNγELISPOT分析对来自30名健康捐赠者和18名癌患者(14名黑色素瘤、3名前列腺癌、1名乳腺癌患者)的PBMC进行了筛选。80%的健康捐赠者和癌症患者中都观察到强烈和频繁的应答(图15C)。用于IFNγ和TNFα产生的细胞内细胞因子染色显示,仅针对A2L2刺激的CD4+应答(图15D)与对于ARG2-1所观察到的相似。在同一名捐赠者中,与ARG2-1应答相比,针对A2L2的免疫应答平均较高,虽然不显著(p=0.7038)(图15E)。
ARG2特异性T细胞的表征
为了进一步表征针对ARG2的免疫应答,产生了ARG2特异性CD4+T细胞培养物。这是通过用ARG2肽负载自体DC反复刺激分离自前列腺癌患者的PBMC,然后富集和快速扩增特异性细胞来实现的。在对TNFα和IFNγ(图16A)的细胞因子染色和IFNγELISPOT(图16B)中,T细胞培养物对ARG2和A2L2均具有高度特异性。此外,发现了在IFNγELISPOT中通过HLA-DR阻滞剂(但不是HLA-DP或HLA-DQ阻滞剂)的添加抑制了来自用肽刺激的ARG2特异性T细胞培养物的IFNγ产生(图16C)。为了评估ARG2特异性T细胞培养物的特异性,检测了ARG2特异性T细胞培养物对细胞内表达ARG2的细胞的识别和应答能力。为此,自体DC用这样的mRNA转染:其编码融合至ARG2DC-LAMP信号序列的ARG2,该mRNA将蛋白质靶向溶酶体室,从而将蛋白质导向II类呈递。与模拟转染的DC相比,观察到对ARG2 mRNA转染的DC的更高的反应性(图16D)。转染细胞的FACS分析显示转染效率>90%,模拟和mRNA转染DC的mRNA分析显示转染24小时后ARG2表达大幅度增加(数据未显示)。
已经示出针对产生ARG2的免疫细胞的反应性,使用IFNγELISPOT测定研究了ARG2特异性T细胞培养物识别和对抗不同癌细胞的能力。针对特异性T细胞培养物的捐赠者的HLA测序分析允许我们选择具有低内源性ARG2表达的三个HLA匹配(HLA-DR01:01)AML细胞系(OCI-AML2、THP-1和MONO-MAC-1,数据未显示),并用ARG2-1肽脉冲以随后用作IFNγELISPOT的靶细胞。Set2,另一株具有高内源性ARG2表达但HLA与ARG2特异性T细胞培养物不匹配的AML细胞系被包括作为阴性对照。OCI-AML2、THP-1和MONO-MAC-1被ARG2特异性T细胞有效识别(图17A),而Set2却没有。通过添加两种不同的HLA-DR特异性抗体证实了ARG2特异性T细胞的HLA-DR限制,因为添加两种HLA-DR阻滞剂消除了ARG2-1脉冲的THP-1细胞的识别(图17B)。
THP-1细胞系是来源于AML患者外周血的单核细胞系。THP-1细胞被报道具有维持的一定可塑性,其功能取决于其周围环境中的特异性细胞因子的存在。IL-4和IL-13被报道是ARG1的主要诱导因子,但它们对ARG2的作用尚不清楚。此外,THP-1细胞被报道在当用IL-4、GM-CSF和TFNα的细胞因子混合物(在本文中称为“细胞因子混合物”)进行48小时刺激时获得了DC相似的特征。因此,用IL-4、IL-13或细胞因子混合物刺激THP-1细胞检测是否会增加THP-1细胞中的ARG2表达。当用细胞因子混合物刺激时,发现超过2倍的ARG2表达的诱导,然而IL-4和IL-13对ARG2表达水平没有太大影响(图17C)。接下来研究了细胞因子混合物刺激后的ARG2表达的增加是否能引起来自ARG2特异性T细胞的免疫应答。事实上,发现细胞因子混合物导致IFNγELISPOT中的受刺激的THP-1细胞的识别(图17D),和通过细胞内细胞因子染色检测到的TNFα和IFNγ产生(图17E)。用细胞因子处理THP-1细胞后,只有ARG2表达增加,而ARG1表达保持不变(图17F)。对细胞因子刺激的THP-1细胞的应答可被HLA-DR特异性抗体阻断(图17G)。
值得注意的是,与未受刺激的细胞相比,细胞因子混合物刺激的THP-1细胞改变了形态,具有更多的集落形成、小突起和获得性粘附(数据未显示)。重要的是,细胞因子混合物没有上调HLA-DR表达(数据未显示)。相反,用IFNγ处理THP-1细胞增加了细胞表面上的HLA-DR表达(未显示),但不增加ARG2表达(图17H),并且通过IFNγELISPOT测定中的ARG2特异性T细胞无法识别IFNγ刺激的THP-1细胞(图17I)。
MONO-MAC-1是一种AML细胞系,与THP-1细胞一样,仍具有分化能力或受细胞因子刺激的影响。与THP-1细胞的观察类似,通过细胞因子在MONO-MAC-1细胞中增加ARG2表达是可能的(图18a)。与MONO-MAC-1细胞中未受刺激的细胞相比,用细胞因子混合物刺激MOO-MAC-1细胞不会增加HLA-DR表达(未显示)。此外,用IFNγ刺激的MONO-MAC-1细胞没有上调ARG2表达(图18B),并且在IFNγELISPOT中,只有细胞因子处理的MONO-MAC-1细胞被ARG2特异性T细胞识别(图18C)。用细胞因子混合物刺激的MONO-MAC-1也会改变形态,类似于针对THP-1细胞所观察到的(未显示)。
为了进一步测试ARG2表达依赖T细胞识别的概念,使用ARG2-DC-LAMP构建物用ARG2 mRNA转染THP-1细胞。DC-LAMP序列被报道对成熟DC是特异性的,但THP-1细胞可分化为DC样细胞,因此该构建体也同样适用于THP-1细胞的转染。事实上,观察到ARG2特异性T细胞培养物对用ARG2-DC-LAMP mRNA转染的THP-1细胞产生反应(图19A)。此外,与用ARG1-DC-LAMP mRNA转染的细胞相比,针对用ARG2-DC-LAMP mRNA转染的细胞的反应性显著更高(图7A),强调了ARG2特异性T细胞的特异性。此外,与仅mRNA转染或细胞因子刺激的细胞相比,转染前用细胞因子刺激48小时增加了免疫应答(图19A)。用于TNFα和IFNγ产生的细胞内细胞因子染色显示出类似的趋势(图19B)。转染24小时后,电穿孔效率通过GFP表达细胞的FACS分析来评估,并显示有效转染(>99%GFP+细胞)(数据未显示)。与此相一致,在分别用ARG2-DC-LAMP mRNA或ARG1-DC-LAMP mRNA转染24小时后,观察到ARG2和ARG1表达比模拟细胞大幅倍增(数据未显示)。与Set2细胞中的内源性ARG2表达水平相比,mRNA转染的THP-1细胞中的ARG2表达水平高(数据未显示)。
其次,我们使用ARG2的siRNA介导的敲除进一步证明T细胞识别和激活依赖于ARG2表达。用联合的三个ARG2特异性siRNA转染THP-1细胞导致有效ARG2 KD(图19C)。用siRNA转染和细胞因子刺激48h后,通过细胞内细胞因子染色来检测TNFα和IFNγ产生。我们观察到,与模拟+细胞因子细胞相比,ARG2特异性T细胞对siRNA+细胞因子细胞的TNFα和IFNγ的产生都下降,即使我们未能完全消除产生(图19D)。在细胞中的ARG2表达的RT-qpr显示了siRNA+细胞因子细胞中的ARG2 KD,但ARG2表达水平略高于仅用siRNA-KD获得的水平(图19E)。
实施例3-小鼠模型中疫苗原理的证明
为了证明针对精氨酸酶2的疫苗的治疗潜力,开发了小鼠模型。鼠精氨酸酶2与人精氨酸2具有85%序列同源性,所以,不可能简单地使用人序列。使用表位预测服务器,对C57小鼠(H-2Kb,H2DB)的鼠精氨酸酶2中可能的表位进行了研究。
在两个簇中发现了预测与H2Kb和H2Db结合的表位,在aa85和aal82附近。这些如下表所示,对齐以说明重叠。
SEQ ID 序列 名称 起始位置 终止位置
45 VVYPRSVGL--------- mArg2 P1 85 93
46 VVYPRSVGLANQELAEVV mArg2 P2 85 102
47 ---------------PNIVYIGL mArg2 P3 191 198
48 WIKPCLSPPNIVYIGL mArg2 P4 182 197
49 ----------LSPPNIVYI-- mArg2 P5 188 196
50 IQYFSMREI mArg2 P6 213 221
每个预测表位被预测与H2-Kb或H2-Db结合,但是mArg2_P2由两个预测表位放在一起——理论上——能够与H2-Kb和H2-Db结合。mArg2_P6被预测与H2-Kb和H2-Db结合。
这些肽用于免疫接种筛选(参见图11中的实验示意图),其中三只C57小鼠皮下接种6个肽中的一个。一周后处死小鼠,取脾脏匀浆,以获得PBMC。这些用于建立IFNγELISPOT以筛选针对用于免疫接种的肽和具有重叠序列的其他预测表位肽的应答。
如图12所示,接种mArg2 P5(aal88-196)的小鼠给出最强、最显著应答。用这种肽进行了进一步的免疫接种实验。如图13所示,接种mArg2 P5的小鼠对mArg2 P5(aal88-196)和P4(aal82-197)都有应答,而对mArg2 P3(asl91-198)没有应答或只有微弱的应答。这表明主要表位位于aal88-196。然而,总的来说,实验证明了接种精氨酸酶2肽能够刺激体内的免疫应答,验证了精氨酸酶2疫苗作为一般原则的治疗潜力。
实施例4-小鼠模型中疫苗原理的进一步证明-刘易斯(Lewis)肺癌
材料和方法
肽设计-见实施例3。
细胞培养
肿瘤衍生细胞系刘易斯肺(Lewis-Lung)(LL2)在补充有青霉素、链霉素和10%PBS的DMEM培养基中培养。通过用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco)从烧瓶中分离,细胞每周传代2~3次。
动物实验
动物实验在赫列夫(Herlev)医院肿瘤科的动物设施中进行。所有用小鼠的实验均由丹麦动物实验委员会审查和批准。C57BL/6小鼠的日常护理和繁殖由动物设施的动物管理员进行。对于治疗性免疫接种研究,从Taconic购买C57BL/6小鼠。
肿瘤注射
将LL2细胞(5×105)重悬浮于100ul无血清介质中,皮下注射于雌性C57BL/6小鼠右侧腹中。用电子卡尺测量肿瘤体积,肿瘤研究的终点是肿瘤达到800mm3的阈值大小或归因于肿瘤上溃疡的形成。
肽疫苗和鼠ELISPOT
鼠Arg2肽(P1-P6)由PepScan或
Figure BDA0003067385530000271
合成,并据报道的溶解度,分别以2mM或l0mM溶解于超纯水或DMSO中。溶解的肽随后用Montanide佐剂(50μl/小鼠)(Seppic Inc.)乳化,以获得l00μl总体积中给定l00μg总肽的最佳剂量。用27G针头在12~16周龄C57BL/6小鼠的底部,或尾部或侧腹皮下注射乳化的肽疫苗。对照小鼠组给予总体积为100μl的水和Montanide乳化液。对于接种肿瘤的小鼠进行治疗性疫苗研究,分别于肿瘤接种后第0天和第7天在小鼠尾部的侧面和左腹进行疫苗接种。为了表位筛选和验证实验,在小鼠右腹注射单剂量疫苗。一周后处死小鼠,重获脾脏。脾脏打碎通过70μM的过滤器,红血细胞用红血细胞溶解缓冲液(Qiagen)溶解。细胞洗涤4次并计数,然后设置每孔8×106细胞进行鼠IFNγELISPOT分析。
用PD-1阻断抗体的治疗
抗鼠PD-1(CD279)单克隆抗体购自BioXCell(克隆:RMP1-14)。为进行疗效研究,小鼠接受腹腔注射200μlPBS中的250μg PD-1阻断抗体。从LL2接种后的第4天开始,小鼠每周三次用抗PD-1进行处理。
统计分析
使用无分布重采样(DFR)方法(Moodie等人(参考文献)中描述)分析ELISPOT应答。使用R-studio执行ELISPOT应答的统计分析。对ARG2-1和A2L2的应答(特异性IFNγ分泌细胞)的差异与使用Wilcoxon配对有符号秩检验(使用Prism 8)进行比较,显著性水平为0.05。通过使用Prism8的混合效应分析来进行对照组和Arg2接种组之间的平均肿瘤生长差异的统计分析。
结果
实施例1和实施例2显示ARG2作为体外特异性T细胞的靶点,其中免疫细胞和表达ARG2的癌细胞都被ARG2特异性T细胞所特异性地识别。为了检测ARG2特异性T细胞在体内的潜在功能效应,实施例3鉴定了相关的鼠ARG2肽表位,其被进一步评估。通过肽-montanide乳液中的小鼠皮下免疫接种,筛选用于免疫应答的C57BL/6小鼠。每组3只小鼠接种6个候选肽中的每一个,7天后处死小鼠,分离脾细胞,并在体外mIFNγELISPOT测定中进行分析。在所有3只接种P4的小鼠中均观察到强的免疫应答(参见图12,且相同的数据也显示在图20A中)。随后,这在用每组更多小鼠的类似实验中被证实(图20B)。
为了鉴定最相关的肿瘤模型,在来源于C57BL/6的不同移植瘤组中评估Arg2表达。我们发现在通过Lewis肺(LL2)肿瘤细胞形成的肿瘤中的Arg2的最一致的高表达(图20C)。与模拟接种对照组(Ctrl)相比,用LL2肿瘤细胞攻击C57BL/6小鼠,然后进行两次免疫接种(肿瘤接种后第0天和第7天-参见图2D中的治疗方案),导致Arg2接种小鼠(P4)的肿瘤生长减少(图20E)。肿瘤接种后第12天,因为形成了肿瘤溃疡而处死小鼠。为了检测Arg2疫苗是否以能诱导抗PDl抗体作用的方式修饰TME,我们将针对mARG2(188-197)(表示P4)的疫苗与LL2模型中的抗PDl结合在一起。如所预期的,用抗PDl抗体的单一治疗不会影响该模型中的肿瘤生长。然而,抗PDl与ARG2疫苗的联合具有加成效应(图20F和20G)。在肿瘤接种后第12天,由于肿瘤上形成溃疡而处死小鼠。
实施例1-4的总结和讨论
这些实施例表明,ARG2是特异性T细胞的靶点,因此,特异性的ARG2特异性效应T细胞可被开发作为靶向ARG2表达免疫抑制细胞的可能的新方法。首先,这些实施例通过筛选覆盖整个ARG2序列的肽库,鉴定了癌症患者和健康捐赠者中天然存在的外周ARG2特异性T细胞。有趣的是,发现了ARG2含有多个表位,这些表位经常被外周T细胞识别。针对ARG2的频繁T细胞应答强调了ARG2的高免疫原性,并且支持了增强ARG2表达癌症患者(例如前列腺癌或AML患者)的ARG2特异性免疫应答的可能性。此外,健康个体中强烈的免疫应答表明ARG2特异性T细胞是免疫系统的天然组成部分,可能对免疫体内稳态很重要。此外,分离并扩增特异性CD4+T细胞,这些细胞对来自ARG2的明显最具免疫原性区域的肽产生反应。结果表明,ARG2特异性T细胞确实识别并对表达髓样细胞的ARG2产生反应。
一般来说,根据免疫浸润,肿瘤现在分为不同的类别;(i)缺乏的免疫浸润物(在所谓的“冷”肿瘤中);(ii)从与恶性细胞接触排除的免疫浸润物(在所谓的“排除”肿瘤中);或(iii)丰富的肿瘤浸润物(在所谓的“热”肿瘤中),其被强大的免疫抑制机制所控制。一个重要的治疗策略是将“冷”和“排除”肿瘤转为“热”肿瘤的临床联合治疗,因为后者通常与免疫治疗,特别是检查点阻断方面的改善的疾病结局有关。精氨酸酶的一个重要特征是它在“排除”类型肿瘤中的表达,由于在这些肿瘤中的精氨酸酶表达免疫抑制性免疫细胞。ARG1响应于Th2细胞因子,例如IL-4和IL-13(除了IL-10和TGF-β外),在M2样巨噬细胞中上调被很好地描述。相反,ARG2的调节只非常有限地描述,但有趣的是,已认为,Toll样受体配体如脂多糖和含有大量非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤基序(CpG)的寡脱氧核苷酸诱导了鼠巨噬细胞中的ARG2表达。
最近还描述了IL1β和TNFα诱导神经母细胞瘤细胞中的ARG2。重要的是,在本研究中,我们进一步示出了细胞因子的混合物,即IL4、GM-CSF和TNFα诱导恶性髓细胞中的ARG2。因此,ARG2似乎由不仅在排除肿瘤中而且还在更多“中间体”到“热”肿瘤中存在的环境诱导。因此,由于ARG1或ARG2被诱导的微环境不同,因此毫不奇怪,在肿瘤微环境(TME)中发现ARG1和ARG2通过不同细胞和在不同肿瘤类型中表达。因此,ARG1主要由MDSC和TAM表达,而ARG2则已描述由各种实体瘤细胞、AML原始细胞和CAF表达。因此,ARG1和ARG2联合用于免疫接种可能有利于在TME中靶向不同免疫抑制性精氨酸酶表达细胞,从而有利于更多的患者。此外,已经很好地描述了出现响应于Th1细胞因子(例如IFNγ)的传播炎症的活化M1巨噬细胞。重要的是,许多间质细胞不是终末分化细胞,在促炎刺激下可能会恢复为免疫活性细胞。通过例如免疫接种激活精氨酸酶特异性T细胞确实会引起肿瘤部位的Thl炎症。已知存在其它类型的抗调节性T细胞,例如IDO-和PD-L1特异性促炎性T细胞,并且已报道Thl-炎症信号,例如IFNγ,自发地导致此类IDO-和PD-L1特异性T细胞的扩增,表明精氨酸酶与基于IDO-或PDL1的疫苗的潜在协同作用。在这种情况下,ARG1/ARG2免疫接种可在肿瘤部位诱导Thl炎症,否则在该处精氨酸酶表达细胞阻止淋巴细胞浸润。反过来,这种效应将诱导IDO和/或PD-L1,从而通过识别衍生自这些靶点的表位的抗Tregs来进一步靶向。因此,来自不同抗Treg靶抗原的表位的组合可以是免疫接种方法中的添加剂。同样,与仅用对炎症肿瘤有效的检查点阻断相比,使用激活ARG2特异性T细胞的ARG2免疫调节疫苗和检查点阻断抗体的联合治疗应增加对治疗有应答的患者数量。因此,精氨酸酶表达细胞阻止了肿瘤部位处的效应淋巴细胞增殖,并因此是许多癌症患者缺乏抗PDl治疗效果的重要原因。在目前的研究中,我们发现ARG2确实在详细描述的PD-L1抗肿瘤模型Lewis肺中表达。我们发现,通过免疫接种激活ARG2特异性T细胞抑制了Lewis肺细胞的生长,最重要的是,与抗PDl协同发挥作用。因此,与免疫调节性ARG2免疫接种的联合可能确实使抗性Lewis肺细胞对抗PDl治疗敏感。
总的来说,这些实施例表明,ARG2特异性T细胞作为免疫系统的一个天然组成部分存在,并且可以很容易地使平衡远离癌症中的免疫抑制倾斜。针对ARG2的治疗性免疫接种应促进炎症性TME的产生,这将有利于针对癌细胞的癌症特异性免疫应答。因此,基于ARG2的疫苗很可能与其他的免疫治疗特别是检查点抑制剂协同发挥作用。本实施例中使用的来自人ARG2的最具免疫原性的肽在刺激ARG2特异性T细胞应答方面是有效的,这对于微环境的再平衡可能是至关重要的,并且与单途径治疗或目前仅针对靶癌症细胞的癌症疫苗相比,应该增加T细胞增强药物(例如检查点阻断剂)的效力。
序列
起始位置和终止位置表示全长人精氨酸酶2(SEQ ID NO:51)内的位置,除非另有说明。
表X
Figure BDA0003067385530000291
Figure BDA0003067385530000301
Figure BDA0003067385530000311
*表示来自人精氨酸酶1的序列。起始位置和终止位置是在人精氨酸酶1(SEQ IDNO:53)中的位置。
#表示来自鼠精氨酸酶2的序列。起始位置和终止位置是在鼠精氨酸酶2(SEQ IDNO:52)的位置,尽管由于鼠和人蛋白的长度相同,编号也与人精氨酸酶2相匹配。
全长人精氨酸酶2(NP_001163.1)(SEQ ID NO:51)
Figure BDA0003067385530000312
基于精氨酸酶1同源性被鉴定为免疫原性热点的区域以粗体和下划线表示。转运肽边界被鉴定为先前未被认可的热点的中心,用粗体和斜体“KSV”表示。
全长鼠精氨酸酶2(NP_033835.1)(SEQ ID NO:52)
Figure BDA0003067385530000313
Figure BDA0003067385530000321
全长人精氨酸酶1(NP_000036.2)(SEQ ID NO:53)
Figure BDA0003067385530000322
被鉴定为免疫原性热点的区域以粗体和下划线显示。
序列表
<110> IO生物技术公司
<120> 免疫原性精氨酸酶2多肽
<130> N414657WO
<150> GB1818576.9
<151> 2018-11-14
<160> 64
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
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Ser Ile Leu Lys
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gln Lys Arg Lys
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Ala Ala Ile Arg
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Pro Lys Asp Asp
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Ser Val Gly Leu Ala Asn Gln Glu Leu Ala Glu Val Val Ser Arg Ala
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Val Ser Asp Gly
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Glu Val Val Ser Arg Ala Val Ser Asp Gly Tyr Ser Cys Val Thr Leu
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Gly Gly Asp His
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Tyr Ser Cys Val Thr Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Thr
1 5 10 15
Ile Ser Gly His
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Ser Leu Ala Ile Gly Thr Ile Ser Gly His Ala Arg His Cys Pro Asp
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Leu Cys Val Val
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<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Ala Arg His Cys Pro Asp Leu Cys Val Val Trp Val Asp Ala His Ala
1 5 10 15
Asp Ile Asn Thr
20
<210> 15
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
Trp Val Asp Ala His Ala Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Ser Ser
1 5 10 15
Gly Asn Leu His
20
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Pro Leu Thr Thr Ser Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro Val Ser Phe
1 5 10 15
Leu Leu Arg Glu
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<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Arg Glu Leu Gln Asp Lys Val Pro
1 5 10 15
Gln Leu Pro Gly
20
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Leu Gln Asp Lys Val Pro Gln Leu Pro Gly Phe Ser Trp Ile Lys Pro
1 5 10 15
Cys Ile Ser Ser
20
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Ile Ser Ser Ala Ser Ile Val Tyr Ile
1 5 10 15
Gly Leu Arg Asp
20
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
Ala Ser Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Pro Glu His
1 5 10 15
Phe Ile Leu Lys
20
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Val Asp Pro Pro Glu His Phe Ile Leu Lys Asn Tyr Asp Ile Gln Tyr
1 5 10 15
Phe Ser Met Arg
20
<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
Asn Tyr Asp Ile Gln Tyr Phe Ser Met Arg Asp Ile Asp Arg Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gln Lys Val
20
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
Asp Ile Asp Arg Leu Gly Ile Gln Lys Val Met Glu Arg Thr Phe Asp
1 5 10 15
Leu Leu Ile Gly
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
Met Glu Arg Thr Phe Asp Leu Leu Ile Gly Lys Arg Gln Arg Pro Ile
1 5 10 15
His Leu Ser Phe
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<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
Lys Arg Gln Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Ile Asp Ala Phe Asp
1 5 10 15
Pro Thr Leu Ala
20
<210> 26
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
Asp Ile Asp Ala Phe Asp Pro Thr Leu Ala Pro Ala Thr Gly Thr Pro
1 5 10 15
Val Val Gly Gly
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu Gly
1 5 10 15
Met Tyr Ile Ala
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
Leu Thr Tyr Arg Glu Gly Met Tyr Ile Ala Glu Glu Ile His Asn Thr
1 5 10 15
Gly Leu Leu Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Glu Glu Ile His Asn Thr Gly Leu Leu Ser Ala Leu Asp Leu Val Glu
1 5 10 15
Val Asn Pro Gln
20
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
Ala Leu Asp Leu Val Glu Val Asn Pro Gln Leu Ala Thr Ser Glu Glu
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Glu Ala Lys Thr
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Leu Ala Thr Ser Glu Glu Glu Ala Lys Thr Thr Ala Asn Leu Ala Val
1 5 10 15
Asp Val Ile Ala
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
Thr Ala Asn Leu Ala Val Asp Val Ile Ala Ser Ser Phe Gly Gln Thr
1 5 10 15
Arg Glu Gly Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
Ser Ser Phe Gly Gln Thr Arg Glu Gly Gly His Ile Val Tyr Asp Gln
1 5 10 15
Leu Pro Thr Pro
20
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<213> 智人(Homo sapiens)
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His Ile Val Tyr Asp Gln Leu Pro Thr Pro Ser Ser Pro Asp Glu Ser
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Glu Asn Gln Ala Arg Val Arg Ile
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Ile Ser Ser Ala Ser Ile Val Tyr
1 5 10 15
Ile Gly Leu Arg
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ser Ala Ser Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Pro Glu
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Asp Val Asp Pro Pro Glu His Phe Ile Leu Lys Asn Tyr Asp Ile Gln
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Tyr Phe Ser Met
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Lys Asn Tyr Asp Ile Gln Tyr Phe Ser Met Arg Asp Ile Asp Arg Leu
1 5 10 15
Gly Ile Gln Lys
20
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Ile Ser Ser Ala Ser Ile Val Tyr
1 5 10 15
Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Pro Glu His Phe Ile Leu Lys Asn
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Tyr Asp Ile Gln Tyr Phe Ser Met Arg Asp Ile Asp Arg Leu Gly Ile
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Gln Lys
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr
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Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr
20 25 30
Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile
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Gly Lys
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ala Lys Asp Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu
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His Tyr Ile Leu
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr Leu Gly Ile Lys
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Tyr Phe Ser Met
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
Lys Thr Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu
1 5 10 15
Gly Ile Gly Lys
20
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<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 45
Val Val Tyr Pro Arg Ser Val Gly Leu
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<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 46
Val Val Tyr Pro Arg Ser Val Gly Leu Ala Asn Gln Glu Leu Ala Glu
1 5 10 15
Val Val
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<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 47
Pro Asn Ile Val Tyr Ile Gly Leu
1 5
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<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 48
Trp Ile Lys Pro Cys Leu Ser Pro Pro Asn Ile Val Tyr Ile Gly Leu
1 5 10 15
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 49
Leu Ser Pro Pro Asn Ile Val Tyr Ile
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 50
Ile Gln Tyr Phe Ser Met Arg Glu Ile
1 5
<210> 51
<211> 354
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
Met Ser Leu Arg Gly Ser Leu Ser Arg Leu Leu Gln Thr Arg Val His
1 5 10 15
Ser Ile Leu Lys Lys Ser Val His Ser Val Ala Val Ile Gly Ala Pro
20 25 30
Phe Ser Gln Gly Gln Lys Arg Lys Gly Val Glu His Gly Pro Ala Ala
35 40 45
Ile Arg Glu Ala Gly Leu Met Lys Arg Leu Ser Ser Leu Gly Cys His
50 55 60
Leu Lys Asp Phe Gly Asp Leu Ser Phe Thr Pro Val Pro Lys Asp Asp
65 70 75 80
Leu Tyr Asn Asn Leu Ile Val Asn Pro Arg Ser Val Gly Leu Ala Asn
85 90 95
Gln Glu Leu Ala Glu Val Val Ser Arg Ala Val Ser Asp Gly Tyr Ser
100 105 110
Cys Val Thr Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Thr Ile Ser
115 120 125
Gly His Ala Arg His Cys Pro Asp Leu Cys Val Val Trp Val Asp Ala
130 135 140
His Ala Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Ser Ser Gly Asn Leu His
145 150 155 160
Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Arg Glu Leu Gln Asp Lys Val Pro
165 170 175
Gln Leu Pro Gly Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Ile Ser Ser Ala Ser
180 185 190
Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Pro Glu His Phe Ile
195 200 205
Leu Lys Asn Tyr Asp Ile Gln Tyr Phe Ser Met Arg Asp Ile Asp Arg
210 215 220
Leu Gly Ile Gln Lys Val Met Glu Arg Thr Phe Asp Leu Leu Ile Gly
225 230 235 240
Lys Arg Gln Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Ile Asp Ala Phe Asp
245 250 255
Pro Thr Leu Ala Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr
260 265 270
Tyr Arg Glu Gly Met Tyr Ile Ala Glu Glu Ile His Asn Thr Gly Leu
275 280 285
Leu Ser Ala Leu Asp Leu Val Glu Val Asn Pro Gln Leu Ala Thr Ser
290 295 300
Glu Glu Glu Ala Lys Thr Thr Ala Asn Leu Ala Val Asp Val Ile Ala
305 310 315 320
Ser Ser Phe Gly Gln Thr Arg Glu Gly Gly His Ile Val Tyr Asp Gln
325 330 335
Leu Pro Thr Pro Ser Ser Pro Asp Glu Ser Glu Asn Gln Ala Arg Val
340 345 350
Arg Ile
<210> 52
<211> 354
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 52
Met Phe Leu Arg Ser Ser Ala Ser Arg Leu Leu His Gly Gln Ile Pro
1 5 10 15
Cys Val Leu Thr Arg Ser Val His Ser Val Ala Ile Val Gly Ala Pro
20 25 30
Phe Ser Arg Gly Gln Lys Lys Leu Gly Val Glu Tyr Gly Pro Ala Ala
35 40 45
Ile Arg Glu Ala Gly Leu Leu Lys Arg Leu Ser Arg Leu Gly Cys His
50 55 60
Leu Lys Asp Phe Gly Asp Leu Ser Phe Thr Asn Val Pro Gln Asp Asp
65 70 75 80
Pro Tyr Asn Asn Leu Val Val Tyr Pro Arg Ser Val Gly Leu Ala Asn
85 90 95
Gln Glu Leu Ala Glu Val Val Ser Arg Ala Val Ser Gly Gly Tyr Ser
100 105 110
Cys Val Thr Met Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Thr Ile Ile
115 120 125
Gly His Ala Arg His Arg Pro Asp Leu Cys Val Ile Trp Val Asp Ala
130 135 140
His Ala Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Val Ser Gly Asn Ile His
145 150 155 160
Gly Gln Pro Leu Ser Phe Leu Ile Lys Glu Leu Gln Asp Lys Val Pro
165 170 175
Gln Leu Pro Gly Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Leu Ser Pro Pro Asn
180 185 190
Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Glu Pro Pro Glu His Phe Ile
195 200 205
Leu Lys Asn Tyr Asp Ile Gln Tyr Phe Ser Met Arg Glu Ile Asp Arg
210 215 220
Leu Gly Ile Gln Lys Val Met Glu Gln Thr Phe Asp Arg Leu Ile Gly
225 230 235 240
Lys Arg Gln Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Ile Asp Ala Phe Asp
245 250 255
Pro Lys Leu Ala Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Glu Glu Glu Ala Lys Ala Thr Ala Arg Leu Ala Val Asp Val Ile Ala
305 310 315 320
Ser Ser Phe Gly Gln Thr Arg Glu Gly Gly His Ile Val Tyr Asp His
325 330 335
Leu Pro Thr Pro Ser Ser Pro His Glu Ser Glu Asn Glu Glu Cys Val
340 345 350
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
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35 40 45
Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe
50 55 60
Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu
65 70 75 80
Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val
85 90 95
Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Ser Ile Ser Gly His Ala
100 105 110
Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp
115 120 125
Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro
130 135 140
Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro
145 150 155 160
Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr
165 170 175
Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr
180 185 190
Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile
195 200 205
Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys
210 215 220
Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe
225 230 235 240
Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu
245 250 255
Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly
260 265 270
Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu
275 280 285
Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe
290 295 300
Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro
305 310 315 320
Pro Lys
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 54
Ile Leu Lys Lys Ser Val His Ser Val Ala
1 5 10
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 55
Ile Leu Lys Lys Ser Val His Ser Val
1 5
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
Ser Ile Leu Lys Lys Ser Val His Ser Val
1 5 10
<210> 57
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
Ser Leu Ser Arg Leu Leu Gln Thr Arg Val His Ser Ile Leu Lys Lys
1 5 10 15
Ser Val His Ser Val Ala Val Ile Gly Ala Pro Phe Ser
20 25
<210> 58
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 58
Ser Leu Arg Gly Ser Leu Ser Arg Leu Leu Gln Thr Arg Val His Ser
1 5 10 15
Ile Leu Lys Lys Ser Val His Ser Val Ala Val Ile Gly Ala
20 25 30
<210> 59
<211> 33
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 59
Ser Leu Arg Gly Ser Leu Ser Arg Leu Leu Gln Thr Arg Val His Ser
1 5 10 15
Ile Leu Lys Lys Ser Val His Ser Val Ala Val Ile Gly Ala Pro Phe
20 25 30
Ser
<210> 60
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 60
Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Ile Ser Ser Ala Ser Ile Val Tyr Ile
1 5 10 15
Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Pro Glu His Phe Ile Leu
20 25
<210> 61
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 61
Leu Pro Gly Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Ile Ser Ser Ala Ser Ile
1 5 10 15
Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Pro Glu His Phe Ile Leu
20 25 30
<210> 62
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 62
Met Ser Leu Arg Gly Ser Leu Ser Arg Leu Leu Gln Thr Arg Val His
1 5 10 15
Ser Ile Leu Lys Lys Ser
20
<210> 63
<211> 56
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 63
Met Ser Leu Arg Gly Ser Leu Ser Arg Leu Leu Gln Thr Arg Val His
1 5 10 15
Ser Ile Leu Lys Lys Ser Val His Ser Val Ala Val Ile Gly Ala Pro
20 25 30
Phe Ser Gln Gly Gln Lys Arg Lys Gly Val Glu His Gly Pro Ala Ala
35 40 45
Ile Arg Glu Ala Gly Leu Met Lys
50 55
<210> 64
<211> 38
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 64
Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser
1 5 10 15
Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg
20 25 30
Lys Ala Gly Leu Leu Glu
35

Claims (15)

1.一种多肽,其是人精氨酸酶2(SEQ ID NO:51)的免疫原性片段,包括SEQ ID NO:51的至少9个连续氨基酸的序列或由SEQ ID NO:51的至少9个连续氨基酸的序列组成,所述连续氨基酸(i)包括SEQ ID NO:51的至少位置21、22和23处的氨基酸,或(ii)选自SEQ ID NO:51的位置180至229。
2.根据权利要求1所述的多肽,其包括(i)或(ii)所定义的SEQ ID NO:51的多达15、20、25、30、35、40、45或50个连续氨基酸或由(i)或(ii)所定义的SEQ ID NO:51的多达15、20、25、30、35、40、45或50个连续氨基酸组成。
3.根据权利要求1或2所述的多肽,其包括SEQ ID NO:59、58、57、54、55、56、2、3、19、20、21、60或61中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:59、58、57、54、55、56、2、3、19、20、21、60或61中任一个的氨基酸序列组成。
4.根据前述任一项权利要求所述的多肽,其最大长度为9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸,和/或其中C端氨基酸被相应的酰胺替换。
5.一种组合物,其包括前述任一项权利要求所述的多肽和一种佐剂。
6.根据权利要求5所述的组合物,其包括至少一种药学上可接受的稀释剂、载体或防腐剂。
7.根据权利要求5或6所述的组合物,其中所述佐剂选自由基于细菌DNA的佐剂、基于油/表面活性剂的佐剂、基于病毒dsRNA的佐剂、咪唑并喹啉和蒙大拿ISA佐剂所组成的组。
8.一种治疗或预防受试者的疾病或病况的方法,所述方法包括向所述受试者施用权利要求1至4中任一项所述的多肽或权利要求5至7所述的组合物。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述疾病或病况的特征至少部分在于精氨酸酶2的不适当或过度的免疫抑制功能,和/或其中所述疾病或病况是癌症。
10.根据权利要求8或9所述的方法,其中所述疾病或病况是癌症,任选地其中所述方法还包括同时或依次施用其他癌症治疗。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述其他癌症治疗是免疫系统检查点抑制剂,优选地是抗体。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述抗体是抗PDl抗体。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法,其中所述癌症是肾癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌或小肠癌,或者是结直肠癌或胃癌,或者是黑色素瘤,或者是白血病,优选是急性髓系白血病(AML),任选地其中所述癌症对免疫系统检查点抑制剂的治疗有抵抗力。
14.一种刺激精氨酸酶2特异性T细胞的方法,所述方法包括使所述细胞与权利要求1至4中任一项所述的多肽或权利要求5至7所述的组合物接触,任选地其中所述细胞存在于取自健康受试者或癌症患者的样本中,任选地肿瘤样本。
15.一种编码根据权利要求1至4中任一项所述的多肽的核酸。
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