KR20190077381A - 면역원성 아르기나제 펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 아르기닌 단백질의 면역원성 폴리펩타이드 단편에 관한 것이다. 상기 단편은 특히 암의 치료 또는 예방에 유용하다.

Description

면역원성 아르기나제 펩타이드
본 발명은 아르기나제 1의 단편과 같은 신규한 펩타이드 화합물, 뿐만 아니라 이들 펩타이드 화합물을 포함하는 조성물, 용도, 및 부품 키트(kit-of-parts)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단독으로 또는 추가적인 암 치료와 함께 동시에 또는 순차적으로 투여하여 암의 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 핵산, 벡터, 및 상기 펩타이드 화합물을 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다.
아르기나제는 아미노산 L-아르기닌(L-arginine)을 L-오르니틴(L-ornithine) 및 요소(urea)로 전환시키는 반응을 촉매하는 효소이다. 이는 아르기닌의 미세환경을 고갈시키고 암-특이적 세포독성 T세포 반응의 억제를 유도한다. 증가된 아르기나제 활성은 유방암, 폐암, 대장암 또는 전립선암 환자의 암세포에서 검출된 바 있다[1]. 랫트 아르기나제 유전자로 형질감염된 마우스 대식세포가 공-배양된 암 세포의 증식을 촉진한다는 것은 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 모두에서 나타났다[2]. 또한 대식세포에 의한 아르기나제 발현의 유도는 폴리아민(polyamine) 합성을 통해 종양의 혈관화(tumour vascularization)를 증가시키는 것으로 나타났다. 쥐 폐암 모델의 결과는 아르기나제를 고농도로 발현하는 성숙한 암-연관 골수성 세포(myeloid cell)의 아집단(subpopulation)이 존재함을 나타냈다. 이들 암-연관 골수성 세포는 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)의 항원-특이적 증식을 억제하는 세포 외 L-아르기닌을 고갈시켰다. 아르기나제 억제제의 투여는 쥐에서 폐암 성장을 차단하였다. 이는 암세포 및 암 연관 골수성 세포에서의 아르기나제 발현 유도가 TIL에 대한 부정적 영향을 통해 항-종양 면역 반응을 억제함으로써 어떻게 종양 성장을 촉진하는지를 보여준다.
골수-유래 억제 세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)들은 효과기 T세포(effector T cells)와 자연 살해 세포(natural killer cells)의 활성, 증식 및 세포독성을 억제하고, 뿐만 아니라 Treg 분화 및 증식(expansion)을 유도한다. 암세포와 MDSC 모두 효소 산화질소 합성효소(nitric-oxide synthase, NOS)와 아르기나제를 통해 L-아르기닌 대사를 조절함으로써 T세포를 억제할 수 있다. 많은 암들은 종양 미세환경으로부터 아르기닌을 고갈시키는 아르기나제와 유도형 NOS(inducible NOS, iNOS)의 발현 증가를 나타낸다[1]. 몇몇 연구들은 이러한 암-특이적 T세포 반응 억제에 있어서 변화된 암 아르기닌 대사의 중요성을 강조하고, 최근 급성골수성백혈병(AML) 모세포(blast)가 T세포 증식과 조혈모세포(hematopoietic stem cells)를 억제하는 아르기나제-의존적 능력을 나타내는 것이 나타났다. 또한, 아르기나제와 iNOS 억제제는 AML의 억제 활성을 감소시킨다[2].
발명의 요약
본 발명자들은 아르기나제 1로부터 새로운 면역원성 에피토프를 확인하였다. 또한, 아르기나제 1-유래 펩타이드에 대한 특이적 T-세포 반응의 존재에 대해 흑색종 환자의 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 분석하였고 새로운 면역원성 에피토프에 대한 강한 면역 반응이 검출되었다. 나아가, 몇몇 펩타이드 단편에 대한 빈번한 면역 반응이 검출되었다. 또한 아르기나제 1에 대한 면역 반응이 실제로 CD4와 CD8 T세포에 의해 매개되고, CD8 및 CD4 T세포 모두 표적 세포 표면에서 아르기나제 1 유래 펩타이드를 인식할 수 있음이 밝혀졌다.
암에 대한 새로운 면역 치료의 개발에는 병태 생리(pathogenesis)에 관여되는 분자뿐만 아니라 면역계에 의해 인식되는 특이적 단백질에 대한 철저한 이해가 요구된다. 임상에서 아르기나제 특이적 면역 반응의 유도는 암세포의 사멸 이외에 일반적으로 아르기나제 발현 세포, 특히 MDSC와 암-연관 대식세포(tumor-associated macrophages, TAMs)의 면역 억제적 기능을 억제함으로써 항암 면역 반응을 지지할 수 있다. 그러므로, 아르기나제-발현 세포들이 골수성 수지상세포를 표적하는 다른 면역치료적 접근 예를 들어, 백신접종에 대한 원하는 효과를 길항하기 때문에, 결과적으로 추가적인 항암 면역치료와 함께 높은 시너지 효과를 나타낼 수 있다.
본원에서 서열번호 1(아르기나제 1) 또는 서열번호 60(아르기나제 2)의 인간 아르기나제 단백질의 분리된, 면역원성 폴리펩타이드 단편이 제공된다. 단편은 일반적으로 길이가 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 50 또는 55개까지의 아미노산이다. 단편은 서열번호 52 또는 서열번호 58 중 어느 하나의 적어도 8, 9, 10, 20, 30, 40 또는 50개의 연속된 아미노산 서열을 포함하거나 이루어진 것일 수 있다. 폴리펩타이드 단편은 서열번호 52, 50, 51, 34, 35, 36, 37, 9, 53, 54, 2 내지 33, 또는 38 내지 49 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이루어진 것일 수 있다.
폴리펩타이드 단편은 하기 추가적인 특징 중 하나 이상을 가질 수 있다:
a. C 말단 아미노산은 대응하는 아마이드로 대체되고; 및/또는
b. 서열번호 1의 190번 위치에 대응하는 L이 I로 대체되고; 및/또는
c. 서열번호 1의 205번 위치에 대응하는 R이 K로 대체되고; 및/또는
d. 적어도 하나의 추가의 모이어티(moiety)가 N 및/또는 C 말단에 부착되고, 선택적으로 여기서 상기 추가의 모이어티는 R 또는 K와 같은 친수성 아미노산이고; 및/또는
e. 대응하는 전체 길이 아르기나제와 비교하여 아르기나제 활성이 없거나 감소된 것임.
또한 상기 단편, 약학적으로 허용가능한 희석제(diluent) 또는 담체(carrier) 및 선택적으로 어쥬번트(adjuvant)를 포함하는 조성물이 제공된다. 상기 조성물 또는 상기 단편은 암과 같은 질병 또는 증상을 치료하거나 예방하기 위한 방법에 사용될 수 있고, 또는 암과 같은 질병 또는 증상의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 선택적으로 백신으로 기술될 수도 있다. 또한 암과 같은 질병 또는 증상을 치료 또는 예방하는 방법, 상기 조성물 또는 상기 단편을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
폴리펩타이드 단편은 본원에서 펩타이드 화합물(peptide compound) 또는 펩타이드로 상호교환적으로 사용된다.
일 측면에서 본 발명은 하기로부터 선택되는 아르기나제 1 펩타이드 화합물에 관한 것이다:
a) 8 내지 321개 아미노산의 연속 서열로 이루어진 서열번호 1의 펩타이드 단편,
b) 서열번호 1 또는 a)의 펩타이드 단편과 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 95%의 상동성을 갖는 기능적 상동체(functional homologue), 및
c) 서열번호 1 또는 a)의 펩타이드 단편에 적어도 하나의 아미노산이 결실, 삽입 및/또는 치환된 기능적 유사체(functional analogue),
및 a), b) 또는 c) 중 어느 하나의 C-말단 아미노산이 또한 아마이드;
또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함. 상기에서 언급된 맥락에서, “기능적(functional)”이란 “서열번호 1의 아르기나제에 대한 면역 반응을 자극할 수 있음”을 의미한다. 상동체 b)와 유사체 c)는 바람직하게는 감소된(또는 0) 아르기나제 기능을 갖는다.
일 실시예에서 펩타이드 화합물은 a) 8 내지 321개 아미노산의 연속 서열로 이루어진 서열번호 1의 펩타이드 단편으로서, C-말단 아미노산이 아마이드; 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 펩타이드로부터 선택된다. 다른 실시예에서 펩타이드 단편은 8 내지 300개의 아미노산, 8 내지 250개의 아미노산, 8 내지 200개의 아미노산, 8 내지 150개의 아미노산, 8 내지 120개의 아미노산, 예를 들어 10 내지 100개의 아미노산, 20 내지 80개의 아미노산, 30 내지 60개의 아미노산, 40 내지 50개의 아미노산 범위의 연속 서열로 이루어진다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(1-310), ARG(1-301), ARG(1-291), ARG(11-322), ARG(21-322), ARG(30-322), ARG(40-322), ARG(11-310), ARG(11-301), ARG(11-291), ARG(21-310), ARG(21-301), ARG(21-291), ARG(30-310), ARG(30-301), ARG(30-291), ARG(40-310), ARG(40-301), 및 ARG(40-291)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시예에서 아르기나제 활성은 아르기나제 활성 분석에 의해 측정 시 아르기나제 1에 비해 감소된다. 일 실시예에서 아르기나제 활성은 비활성(inactivity)까지 감소된다. 또 다른 실시예에서 아르기나제 활성 분석은 아르기나제 활성 Colorimetric Assay 키트(BioVision Arginase assay # K755-100)로부터 선택된다.
또 다른 실시예에서 연속 서열은 서열번호 52, 50, 51, 37, 36, 35, 34, 9, 53, 54, 2 내지 33, 또는 38 내지 39 중 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다. 일 실시예에서 연속 서열은 서열번호 52, 50, 51, 37, 36, 35, 34, 9, 53 또는 54로부터 선택된 서열을 포함한다.
다른 실시예에서 a)에 따른 펩타이드 단편, b)에 따른 기능적 상동체, 또는 c)에 따른 기능적 유사체는 아르기나제 1을 발현하는 세포를 인식하는 T세포를 활성화한다는 점에서 기능적이다. 일 실시예에서 활성은 본원에 기재된 ELISPOT 분석에 의해 결정된다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드 화합물을 코딩하는 핵산을 개시한다. 본 발명에 따른 펩타이드 화합물은 상기 실시예 중 어느 하나로부터 선택된다. 일 실시예에서 핵산은 DNA 및 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 개시한다. 본 발명의 핵산은 상기 실시예 중 어느 하나로부터 선택되고, 본 발명에 따른 펩타이드 화합물은 상기 실시예 중 어느 하나로부터 선택된다. 일 실시예에서 벡터는 바이러스 벡터로부터 선택된다.
다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 벡터는 상기 실시예 중 어느 하나로부터 선택되고, 핵산은 상기 실시예 중 어느 하나로부터 선택되고, 펩타이드 화합물은 상기 실시예 중 어느 하나로부터 선택된다. 일 실시예에서 상기 숙주 세포는 포유동물 세포로부터 선택된다.
벡터는 바람직하게는 아르기나제 기능을 갖지 않는 서열인 아르기나제 1의 불활성 서열을 코딩하는 핵산을 포함한다.
본원에 기재된 모든 펩타이드, 핵산, 벡터, 또는 숙주세포는 선택적으로 담체 또는 희석제와 같은 약학적으로 허용가능한 첨가제와 함께 조성물로 제공될 수 있다. 상기 조성물은 또한 선택적으로 어쥬번트를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 약제로서 사용될 수 있다. 상기 조성물은 질병의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.
상기 조성물은 암으로부터 선택된 질병, 장애 또는 증상의 치료 또는 예방을 위한 방법에 사용될 수 있다. 일 실시예에서 암은 종양을 형성하는 암 질환이다. 상기 어쥬번트는 박테리아 DNA 기반 어쥬번트, 오일/계면활성제 기반 어쥬번트, 바이러스 dsRNA 기반 어쥬번트, 이미다조치닐린(imidazochinilines), 및 몬타니드(Montanide) ISA 어쥬번트로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
본원에 개시된 질병을 치료 또는 예방하는 방법은 개체에 유효량의:
a) 상기 기재된 조성물, 및
b) 인터루킨(interleukin), 예를 들어 IL-2 및 또는 IL-21과 같은 면역자극 화합물, 화학치료제, 예를 들어 액티마이드(Actimide), 아자시티딘(Azacitidine), 아자티오프린(Azathioprine), 블레오마이신(Bleomycin), 카보플라틴(Carboplatin), 카페시타빈(Capecitabine), 시스플라틴(Cisplatin), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 사이타라빈(Cytarabine), 다우노루비신(Daunorubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 독시플루리딘(Doxifluridine), 독소루비신(Doxifluridine), 에피루비신(Epirubicin), 에토포시드(Etoposide), 플루다라빈(Fludarabine), 플루오로우라실(Fluorouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 하이드록시우레아(Hydroxyurea), 이다루비신(Idarubicin), 이리노테칸(Irinotecan), 레날리도마이드(Lenalidomide), 류코보린(Leucovorin), 메클로레타민(Mechlorethamine), 멜팔란(Melphalan), 메르캅토퓨린(Mercaptopurine), 메토트렉세이트(Methotrexate), 미톡산트론(Mitoxantrone), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 페메트렉시드(Pemetrexed), 레블리미드(Revlimid), 테모졸로마이드(Temozolomide), 테니포시드(Teniposide), 티오구아닌(Thioguanine), 발루비신(Valrubicin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine) 및 비노렐빈(Vinorelbine)과 같은 항암제, 또는 항체, 예를 들어 니볼루맙(nivolumab) 또는 펨브롤리주맙(pembrolizumab)과 같은 관문 억제제로부터 선택된 적어도 하나의 2차 활성 성분(active ingredient)을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
제공된 조성물은 동시 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 조성물은 부품 키트(kit-of-parts)의 구성성분으로서 제공될 수 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은 서열번호 1의 아르기나제 1의 발현으로 특징지어지는 임상적 증상을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 임상적 증상을 앓고 있는 개인에게 전술한 펩타이드, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서 본 발명은 암환자에서 CD4와 CD8 T세포와 같은 아르기나제 1 특이적 T세포를 자극하는 방법으로서, 상기 방법은 암환자에게 전술한 펩타이드 화합물, 또는 핵산, 또는 벡터 또는 숙주 세포를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 암환자에서 아르기나제 1 발현 세포의 면역 억제 기능을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 암환자에게 전술한 펩타이드 화합물, 또는 핵산, 또는 벡터 또는 숙주 세포를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 암을 치료 또는 예방하는 면역치료 조성물 또는 백신과 같은 의약을 제조하기 위한 전술한 펩타이드 화합물, 또는 핵산, 또는 벡터, 또는 숙주세포의 용도에 관한 것으로, 상기 암은 선택적으로 아르기나제 1의 발현을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 선택적으로 추가적인 암 치료와 함께 동시 또는 순차적으로 투여하여 암의 치료 또는 예방하기 위한 방법에 사용하기 위한 펩타이드 화합물, 또는 핵산, 또는 벡터, 또는 숙주 세포에 관한 것이다.
추가적인 암 치료는 사이토카인 치료, T 세포 치료, NK 치료, 면역계 관문 억제제(immune system checkpoint inhibitor), 화학요법(chemotherapy), 방사선 치료(radiotherapy), 면역증강 물질(immunostimulating substances), 유전자 치료(gene therapy), 항체 및 수지상 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 일 실시예에서 추가적인 암 치료는 예를 들어 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙과 같은 면역계 관문 억제 항체와 같은 면역계 관문 억제제로부터 선택된 것일 수 있고, 또는 액티마이드(Actimide), 아자시티딘(Azacitidine), 아자티오프린(Azathioprine), 블레오마이신(Bleomycin), 카보플라틴(Carboplatin), 카페시타빈(Capecitabine), 시스플라틴(Cisplatin), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 사이타라빈(Cytarabine), 다우노루비신(Daunorubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 독시플루리딘(Doxifluridine), 독소루비신(Doxifluridine), 에피루비신(Epirubicin), 에토포시드(Etoposide), 플루다라빈(Fludarabine), 플루오로우라실(Fluorouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 하이드록시우레아(Hydroxyurea), 이다루비신(Idarubicin), 이리노테칸(Irinotecan), 레날리도마이드(Lenalidomide), 류코보린(Leucovorin), 메클로레타민(Mechlorethamine), 멜팔란(Melphalan), 메르캅토퓨린(Mercaptopurine), 메토트렉세이트(Methotrexate), 미톡산트론(Mitoxantrone), , 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), , 페메트렉시드(Pemetrexed), 레블리미드(Revlimid), 테모졸로마이드(Temozolomide), 테니포시드(Teniposide), 티오구아닌(Thioguanine), 발루비신(Valrubicin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine) 및 비노렐빈(Vinorelbine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
도 1은 6명의 암환자로부터의 샘플에서 서열번호 2 내지 16(Arg1 내지 Arg15)의 아미노산 서열 각각으로 이루어진 펩타이드에 대한 T세포 반응을 나타낸다.
도 2는 6명의 암환자로부터의 샘플에서 서열번호 9(Arg8)의 아미노산 서열 각각으로 이루어진 펩타이드에 대한 T세포 반응을 나타낸다.
도 3은 3명의 암환자로부터의 샘플에서 서열번호 18 내지 48(Arg1-1 내지 Arg1-31)의 아미노산 서열 각각으로 이루어진 펩타이드에 대한 T세포 반응을 나타낸다.
도 4는 8명의 건강한 개인으로부터의 샘플에서 서열번호 9(Arg8), 서열번호 21(Arg1-4), 서열번호 29(Arg1-12), 서열번호 34(Arg1-17), 서열번호 35(Arg1-18), 서열번호 36(Arg1-19), 서열번호 37(Arg1-20), 서열번호 40(Arg1-23), 서열번호 44(Arg1-17)의 아미노산 서열 각각으로 이루어진 펩타이드에 대한 T세포 반응을 나타낸다.
도 5는 CD8 양성 배양이 서열번호 9(Arg8)의 아미노산 서열 각각으로 이루어진 펩타이드가 로딩된 표적 세포를 사멸시킬 수 있음을 나타낸다.
도 6은 아르기나제 특이적 T세포에 의한 아르기나제 양성 암(흑색종) 세포주 FM3 및 FM93의 사멸을 나타낸다.
도 7은 서열번호 9(Arg8)의 아미노산 서열 각각으로 이루어진 펩타이드로 자극을 시키지 않거나(상부 판넬) 자극시킨(하부 판넬) 배양 후에 IFN-g(PE-Cy7A) 및 TNF-알파(APC-A)의 세포 내 염색에 의해 평가된 암환자로부터의 CD4 T세포의 유세포 분석(flow cytometric analysis)을 나타낸다. 유사한 결과가 도 8에 나와있다.
도 9는 IFNγ ELISPOT으로 평가할 때 여러 개의 아르기나제-1 펩타이드가 3명의 흑색종 환자(9A) 및 8명의 건강한 공여자(9B)로부터의 PBMC에 의해 인식됨을 나타낸다. 펩타이드들은 인간 아르기나제 1 서열 내에서 그들 서열의 시작과 끝 위치를 참조로 하여 표현되었다. 스팟 값(spot count)은 펩타이드로 자극시킨 웰과 대조군 웰의 평균값 차이로 나타내었다. 펩타이드 및 대조군 자극은 2회 또는 3회 반복 수행되었다.
도 10은 서열번호 1의 161 내지 210 위치에 대응하는 부위가 암환자 및 건강한 공여자의 PBMC에 의해 폭넓게 인식됨을 나타낸다
A - 서열번호 34(Arg161-180), 서열번호 35(Arg171-190) 및 서열번호 36(Arg181-200) 각각의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 대한 반응으로 IFNγ를 방출하는 흑색종 환자로부터의 종양 침윤 림프구(tumour infiltrating lymphocytes, TILs) 내 CD4+ T세포의 비율을 나타낸다. 펩타이드 이름은 인간 아르기나제 1 서열 내에서 그들 서열의 시작과 끝 위치를 나타낸다.
B - 좌측: 5명의 선택된 암환자 및 4명의 건강한 공여자로부터의 PBMC 에서 Arg(161-190) 펩타이드에 대한 반응. 우측: 2명의 건강한 공여자(HD..) 및 2명의 암환자(MM..)에서 Arg(161-190) 펩타이드 또는 대조군에 대한 반응으로서 예시적인 ELISPOT 웰.
C - 좌측: 5명의 선택된 암환자 및 4명의 건강한 공여자로부터의 PBMC 에서 Arg(180-210) 펩타이드에 대한 반응. 우측: 2명의 건강한 공여자(HD..) 및 2명의 암환자(MM..)에서 Arg(161-190) 펩타이드에 대한 반응으로서 예시적인 ELISPOT 웰.
스팟 값은 펩타이드로 자극시킨 웰과 대조군 웰의 평균값 차이로 나타내었다. 펩타이드 및 대조군 자극은 3회 반복 수행되었다.
도 11은 서열번호 1의 161 내지 210 위치에 대응하는 부위에 대한 반응의 추가적인 분석을 나타낸다.
A - 위는 펩타이드 Arg(161-190)으로 8시간 동안의 자극 또는 자극시키지 않은 후 IFN-g(PE-Cy7A) 및 TNF-알파(APC-A)의 세포 내 염색에 의해 평가된 암환자로부터의 CD4 T세포의 유세포 분석(flow cytometric analysis)을 나타낸다. 아래는 2명의 건강한 공여자(HD..) 및 1명의 암환자(MM..)에 대한 이 분석에서 CD4+ T세포를 방출하는 TNF-a의 비율을 나타낸다.
B - 3명의 암환자로부터의 PBMC를 펩타이드 Arg(161-190) 단독, 또는 HLA 클래스 I (anti-Class I; W6/32) 또는 HLA 클래스 II (anti-Class II; Tu39) 발현을 차단하는 항체와 함께 자극시킨 후의 IFNγ ELISPOT 결과 요약. 스팟 값은 펩타이드로 자극시킨 웰과 대조군 웰의 평균값 차이로 나타내었다. 펩타이드 및 대조군 자극은 2회 또는 3회 반복 수행되었다.
C - 좌측: 아르기나제 1(Arg161-190)의 161 내지 190 위치의 서열로 이루어진 30mer인 ArgShort, 또는 아르기나제 1(Arg161-210)의 161 내지 210 위치의 서열로 이루어진 50mer로 자극된 경우, 또는 자극되지 않은 경우(대조군)의 아르기나제 특이적 CD4 T세포(서열번호 9(ArgShort)의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 반복적으로 자극시킴에 따라 생산됨)로부터의 IFNγ ELISPOT 반응. 우측: 펩타이드 Arg(161-190)으로 8시간 동안의 자극시킨 후 또는 대조군의 IFN-g(PE-Cy7A) 및 TNF-알파(APC-A)의 세포 내 염색에 의해 평가된 아르기나제 특이적 CD4 T세포의 예시적인 유세포 분석(flow cytometric analysis).
도 12는 아르기나제-특이적 T세포가 아르기나제-발현 면역 세포를 인식하는 것을 나타낸다
A 및 C - 서로 다른 2명 흑색종 환자 (MM01 및 MM05)로부터의 아르기나제 특이적 T세포 배양에서 무관한(irrelevant) 대조군 mRNA(DC Mock) 또는 아르기나제-1 mRNA(DC Arg mRNA)로 전기천공 및 형질감염시킨 자가유래 수지상세포에 대한 IFNγ 반응. 효과기-표적 비율(effector to target ratio) 10:1.
B 및 D - 서로 다른 2명 흑색종 환자로부터의 아르기나제 특이적 T세포 배양에서 무관한 대조군 mRNA(DC Mock) 또는 아르기나제-1 mRNA(DC Arg mRNA)로 전기천공 및 형질감염시킨 자가유래 B세포에 대한 IFNγ반응. 효과기-표적 비율(effector to target ratio) 2:1.
E - 아래: 아르기나제 특이적 T세포 배양에서 무관한 대조군 mRNA(DC Mock), 아르기나제 mRNA(DC Arg mRNA) 또는 DC-LAMP 신호 서열을 포함하는 아르기나제 mRNA(DC LAMP Arg mRNA)로 전기천공 및 형질감염시킨 자가유래 수지상세포에 대한 IFNγ반응. 위: 대표적인 ELISPOT 웰 이미지. 대조군 및 형질감염된 세포 자극은 2회 또는 3회 반복 수행되었다.
도 13은 인간 아르기나제 1 및 쥐 아르기나제의 서열 정렬이다.
도 14는 여기에 개시된 서로 다른 펩타이드로 백신접종된 후 C57BL/6 마우스에서 아르기나제 특이적 면역 반응이 증가함을 나타낸다.
도 15는 여기에 개시된 서로 다른 펩타이드로 백신접종된 후 Balb/c 마우스에서 아르기나제 특이적 면역 반응이 증가함을 나타낸다.
도 16은 여기에 개시된 서로 다른 펩타이드로 백신접종된 마우스 암 모델에서 종양 부피가 감소함을 나타낸다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 인간 아르기나제 1의 야생형 아미노산 서열
서열번호 2 내지 54는 인간 아르기나제 1의 펩타이드 단편의 아미노산 서열
서열번호 55 내지 57은 쥐 아르기나제 1의 펩타이드 단편의 아미노산 서열
서열번호 58은 인간 아르기나제 2의 펩타이드 단편의 아미노산 서열
서열번호 59는 쥐 아르기나제 1의 야생형 아미노산 서열
서열번호 60은 인간 아르기나제 2의 야생형 아미노산 서열
서열번호 61은 인간 아르기나제 1의 대체 서열
본 발명은 아르기나제 단백질의 면역원성 폴리펩타이드 단편에 관한 것이다. 이러한 단편은 백신으로서 유용할 수 있다. “면역원성(immunogenic)”은 폴리펩타이드 단편이 적어도 하나의 개체에 있어서 상기 개체에 투여한 후 면역 반응, 바람직하게는 T세포 반응을 유도시킬 수 있음을 의미한다. 폴리펩타이드는 시험관 내(in vitro) 방법을 포함하는 임의의 적합한 방법을 사용하여 면역원성으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 다음 특성 중 적어도 하나를 가지는 경우 면역원성으로 확인될 수 있다:
(ⅰ) ELISPOT 분석에 의해 적어도 1명의 암환자의 PBL 집단에서 IFN-γ-생산 세포를 유도할 수 있고, 및/또는
(ⅱ) 상응하는 아르기나제와 반응성인 CTL의 종양 조직 샘플에서 원위치(in situ) 검출이 가능하고; 및/또는
(ⅲ) 특이적 T세포의 시험관 내(in vitro) 성장을 유도할 수 있다.
폴리펩타이드가 면역원성 활성을 갖는지 여부를 결정하기에 적합한 방법은 하기 실시예에서도 제공된다.
본 발명자들은 서열번호 1의 아르기나제 1 서열의 다수의 영역이 면역원성임을 확인하였다. 이들은 서열번호 52, 50, 51, 37, 36, 35, 34, 9, 53, 54, 2 내지 33, 또는 38 내지 49를 포함한다. 서열번호 52는 서열번호 1의 161 내지 210 위치의 아르기나제 1 부위에 대응된다. 이 부위는 암환자와 건강한 공여자들 사이에서 가장 빈번하게 검출되는 T세포 반응에 대한 서열을 포함하기 때문에 면역원성 핫스팟(hotspot)으로 기술된다. 면역원성 폴리펩타이드는 길이가 최대 50 또는 55개 아미노산일 수 있고 및/또는 적어도 서열번호 52의 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 모든 50개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 연속된 아미노산은 바람직하게는 서열번호 50, 51, 34, 35, 36, 37, 9, 53 및 54 중 어느 하나를 포함하거나 이루어질 수 있다. 서열번호 50, 51, 34, 35, 36, 37, 9, 53 및 54 각각은 서열번호 52의 서열 내로부터의 서열을 포함한다. 구체적으로, 서열번호 50, 51, 34, 35, 36, 37, 9, 53 및 54 각각은 각각 161-190, 181-210, 161-180, 171-190, 181-200, 191-210, 174-182, 172-179 및 193-200 위치로 정의되는 서열번호 1의 부위에 대응된다.
면역원성 폴리펩타이드 단편은 길이가 최대 30, 35, 40, 45, 50 또는 55개일 수 있고 서열번호 50 또는 51의 적어도 8, 9, 10, 15, 20, 25개 또는 모든 30개의 연속 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 면역원성 폴리펩타이드 단편은 길이가 최대 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 55개일 수 있고 서열번호 37, 36, 35, 34의 적어도 8, 9, 10, 15개 또는 모든 20개 연속 아미노산을 포함하는 것일 수 있다.
폴리펩타이드 단편은 바람직하게는 서열번호 1의 181-200 위치로 정의되는 부위(서열번호 36)의 적어도 8, 9, 10, 15 또는 모든 20개 연속 아미노산 또는 서열번호 1의 191-200 위치로 정의되는 부위(서열번호 37)의 적어도 8, 9, 10, 15 또는 모든 20개 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드 단편은 서열번호 1의 161-180 위치로 정의되는 부위(서열번호 34) 또는 서열번호 1의 171-190 위치로 정의되는 부위(서열번호 35)의 적어도 8, 9, 10, 15 또는 모든 20개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 전자(서열번호 34)는, 168 위치에 대응되는 시스테인(cysteine)이 예를 들어 용해도 또는 안정성을 향상시키기 위해 선택적으로 보존적으로 치환된 것일 수 있다.
면역원성 폴리펩타이드 단편은 길이가 최대 8 또는 9개 아미노산일 수 있고 서열번호 9, 53, 또는 54 중 어느 하나의 적어도 8 또는 9개 연속 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 면역원성 폴리펩타이드 단편은 서열번호 52, 50, 51, 34, 35, 36, 37, 9, 53, 54, 2 내지 33, 또는 38 내지 49 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이루어진 것일 수 있다.
본 발명자들은 또한 위치 221-240(서열번호 40, 7, 14 참조); 271-290(서열번호 45, 8, 10, 11, 12 참조); 111-130(서열번호 29 참조); 1-20(서열번호 18 참조); 61-80(서열번호 24 참조); 131-150(서열번호 31, 4 참조); 141-160(서열번호 32, 4 참조); 51-70(서열번호 23 참조); 151-170(서열번호 33, 4 참조); 211-240(서열번호 39, 6 참조); 및 281-300(서열번호 46 참조) 위치로 정의되는(또는 이와 적어도 부분적으로 중첩되는) 부위를 포함하는 서열번호 1의 다른 부위에 대응되는 서열에 대한 반응을 확인하였다. 면역원성 폴리펩타이드 단편은 따라서 이들 부위 또는 서열 중 어느 하나의 적어도 8, 9개 또는 그 이상의 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 면역원성 폴리펩타이드 단편은 이들 부위 또는 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이루어진 것일 수 있다.
인간 아르기나제 2는 아르기나제 1과 관련이 있으며 서열 상의 유사성이 있다(각각, 서열번호 60과 서열번호 1 참조). 아르기나제 1의 관심 부위는 따라서 아르기나제 2의 관심 부위가 될 수 있다. 따라서, 전술한 부분에서 기재된 서열 중 어느 하나는 하나 이상의 아미노산이 아르기나제 2의 대응되는 부위의 하나 이상의 아미노산으로 대체된 것일 수 있다. 상기 서열 전부는 아르기나제 2의 대응되는 서열로 대체될 수 있다. 면역원성 폴리펩타이드는 서열번호 52, 50, 51, 34, 35, 36, 37, 9, 53, 54, 2 내지 33, 또는 38 내지 49 중 어느 하나의 서열번호 1의 위치에 대응되는 서열번호 60의 위치들로 정의되는 서열번호 60의 서열을 포함하거나 이루어진 것일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 161-210 위치로 정의되는 핫스팟 부위는 본원에서 서열번호 58로 표시되는 서열번호 60의 180-229 위치에 대응된다. 그러므로, 서열번호 52에 대한 내용은 서열번호 58에 대한 참조로서 대체될 수 있다. 면역원성 폴리펩타이드는 서열번호 58의 적어도 8, 9, 또는 바람직하게는 적어도 20 또는 30개의 연속 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
인간 아르기나제 1은 또한 쥐 아르기나제 1(각각, 서열번호 59와 서열번호 1 참조, 도 13)과 매우 유사하다. 따라서, 인간 아르기나제 1에 대하여 전술한 부분에서 기재된 서열 중 어느 하나는 하나 이상의 아미노산이 쥐 아르기나제 1의 대응되는 위치의 하나 이상의 아미노산으로 대체된 것일 수 있다. 상기 서열 전부는 쥐 아르기나제 1의 대응되는 서열로 대체될 수 있다. 면역원성 폴리펩타이드는 서열번호 52, 50, 51, 34, 35, 36, 37, 9, 53, 54, 2 내지 33, 또는 38 내지 49 중 어느 하나의 서열번호 1의 위치에 대응되는 서열번호 59의 위치들로 정의되는 서열번호 59의 서열을 포함하거나 이루어진 것일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 161-210 위치로 정의되는 핫스팟 부위는 본원에서 서열번호 57로 표시되는 서열번호 59의 161-210 위치에 대응된다. 그러므로, 서열번호 52에 대한 내용은 서열번호 57에 대한 참조로서 대체될 수 있다. 면역원성 폴리펩타이드는 서열번호 57의 적어도 8, 9, 또는 바람직하게는 적어도 20 또는 30개의 연속 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 사실상, 이는 이들 잔기를 포함하는 본원에서 기재된 임의의 폴리펩타이드 단편에서, 서열번호 1의 190번 위치에 대응되는 위치의 L이 I로 대체되고 및/또는 서열번호 1의 205번 위치에 대응되는 위치의 R이 K로 대체될 수 있음을 의미한다.
본원에 기재된 임의의 폴리펩타이드 단편에서, C 말단 아미노산은 용해도를 향상시키고 및/또는 제조/분리를 돕기 위해 선택적으로 대응되는 아마이드로 대체될 수 있다. 유사하게, 폴리펩타이드는 용해도를 향상시키고 및/또는 제조/분리를 돕기 위해 N 및/또는 C말단에 적어도 하나의 추가의 모이어티(moiety)가 부착된 것일 수 있다. 적합한 모이어티는 친수성 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 아미노산 KR은 N말단에 추가될 수 있고 및/또는 아미노산 RK는 순서대로 C말단에 추가될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 폴리펩타이드 단편은 바람직하게는 대응되는 전체-길이 아르기나제에 비해 아르기나제 활성이 감소된 것일 수 있다. 아르기나제 활성의 감소는 비활성까지의 감소를 포함한다. 아르기나제 활성을 위한 적합한 분석은 아르기나제 활성 Colorimetric Assay 키트 (BioVision Arginase assay # K755-100)이다.
일 측면에서 본 발명은 다음으로부터 선택된 아르기나제 1의 펩타이드 화합물에 관한 것이다:
a) 8 내지 321개 아미노산의 연속 서열로 이루어진 서열번호 1의 펩타이드 단편,
b) 서열번호 1 또는 a)의 펩타이드 단편과 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 95%의 상동성을 갖는 기능적 상동체(functional homologue), 및
c) 서열번호 1 또는 a)의 펩타이드 단편에 적어도 하나의 아미노산이 결실, 삽입 및/또는 치환된 기능적 유사체(functional analogue),
및 a), b) 또는 c) 중 어느 하나의 C-말단 아미노산이 또한 아마이드;
또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함.
일 실시예에서 펩타이드 화합물은 b) 서열번호 1 또는 a)의 펩타이드 단편과 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 95%의 상동성을 갖는 기능적 상동체(functional homologue)로부터 선택되며, C-말단 아미노산이 또한 아마이드; 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 일 실시예에서 기능적 상동체는 서열번호 1의 적어도 80% 상동성을 가진다. 다른 실시예에서 기능적 상동체는 서열번호 1의 적어도 90% 상동성을 가진다. 다른 실시예에서 기능적 상동체는 서열번호 1의 적어도 95% 상동성을 가진다. 다른 실시예에서 기능적 상동체는 a)의 펩타이드 단편의 적어도 70% 상동성을 가진다. 다른 실시예에서 기능적 상동체는 a)의 펩타이드 단편의 적어도 80% 상동성을 가진다. 다른 실시예에서 기능적 상동체는 a)의 펩타이드 단편의 적어도 90% 상동성을 가진다. 다른 실시예에서 기능적 상동체는 a)의 펩타이드 단편의 적어도 95% 상동성을 가진다.
또 다른 실시예에서 펩타이드 화합물은 c) 서열번호 1 또는 a)의 펩타이드 단편에 적어도 하나의 아미노산이 결실, 삽입 및/또는 치환된 기능적 유사체로부터 선택되며, C-말단 아미노산이 또한 아마이드; 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
다른 실시예에서 펩타이드 화합물은 a) 8 내지 321개 아미노산의 연속 서열로 이루어진 서열번호 1의 펩타이드 단편으로부터 선택되며, C-말단 아미노산이 또한 아마이드; 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 다른 실시예에서 펩타이드 단편은 8 내지 300개 아미노산의 연속 서열로 이루어진다. 다른 실시예에서 펩타이드 단편은 8 내지 250개 아미노산의 연속 서열로 이루어진다. 다른 실시예에서 펩타이드 단편은 8 내지 200개 아미노산의 연속 서열로 이루어진다. 다른 실시예에서 펩타이드 단편은 8 내지 150개 아미노산의 연속 서열로 이루어진다. 다른 실시예에서 펩타이드 단편은 8 내지 120개 아미노산의 연속 서열로 이루어진다. 다른 실시예에서 펩타이드 단편은 10 내지 100개 아미노산의 연속 서열로 이루어진다. 다른 실시예에서 펩타이드 단편은 20 내지 80개 아미노산의 연속 서열로 이루어진다. 다른 실시예에서 펩타이드 단편은 30 내지 60개 아미노산의 연속 서열로 이루어진다. 다른 실시예에서 펩타이드 단편은 40 내지 50개 아미노산의 연속 서열로 이루어진다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(1-310), ARG(1-301), ARG(1-291), ARG(11-322), ARG(21-322), ARG(30-322), ARG(40-322), ARG(11-310), ARG(11-301), ARG(11-291), ARG(21-310), ARG(21-301), ARG(21-291), ARG(30-310), ARG(30-301), ARG(30-291), ARG(40-310), ARG(40-301), 및 ARG(40-291)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(1-310)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(1-301)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(1-291)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(11-322)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(21-322)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(30-322)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(40-322)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(11-310)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(11-301)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(11-291)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(21-310)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(21-301)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(21-291)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(30-310)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(30-301)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(30-291)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(40-301)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(40-301)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(40-291)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(161-190)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(180-210)으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서 서열번호 1의 펩타이드 단편은 ARG(161-210)으로부터 선택된다.
펩타이드 단편이 8 내지 120개 범위의 연속 서열로 이루어진 경우, 예를 들어 ARG(40-291)의 서열 내에서 동시에 선택될 수 있는 반면, 8 내지 321개 범위의 연속 서열로 이루어진 펩타이드 단편은 예를 들어 ARG(40-291)의 서열 내에서 동시에 선택될 수 없으며, 이는 당업자에게 알려져 있다고 이해될 것이다. 그 외 모든 조합이 본 발명 내에서 고려된다.
또한 ARG(x-y)에 있어서, x와 y는 본원에 정의된 서열번호 1을 갖는 아르기나제의 펩타이드 단편을 의미하는 것으로 사용되는 1 내지 322 사이의 정수로, x는 N-말단 아미노산이고 y는 C-말단 아미노산이며, 예를 들어 ARG(174-182)는 서열번호 1의 아미노산 174부터 서열번호 1의 아미노산 182까지의, 여기서 아미노산 174는 I이고 아미노산 182는 V인 펩타이드 단편을 의미한다.
용어 “상동성(identity)”은 2개 이상의 펩타이드, 예를 들어 폴리펩타이드의 서열들을 비교하여 결정되는 서열 간의 관계를 나타낸다. 당 분야에서, “상동성”은 또한 단백질 또는 폴리펩타이드 사이의 서열 연관성의 정도를 의미하며, 2개 이상의 아미노산 잔기 사이의 일치 수에 의해 결정된다. “상동성”은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, “알고리즘(algorithms)”에 의해 처리된 갭(gap) 정렬(있을 경우)을 갖는 2개 이상의 서열 중 더 작은 것 사이의 동일한 대응(match)의 백분율을 측정한다. 관련된 단백질 또는 펩타이드의 상동성은 알려진 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 이러한 방법들은 Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Pro-jects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Se-quence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48, 1073, (1988)에 기재된 내용을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상동성을 결정하는 바람직한 방법은 실험에 사용된 서열 간의 가장 큰 일치도를 제공하도록 설계되었다. 상동성을 결정하는 방법은 공개적으로 사용 가능한 컴퓨터 프로그램에 설명되어 있다. 2개 서열 간 상동성을 결정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법에는 GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12, 387, (1984)을 포함하는 GCG program package,; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, (1990))가 포함된다. BLASTX 프로그램은 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI) 및 다른 출처(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra)로부터 공개적으로 사용가능하다. 잘 알려진 스미스-워터맨(Smith Waterman) 알고리즘 역시 상동성 결정에 사용될 수 있다.
예를 들어, 컴퓨터 알고리즘 GAP(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)을 사용하여, 서열 상동성 백분율이 결정될 2개 단백질을 이들 각각의 아미노산의 최적 일치(optimal matching)를 위해 정렬한다(“대응되는 스팬(matched span)”, 알고리즘에 의해 결정됨). 알고리즘과 함께, 갭 열림 패널티(gap opening penalty)(평균 대각선의 3배로서 계산됨; “평균 대각선(average diagonal)”은 사용되는 비교 매트릭스 상의 대각선의 평균; “대각선(diagonal)”은 특정 비교 매트릭스 상에서 각각의 완벽한 아미노산 대응에 부여되는 점수 또는 숫자) 및 갭 확장 패널티(gap extension penalty)(주로 {(1/10)} x 갭 열림 패널티에 해당), 뿐만 아니라 PAM250 또는 BLOSUM62와 같은 비교 매트릭스가 사용된다. 알고리즘에 의해 표준 비교 매트릭스(PAM250 비교 매트릭스는 Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978); BLOSUM62 비교 매트릭스는 Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89, 10915-10919, (1992) 참조) 또한 사용된다. 단백질 또는 펩타이드 서열 비교를 위한 바람직한 파라미터는 다음을 포함한다: 알고리즘: Needleman et al., J. Mol. Biol, 48, 443-453, (1970); 비교 매트릭스: BLOSUM 62 (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10915-10919, (1992)); 갭 페널티: 12, 갭 길이 패널티(Gap Length Penalty: 4, 유사도 역치(Threshold of Similarity): 0. GAP 프로그램은 상기 파라미터에서 유용하다. 전술한 파라미터는 GAP 알고리즘을 이용한 단백질 비교(마지막 갭(end gap)에 대해 페널티 없음)를 위한 기본 파라미터에 해당한다.
다른 실시예에서 아르기나제 활성은 아르기나제 활성 분석에서 측정 시 아르기나제 1과 비교하여 감소되었다. 일 실시예에서 아르기나제 활성은 비활성까지 감소되었다. 또 다른 실시예에서 아르기나제 활성 분석은 아르기나제 활성 Colorimetric Assay 키트( BioVision Arginase assay # K755-100)로부터 선택되었다. 다른 실시예에서 아르기나제 활성은 아르기나제 활성 Colorimetric Assay 키트( BioVision Arginase assay # K755-100)로부터 선택된 아르기나제 활성 분석에서 측정 시 아르기나제 1과 비교하여 비활성까지 감소되었다.
또 다른 실시예에서 연속 서열은 서열번호 2 내지 17에서 선택된 어느 하나의 하나 이상의 서열을 포함한다. 일 실시예에서 연속 서열은 서열번호 9에서 선택된 서열을 포함한다. 또 다른 실시예에서 연속 서열은 서열번호 9에서 선택된 서열만을 포함하고, 서열번호 2 내지 8 또는 10 내지 17의 어느 서열도 포함하지 않는다.
다른 실시예에서 연속 서열은 서열번호 50을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시예에서 연속 서열은 서열번호 51을 갖는 서열을 포함한다. 다른 실시예에서 연속 서열은 서열번호 52를 갖는 서열을 포함한다.
다른 실시예에서 a)에 따른 펩타이드 단편, b)에 따른 기능적 상동체, 또는 c)에 따른 기능적 유사체는 아르기나제 1을 발현하는 세포를 인식하는 T세포를 활성화시킨다. 일 실시예에서 상기 활성은 본원에 기재된 ELISPOT 분석을 통해 결정된다. 또 다른 실시예에서 a)에 따른 펩타이드 단편은 본원에 기재된 ELISPOT 분석을 통해 결정된 바와 같이 아르기나제 1 발현 세포를 인식하는 T세포를 활성화시킨다.
본 발명의 일 측면에서 아르기나제 1의 펩타이드 화합물은 다음에서 선택된다:
a) 서열번호 52 또는 8 내지 49개 아미노산의 연속 서열로 이루어진 서열번호 52의 펩타이드 단편,
b) 서열번호 52 또는 a)의 펩타이드 단편과 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 95%의 상동성을 갖는 기능적 상동체(functional homologue), 및
c) 서열번호 52 또는 a)의 펩타이드 단편에 적어도 하나의 아미노산이 결실, 삽입 및/또는 치환된 기능적 유사체(functional analogue),
및 a), b) 또는 c) 중 어느 하나의 C-말단 아미노산이 또한 아마이드;
또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함. a), b) 또는 c) 중 어느 펩타이드 화합물도 개별적인 실시예의 대상이 될 수 있다.
다른 실시예에서 펩타이드 단편은 9 내지 49개 아미노산, 예컨대 10 내지 40개의 아미노산, 예컨대 20 내지 30개의 아미노산 범위의 연속 서열로 이루어진다.
다른 실시예에서 서열번호 52의 펩타이드 단편은 8 내지 49개 아미노산을 갖는 연속 서열로 이루어지고, 서열번호 51을 포함한다. 다른 실시예에서 서열번호 52의 펩타이드 단편은 8 내지 49개 아미노산을 갖는 연속 서열로 이루어지고, 서열번호 50을 포함한다. 다른 실시예에서 서열번호 52의 펩타이드 단편은 8 내지 49개 아미노산을 갖는 연속 서열로 이루어지고, 서열번호 9를 포함한다.
다른 실시예에서 펩타이드 단편은 적어도 하나의 CD4+ 및 적어도 하나의 CD8+ T세포 에피토프를 포함한다. 또 다른 실시예에서 펩타이드 단편은 적어도 하나의 CD4+ 또는 적어도 하나의 CD8+ T세포 에피토프를 포함한다. 또 다른 실시예에서 펩타이드 단편은 적어도 하나의 CD4+ T세포 에피토프를 포함한다. 또 다른 실시예에서 펩타이드 단편은 적어도 하나의 CD8+ T세포 에피토프를 포함한다. 또 다른 실시예에서 펩타이드 단편은 모든 T세포 에피토프를 포함하며, 특히 ARG(161-210) 핫-스팟 부위에 위치하는 모든 CD4+ 및 CD8+ 에피토프를 포함한다. 또 다른 실시예에서 펩타이드 단편은 ARG(161-210) 핫-스팟 부위에 위치하는 하나를 제외한 모든 T세포 에피토프, 특히, 모든 CD4+ 및 CD8+ 에피토프를 포함한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드 화합물을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 펩타이드 화합물은 상기 실시예 중 어느 하나로부터 선택된다. 일 실시예에서 상기 핵산은 DNA 및 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 핵산은 상기 실시예 중 어느 하나로부터 선택되고, 본 발명에 따른 펩타이드 화합물은 상기 실시예 중 어느 하나로부터 선택된다. 일 실시예에서 상기 벡터는 바이러스 벡터로부터 선택된다.
다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 벡터는 상기 실시예 중 어느 하나로부터 선택되고, 핵산은 상기 실시예 중 어느 하나로부터 선택되고, 펩타이드 화합물은 상기 실시예 중 어느 하나로부터 선택된다. 일 실시예에서 상기 숙주 세포는 포유동물 세포로부터 선택된다.
또 다른 측면에서 본 발명은 아르기나제 1의 비활성 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것으로 다음에서 선택된다:
a) 8 내지 321개 아미노산의 연속 서열로 이루어진 서열번호 1의 펩타이드 단편,
b) 서열번호 1 또는 a)의 펩타이드 단편과 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 95%의 상동성을 갖는 기능적 상동체(functional homologue), 및
c) 서열번호 1 또는 a)의 펩타이드 단편에 적어도 하나의 아미노산이 결실, 삽입 및/또는 치환된 기능적 유사체(functional analogue),
및 a), b) 또는 c) 중 어느 하나의 C-말단 아미노산이 또한 아마이드를 포함하고, 상기 핵산은 비활성 서열을 발현하며, 및 상기 비활성 서열은 적어도 1개의 면역원성 에피토프를 포함. 일 실시예에서 상기 에피토프는 서열번호 2 내지 17로 이루어진 군에서 선택되며, 일반적으로 상기 에피토프는 서열번호 9에서 선택된다. 또 다른 실시예에서 상기 에피토프는 서열번호 50 내지 52 중 어느 하나를 포함하는 적어도 8개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다.
다른 측면에서 본 발명은 선택적으로 담체 또는 어쥬번트와 같은 약학적으로 허용가능한 첨가제와 함께, 본 발명에 개시된 펩타이드 화합물 또는 핵산 또는 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 면역치료 조성물에 관한 것으로
의약에 사용하기 위한
a) 본 발명에 따른 펩타이드 화합물 또는 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터 또는 본 발명에 따른 숙주 세포; 및
b) 어쥬번트; 를 포함한다.
일 실시예에서 면역치료 조성물은 암으로부터 선택된 질병, 장애 또는 증상을 치료 또는 예방하는 방법을 위해 사용된다. 일 실시예에서 암은 종양 형성 암 질환이다. 다른 실시예에서 어쥬번트는 박테리아 DNA 기반 어쥬번트, 오일/계면활성제 기반 어쥬번트, 바이러스 dsRNA 기반 어쥬번트, 이미다조치닐린(imidazochinilines), 및 몬타니드(Montanide) ISA 어쥬번트로 이루어진 군에서 선택된다.
다른 측면에서 본 발명은 부품 키트(kit-of-parts)에 관한 것으로 이는
a) 본 발명에 따른 면역치료 조성물, 및
b) 인터루킨(interleukin), 예를 들어 IL-2 및 또는 IL-21과 같은 면역자극 화합물, 액티마이드(Actimide), 아자시티딘(Azacitidine), 아자티오프린(Azathioprine), 블레오마이신(Bleomycin), 카보플라틴(Carboplatin), 카페시타빈(Capecitabine), 시스플라틴(Cisplatin), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 사이타라빈(Cytarabine), 다우노루비신(Daunorubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 독시플루리딘(Doxifluridine), 독소루비신(Doxifluridine), 에피루비신(Epirubicin), 에토포시드(Etoposide), 플루다라빈(Fludarabine), 플루오로우라실(Fluorouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 하이드록시우레아(Hydroxyurea), 이다루비신(Idarubicin), 이리노테칸(Irinotecan), 레날리도마이드(Lenalidomide), 류코보린(Leucovorin), 메클로레타민(Mechlorethamine), 멜팔란(Melphalan), 메르캅토퓨린(Mercaptopurine), 메토트렉세이트(Methotrexate), 미톡산트론(Mitoxantrone), 니볼루맙(Nivolumab), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 펨블로리주맙(Pembrolizumab), 페메트렉시드(Pemetrexed), 레블리미드(Revlimid), 테모졸로마이드(Temozolomide), 테니포시드(Teniposide), 티오구아닌(Thioguanine), 발루비신(Valrubicin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine) 및 비노렐빈(Vinorelbine)과 같은 항암제로부터 선택된 적어도 하나의 2차 활성 성분(active ingredient)을 포함하는 조성물을 포함한다.
부품 키트의 일 실시예에서, 제공된 조성물은 동시 또는 순차적으로 투여된다.
다른 측면에서 본 발명은 서열번호 1의 아르기나제 1의 발현으로 특징지어지는 임상 증상의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 임상적 증상을 앓고 있는 개인에게 본 발명에 따른 펩타이드 화합물, 또는 본 발명에 따른 핵산, 또는 본 발명에 따른 벡터 또는 본 발명에 따른 숙주 세포를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서 본 발명은 암환자에서 CD4 및 CD8 T세포와 같은 아르기나제 1 특이적 T세포를 자극하는 방법으로서, 암환자에게 본 발명의 펩타이드 화합물, 또는 핵산, 또는 벡터 또는 숙주 세포를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 암환자에서 아르기나제 1 발현 세포의 면역 억제 기능을 억제하는 방법으로서, 암환자에게 본 발명의 펩타이드 화합물, 또는 핵산, 또는 벡터 또는 또는 숙주 세포를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 아르기나제 1의 발현을 특징으로 하는 암을 치료 또는 예방하기 위한 면역치료 조성물 또는 백신과 같은 의약을 제조하기 위한 본 발명의 펩타이드 화합물, 또는 핵산, 또는 벡터, 또는 숙주세포의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 추가적인 암 치료와 함께 동시 또는 순차적으로 투여하여 암의 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 펩타이드 화합물, 또는 핵산, 또는 벡터, 또는 숙주 세포에 관한 것이다.
추가적인 암 치료는 사이토카인 치료, T 세포 치료, NK 치료, 면역계 관문 억제제(immune system checkpoint inhibitor), 화학요법(chemotherapy), 방사선 치료(radiotherapy), 면역증강 물질(immunostimulating substances), 유전자 치료(gene therapy), 항체 및 수지상 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 일 실시예에서 추가적인 암 치료는 예를 들어 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙과 같은 면역계 관문 억제 항체와 같은 면역계 관문 억제제로부터 선택된 것일 수 있고, 또는 액티마이드(Actimide), 아자시티딘(Azacitidine), 아자티오프린(Azathioprine), 블레오마이신(Bleomycin), 카보플라틴(Carboplatin), 카페시타빈(Capecitabine), 시스플라틴(Cisplatin), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 사이타라빈(Cytarabine), 다우노루비신(Daunorubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 독시플루리딘(Doxifluridine), 독소루비신(Doxifluridine), 에피루비신(Epirubicin), 에토포시드(Etoposide), 플루다라빈(Fludarabine), 플루오로우라실(Fluorouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 하이드록시우레아(Hydroxyurea), 이다루비신(Idarubicin), 이리노테칸(Irinotecan), 레날리도마이드(Lenalidomide), 류코보린(Leucovorin), 메클로레타민(Mechlorethamine), 멜팔란(Melphalan), 메르캅토퓨린(Mercaptopurine), 메토트렉세이트(Methotrexate), 미톡산트론(Mitoxantrone), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 페메트렉시드(Pemetrexed), 레블리미드(Revlimid), 테모졸로마이드(Temozolomide), 테니포시드(Teniposide), 티오구아닌(Thioguanine), 발루비신(Valrubicin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine) 및 비노렐빈(Vinorelbine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
아르기나제 활성은 예를 들어 아르기나제 활성 Colorimetric Assay 키트(BioVision Arginase assay # K755-100)를 이용하여 측정될 수 있다. BioVision의 아르기나제 활성 분석 키트는 단순하고, 민감하며 신속하다. 이 분석에서, 아르기나제는 아르기닌과 반응하고 유색 생성물을 생성하기 위해 OxiRed™프로브(probe)와 세포조직생리학적으로(stoichiometrically) 반응하여 중간체를 형성하는 일련의 반응을 거친다. 상기 키트는 96-웰 분석 포맷에서 아르기나제 활성을 0.2 U/L 이하로 검출할 수 있다.
본원에서 나타난 모든 아미노산 서열은 C-말단 아미노산이 아마이드 형태(-CONH2) 또는 산 형태(-COOH)로 변형될 수 있고, 따라서 이들 중 어느 하나는 바람직한 실시예이며, I, F, R, L, K, G, M, D, V, S, T, N, Y, P와 같은 임의의 C-말단 아미노산은 -NH2 또는 -OH로 기술되지 않는 이상 아마이드 및 산 형태를 동시에 포함한다.
본원에 개시된 아르기나제 펩타이드 단편은 고상 펩타이드 합성(solid-phase peptide synthesis)과 같은 표준 펩타이드 합성에 따라 제조되었다. SPPS는 실험실에서 펩타이드를 합성하는 표준 방법이다. SPPS는 박테리아에서 발현되기 힘든 자연 펩타이드의 합성, 자연적이지 않은 아미노산의 도입, 펩타이드/단백질 백본(backbone) 수정, 및 D-아미노산으로 이루어진 D-단백질의 합성을 가능하게 한다. 작은 다공성 비드를 펩타이드 사슬이 만들어질 수 있는 기능적 단위('링커(linkers)')와 함께 처리한다. 펩타이드는 무수 불화수소(anhydrous hydrogen fluoride) 또는 트리풀루오로아세트산(trifluoroacetic acid)과 같은 시약에 의해 절단될 때까지 비드에 공유결합한 상태로 유지된다. 상기 펩타이드는 따라서 고상에 '고정화(immobilized)'되고 액상 시약 및 합성 부산물이 씻겨져 나가는 동안 여과 과정에서 유지될 수 있다. SPSS의 일반적인 원리는 탈보호(deprotection)-세척(wash)-커플링(coupling)-세척(wash)의 반복되는 사이클 중 하나이다. 고상 부착 펩타이드의 유리 N-말단 아민은 단일 N-보호된 아미노산 단위(unit)에 커플링된다. 이 단위는 이후 탈보호되고, 새로운 N-말단 아민을 드러내어 추가적인 아미노산이 결합될 수 있다. 이 기술의 우위는 부분적으로 각 반응 이후 세척 단계를 수행하여, 불용성 수지(resin)에 공유결합 된 채로 남아 성장하는 목적 펩타이드의 전부와 함께 과량의 시약을 제거하는 능력에 있다. SPSS로 주로 사용되는 두 가지 형태로 Fmoc과 Boc가 있다. 리보솜(ribosome) 단백질 합성과 달리, 고상 펩타이드 합성은 C-말단에서 N-말단으로 합성이 진행된다. 아미노산 단량체의 N-말단은 이들 두 그룹 중 어느 하나로 보호되고, 탈보호된 아미노산 사슬에 가서 첨가된다. 많은 연구 그룹이 수동으로 SPPS를 수행하지만, 두 기술 모두 자동화된 합성기(automated synthesizers)가 존재한다. 나아가, 당업자라면 전술한 과정 및 중간 화합물의 기능적 작용기가 보호기(protecting group)에 의해 보호될 필요가 있음을 이해할 것이다.
본원에 기재된 펩타이드 화합물, 핵산, 벡터, 숙주 세포 및 약학적 조성물이 상기 치료에 사용되는 경우, 적어도 하나의 조성물의 치료적으로 유효한 양이 상기 치료를 필요로 하는 포유 동물에게 투여된다.
본원에서 사용된 바와 같이 아미노산은 당업자에게 알려진 한 글자 또는 세 글자 코드로서 식별되며 편의를 위해 하기 표에 나타내었다:
아미노산, 한 글자 및 세 글자 코드
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본원에 사용된 용어 “치료” 및 “치료하는”은 질병 또는 장애와 같은 증상을 방지하기 위한 목적으로 환자를 관리(management) 및 간호(care)하는 것을 의미한다. 상기 용어는 증상 또는 합병증을 경감시키고, 질병, 장애 또는 증상의 진행을 지연시키고, 증상 또는 합병증을 경감시키고, 및/또는 질병, 장애 또는 증상을 치료 또는 제거할 뿐만 아니라 증상을 예방하기 위해 환자가 앓고 있는 주어진 증상에 대하여 활성 화합물의 투여와 같은 치료의 전체 스펙트럼을 포함하는 것으로, 상기 예방은 질병, 증상, 또는 장애를 방지하기 위한 목적으로 환자를 관리 및 간호하고, 증상 또는 합병증의 발병을 예방하기 위해 활성 화합물의 투여를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 치료는 급성 또는 만성적으로 수행될 수 있다. 치료되어야 하는 환자는 바람직하게는 포유동물이고; 특히 인간이지만, 개, 고양이, 소, 원숭이(monkeys), 유인원(apes), 양 및 돼지와 같은 동물도 또한 포함한다.
본원에 기재된 본 발명에 따른 펩타이드 화합물 또는 펩타이드 단편의 “치료적으로 유효한 양(a therapeutically effective amount)”은, 주어진 질환 및 이의 합병증의 임상 양상을 치료, 경감 또는 부분적으로 정지시키기 위해 충분한 양을 의미한다. 이를 달성하기에 충분한 양을 “치료적으로 유효한 양”이라고 한다. 각 목적에 대한 유효량(effective amounts)은 질병 또는 부상의 중증도뿐만 아니라 개체의 무게 및 일반적인 상태에 달려 있다. 적당한 투여량(dosage)의 결정은 값을 행렬(matrix)로 구성하거나 행렬에서 서로 다른 값을 실험해보는 등 숙련된 의사 또는 수의사의 통상적인 기술에 해당하는 일상적인 실험(routine experimentation)에 따라 달성될 수 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은 펩타이드 단편과 같은 본 발명에 따른 펩타이드 화합물 및 담체(carrier) 또는 부형제(excipient)와 같은 약학적으로 허용가능한 첨가제(additive)를 선택적으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본원에서 “약학적으로 허용가능한 첨가제”는 당업자가 약학적 조성물을 제조하기 위해 본 발명에 따른 화합물을 제형화할 때 사용하는 것으로 고려할 수 있는 담체, 부형제, 희석제, 어쥬번트, 착색제(colorings), 방향제(aroma), 보존제(preservatives) 등을 제한 없이 포함한다.
본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 어쥬번트, 희석제, 부형제 및/또는 담체는 펩타이드 화합물, 펩타이드 단편, 핵산, 벡터, 또는 숙주 세포 및 약학적 조성물의 다른 구성성분과 적합성(compatibility)이 있어야 한다는 의미로 약학적으로 허용가능해야 하며, 수용자에게 해롭지 않아야 한다. 상기 조성물은 바람직하게는 알러지 반응과 같은 부작용을 일으킬 수 있는 어떤 물질도 포함하지 않아야 한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물에 사용될 수 있는 어쥬번트, 희석제, 부형제 및 담체는 당업자에게 잘 알려져 있다.
어쥬번트는 조성물에 첨가된 혼합물로 조성물에 의해 유도되는 면역 반응을 증가시키거나 또는 다른 방식으로 변형시키는 임의의 물질이다. 어쥬번트는, 광범위하게 정의되는 경우, 면역 반응을 촉진하는 물질에 해당한다. 어쥬번트는 투여 부위로부터 활성 성분의 느리고 계속적인 방출을 야기한다는 점에서 바람직하게는 창고 효과(depot effect)를 가질 수 있다. 어쥬번트에 대한 일반적인 논의는 Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (2nd edition, 1986)의 61-63 페이지에 나와 있다.
어쥬번트는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4 (SO4), 실리카(silica), 알룸(alum), Al(OH)3, Ca3 (PO4)2, 카올린(kaolin), 탄소(carbon), 수산화 알루미늄(aluminum hydroxide), 뮤라밀 디펩타이드(muramyl dipeptides), N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine, thr-DMP), N-아세틸-놀누라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(N-acetyl-nornuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine, CGP 11687, 또는 nor-MDP로도 지칭됨), N-아세틸뮤라미울-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'2'-디팔미톨-슨-글리세로-3-하이트록시포스포릴록시)-에틸아민(N-acetylmuramyul-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(1'2'-dipalmitoyl-sn -glycero-3-hydroxphosphoryloxy)-ethylamine(CGP 19835A, 또는 MTP-PE로도 지칭됨), 2% 스쿠알렌/트윈-80.RTM. 에멀젼에서 RIBI (MPL+TDM+CWS), 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharides) 및 지질 A, Freund's 완전한 어쥬버트(FAC), Freudn's 불환전한 어쥬번트, 머크 어쥬번트 65, 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 폴리 IC 및 폴리 AU 산), 마이코박테리움으로부터 왁스 D, 결핵(tuberculosis), 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum), 보데텔라 펄투시스(Bordetella pertussis) 및 브루셀라(Brucella) 속의 멤버에서 발견되는 물질, 리포솜 또는 다른 지질 에멀젼, 티터맥스, ISCOMS, 퀴일(Quil A), ALUN(US 58767 및 5,554,372 참조), 지질 A 유도체들, 콜레라톡신 유도체들, HSP 유도체들, LPS 유도체, 합성 펩타이드 매트릭스 또는 GMDP, 인터루킨 1, 인터루킨 2, 몬타나이드 ISA-51(Montanide ISA-51) 및 QS-21을 포함하는 다양한 유도체들. 다양한 사포닌 유도체들 또한 면역원성 조성물에서 어쥬번트로서 유용하다고 제안되어 왔다. 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF) 또한 어쥬번트로 사용될 수 있다.
본 발명과 사용될 수 있는 바람직한 어쥬번트는 몬타니드 어쥬번트(Montanide adjuvants)(Seppic, Belgium에서 입수 가능), 바람직하게는 몬타니드 ISA-51과 같은 오일/계면활성제 기반 어쥬번트를 포함한다. 다른 바람직한 어쥬번트로는 CpG 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 박테리아 DNA 기반 어쥬번트가 있다. 또 다른 바람직한 어쥬번트로는 폴리 I:C와 같은 바이러스 dsRNA 기반 어쥬번트가 있다. GM-CSF 및 이미다조치닐린(Imidazochinilines)은 바람직한 어쥬번트의 또 다른 예이다.
가장 바람직한 어쥬번트는 몬타니드 ISA 어쥬번트이다. 몬타니드 ISA 어쥬번트는 바람직하게는 Montanide ISA 51 또는 Montanide ISA 720이다.
Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (2nd edition, 1986)의 61-63페이지를 보면 목적 항원의 분자량이 낮거나, 면역원성이 낮은 경우, 면역원성 담체와 커플링하는 것이 권장된다. 본 발명에 따른 면역치료 조성물의 펩타이드 화합물, 펩타이드 단편, 핵산, 벡터, 또는 숙주 세포는 담체와 커플링될 수 있다. 담체는 어쥬번트와 독립적으로 존재할 수 있다. 담체의 기능은, 예를 들어, 펩타이드 화합물, 펩타이드 단편, 핵산, 벡터, 또는 숙주 세포의 분자량을 증가시켜 활성 또는 면역원성을 증가시키거나, 안정성을 부여하거나, 생물학적 활성을 증가시키거나, 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 나아가, 담체는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 T세포에 제시하는 것을 도울 수 있다. 따라서, 면역원성 조성물에서, 폴리펩타이드 또는 이의 단편은 하기에 기재된 바와 같은 담체와 결합될 수 있다.
상기 담체는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 담체, 예를 들어 단백질 또는 수지상세포(dendritic cell, DC)와 같은 항원 제시 세포(antigen presenting cell)일 수 있다. 담체 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 트렌스페린(transferrin), 소태아 혈청(bovine serum albumin), 인간 혈청 알부민(human serum albumin), 갑상선글로불린(thyroglobulin) 또는 오브알브민(ovalbumin)과 같은 혈청 단백질, 면역글로불린(immunoglobulins) 또는 인슐린(insulin)과 같은 호르몬 또는 팔미트산을 포함한다. 또는, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid) 또는 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid)일 수 있다. 또는, 담체는 세파로스(sepharose)와 같은 덱스트란(dextran)일 수 있다. 담체는 인간에게 생리적으로 적합하고 안전해야한다.
면역치료 조성물은 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 상기 부형제는 조성물의 다른 구성성분과 적합성(compatibility)이 있어야 한다는 의미로 '허용가능(acceptable)'해야 하며, 수용자에게 해롭지 않아야 한다. 부형제(excipient)에는 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 및 이의 유사물질과 같은 보조 물질(auxiliary substances)이 존재할 수 있다. 이들 부형제 및 보조 물질은 일반적으로 조성물을 받아들이는 개인에서 면역 반응을 유도하지 않는 약학적 제제이며, 과도한 독성 없이 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 물, 식염수(saline), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 히알루론산(hyaluronic acid), 글리세롤(glycerol) 및 에탄올과 같은 액체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 약학적으로 허용가능한 염에는, 예를 들어, 염산염(hydrochlorides), 브롬화수소산염(hydrobromides), 인산염, 황산염 및 이의 유사물질과 같은 무기산 염(mineral acid salts); 및 아세트산염, 프로피온산염, 말산, 벤조산염, 및 이의 유사물질과 같은 유기산이 포함될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제, 비히클 및 보조 물질에 대한 철저한 논의는 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)에서 알 수 있다.
면역치료 조성물은 한번에(bolus) 투여 또는 계속적인 투여를 위해 적합한 형태로 준비되고, 포장되고, 또는 판매될 수 있다. 주사용 조성물은 앰풀(ampoules) 또는 보존제를 포함하는 다회 투여 용기와 같은 단위 투여 형태로 준비되고, 포장되고, 또는 판매될 수 있다. 조성물은 부유액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 내의 에멀젼, 페이스트 및 이식가능한 서방형 또는 생분해성 제형을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 조성물의 일 실시예에서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 투여 전에 적합한 비히클(예를 들어, 발열성 물질이 없는(pyrogen-free) 멸균수)과의 재구성을 위하여 건조된(예를 들어, 분말 또는 과립) 형태로 제공된다. 조성물은 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 부유액 또는 용액 상태로 준비되고, 포장되고, 또는 판매될 수 있다. 이 부유액 또는 용액은 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있으며, 활성 성분 이외에, 본원에 기재된 어쥬번트, 부형제 및 보조 물질과 같은 추가 성분을 포함할 수 있다. 이러한 멸균 주사 제형은 비독성의 비경구적으로-허용되는 희석제 또는 용매, 예를 들어 물 또는 1,3-부탄디올을 사용하여 준비될 수 있다. 다른 허용가능한 희석제 및 용매는 링거 용액(Ringer's solution), 등장성 식염수 용액(isotonic sodium chloride solution), 및 합성 모노-또는 디-글리세라이드(synthetic mono-or di-glyceride)와 같은 고정유(fixed oil)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
유용한 기타 조성물은 활성 성분을 미정질(microcrystalline) 형태, 리포좀 제제, 또는 생분해성 중합체 시스템의 구성성분으로서 포함한다. 서방형 또는 이식용 조성물은 에멀젼, 이온 교환 수지, 난용성 중합체(sparingly soluble polymer), 또는 난용성 염(sparingly soluble salt)과 같은 약학적으로 허용가능한 중합체성(polymeric) 또는 소수성 물질을 포함한다. 또는, 조성물의 활성 성분은 입자 담체(particulate carrier)와 캡슐화, 흡수 또는 결합될 수 있다. 적합한 입자 담체는 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate) 중합체로부터 유래된 것, 뿐만 아니라 폴리락타이드(poly(lactides)) 및 폴리락틱코글리코릭산(poly(lactide-co-glycolides))으로부터 유래된 PLG 미세입자를 포함한다. 예를 들어, Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10:362-368 참조. 그 외 입자 시스템 및 중합체, 예를 들어, 폴리리신(polylysine), 폴리아르기닌(polyarginine), 폴리오르니틴(polyornithine), 스페르민(spermine), 스페르미딘(spermidine), 뿐만 아니라 이들 분자의 컨쥬게이트(conjugates)와 같은 중합체도 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본원에 개시된 조성물 및 특히 면역치료 조성물은, 본원에 기재된 조성물 이외에, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 어쥬번트, 희석제, 부형제 및/또는 담체를 더 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 약학적 조성물은 1 내지 99 중량%의 상기 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 어쥬번트, 희석제, 부형제 및/또는 담체 및 본원에 개시된 1 내지 99 중량%의 화합물을 포함한다. 활성 성분 및 약학적으로 허용가능한 어쥬번트, 희석제, 부형제 및/또는 담체의 혼합된 양은 조성물, 특히 약학적 조성물의 100 중량%를 초과하여 구성될 수 없다.
일부 실시예에서, 본원에 개시된 오직 하나의 화합물만이 상기 목적으로 사용된다.
일부 실시예에서, 본원에 개시된 2개 이상의 화합물은 상기 목적을 위해 조합하여 사용된다.
조성물, 특히 본원에 기재된 화합물을 포함하는 면역치료 조성물은 경구, 정맥 내, 국소, 복강 내, 비강, 협측, 설하, 또는 피하 투여용, 또는 호흡관을 통한 투여를 위한 형태, 예를 들어, 에어로솔(aerosol) 또는 부유된 미세 분말(air-suspended fine powder)로 조정된 것일 수 있다. 따라서, 약학적 조성물은, 예를 들어, 정제, 캡슐, 분말, 나노입자, 결정, 비정질 물질, 용액, 경피 패치 또는 좌제의 형태일 수 있다.
제조공정의 다른 실시예는 본원의 실험예에 기재되어 있고, 각 개별 제조공정뿐만 아니라 각 출발 물질은 실시예의 부분을 형성할 수 있는 실시예를 구성한다.
상기 실시예는 본원 발명의 특정 측면 또는 측면들과 관련되어 있다고 별도로 기재되지 않는 한 본원에 기재된 임의의 일 측면(예를 들면, '치료 방법', '면역치료 조성물', '의약으로 사용하기 위한 펩타이드 화합물', 또는 '방법에 사용하기 위한 펩타이드 화합물')뿐만 아니라 본원에 기재된 임의의 일 실시예도 지칭할 수 있는 것으로 보아야 한다.
본원에 인용된 간행물, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 문헌은 각 문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참고문헌으로 인용되도록 지시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고 문헌으로 포함되며, 본원에 그 전부가 기재되어 있다.
본원에 사용된 모든 표제 및 소제목은 편의를 위해서만 사용되었으며 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에서 달리 지시되지 않는 한 또는 문맥에 의해 명백하게 부정되지 않는 한 모든 가능한 변형의 상기 언급된 요소의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.
개시된 제품 및 방법의 서로 다른 적용은 당 업계의 특정 요구에 따라 조정될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 본 발명의 특정 실시예를 설명하기 위한 것이며, 제한하기 위한 것이 아님을 이해하여야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 것과 같이, 단수 형태 “a”“an”및 “the”는 내용 중 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, “펩타이드(a peptide)”는 2개 이상의 이러한 펩타이드를 포함한다.
본원에 사용된 “폴리펩타이드(polypeptide)”는 2개 이상의 아미노산 소단위(subunit), 아미노산 유사체, 또는 다른 펩티드 모방체(peptidomimetics)의 화합물을 지칭하는 가장 넓은 의미이다. 용어 “폴리펩타이드”는 따라서 짧은 펩타이드 서열 및 더 긴 폴리펩타이드 및 단백질을 포함한다. 본원에서 사용된, 용어 “아미노산(amino acid)”은 D 또는 L 광학 이성질체 모두, 아미노산 유사체 및 펩티드 모방체, 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다.
본원에 사용된 “개체(subject)”는 임의의 포유동물, 바람직하게는 인간을 포함한다.
본원에서 값의 범위를 열거한 것은 본원에 다른 언급이 없는 한, 범위 내에 속하는 각 개별값을 개별적으로 언급하는 약식 방법으로 기능하는 것으로 의도되며, 각 개별값은 개별적으로 인용된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 제공된 모든 정확한 값은 상응하는 근사값을 나타낸다(예를 들어, 특정 요소 또는 측정과 관련한 모든 정확한 예시값은 적절한 경우 “약(about)”으로 수정된 상응하는 대략의 측정치를 제공하는 것으로 간주될 수 있다).
본원에 기재된 모든 방법은 본원에 달리 기재되지 않거나 문맥에 의해 명백하게 부정되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다.
본원에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, “와 같은(such as)”의 사용은 달리 명시되지 않는 한 본원 발명을 보다 잘 나타내도록 의도된 것이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서에서 어떠한 언어도 명세적으로 언급되지 않는 한 임의의 요소가 본 발명의 실시에 필수적임을 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에서 특허 문헌의 인용 및 포함은 편의를 위해서만 이루어진 것이며, 이러한 특허 문헌의 유효성, 특허가능성 및/또는 권리행사에 대한 어떠한 견해도 반영하지 않는다.
“~을 포함하는(comprising)”“갖는(having)”“포함하는(including)”또는 “포함하는(containing)”과 같은 용어를 요소 또는 요소들과 관련하여 사용하는 본 발명의 임의의 측면 또는 실시예에 대한 본원의 설명은 달리 명시되거나 또는 문맥에 의하여 명백하게 부정되지 않는 한 특정 요소 또는 요소들 “~로 이루어진(comsists of)”“필수적으로 이루어진(consists essentially of)”또는 “실질적으로 포함하는(substantially comprises)” 본원 발명의 유사한 측면 또는 실시예를 위한 뒷받침을 제공하기 위한 것이다(예를 들어, 특정 요소를 포함하는 것으로 본원에 기재된 조성물은 또한 달리 명시되거나 또는 문맥에 의하여 명백하게 부정되지 않는 한 그 요소로 이루어진 조성물도 의미하는 것으로 이해되어야 한다).
본 발명은 적용 가능한 법에 의해 허용되는 최대 한도 내에서 본 명세서에 인용된 대상의 모든 변형 및 등가물을 포함한다.
측면
다음은 본 개시내용의 몇 가지 추가적인 측면이다:
1. 하기로부터 선택되는 아르기나제 1 펩타이드 화합물:
a) 8 내지 321개 아미노산의 연속 서열로 이루어진 서열번호 1의 펩타이드 단편,
b) 서열번호 1 또는 a)의 펩타이드 단편과 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 95%의 상동성을 갖는 기능적 상동체(functional homologue), 및
c) 서열번호 1 또는 a)의 펩타이드 단편에 적어도 하나의 아미노산이 결실, 삽입 및/또는 치환된 기능적 유사체(functional analogue),
및 a), b) 또는 c) 중 어느 하나의 C-말단 아미노산이 또한 아마이드;
또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것.
2. 8 내지 321개 아미노산의 연속 서열로 이루어진 서열번호 1의 펩타이드 단편인 a)로부터 선택된 1측면의 펩타이드 화합물로서, C-말단 아미노산이 아마이드; 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것.
3. 펩타이드 단편이 8 내지 300개의 아미노산, 8 내지 250개의 아미노산, 8 내지 200개의 아미노산, 8 내지 150개의 아미노산, 8 내지 120개의 아미노산, 예를 들어 10 내지 100개의 아미노산, 20 내지 80개의 아미노산, 30 내지 60개의 아미노산, 40 내지 50개의 아미노산 범위의 연속 서열로 이루어진 2 측면의 펩타이드 화합물.
4. 2-3 측면 중 어느 하나의 펩타이드 화합물로서 서열번호 1의 펩타이드 단편이 ARG(1-310), ARG(1-301), ARG(1-291), ARG(11-322), ARG(21-322), ARG(30-322), ARG(40-322), ARG(11-310), ARG(11-301), ARG(11-291), ARG(21-310), ARG(21-301), ARG(21-291), ARG(30-310), ARG(30-301), ARG(30-291), ARG(40-310), ARG(40-301), 및 ARG(40-291)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것.
5. 1-4 측면 중 어느 하나의 펩타이드 화합물로서 아르기나제 활성 Colorimetric Assay 키트( BioVision Arginase assay # K755-100)와 같은 아르기나제 활성 분석으로 측정 시, 아르기나제 활성이 아르기나제 1에 비해 감소되고, 바람직하게는 비활성(inactivity)까지 감소된 것.
6. 2-5 측면 중 어느 하나의 펩타이드 화합물로서 연속 서열은 서열번호 2 내지 17에서 선택된 어느 하나의 하나 이상, 예를 들어 서열번호 9에서 선택된 서열을 포함하는 것.
7. 1-6 측면 중 어느 하나의 펩타이드 화합물로서 a)에 따른 펩타이드 단편, b)에 따른 기능적 상동체, 또는 c)에 따른 기능적 유사체는 아르기나제 1을 발현하는 세포를 인식하는 T세포를 활성화시키는 것.
8. 7 측면에 따른 펩타이드 화합물로서 활성은 본원에 기재된 ELISPOT 분석을 통해 결정되는 것.
9. 전술한 측면 중 어느 하나의 펩타이드 화합물을 코딩하는, DNA 또는 RNA와 같은, 핵산.
10. 9 측면에 따른 핵산을 포함하는, 바이러스 벡터와 같은, 벡터.
11. 10 측면에 따른 벡터를 포함하는, 포유동물 세포와 같은, 숙주 세포.
12. 다음에서 선택되는 아르기나제 1의 비활성 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터:
a) 8 내지 321개 아미노산의 연속 서열로 이루어진 서열번호 1의 펩타이드 단편,
b) 서열번호 1 또는 a)의 펩타이드 단편과 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 95%의 상동성을 갖는 기능적 상동체(functional homologue), 및
c) 서열번호 1 또는 a)의 펩타이드 단편에 적어도 하나의 아미노산이 결실, 삽입 및/또는 치환된 기능적 유사체(functional analogue),
및 a), b) 또는 c) 중 어느 하나의 C-말단 아미노산이 또한 아마이드를 포함하고, 상기 핵산은 비활성 서열을 발현하며, 및 상기 비활성 서열은 적어도 1개의 면역원성 에피토프를 포함하며, 상기 에피토프는 서열번호 2 내지 17로 이루어진 군에서 선택되며, 일반적으로 상기 에피토프는 서열번호 9에서 선택되는 것.
13. 선택적으로 담체 또는 어쥬번트와 같은 약학적으로 허용가능한 첨가제와 함께 1-8 측면 중 어느 하나의 펩타이드 화합물을 포함하는 조성물, 9측면의 핵산 또는 10 또는 12 측면의 벡터 또는 11 측면의 숙주 세포를 포함하는 조성물.
14. 의약에 사용하기 위한
a) 본 발명에 따른 펩타이드 화합물 또는 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터 또는 본 발명에 따른 숙주 세포; 및
b) 어쥬번트; 를 포함하는 면역치료 조성물.
15. 암으로부터 선택된 질병, 장애 또는 증상을 치료 또는 예방하는 방법을 위해 사용되는 14 측면에 따른 면역치료 조성물.
16. 14-15 측면 중 어느 하나의 면역치료 조성물로서 어쥬번트는 박테리아 DNA 기반 어쥬번트, 오일/계면활성제 기반 어쥬번트, 바이러스 dsRNA 기반 어쥬번트, 이미다조치닐린(imidazochinilines), 및 몬타니드(Montanide) ISA 어쥬번트로 이루어진 군에서 선택되는 것.
17. a) 14-16 측면 중 어느 하나의 면역치료 조성물, 및
b) 인터루킨(interleukin), 예를 들어 IL-2 및 또는 IL-21과 같은 면역자극 화합물, 화학치료제, 예를 들어 액티마이드(Actimide), 아자시티딘(Azacitidine), 아자티오프린(Azathioprine), 블레오마이신(Bleomycin), 카보플라틴(Carboplatin), 카페시타빈(Capecitabine), 시스플라틴(Cisplatin), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 사이타라빈(Cytarabine), 다우노루비신(Daunorubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 독시플루리딘(Doxifluridine), 독소루비신(Doxifluridine), 에피루비신(Epirubicin), 에토포시드(Etoposide), 플루다라빈(Fludarabine), 플루오로우라실(Fluorouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 하이드록시우레아(Hydroxyurea), 이다루비신(Idarubicin), 이리노테칸(Irinotecan), 레날리도마이드(Lenalidomide), 류코보린(Leucovorin), 메클로레타민(Mechlorethamine), 멜팔란(Melphalan), 메르캅토퓨린(Mercaptopurine), 메토트렉세이트(Methotrexate), 미톡산트론(Mitoxantrone), 니볼루맙(Nivolumab), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 펨블로리주맙(Pembrolizumab), 페메트렉시드(Pemetrexed), 레블리미드(Revlimid), 테모졸로마이드(Temozolomide), 테니포시드(Teniposide), 티오구아닌(Thioguanine), 발루비신(Valrubicin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine) 및 비노렐빈(Vinorelbine)과 같은 항암제로부터 선택된 적어도 하나의 2차 활성 성분(active ingredient)을 포함하는 조성물을 포함하는 부품 키트(kit-of-parts).
18. 17 측면에 따른 부품 키트로서, 상기 제공된 조성물은 동시 또는 순차적으로 투여되는 것.
19. 서열번호 1의 아르기나제 1의 발현으로 특징지어지는 임상 증상의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 임상적 증상을 앓고 있는 개인에게 1-8 측면 중 어느 하나에 따른 펩타이드 화합물, 9 측면에 따른 핵산, 10 또는 12 측면에 따른 벡터 또는 11 측면에 따른 숙주 세포를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
20. 암환자에서 CD4 및 CD8 T세포와 같은 아르기나제 1 특이적 T세포를 자극하는 방법으로서, 암환자에게 1-8 측면 중 어느 하나에 따른 펩타이드 화합물, 9 측면에 따른 핵산, 또는 10 또는 12 측면에 따른 벡터 또는 11 측면에 따른 숙주 세포를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
21. 아르기나제 1 발현 세포의 면역 억제 기능을 억제하는 방법으로서, 암환자에게 1-8 측면 중 어느 하나에 따른 펩타이드 화합물, 또는 9 측면에 따른 핵산, 또는 10 또는 12 측면에 따른 벡터 또는 11 측면에 따른 숙주 세포를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
22. 아르기나제 1의 발현을 특징으로 하는 암을 치료 또는 예방하기 위한 면역치료 조성물 또는 백신과 같은 의약을 제조하기 위한 1-8 측면 중 어느 하나에 따른 펩타이드 화합물, 또는 9 측면에 따른 핵산, 또는 10 또는 12 측면에 따른 벡터, 또는 11 측면에 따른 숙주세포의 용도.
23. 사이토카인 치료, T 세포 치료, NK 치료, 면역계 관문 억제제(immune system checkpoint inhibitor), 화학요법(chemotherapy), 방사선 치료(radiotherapy), 면역증강 물질(immunostimulating substances), 유전자 치료(gene therapy), 항체 및 수지상 세포와 같은 추가적인 암 치료와 함께 동시 또는 순차적으로 투여하여 암의 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 1-8 측면 중 어느 하나에 따른 펩타이드 화합물, 또는 9 측면에 따른 핵산, 또는 10 또는 12 측면에 따른 벡터, 또는 11 측면에 따른 숙주 세포.
24. 23 측면에 따른 펩타이드 단편, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포로 상기 면역계 관문 억제 항체는 액티마이드(Actimide), 아자시티딘(Azacitidine), 아자티오프린(Azathioprine), 블레오마이신(Bleomycin), 카보플라틴(Carboplatin), 카페시타빈(Capecitabine), 시스플라틴(Cisplatin), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 사이타라빈(Cytarabine), 다우노루비신(Daunorubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 독시플루리딘(Doxifluridine), 독소루비신(Doxifluridine), 에피루비신(Epirubicin), 에토포시드(Etoposide), 플루다라빈(Fludarabine), 플루오로우라실(Fluorouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 하이드록시우레아(Hydroxyurea), 이다루비신(Idarubicin), 이리노테칸(Irinotecan), 레날리도마이드(Lenalidomide), 류코보린(Leucovorin), 메클로레타민(Mechlorethamine), 멜팔란(Melphalan), 메르캅토퓨린(Mercaptopurine), 메토트렉세이트(Methotrexate), 미톡산트론(Mitoxantrone), 니볼루맙(Nivolumab), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 펨블로리주맙(Pembrolizumab), 페메트렉시드(Pemetrexed), 레블리미드(Revlimid), 테모졸로마이드(Temozolomide), 테니포시드(Teniposide), 티오구아닌(Thioguanine), 발루비신(Valrubicin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine) 및 비노렐빈(Vinorelbine)으로부터 선택된 것.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되지만, 보호범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 전술한 설명 및 하기의 실시예에서 개시된 특징들은 개별적으로 및 이들의 임의의 조합으로 본 발명을 이의 다양한 형태로 실현하기 위한 내용일 수 있다.
실시예
서론
다음은 다음 실험 중 일부의 계획 및 실행에 대한 근거를 설명한다:
아르기나제 1(Arginase 1)의 새로운 면역원성 에피토프, 및 새로운 면역원성 에피토프에 대한 강력한 면역 반응뿐만 아니라 아르기나제 1의 몇몇 펩타이드 단편에 의해 검출되는 빈번한 면역 반응에 더하여, 본 발명자들은 또한 T세포가 마찬가지로 아르기나제를 인식하는지 확인하고자 한다. 나아가, 아르기나제로부터의 면역원성 에피토프가 확인될 것이다. 역 면역학(reverse immunology)적 접근을 사용하여, 잠재적 MHC 클래스 I 결합 모티프가 확인되고 후보 펩타이드를 합성할 것이다. 결과적으로, 대응하는 MHC 대립 유전자에 대한 실제 결합이 확립될 것이다. 클래스 I 결합 펩타이드 화합물의 확인 후, 그 펩타이드들은 건강한 공여자뿐만 아니라 암환자의 말초 PBMC에도 특이적 T세포가 존재하는지 여부를 검토하기 위해 ELISPOT 분석에서 펩타이드 특이적 T세포에 의한 사이토카인 방출이 검증될 것이다. 계획된 연구에서 유세포분석에 의한 말초 혈액에서의 T세포 반응성을 조사하기 위한 추가적인 수단으로 4량체 MHC/-펩타이드-복합체가 사용될 것이다. 마지막으로, 4량체 MHC/펩타이드 복합체는 환자 혈액 또는 종양 침윤 림프절로부터 특이적 T세포를 직접적으로 분리하기 위해 사용될 것이다. 이는 특이적 T세포의 기능을 결정하기 위해 사용될 것이다.
게다가, CD4+ T세포가 항원-특이적 세포 및 체액성 면역 반응을 생성하고 유지하는데 중요한 역할을 하기 때문에, 본 발명자들은 MHC 클래스 II 분자에 의해 제시되는 새로운 에피토프를 찾고자 한다. CD4+ T세포는 ELISPOT 분석에서 전체 단백질 서열에 걸친 18-mer의 중첩되는 합성 펩타이드와 함께 나타난다. 펩타이드-특이적 CD4+ T-세포 클론들은 펩타이드에 의한 반복적인 자극에 의해 생성된다. 뿐만 아니라, 부분적으로 조직적합적인(histocompatible) EBV-B 세포주 및 MHC 클래스 II-특이적 항체로 된 세트를 사용하여, HLA 클래스 II 제한 요소(restriction elements)를 확인하고자 한다. 마지막으로, CD4 및 CD8 펩타이드 에피토프에 대한 종양 침윤 림프구(TIL) 배양물의 반응성을 분석하여 중추적인 생체 내(in vivo) 표적에 대한 중요한 정보를 밝히고자 한다.
아르기나제는 면역계의 주요한 역할을 담당하고 있으며, 그러한 T 세포는 일반적인 면역 조절에 관여한다고 추측할 수 있다. 아르기나제 특이적 T세포의 역할 분석을 목표로 하는 이러한 연구의 또 다른 부분은 따라서 면역 조절에서 역할을 할 수 있다. 우선, 아르기나제-특이적 T세포가 아르기나제-발현 조절 세포들을 제거함으로써 국소적 면역 억제를 억제 및/또는 지연시켜 면역력에 영향을 줄 수 있는지가 검증될 것이다. 아르기나제 T세포의 가능한 면역 효과를 검증하기 위해, 아르기나제-특이적 T세포의 존재 또는 아르기나제-유래의 펩타이드에 의한 그러한 T세포의 활성화가 다른 항원들에 대한 추가적인 T- 및/또는 B-세포 반응을 증가시킬 수 있는지가 검증될 것이다. 조절 세포들은 주어진 면역 반응의 강도와 지속기간에 기여한다. 그러므로, 다른 면역 세포에 대한 아르기나제-특이적 T세포의 어떠한 “지지적인(supportive)”효과도 여러 직접적인 및 간접적인 방식으로 당연하게 조절될 수 있다. 이와 관련하여, 필수 아미노산의 수준이 검증될 것이며, Tregs 뿐만 아니라 IL-17 생산 세포의 빈도 역시 검증될 것이다. 나아가, INF-γ, IL-6, TNF-α 뿐만 아니라 IL-10 및 TGF-β를 포함하는 서로 다른 사이토카인의 전체 생산량에 대한 아르기나제-특이적 T세포의 효과도 검증될 것이다. 아르기나제-특이적 T세포의 또 다른 가능한 효과로는 아르기닌 대사산물을 매개로 하여 조절될 수 있다. 나아가, FACS에 의한 아르기나제-특이적 T세포의 표현형뿐만 아니라 그러한 T세포의 사이토카인 프로파일에 대한 분석이 설명될 것이다. 또한, 공동자극(co-stimulatory) 분자의 발현(FACS), 효과기 세포 및 APC(세포독성 분석)의 직접 또는 간접적 사멸이 기술될 것이다. 엄청난 수의 T세포를 포함하는 암환자로부터의 백혈구성분분리채집(leukapheresis) 샘플의 사용은 공여자들로부터 직접적으로 분리된 아르기나제-특이적 T세포의 자연적 아형(natural subset)으로 실험을 수행하는 것을 가능하게 한다.
펩타이드
이 실험에 사용된 펩타이드들의 서열을 아래 표 A에 전체적으로 나타내었다(“서열”이라는 제목의 섹션 참조). 표 A의 펩타이드들은 서열번호(SEQ ID NO), 이름 또는 아르기나제 1의 전체 서열 내에서 각 펩타이드 서열의 시작과 끝 위치를 참조로 하여 설명되었다. 각각은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 34의 펩타이드는 대안적으로 Arg1-17의 이름으로 지칭되거나 또는 Arg161-190(시작 위치 161 및 끝 위치 190이 주어짐)으로 지칭될 수도 있다. 각 경우의 의도된 참고문헌은 문맥으로부터 명백하다. 서열번호 9의 펩타이드는 추가적으로 ArgShort로 지칭될 수도 있다.
20-mer와 22-mer 펩타이드들은 PepScan(Netherlands)에서 합성하였고 10mM의 농도로 DMSO에 녹였다. 30-mer와 50-mer 펩타이드들은 Schafer-N ApS(Denmark)에서 합성하였고 10mM의 스톡(stock) 농도로 DMSO에 녹였다. 더 짧은 펩타이드들을 KJ Ross-Petersen ApS(Denmark)에서 합성하였고 2mM의 스톡 농도로 멸균수에 녹였다. 합성된 펩타이드의 순도는 >80%였다.
실시예 1
환자, 프로토콜 및 방법
환자:
본 프로젝트는 흑색종, 신장세포암종 및 난소암 환자로부터의 혈액 및 종양 병변 분석을 기반으로 한 것이다. 혈액 및 종양 샘플의 수집은 Herlev Hospital에서 실시되었다. 혈액 샘플들은 어떤 종류의 항암 요법이든 종료 후 최소 4주 이후 수집되었다. PBMC는 Lymphoprep™(Alere AS, cat. 1114547)으로 분리되고, 10% DMSO(Sigma-Aldrich, cat. D5879-100ML)를 갖는 FCS에서 HLA-유형화 및 동결되었다. 재료의 즉각적인 처리는 현지 윤리적 요건을 준수하면서 CCIT(Centre for Cancer Immunotherapy)에서 이루어졌다. 모든 환자들은 충분한 설명에 근거한 서면동의에 의해서만 참가하였고, 윤리위원회는 본 프로젝트를 승인하였다.
효소-결합 면역스팟 (ELISPOT):
“ELISPOT”기술을 사용하면 상대적으로 적은 T세포 이용가능성에도 불구하고 수많은 펩타이드 항원들의 T세포 인식을 스크리닝 하는 것이 가능하다. “ELISPOT”기술은 T세포가 TCR 관여 및 그 이후의 신호전달에 따라 예를 들어, IFN-γ와 같은 사이토카인을 합성한다는 사실을 이용한다. 이 방법은 임의로 선택한 사이토카인 - 실험실에서는 일반적으로 IFN-γ, TNF-α, IL-10, 그랜자임(Granzyme)-B 또는 퍼포린(perforin)을 사용 - 의 분비를 분석할 때 사용한다. 표준화된 정량화는 ELISPOT 리더(IMMUNOSPOT, CTLanalyzers LLC http://www.immunospot.com/)를 사용하여 수행된다.
세포독성 분석
CTL-매개 세포독성에 대한 통상적인 51Cr-방출 분석은 다른 곳에서 기술된 바와 같이 수행되었다 [3]. 표적 세포는 T2-세포(ATCC), HLA-A2+ 흑색종 세포주(FM3 및 FM93)이다.
FACS:
지난 수년간, 새로운 강력한 FACS 기술 - 특히 면역 기능과 특이성에 대한 연구에 대한 기술이 개발되었다. 이와 관련하여, 펩타이드/HLA 복합체는 펩타이드 특이적 T세포의 빈도 분석에 용이하게 사용된다. 특이적 T세포는 시험관 내에서(in vitro) 분리되고 증식될 수 있다. 세포 내 염색에 있어서, 세포들은 아르기나제 유래 펩타이드로 자극되고, 표면 마커로는 4 μl NIR, 10 μl CD4 PerCP, 2 μl CD8 퍼시픽 블루, 및 10 μl CD3 FITC를 사용하였고 세포내 염색에는 PE-Cy7 또는 APC와 결합한 2 μl 항-TNF-a 및 항-IFN-g 항체를 사용하였다. 세척, 투과과정(permeabilization) 염색 절차는 이전에 기술된 방법에 따랐다 [4]. 유세포 분석은 FACSCANTO II(BD Biosciences, San Jose CA, USA)로 수행되었다.
결과:
아르기나제 1에서 유래된 16개의 펩타이드가 설계되었다. 이들 펩타이드는 본원에서 Arg1 내지 Arg16(서열번호 12 내지 17)으로 지칭된다. 이들 펩타이드의 서열을 아래 표 A에 전체적으로 나타내었다(“서열”이라는 제목의 섹션 참조). ELISPOT에서 15개의 펩타이드(Arg1 내지 Arg15)가 검증되었다. 본 발명자들은 IFN-감마 ELISPOT 분석을 사용하여 6명의 흑색종 환자로부터의 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)에 대해 Arg-유래된 펩타이드에 대한 특이적 T세포 반응의 존재를 면밀하게 조사하였다. Arg2(서열번호 3), Arg3(서열번호 4), Arg5(서열번호 6), Arg6(서열번호 7), Arg7(서열번호 8), Arg8(서열번호 9), Arg9(서열번호 10), Arg10(서열번호 11), Arg11(서열번호 12), Arg14(서열번호 15), Arg15(서열번호 16)에 대한 강력한 반응이 검출되었다. 도 1은 Arg-특이적 T세포 반응을 예시한다. 특히 Arg8(서열번호 9)은 보다 자세히 검증되었다. Arg8에 대한 환자 PBMC 호스트 면역 반응. 도 2에서와 같은 아르기나제-유래의 Arg8 펩타이드에 대한 6명의 암환자로부터의 면역 반응(특이적 세포/3x10e5 세포). 환자 PBMC에서 매우 강한 반응이 빈번하게 검출되었다.
본 발명자들은 다음으로 전체 아르기나제 서열 서열번호 1에 걸쳐서 겹치는 20mer 펩타이드를 검증하였다. 따라서 서열 전체 길이에 걸쳐 30x 20mer 펩타이드와 1x 22mer가 존재한다. 이들 펩타이드들의 서열을 아래 표 A에 전체적으로 나타내었고(“서열”이라는 제목의 섹션 참조) 서열번호 18 내지 48에 대응된다. 본 발명자들은 상기 기재된 펩타이드들을 도 3에서와 같은 3명의 암환자로부터의 PBMC에서의 면역 반응 검증에 사용하였다. 몇몇 펩타이드들 특히 Arg1-23, Arg1-18, Arg1-27, Arg1-17, Arg1-19, Arg1-12, Arg1-20, Arg1-4, Arg1-1, Arg1-7, Arg1-14, Arg1-15, Arg1-6, Arg1-16, Arg1-22, Arg1-29로 지칭되는 긴 펩타이드들에 대한 빈번한 면역 반응이 검출되었다. 또한, 본 발명자들은 이들 긴 펩타이드들에 대한 건강한 개인으로부터의 PBMC에서의 반응을 나타내었다(도 4).
도 5에서와 같이, 표준 크롬 방출 분석에 의해 검증 시 CD8 양성 배양은 표면이 Arg8로 로딩된 표적 세포를 사멸시킬 수 있다. 도 6에서와 같이, 아르기나제 특이적 T세포에 의한 아르기나제 양성 암(흑색종) 세포주 FM3 및 FM93의 사멸 또한 표준 크롬 방출 분석에 의해 나타내었다. 이 실험에서 아르기나제 특이적 T세포들은 서로 다른 효과기:표적 비율의 Cr-표지된 흑색종 세포주 FM3 또는 FM93에서 4시간 동안 배양되었다. 두 세포주 모두 세포 내 아르기나제를 발현하였다.
다음으로, 본 발명자들은 CD4 CD4 T-세포가 시험관 내 자극 후 아르기나제를 인식할 수 있는지 검증하였다. 따라서, 본 발명자들은 세포내 사이토카인 염색을 사용하여 Arg8에 대한 반응을 보이는 환자의 PBMC를 분석하기로 결정하였다. 이 방법은 ELISPOT보다 덜 민감하지만, 어떤 면역 세포가 ELISPOT에서 확인된 사이토카인을 분비하는지 밝힐 수 있다. 그러므로, 본 발명자들은 암환자로부터의 CD4 T세포를 Arg8 펩타이드로 5회 자극시켰다. 다음으로, 본 발명자들은 Arg8 펩타이드로 시험관 내에서 5회 자극 후 상기 T-세포 배양물에서 INF (PE-Cy7A) 및 TNF-알파 (APC-A)에 대한 세포 내 염색을 수행하였다. 도 7에서와 같이, 배양물은 Arg8 펩타이드로 자극을 시키거나 또는 시키지 않았다. 유사한 결과가 도 8에 나와있다.
결론: CD8 및 CD4 T세포는 모두 표적 세포 표면에서 아르기나제 유래 펩타이드를 인식할 수 있다. 아르기나제 1의 161 내지 190 위치에 걸친 부위는 특히 면역원성이 있는 것으로 보였다. 본원에서 이 영역은 핫스팟(hotspot)이라고 지칭될 수 있다.
실시예 2
재료 및 방법
추가적인 펩타이드 자극 및 ELISPOT 분석
건강한 공여자 또는 암환자로부터의 PBMC를 80μg의 아르기나제-유래된 펩타이드 및 120 U/ml IL-2(Peprotech, London, UK, cat. 200-02)로 1주일 동안 자극시켰다. 그 후 4-6x105 PBMCs를 IFN-γ capture Ab(Mabtech, cat. 3420-3-1000)로 전-코팅된 ELISPOT 플레이트(바닥이 니트로셀룰로오스로 덮여있는 96-웰 플레이트, MultiScreen MAIP N45; Millipore, cat. MSIPN4W50) 바닥에 위치시키고 1-10μg의 아르기나제 유래 펩타이드를 첨가하였다. 각 환자 및 공여자로부터의 PBMC는 펩타이드 및 대조군 자극을 위해 2회 또는 3회 반복으로 셋업하였다. 세포들을 항원 존재 하에서 14-16시간 동안 ELISPOT 플레이트에서 배양한 후 세척하고 2차 비오틴화된 Ab(Mabtech, cat. 3420-6-1000)를 첨가하였다. 2시간 배양 후 결합되지 않은 2차 항체를 씻어내고 스트렙타비딘(streptavidin)이 접합된 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP)(Mabtech, cat. 3310-10)를 1시간 동안 첨가하였다. 그 다음, 결합되지 않은 접합된 효소를 씻어내고 BCIP/NBT 기질(Mabtech, cat. 3650-10)을 첨가하였다. ELISPOT 플레이트는 CTL ImmunoSpot S6 Ultimate-V 분석기, Immunospot 소프트웨어 v5.1로 분석하였다. 반응은 아르기나제-1 펩타이드로 자극된 웰 및 대조군 웰에서 평균 스팟 개수 차이로서 계산하였다.
HLA -블로킹
HLA 클래스 I 및 II의 블로킹을 위해, 펩타이드를 첨가하기 전 PBMC를 2μg/ml의 블로킹 항체: 항-인간 HLA-DR, DP, DQ 항체 CloneTu39(Biolegend, cat. 361702) 또는 항-인간 HLA-ABC 항체 Clone w6/32(Dako, Agilent) 로 상온에서 20분 동안 전배양하였다.
아르기나제 -특이적 T세포 배양 확립
아르기나제-특이적 T세포 배양은 조사된 ArgShort(서열번호 9) 펩타이드가 로딩된 자가유래 DC 또는 PBMC로 암 환자 PBMC를 자극시켜 확립하였다. 다음날 IL-7 및 IL-12(PeproTech, London, UK, cat. 200-07-10 및 200-12)를 첨가하였다.
배양물의 자극은 ArgShort 펩타이드가 로딩된 조사된 자가유래 DC 및 뒤이어 ArgShort 펩타이드가 로딩된 조사된 자가유래 PBMC로 8일마다 수행되었다. 그 다음날 IL-2(PeproTech, London, UK, cat. 200-12)를 첨가하였다. 5회 자극 후 TNF-α 세포 농축 키트(MiltenyiBiotec, cat. 130-091-269)를 사용하여 아르기나제-특이적 T세포를 농축시켰다.
수지상세포 제조
수지상세포(dendritic cells, DCs)는 RPMI-1640에서 1~2시간 동안 37°C에서 배양 디쉬에 부착시켜 PBMC로부터 제조하였다. 부착성 단핵구(monocytes)를 IL-4(250 U/ml) 및 GM-CSF(1000 U/ml)(Peprotech, London, UK, cat. 200-04 및 300-03-100) 존재 하에 10% FCS가 보충된 RPMI-1640에서 6일 동안 배양하였다. 수지상세포는 IL-β), IL-6(1000U/ml) TNF-α(1000U/ml)(Peprotech, London, UK, cat. 200-01B, 200-06 및 300-01A) 및 PGE2(1ug/ml)(Sigma Aldrich, cat. P6532)를 첨가하여 성숙시켰다.
B세포 분리
암환자로부터의 PBMC는 해동하여 밤새도록 두었다. B세포들은 Pan B 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec Inc., cat. 130-101-638)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 환자 PBMC로부터 분리되었다.
시험관 내-전사된(in vitro-transcribed) mRNA의 제조
아르기나제(accession nr. NM_000045)를 코딩하는 cDNA는 합성되었고, 5'XhoI/3'PacI 제한 위치(restriction sites)를 사용하여 pSP73-SphA64(kindly provided by Dr. E. Gilboa, Duke University Medical Center, Durham, NC) 또는 5'BamHI/3'BamHI 제한 위치를 사용하여 HLA 클래스 II 표적 플라스미드 pGEM-sig-DC.LAMP(kindly by provided by Dr. K. Thielemans, Medical School of the Vrije Universiteit Brussel) 둘 중 하나로 클로닝되었다. 두 플라스미드 모두 시험관 내 전사(in vitro transcription)를 위한 DNA 주형으로 사용되기 전 SpeI로 선형화되었다.
전기천공법( electroporation )
mRNA 실험을 위해, 수지상세포 및 B세포를 전술한 방법에 따라 전기천공법 파라미터를 사용하여 아르기나제 mRNA 또는 GFP 또는 신경 성장 인자 수용체(nerve growth factor receptor, NGFR)를 코딩하는 대조군 mRNA로 형질감염시켰다. 간단하게, 세포들을 두 번 세척하고, Opti-MEM 배지(Invitrogen, cat. 11058021)에 부유시키고 최종 세포 밀도가 4-7x106 cells/ml가 되도록 조절하였다. 세포 부유액(200-300 ul)을 얼음 위에서 5분 동안 전배양시키고 mRNA 5-10μg을 첨가하였다. 그 후 세포 부유액을 4-mm 갭(gap)의 전기천공 큐벳(cuvette)으로 옮기고 전기천공 하였다. 전기천공된(electroporated) 세포들은 5% CO2의 습도 조건에서 추가로 배양되었고 기술된 바와 같이 실험적 분석에 사용되었다. 전기천공법 효율은 24시간 후 GFP 또는 NGFR 형질감염 세포에 대한 FACS 분석으로 결정되었다.
유세포 분석(Flow cytometric analysis)
유세포 분석은 FACSCanto™II(BD Biosciences, San Jose CA, USA)를 사용하여 수행되었다. 세포 배양물의 세포 내 염색은 세포들을 20-mere 펩타이드로 5시간 동안 또는 30-mere 펩타이드로 8시간 동안(BD GolgiPlug™ cat. 555029, 처음 1시간 후 첨가함) 자극시킨 후 수행하였다. 세포들을 이후 표면 마커에 대해 염색하고, 그 후 세척하고 제조사의 매뉴얼에 따라 고정/투과 및 투과 완충액(eBioscience, cat. 00-5123-43)으로 투과처리(permeabilized)하였다. 사용된 항체: IFNγ-APC(cat.341117), TNFα-BV421(cat.562783), CD4-FITC(cat.347413), CD8-PerCP(cat.345774)(모두 BD Biosciences). 사멸된 세포는 제조사의 매뉴얼에 따라 FVS510(564406, BD Biosciences)로 염색하였다.
결과
아르기나제 -1에 대한 자발적인(spontaneous) 면역 반응
본 발명자들은 전체 아르기나제-1 단백질 서열을 중첩되는 20-아미노산-길이 펩타이드로 나누고, 전체 서열을 커버하는 31개 펩타이드(서열번호 18-48)의 라이브러리를 생성하였다. 라이브러리의 각 펩타이드는 다음 펩타이드의 처음 10개 아미노산과 중첩된다. 이 아르기나제 펩타이드 라이브러리 및 IFNγ ELISPOT 분석을 사용하여, 본 발명자들은 다음으로 자발적인 반응을 위해 흑색종 환자와 건강한 공여자들로부터의 PBMC를 스크리닝하였다(도 9A 및 9B). PBMC를 3-4개의 인접한 20-mer 아르기나제 라이브러리 펩타이드 풀(pool) 및 낮은 농도의 IL-2(120 U/mL)로 1주일 동안 자극시켰다. 그 후 각 20-mer 펩타이드에 대한 반응을 개별적으로 스크리닝하기 위해 IFNγ ELISPOT 분석에 대해 셋업을 하였다. 다음 8개의 펩타이드는 암환자 PBMC 중 가장 높고 풍부한 반응을 나타내었다(펩타이드들은 시작과 끝 위치를 참조로 하여 라벨링되었다): Arg(31-50), Arg(111-130), Arg(161-180), Arg(171-190), Arg(181-200), Arg(191-210), Arg(221-240), 및 Arg(261-280). 이 중첩되는 펩타이드들 중, Arg(161-180), Arg(171-190), Arg(181-200), 및 Arg(191-210)은 50-아미노산-길이의 부위에 걸친 것으로 거의 모든 환자들이 이들 펩타이드 하나 또는 그 이상에 대하여 반응을 갖고 있기 때문에 핫-스팟(hot-spot) 부위인 것으로 생각되었다(도 9A). 선별된 8개 펩타이드를 이후 IFNγ ELISPOT을 사용하여 8명의 건강한 공여자들로부터의 PBMC에서 아르기나제-1에 대한 자발적인 면역 반응을 스크리닝하는데 사용하였다. 암환자의 PBMC에서와 같이, 건강한 공여자의 PBMC는 핫-스팟 부위에서 4개 아르기나제 펩타이드에 대해 가장 높은 IFNγ 반응을 나타내었다(도 9B).
흑색종 TIL에서 아르기나제 -1 반응
암에서 종양-침윤 림프구 중 아르기나제-특이적 T세포의 존재가능성을 알아보기 위해, 본 발명자들은 아르기나제-1 유래 펩타이드에 대한 반응에 대하여 8명의 흑색종 환자의 TIL을 스크리닝하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 펩타이드 자극에 대한 반응으로 IFNγ및 TNFα 방출에 대한 세포 내 염색을 수행하였다. TIL을 해동 하여 IL-2 없이 밤새도록 둔 다음, 3개의 핫-스팟 면역원성 부위의 20-mer 펩타이드로 5시간 동안 자극하였다(펩타이드들은 시작과 끝 위치를 참조로 하여 라벨링되었다): Arg(161-180), Arg(171-190), Arg(181-200). TIL 배양 중 하나에서, 3개 아르기나제 펩타이드 자극 모두에 대해 반응하여 IFNγ이 CD4+ T세포로부터 방출되어(도 10A), 아르기나제-1 핫-스팟 부위에 다수의 CD4+ T세포 에피토프가 존재할 가능성이 있음을 시사하였다. IFNγ-생산 세포의 비율은 Arg(161-180)과 비교하여 Arg(171-190) 및 Arg(181-200)의 경우에 더 높았고, Arg(181-200)에 대한 반응은 Arg(161-180)의 거의 2배였다. CD8+ T세포에서는 IFNγ또는 TNFα 어느 것의 방출도 관찰되지 않았다.
CD4+ 및 CD8+ T세포에 의해 인식되는 아르기나제 -1 핫-스팟 부위
핫-스팟 부위에서 아르기나제-1 펩타이드에 대한 반응을 가장 빈번하게 관찰했으므로, 본 발명자들은 다음으로 동일한 서열을 커버하는 더 긴 펩타이드가 4개의 20-mer 대신 사용될 수 있는지 분석하였다. 전체 핫-스팟 부위를 커버하는 50-mer 펩타이드는 20-mer 펩타이드에 비해 낮은 반응을 유도하였다(데이터는 나타내지 않음). 본 발명자들은 그 다음으로 아르기나제-1 핫-스팟 부위를 10개 아미노산이 중첩되는 2개의 30-mer 펩타이드로 나누었다(펩타이드들은 시작과 끝 위치를 참조로 하여 라벨링되었다): Arg(161-190) 및 Arg(181-210). 이들 30-mer 펩타이드는 이전에 20-mer 핫-스팟 펩타이드에 대해 반응을 보인 암환자와 건강한 공여자들로부터 선별된 PBMC에서 반응을 확인하기 위해 사용되었다. PBMC는 IL-2 존재 하에 Arg(161-190) 또는 Arg(181-210)로 1주일 동안 자극되었고, 그 후 IFNγ ELISPOT에서 사용되었다. 20-mer 펩타이드에 대한 반응과 달리, 암환자와 건강한 공여자들의 PBMC 모두에서 Arg(161-190)에 대한 높은 반응이 나타났다(도 10B). 몇몇 PBMC는 30-mer Arg(181-210) 펩타이드에 대해서도 반응을 나타내었다(도 10C); 그러나, 이들 반응은 동일한 단백질 부위를 커버하는 중첩되는 20-mer 펩타이드에 대한 반응보다는 낮았다(도 9B).
어떤 종류의 T세포가 핫-스팟 부위의 펩타이드 에피토프에 반응하는지 알아보기 위해, 본 발명자들은 IFNγ ELISPOT에서 Arg(161-190) 펩타이드에 대해 반응을 보인 2명의 건강한 공여자와 1명의 암환자의 PBMC에서 IFNγ및 TNFα 방출에 대해 세포 내 염색을 수행하였다. 본 발명자들은 Arg(161-190)과 함께 8시간 동안 배양한 CD4+ T세포에서 TNFα 방출을 검출하였다(도 11A). 본 발명자들은 또한 몇몇 샘플의 CD8+ T세포에서도 작은 반응을 검출하여(데이터는 나타내지 않음), 아르기나제-1 핫-스팟 부위에서의 HLA 클래스 I 및 II 에피토프의 존재를 시사하였다. HLA 클래스 I 또는 II의 발현 억제는 부분적으로 Arg(161-190) 펩타이드 자극에 대한 반응으로서의 IFNγ 방출을 억제시켜, Arg(161-190)이 CD4+ 및 CD8+ T세포 에피토프를 포함하고 있음을 나타내었다(도 11B).
본 발명자들은 수지상세포 및 핫-스팟 부위에 최소 아르기나제 펩타이드(ArgShort)가 로딩된 PBMC를 가진 흑색종 환자의 PBMC를 반복적으로 자극시켜 아르기나제-특이적 CD4+ T세포 배양물을 제조하였다. 최소 아르기나제 에피토프에 특이적인 T세포 배양은 IFNγ ELISPOT(도11C, 좌측) 및 세포 내 염색(도 11C, 우측)에서 30-mer Arg(161-190) 펩타이드도 인식하였다. 그러나, 전체 핫-스팟 부위를 커버하는 50-mer 펩타이드는 인식되지 않았다. 8시간의 Arg(161-190) 펩타이드 자극 후, 세포 내 염색은 CD4+ T세포로부터의 TNFα 방출을 나타내었다.
아르기나제 -1 발현에 의존하는 T세포 인식
아르기나제-특이적 CD4+ T세포가 아르기나제-1을 생산하는 면역세포를 인식하고 이에 반응하는 능력을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 자가유래 수지상세포와 B세포를 아르기나제-1 단백질을 코딩하는 mRNA로 형질감염시켰다. 자가유래 수지상세포는 아르기나제-1 mRNA를 코딩하는 2개의 서로 다른 구조체(construct)로 감염시켰다. 이들 구조체 중 하나는 단백질을 리소좀 구획(lysosomal compartment) 쪽으로 표적시킴에 따라 그 단백질을 클래스 II 제시로 향하게 하는 DC-LAMP 신호 서열에 융합된 아르기나제-1 서열이다. 2명의 서로 다른 흑색종 환자의 아르기나제-특이적 CD4+ T세포 배양물을 IL-2 없이 24시간 동안 둔 후, 전기천공된 수지상세포 또는 B세포와 함께 IFNγ ELISPOT을 위한 셋업을 하였다. 본 발명자들은 Mock 대조군에 비하여 아르기나제-1 mRNA로 형질감염된 수지상세포 및 B세포에 대하여 더 높은 반응성을 관찰하였다(도 12A-D). 아르기나제-DC-LAMP로 형질감염된 수지상세포에 대한 반응은 Mock 대조군 및 아르기나제-1 mRNA 모두에 비하여 훨씬 높았다(도 12E). 24시간 후, 본 발명자들은 GFP/NGFR-발현 세포에 대한 FACS 분석을 통해 수지상세포의 전기천공 효율을 검증하였고, >90%의 형질감염 효율을 확인하였다.
결론
이 실험들로 아르기나제 1의 161 내지 190 위치에 걸친 부위가 암환자와 건강한 공여자 모두에서 특히 면역원성이며, CD4 및 CD8 양성 T세포 반응 모두를 일으킴을 확인하였다. 이 부위는 다수의 HLA 클래스 I 및 클래스 II 제한을 포함할 수 있다. 이 부위 유래의 펩타이드는 아르기나제1에 대한 백신에서 특히 효과적일 수 있다. 이러한 백신은 암에서 치료적 이점을 가질 것으로 기대된다.
실시예 3 - 생체 내(in vivo ) 실험
생체 내( in vivo ) 실험을 위한 펩타이드의 설계
마우스에서의 백신 실험에 사용하기에 적합한 펩타이드를 설계하기 위하여, 쥐 아르기나제 1(서열번호 59)과 서열번호 1의 인간 아르기나제 1 서열을 비교하였다. 도13에 나타낸 정렬을 보면, 서열들이 높은 유사성을 가짐을 나타낸다. 유사성의 수준은 상기 실시예들에 기재된 인간 아르기나제 1의 핫스팟 부위, 즉, 서열번호 1의 161-210 위치에 대응하는 부위에서 특히 높다 - 이 50개의 아미노산 부위는 도 13에서 두 서열 모두에 대해 볼드체로 나타내었다. 이 부위의 정렬 및 쥐 아르기나제 1에서의 대응하는 부위는 하기에 나타내었다:
hArg1: GFSWVTPCISAKDIVYIGLRDVDPGEHYILKTLGIKYFSMTEVDRLGIGK (서열번호 52)
mArg1: GFSWVTPCISAKDIVYIGLRDVDPGEHYI I KTLGIKYFSMTEVD K LGIGK (서열번호 57)
50개 중 2개 잔기만이 다르며, 볼드체와 밑줄로 나타내었다. 인간 서열에서의 류신(leucine)은 쥐에서 매우 유사한 지방족 아미노산인 이소류신(isoleucine)으로 치환되었고, 인간 서열의 아르기닌(arginine)은 쥐에서 유사한 염기성 라이신(lysine)으로 치환되었다. 두 변경사항 모두 보존적이다. 따라서 핫스팟 부위는 인간과 쥐에서 매우 보존적이다.
상기 유사성을 고려할 때, 이전 실시예에서 실험에 사용된 인간 펩타이드에 대한 쥐 유사체(murine analogues)를 제조하기 위해서는 상대적으로 적은 변화가 요구됨을 알 수 있었다. 따라서 사용된 펩타이드는 다음과 같다:
- GFSWVTPCISAKDIVYIGLR (서열번호 34)
ARG17은 인간 아르기나제1(서열번호 1)의 161-180 위치의 서열이다. 쥐 아르기나제1의 대응 부위는 동일하다. (이전 실시예에서 ARG1-17 및 ARG(161-180)으로도 상호교환적으로 지칭된다)
- DVDPGEHYI L KTLGIKYFSM (서열번호 36)
ARG1-19는 인간 아르기나제 1(서열번호 1)의 181-200 위치의 서열이다. 쥐 아르기나제 1의 대응 부위는 1개 위치에서 차이가 있다(볼드체 밑줄의 L은 쥐 서열에서 I로 대체된다). (이전 실시예에서 ARG(181-200)으로도 상호교환적으로 지칭된다)
- KDIVYIGL (서열번호 53)
mARG1은 인간 아르기나제 1(서열번호 1)의 172-179 위치의 서열이다. 쥐 아르기나제 1의 대응부위는 동일하다.
- LGIKYFSM (서열번호 54)
mARG2는 인간 아르기나제 1(서열번호 1)의 193-200 위치의 서열이다. 쥐 아르기나제 1의 대응부위는 동일하다.
- KTLGIKYFSMTEVD K LGIGK (서열번호 56)
mARG20은 쥐 아르기나제 1(서열번호 59)의 191-200 위치의 서열이다. 인간 아르기나제 1의 대응 부위는 서열번호 37이며 1개 위치에서 차이가 있다(볼드체 밑줄의 K는 인간 서열에서 R로 대체된다).
C57BL /6 및 Balb /c 마우스에서 펩타이드 백신 접종
불완전 프로인트 어쥬번트(IFA) 또는 몬타니드(Montanide)와 1:1 에멀젼화된 DMSO/H2O 에 녹인 100μg 펩타이드를 동물들에 피하로 백신접종하였다. IFA + DMSO/H2O를 대조군 백신으로 사용하였다. 백신접종은 0일 및 7일째에 수행하였다. 특이적 펩타이드에 대한 면역 반응에 대한 계속되는 분석을 위해, 14일째에 마우스를 희생시켜 비장과 배수 림프절(draining lymph nodes, dLNs)을 얻었다.
펩타이드 -특이적 반응에 대한 ELISPOT 분석
마우스 면역세포에 대하여 ELISPOT 분석을 수행하였다. 세포 여과기를 통과시켜 비장 또는 배수 림프절로부터 단일 세포 부유액을 제조하였다. 적혈구를 용해시킨 후, 항-IFN감마 항체로 코팅된 ELISPOT 플레이트에 0.9x10E6 cells/well을 시딩하였다. 목적 펩타이드를 지정된 웰에 첨가하고 세포를 펩타이드와 함께 o/n 동안 배양하였다. 다음 날, 세포들을 제거하고, 플레이트를 세척한 후 비오틴화된 검출 항체와 함께 배양하였다. 마지막으로, 스트렙타비딘(Streptavidin)-ALP 및 기질을 첨가한 후 눈에 보이는 스팟들이 나타났다. 각 스팟은 개별적인 IFN감마 생성 세포에 대응된다. Immunospot 분석기로 플레이트를 분석하고 스팟/0.9x10E6 세포 - 백그라운드(즉, 대응되는 자극되지 않은(펩타이드가 없는) 웰의 스팟 수를 뺀 것)로 플롯팅하였다.
9-10주령, 그룹 당 4마리의 수컷 Balb /c 마우스의 암 백신 접종
각 동물들은 0.5x10E6의 동계의 CT26이 좌측 옆구리(flank)에 피하로 접종되었다. 100μl PBS 내 WT 대장암 세포. 종양이 감지되는 접종 6일 후, 동물들은 펩타이드 또는 대조군 백신(펩타이드 백신 접종에서 전술된 바와 같이)에 대한 첫번째 백신 접종을 받았다. 13일째, 동물들은 두번째 백신 접종을 받았다. 종양 성장은 모니터링되며 1주일마다 3회씩 측정되었다. 종양 부피는 V [mm3]= l x w2 /2(1이 가장 긴 지름이고 w는 1에 수직임)로 계산되었다.
결과
ARG17, ARG1-19 및 mARG20은 C57BL/6 및 Balb/c 마우스 모두에서 면역원성이 있는 것으로 밝혀졌다. ARG17, ARG1-19 및 mARG20 각각으로 백신접종된 C57BL/6 및 Balb/c 마우스 모두에서 펩타이드 특이적 반응이 검출되었다(도 14-15). 더 짧은 펩타이드 중, mARG1은 C57BL/6 마우스에서 면역원성이었고 mARG2는 두 종 모두에서 면역원성이 없었다(데이터는 나타내지 않음).
종양 접종 실험에서, ARG17, ARG1-19 및 mARG20 각각의 백신 접종은 대조군 펩타이드로 백신 접종한 경우와 비교하여 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 그 효과는 ARG1-19 및 mARG20의 경우에 가장 두드러졌지만, 치료적 효과는 실험에 사용된 3개 펩타이드 모두에서 분명했다. 이는 본 발명에 따른 펩타이드(및 일반적인 아르기나제 1에 대한 백신 접종)의 암 치료제로서의 가능성을 확인시켜 준다.
ARG17에 대한 낮은 반응은 그 펩타이드의 안정성 부족, 예를 들어 시스테인(cysteine) 잔기의 존재를 반영한 것일 수 있다. 보존적 치환에 따른 상기 아미노산의 대체로서 161-180 위치로 정의되는 Arg1의 서열에 대한 다른 특성을 변경시키지 않고도 이 문제를 해결할 수 있다. 그러나, 이 결과는 또한 181-200, 특히 191-210 위치로 정의되는 Arg1의 서열이 제조하기가 용이하며, 안정하고 마우스에서 최상의 반응을 나타낸다는 점에서 선호될 수 있음을 시사한다.
참고문헌
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[3] Andersen MH, Bonfill JE, Neisig A, Arsequell G, Sondergaard I, Valencia G, et al. (1999) Phosphorylated Peptides Can Be Transported by TAP Molecules, Presented by Class I MHC Molecules, and Recognized by Phosphopeptide-Specific CTL. J Immunol 163:3812-8.
[4] Ahmad SM, Martinenaite E, Hansen M, Junker N, Borch TH, Met O, et al. PD-L1 peptide co-stimulation increases immunogenicity of a dendritic cell-based cancer vaccine. in press ed. 2016.
서열
전체 길이 인간 아르기나제 1 (NP_000036.2) (서열번호1)
MSAKSRTIGI IGAPFSKGQP RGGVEEGPTV LRKAGLLEKL KEQECDVKDY GDLPFADIPN
DSPFQIVKNP RSVGKASEQL AGKVAEVKKN GRISLVLGGD HSLAIGSISG HARVHPDLGV
IWVDAHTDIN TPLTTTSGNL HGQPVSFLLK ELKGKIPDVP GFSWVTPCIS AKDIVYIGLR
DVDPGEHYIL KTLGIKYFSM TEVDRLGIGK VMEETLSYLL GRKKRPIHLS FDVDGLDPSF
TPATGTPVVG GLTYREGLYI TEEIYKTGLL SGLDIMEVNP SLGKTPEEVT RTVNTAVAIT
LACFGLAREG NHKPIDYLNP PK
면역원성에 대한 핫스팟으로 확인된 부위는 볼드체 및 밑줄로 나타냄
참고: 상기 서열은 가장 광범위한 발현 분포를 갖는 인간 아르기나제 1의 동위체2(isoform2)이다. 대안적으로, 더 긴 동위체1(isoform1)은 주로 간에서 발현된다. 이 경우의 서열은 NP_001231367.1로서 제공된다. 이는 서열번호 1에 나타낸 바와 같이 동위체2의 43 및 44 위치에 대응되는 위치 사이에 추가적인 8개의 아미노산 서열을 포함한다. 동위체 2의 이들 위치에 걸친 본 발명의 어떤 폴리펩타이드도 동위체 1의 상기 추가적인 8개 아미노산의 삽입을 선택적으로 포함할 수 있다.
전체 길이 쥐 아르기나제 1 (NP_031508.1)(서열번호 59)
MSSKPKSLEI IGAPFSKGQP RGGVEKGPAA LRKAGLLEKL KETEYDVRDH GDLAFVDVPN
DSSFQIVKNP RSVGKANEEL AGVVAEVQKN GRVSVVLGGD HSLAVGSISG HARVHPDLCV
IWVDAHTDIN TPLTTSSGNL HGQPVSFLLK ELKGKFPDVP GFSWVTPCIS AKDIVYIGLR
DVDPGEHYII KTLGIKYFSM TEVDKLGIGK VMEETFSYLL GRKKRPIHLS FDVDGLDPAF
TPATGTPVLG GLSYREGLYI TEEIYKTGLL SGLDIMEVNP TLGKTAEEVK STVNTAVALT
LACFGTQREG NHKPGTDYLK PPK
면역원성에 대한 핫스팟으로 확인된 부위는 볼드체 및 밑줄로 나타냄
전체 길이 인간 아르기나제 2 (NP_001163.1)(서열번호 60)
MSLRGSLSRL LQTRVHSILK KSVHSVAVIG APFSQGQKRK GVEHGPAAIR EAGLMKRLSS
LGCHLKDFGD LSFTPVPKDD LYNNLIVNPR SVGLANQELA EVVSRAVSDG YSCVTLGGDH
SLAIGTISGH ARHCPDLCVV WVDAHADINT PLTTSSGNLH GQPVSFLLRE LQDKVPQLP G
FSWIKPCISS ASIVYIGLRD VDPPEHFILK NYDIQYFSMR DIDRLGIQK V MERTFDLLIG
KRQRPIHLSF DIDAFDPTLA PATGTPVVGG LTYREGMYIA EEIHNTGLLS ALDLVEVNPQ
LATSEEEAKT TANLAVDVIA SSFGQTREGG HIVYDQLPTP SSPDESENQA RVRI
면역원성에 대한 핫스팟으로 확인된 부위는 볼드체 및 밑줄로 나타냄
표 A
Figure pct00002
Figure pct00003
* 는 인간 아르기나제1에 대응되는 부위와 비교하여 적어도 하나의 차이를 포함하는 쥐 아르기나제 1의 서열을 나타낸다. 대응되는 인간 서열과 동일하지 않은 잔기는 볼드체 및 밑줄로 표시하였다. 쥐 및 인간 아르기나제 1은 길이가 동일하므로 시작과 끝 위치가 동일하다.
# 는 인간 아르기나제 2의 서열을 의미한다. 시작과 끝 위치는 인간 아르기나제 1에서 대응되는 위치이다.
대안적인 인간 아르기나제 1 서열 (서열번호 61)
MSAKSRTIGIIGAPFSKGQPRGGVEEGPTVLRAGLLEKLKEQECDVKDYGDLPFADIPN
DSPFQIVKNPRSVGKASEQLAGKVAEVKKNGRISLVLGGDHSLAISIGHARVHPDLGV
IWVDAHTDINTPLTTTSGNLHGQPVSFLLKELKGKIPDVPGFSWVTPCISAKDIVYIGLR
DVDPGEHYILKTLGIKYFSMTEVDRLGIGKVMEETLSYLLGRKRPIHLSFDVDGLDPSF
TPATGTPVVGGLTYREGLYITEEIYKTGLLSGLDIMEVNPSLGKTPEEVTRTVNTAVAIT
LACFGLAREGNHKPIDYLNPPK
SEQUENCE LISTING <110> Company <120> <130> 10060PC00 <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 322 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser 1 5 10 15 Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg 20 25 30 Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys 35 40 45 Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe 50 55 60 Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu 65 70 75 80 Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val 85 90 95 Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Ser Ile Ser Gly His Ala 100 105 110 Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp 115 120 125 Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro 130 135 140 Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro 145 150 155 160 Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr 165 170 175 Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr 180 185 190 Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile 195 200 205 Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys 210 215 220 Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe 225 230 235 240 Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu 245 250 255 Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly 260 265 270 Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu 275 280 285 Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe 290 295 300 Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro 305 310 315 320 Pro Lys <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 2 Gln Leu Ala Gly Lys Val Ala Glu Val 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 3 Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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sequence <400> 29 His Ala Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile Trp Val Asp Ala His 1 5 10 15 Thr Asp Ile Asn 20 <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 30 Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr 1 5 10 15 Ser Gly Asn Leu 20 <210> 31 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 31 Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro Val Ser 1 5 10 15 Phe Leu Leu Lys 20 <210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 32 His Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile 1 5 10 15 Pro Asp Val Pro 20 <210> 33 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 33 Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro Gly Phe Ser Trp Val Thr 1 5 10 15 Pro Cys Ile Ser 20 <210> 34 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 34 Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser 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Artificial sequence <400> 55 Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Ile Lys Thr Leu Gly Ile Lys 1 5 10 15 Tyr Phe Ser Met 20 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 56 Lys Thr Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Lys Leu 1 5 10 15 Gly Ile Gly Lys 20 <210> 57 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 57 Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr 1 5 10 15 Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Ile Lys Thr 20 25 30 Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Lys Leu Gly Ile 35 40 45 Gly Lys 50 <210> 58 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 58 Gly Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Ile Ser Ser Ala Ser Ile Val Tyr 1 5 10 15 Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Pro Glu His Phe Ile Leu Lys Asn 20 25 30 Tyr Asp Ile Gln Tyr Phe Ser Met Arg Asp Ile Asp Arg Leu Gly Ile 35 40 45 Gln Lys 50 <210> 59 <211> 323 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 59 Met Ser Ser Lys Pro Lys Ser Leu Glu Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser 1 5 10 15 Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Lys Gly Pro Ala Ala Leu Arg 20 25 30 Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Thr Glu Tyr Asp Val Arg 35 40 45 Asp His Gly Asp Leu Ala Phe Val Asp Val Pro Asn Asp Ser Ser Phe 50 55 60 Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Asn Glu Glu Leu 65 70 75 80 Ala Gly Val Val Ala Glu Val Gln Lys Asn Gly Arg Val Ser Val Val 85 90 95 Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Val Gly Ser Ile Ser Gly His Ala 100 105 110 Arg Val His Pro Asp Leu Cys Val Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp 115 120 125 Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Ser Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro 130 135 140 Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Phe Pro Asp Val Pro 145 150 155 160 Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr 165 170 175 Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Ile Lys Thr 180 185 190 Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr 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Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 62 Val Thr Gln Asn Phe Leu Ile Leu 1 5

Claims (10)

  1. 55개 이하의 아미노산 길이이고, 서열번호 52 또는 서열번호 58 중 어느 하나의 적어도 8, 9, 10, 20, 30, 40 또는 50개의 연속된 아미노산의 서열을 포함하거나 이루어진, 서열번호 1(아르기나제 1) 또는 서열번호 60(아르기나제 2)의 인간 아르기나제 단백질의 분리된 면역원성 폴리펩타이드 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 52, 50, 51, 37, 35, 35, 34, 9, 53, 54, 2 내지 33, 또는 38 내지 49 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이루어진, 폴리펩타이드 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 37, 36, 34 또는 35 중 어느 하나의 적어도 8, 9, 10, 15 또는 모든 20개의 연속된 아미노산을 포함하고, 선택적으로 상기 서열번호 34의 시스테인은 보존적 치환으로 대체된 것인, 폴리펩타이드 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 단편으로서,
    a. C 말단 아미노산은 대응하는 아마이드로 대체되고; 및/또는
    b. 서열번호 1의 190번 위치에 대응하는 L이 I로 대체되고; 및/또는
    c. 서열번호 1의 205번 위치에 대응하는 R이 K로 대체되고; 및/또는
    d. 적어도 하나의 추가의 모이어티(moiety)가 폴리펩타이드의 용해도 또는 제조가능성을 증가시키기 위해 N 및/또는 C 말단에 부착되고, 선택적으로 상기 추가의 모이어티는 R 또는 K와 같은 친수성 아미노산이고; 및/또는
    e. 상기 단편은 대응하는 전체 길이 아르기나제와 비교하여 아르기나제 활성이 없거나 감소된 것이고; 및/또는
    f. 상기 단편은 대응하는 아르기나제를 발현하는 세포를 인식하는 T세포를 자극시킬 수 있는 것인, 폴리펩타이드 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 단편, 약학적으로 허용가능한 희석제(diluent) 또는 담체(carrier) 및 선택적으로 어쥬번트(adjuvant)를 포함하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 어쥬번트는 박테리아 DNA 기반 어쥬번트, 오일/계면활성제 기반 어쥬번트, 바이러스 dsRNA 기반 어쥬번트, 이미다조치닐린(imidazochinilines), 및 몬타니드(Montanide) ISA 어쥬번트로 이루어진 군에서 선택된 것인, 조성물.
  7. 개체에 제1항 내지 제4항의 분리된 폴리펩타이드 또는 제5항 또는 제6항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 개체의 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 적어도 부분적으로는 아르기나제의 부적절하거나 과도한 면역 억제 기능에 의해 특징지어지고, 및/또는 상기 질병 또는 상태는 암인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 암이고 선택적으로 상기 방법은 사이토카인 치료, T 세포 치료, NK 치료, 면역계 관문 억제제(예를 들어, 항체), 화학요법, 방사선 치료, 면역증강 물질, 유전자 치료, 및 수지상 세포와 같은 추가적인 암 치료의 동시 또는 순차적인 투여를 더 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 추가적인 암 치료는 액티마이드(Actimide), 아자시티딘(Azacitidine), 아자티오프린(Azathioprine), 블레오마이신(Bleomycin), 카보플라틴(Carboplatin), 카페시타빈(Capecitabine), 시스플라틴(Cisplatin), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 사이타라빈(Cytarabine), 다우노루비신(Daunorubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 독시플루리딘(Doxifluridine), 독소루비신(Doxifluridine), 에피루비신(Epirubicin), 에토포시드(Etoposide), 플루다라빈(Fludarabine), 플루오로우라실(Fluorouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 하이드록시우레아(Hydroxyurea), 이다루비신(Idarubicin), 이리노테칸(Irinotecan), 레날리도마이드(Lenalidomide), 류코보린(Leucovorin), 메클로레타민(Mechlorethamine), 멜팔란(Melphalan), 메르캅토퓨린(Mercaptopurine), 메토트렉세이트(Methotrexate), 미톡산트론(Mitoxantrone), 니볼루맙(Nivolumab), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 펨블로리주맙(Pembrolizumab), 페메트렉시드(Pemetrexed), 레블리미드(Revlimid), 테모졸로마이드(Temozolomide), 테니포시드(Teniposide), 티오구아닌(Thioguanine), 발루비신(Valrubicin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine) 및 비노렐빈(Vinorelbine) 중 하나 이상인, 방법.
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