CN109890399A - 免疫原性精氨酸酶肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人精氨酸酶蛋白的免疫原性多肽片段。所述片段特别适用于治疗或预防癌症。

Description

免疫原性精氨酸酶肽

技术领域

本发明涉及新的肽化合物，例如精氨酸酶1的片段，以及包含这些肽化合物的组合物、用途和试剂盒。此外，本发明涉及表达所述肽化合物的核酸、载体和宿主细胞，其单独地或与其他癌症疗法同时或依序给予时用于治疗或预防癌症的方法。

背景技术

精氨酸酶是催化氨基酸L-精氨酸转化为L-鸟氨酸和尿素的反应的酶。这消耗了精氨酸的微环境并导致肿瘤特异性细胞毒性T细胞应答的抑制。在乳腺癌、肺癌、结肠癌或前列腺癌患者的癌细胞中检测到精氨酸酶活性升高[1]。已表明，在体外和体内，用大鼠精氨酸酶基因转染的小鼠巨噬细胞促使共培养的肿瘤细胞的增殖[2]。此外，已表明诱导巨噬细胞表达精氨酸酶通过聚胺合成而增加肿瘤血管形成。鼠肺癌模型的结果表明，存在成熟肿瘤相关骨髓细胞的亚群，其表达高水平的精氨酸酶。这些肿瘤相关骨髓细胞消耗了胞外L-精氨酸，这抑制肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的抗原特异性增殖。在小鼠中，注入精氨酸酶抑制剂阻断了肺癌的生长。这表明在肿瘤细胞和肿瘤相关骨髓细胞中诱导精氨酸酶表达如何通过抑制抗肿瘤免疫应答(通过对TIL的负效应)来促使肿瘤生长。

MDSC(骨髓衍生的抑制细胞)抑制效应T细胞和天然杀伤细胞的活化、增殖和细胞毒性，以及诱导Treg分化和扩张。肿瘤细胞和MDSC都能通过操控经由酶——一氧化氮合酶(NOS)和精氨酸酶的L-精氨酸代谢来抑制T细胞。许多肿瘤表现出增加的精氨酸酶和可诱导NOS(iNOS)的表达，导致肿瘤微环境中的精氨酸消耗[1]。若干研究强调这种改变的肿瘤精氨酸代谢在抑制肿瘤特异性T细胞应答中的重要性，并且最近证明AML blast显示出精氨酸酶依赖性的抑制T细胞增殖和造血干细胞的能力。此外，精氨酸酶和iNOS抑制剂降低了AML的抑制活性[2]。

发明内容

本发明的发明人从精氨酸酶1鉴定了新的免疫原性表位。此外，分析了来自黑色素瘤患者的外周血单核细胞(PBMC)中存在的针对精氨酸酶1衍生肽的特异性T细胞应答，并且检测了针对所述新的免疫原性表位的强免疫应答。此外，检测了针对若干肽片段的频繁免疫应答。还表明针对精氨酸酶1的免疫应答实际上由CD4和CD8 T细胞介导，并且CD8和CD4 T细胞能够识别靶细胞表面上的精氨酸酶1衍生肽。

癌症的新免疫疗法的开发需要充分理解发病机理中涉及的分子以及免疫系统识别的特异性蛋白。在临床背景下，诱导精氨酸酶特异性免疫应答，除杀伤癌细胞以外，还能够通过抑制表达精氨酸酶的细胞(特别是MDSC和肿瘤相关巨噬细胞(TAM))的免疫抑制功能而在总体上支持抗癌免疫应答。因此，由于表达精氨酸酶的细胞拮抗其他免疫治疗方法的期望的效果，因此靶向骨髓树突细胞(例如通过免疫接种)将与其他抗癌免疫疗法高度协同。

本文提供了SEQ ID NO：1(精氨酸酶1)或SEQ ID NO：60(精氨酸酶2)的人精氨酸酶蛋白的免疫原性多肽片段。所述片段通常长度最多达8、9、10、15、20、25、30、45、50或55个氨基酸。所述片段可包含SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：58的至少8、9、10、20、30、40或50个连续氨基酸的序列或由其组成。所述多肽片段可包含SEQ ID NO：52、50、51、34、35、36、37、9、53、54、2至33、或38或49中任一个的氨基酸序列或由其组成。

所述多肽片段可具有以下其他特征中的一个或更多个：

a.C端氨基酸被相应的酰胺替换；和/或

b.对应于SEQ ID NO：1第190位的位置上的L被I替换；和/或

c.对应于SEQ ID NO：1第205位的位置上的R被K替换；和/或

d.至少一个额外的部分(moiety)连接至N和/或C端，任选地其中所述额外的部分是亲水氨基酸，例如R或K；和/或

e.相对于相应的全长精氨酸酶，缺乏精氨酸酶活性或精氨酸酶活性降低。

还提供了包含所述片段、可药用的稀释剂或载体和任选的佐剂的组合物。所述组合物或所述片段可用于治疗或预防疾病或病况(例如癌症)的方法，或用于制备用于治疗或预防疾病或病况(例如癌症)的药物。所述组合物可任选地被描述为疫苗。还提供了治疗或预防疾病或病况(例如癌症)的方法，所述方法包括将所述组合物或所述片段给予至有需要的受试者。

在本文中，多肽片段可互换地描述为肽化合物或肽。

一方面，本公开内容涉及精氨酸酶1的肽化合物，其选自：

a)SEQ ID NO 1的肽片段，其由8至321个氨基酸的连续序列组成，

b)与SEQ ID NO 1或a)的肽片段具有至少70％、80％、90％或95％同一性的功能性同源物，和

c)功能性类似物，其中SEQ ID NO 1或a)的肽片段中至少一个氨基酸被缺失、插入和/或置换，

其中a)、b)或c)中任一个的C端氨基酸还包含酰胺；

或其可药用的盐。在上述上下文中，“功能性”意指“能够刺激对SEQ ID NO：1的精氨酸酶的免疫应答”。同源物b)和类似物c)优选具有降低的(或不具有)精氨酸酶功能。

在一个实施方案中，肽化合物选自a)SEQ ID NO 1的肽片段，其由8至321个氨基酸的连续序列组成，其中C端氨基酸还包含酰胺；或其可药用的盐。在另一个实施方案中，肽片段由8至300个氨基酸、8至250个氨基酸、8至200个氨基酸、8至150个氨基酸、8至120个氨基酸，例如10至100个氨基酸、20至80个氨基酸、30至60个氨基酸、40至50个氨基酸的连续序列组成。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(1-310)、ARG(1-301)、ARG(1-291)、ARG(11-322)、ARG(21-322)、ARG(30-322)、ARG(40-322)、ARG(11-310)、ARG(11-301)、ARG(11-291)、ARG(21-310)、ARG(21-301)、ARG(21-291)、ARG(30-310)、ARG(30-301)、ARG(30-291)、ARG(40-310)、ARG(40-301)和ARG(40-291)。

在另一个实施方案中，通过精氨酸酶活性测定，与精氨酸酶1相比精氨酸酶活性降低。在一个实施方案中，精氨酸酶活性降低至无活性。在另一个实施方案中，精氨酸酶活性测定选自精氨酸酶活性比色测定试剂盒(BioVision精氨酸酶测定#K755-100)。

在另一个实施方案中，连续序列包含一个或更多个选自SEQ ID NO：52、50、51、37、36、35、34、9、53、54、2至33、或38至39中任一个的序列。在一个实施方案中，连续序列包含选自SEQ ID NO 52、50、51、37、36、35、34、9、53或54的序列。

在另一个实施方案中，a)的肽片段、b)的功能性同源物或c)的功能性类似物具有功能性的意义在于其激活识别表达精氨酸酶1的细胞的T细胞。在一个实施方案中，通过本文所述的ELISPOT测定来确定所述激活。

本文还公开了编码本发明的肽化合物的核酸。本发明的肽化合物选自上述实施方案中的任一个。在一个实施方案中，所述核酸选自DNA和RNA。

本文还公开了包含本发明的核酸的载体。本发明的核酸选自上述实施方案中的任一个，本发明的肽化合物选自上述实施方案中的任一个。在一个实施方案中，所述载体选自病毒载体。

另一方面，本公开内容涉及包含本发明的载体的宿主细胞。所述载体选自上述实施方案中的任一个，所述核酸选自上述实施方案中的任一个，所述肽化合物选自上述实施方案中的任一个。在一个实施方案中，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞。

载体优选包含编码精氨酸酶1的无活性序列——即为缺乏精氨酸酶功能的序列——的核酸。

本文所述的任何肽、核酸、载体或宿主细胞可在组合物中提供，任选地与可药用的添加剂(例如载体或稀释剂)一起。所述组合物可任选地还包含佐剂。所述组合物可用作药物。所述组合物可用于制备用于治疗或预防疾病的药物。

所述组合物可用于治疗或预防选自癌症的疾病、病症或病况。在一个实施方案中，癌症是形成肿瘤的癌症疾病。佐剂可选自基于细菌DNA的佐剂、基于油/表面活性剂的佐剂、基于病毒dsRNA的佐剂、imidazochiniline和Montanide ISA佐剂。

本文公开的治疗或预防疾病的方法可包括给予受试者有效量的：

a)如上文所述的组合物，和

b)包含至少一种第二活性成分的组合物，所述第二活性成分选自免疫刺激化合物，例如白细胞介素(例如IL-2和/或IL-21)，抗癌剂，例如化疗剂，例如辅酶B12(Actimide)、阿扎胞苷(Azacitidine)、硫唑嘌呤(Azathioprine)、博来霉素(Bleomycin)、卡铂(Carboplatin)、卡培他滨(Capecitabine)、顺铂(Cisplatin)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、柔红霉素(Daunorubicin)、多西他赛(Docetaxel)、去氧氟尿苷(Doxifluridine)、多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、依托泊苷(Etoposide)、氟达拉滨(Fludarabine)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、吉西他滨(Gemcitabine)、羟基脲(Hydroxyurea)、伊达比星(Idarubicin)、伊立替康(Irinotecan)、来那度胺(Lenalidomide)、甲酰四氢叶酸(Leucovorin)、氮芥(Mechlorethamine)、美法仑(Melphalan)、巯基嘌吟(Mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、培美曲塞(Pemetrexed)、瑞复美(Revlimid)、替莫唑胺(Temozolomide)、替尼泊苷(Teniposide)、硫鸟嘌呤(Thioguanine)、戊柔比星(Valrubicin)、长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春地辛(Vindesine)和长春瑞滨(Vinorelbine)，或检查点抑制剂，例如抗体如nivolumab或pembrolizumab。

所提供的组合物可同时给予或依序给予。所述组合物可作为试剂盒中的组分提供。

另一方面，本公开内容涉及治疗临床病况的方法，所述临床病况的特征在于SEQID NO 1的精氨酸酶1的表达，所述方法包括给予患有所述临床病况的个体有效量的上文所述的肽、核酸、载体或宿主细胞。

另一方面，本公开内容涉及在癌症患者中刺激精氨酸酶1特异性T细胞(例如CD4和CD8 T细胞)的方法，所述方法包括给予癌症患者有效量的上文所述的肽化合物、或核酸、或载体、或宿主细胞。

另一方面，本公开内容涉及在癌症患者中抑制表达精氨酸酶1的细胞的免疫抑制功能，所述方法包括给予癌症患者有效量的上文所述的肽化合物、或核酸、或载体、或宿主细胞。

另一方面，本发明涉及上文所述的肽化合物、或核酸、或载体、或宿主细胞用于制备治疗或预防癌症的药物(例如免疫治疗组合物或疫苗)的用途，其中所述癌症任选地特征为表达精氨酸酶1。

另一方面，本公开内容涉及用于治疗或预防癌症的方法中的肽化合物、或核酸、或载体、或宿主细胞，任选地与其他癌症疗法同时或依序给予。

其他癌症疗法可选自细胞因子疗法、T细胞疗法、NK疗法、免疫系统检查点抑制剂、化学疗法、放射疗法、免疫刺激物质、基因疗法、抗体和树突细胞。在一个实施方案中，其他癌症疗法选自免疫系统检查点抑制剂，例如检查点阻断抗体(例如选自nivolumab或pemrbolizumab)，或选自辅酶B12、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊立替康、来那度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、美法仑、巯基嘌吟、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、瑞复美、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

附图说明

图1表示在来自6名癌症患者的样品中对由SEQ ID NO：2至16的每个氨基酸序列组成的肽(Arg1至Arg15)的T细胞应答。

图2表示在来自6名癌症患者的样品中针对由SEQ ID NO：9的每个氨基酸序列组成的肽(Arg8)的T细胞应答。

图3表示在来自3名癌症患者的样品中对由SEQ ID NO：18至48的每个氨基酸序列组成的肽(Arg1-1至Arg1-31)的T细胞应答。

图4表示在来自8名健康个体的样品中对由SEQ ID NO：9(Arg8)、SEQ ID NO：21(Arg1-4)、SEQ ID NO：29(Arg1-12)、SEQ ID NO：34(Arg1-17)、SEQ ID NO：35(Arg1-18)、SEQ ID NO：36(Arg1-19)、SEQ ID NO：37(Arg1-20)、SEQ ID NO：40(Arg1-23)、SEQ ID NO：44(Arg1-17)的每个氨基酸序列组成的肽的T细胞应答。

图5表示CD8阳性培养物能够杀死荷载由SEQ ID NO：9(Arg8)的每个氨基酸序列组成的肽的靶细胞。

图6表示精氨酸酶特异性T细胞杀死精氨酸酶阳性癌(黑色素瘤)细胞系FM3和FM93。

图7表示在不采用(上图)或采用(下图)由SEQ ID NO：9(Arg8)的每个氨基酸序列组成的肽进行刺激的情况下，培养后通过IFN-g(PE-Cy7A)和TNF-α(APC-A)的胞内染色来评估的来自癌症患者的CD4 T细胞的流式细胞术分析。类似结果示于图8中。

图9表示当通过IFNγ ELISPOT评估时，多个精氨酸酶1肽被来自3名黑色素瘤患者(9A)和8名健康捐赠者(9B)的PBMC识别。肽通过提及它们的序列在人精氨酸酶1序列内的起始位置和终止位置来描述。斑点计数表示为用肽刺激的孔的平均值和对照孔的平均值之间的差异。肽和对照刺激平行进行两次或三次。

图10表示对应于SEQ ID NO：1的第161至210位的区域被癌症患者和健康捐赠者PBMC广泛识别。

A——表示CD4+ T细胞在来自黑色素瘤患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中的比例，所述CD4+ T细胞响应于由SEQ ID NO：34(Arg161-180)、SEQ ID NO：35(Arg171-190)和SEQID NO：36(Arg181-200)中每个的氨基酸序列组成的肽而释放IFNγ。肽名称指它们的序列在人精氨酸酶1序列内的起始位置和终止位置。

B——左：在来自5名经挑选的癌症患者和4名健康捐赠者的PBMC中针对Arg(161-190)肽的应答。右：在2名健康捐赠者(HD..)和2名癌症患者(MM..)中针对Arg(161-190)肽的应答的示例性ELISPOT孔。

C——左：在来自5名经挑选的癌症患者和4名健康捐赠者的PBMC中针对Arg(181-210)肽的应答。右：在2名健康捐赠者(HD..)和2名癌症患者(MM..)中针对Arg(161-190)肽的应答的示例性ELISPOT孔。

斑点计数表示为用肽刺激的孔的平均值和对照孔的平均值之间的差异。肽和对照刺激进行三次。

图11表示针对对应于SEQ ID NO：1的第161至210位的区域的应答的进一步分析。

A——上图表示用肽Arg(161-190)刺激8小时或未用肽刺激之后，通过IFN-g(PE-Cy7A)和TNF-α(APC-A)释放的胞内染色来评估的来自癌症患者的CD4 T细胞的流式细胞术分析。下图表示对于2名健康捐赠者(HD..)和1名癌症患者(MM..)，该测定中释放TNF-α的CD4+ T细胞的比例。

B——单独采用肽Arg(161-190)或采用阻断HLA I类(抗I类；W6/32)或HLA II类(抗II类；Tü39)表达的抗体刺激来自3名癌症患者的PBMC之后IFNγ ELISPOT结果的总结。斑点计数表示为用肽刺激的孔的平均值和对照孔之间的差异。肽和对照刺激平行进行两次或三次。

C——左：当用精氨酸酶第161至190位的序列组成的30mer ArgShort(Arg 161-190)刺激，或用精氨酸酶第161至210位的序列组成的50mer(Arg 161-210)刺激，或不刺激(对照)时，来自精氨酸酶特异性CD4 T细胞的IFNγ ELISPOT应答(通过用SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的肽(ArgShort)重复刺激而产生)。右：用肽Arg(161-190)或对照刺激8小时之后，通过IFN-g(PE-Cy7A)和TNF-α(APC-A)释放的胞内染色来评估的精氨酸酶特异性CD4T细胞的流式细胞术分析。

图12表示精氨酸酶特异性T细胞识别表达精氨酸酶的免疫细胞。

A和C——来自两名不同的黑色素瘤患者(MM01和MM05)的精氨酸酶特异性T细胞培养物对经电穿孔并用不相关对照mRNA(DC Mock)或精氨酸酶1mRNA(DC Arg mRNA)转染的自体树突细胞的IFNγ应答。效靶比10∶1。

B和D——来自两名不同的黑色素瘤患者的精氨酸酶特异性T细胞培养物对经电穿孔并用不相关对照mRNA(DC Mock)或精氨酸酶1mRNA(DC Arg mRNA)转染的自体B细胞的IFNγ应答。效靶比2∶1。

E——下：精氨酸酶特异性T细胞培养物对经电穿孔并用不相关对照mRNA(DCMock)、精氨酸酶mRNA(DC Arg mRNA)或包含DC-LAMP信号序列的精氨酸酶mRNA(DC LAMPArg mRNA)转染的自体树突细胞的IFNγ应答。上：代表性ELISPOT孔图像。对照和经转染的孔刺激平行进行两次或三次。

图13是人精氨酸酶1和鼠精氨酸酶1的序列比对。

图14表示在C57BL/6小鼠中，用本文公开的不同肽接种之后精氨酸酶特异性免疫应答增加。

图15表示在Balb/c小鼠中，用本文公开的不同肽接种之后精氨酸酶特异性免疫应答增加。

图16表示在癌症小鼠模型中，用本文公开的不同肽接种之后肿瘤体积减小。

序列简述

SEQ ID NO：1是人精氨酸酶1的野生型氨基酸序列。

SEQ ID NO：2至54是人精氨酸酶1的肽片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO：55至57是人精氨酸酶1的肽片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO：58是人精氨酸酶2的肽片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO：59是鼠精氨酸酶1的野生型氨基酸序列。

SEQ ID NO：60是人精氨酸酶2的野生型氨基酸序列。

SEQ ID NO：61是人精氨酸酶1的替代序列。

具体实施方式

本发明涉及精氨酸酶蛋白的免疫原性多肽片段。这类片段适于用作疫苗。“免疫原性”意指多肽片段在至少一个个体中在给予至所述个体之后能够引起免疫应答，优选T细胞应答。可使用任何适合的方法，包括体外方法来鉴定多肽的免疫原性。例如，如果多肽具有以下特征中至少一种，则多肽可被鉴定为具有免疫原性：

(i)通过ELISPOT测定，它能够在至少一名癌症患者的PBL群中诱导产生IFN-γ的细胞，和/或

(ii)它能够在肿瘤组织样品中原位检测与相应的精氨酸酶反应的CTL；和/或

(iii)它能够诱导特异性T细胞的体外生长。

以下实施例部分还提供了适于测定多肽是否具有免疫原活性的方法。

发明人已经确定了SEQ ID NO：1的精氨酸酶1序列的多个区域具有免疫原性。这些区域包括SEQ ID NO：52、50、51、37、36、35、34、9、53、54、2至33、或38至49。SEQ ID NO：52对应于SEQ ID NO：1的第161至210位的精氨酸酶1区域。该区域被描述为免疫原性热点区(hotspot)，因为它包含癌症患者和健康受试者中最常检测到T细胞应答所针对的序列。免疫原性多肽的长度可最多达50或55个氨基酸和/或包含SEQ ID NO：52的至少8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或全部50个连续氨基酸。所述连续氨基酸优选包含SEQ ID NO：50、51、34、35、36、37、9、53和54中任一个或由其组成。SEQ ID NO：50、51、34、35、36、37、9、53和54中每一个包含来自SEQ ID NO：52的序列内的序列。特别地，SEQ ID NO：50、51、34、35、36、37、9、53和54中每一个对应于分别通过位置161-190、181-210、161-180、171-190、181-200、191-210、174-182、172-179和193-200来定义的SEQ ID NO：1的区域。

免疫原性多肽片段长度可最多达30、35、40、45、50或55个氨基酸并且包含SEQ IDNO：50或51的至少8、9、10、15、20、25或全部30个连续氨基酸。免疫原性片段长度可最多达20、25、30、35、40、45、50或55个氨基酸并且包含SEQ ID NO：37、36、35、34中任一个的至少8、9、10、15或全部20个连续氨基酸。

多肽片段优选包含来自通过SEQ ID NO：1的第181-200位定义的区域(其为SEQ IDNO：36)的至少8、9、10、15或全部20个连续氨基酸，或最优选来自通过SEQ ID NO：1的第191-200位定义的区域(其为SEQ ID NO：37)的至少8、9、10、15或全部20个连续氨基酸。多肽片段可包含来自通过SEQ ID NO：1的第161-180位定义的区域(其为SEQ ID NO：34)或通过SEQID NO：1的第171-190位定义的区域(其为SEQ ID NO：35)的至少8、9、10、15或全部20个连续氨基酸。在前者(SEQ ID NO：34)中，对应于第168位的半胱氨酸可任选地被保守置换所替换，例如以提高溶解度或稳定性。

免疫原性肽片段长度可最多达8或9个氨基酸，并且可包含SEQ ID NO：9、53或54中任一个的至少8或9个连续氨基酸。免疫原性多肽片段可包含SEQ ID NO：52、50、51、34、35、36、37、9、53、54、2至33、或38至49中任一个的氨基酸序列或由其组成。

发明人还鉴定了对应于SEQ ID NO：1的其他区域的序列中的应答，包括通过以下位置定义的区域(或至少与以下位置部分重叠)：221-240位(参见SEQ ID NO：40、7、14)、271-290位(参见SEQ ID NO：45、8、10、11、12)、111-130位(参见SEQ ID NO：29)、1-20位(参见SEQ ID NO：18)、61-80位(参见SEQ ID NO：24)、131-150位(参见SEQ ID NO：31、4)、141-160位(参见SEQ ID NO：32、4)、51-70位(参见SEQ ID NO：23)、151-170位(参见SEQ ID NO：33、4)、211-240位(参见SEQ ID NO：39、6)、和281-300位(参见SEQ ID NO：46)。因此，免疫原性多肽片段可包含这些区域或序列中任一个的至少8、9或更多个连续氨基酸。免疫原性多肽片段可包含这些区域或序列中任一个的氨基酸序列或由其组成。

人精氨酸酶2与精氨酸酶1相关并且在序列上具有一些相似性(分别参见SEQ IDNO：60相对于SEQ ID NO：1)。因此，精氨酸酶1中的目的区域也可能是精氨酸酶2中的目的区域。因此，前面部分中所述的任一个序列中的一个或更多个氨基酸可被精氨酸酶2中对应位置上的一个或更多个氨基酸替换。所述序列可全部被精氨酸酶2的对应序列替换。免疫原性多肽可包含SEQ ID NO：60的序列或由其组成，所述序列通过SEQ ID NO：60中的位置来定义，所述位置对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：52、50、51、34、35、36、37、9、53、54、2至33、或38至49中任一个中的位置。例如，通过SEQ ID NO：1的第161-210位定义的热点区对应于SEQID NO：60的第180-229位(其在本文中表示为SEQ ID NO：58)。因此，提及SEQ ID NO：52可被提及SEQ ID NO：58替换。免疫原性多肽可包含SEQ ID NO：58的至少8、9或优选至少20或30个连续氨基酸。

人精氨酸酶1高度类似于鼠精氨酸酶1(分别参见SEQ ID NO：59相对于SEQ ID NO：1，再加上图13)。因此，人精氨酸酶1在前面部分中所述的任一个序列中的一个或更多个氨基酸可被鼠精氨酸酶1中对应位置上的一个或更多个氨基酸替换。所述序列可全部被鼠精氨酸酶1的对应序列替换。免疫原性多肽可包含SEQ ID NO：59的序列或由其组成，所述序列通过SEQ ID NO：59中的位置来定义，所述位置对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：52、50、51、34、35、36、37、9、53、54、2至33、或38至49中任一个中的位置。例如，通过SEQID NO：1的第161-210位定义的热点区对应于SEQ ID NO：59的第161-210位(其在本文中表示为SEQ IDNO：57)。因此，提及SEQ IDNO：52可被提及SEQ ID NO：57替换。免疫原性多肽可包含SEQIDNO：57的至少8、9或优选至少20或30个连续氨基酸。实际上，这意指在本文所述的包含那些残基的任何多肽片段中，对应于SEQ ID NO：1的第190位的位置上的L可被I替换，和/或对应于SEQ ID NO：1的第205位的位置上的R可被K替换。

在本文所述的任何多肽片段中，C端氨基酸可任选地被相应的酰胺替换以提高溶解度和/或有助于制备/分离。类似地，多肽可在N和/或C端连接至少一个额外的部分以提高溶解度和/或有助于制备/分离。适合的部分包括亲水氨基酸。例如，氨基酸KR可添加在N端和/或氨基酸RK可依序添加在C端。

相对于全长精氨酸酶，本文所述的任何多肽片段优选具有降低的精氨酸酶活性。精氨酸酶活性降低可包括降低至无活性。适合的精氨酸酶活性测定是精氨酸酶活性比色测定试剂盒(BioVision精氨酸酶测定#K755-100)。

一方面，本公开内容涉及精氨酸酶1的肽化合物，其选自：

a)由8至321个氨基酸的连续序列组成的SEQ ID NO 1的肽片段，

b)与SEQ ID NO 1或a)的肽片段具有至少70％、80％、90％或95％同一性的功能性同源物，和

c)功能性类似物，其中SEQ ID NO 1或a)的肽片段中至少一个氨基酸被缺失、插入和/或置换。

其中a)、b)或c)中任一个的C端氨基酸还包含酰胺；

或其可药用的盐。

在一个实施方案中，所述肽化合物选自b)与SEQ ID NO 1或a)的肽片段具有至少70％、80％、90％或95％同一性的功能性同源物，其中C端氨基酸还包含酰胺；或其可药用的盐。在一个实施方案中，所述功能性同源物与SEQ ID NO 1具有至少80％同一性。在另一个实施方案中，所述功能性同源物与SEQ ID NO 1具有至少90％同一性。在另一个实施方案中，所述功能性同源物与SEQ ID NO 1具有至少95％同一性。在另一个实施方案中，所述功能性同源物与a)的肽片段具有至少70％同一性。在另一个实施方案中，所述功能性同源物与a)的肽片段具有至少80％同一性。在另一个实施方案中，所述功能性同源物与a)的肽片段具有至少90％同一性。在另一个实施方案中，所述功能性同源物与a)的肽片段具有至少95％同一性。

在另一个实施方案中，所述肽化合物选自c)功能性类似物，其中SEQ ID NO 1或a)的肽片段中至少一个氨基酸被缺失、插入和/或置换，其中C端氨基酸还包含酰胺；或其可药用的盐。

在另一个实施方案中，所述肽化合物选自a)由8至321个氨基酸的连续序列组成的SEQ ID NO 1的肽片段，其中C端氨基酸还包含酰胺；或其可药用的盐。在另一个实施方案中，所述肽片段由8至300个氨基酸的连续序列组成。在另一个实施方案中，所述肽片段由8至300个氨基酸的连续序列组成。在另一个实施方案中，所述肽片段由8至250个氨基酸的连续序列组成。在另一个实施方案中，所述肽片段由8至200个氨基酸的连续序列组成。在另一个实施方案中，所述肽片段由8至150个氨基酸的连续序列组成。在另一个实施方案中，所述肽片段由8至120个氨基酸的连续序列组成。在另一个实施方案中，所述肽片段由10至100个氨基酸的连续序列组成。在另一个实施方案中，所述肽片段由20至80个氨基酸的连续序列组成。在另一个实施方案中，所述肽片段由30至60个氨基酸的连续序列组成。在另一个实施方案中，所述肽片段由40至50个氨基酸的连续序列组成。在另一个实施方案中，SEQ ID NO1的肽片段选自ARG(1-310)、ARG(1-301)、ARG(1-291)、ARG(11-322)、ARG(21-322)、ARG(30-322)、ARG(40-322)、ARG(11-310)、ARG(11-301)、ARG(11-291)、ARG(21-310)、ARG(21-301)、ARG(21-291)、ARG(30-310)、ARG(30-301)、ARG(30-291)、ARG(40-310)、ARG(40-301)、和ARG(40-291)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(1-310)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(1-301)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(1-291)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(11-322)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(21-322)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(30-322)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(40-322)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(11-310)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(11-301)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(11-291)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(21-310)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(21-301)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO1的肽片段选自ARG(21-291)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(30-310)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(30-301)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(30-291)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(40-310)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(40-301)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(40-291)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO1的肽片段选自ARG(161-190)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(181-210)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(161-210)。

应当理解，当肽片段由8至120个的连续序列组成时，它可同时在实例ARG(40-291)的序列内选择，而由8至321个的连续序列组成的肽片段无法同时在实例ARG(40-291)的序列内选择，这是本领域技术人员已知的。其他的所有组合被包含于本发明中。

还应理解，本文使用的ARG(x-y)(其中x和y是选自1-322的整数)意指具有如本文定义的SEQ ID NO 1的精氨酸酶1的肽片段，其中x是N端氨基酸，y是C端氨基酸，例如ARG(174-182)表示从SEQ ID NO 1的第174位氨基酸至SEQ ID NO 1的第182位氨基酸的肽片段，其中第174位氨基酸是I，第182位氨基酸是V。

本文使用的术语“同一性”指两个或更多个肽的(例如多肽)序列之间的关系，如通过比较序列而确定。在本领域中，“同一性”还意指蛋白或多肽之间序列相关程度，如通过两个或更多个氨基酸残基串(string)之间的匹配数目来确定。“同一性”测量具有空位比对(如果存在)的两个或更多个序列的较小序列之间的相同匹配百分比，这通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来进行。相关蛋白或肽的同一性可容易地通过已知方法来计算。这类方法包括但不限于以下文献中所述的那些：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informaticsand Genome Pro-jects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，HumanaPress，New Jersey，1994；Se-quence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M.Stockton Press，New York，1991；和Carillo et al.，SIAM J.Applied Math.，48，1073，(1988)。

设计确定同一性的优选方法以得出测试序列之间的最大匹配。确定同一性的方法在可公开获得的计算机程序中有描述。优选的确定两个序列之间同一性的计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux et al.，Nucl.Acid.Res.，12，387，(1984)；GeneticsComputer Group，University of Wisconsin，Madison，Wis.)、BLASTP、BLASTN、和FASTA(Altschul et al.，J.Mol.Biol.，215，403-410，(1990))。BLASTX程序可公开地获自美国国家生物技术信息中心(NCBI)和其他来源(BLAST Manual，Altschul et al.NCB/NLM/NIHBethesda，Md.20894；Altschul et al.，见上文)。公知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。

例如，使用计算机算法GAP(Genetics Computer Group，University ofWisconsin，Madison，Wis.)，比对待确定序列同一性百分比的两个蛋白，以实现它们各自氨基酸的最佳匹配(通过算法确定的“匹配跨度(matched span)即)。空位缺口罚分(gapopening penalty)(其计算为3倍平均对角线，“平均对角线”是所使用的比较矩阵的对角线平均值；“对角线”是特定的比较矩阵分配给每个完全氨基酸匹配的得分或数目)和空位延伸罚分(gap extension penalty)(其通常为空位缺口罚分的倍数{分数(1/10)})，以及比较矩阵如PAM 250或BLOSUM 62与算法结合使用。算法还使用标准的比较矩阵(对于PAM 250比较矩阵，参见Dayhoff et al.，Atlas of Protein Sequence and Structure，vol.5，supp.3(1978)；对于BLOSUM 62比较矩阵，Henikoff et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89，10915-10919，(1992))。蛋白或肽序列比较的优选参数包括以下：算法：Needleman et al.，J.Mol.Biol，48，443-453，(1970)；比较矩阵：BLOSUM 62，来自Henikoff et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10915-10919，(1992)；空位罚分：12；空位长度罚分：4；相似性临界值：0。以上参数适用于GAP程序。使用GAP算法进行蛋白质比较时，前述参数是默认参数(以及末端空位没有罚分)。

在另一个实施方案中，通过精氨酸酶活性测定来测量，与精氨酸酶1相比，精氨酸酶活性降低。在一个实施方案中，精氨酸酶活性降低至无活性。在另一个实施方案中，精氨酸酶活性测定选自精氨酸酶活性比色测定试剂盒(BioVision精氨酸酶测定#K755-100)。在另一个实施方案中，通过精氨酸酶活性测定来测量，与精氨酸酶1相比，精氨酸酶活性降低至无活性，所述精氨酸酶活性测定选自精氨酸酶活性比色测定试剂盒。

在另一个实施方案中，所述连续序列包括选自SEQ ID NO 2-17中任一个的一个或更多个序列。在一个实施方案中，所述连续序列包含选自SEQ ID NO 9的序列。在另一个实施方案中，所述连续序列仅包含选自SEQ ID NO 9的序列，但不包含选自SEQ ID NO 2-8或10-17中任一个的序列。

在另一个实施方案中，所述连续序列包含具有SEQ ID NO 50的序列。在另一个实施方案中，所述连续序列包含具有SEQ ID NO 51的序列。在另一个实施方案中，所述连续序列包含具有SEQ ID NO 52的序列。

在另一个实施方案中，a)的肽片段、b)的功能性同源物、或c)的功能性类似物激活识别表达精氨酸酶1的细胞的T细胞。在一个实施方案中，所述激活通过本文所述的ELISPOT测定来确定。在另一个实施方案中，如通过本文所述的ELISPOT测定来确定，a)的肽片段激活识别表达精氨酸酶1的细胞的T细胞。

在一个特定方面，本公开内容涉及精氨酸酶1的肽化合物，其选自：

a)由8至49个氨基酸的连续序列组成的SEQ ID NO 52或SEQ ID NO 52的肽片段，

b)与SEQ ID NO 52或a)的肽片段具有至少70％、80％、90％或95％同一性的功能性同源物，和

c)功能性类似物，其中SEQ ID NO 52或a)的肽片段中至少一个氨基酸被缺失、插入和/或置换，

其中a)、b)或c)中任一个的C端氨基酸还包含酰胺；

或其可药用的盐。意图是a)、b)或c)的任一种肽化合物可以是单独的实施方案的对象。

在另一个实施方案中，所述肽片段由9至49个氨基酸(例如10至40个氨基酸，例如20至30个氨基酸)的连续序列组成。

在另一个实施方案中，由具有8至49个氨基酸的连续序列组成的SEQ ID NO 52的肽片段包含SEQ ID NO 51。在另一个实施方案中，由具有8至49个氨基酸的连续序列组成的SEQ ID NO 52的肽片段包含SEQ ID NO 50。在另一个实施方案中，由具有8至49个氨基酸的连续序列组成的SEQ ID NO 52的肽片段包含SEQ ID NO 9。

在另一个实施方案中，所述肽片段包含至少一个CD4+和至少一个CD8+ T细胞表位。在另一个实施方案中，所述肽片段包含至少一个CD4+或至少一个CD8+ T细胞表位。在另一个实施方案中，所述肽片段包含至少一个CD4+ T细胞表位。在另一个实施方案中，所述肽片段包含至少一个CD8+ T细胞表位。在另一个实施方案中，所述肽片段包含全部T细胞表位，特别是位于ARG(161-210)中热点区中的全部CD4+和CD8+表位。在另一个实施方案中，所述肽片段包含除一个表位以外的全部T细胞表位，特别是位于ARG(161-210)中热点区中的全部CD4+和CD8+表位。

另一方面，本公开内容涉及编码本发明的肽化合物的核酸。所述肽化合物选自上述实施方案中的任一个。在一个实施方案中，所述核酸选自DNA和RNA。

另一方面，本公开内容涉及包含本发明的核酸的载体。所述核酸选自上述实施方案中任一个，本发明的肽化合物选自上述实施方案中任一个。在一个实施方案中，载体选自病毒载体。

另一方面，本公开内容涉及包含本发明的载体的宿主细胞。所述载体选自上述实施方案中任一个，所述核酸选自上述实施方案中任一个，所述肽化合物选自上述实施方案中任一个。在一个实施方案中，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞。

另一方面，本公开内容涉及包含编码精氨酸酶1的无活性序列的核酸的载体，所述精氨酸酶1的无活性序列选自：

a)SEQ ID NO 1的肽片段，其由8至321个氨基酸的连续序列组成，

b)与SEQ ID NO 1或a)的肽片段具有至少70％、80％、90％或95％同一性的功能性同源物，和

c)功能性类似物，其中SEQ ID NO 1或a)的肽片段中至少一个氨基酸被缺失、插入和/或置换，

其中a)、b)或c)中任一个的C端氨基酸还包含酰胺，其中所述核酸表达无活性序列，并且其中所述无活性序列包含至少1个免疫原性表位。在一个实施方案中，所述表位选自SEQ ID NO 2-17，通常所述表位选自SEQ ID NO 9。在另一个实施方案中，所述表位可包含SEQ ID NO：50-52中任一个内包含的至少8个连续氨基酸的任意序列。

另一方面，本公开内容涉及组合物，其包含本公开内容的肽化合物或核酸或载体或宿主细胞，任选地以及可药用的添加剂，例如载体或佐剂。

另一方面，本公开内容涉及免疫治疗组合物，其包含：

a)本发明的肽化合物或本发明的核酸或本发明的载体或本发明的宿主细胞；和

b)佐剂；

其用作药物。

在一个实施方案中，免疫治疗组合物用于治疗或预防选自癌症的疾病、病症或病况的方法。在一个实施方案中，所述癌症为形成肿瘤的癌症疾病。在另一个实施方案中，佐剂选自基于细菌DNA的佐剂、基于油/表面活性剂的佐剂、基于病毒dsRNA的佐剂、imidazochiniline和Montanide ISA佐剂。

另一方面，本公开内容涉及试剂盒，其包含：

a)本发明的免疫治疗组合物，和

b)包含至少一种第二活性成分的组合物，所述第二活性成分选自免疫刺激化合物，例如白细胞介素(例如IL-2和/或IL-21)，抗癌剂，例如辅酶B12、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊立替康、来那度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、美法仑、巯基嘌吟、甲氨蝶呤、米托蒽醌、nivolumab、奥沙利铂、紫杉醇、pembrolizumab、培美曲塞、瑞复美、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

在试剂盒的一个实施方案中，将所提供的组合物同时或依序给予。

另一方面，本公开内容涉及治疗临床病况的方法，所述临床病况的特征为表达SEQID NO 1的精氨酸酶1，所述方法包括给予患有所述临床病况的个体有效量的本发明的肽化合物或本发明的核酸或本发明的载体或本发明的宿主细胞。

另一方面，本公开内容涉及在癌症患者中刺激精氨酸酶1特异性T细胞(例如CD4和CD8 T细胞)的方法，所述方法包括给予癌症患者有效量的本公开内容的肽化合物、或核酸、或载体、或宿主细胞。

另一方面，本公开内容涉及在癌症患者中抑制表达精氨酸酶1的细胞的免疫抑制功能的方法，所述方法包括给予癌症患者有效量的本公开内容的肽化合物、或核酸、或载体、或宿主细胞。

另一方面，本公开内容涉及本公开内容的肽化合物、或核酸、或载体、或宿主细胞用于制备治疗或预防特征为表达精氨酸酶1的癌症的药物(例如免疫治疗组合物或疫苗)的用途。

另一方面，本公开内容涉及本公开内容的肽化合物、或核酸、或载体、或宿主细胞，其与其他癌症疗法同时或依序给予用于癌症的治疗或预防方法。

所述其他癌症疗法选自细胞因子疗法、T细胞疗法、NK疗法、免疫系统检查点抑制剂、化学疗法、放射疗法、免疫刺激物质、基因疗法、抗体和树突细胞。在一个实施方案中，所述其他癌症疗法选自免疫系统检查点抑制剂，例如检查点阻断抗体(例如nivolumab、pemrbolizumab)，或选自辅酶B12、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊立替康、来那度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、美法仑、巯基嘌吟、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、瑞复美、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

通过使用例如精氨酸酶活性比色测定试剂盒(BioVision精氨酸酶活性#K755-100)来测量精氨酸酶活性。BioVision的精氨酸酶活性测定试剂盒简单、灵敏并且快速。在该测定中，精氨酸酶与精氨酸发生反应并经历一系列反应以形成中间物，其与OxiRed^TM探针按化学计量发生反应以产生有色产物(OD 570nm)。所述试剂盒能够以96孔测定形式检测低于0.2U/L的精氨酸酶活性。

如本文使用，所示的任何氨基酸序列可在C端氨基酸处被修饰为酰胺形式(-CONH₂)或可以为酸形式，因此这些中任一种都是优选实施方案，并且意图为任意C端氨基酸(例如I、F、R、L、K、G、M、D、V、S、T、N、Y、P)包含酰胺形式和酸形式，除非通过-NH₂或-OH来具体说明。

本文公开的精氨酸酶肽片段通过标准肽合成(例如固相肽合成(SPPS))来制备。SPPS是实验室中合成肽的标准方法。SPPS允许合成难以在细菌中表达的天然肽，掺入非天然氨基酸、肽/蛋白骨架修饰和合成由D氨基酸组成的D蛋白。用可在其上搭建肽链的功能单元(“接头”)处理小孔珠。肽将与珠保持共价连接，直至通过试剂(例如无水氟化氢或三氟乙酸)从珠上裂解。因此，肽“固定”在固相上并在过滤过程中被保留，而液相试剂和合成副产物被冲走。SPPS的一般原理是脱保护-清洗-偶联-清洗的重复循环之一。固相连接的肽的游离N端胺偶联至单一N脱保护的氨基酸单位。该单位之后被脱保护，暴露出新的N端胺，其上可连接其他氨基酸。这种技术的优势部分在于能够在每次反应之后进行清洗循环，除去过量的试剂，所有生长中的目的肽保持与不溶性树脂的共价连接。主要使用两种形式的SPPS——Fmoc和Boc。不同于核糖体蛋白质合成，固相肽合成以C端至N端的方式进行。氨基酸单体的N端被这两组中任一组保护并被添加到脱保护的氨基酸链中。对于这两种技术而言，皆可获得自动合成仪，尽管许多研究组继续手动进行SPPS。此外，本领域技术人员理解，在上文和下文所述的方法中，中间化合物的功能基团可能需要被保护基团保护。

当本文公开的肽化合物、核酸、载体、宿主细胞和药物组合物用于上述治疗时，将有效量的至少一种化合物给予至需要所述治疗的哺乳动物。

本文使用的氨基酸通过本领域技术人员已知的单字母或三字母代码来识别，为方便起见，示于以下表格中：

氨基酸，单字母和三字母代码

本文使用的术语“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”意指为了减轻病况(例如疾病或病症)的目的而管理和护理患者。该术语意欲包括针对患者所患的给定病况的全部范围的治疗，例如给予活性化合物以减轻症状或并发症，以延缓疾病、病症或病况的发展，以减轻或缓解症状和并发症，和/或以治愈或清除疾病、病症或病况以及预防病况，其中预防应理解为为了减轻疾病、病况或病症的目的而管理和护理患者并且包括给予活性化合物以预防症状或并发症的发生。治疗可以以急性方式或以慢性方式进行。待治疗的患者优选为哺乳动物，特别是人，但是还可包括动物，例如狗、猫、牛、猴、猿、绵羊和猪。

本文使用的术语“治疗有效量即的本发明的肽化合物或本文公开的肽片段意指足以治愈、缓解或部分控制给定疾病及其并发症的临床表现的量。足以实现这一目的的量被定义为“治疗有效量”。用于各目的的有效量取决于疾病或损伤的严重性以及受试者的体重和整体状态。应理解，使用常规实验，通过构建数值矩阵并测试矩阵中不同的点——这在受训的医生或兽医的常规技术能力范围内，可确定适合的剂量。

另一方面，本公开内容涉及药物组合物，其包含本发明的肽化合物(例如肽片段)和任选的可药用的添加剂(例如载体或赋形剂)。

如本文使用的“可药用的添加剂”意欲非限制性地包括载体、赋形剂、佐剂、着色剂、芳香剂、防腐剂等，技术人员配制本发明的化合物时将考虑所述添加剂，从而制备药物组合物。

可用于本发明的组合物的佐剂、稀释剂、赋形剂和/或载体在与所述药物组合物的肽化合物、肽片段、核酸、载体、或宿主细胞和其他成分相容的意义上必须是可药用的，并且对其接受者无毒。优选地，所述组合物不包含可导致不良反应(例如过敏反应)的任何物质。可用于本发明的药物组合物的佐剂、稀释剂、赋形剂和载体是本领域技术人员公知的。

佐剂是任何这样的物质，即其混合到组合物中将增加或以其他方式改变所述组合物引起的免疫应答。广义上的佐剂是促进免疫应答的物质。佐剂还可优选具有储库效应，即它们还使活性剂从给药位置缓慢持续地释放。佐剂的一般性讨论在Goding，MonoclonalAntibodies：Principles&Practice(第二版，1986)61-63页中有描述。

佐剂可选自AlK(SO₄)₂，AlNa(SO₄)₂，AlNH₄(SO₄)，二氧化硅，明矶，Al(OH)₃，Ca₃(PO₄)₂，高岭土，碳，氢氧化铝，胞壁酰二肽，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-DMP)，N-乙酰-去甲胞壁酰(nornuramyl)-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11687，还称为nor-MDP)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′2′-二棕榈酰-sn-丙三氧基-3-羟磷氧基)-乙胺(CGP 19835A，还称为MTP-PE)，于2％鲨烯/吐温-80.RTM.乳液中的RIBI(MPL+TDM+CWS)，脂多糖及其多种衍生物，包括脂质A、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂、Merck佐剂65，多核苷酸(例如多IC和多AU酸)，来自结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的蜡D，存在于短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)和布鲁氏菌属(Brucella)成员中的物质，Titermax，ISCOMS，Quil A，ALUN(参见US 58767和5,554,372)，脂质A衍生物，霍乱毒素衍生物，HSP衍生物，LPS衍生物，合成肽基质或GMDP，白细胞介素1，白细胞介素2，Montanide ISA-51和QS-21。也表明多种皂素(saponin)提取物适于作为免疫原性组合物中的佐剂。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)也可用作佐剂。

用于本发明的优选佐剂包括基于油/表面活性剂的佐剂，例如Montanide佐剂(可获自比利时Seppic)，优选Montanide ISA-51。其他优选佐剂为基于细菌DNA的佐剂，例如包含CpG寡核苷酸序列的佐剂。其他优选佐剂为基于病毒dsRNA的佐剂，例如poly I：C。GM-CSF和Imidazochiniline也是优选佐剂的实例。

佐剂最优选Montanide ISA佐剂。Montanide ISA佐剂优选Montanide ISA 51或Montanide ISA 720。

在Goding，Monoclonal Antibodies：Principles&Practice(第二版，1986)，61-63页中，还记载了，当目的抗原分子量小或免疫原性差时，推荐偶联至免疫原性载体(carrier)。本发明的免疫治疗组合物的肽化合物、肽片段、核酸、载体(vector)或宿主细胞可偶联至载体。载体可独立于佐剂存在。载体的功能可以是，例如，增加肽化合物、肽片段、核酸、载体或宿主细胞的分子量以增强活性或免疫原性，赋予稳定性，提高生物活性，或延长血清半衰期。此外，载体可辅助将多肽或其片段呈递到T细胞。因此，在免疫原性组合物中，多肽或其片段可与载体(例如下文所述的那些)联合。

载体可以是本领域技术人员已知的任何适合的载体，例如蛋白或抗原呈递细胞，例如树突细胞(DC)。载体蛋白包括钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)，血清蛋白如转铁蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵白蛋白，免疫球蛋白，或激素如胰岛素或棕榈酸。或者，载体蛋白可以是破伤风类毒素或白喉类毒素。或者，载体可以是右旋糖苷如琼脂糖。载体必须是人生理上可接受的及安全的。

免疫治疗组合物可任选地包含可药用的赋形剂。赋形剂在与所述组合物的其他成分相容的意义上必须是“可接受的”并且对其接受者无毒。辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于赋形剂中。这些赋形剂和辅助物质通常是药剂，其在接受组合物的个体中不引起免疫应答并且可在不产生过度毒性的情况下给予。可药用的赋形剂包括但不限于液体剂，例如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油和乙醇。其中还可包含可药用的盐，例如无机酸盐类，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；有机酸盐类，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。可药用的赋形剂、载体和辅助物质的充分讨论参见Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)。

可以以适于推注给药或适于连续给药的形式制备、包装或销售免疫治疗组合物。可以以单位剂量形式(例如以安瓿瓶)或以包含防腐剂的多剂量容器来制备、包装或销售可注射组合物。组合物包括但不限于悬浮剂、溶液剂、油性或水性媒介物中的乳剂、糊剂和可植入缓释或生物可降解制剂。在组合物的一个实施方案中，以干燥形式(例如粉末或颗粒)提供活性成分，使用适合的媒介物(例如无菌无热原的水)来复原，之后给予经复原的组合物。可以以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式来制备、包装或销售组合物。该悬浮液或溶液可以根据已知的现有技术来配制，除活性成分以外可包含其他成分，例如本文所述的佐剂、赋形剂和辅助物质。可以使用无毒、肠外可接受的稀释剂或溶剂(例如水或1，3-丁二醇)来制备这类无菌可注射制剂。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于Ringer′s溶液、等渗氯化钠溶液和不易挥发的油类(例如合成的甘油单酯或甘油二酯)。

其他适用的组合物包括这样的组合物，其包含微晶形式、以脂质体制剂、或作为生物可降解聚合物体系的组分的活性成分。用于缓释或植入的组合物可包括可药用的聚合材料或疏水材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶性聚合物或微溶性盐。或者，组合物的活性成分可被封装、吸收至微粒载体或与微粒载体交联。适合的微粒载体包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物，以及衍生自聚(丙交酯)和聚(丙交酯-乙醇酸交酯)的PLG微粒。参见，例如Jeffery et a1.(1993)Pharm.Res.10：362-368。还可使用其他微粒体系和聚合物，例如，聚合物如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺，以及这些分子的缀合物。

如上文所提及的，本文公开的组合物特别是免疫治疗组合物，除本文公开的化合物以外还包含至少一种可药用的佐剂、稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方案中，药物组合物包含1至99重量％的所述至少一种可药用的佐剂、稀释剂、赋形剂和/或载体和1至99重量％的本文公开的化合物。活性成分和可药用的佐剂、稀释剂、赋形剂和/或载体的组合的量可组成不超过组合物(特别是药物组合物)的100重量％。

在一些实施方案中，仅一种本文公开的化合物用于上述目的。

在一些实施方案中，两种或更多种本文公开的化合物用于组合用于上述目的。

包含本文所述的化合物的组合物，特别是免疫治疗组合物，可适用于口服、静脉内、局部、腹膜内、鼻、口腔、舌下或皮下给药，或适用于以例如气雾剂或气悬细粉的形式经呼吸道给药。因此，药物组合物可以是例如片剂、胶囊、粉末、纳米颗粒、晶体、无定型物质、溶液、透皮贴剂或栓剂的形式。

所述方法的其他实施方案在本文实验部分描述，每种单独的方法以及每种起始物质构成实施方案，其可组成实施方案的一部分。

上述实施方案应当被视为提及本文所述的任一方面(例如“治疗方法”、“免疫治疗组合物”、“用作药物的肽化合物”或“用于方法中的肽化合物”)以及本文所述的任一实施方案，除非具体说明实施方案涉及本发明的某一方面或某些方面。

本文引用的所有参考文献，包括公开出版物、专利申请和专利以引用的方式纳入本文，其引用程度等同于单独且具体指明各参考文献以引用的方式纳入本文并且被全文阐述。

本文使用的所有标题和副标题仅为方便起见，不应当理解为以任何方式限制本发明。

本发明涵盖了上述要素全部可能变化形式的任何组合，除非本文另外说明或明显与上下文矛盾。

应理解，所公开的产物和方法的不同应用可被改变以适应本领域的具体需求。还应理解，本文使用的术语仅以描述本发明的具体实施方案为目的，并且不意欲进行限制。

除在本说明书和所附权利要求中使用以外，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指代物，除非内容中另外明确说明。因此，例如，提及“一种肽”包括两种或更多种这类肽。

本文使用的“多肽”广义上指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或其他肽模拟物的化合物。因此，术语“多肽”包括短肽序列，还包括更长的多肽和蛋白。本文使用的术语“氨基酸即指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括D或L光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物，以及其任何可药用的盐。

本文使用的“受试者”包括任何哺乳动物，优选人。

本文记载的数值范围仅意欲作为单独提及每个落入该范围的单独数值的速记法，除非本文另外说明，并且每个单独的数值被纳入本说明书，如同其在本文中被单独记载。除非另外说明，本文提供的全部准确数值代表相应的近似数值(例如，关于具体因子或测量值，所提供的全部准确示例数值可被认为还提供了相应的近似测量值，如果合适，以“约”来修正)。

本文所述的全部方法可以以任何适合的次序进行，除非本文另外说明，或明显与上下文矛盾。

本文提供的任何或全部实施例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅意欲更好地阐述本发明，不对本发明的范围进行限制，除非另外说明。说明书中的语言不应当视为说明任何要素对本发明的实施是必需的，除非如此明确说明。

本文对专利文件的引用和纳入仅为方便起见，不表达对所述专利文件的有效性、专利性和/或可实施性的任何观点。

在本文中，关于一个要素或多个要素，使用术语如“包括”、“具有”、“包含”或“含有”来描述本发明的任何方面或实施方案意欲为“由……组成”、“基本上由……组成”或“基本包含”该具体要素或多个要素的本发明的类似方面或实施方案提供支持，除非另外说明或明显与上下文矛盾(例如，本文所述的包含具体要素的组合物应当理解为还描述了由该要素组成的组合物，除非另外说明或明显与上下文矛盾)。

本发明包括本文记载的主题的全部修改和等价物，直至适用的法律允许的最大程度。

方面

以下是本公开内容的一些其他方面：

1.精氨酸酶1的肽化合物，其选自：

a)SEQ ID NO 1的肽片段，其由8至321个氨基酸的连续序列组成，

b)与SEQ ID NO 1或a)的肽片段具有至少70％、80％、90％或95％同一性的功能性同源物，和

c)功能性类似物，其中SEQ ID NO 1或a)的肽片段中至少一个氨基酸被缺失、插入和/或置换，

其中a)、b)或c)中任一个的C端氨基酸还包含酰胺；

或其可药用的盐。

2.方面1的肽化合物，其选自：a)SEQ ID NO 1的肽片段，其由8至321个氨基酸的连续序列组成，其中C端氨基酸还包含酰胺；或其可药用的盐。

3.方面2的肽化合物，其中所述肽片段由8至300个氨基酸、8至250个氨基酸、8至200个氨基酸、8至150个氨基酸、8至120个氨基酸，例如10至100个氨基酸、20至80个氨基酸、30至60个氨基酸、40至50个氨基酸的连续序列组成。

4.方面2-3中任一项的肽化合物，其中SEQ ID NO 1的肽片段选自ARG(1-310)、ARG(1-301)、ARG(1-291)、ARG(11-322)、ARG(21-322)、ARG(30-322)、ARG(40-322)、ARG(11-310)、ARG(11-301)、ARG(11-291)、ARG(21-310)、ARG(21-301)、ARG(21-291)、ARG(30-310)、ARG(30-301)、ARG(30-291)、ARG(40-310)、ARG(40-301)和ARG(40-291)。

5.方面1-4中任一项的肽化合物，其中精氨酸酶活性与精氨酸酶1相比降低，优选降低至无活性，如通过精氨酸酶活性测定，例如精氨酸酶活性比色测定试剂盒(BioVision精氨酸酶测定#K755-100)所测量的。

6.方面2-5中任一项的肽化合物，其中所述连续序列包括选自SEQ ID NO 2-17中任一个的一个或更多个序列，例如选自SEQ ID NO 9的一个序列。

7.方面1-6中任一项的肽化合物，其中a)的肽片段、b)的功能性同源物、或c)的功能性类似物激活识别表达精氨酸酶1的细胞的T细胞。

8.方面7的肽化合物，其中所述激活是通过本文所述的ELISPOT测定来确定的。

9.编码前述方面中任一项的肽化合物的核酸，例如DNA或RNA。

10.包含方面9的核酸的载体，例如病毒载体。

11.包含方面10的载体的宿主细胞，例如哺乳动物细胞。

12.包含编码精氨酸酶1的无活性序列的核酸的载体，所述无活性序列选自：

a)SEQ ID NO 1的肽片段，其由8至321个氨基酸的连续序列组成，

b)与SEQ ID NO 1或a)的肽片段具有至少70％、80％、90％或95％同一性的功能性同源物，和

c)功能性类似物，其中SEQ ID NO 1或a)的肽片段中至少一个氨基酸被缺失、插入和/或置换，

其中a)、b)或c)中任一个的C端氨基酸还包含酰胺，其中所述核酸表达所述无活性序列，其中所述无活性序列包含至少1个免疫原性表位，例如选自SEQ ID NO 2-17的表位，通常所述表位选自SEQ ID NO 9。

13.一种组合物，其包含方面1-8中任一项的肽化合物，或方面9的核酸，或方面10或12的载体，或方面11的宿主细胞，任选地以及可药用的添加剂，例如载体或佐剂。

14.免疫治疗组合物，包括：

a)方面1-8中任一项的肽化合物，或方面9的核酸，或方面10或12的载体，或方面11的宿主细胞；和

b)佐剂；

其用作药物。

15.方面14的免疫治疗组合物，其用于治疗或预防疾病、病症或病况的方法中，所述疾病、病症或病况选自癌症，例如形成肿瘤的癌症疾病。

16.方面14-15中任一项的免疫治疗组合物，其中所述佐剂选自基于细菌DNA的佐剂、基于油/表面活性剂的佐剂、基于病毒dsRNA的佐剂、imidazochiniline、Montanide ISA佐剂。

17.试剂盒，包括：

a)方面14-16中任一项的免疫治疗组合物，和

b)包含至少一种第二活性成分的组合物，所述第二活性成分选自免疫刺激化合物，例如白细胞介素，例如IL-2和/或IL-21，抗癌剂，例如化疗剂，例如辅酶B12、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊立替康、来那度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、美法仑、巯基嘌吟、甲氨蝶呤、米托蒽醌、nivolumab、奥沙利铂、紫杉醇、pembrolizumab、培美曲塞、瑞复美、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

18.方面17的试剂盒，其中将提供的组合物同时或依序给予。

19.治疗临床病况的方法，所述临床病况的特征在于表达SEQ ID NO 1的精氨酸酶1，所述方法包括给予患有所述临床病况的个体有效量的方面1-8中任一项的肽化合物或方面9的核酸或方面10或12的载体或方面11的宿主细胞。

20.在癌症患者中刺激精氨酸酶1特异性T细胞，例如CD4和CD8 T细胞的方法，所述方法包括给予所述癌症患者有效量的方面1-8中任一项的肽化合物或方面9的核酸或方面10或12的载体或方面11的宿主细胞。

21.在癌症患者中抑制表达精氨酸酶1的细胞的免疫抑制功能的方法，所述方法包括给予所述癌症患者有效量的方面1-8中任一项的肽化合物或方面9的核酸或方面10或12的载体或方面11的宿主细胞。

22.方面1-8中任一项的肽化合物或方面9的核酸或方面10或12的载体或方面11的宿主细胞用于制备治疗或预防以表达精氨酸酶1为特征的癌症的药物的用途，所述药物例如免疫治疗组合物或疫苗。

23.方面1-8中任一项的肽化合物或方面9的核酸或方面10或12的载体或方面11的宿主细胞用于治疗或预防癌症的方法，其与其他癌症疗法同时或依序给予，所述其他癌症疗法例如细胞因子疗法、T细胞疗法、NK疗法、免疫系统检查点抑制剂、化学疗法、放射疗法、免疫刺激物质、基因疗法、抗体和树突细胞。

24.方面23的肽片段、核酸、载体或宿主细胞，其中所述检查点阻断抗体选自辅酶B12、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊立替康、来那度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、美法仑、巯基嘌吟、甲氨蝶呤、米托蒽醌、Nivolumab、奥沙利铂、紫杉醇、Pembrolizumab、培美曲塞、瑞复美、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

本发明进一步通过以下实施例来说明，然而，以下实施例不应当理解为限制本发明的范围。上文描述和以下实施例中公开的特征可单独地或以其任意组合作为以其多种形式实现本发明的材料。

实施例

引言

以下解释了计划和实施一些以下实验的基本原理：

除了来自精氨酸酶1的新的免疫原性表位，和针对所述新的免疫原性表位的强免疫应答以及检测到的针对精氨酸酶1的若干肽片段的频繁免疫应答之外，本发明的发明人还将鉴定T细胞是否同样识别精氨酸酶。此外，将鉴定精氨酸酶的免疫原性表位。使用反向免疫学方法，将鉴定可能的MHC I类结合基序，然后合成候选肽。随后，将建立与相应的MHC等位基因的真正结合。在鉴定I类结合肽化合物之后，将在ELISPOT测定中检验针对这些肽的肽特异性T细胞的细胞因子释放，以检验特异性T细胞是否存在于癌症患者以及健康捐赠者的外周PBMC中。在计划的研究中，四聚体的MHC/肽复合物将被用作通过流式细胞术来研究外周血中T细胞反应性的其他方式。最后，四聚体的MHC/肽复合物将用于直接从患者血液或肿瘤浸润的淋巴结中分离特异性T细胞。将使用它来确定特异性T细胞的功能性能力。

此外，发明人将研究由MHC II类分子呈递的新表位，因为CD4+ T细胞在产生并维持抗原特异性细胞免疫应答和体液免疫应答中发挥关键作用。在ELISPOT测定中，使用跨越整个蛋白序列的18-mer重叠合成肽来呈递CD4+ T细胞。通过用肽反复刺激，产生肽特异性CD4+ T细胞克隆。此外，使用一组部分组织相容的EBV-B细胞系和MHC II类特异性抗体，鉴定HLA II类限制性因子。最后，分析肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)培养物针对CD4和CD8肽表位的反应性，揭示关于关键的体内靶标的重要信息。

精氨酸酶在免疫系统中发挥主要作用，可以预测这类T细胞参与一般性免疫调控。这些研究的其他部分旨在分析精氨酸酶特异性T细胞的作用，因此可能还在免疫调控中起作用。首先，检查精氨酸酶特异性T细胞是否能够通过清除表达精氨酸酶的调控细胞来产生免疫性，从而抑制和/或延迟局部免疫抑制。为了检验精氨酸酶T细胞可能的免疫作用，检查精氨酸酶特异性T细胞的存在或这类T细胞被精氨酸酶衍生肽的活化是否可促进针对其他抗原的T细胞和/或B细胞应答。调节细胞促进给定免疫应答的强度和持续时间。因此，可以以若干直接和间接的方式来介导精氨酸酶特异性T细胞对其他免疫细胞的任何“支持”作用。在这方面，检查必需氨基酸的水平、Tregs的频率以及产生IL-17的细胞的频率。此外，检查精氨酸酶特异性T细胞对不同的细胞因子(包括INF-γ、IL-6、TNF-α以及IL-10和TGF-β)的总体产生的影响。精氨酸酶特异性T细胞的另一种可能的作用可通过精氨酸的代谢物来介导。此外，将通过FACS以及分析这类T细胞的细胞因子特征来描述精氨酸酶特异性T细胞的表型。此外，将报告共刺激分子的表达(FACS)，效应细胞和APC的直接或间接灭杀作用(细胞毒性测定)。使用来自癌症患者的包含大量T细胞的去除了白细胞的样品，可以利用直接从捐赠者分离的精氨酸酶特异性T细胞的天然亚组来进行实验。

肽

用于这些实验的序列完全示于以下表A(参见题为“序列”的部分)。表A中通过SEQID NO、通过名称、或通过提及在精氨酸酶1的全长序列内各肽序列的起始和终止位置来描述肽。每种描述可互换使用。例如，SEQ ID NO：34的肽或者可通过名称Arg1-17来提及，或者可提及为Arg161-190(给出起始位置161和终止位置190)。基于上下文，每种情况下的预期的提及是清楚的。SEQ ID NO：9的肽可另外称为ArgShort。

通过PepScan(荷兰)合成20-mer和22-mer肽并将其以10mM的浓度溶解于DMSO中。通过Schafer-N ApS(丹麦)合成30-mer和50-mer肽并将其以10mM的原液浓度溶解于DMSO中。通过KJ Ross-Petersen ApS(丹麦)合成更短的肽并将其溶解于无菌水中至原液浓度为2mM。合成肽的纯度＞80％。

实施例1

患者，方案和方法

患者材料：

本项目基于对来自黑色素瘤、肾细胞癌和卵巢癌患者的血液和肿瘤病变的分析。在Herlev医院进行血液和肿瘤样品采集。在终止任何类型的抗癌治疗之后最少4周提取血液样品。使用Lymphoprep^TM(Alere AS，目录号1114547)分离法分离PBMC，进行HLA类型化并冷冻于含10％DMSO(Sigma-Aldrich，目录号D5879-100ML)的FCS中。按照当地的伦理要求，在CCIT(癌症免疫治疗中心)立即对材料进行处理。所有患者只有在签署书面告知同意书之后才能参与，伦理委员会已批准该项目。

酶联免疫斑点(ELISPOT)：

使用“ELISPOT”技术，可筛选大量肽抗原的T细胞识别，尽管可利用相对较少的T细胞。“ELISPOT”技术利用的事实是，T细胞在TCR衔接和随后的信号传导之后合成细胞因子，例如IFN-γ。所述方法可用于分析任何选择的细胞因子的分泌——在我们实验室中，我们通常使用IFN-γ、TNF-α、IL-10、颗粒酶B以及穿孔蛋白——ELISPOT分析。通过使用ELISPOT读数仪完成标准化定量(IMMUNOSPOT，CTL分析仪LLC http：//www.immunospot.com/)。

细胞毒性测定

如别处所述[3]，对CTL介导的细胞毒性进行常规的⁵¹Cr-释放测定。靶细胞为T2细胞(ATCC)，HLA-A2⁺黑色素瘤细胞系(FM3和FM93)。

FACS：

在过去，已开发了新的强FACS技术——特别是对于免疫功能和特异性研究。在这方面，肽/HLA复合物容易地用于分析肽特异性T细胞的频率。可分离特异性T细胞并使其在体外扩增。对于胞内染色，用精氨酸酶衍生肽刺激细胞，对于表面标记物，我们使用4μlNIR、10μl CD4PerCP、2μl CD8Pacific Blue和10μl CD3FITC，对于胞内染色，我们使用与PE-Cy7或APC缀合的2μl抗TNF-a和抗IFN-g抗体。在前述方法之后，进行清洗、透化和染色步骤[4]。在FACSCANTO II(BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞)上进行流式细胞术分析。

结果：

设计了衍生自精氨酸酶1的16种肽。这些肽在本文中称为Arg 1至Arg 16(SEQ IDNO：12至17)。这些肽的全序列示于以下表A(参见题为“序列”的部分)。在ELISPOT中检验所述肽中的15种(Arg1至Arg15)。我们使用IFN-γELISPOT分泌测定，检查了来自6名黑色素瘤患者的外周血单核细胞(PBMC)中存在的针对Arg衍生肽的特异性T细胞应答。检测到针对Arg2(SEQ ID NO3)、Arg3(SEQ ID NO 4)、Arg5(SEQ ID NO 6)、Arg 6(SEQ ID NO7)、Arg7(SEQ ID NO 8)、Arg8(SEQ ID NO 9)、Arg9(SEQ ID NO10)、Arg10(SEQ ID NO11)、Arg11(SEQ ID NO12)、Arg14(SEQ ID NO15)、Arg15(SEQ ID NO 16)的强应答。图1示例说明了Arg特异性T细胞应答。特别地，更详细地检验了Arg8(SEQ ID NO 9)。产生了针对Arg8的患者PBMC宿主免疫应答。图2为来自6名癌症患者的针对精氨酸酶衍生的Arg 8肽的免疫应答(特异性细胞/3x10e5细胞)。在患者PBMC中频繁检测到非常强的应答。

我们接下来检查了跨越SEQ ID NO 1的全部精氨酸酶序列的重叠的20mer重叠肽。因此，30x20mer肽和1x22mer跨越所述序列的全长。这些肽的全序列示于以下表A(参见题为“序列”的部分)并对应于SEQ ID NO：18至48。我们使用上述肽以检测来自3名癌症患者的PBMC中的免疫应答，如图3所示。检测到针对若干肽，特别是名称为以下的长肽的频繁免疫应答：Arg1-23、Arg1-18、Arg1-27、Arg1-17、Arg1-19、Arg1-12、Arg1-20、Arg1-4、Arg1-1、Arg1-7、Arg1-14、Arg1-15、Arg1-6、Arg1-16、Arg1-22、Arg1-29。此外，我们示出了来自健康个体的PBMC中针对这些长肽的应答(图4)。

通过标准铬释放测定检验，CD8阳性培养物能够杀死表面荷载Arg8的靶细胞，如图5所示。使用标准铬释放测定，还证明精氨酸特异性T细胞杀死精氨酸酶阳性癌症(黑色素瘤)细胞系FM3和FM93，如图6所示。在该实验中，在不同的效靶比下将精氨酸酶特异性T细胞与Cr标记的黑色素瘤细胞系FM3或FM93孵育4h。这两种细胞系都表达胞内精氨酸酶。

接下来，我们检查了CD4 T细胞在体外刺激后是否能够识别精氨酸酶。因此，我们选择使用胞内细胞因子染色分析了来自具有针对Arg8的应答的患者的PBMC。尽管该方法的灵敏度低于ELISPOT，它允许阐明哪些免疫细胞分泌在ELISPOT中鉴定的细胞因子。因此，我们用Arg8肽刺激来自癌症患者的CD4 T细胞5次。接下来，在体外用Arg8肽刺激5次之后，我们进行针对T细胞培养物的INF(PE-Cy7A)和TNF-α(APC-A)的胞内染色。将培养物用或不用Arg8肽刺激，如图7所示。类似的结果参见图8。

结论：CD8和CD4 T细胞都能够识别靶细胞表面的精氨酸酶衍生肽。跨越精氨酸酶1的第161-190位的区域似乎具有特别的免疫原性。该区域在本文中可称为热点。

实施例2

材料和方法

其他肽刺激和ELISPOT测定

将来自健康捐赠者或癌症患者的PBMC用80μg精氨酸酶衍生肽和120U/ml IL-2(Peprotech，英国伦敦，目录号200-02)刺激一周。然后将4-6x10⁵PBMC放置在预包被了IFN-γ捕获Ab(Mabtech，目录号3420-3-1000)的ELISPOT板(MultiScreen MAIP N45的硝酸纤维素铺底的96孔板；Millipore，目录号MSIPN4W50)的底部并添加1-10μg精氨酸酶衍生肽。准备平行两份或三份来自每名患者和捐赠者的PBMC，用于肽和对照刺激。在存在抗原的情况下将细胞在ELISPOT板中孵育14-16小时，然后冲洗并添加第二生物素化Ab(Mabtech，目录号3420-6-1000)。孵育2h之后，洗去未结合的第二抗体并添加链霉亲和素缀合的碱性磷酸酶(AP)(Mabtech，目录号3310-10)，放置1小时。接下来，洗去未结合的缀合酶，并通过添加BCIP/NBT底物(Mabtech，目录号3650-10)使测定显色。使用Immunospot软件v5.1，在CTLImmunoSpot S6Ultimate-V分析仪上分析经显色的ELISPOT板。将应答计算为用精氨酸酶1肽刺激的孔中和对照孔中斑点平均数之间的差异。

HLA阻断

为了阻断HLA I类和II类，在室温下将PBMC用2μg/ml的阻断抗体：抗人HLA-DR、DP、DQ抗体克隆Tü39(Biolegend，目录号361702)或抗人HLA-ABC抗体克隆w6/32(Dako，Agilent)预孵育20分钟，然后添加肽。

精氨酸酶特异性T细胞培养物的建立

通过用经辐照的荷载ArgShort(SEQ ID NO 9)肽的自体DC或PBMC来刺激癌症患者PBMC，建立精氨酸酶特异性T细胞。第二天添加IL-7和IL-12(PeproTech，英国伦敦，目录号200-07-10和200-12)。每8天用荷载ArgShort肽、经辐照的自体DC，之后用荷载ArgShort肽、经辐照的自体PBMC刺激培养物。肽刺激后第一天添加IL-2(PeproTech，英国伦敦，目录号200-12)。5次刺激之后，使用TNF-α细胞富集试剂盒(MiltenyiBiotec，目录号130-091-269)来富集精氨酸酶特异性T细胞。

树突细胞的产生

通过在37℃下附着于培养皿，从PBMC中产生DC，持续1-2小时。在IL-4(250U/ml)和GM-CSF(1000U/ml)(Peprotech，英国伦敦，目录号200-04和300-03-100)存在下，将附着的单核细胞在补充有10％FCS的RPMI-1640中培养6天。通过添加IL-β(1000U/ml)、IL-6(1000U/ml)、TNF-α(1000U/ml)(Peprotech，英国伦敦，目录号200-01B、200-06和300-0IA)和PGE2(1μg/ml)(Sigma Aldrich，目录号P6532)使DC成熟。

B细胞分离

将来自患者的PBMC解冻并过夜放置。使用泛B细胞分离试剂盒(Miltenyi BiotecInc.，目录号130-101-638)，根据制造商的说明，从患者PBMC中分离B细胞。

体外转录的mRNA的产生

合成编码精氨酸酶的cDNA(登录号NM_000045)，并使用5’XhoI/3’PacI限制性位点(Geneart/Life Technologies)将该cDNA克隆到pSP73-SphA64(由杜克大学医学中心，Durham，NC的E.Gilboa博士友情提供)中，或使用5’BamHI/3’BamHI限制性位点将该cDNA克隆到HLA II类靶向质粒pGEM-sig-DC.LAMP(由布鲁塞尔自由大学医学院K.Thielemans博士友情提供)中。将这两种质粒用SpeI线性化，然后作为DNA模板用于体外转录。

电穿孔

对于mRNA实验，使用之前所述的电穿孔参数，将树突细胞和B细胞用精氨酸酶mRNA或编码GFP或神经生长因子受体(NGFR)的对照mRNA转染。简言之，将细胞清洗两次，悬浮于Opti-MEM培养基(Invitrogen，目录号11058021)并调节至最终细胞密度4-7x10⁶细胞/ml。细胞悬浮物(200-300μl)在冰上预孵育5分钟并添加5-10μgmRNA。然后将细胞悬浮物转移至4mm空隙电穿孔杯中并进行电穿孔。将经电穿孔的细胞在含5％CO₂的湿润气氛中进一步孵育，并按照说明进行实验分析。24小时之后，通过GFP或NGFR转染的细胞的FACS分析来测定电穿孔率。

流式细胞分析

在FACSCanto^TM II(BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞)上进行流式细胞分析。在用20-mer肽刺激细胞5小时或用30-mer肽刺激细胞8小时(BD GolgiPlug^TM目录号555029，第一小时之后添加)之后，进行细胞培养物的胞内染色。然后对细胞的表面标记物进行染色，然后冲洗并使用固定/透化和透化缓冲液(eBioscience，目录号00-5123-43)，根据制造商的使用说明进行透化。所使用的抗体：IFNγ-APC(目录号341117)、TNFα-BV421(目录号562783)、CD4-FITC(目录号347413)、CD8-PerCP(目录号345774)(全部来自BDBiosciences)。使用FVS510(564406，BD Biosciences)，根据制造商的使用说明，对死亡的细胞进行染色。

结果

针对精氨酸酶1的自发免疫应答

我们将全部精氨酸酶1蛋白序列分成相互重叠的20个氨基酸长的肽，产生覆盖整个序列的31种肽的文库(SEQ ID NO 18-48)。文库中的每种肽与其后的肽的前10个氨基酸重叠。使用该精氨酸酶肽文库和IFNγELISPOT测定，我们接下来筛选来自黑色素瘤患者和健康捐赠者的PBMC的自发性应答(图9A和9B)。将PBMC用3-4种相邻的20-mer精氨酸酶文库肽的混合物和低剂量的IL-2(120U/mL)刺激一周。然后将其用于IFNγ ELISPOT测定以筛选单独地针对每种20-mer肽的应答。以下8种肽在癌症患者PBMC中显示出最高和最充分的应答(通过提及起始位置和终止位置来标识肽)：Arg(31-50)、Arg(111-130)、Arg(161-180)、Arg(171-190)、Arg(181-200)、Arg(191-210)、Arg(221-240)和Arg(261-280)。在这些重叠肽中，Arg(161-180)、Arg(171-190)、Arg(181-200)和Arg(191-210)跨越50个氨基酸长的区域，该区域被认为是热点区，因为几乎所有患者都具有针对一种或更多种这些肽的应答(图9A)。使用IFNγELISPOT，将经选择的8种肽进一步用于筛选来自8名健康捐赠者的PBMC中针对精氨酸酶1的自发免疫应答。如同在来自癌症患者的PBMC中，来自健康捐赠者的PBMC显示出针对热点区的4种精氨酸酶肽的最高IFNγ应答(图9B)。

黑色素瘤TIL中的精氨酸酶1应答

为了研究癌症肿瘤浸润的淋巴细胞中可能存在的精氨酸酶特异性T细胞，我们筛选了来自8名黑色素瘤患者的TIL中针对精氨酸酶1衍生肽的应答。为了该目的，我们针对响应于肽刺激而释放的IFNγ和TNFα进行了胞内染色。将TIL解冻并在无IL-2的情况下放置过夜，然后用三种热点免疫原性区20-mer肽(通过提及起始位置和终止位置而标识肽)：Arg(161-180)、Arg(171-190)、Arg(181-200)刺激5小时。在一种TIL培养物中，响应于所有三种精氨酸酶肽的刺激，CD4+ T细胞释放IFNγ(图10A)，表明精氨酸酶-1热点区可能包含许多CD4+ T细胞表位。与Arg(161-180)相比，Arg(171-190)和Arg(181-200)的产IFNγ细胞的百分比更高，针对Arg(181-200)的应答几乎是针对Arg(161-180)的应答的两倍。未观察到从CD8+ T细胞释放IFNγ或TNFα。

精氨酸酶热点区被CD4+和CD8+ T细胞识别

因为我们频繁地观察到针对来自热点区的精氨酸酶1肽的应答，我们接下来分析了是否可使用覆盖相同序列的更长的肽来替换4种20-mer。与20-mer相比，覆盖全部热点区的50-mer肽引起较低的应答(数据未示出)。我们之后将精氨酸酶1热点区分成两种30-mer肽，其重叠10个氨基酸(通过提及起始位置和终止位置而标识肽)：Arg(161-190)和Arg(181-210)。这些30-mer肽用于检查在经选择的来自癌症患者和健康捐赠者的PBMC中的应答，所述PBMC之前表现出针对20-mer热点肽的应答。在存在IL-2的情况下，将所述PBMC用Arg(161-190)或Arg(181-210)刺激一周，之后用于IFNγELISPOT。来自癌症患者和健康捐赠者的PBMC表现出针对Arg(161-190)的高应答(图10B)，这与针对20-mer肽的应答相当。一些PBMC还表现出针对30-mer Arg(181-210)肽的应答(图10C)；然而，这些应答低于针对覆盖相同蛋白区域的重叠的20-mer肽的应答(图10B)。

为了研究哪种类型的T细胞与热点区的肽表位反应，我们针对来自两名健康捐赠者和一名癌症患者的PBMC中的IFNγ和TNFα释放进行了胞内染色，所述PBMC在IFNγELISPOT中已表现出针对Arg(161-190)肽的应答。用Arg(161-190)孵育8小时之后，我们检测了CD4+ T细胞的TNFα释放(图11A)。我们还检测到了一些样品中CD8+ T细胞的较小的释放(数据未示出)，表明精氨酸酶1热点区存在HLA I类和II类表位。阻断HLA I类或II类表达部分阻断了响应于Arg(161-190)肽刺激的IFNγ释放，进一步证明Arg(161-190)包含CD4+和CD8+ T细胞表位(图11B)。

通过用DC和PBMC重复刺激来自黑色素瘤患者的PBMC，我们产生了精氨酸酶特异性CD4+ T细胞培养物，所述DC和PBMC荷载位于热点区的最小精氨酸酶肽(ArgShort)。在IFNγELISPOT(图11C，左)和胞内染色(图11C，右)中，针对所述最小精氨酸酶表位的特异性T细胞培养物还识别30-mer Arg(161-190)肽。然而，覆盖整个热点区的50-mer肽未被识别。用Arg(161-190)肽刺激8小时之后，胞内染色揭示出从CD4+ T细胞中释放TNFα。

依赖于精氨酸酶1表达的T细胞识别

为了评估精氨酸酶特异性CD4+ T细胞识别产生精氨酸酶1的细胞并对其产生反应的能力，我们用编码精氨酸酶1蛋白的mRNA转染自体树突细胞和B细胞。用编码精氨酸酶1mRNA的两种不同的构建体转染自体DC。这些构建体之一包含融合至DC-LAMP信号序列的精氨酸酶1序列，所述信号序列将蛋白靶向至溶酶体区室，因此指引该蛋白趋向II类呈递。在无IL-2的情况下，将来自两名不同的黑色素瘤患者的精氨酸酶特异性CD4+ T细胞培养物放置24小时，然后用于具有经电穿孔的自体DC或B细胞的IFNγELISPOT。我们观察到，与Mock对照相比，针对用精氨酸酶1mRNA转染的DC和B细胞的反应性更高(图12A-D)。与Mock对照和精氨酸酶1mRNA两者相比，针对用精氨酸酶-DC-LAMP转染的DC的应答甚至更高(图12E)。24小时之后，我们通过表达GFP/NGFR的细胞的FACS分析检查了DC的电穿孔率，发现＞90％的转染率。

结论

这些实验确认，在癌症患者和健康捐赠者中，跨越精氨酸酶1的第161至190位的区域具有特别的免疫原性，产生CD4和CD8阳性T细胞应答。所述区域可包括多个HLA I类和II类限制。衍生自该区域的肽在针对精氨酸酶1的疫苗中特别有效。预期这类疫苗将具有癌症治疗益处。

实施例3——体内实验

用于体内实验的肽的设计

为了设计适用于小鼠接种实验的肽，将鼠精氨酸酶1(SEQ ID NO：59)的序列与SEQID NO：1的人精氨酸酶1序列比较。参见图13中所示的比对，其证明所述序列具有高度相似性。在上述实施例中所述的人精氨酸酶1的热点区，相似性水平非常高，即对应于SEQ IDNO：1的第161-210位的区域——这50个氨基酸的区域在图13的两个序列中用粗体表示。该区域和鼠精氨酸酶1的对应区域的比对也如以下所示：

hArgl：

GFSWVTPCISAKDIVYIGLRDVDPGEHYILKTLGIKYFSMTEVDRLGIGK(SEQ ID NO：52)

mArg1：

GFSWVTPCISAKDIVYIGLRDVDPGEHYIIKTLGIKYFSMTEVDKLGIGK(SEQ ID NO：57)

50个氨基酸中仅有2个残基不同，以粗体和下划线表示。人序列中的亮氨酸在小鼠中被替换为高度相似的脂肪族氨基酸异亮氨酸，人序列中的精氨酸在小鼠中被替换为类似的碱性赖氨酸。这两个变化都是保守的。因此，在人和小鼠之间热点区是高度保守的。

考虑到上述相似性，可确定需要相对较少的变化以产生之前实施例中所检验的人肽的鼠类似物。因此，所使用的肽如下所示：

-GFSWVTPCISAKDIVYIGLR(SEQ ID NO：34)

ARG17是人精氨酸酶1(SEQ ID NO：1)的第161-180位的序列。鼠精氨酸酶1的对应区域是相同的。(在之前的实施例中还可互换地称为ARG1-17和ARG(161-180))。

-DVDPGEHYILKTLGIKYFSM(SEQ ID NO：36)

ARG1-19是人精氨酸酶1(SEQ ID NO：1)的第181-200位的序列。鼠精氨酸酶1的对应区域在单一位置上不同(粗体加下划线的L在鼠序列中被替换为I)。(在之前的实施例中还可互换地称为ARG(181-200))。

-KDIVYIGL(SEQ ID NO：53)

mARG1是人精氨酸酶1(SEQ ID NO：1)的第172-179位的序列。鼠精氨酸酶1的对应区域是相同的。

-LGIKYFSM(SEQ ID NO：54)

mARG2是人精氨酸酶1(SEQ ID NO：1)的第193-200位的序列。鼠精氨酸酶1的对应区域是相同的。

-KTLGIKYFSMTEVDKLGIGK(SEQ ID NO：56)

mARG20是鼠精氨酸酶1(SEQ ID NO：59)的第191-210位的序列。人精氨酸酶1的对应区域为SEQ ID NO：37，并且在单一位置上不同(粗体加下划线的K在人序列中被替换为R)。

C57BL/6和Balb/c小鼠的肽接种

动物皮下接种于DMSO/H₂O中的100μg肽，其为含弗氏不完全佐剂(IFA)或montanide的1∶1乳液。IFA+DMSO/H₂O用作对照疫苗。在第0天和第7天进行接种。为了随后分析针对特异性肽的免疫应答，在第14天将小鼠处死并采集脾和引流淋巴结(dLN)。

肽特异性应答的ELISPOT分析

对鼠免疫细胞进行ELISPOT分析。通过流经细胞滤器，从脾或dLN中制备单细胞悬浮液。裂解红血细胞之后，将0.9x10E6细胞/孔接种到包被了抗IFNγ抗体的ELISPOT板。将目的肽添加到指定孔种并将细胞与肽过夜孵育。第二天，除去细胞，清洗板并与生物素化的监测抗体一起孵育。最后，添加链霉亲和素-ALP和底物之后，出现可见斑点。每个斑点对应于单个的产IFNγ的细胞。在Immunospot分析仪中分析板，并标记为扣除背景的斑点/0.9x10E6细胞(即扣除对应的未刺激的(无肽)孔的斑点数目)。

9-10周龄的雄性Balb/c小鼠的肿瘤接种，每组4只小鼠

每只动物经皮下接种100μl于PBS中的0.5x10E6同基因CT26.WT结肠癌细胞到左侧腹。接种后第6天，当可触摸到肿瘤时，使动物接受肽或对照疫苗的第一次接种(如上述的肽接种)。在第13天时，动物接受第二次接种。监测肿瘤生长并且每周测量肿瘤3次。肿瘤体积计算为V[mm³]＝l x w²/2(其中1是最长直径，w垂直于1)。

结果

在C57BL/6和Balb/c小鼠中，发现ARG17、ARG1-19和mARG20均具有免疫原性。在接种ARG17、ARG1-19和mARG20中每一种的C57BL/6和Balb/c小鼠中均检测到肽特异性应答(参见图14-15)。在更短的肽中，mARGl在C57BL/6小鼠中具有免疫原性，mARG2在任一品系中都不具有免疫原性(数据未示出)。

在肿瘤接种实验中，相对于用对照肽接种，发现用ARGl7、ARGl-19和mARG20中每一种的接种均抑制肿瘤生长。使用ARG1-19和mARG20时作用最为显著，尽管全部三种测试肽均有明显的治疗益处。这证实了本发明的肽(以及通常针对精氨酸酶1的接种)用于癌症治疗的潜能。

对ARG17的较低的应答可反映出该肽缺乏稳定性，例如由于存在半胱氨酸残基。通过保守置换来替换该氨基酸可解决这个问题，而不改变通过第161-180位定义的Argl序列的其他特性。然而，这些结果还表明，通过第181-200位，特别是第191-210位定义的Arg1序列可能是优选的，原因在于它们易于制备、稳定并且似乎在小鼠中产生最佳应答。

参考文献

[1]Bronte V，Zanovello P(2005)Regulation of immune responses by L-arginine metabolism.Nat Rev Immunol 5：641-54.

[2]Mussai F，De SC，Abu-Dayyeh I，Booth S，Quek L，McEwen-Smith RM，et al.(2013)Acute myeloid leukemia creates an arginase-dependent immunosuppressivemicroenvironment.Blood 122：749-58.

[3]Andersen MH，Bonfill JE，Neisig A，Arsequell G，Sondergaard I，ValenciaG，et al.(1999)Phosphorylated Peptides Can Be Transported by TAP Molecules，Presented by Class I MHC Molecules，and Recognized by Phosphopeptide-SpecificCTL.J Immunol 163：3812-8.

[4]Ahmad SM，Martinenaite E，Hansen M，Junker N，Borch TH，Met O，et al.PD-L1peptide co-stimulation increases immunogenicity of a dendritic cell-basedcancer vaccine.in press ed.2016.

序列

全长人精氨酸酶1(NP_0000036.2)(SEQ ID NO：1)

被鉴定为免疫原性热点的区域以粗体和下划线表示

注意：上述序列为人精氨酸酶1的亚型2，其具有最广泛分布的表达。另外的较长的亚型1主要在肝中表达。该亚型的序列作为NP_001231367.1提供。它包括另外的8氨基酸序列(VTQNFLIL，SEQ ID NO：62)，其被插入到如SEQ ID NO：1中所示的亚型2的第43位和第44位对应的位置之间。跨越亚型2的这些位置的本发明的任何多肽可任选地包含所述亚型1的另外的8个氨基酸的插入。

全长鼠精氨酸酶1(NP_031508.1)(SEQ ID NO：59)

被鉴定为免疫原性热点的区域以粗体和下划线表示

全长人精氨酸酶2(NP_001163.1)(SEQ ID NO：60)

被鉴定为免疫原性热点的区域以粗体和下划线表示

表A

＊表示来自鼠精氨酸酶1的序列，其包含至少一个相对于人精氨酸酶1的对应区域的差异。与对应的人序列不同的残基以粗体和下划线表示。鼠和人精氨酸酶1的长度相同，因此起始和终止位置相同。

#表示来自人精氨酸酶2的序列。起始和终止位置是人精氨酸酶1中的对应位置。

另一种人精氨酸酶1序列(SEQ ID NO：61)

序列表

<110> Company

<120>

<130> 10060PC00

<160> 62

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 322

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser

1 5 10 15

Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg

20 25 30

Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys

35 40 45

Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe

50 55 60

Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu

65 70 75 80

Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val

85 90 95

Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Ser Ile Ser Gly His Ala

100 105 110

Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp

115 120 125

Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro

130 135 140

Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro

145 150 155 160

Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr

165 170 175

Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr

180 185 190

Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile

195 200 205

Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys

210 215 220

Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe

225 230 235 240

Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu

245 250 255

Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly

260 265 270

Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu

275 280 285

Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe

290 295 300

Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro

305 310 315 320

Pro Lys

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Gln Leu Ala Gly Lys Val Ala Glu Val

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Leu

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Asp Val

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 7

His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 8

Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu Val

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 10

Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Ile Met

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 11

Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser Leu

1 5

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 12

Leu Leu Ser Gly Leu Asp Ile Met Glu Val

1 5 10

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 13

Asn Leu His Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 14

Ser Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Leu

1 5 10

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 15

Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys Arg Pro Ile

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 16

Val Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile

1 5 10

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 17

Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile

1 5 10

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 18

Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser

1 5 10 15

Lys Gly Gln Pro

20

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 19

Ile Gly Ala Pro Phe Ser Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu

1 5 10 15

Gly Pro Thr Val

20

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 20

Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg Lys Ala Gly Leu

1 5 10 15

Leu Glu Lys Leu

20

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 21

Leu Arg Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Gln Glu Cys Asp

1 5 10 15

Val Lys Asp Tyr

20

<210> 22

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 22

Lys Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala

1 5 10 15

Asp Ile Pro Asn

20

<210> 23

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 23

Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe Gln Ile

1 5 10 15

Val Lys Asn Pro

20

<210> 24

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 24

Asp Ser Pro Phe Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala

1 5 10 15

Ser Glu Gln Leu

20

<210> 25

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 25

Arg Ser Val Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu Ala Gly Lys Val Ala Glu

1 5 10 15

Val Lys Lys Asn

20

<210> 26

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 26

Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val

1 5 10 15

Leu Gly Gly Asp

20

<210> 27

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 27

Gly Arg Ile Ser Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly

1 5 10 15

Ser Ile Ser Gly

20

<210> 28

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 28

His Ser Leu Ala Ile Gly Ser Ile Ser Gly His Ala Arg Val His Pro

1 5 10 15

Asp Leu Gly Val

20

<210> 29

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 29

His Ala Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile Trp Val Asp Ala His

1 5 10 15

Thr Asp Ile Asn

20

<210> 30

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 30

Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr

1 5 10 15

Ser Gly Asn Leu

20

<210> 31

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 31

Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro Val Ser

1 5 10 15

Phe Leu Leu Lys

20

<210> 32

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 32

His Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile

1 5 10 15

Pro Asp Val Pro

20

<210> 33

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 33

Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro Gly Phe Ser Trp Val Thr

1 5 10 15

Pro Cys Ile Ser

20

<210> 34

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 34

Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr

1 5 10 15

Ile Gly Leu Arg

20

<210> 35

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 35

Ala Lys Asp Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu

1 5 10 15

His Tyr Ile Leu

20

<210> 36

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 36

Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr Leu Gly Ile Lys

1 5 10 15

Tyr Phe Ser Met

20

<210> 37

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 37

Lys Thr Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu

1 5 10 15

Gly Ile Gly Lys

20

<210> 38

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 38

Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu

1 5 10 15

Ser Tyr Leu Leu

20

<210> 39

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 39

Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys Arg Pro

1 5 10 15

Ile His Leu Ser

20

<210> 40

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 40

Gly Arg Lys Lys Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu

1 5 10 15

Asp Pro Ser Phe

20

<210> 41

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 41

Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe Thr Pro Ala Thr Gly Thr

1 5 10 15

Pro Val Val Gly

20

<210> 42

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 42

Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu

1 5 10 15

Gly Leu Tyr Ile

20

<210> 43

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 43

Gly Leu Thr Tyr Arg Glu Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Lys

1 5 10 15

Thr Gly Leu Leu

20

<210> 44

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 44

Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Ile Met

1 5 10 15

Glu Val Asn Pro

20

<210> 45

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 45

Ser Gly Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser Leu Gly Lys Thr Pro

1 5 10 15

Glu Glu Val Thr

20

<210> 46

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 46

Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala

1 5 10 15

Val Ala Ile Thr

20

<210> 47

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 47

Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe Gly Leu

1 5 10 15

Ala Arg Glu Gly

20

<210> 48

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 48

Leu Ala Cys Phe Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Ile Asp

1 5 10 15

Tyr Leu Asn Pro Pro Lys

20

<210> 49

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 49

Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly

1 5 10 15

Leu Asp Ile Met

20

<210> 50

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 50

Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr

1 5 10 15

Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu

20 25 30

<210> 51

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 51

Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr Leu Gly Ile Lys

1 5 10 15

Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile Gly Lys

20 25 30

<210> 52

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 52

Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr

1 5 10 15

Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr

20 25 30

Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile

35 40 45

Gly Lys

50

<210> 53

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 53

Lys Asp Ile Val Tyr Ile Gly Leu

1 5

<210> 54

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 54

Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met

1 5

<210> 55

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 55

Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Ile Lys Thr Leu Gly Ile Lys

1 5 10 15

Tyr Phe Ser Met

20

<210> 56

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 56

Lys Thr Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Lys Leu

1 5 10 15

Gly Ile Gly Lys

20

<210> 57

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 57

Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr

1 5 10 15

Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Ile Lys Thr

20 25 30

Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Lys Leu Gly Ile

35 40 45

Gly Lys

50

<210> 58

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 58

Gly Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Ile Ser Ser Ala Ser Ile Val Tyr

1 5 10 15

Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Pro Glu His Phe Ile Leu Lys Asn

20 25 30

Tyr Asp Ile Gln Tyr Phe Ser Met Arg Asp Ile Asp Arg Leu Gly Ile

35 40 45

Gln Lys

50

<210> 59

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 59

Met Ser Ser Lys Pro Lys Ser Leu Glu Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser

1 5 10 15

Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Lys Gly Pro Ala Ala Leu Arg

20 25 30

Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Thr Glu Tyr Asp Val Arg

35 40 45

Asp His Gly Asp Leu Ala Phe Val Asp Val Pro Asn Asp Ser Ser Phe

50 55 60

Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Asn Glu Glu Leu

65 70 75 80

Ala Gly Val Val Ala Glu Val Gln Lys Asn Gly Arg Val Ser Val Val

85 90 95

Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Val Gly Ser Ile Ser Gly His Ala

100 105 110

Arg Val His Pro Asp Leu Cys Val Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp

115 120 125

Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Ser Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro

130 135 140

Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Phe Pro Asp Val Pro

145 150 155 160

Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr

165 170 175

Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Ile Lys Thr

180 185 190

Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Lys Leu Gly Ile

195 200 205

Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Phe Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys

210 215 220

Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ala Phe

225 230 235 240

Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Leu Gly Gly Leu Ser Tyr Arg Glu

245 250 255

Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly

260 265 270

Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Thr Leu Gly Lys Thr Ala Glu Glu

275 280 285

Val Lys Ser Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Leu Thr Leu Ala Cys Phe

290 295 300

Gly Thr Gln Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Gly Thr Asp Tyr Leu Lys

305 310 315 320

Pro Pro Lys

<210> 60

<211> 354

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 60

Met Ser Leu Arg Gly Ser Leu Ser Arg Leu Leu Gln Thr Arg Val His

1 5 10 15

Ser Ile Leu Lys Lys Ser Val His Ser Val Ala Val Ile Gly Ala Pro

20 25 30

Phe Ser Gln Gly Gln Lys Arg Lys Gly Val Glu His Gly Pro Ala Ala

35 40 45

Ile Arg Glu Ala Gly Leu Met Lys Arg Leu Ser Ser Leu Gly Cys His

50 55 60

Leu Lys Asp Phe Gly Asp Leu Ser Phe Thr Pro Val Pro Lys Asp Asp

65 70 75 80

Leu Tyr Asn Asn Leu Ile Val Asn Pro Arg Ser Val Gly Leu Ala Asn

85 90 95

Gln Glu Leu Ala Glu Val Val Ser Arg Ala Val Ser Asp Gly Tyr Ser

100 105 110

Cys Val Thr Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Thr Ile Ser

115 120 125

Gly His Ala Arg His Cys Pro Asp Leu Cys Val Val Trp Val Asp Ala

130 135 140

His Ala Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Ser Ser Gly Asn Leu His

145 150 155 160

Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Arg Glu Leu Gln Asp Lys Val Pro

165 170 175

Gln Leu Pro Gly Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Ile Ser Ser Ala Ser

180 185 190

Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Pro Glu His Phe Ile

195 200 205

Leu Lys Asn Tyr Asp Ile Gln Tyr Phe Ser Met Arg Asp Ile Asp Arg

210 215 220

Leu Gly Ile Gln Lys Val Met Glu Arg Thr Phe Asp Leu Leu Ile Gly

225 230 235 240

Lys Arg Gln Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Ile Asp Ala Phe Asp

245 250 255

Pro Thr Leu Ala Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr

260 265 270

Tyr Arg Glu Gly Met Tyr Ile Ala Glu Glu Ile His Asn Thr Gly Leu

275 280 285

Leu Ser Ala Leu Asp Leu Val Glu Val Asn Pro Gln Leu Ala Thr Ser

290 295 300

Glu Glu Glu Ala Lys Thr Thr Ala Asn Leu Ala Val Asp Val Ile Ala

305 310 315 320

Ser Ser Phe Gly Gln Thr Arg Glu Gly Gly His Ile Val Tyr Asp Gln

325 330 335

Leu Pro Thr Pro Ser Ser Pro Asp Glu Ser Glu Asn Gln Ala Arg Val

340 345 350

Arg Ile

<210> 61

<211> 318

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 61

Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser

1 5 10 15

Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg

20 25 30

Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys Asp

35 40 45

Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe Gln

50 55 60

Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu Ala

65 70 75 80

Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val Leu

85 90 95

Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Ser Ile Gly His Ala Arg Val His

100 105 110

Pro Asp Leu Gly Val Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp Ile Asn Thr

115 120 125

Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro Val Ser Phe

130 135 140

Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro Gly Phe Ser

145 150 155 160

Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr Ile Gly Leu

165 170 175

Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr Leu Gly Ile

180 185 190

Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile Gly Lys Val

195 200 205

Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Arg Pro Ile His

210 215 220

Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe Thr Pro Ala Thr

225 230 235 240

Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu Gly Leu Tyr Ile

245 250 255

Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Ile Met

260 265 270

Glu Val Asn Pro Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu Val Thr Arg Thr

275 280 285

Val Asn Thr Ala Val Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe Gly Leu Ala Arg

290 295 300

Glu Gly Asn His Lys Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro Pro Lys

305 310 315

<210> 62

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 62

Val Thr Gln Asn Phe Leu Ile Leu

1 5

Claims (10)

1.一种分离的SEQ ID NO：1的人精氨酸酶蛋白(精氨酸酶1)或SEQ ID NO：60的人精氨酸酶蛋白(精氨酸酶2)的免疫原性多肽片段，所述片段的长度最多达55个氨基酸并且包含SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：58的至少8、9、10、20、30、40或50个连续氨基酸的序列或由所述序列组成。

2.权利要求1的多肽片段，其包含SEQ ID NO：52、50、51、37、35、35、34、9、53、54、2至33、或38至49中任一个的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

3.权利要求1或2的多肽片段，其包含SEQ ID NO：37、36、34或35中任一个的至少8、9、10、15或全部20个连续氨基酸，任选地其中SEQ ID NO：34中的半胱氨酸被保守置换所替换。

4.前述权利要求中任一项的多肽片段，其中

a.C端氨基酸被相应的酰胺替换；和/或

b.对应于SEQ ID NO：1第190位的位置上的L被I替换；和/或

c.对应于SEQ ID NO：1第205位的位置上的R被K替换；和/或

d.至少一个额外的部分连接至N和/或C端以提高所述多肽的溶解度和可制备性，任选地其中所述额外的部分是亲水氨基酸，例如R或K；和/或

e.所述片段相对于相应的全长精氨酸酶，缺乏精氨酸酶活性或精氨酸酶活性降低；和/或

f.所述片段能够刺激识别表达相应精氨酸酶的细胞的T细胞。

5.一种组合物，其包含权利要求1至4中任一项的多肽片段，可药用的稀释剂或载体，以及任选的佐剂。

6.权利要求5的组合物，其中所述佐剂选自基于细菌DNA的佐剂、基于油/表面活性剂的佐剂、基于病毒dsRNA的佐剂、imidazochiniline和Montanide ISA佐剂。

7.治疗或预防受试者的疾病或病况的方法，所述方法包括给予所述受试者权利要求1至4中任一项的分离的多肽或权利要求5或6的组合物。

8.权利要求7的方法，所述疾病或病况的特征至少部分在于精氨酸酶的不适当或过度的免疫抑制功能，和/或其中所述疾病或病况是癌症。

9.权利要求8的方法，其中所述疾病或病症是癌症，任选地其中所述方法还包括同时或依序给予其他癌症疗法，例如细胞因子疗法、T细胞疗法、NK疗法、免疫系统检查点抑制剂(例如抗体)、化学疗法、放射疗法、免疫刺激物质、基因疗法、和树突细胞。

10.权利要求9的方法，其中所述其他癌症疗法是以下中的一种或更多种：辅酶B12、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊立替康、来那度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、美法仑、巯基嘌吟、甲氨蝶呤、米托蒽醌、Nivolumab、奥沙利铂、紫杉醇、Pembrolizumab、培美曲塞、瑞复美、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。