ES2965009T3 - Terapia combinada contra el cancer - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para la prevención o tratamiento del cáncer en un sujeto. El método comprende administrar a dicho sujeto una composición inmunoterapéutica que comprende un componente de un punto de control del sistema inmunológico, o un fragmento inmunogénico de dicho componente; y un agente inmunomodulador que bloquea o inhibe un punto de control del sistema inmunológico, cuyo punto de control puede ser el mismo o diferente del punto de control del cual la composición comprende un componente. La invención también se refiere a dicha composición inmunoterapéutica y dicho agente, y a kits que los comprenden. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia combinada contra el cáncer

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición inmunoterapéutica para usar en un método para la prevención o el tratamiento del cáncer en un sujeto, en donde el método comprende la administración conjunta de dicha composición, que comprende un péptido IDO y un péptido PD-L1, y de un anticuerpo anti-PD1.

Antecedentes de la invención

El sistema inmunitario humano es capaz de generar una respuesta contra los tumores cancerosos. Explotar esta respuesta se considera cada vez más una de las rutas más prometedoras para tratar o prevenir el cáncer. La célula efectora clave de una respuesta inmunitaria antitumoral duradera es el linfocito T efector específico del tumor activado. Sin embargo, aunque los pacientes con cáncer suelen tener linfocitos T específicos para antígenos tumorales, la actividad de estos linfocitos T se suprime con frecuencia por factores y vías inhibidoras, y el cáncer sigue siendo una de las principales causas de muertes prematuras en el mundo desarrollado.

Durante la última década han surgido tratamientos que se dirigen de manera específica a los puntos de control del sistema inmunitario. Un ejemplo de esto es ipilimumab, que es un anticuerpo IgG1 completamente humano específico para CTLA-4. El tratamiento del melanoma metastásico con ipilimumab se asoció con una tasa de respuesta general del 10,9 % y una tasa de beneficio clínico de casi el 30 % en un gran estudio de fase III y los análisis posteriores han indicado que las respuestas pueden ser duraderas y prolongadas. Sin embargo, estas cifras todavía indican que la mayoría de los pacientes no se benefician del tratamiento, lo que deja margen de mejora.

En consecuencia, existe una necesidad de métodos para la prevención o el tratamiento del cáncer que aumenten la respuesta antitumoral de los linfocitos T en una mayor proporción de pacientes, pero sin provocar efectos indeseables tales como enfermedades autoinmunitarias.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una composición inmunoterapéutica para usar en un método para la prevención o el tratamiento del cáncer en un sujeto, comprendiendo el método administrar a dicho sujeto:

(i) dicha composición inmunoterapéutica, que comprende el péptido de secuencia DTLLKALLEIASCLEKALQVF (SEQ ID NO: 3) y el péptido de secuencia FMTYWHLLNAFTVTVPKDL (SEQ ID NO: 32);

y (ii) un agente inmunomodulador que es un anticuerpo inhibidor que se une a PD1.

Breve descripción del listado de secuencias

La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos de la indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO1).

La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de un fragmento de IDO1, denominado en el presente documento IO101 o IDO5.

La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos de un fragmento de IDO1, denominado en el presente documento IO102.

Las SEQ ID NO: 4 a 13 son las secuencias de aminoácidos de otros fragmentos de IDO1 divulgados en el presente documento.

La SEQ ID NO: 14 es la secuencia de aminoácidos de PD-L1

Las SEQ ID NO: 15 a 31 y 32 son las secuencias de aminoácidos de fragmentos de PD-L1 divulgados en el presente documento.

Las SEQ ID NO: 33 y 34 son las secuencias de aminoácidos de fragmentos de IDO1 de ratón, denominados en el presente documento IDO-Pep1 e IDO-EP2, respectivamente.

La SEQ ID NO: 35 es un fragmento de la oncoproteína E7 del VPH.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: concentración de citocinas en suero en un paciente (n.° 10) tratado de acuerdo con la invención.

Los niveles de siete citocinas diferentes en suero se muestran en varios momentos diferentes durante el tratamiento. IL: interleucina. TNF: factor de necrosis tumoral (del ingléstumour necrosis factor).IFN: interferón. Semana: Semanas después de la primera serie de ipilimumab.

Figura 2: Respuestas a la vacuna en pacientes tratados de acuerdo con la invención.Las respuestas inducidas por la vacuna en los pacientes se evaluaron con ELISpot de interferón gamma directo y tinción intracelular de citocinas.

a) Respuesta frente al péptido IO102. Las barras representan el n.° de puntos específicos, es decir, se resta el control negativo.

b) Reactividad de IO102 en seis pacientes tratados con ipilimumab sin vacuna peptídica IDO. Ninguno de estos pacientes mostró ninguna respuesta medible a IO102.

c) Tinción intracelular de citocinas de cultivos de linfocitos T estimulados con IO102 después de cuatro semanas de estimulación peptídica con IO102in vitroen los pacientes n.° 02, n.° 05 y n.° 07.

d) Tinción intracelular de citocinas de cultivos de linfocitos T estimulados con IO102 como se presenta en 2c, pero después de una captura adicional de TNF-a y una rápida expansión (véanse los métodos). TNF: factor de necrosis tumoral (del ingléstumour necrosis factor).IFN: interferón. Semana: Semanas después de la primera serie de ipilimumab

Figura 3: Células reguladoras en sangre periférica de pacientes tratados de acuerdo con la invención.

Análisis de citometría de flujo de la frecuencia de linfocitos T, linfocitos T auxiliares, linfocitos T reguladores (Treg) y células supresoras procedentes de mieloides (MDSC, del inglésmyeloid derived suppressor cells).

a+b) Estrategia de selección para Treg y MDSC (se incluyó la selección de singletes y de células vivas, pero no se muestran aquí).

c) Porcentaje de Treg en los linfocitos T CD4+ durante el tratamiento.

d) Porcentaje de MDSC en las PBMC singlete vivas.

e) Porcentaje de linfocitos T en la selección de linfocitos.

f) Porcentaje de células CD4+ en los linfocitos T.

Figura 4: Respuestas clínicas en pacientes tratados de acuerdo con la invención.Cambio en el diámetro de la lesión diana medido de acuerdo con RECIST 1.1. Los pacientes se evaluaron con PET-CT antes del inicio del tratamiento (valor inicial), después de 12 semanas y posteriormente cada 8-12 semanas hasta la progresión. El cambio en el diámetro de la lesión diana se calculó como un cambio porcentual desde el valor inicial y la suma del diámetro de la lesión diana. Los triángulos de colores más claros indican la aparición de nuevas lesiones. EP: Enfermedad progresiva. RP: Respuesta parcial.

Figura 5: IO102 induce un refuerzo superior de linfocitos T específicos en comparación con IDO5Gráficos de puntos de citometría de flujo que muestran el efecto potenciador en el número de linfocitos T específicos de CMV al añadir IDO5 o IO102 a células estimuladas con péptido de CMV. Se incluye como control la estimulación con un péptido de VIH que no tiene nada que ver. En la figura se muestran los resultados de dos lotes diferentes de PBMC (A y B). El porcentaje indica la fracción de células específicas para CMV. NLV-PE = tetrámero de CMV conjugado con ficoeritrina (PE), NLV-APC = tetrámero de CMV conjugado con aloficocianina (APC)

Figura 6: IO102 mejora el refuerzo inducido por IDO SMI de linfocitos T específicosGráficos de puntos de citometría de flujo que muestran el efecto potenciador en el número de linfocitos T específicos de CMV al añadir IO102 a células estimuladas con péptido de CMV y el inhibidor de molécula pequeña (SMI, del ingléssmall molecule inhibitor)IDO 1-MT. El porcentaje indica la fracción de células específicas para CMV. NLV-PE = tetrámero de CMV conjugado con ficoeritrina (PE), NLV-APC = tetrámero de CMV conjugado con aloficocianina (APC)Figura 7:Porcentaje de lisis de células diana THP-1 inducida por PBMC (células efectoras) cultivadas en presencia del péptido desordenado IDO (barras negras) o IO102 (barras grises) en proporciones efector:diana como se muestra.

Figura 8:Porcentaje de lisis de células diana THP-1 inducida por PBMC (células efectoras) cultivadas en presencia de control (IDO desordenada, barras negras), IDO5 (barras de color gris claro) o IO102 (barras de color gris oscuro) en proporciones efector:diana como se muestra.

Figura 9:Porcentaje de lisis de células diana THP-1 inducida por PBMC (células efectoras) cultivadas en presencia de IDO desordenada anticuerpo anti-PD-1 (control) o IO102 anticuerpo anti-PD-1.

Las barras representan la lisis inducida por IO102 anticuerpo anti-PD-1, menos el control, en proporciones efector:diana como se muestra.

Figura 10:muestra el cambio en el volumen tumoral (A) y el porcentaje de supervivencia (B) a lo largo del tiempo para ratones C57BL/6 que albergan un tumor TC-1 tratado con el péptido IDO (IDO-Pep1) o el péptido E7 (E7-Vax). Los ratones no tratados se muestran como control.

Figura 11:muestra el cambio en el porcentaje de supervivencia a lo largo del tiempo para ratones C57BL/6 que albergan un tumor TC-1 tratados con el péptido IDO (Pep1), el péptido E7 (E7-Vax) o ambos (Pep1 E7-Vax). Los ratones no tratados se muestran como control.

Figura 12:muestra el cambio en el porcentaje de supervivencia a lo largo del tiempo para ratones C57BL/6 que albergan un tumor TC-1 tratados con el péptido IDO (Pep1), 1-MT o ambos (Pep1 1-MT). Los ratones no tratados se muestran como control.

Figura 13:muestra el cambio en el volumen tumoral a lo largo del tiempo en ratones BALB/c que albergan un tumor CT26 tratados con el péptido IDO (EP2) o Montanide solo (Vehículo). Los ratones no tratados se muestran como control.

Descripción detallada de la invención

Un "sujeto", tal como se utiliza en el presente documento, incluye cualquier mamífero, preferentemente un ser humano.

El término "polipéptido" incluye por tanto secuencias de péptidos cortos y también polipéptidos y proteínas más largos.

Como se utiliza en el presente documento, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo tanto los isómeros ópticos D o L como análogos de aminoácidos y peptidomiméticos.

Punto de control del sistema inmunitario

La activación de los linfocitos T efectores normalmente está provocada por el receptor de linfocitos T que reconoce el péptido antigénico presentado por el complejo MHC. El tipo y nivel de activación logrado está determinado por el equilibrio entre las señales que estimulan y las señales que inhiben la respuesta de los linfocitos T efectores. La expresión "punto de control del sistema inmunitario" se utiliza en el presente documento para referirse a cualquier interacción molecular que altere el equilibrio a favor de la inhibición de la respuesta de los linfocitos T efectores. Es decir, una interacción molecular que, cuando ocurre, regula negativamente la activación de un linfocito T efector. Dicha interacción podría ser directa, tal como la interacción entre un ligando y un receptor de la superficie celular que transmite una señal inhibidora a un linfocito T efector. O podría ser indirecta, tal como el bloqueo o inhibición de una interacción entre un ligando y un receptor de la superficie celular que de otro modo transmitiría una señal de activación al linfocito T efector, o una interacción que promueve el aumento de una molécula o célula inhibidora, o el agotamiento por una enzima de un metabolito requerido por el linfocito T efector, o cualquier combinación de los mismos.

Ejemplos de puntos de control del sistema inmunitario incluyen:

a) La interacción entre la indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO1) y su sustrato;

b) La interacción entre PD1 y PDL1 y/o PD1 y PDL2;

c) La interacción entre CTLA4 y CD86 y/o CTLA4 y CD80;

d) La interacción entre B7-H3 y/o B7-H4 y sus respectivos ligandos;

e) La interacción entre HVEM y BTLA;

f) La interacción entre GAL9 y TIM3;

g) La interacción entre MHC de clase I o II y LAG3; y

h) La interacción entre MHC de clase I o II y KIR

El punto de control (a), es decir, la interacción entre IDO1 y su sustrato, es la vía metabólica en las células del sistema inmunitario que requiere el aminoácido esencial triptófano. La falta de triptófano da como resultado la supresión general de las funciones de los linfocitos T efectores y promueve la conversión de linfocitos T indiferenciados en linfocitos T reguladores (Treg) (es decir, inmunosupresores). La proteína IDO1 está aumentada en las células de muchos tumores y es responsable de degradar el nivel de triptófano. IDO1 es una enzima que cataliza la conversión de L-triptófano en N-formilquinurenina y, por lo tanto, es la primera enzima limitante de la tasa de catabolismo del triptófano a través de la vía de la quinurenina.

Punto de control (b), es decir, la interacción entre PD1 y cualquiera de sus ligandos PD-L1 y PD-L2. PD1 se expresa en linfocitos T efectores. La unión con cualquiera de los ligandos da como resultado una señal que disminuye la activación. Los ligandos se expresan en algunos tumores. En particular, PD-L1 se expresa en muchos tumores sólidos, incluido el melanoma. Por lo tanto, estos tumores pueden disminuir los efectos antitumorales mediados por el sistema inmunitario mediante la activación de los receptores inhibidores de PD-1 en los linfocitos T. Mediante el bloqueo de la interacción entre PD1 y uno o ambos de sus ligandos, se puede eliminar un punto de control de la respuesta inmunitaria, lo que conduce a respuestas aumentadas de linfocitos T antitumorales.

Punto de control (c), es decir, la interacción entre el receptor de linfocitos T CTLA-4 y sus ligandos, las proteínas B7 (B7-1 y B7-2). CTLA-4 normalmente está aumentado en la superficie de los linfocitos T después de la activación inicial, y la unión al ligando da como resultado una señal que inhibe una activación adicional o continuada. CTLA-4 compite por la unión a las proteínas B7 con el receptor CD28, que también se expresa en la superficie de los linfocitos T, pero que aumenta la activación. Por tanto, mediante el bloqueo de la interacción de CTLA-4 con las proteínas B7, pero no la interacción de CD28 con las proteínas B7, se puede eliminar uno de los puntos de control normales de la respuesta inmunitaria, lo que conduce a respuestas aumentadas de linfocitos T antitumorales.

La invención se refiere a una composición inmunoterapéutica para usar en un método para prevenir o tratar el cáncer.

El cáncer puede ser cáncer de próstata, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer de cabeza/cuello/garganta, melanoma maligno, cáncer de vejiga o un cáncer hemático. El cáncer puede tomar la forma de un tumor o de un cáncer de difusión hematógena. El tumor puede ser sólido. El tumor suele ser maligno y puede ser metastásico. El tumor puede ser un adenoma, un adenocarcinoma, un blastoma, un carcinoma, un tumor desmoide, un tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, un tumor endocrino, un tumor de células germinales, un linfoma, una leucemia, un sarcoma, un tumor de Wilms, un tumor de pulmón, un tumor de colon, un tumor linfático, un tumor de mama o un melanoma.

Los tipos de blastoma incluyen hepatoblastoma, glioblastoma, neuroblastoma o retinoblastoma. Los tipos de carcinoma incluyen carcinoma colorrectal o carcinoma hepatocelular, carcinomas pancreático, de próstata, gástrico, esofágico, de cuello uterino, de cabeza y cuello, y adenocarcinoma. Los tipos de sarcoma incluyen el sarcoma de Ewing, osteosarcoma, rabdomiosarcoma o cualquier otro sarcoma de tejidos blandos. Los tipos de melanoma incluyen lentigo maligno, melanoma sobre lentigo maligno, melanoma de diseminación superficial,

melanoma lentiginoso acral, melanoma de las mucosas, melanoma nodular, melanoma polipoide, melanoma desmoplásico, melanoma amelánico, melanoma de tejidos blandos, melanoma con pequeñas células parecidas a nevo, melanoma con características de nevo de Spitz y melanoma uveal. Los tipos de linfoma y leucemia incluyen leucemia/linfoma de linfocitos T precursores, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica aguda, linfoma folicular, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma de células del manto, leucemia/linfoma linfocítico crónico, linfoma MALT, linfoma de Burkitt, micosis fungoide, linfoma periférico de linfocitos T, forma de esclerosis nodular del linfoma de Hodgkin, subtipo de linfoma de Hodgkin de celularidad mixta. Los tipos de tumores de pulmón incluyen tumores de cáncer de pulmón no microcítico (adenocarcinoma, carcinoma epidermoide y carcinoma de células grandes) y carcinoma de pulmón microcítico.

El método de la invención funciona mediante la activación o el aumento de la respuesta contra el cáncer de los linfocitos T en un sujeto. Esto se logra mediante el aumento de la activación de los linfocitos T efectores específicos del cáncer o del tumor, mediante el bloqueo o la inhibición de uno o más puntos de control inmunitarios. El método de la invención utiliza al menos dos enfoques diferentes para bloquear o inhibir dicho uno o más puntos de control inmunitarios.

El primer enfoque es bloquear o inhibir un punto de control mediante la administración de una composición inmunoterapéutica que da como resultado una respuesta inmunitaria en el sujeto contra un componente del punto de control, bloqueando o inhibiendo así la actividad del punto de control. Por lo tanto, de manera alternativa puede describirse como una vacuna contra dicho componente de dicho punto de control. El componente del punto de control al que se dirige dicha respuesta inmunitaria se expresa preferentemente en células tumorales y también puede expresarse en células normales que tienen un efecto inhibidor inmunitario. En consecuencia, dicha respuesta inmunitaria tiene un doble efecto porque bloquea e inhibe la actividad del punto de control y también ataca directamente al tumor.

El segundo enfoque es bloquear o inhibir un punto de control mediante la administración de un agente inmunomodulador que se une a un componente del punto de control o lo modifica de otro modo, bloqueando o inhibiendo así la actividad del punto de control. El agente puede ser un anticuerpo o un inhibidor de molécula pequeña que se une a un componente del punto de control. Se pueden administrar múltiples agentes de este tipo, cada uno de los cuales se dirige a un punto de control diferente o a un componente diferente del mismo punto de control.

Mediante la explotación de diferentes enfoques para bloquear o inhibir los puntos de control del sistema inmunitario, el método de la invención dará como resultado una mayor respuesta antitumoral con menos efectos secundarios o complicaciones en comparación con métodos alternativos. La respuesta antitumoral suele ser mayor de la que se esperaría si se utilizara un solo enfoque. Además, hay menos probabilidades de que se produzcan reducciones en la eficacia debido a respuestas antifármaco, dado que el primer enfoque (la vacuna) se beneficiará activamente de dicha respuesta, lo que también puede dar lugar a un efecto duradero. Estos beneficios se aplican incluso si ambos enfoques se dirigen al mismo punto de control del sistema inmunitario.

La invención utiliza una composición inmunoterapéutica para dirigirse a IDO1 y PD-L1 y como agente inmunomodulador un anticuerpo que se une a PD1.

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Composición inmunoterapéutica

Una composición inmunoterapéutica de la invención da como resultado una respuesta inmunitaria contra un componente de un punto de control del sistema inmunitario. Los componentes son los péptidos de las SEQ ID NO: 3 y 32.

La capacidad de un fragmento para provocar una respuesta inmunitaria ("inmunogenicidad") a un componente de un punto de control del sistema inmunitario puede evaluarse mediante cualquier método adecuado. Normalmente, el fragmento será capaz de inducir proliferación y/o liberación de citocinasin vitroen linfocitos T específicos para dicho componente, en donde dichas células pueden estar presentes en una muestra de linfocitos tomadas de un paciente con cáncer. La proliferación y/o la liberación de citocinas pueden evaluarse mediante cualquier método adecuado, incluidos ELISA y ELISPOT. Métodos ilustrativos se describen en los ejemplos. Preferentemente, el fragmento induce la proliferación de linfocitos T específicos de componentes y/o induce la liberación de interferón gamma a partir de dichas células.

Para inducir la proliferación y/o la liberación de citocinas en linfocitos T específicos para dicho componente, el fragmento debe ser capaz de unirse a una molécula de MHC de modo que se presente a un linfocito T. Dicho de otro modo, el fragmento comprende o consiste en al menos un epítopo de unión a MHC de dicho componente. Dicho epítopo puede ser un epítopo de unión a MHC de clase I o un epítopo de unión a MHC de clase II. En particular, se prefiere si el fragmento comprende más de un epítopo de unión a MHC, cada uno de dichos epítopos se une a una molécula de MHC expresada a partir de un alelo HLA diferente, aumentando así la amplitud de la cobertura de sujetos tomados de una población humana exogámica.

La unión a MHC puede evaluarse mediante cualquier método adecuado, incluido el uso de métodos informáticos. Los métodos preferidos incluyen ensayos de inhibición competitiva en donde la unión se mide con respecto a un péptido de referencia. Normalmente, el péptido de referencia es un péptido que se sabe que es un fuerte aglutinante para una molécula de MHC determinada. En dicho ensayo, un péptido es un aglutinante débil para una molécula de HLA determinada si tiene una CI<50>más de 100 veces menor que el péptido de referencia para la molécula de HLA determinada. Un péptido es un aglutinante moderado si tiene una CI<50>más de 20 veces menor pero menos de 100 veces menor que el péptido de referencia para la molécula de HLA determinada. Un péptido es un aglutinante fuerte si tiene una CI<50>menos de 20 veces menor que el péptido de referencia para la molécula de HLA determinada.

Un fragmento que comprende un epítopo del MHC de clase I se une preferentemente a una especie de HLA del MHC de clase I seleccionada del grupo que consiste en HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11 y HLA-A24, más preferentemente HLA-A3 o HLA-A2. De manera alternativa, el fragmento puede unirse a una especie HLA-B del MHC de clase I seleccionada del grupo que consiste en HLA-B7, HLA-B35, HLA-B44, HLA-B8, HLA-B15, HLA-B27 y HLA-B51.

Un fragmento que comprende un epítopo del MHC de clase II se une preferentemente a una especie de HLA del MHC de clase II seleccionada del grupo que consiste en HLA-DPA-1, HLA-Dp B-1 , HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB y todos los alelos de estos grupos y HLA-DM y HLA-DO.

La composición inmunoterapéutica de la invención da como resultado una respuesta inmunitaria contra el polipéptido indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO1). La composición inmunoterapéutica de la invención comprende el siguiente fragmento de IDO1: IO102: DTLLKALLEIASCLEKALQVF [194-214] (SEQ ID NO: 3).

Los números entre paréntesis cuadrados [ ] indican las posiciones correspondientes en el polipéptido IDO de SEQ ID NO: 1, contando desde el extremo N al extremo C.

Se describe una vacuna contra el cáncer que comprende este péptido en Bjoernet al.,(2016), Cytotherapy, 18:1043-1055.

La composición inmunoterapéutica de la invención también da como resultado una respuesta inmunitaria contra el polipéptido, ligando 1 de muerte programada (PD-L1). La composición inmunoterapéutica de la invención comprende el fragmento PD-L1 de SEQ ID NO: 32, que puede verse en la parte inferior de la siguiente tabla.

Una composición inmunoterapéutica puede comprender preferentemente un adyuvante y/o un vehículo.

Los adyuvantes son cualquier sustancia cuya mezcla en la composición aumenta o modifica de otro modo la respuesta inmunitaria provocada por la composición. Los adyuvantes, definidos en términos generales, son sustancias que favorecen la respuesta inmunitaria. Los adyuvantes también pueden tener preferentemente un efecto prolongado, porque también dan como resultado una liberación lenta y sostenida de un agente activo desde el sitio de administración. Se proporciona un análisis general de adyuvantes en Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (2.a edición, 1986) en las páginas 61-63.

Los adyuvantes pueden seleccionarse del grupo que consiste en AlK(SO<4>)<2>, AlNa(SO<4>)<2>, AlNH<4>(SO<4>), sílice, alumbre, Al(OH)<3>, Ca<a>(PO<4>)<2>, caolín, carbono, hidróxido de aluminio, dipéptidos de muramilo, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-DMP), N-acetil-nornuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11687, también conocida como nor-MDP), N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1',2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, también denominada MTP-PE), RIBI (MPL+TDM+CWS) en una emulsión de escualeno/Tween-80.RTM al 2 %, lipopolisacáridos y sus diversos derivados, incluido el lípido A, adyuvante completo de Freund (FCA), adyuvante incompleto de Freund, adyuvante 65 de Merck, polinucleótidos (por ejemplo, poli IC y poli ácidos AU), cera D deMycobacterium,tuberculosis, sustancias encontradas enCornyebacterium parvum, Bordetella pertussiso miembros del géneroBrucella,TiterMax, ISCOM, Quil A, ALUN (véanse los documentos US 58767 y 5.554.372), derivados del lípido A, derivados de la toxina del cólera, derivados de HSP, derivados de LPS, matrices de péptidos sintéticos o GMDP, interleucina 1, interleucina 2, Montanide ISA-51 y QS-21. También se ha sugerido que varios extractos de saponina son útiles como adyuvantes en composiciones inmunogénicas. El factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) también se puede utilizar como adyuvante.

Los adyuvantes preferidos para su uso con la invención incluyen adyuvantes basados en aceite/tensioactivo, tales como adyuvantes Montanide (disponibles en Seppic, Bélgica), preferentemente Montanide ISA-51. Otros adyuvantes preferidos son adyuvantes basados en ADN bacteriano, tales como adyuvantes que incluyen secuencias de oligonucleótidos CpG. Otros adyuvantes incluso preferidos son los adyuvantes basados en ARNbc vírico, tal como poli I:C. El GM-CSF y las imidazoquinilinas también son ejemplos de adyuvantes preferidos.

El adyuvante es preferentemente un adyuvante Montanide ISA. El adyuvante Montanide ISA es preferentemente Montanide ISA 51 o Montanide ISA 720.

En Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (2.a edición, 1986) en las páginas 61 a 63 también se observa que, cuando un antígeno de interés es de bajo peso molecular o poco inmunogénico, se recomienda el acoplamiento a un transportador inmunogénico. Un polipéptido o fragmento de una composición inmunoterapéutica de la invención puede acoplarse a un transportador. Puede haber un transportador independientemente de un adyuvante. La función del transportador puede ser, por ejemplo, aumentar el peso molecular de un fragmento de polipéptido con el fin de aumentar la actividad o la inmunogenicidad, para conferir estabilidad, para aumentar la actividad biológica o para aumentar la semivida sérica. De manera adicional, un transportador puede ayudar a presentar el polipéptido o un fragmento del mismo a los linfocitos T. Por tanto, en la composición inmunogénica, el polipéptido o fragmento del mismo puede estar asociado con un transportador, tal como los que se exponen a continuación.

El transportador puede ser cualquier transportador adecuado conocido por un experto en la materia, por ejemplo, una proteína o una célula presentadora de antígeno, tal como una célula dendrítica (CD). Las proteínas transportadoras incluyen hemocianina de lapa californiana, proteínas séricas, tales como transferrina, seroalbúmina bovina, seroalbúmina humana, tiroglobulina u ovoalbúmina, inmunoglobulinas u hormonas, tales como insulina o ácido palmítico. De manera alternativa, la proteína transportadora puede ser toxoide tetánico o toxoide diftérico. De manera alternativa, el transportador puede ser un dextrano, tal como sefarosa. El transportador debe ser fisiológicamente aceptable para los seres humanos y seguro.

Opcionalmente, la composición inmunoterapéutica puede comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable. El excipiente debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la composición y no perjudicial para el receptor de la misma. Sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y similares, pueden estar presentes en el excipiente. En general, estos excipientes y sustancias auxiliares son agentes farmacéuticos que no inducen una respuesta inmunitaria en el individuo que recibe la composición, y que pueden administrarse sin producir excesiva toxicidad. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, líquidos, tales como agua, solución salina, polietilenglicol, ácido hialurónico, glicerol y etanol. También se pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Una profunda discusión de excipientes, vehículos y sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

La composición inmunoterapéutica se pueden preparar, envasar o comercializar en una forma adecuada para la administración en bolo o para la administración continua. Las composiciones inyectables se pueden preparar, envasar o comercializar en formas farmacéuticas unitarias, tal como en ampollas o en recipientes multidosis que contengan un conservante. Las composiciones incluyen, pero sin limitación, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberación sostenida o biodegradables. En una realización de una composición, el principio activo se proporciona en forma seca (por ejemplo, un polvo o granulado) para la reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril sin pirógeno) antes de la administración de la composición reconstituida. La composición se puede preparar, envasar o comercializar en forma de suspensión o solución acuosa u oleosa inyectable estéril. Esta suspensión o solución se puede formular de acuerdo con la materia conocida y puede comprender, además del principio activo, ingredientes adicionales, tales como los adyuvantes, excipientes y sustancias auxiliares descritas en el presente documento. Tales formulaciones inyectables estériles se pueden preparar con un diluyente o disolvente no tóxico por vía parenteral aceptable, tal como agua o 1,3-butanodiol, por ejemplo. Otros diluyentes y disolventes aceptables incluyen, pero sin limitación, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio y aceites no volátiles, tales como monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Otras composiciones útiles incluyen aquellas que comprenden el principio activo en forma microcristalina, en una preparación liposomal o como un componente de un sistema polimérico biodegradable. Las composiciones para la liberación sostenida o implantación pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero poco soluble en pequeñas cantidades o una sal soluble en pequeñas cantidades. De manera alternativa, los principios activos de la composición pueden estar encapsulados, adsorbidos o asociados con transportadores de partículas. Los transportadores de partículas adecuados incluyen aquellos procedentes de polímeros de polimetilmetacrilato, así como micropartículas de PLG procedentes de poli(lactidas) y poli(lactida-co-glicolidas). Véase, por ejemplo, Jefferyet al.(1993) Pharm. Res.

10:362-368. También se pueden utilizar otros sistemas de partículas y polímeros, por ejemplo, polímeros como polilisina, poliarginina, poliomitina, espermina, espermidina, así como conjugados de estas moléculas.

Agente inmunomodulador

Un "agente inmunomodulador" se utiliza en el presente documento para referirse a cualquier agente que, cuando se administra a un sujeto, bloquea o inhibe la acción de un punto de control del sistema inmunitario, lo que da como resultado el aumento de una respuesta efectora inmunitaria en el sujeto, normalmente una respuesta efectora de linfocitos T, que preferentemente comprende una respuesta efectora de linfocitos T antitumorales.

El agente inmunomodulador utilizado en la presente invención es un anticuerpo inhibidor que se une a PD1.

Un "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, una "porción de unión a antígeno") o cadenas sencillas de los mismos. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal y puede producirse mediante cualquier método adecuado. Los ejemplos de los fragmentos de unión abarcados en la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab', un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento dAb y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Los anticuerpos monocatenarios, tales como scFv, y los anticuerpos de cadena pesada, tales como anticuerpos del VHH y de camello, también tienen por objeto abarcarse en la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo.

Los anticuerpos que bloquean o inhiben la interacción de PD1 con PD-L1 incluyen nivolumab, pembrolizumab, lambrolizumab, pidilzumab y AMP-224.

Un agente inmunomodulador de la invención puede formularse con un excipiente farmacéuticamente aceptable para su administración a un sujeto. Los excipientes y sustancias auxiliares adecuados se describen anteriormente para la composición inmunoterapéutica de la invención, y los mismos también se pueden utilizar con el agente inmunomodulador de la invención. Las formas adecuadas para la preparación, el envasado y la comercialización de la composición inmunoterapéutica también se describen anteriormente. Las mismas consideraciones se aplican al agente inmunomodulador de la invención.

Pauta de administración

Para tratar el cáncer, la composición inmunoterapéutica y el agente inmunomodulador se administran cada uno al sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. Por una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una sustancia se entiende que una determinada sustancia se administra a un sujeto que padece cáncer, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente el cáncer o uno o más de sus síntomas. Dicho tratamiento terapéutico puede dar como resultado una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad o un aumento de la frecuencia o duración de los períodos sin síntomas. Dicho tratamiento puede dar lugar a una reducción del volumen de un tumor sólido.

Para prevenir el cáncer, la composición inmunoterapéutica y el agente inmunomodulador se administran cada uno al sujeto en una cantidad profilácticamente eficaz. Por "cantidad profilácticamente eficaz" de una sustancia se entiende que una sustancia determinada se administra a un sujeto en una cantidad suficiente para prevenir la aparición o recaída de uno o más síntomas asociados con el cáncer durante un período prolongado.

Las cantidades eficaces para un propósito determinado y una composición o agente determinado dependerán de la intensidad de la enfermedad así como del peso y estado general del sujeto, y el médico puede determinarlas fácilmente.

La composición inmunoterapéutica y el agente inmunomodulador se pueden administrar de manera simultánea o secuencial, en cualquier orden. Un médico puede determinar las vías de administración y dosis adecuadas para cada uno, y la composición y el agente pueden formularse en consecuencia.

La composición inmunoterapéutica normalmente se administra por vía parenteral, normalmente por inyección. La administración puede ser preferentemente por vía subcutánea, intradérmica, intramuscular o intratumoral. El lugar de la inyección puede recibir un tratamiento previo, por ejemplo con imiquimod o un adyuvante tópico similar para mejorar la inmunogenicidad. La cantidad total de polipéptido presente como agente activo en una dosis única de una composición inmunoterapéutica de la invención estará normalmente en el intervalo de 10 |jg a 1000 |jg, preferentemente de 10 jg a 150 jg .

Cuando el agente inmunomodulador es un anticuerpo, normalmente se administra como una infusión sistémica, por ejemplo, por vía intravenosa. Cuando el agente inmunomodulador es un SMI, normalmente se administra por vía oral. Un médico puede determinar las dosis adecuadas de anticuerpos y SMI. Las dosis adecuadas de anticuerpos suelen ser proporcionales al peso corporal del sujeto.

Una pauta normal implicará múltiples administraciones independientes tanto de la composición inmunoterapéutica como del agente inmunomodulador. Cada uno puede administrarse de forma independiente en más de una ocasión, tal como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más veces. La composición inmunoterapéutica en particular puede proporcionar un beneficio aumentado si se administra en más de una ocasión, ya que dosis repetidas pueden estimular la respuesta inmunitaria resultante. Las administraciones individuales de composición o agente pueden estar separadas por un intervalo adecuado determinado por un médico, pero el intervalo suele ser de 1 a 2 semanas. El intervalo entre administraciones normalmente será más corto al comienzo de un ciclo de tratamiento y aumentará hacia el final de un ciclo de tratamiento.

Una pauta de administración ilustrativa comprende la administración de un agente inmunomodulador en, por ejemplo, una dosis de 3 miligramos por kilogramo de peso corporal, cada tres semanas durante un total de alrededor de cuatro series, con una composición inmunoterapéutica (que normalmente incluye un adyuvante) también administrada por vía subcutánea en la parte posterior del brazo o en la parte anterior del muslo, alternando entre el lado derecho y el izquierdo. La administración de la composición inmunoterapéutica puede iniciarse al mismo tiempo con la primera serie de agente, con un total de alrededor de 7 dosis de composición administradas; primero semanalmente durante un total de cuatro y después tres dosis adicionales cada dos semanas. Una pauta de este tipo se describe en el ejemplo 1.

Otra pauta de administración ilustrativa comprende tratar a los sujetos cada dos semanas (inducción) durante 2,5 meses y posteriormente mensualmente (mantenimiento) con una composición inmunoterapéutica (que normalmente incluye adyuvante) administrada por vía subcutánea. La pomada de imiquimod (Aldara, Meda AS, www.meda.se) se puede administrar opcionalmente 8 horas antes de la administración de la composición y recubrir la piel con un parche hasta la administración en la misma zona de la piel.

La invención se ilustrará mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1: Estudio de fase I

Métodos

Diseño del estudio

Los pacientes se inscribieron en el primer ensayo clínico de fase I en seres humanos del departamento de Oncología del Hospital Herlev, Universidad de Copenague (Herlev, Dinamarca) de marzo de 2014 a agosto de 2014. El estudio se diseñó originalmente como un estudio de fase I con dos grupos, que combinaba la vacunación con péptidos procedentes de IDOl con el tratamiento habitual con ipilimumab o vemurafenib. Sólo se informan datos de pacientes tratados con ipilimumab en combinación con la vacuna. Los sujetos debían tener melanoma maligno en estadio III o estadio IV irresecable verificado histológicamente, edad >18 años, valoración funcional según el Grupo Oncológico Cooperativo de la Costa Este (ECOG) <2, al menos 21 días desde el último tratamiento sistémico para el melanoma y completamente recuperado después de este y función hematológica, renal y hepática adecuadas. Se permitieron antecedentes de tratamiento previo anti-CTLA-4 a menos que el tratamiento hubiera sido ineficaz o se hubiera interrumpido debido a toxicidad.

Los principales criterios de exclusión incluyeron tratamiento inmunodepresor sistémico simultáneo, infección crónica conocida, cáncer previo dentro en los últimos tres años, enfermedad médica simultánea grave, cirugía abdominal mayor en los últimos 28 días, mujeres embarazadas o lactantes, enfermedad psiquiátrica grave que afecte el cumplimiento, intolerancia conocida a los adyuvantes de la vacuna Montanide o imiquimod, antecedentes de autoinmunidad o receptores de vacunas profilácticas en los últimos 28 días. El estudio fue aprobado por la Agencia Danesa de Medicamentos y Salud y el Comité de ética local, Capital Region de Dinamarca. El estudio se realizó de acuerdo con la declaración de Helsinki II y la buena práctica clínica (BPC). Todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito antes de realizar los procedimientos relacionados con el estudio. El estudio está registrado en www.clinicaltrials.gov (NCT02077114) y https://eudract.ema.europa.eu/ (EudraCT n.° 2013-000365-37).

El criterio de valoración principal fue la toxicidad. Además, se evaluó la respuesta inmunitaria contra el péptido vacunal y el beneficio clínico del tratamiento. Los pacientes recibieron tratamiento con ipilimumab, a una dosis de 3 miligramos por kilogramo de peso corporal cada tres semanas durante un total de cuatro series. Además de esto, los pacientes recibieron una vacuna, que contenía el péptido IO102 en una emulsión de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y Montanide ISA-51, administrada por vía subcutánea en la parte posterior del brazo o en la parte delantera del muslo, alternando entre el lado derecho y el izquierdo. La vacunación se inició de forma simultánea con la primera serie de ipilimumab y se administraron un total de 7 vacunas; primero semanalmente durante un total de cuatro vacunas y posteriormente tres vacunas adicionales cada dos semanas.

Vacuna con IO102

La vacuna consiste en un péptido de 21 aminoácidos que corresponde a los restos 194 a 214 de la indoleamina 2,3-dioxigenasa. El péptido se denomina en el presente documento IO102. El péptido tiene la secuencia de aminoácidos DTLLKALLEIASCLEKALQVF (SEQ ID NO: 3). Fue producido según el patrón de GMP por JPT Peptides Technologies BmbH, Berlín, Alemania). Para la administración, la farmacia del hospital (Capital Region de Dinamarca) disolvió el péptido en 2 % de dimetilsulfóxido y 98 % de PBS y lo mezcló con Montanide ISA-51 (Seppic Inc., ingredientes especiales de Air Liquide Healthcare, París La Défense, Francia). Se aplicó una crema tópica de imiquimod al 5 % (Medea, Allerod, Dinamarca) en el lugar de la vacuna y se mantuvo bajo un vendaje oclusivo de 6 a 12 horas antes de la inyección.

El péptido tiene numerosos epítopos de HLA de clase I diferentes intercalados dentro de la secuencia, que se prevé que se unan a varios de los alelos HLA más comunes mediante análisis informático (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/).

Criterios de evaluación clínica

La seguridad del tratamiento del estudio se evaluó en términos de aparición de acontecimientos adversos, clasificados de acuerdo con los criterios de terminología común para acontecimientos adversos (CTCAE, del inglésCommon Terminology Criteria for Adverse Events)versión 4.0. La actividad antitumoral se evaluó con tomografía computarizada por emisión de positrones (PET-CT) obtenida al inicio (hasta 28 días antes del inicio del tratamiento), después de 12 semanas y posteriormente cada 8 a 12 semanas hasta la progresión. Las tomografías computarizadas se evaluaron de acuerdo con los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST, del inglésResponse Evaluation Criteria In Solid Tumors)versión 1.1. Las categorías de respuesta son respuesta completa (RC), respuesta parcial (RP), enfermedad progresiva (EP) y enfermedad estable (EE). Los pacientes que recibieron al menos cinco vacunas se consideraron elegibles para la evaluación de los criterios de valoración clínicos e inmunológicos del estudio.

Procesamiento de muestras de sangre

Las PBMC se purificaron a partir de sangre heparinizada utilizando centrifugación en gradiente de densidad Lymphoprep<™>(StemCell Technologies) en tubos LeucoSep<™>(Greiner Bio-One). Después del procesamiento, las células se congelaron en NuncR 1,8 ml CryoT ube (thermo Scientific) y se almacenaron a -150 °C en suero AB humano al 90 % (Sigma Aldrich) y sulfóxido de dimetilo al 10 % (Herlev Hospital Pharmacy). Se buscó mantener el tiempo entre el paciente y el procesamiento lo más bajo posible y, por lo general, el procesamiento se inició en un plazo de 4 horas. La sangre para la recogida del suero se recogió en un tubo de gel VacuetteR de 8 ml que contenía activador de coágulos (Greiner Bio-One). El suero se distribuyó en alícuotas en NuncR de 1,8 ml de CryoTube (thermo Scientific) y se almacenó a -80 °C hasta el análisis. Se procesaron PBMC a partir de 100 ml de sangre heparinizada por muestreo y suero a partir de 8 ml de sangre completa. Se obtuvieron muestras de sangre al inicio del estudio, en la semana cuatro, la semana ocho y la semana 12. En los pacientes que no progresaron, se obtuvieron muestras de sangre adicionales al mismo tiempo que las evaluaciones radiológicas cada 8 a 12 semanas.

Validaciónin vitrode la inmunogenicidad de IO102

Los análisis de ELISpot se realizaron de acuerdo con las pautas del Programa de Inmunoguía (CIP) de CIMT (http://cimt.eu/cimt/files/dl/cip_guidelines.pdf). Las respuestas a la vacuna se evaluaron directamenteex-vivoen muestras de PBMC adquiridas antes, durante y después de la terapia. Las muestras crioconservadas se descongelaron y se dejaron reposar durante la noche en placas de 24 pocillos en medio de cultivo X-vivio (Lonza) que contenía suero AB humano al 5 % (Sigma). Placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (MultiScreen<m>A<i>P MSIPN4W; Millipore) se recubrieron durante la noche con el anticuerpo de captura de IFN-<y>(Mabtech). Los pocillos se lavaron en p Bs (Sigma-Aldrich), se bloquearon con x-vivo durante dos horas a 37 °C en una atmósfera humidificada y se añadieron las PBMC en una concentración de 5 * 10<5>/pocillo y 2 * 10<5>/pocillo y el péptido IO102 (adquirido de KJ Ross-Petersen, Klampenborg, Dinamarca) se añadió a una concentración de 5 pM. Se utilizó un péptido procedente del VIH que no tenía nada que ver como control negativo (ILKEPVHGV, adquirido de KJ Ross-Petersen, Klampenborg, Dinamarca). Después de la adición del péptido, las placas se dejaron incubar durante la noche a 37 °C en una atmósfera humidificada complementada con CO<2>al 5 %. Al día siguiente se descartó el medio y los pocillos se lavaron antes de la adición del anticuerpo IFN-<y>secundario biotinilado (Mabtech). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas, se lavaron y se añadió el conjugado avidina-enzima (AP-Avidina; Calbiochem/Invitrogen Life Technologies) a cada pocillo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y se añadió el sustrato enzimático NBT/BCIP (Invitrogen Life Technologies) a cada pocilio y se incubó a temperatura ambiente durante 1 a 10 minutos. Tras la aparición de puntos de color púrpura oscuro, a juzgar por la inspección visual, la reacción se terminó lavando con agua desmineralizada. Los puntos se contaron con el analizador ImmunoSpot Serie 2.0 (CTL Analyzers). Las respuestas de ELISpot se consideraron positivas cuando el número de células secretoras de IFN-<y>era al menos 2 veces superior al control negativo y con un mínimo de 50 puntos (por 5 * 105 PBMC) detectados. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Los resultados se presentan restando el valor inicial promedio.

Establecimiento de cultivos de linfocitos T específicos de IDO

Las PBMC se estimularon con el péptido IO102 en X-vivo 15 con suero AB humano al 5 % y 120 U/ml de IL2 (Novartis, Dinamarca) en placas de 24 pocillos (Nunc, Fischer Scientific). Inicialmente, se utilizó el péptido 20 pM y los cultivos se reestimularon cada 7 días con una concentración de péptido disminuida de log 10 cada semana. Los cultivos celulares se complementaron con IL2 nueva cada 7 a 10 días. Las células se mantuvieron a una concentración de 3 a 4 * 106/pocillo.

Para el enriquecimiento y expansión de los linfocitos T específicos de IDO, las células cultivadas se reestimularon, después de cuatro semanas de cultivo, con péptido 20 pM y se enriquecieron con el ensayo de secreción de TNF-a (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se estimularon con péptidos 2,5 horas antes de la tinción con el anticuerpo primario. Las células enriquecidas se expandieron en un protocolo de expansión rápida modificado (véase a continuación).

Protocolo de expansión rápida

Se expandieron los linfocitos T enriquecidos para la reactividad de IDO y se utilizaron aproximadamente de 1 a 2 * 105 células inicialmente. Los cultivos se iniciaron en matraces T25 verticales (Nunc) que contenían 20 ml de X-vivo 15 (Lonza) complementado con suero AB humano al 10 %, 0,6 pg de anti-CD3 (OKT3, Janssen-Cilag), 6000 U/ml de IL2 (Proleukin, Novartis), 1,25 pg/ml de Fungizona (Squibb), 100 100 U/ml de PenStrep (Gribco, Life Technologies) y 2 * 107 células alimentadoras. Como células alimentadoras se utilizaron PBMC alógenas mezcladas de al menos tres donantes diferentes. Inmediatamente antes de su uso, las células alimentadoras se descongelaron en RPMI (Gribco, Life Technologies) con 0,025 mg/ml de Pulmozyme (Roche) y se irradiaron con<y>con 30 Gy. Después de 5 días de cultivo, se aspiraron cuidadosamente 10 ml de medio de cultivo y los frascos se complementaron con medios nuevos que contenían suero AB humano al 10 %, 6000 U/ml de IL2, 1,25 pg/ml de Fungizone y 100 100 U/ml de PenStrep. Los cultivos se evaluaron periódicamente con respecto al número de células y el color de los medios, y se transfirieron a matraces T80 o T175 además de añadir nuevos medios si correspondía. Las células se recolectaron después de un total de 14 días de cultivo y se analizaron directamente o se crioconservaron en suero AB humano al 90 y sulfóxido de dimetilo al 10 %.

Tinción intracelular de citocinas

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Nunc, Fischer Scientific) a una concentración de 2 a 3 * 106/ml. Se añadió el péptido IO102 a una concentración de 5 pM y después de una hora, se añadió GolgiPlugTM (BD Biosciences) a una concentración de 1 pl/ml de medio de cultivo. Después de cinco horas, las células se recogieron y procesaron más. Las células se tiñeron para detectar antígenos de superficie y células muertas con los siguientes anticuerpos/colorantes: anti-CD3-PerCP, anti-CD4-Horizon V500, anti-CD8-FITC y LIVE/DEADR Fixable Near-IR Dead Cell Stain (Life Technologies). Las células se fijaron y permeabilizaron utilizando el kit BD Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se tiñeron para detectar citocinas intracelulares con los siguientes anticuerpos: anti-IL2-PE, anti-IFN-Y-APC (BD Biosciences) y anti-TNF-a-PE-Cy7 (Biolegend). Las células se adquirieron en un FACSCanto II (BD Biosciences) utilizando el programa informático FACSDiva versión 6.1.3 (BD Biosciences). Se utilizó el programa informático FlowJo versión 10 (Tree Star, Ashland, EE. UU.) para determinar la frecuencia de células positivas para citocinas.

Análisis de células reguladoras en sangre periférica

Las muestras de PBMC se descongelaron en medio RPMI 1640 (Lonza) a 37 °C complementado con 2,5 ml de ADNasa que contenía Pulmozyme (Roche) y 0,26 mmol de MgCl (Herlev Hospital Pharmacy) por 100 ml de tampón. Todas las tinciones se realizaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Lonza) que contenía seroalbúmina bovina al 0,5 % (Sigma-Aldrich). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: FoxP3-PE, HLA-DR-HV500, CD3-PE-Cy7, CD19-PE-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD4-HV500, CD11b-APC, CD3-APC (adquirido en BD Bioscience), CD33-FITC, CD124-PE (adquirido en BD Pharmigen), HELIOS-PerCP-Cy5.5, CD14-BV421, CD25-BV421 (todos adquiridos en Biolegend), CD127-FITC, CD39-PE-Cy7 (adquirido en eBioscience). De manera adicional, todas las muestras se tiñeron con el kit de tinción de células muertas de infrarrojo cercano LIVE/DEADR Fixable (Life technologies). Para la tinción intracelular de factores de transcripción, se utilizó el conjunto de tampones de tinción Foxp3/factor de transcripción (eBioscience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se adquirieron en un FACSCanto II utilizando el programa informático FACSDiva versión 6.1.3 (BD Biosciences). El análisis de los datos de flujo se realizó con el programa informático FlowJo versión 10 OSX (TreeStar, Inc., Ashland, OR). El análisis de datos se realizó después de filtrar las células muertas y los dobletes/tripletes.

Matriz de perlas de citocinas

Se midieron las concentraciones de interleucina (IL) 2, IL4, IL6, IL10, IL17A, TNF-a y IFN-y en suero de pacientes antes y durante el tratamiento utilizando el Kit BD™ Human Th1/Th2/Th17 CBA (B<d>Biosciences) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de citocinas se midieron en muestras de suero descongeladas y sin diluir. La concentración de citocinas se calculó con programa informático FCAP Array™ versión 3.0 (BD SoftFlow).

Cohorte de pacientes de referencia

Para comparar los datos clínicos e inmunológicos, se utilizó una cohorte de pacientes tratados con ipilimumab en el centro (datos de pacientes, etc. presentados en el manuscrito II). Estos pacientes habían participado en un estudio de biomarcadores aprobado por el Comité de Ética local para la Capital Region de Dinamarca (n.° de aprobación H-2-2012-058) y todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito. Los criterios de inclusión para este protocolo fueron similares a los criterios de inclusión para el estudio de vacunas, aunque no se evaluó la intolerancia conocida a los adyuvantes de la vacuna Montanide o imiquimod. Los pacientes se seleccionaron como controles según la edad (+/- 5 años) y el estadio M. Para comparar la reactividad de los linfocitos T hacia IO102 durante la terapia con ipilimumab, se midió la secreción de IFN-y en un ensayo ELISpot como se explicó anteriormente. La reactividad se evaluó en muestras de PBMC obtenidas antes del inicio del tratamiento y después de tres series de tratamiento.

Estadísticas

Todos los cálculos estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA). Los diagramas de dispersión se presentan con la mediana (línea horizontal). Todas las pruebas se realizaron bilateralmente y se consideró significativo un valor dep<0,05. Cuando correspondía, las diferencias a lo largo del tiempo se evaluaron mediante la prueba del orden rangos con signo de pares emparejados de Wilcoxon.

Resultados

Datos demográficos

Se evaluó a trece pacientes para su inclusión en el estudio, 12 fueron incluidos, uno no deseaba participar. A dos pacientes se les diagnosticó metástasis cerebral clínicamente significativa antes de recibir el primer tratamiento y fueron excluidos del estudio. Diez pacientes recibieron tratamiento en el protocolo y todos se consideraron elegibles para la evaluación de los criterios de valoración clínicos e inmunológicos del estudio. Las características de estos diez pacientes se presentan en la tabla 1. Ocho pacientes recibieron el protocolo especificado, cuatro series de ipilimumab y siete vacunas peptídicas. Un paciente desarrolló metástasis cerebral sintomática después de recibir tres series de ipilimumab y cinco vacunas, y fue excluido del protocolo debido a la necesidad de tratamiento con corticoesteroides en dosis elevadas. Se administró ipilimumab como terapia de primera línea en los diez pacientes. Un paciente había recibido interferón-a en un entorno adyuvante antes de ingresar al ensayo. Ninguno de los pacientes había recibido ningún tratamiento sistémico previo para la enfermedad metastásica.

TABLA 1

Datos demográficos de los pacientes - Datos demográficos de los diez pacientes que reciben tratamiento en el protocolo. GL: Ganglio linfático. Estadio M: Estadio metastásico inicial de acuerdo con la clasificación del American Joint Committee on Cancer.

(continuación)

Toxicidad

Los resultados se presentan en la tabla 2. No se observaron reacciones adversas CTCAE de grado III o IV relacionadas con la vacuna. En general, el tratamiento fue bien tolerado y se asoció con una toxicidad limitada y manejable.

La mayoría de los pacientes experimentaron reacciones de leves a moderadas en el lugar de la inyección, incluidos picazón, hinchazón y eritema. En la mayoría de los casos, los síntomas respondieron a los antihistamínicos orales y los síntomas remitieron después de completar el tratamiento con la vacuna en todos los pacientes. Curiosamente, se observó un aumento de la señal PET en muchos de los pacientes en la zona de administración de la vacuna.

Varios de los pacientes experimentaron reacciones adversas probablemente relacionadas con el tratamiento con ipilimumab. Dos pacientes experimentaron diarrea de grado II, que respondió al tratamiento con loperamida. Un paciente (el paciente n.° 10) ingresó en el centro para recibir tratamiento por diarrea de grado III y una colonoscopia confirmó el diagnóstico de colitis inducida por ipilimumab. Inicialmente, la afección era resistente al tratamiento incluso a dosis elevadas de corticoesteroides orales, pero remitió tras la administración de metilprednisolona intravenosa. Una semana después del alta, este paciente fue reingresado en un hospital local debido a una recaída de diarrea, edema periférico y malestar general. En este punto sus pruebas de laboratorio mostraban hiponatremia, hipopotasiemia, hipoalbuminemia y trombocitopenia. Se trató con terapia de reemplazo de electrolitos y líquidos, pero murió una semana después del ingreso. En este punto, la causa exacta de la muerte no está del todo clara. Una exploración PET-CT realizada cuatro semanas antes de su muerte reveló solo metástasis cutáneas y subcutáneas y estabilización de la enfermedad y, por lo tanto, no es muy probable que la enfermedad progresase. Lo más probable es que el paciente hubiera desarrollado colitis acelerada, ya sea por falta de adherencia al tratamiento con corticoides o por enfermedad resistente a esteroides. La colitis inducida por ipilimumab puede ser mortal en sí misma, pero también es probable que el paciente hubiera desarrollado sepsis durante su estancia hospitalaria. Los análisis de citocinas inflamatorias en las muestras de suero utilizando una matriz de perlas de citocinas mostraron niveles profundamente aumentados de IL17A e IL6 en la semana 12, simultáneo con el desarrollo de colitis fulminante en este paciente (figura 1).

De manera adicional, dos pacientes experimentaron erupción maculopapular de grado II en el tronco y las extremidades, que respondió al tratamiento con esteroides tópicos y remitió completamente una vez finalizado el tratamiento. Un paciente experimentó un brote de su rosácea preexistente después de la primera dosis de ipilimumab, que remitió durante la terapia posterior. Un paciente experimentó coroiditis de grado II 10 semanas después de la última dosis de ipilimumab, que se resolvió tras tratamiento local con corticoides, posiblemente relacionado con el tratamiento. Por último, a un paciente se le diagnosticaron múltiples embolias pulmonares pequeñas, clínicamente silenciosas, evidentes en una exploración PET-CT dos meses después de recibir la última dosis de ipilimumab. Este paciente tenía antecedentes de metástasis pulmonar y enfermedad pulmonar obstructiva crónica en etapa temprana, y lo más probable es que el acontecimiento no estuviera relacionado ni con el ipilimumab ni con el tratamiento con vacuna.

TABLA 2

Reacciones adversas - Reacciones y acontecimientos adversos de acuerdo con CTCAE v. 4.0. Las reacciones se atribuyeron a ipilimumab o a la vacuna IDO a criterio del médico tratante.

(continuación)

Respuesta de los linfocitos T contra los epítopos de las vacunas

Se han informado anteriormente respuestas espontáneas de los linfocitos T hacia IO102 (SEQ ID NO: 3) y el epítopo HLA-A2 intercalado IDO5 (SEQ ID NO: 2, también conocido como IO101), y tanto la eficacia clínica como la inmunogenicidad de IDO5 como epítopo de vacuna se han demostrado en un estudio clínico previo de fase I en cáncer de pulmón.

El presente estudio realizó una selección inicial para la liberación de IFN-<y>en muestras de PBMC estimuladas con IO102 utilizando ELISpot directo. Todos los experimentos se realizaron por triplicado con dos concentraciones celulares diferentes (5 * 105 y 2 * 105). Las respuestas se consideraron específicas si el recuento de puntos era al menos dos veces superior al fondo y al menos 50 puntos más que el control negativo correspondiente (péptido del VIH). Como se ve en la figura 2a, ninguno de los pacientes tuvo respuestas detectables antes del tratamiento hacia IO102. Sin embargo, tres de los pacientes generaron respuestas que excedieron el umbral empírico de 50 puntos por encima del control negativo durante la terapia, lo cual, hasta cierto punto, parecía aumentar con vacunaciones repetidas.

Ni la presencia o ausencia de una respuesta a la vacuna ni la magnitud de las respuestas parecieron correlacionarse con el efecto clínico del tratamiento o el tipo/grado de toxicidad. Para determinar si las respuestas específicas de IDO fueron inducidas por la vacuna o más bien como un fenómeno general que ocurre durante el tratamiento con ipilimumab, se midió la reactividad de IDO en PBMC de pacientes con melanoma tratados con ipilimumab sin vacuna (véanse los métodos). Se evaluó la reactividad antes del tratamiento y después de tres series. Como se observa en la figura 2b, no se observó inducción de células específicas de IDO durante el tratamiento con ipilimumab sin vacuna IDO. Por tanto, las respuestas a IDO observadas fueron inducidas por la vacuna. Para seguir examinando los linfocitos T específicos de la vacuna inducidas, se evaluó la producción de citocinas en muestras de PBMC estimuladas con IO102, tanto directamenteex-vivocomo después de cuatro semanas de estimulaciónin vitrocon el péptido IO102, mediante tinción de citocinas intracelulares y citometría de flujo. Esto se intentó en tres pacientes, que fueron seleccionados en función de los resultados de los análisis de ELISpot.

Como se observa en la figura 2c, se demostró el enriquecimiento de linfocitos T positivas para citocinas, principalmente CD4+, tras la estimulación con IO102. Estas células producían predominantemente TNF-a y pocas células secretaban también IFN-<y>. Asimismo, se realizó una purificación de linfocitos T reactivos a IDO basada en la captura extracelular de TNF-a seguida de una expansión inespecífica (véanse los métodos). Los resultados de la tinción de citocinas intracelulares después de este enriquecimiento se presentan en la figura 2d. Como se ve, los linfocitos T CD4+ reactivos a IDO todavía estaban presentes en los tres pacientes. De manera adicional, se observó enriquecimiento de linfocitos T CD8+ reactivos a IDO en los pacientes n.° 07 y n.° 02, aunque sólo unos pocos linfocitos T CD8+ estaban presentes en el cultivo del paciente n.° 02. Ninguno de los subconjuntos mostró una producción significativa de IL2 (datos no mostrados).

Dinámica de las células reguladoras durante el tratamiento

IDO es un mediador importante de la supresión inmunitaria y puede tener un impacto importante en la dinámica de las células inmunitarias reguladoras. En ratones, se ha demostrado que la expresión de IDO y los metabolitos producidos por la degradación del triptófano catalizada por IDO inducen la generación de Treg. De manera adicional, IDO puede expresarse en MDSC (células supresoras procedentes de mieloides) y, por lo tanto, representa uno de varios mecanismos efectores para este tipo de célula. Los niveles de Treg y MDSC en sangre periférica se midieron antes, durante y después de la terapia.

Los Treg se definieron como CD3+CD4+CD25highCD127-FOXP3+.

Las MDSC se definieron como PBMC negativas para los marcadores de estirpe CD3, CD19 y CD56 y además HLADR-/lowCD14+CD11b+CD33+CD124-.

La estrategia de activación se presenta en las figuras 3a+b. Los resultados se presentan en la figura 3c a f.

Como se ve, se observó un aumento de la frecuencia de linfocitos Treg después de cuatro (dos series de ipilimumab y cuatro vacunas) y ocho semanas (tres series de ipilimumab y cinco vacunas). Después de completar todo el curso de tratamiento en la semana 12, el nivel seguía siendo elevado en comparación con el valor inicial, pero mucho menos pronunciado. El cambio sólo fue significativo en la semana ocho (p = 0,008). De manera adicional, Se examinaron los Treg para determinar la expresión del marcador de superficie CD39 y el factor de transcripción Helios, que puede distinguir los Treg naturales activados/no activados y los indiferenciados de los procedentes del conjunto de linfocitos T efectores. No se observaron cambios coherentes en ninguno de estos subconjuntos de Treg (datos no mostrados). No se observaron cambios en la proporción de linfocitos positivos para CD3 y solo se observaron cambios menores en la frecuencia de linfocitos T c D4+ (figura 3e+f).

Con respecto a las MDSC, se observó una sorprendente imagen especular de los niveles de Treg, es decir, niveles reducidos en comparación con el valor inicial. Sin embargo, el cambio no alcanzó significación en ninguno de los puntos temporales evaluados (desde el inicio hasta la semana ocho,p= 0,13). No se encontró una correlación convincente entre el nivel y el cambio en Treg frente a MDSC (datos no mostrados).

Eficacia clínica

De los 12 pacientes incluidos, 10 recibieron tratamiento como parte del protocolo y todos recibieron al menos cinco vacunas, según protocolo especificado para pacientes evaluables. Con este fin, siete de los diez pacientes seguían vivos 10 meses después de finalizar el tratamiento.

Los resultados se presentan en la figura 4. En la primera evaluación, un paciente (n.° 03) tuvo una remisión parcial (RP), con una reducción del 44 % del diámetro de la lesión diana (LD) y cuatro pacientes estaban dentro de los límites de enfermedad estable (EE). Cinco pacientes progresaron y fueron remitidos a otros tratamientos. Aparte de estos, dos pacientes (n.° 02 y n.° 13) se diagnosticaron con metástasis cerebral después de recibir la tercera serie de ipilimumab y uno poco después de completar la cuarta serie de ipilimumab y la séptima vacuna. Como no se realizaron imágenes cerebrales de forma rutinaria al inicio del estudio en pacientes asintomáticos, no está claro si los pacientes n.° 02 y n.° 07 desarrollaron metástasis cerebrales durante la terapia o si las lesiones eran preexistentes. Sin embargo, en el caso del paciente n.° 13, una resonancia magnética realizada inmediatamente antes de la inclusión no había dado indicios de metástasis en el sistema nervioso central.

De los cuatro pacientes con EE en la primera evaluación, uno (n.° 01) progresó inequívocamente en la segunda evaluación después de ocho semanas con un aumento del 100 % en la suma del diámetro de la LD. Un paciente (n.° 10) murió seis semanas después de recibir su último tratamiento (véase la sección de toxicidad). Dos pacientes habían continuado con EE. Aparte de estos, uno fue tratado entre exploraciones de evaluación por una metástasis pulmonar con radiación de argón, y no es posible determinar qué tratamiento fue el más responsable de la estabilización de la enfermedad. El paciente n.° 03, que tenía una RP inicial (no confirmada), tuvo una ligera disminución adicional en el diámetro de la LD del -57 % en comparación con el valor inicial, pero lamentablemente la PET-CT reveló nuevas lesiones en el hígado y el tejido subcutáneo, haciendo que su mejor respuesta se EE. Actualmente, dos pacientes tienen EE en curso y están a la espera de una evaluación adicional.

Resumiendo, la tasa de respuesta objetiva general, es decir, la respuesta completa respuesta parcial (RC RP) fue del 0 %, ya que ninguno de los pacientes tuvo respuestas confirmadas mejores que<e>E. Por tanto, cinco pacientes (50 %) estaban en EE en la primera evaluación, de los cuales dos se confirmaron y dos progresaron en la 2.a evaluación, y uno falleció entre la 1.a y la 2.a evaluación.

Análisis

Se ha demostrado que ipilimumab, dirigido a la molécula inmunoinhibidora CTLA-4, prolonga la supervivencia general en pacientes con melanoma metastásico. Este tratamiento puede inducir respuestas duraderas con reducciones considerables de la carga tumoral y, en algunos pacientes, incluso respuestas completas. A pesar de este optimismo, todavía es una pequeña fracción de pacientes los que realmente responden a la terapia, dejando mucho margen de mejora. En un intento de lograr esto, numerosos ensayos se han centrado en la terapia combinada, como medio para alcanzar más de una diana a la vez. Varios ensayos han probado la combinación de ipilimumab con otras intervenciones y, hasta ahora, los datos más prometedores han sido sobre la combinación con el anticuerpo dirigido a PD-1 nivolumab. Sin embargo, no se ha intentado ninguna combinación con una vacuna contra IDOl antes del estudio que se presenta en el presente documento.

El tratamiento con la combinación se asoció con toxicidad leve a moderada en la mayoría de los pacientes, pero en general fue seguro y bien tolerado. La mayoría de los pacientes experimentaron algún grado de reacción local en el lugar de la administración de la vacuna, incluido eritema, edema y bultos no dolorosos en el tejido subcutáneo. Esto último es un efecto secundario común y transitorio de las vacunas peptídicas que contienen el adyuvante oleoso Montanide, que también se utilizó en este ensayo.

Varios de los pacientes experimentaron reacciones comúnmente asociadas con el tratamiento con ipilimumab, incluida la diarrea y la erupción maculopapular. Un paciente fue diagnosticado con coroiditis monocular 10 semanas después del último tratamiento, que se ha informado anteriormente como un efecto secundario poco frecuente del ipilimumab. Es difícil demostrar si esto estuvo relacionado con el tratamiento o no, dada la disociación temporal del tratamiento y los síntomas.

Un paciente desarrolló colitis asociada a ipilimumab durante el tratamiento, que inicialmente se trató con prednisolona parenteral en dosis elevadas durante la hospitalización en el centro. Debido a circunstancias desafortunadas, este paciente ingresó posteriormente en un hospital local sin experiencia en el tratamiento de este tipo de pacientes, falleciendo una semana después del ingreso. Al ingresar, la química clínica y la presentación indicaron colitis acelerada y posible sepsis. Simultáneamente con la aparición de la colitis, se demostró un aumento notable en el nivel de citocinas IL17A e IL6 en muestras de suero de este paciente. Es importante destacar que ambas citocinas pueden desempeñar un papel en la colitis autoinmunitaria. No se demostró un aumento similar en ninguno de los otros pacientes tratados, lo que indica que el aumento del nivel de citocinas probablemente medió la colitis o representó una respuesta posterior a la inflamación intestinal. Como IDO se expresa altamente en el tubo digestivo, en teoría, es posible que la vacuna pueda causar o aumentar la diarrea o la colitis provocadas por ipilimumab. No se observó asociación entre la presencia o magnitud de linfocitos T reactivos a IDO inducidos por la vacuna y la aparición de toxicidad. Sin embargo, en un ensayo anterior realizado en el mismo centro, una vacuna con un epítopo mínimo dirigida a la IDO en el cáncer de pulmón se asoció con diarrea de grado I/II en el 27 % de los pacientes. Por lo demás, las reacciones adversas fueron generalmente manejables.

A todos los pacientes participantes se les realizaron pruebas para determinar las respuestas contra el péptido IO102 usando ELISpot con iFN-y, y se encontraron respuestas inducidas por la vacuna que excedieron el umbral empírico en tres de los diez pacientes tratados. Lo más probable es que las respuestas en estos pacientes fueran inducidas por la vacuna, ya que ninguno de los pacientes emparejados por edad y estadio de la enfermedad que recibieron ipilimumab sin vacuna presentó signos de reactividad a IDO durante el tratamiento. Ninguno de los pacientes tuvo respuestas detectables al inicio del estudio. Las pruebas de reactividad a IDO se llevaron a cabo directamenteex vivo,para obtener una especificidad elevada del ensayo. Sin embargo, esta disposición es un compromiso de sensibilidad, y ciertamente es posible que un enfoque indirecto pudiera haber demostrado más respuestas inmunitarias.

Se llevó a cabo un refuerzoin vitrode la respuesta a IDO en pacientes que demostraron respuesta en la evaluación inicial para caracterizar aún más los linfocitos T reactivos. Esto reveló que las células reactivas eran predominantemente linfocitos T CD4+ productores de TNF-a, pero después del enriquecimiento y la rápida expansión, se pudieron detectar linfocitos T citotóxicos reactivos a IDO. Los linfocitos T reactivos a IDO no se demostraron directamenteex-vivomediante tinción de citocinas intracelulares. Se han publicado datos contradictorios sobre el beneficio de los linfocitos T CD4+ específicos de tumores. Las pruebas sustanciales de la función de los linfocitos T auxiliares en la inmunidad tumoral indican que el beneficio depende del subtipo de célula predominante y, como consecuencia, del entorno de citocinas creado en el tumor. En investigaciones preclínicas, tanto los linfocitos Th1 como los Th2 pueden ejercer actividad antitumoral directamente o mediante un efecto quimiotáctico y de apoyo en otras células, mientras que Th17 y Treg pueden tener un impacto negativo dependiendo del tipo de tumor. En un estudio de vacunación que utilizó un péptido largo procedente de la telomerasa, se demostraron respuestas de linfocitos T CD4 con aparente potencial citotóxico y signos de eficacia clínica.

Los análisis de este estudio revelaron que los linfocitos T CD4+ reactivos a IDO expandidos producían predominantemente TNF-a, una pequeña fracción de IFN-<y>, mientras que los linfocitos T<c>D8+ reactivos fueron predominantemente doble positivos. Esto sugeriría un fenotipo inflamatorio de ambos subconjuntos de células y, en el caso de los linfocitos T auxiliares, un estado de agotamiento posiblemente inducido por el extenso cultivoex-vivode las células. No se encontró una buena correlación entre la eficacia del tratamiento y la respuesta a la vacuna, ya que los tres pacientes experimentaron progresión de la enfermedad. En un ensayo previo de vacunación IDO en cáncer de pulmón, se encontró una correlación significativa entre las respuestas IDO preexistentes y la respuesta al tratamiento, pero no hubo correlación con las respuestas inducidas por la vacuna, lo que en teoría podría deberse a la migración de los linfocitos T reactivos al tumor al sitio del tumor tras la vacunación. Varios otros ensayos han tratado de correlacionar las respuestas clínicas e inmunitarias, arrojando resultados contradictorios, a menudo precipitados por un número bajo de pacientes que responden al tratamiento en los ensayos de vacunación.

Como se ha mencionado anteriormente, la IDO se expresa en varios tejidos diferentes, incluidos algunos subtipos de MDSC, y es posible que el tratamiento dirigido contra la IDO pueda afectar la frecuencia de las MDSC. De manera adicional, se ha demostrado que la frecuencia de las MDSC se reduce con el tratamiento con ipilimumab. De acuerdo con esto, durante el tratamiento se encontraron frecuencias decrecientes de MDSC monocíticas. Curiosamente, esto se reflejó en un mayor nivel de Treg, lo que podría representar un mecanismo contrarregulador que previene la autoinmunidad, aunque no se encontró proporcionalidad entre niveles/cambios en MDSC frente a Treg. Anteriormente se informó en varias publicaciones que ipilimumab puede aumentar la frecuencia de T reg en sangre periférica, aunque otros informes han demostrado lo contrario.

Se observaron niveles reducidos de Treg y ningún cambio en MDSC en pacientes tratados con ipilimumab sin la vacuna utilizando la misma selección y grupo de marcadores que se utilizó en este estudio (datos no mostrados). Suponiendo que los cambios inversos en Treg y MDSC no se deben a una variación biológica aleatoria, esto podría indicar un efecto específico de la vacuna, posiblemente dirigido a células que expresan IDO, por ejemplo, MDSC.

A los 10 meses de finalizar el tratamiento, siete de los diez pacientes siguen vivos y dos pacientes todavía se encuentran estables. Debido al tamaño modesto de la muestra del ensayo actual, se esperaría que el número de pacientes que respondieron, independientemente de la vacuna, pudiera desviarse sustancialmente de los grandes estudios clínicos con ipilimumab como tratamiento único, únicamente debido a la variación biológica. Recientemente se demostró que la respuesta al ipilimumab está estrechamente relacionada con el número de mutaciones no sinónimas que dan lugar a neoepítopos, que estaban presentes en aproximadamente la mitad de las muestras de pacientes analizadas, lo que deja una posibilidad significativa de una distribución desigual de este y otros factores pronósticos en ensayos pequeños. En la cohorte analizada, la tasa de respuesta objetiva fue muy modesta, es decir, ninguno de los pacientes tuvo una respuesta objetiva confirmada. Un paciente tuvo una reducción muy significativa en la carga tumoral en la primera evaluación, pero a pesar de la respuesta continua sobre las lesiones diana en la segunda evaluación confirmatoria, progresó con nuevas lesiones en múltiples sitios. Probablemente, este paciente tenía un crecimiento de un clon maligno que respondía menos o no respondía al tratamiento, mientras que la heterogeneidad genética del tumor permitió que algunas de las lesiones tuvieran una respuesta continua. Cinco de los diez pacientes tratados se consideraron con posible EE en la primera evaluación, de los cuales dos se confirmaron en la segunda evaluación, uno murió y dos progresaron. La modesta tasa de respuesta también debe considerarse a la luz del número bastante elevado (tres) de pacientes que desarrollaron metástasis cerebrales clínicamente evidentes, lo que invariablemente confiere un mal pronóstico.

En conclusión, la administración de una vacuna peptídica IDO fue segura y se asoció con una toxicidad mínima en combinación con ipilimumab. La vacuna indujo respuestas de linfocitos T iDo que eran detectables directamenteex vivo.

Ejemplo 2 - Caracterización adicional de los componentes de la vacuna peptídica IDO (1)

Comparación del efecto de refuerzo de IDO5 e IO102 en la estimulación de linfocitos T inducida por el péptido del CMV

Método

El esquema general del método se resume en la tabla X.

Día 1:

- Las muestras de la capa leucoplaquetaria se descongelaron, se lavaron dos veces y resuspendieron en medio.

Se contaron las células.

- A continuación, se añadieron las células a los pocillos de las placas de cultivo celular a 5 * 106/0,5 ml en X-VIVO HS al 5 %

- Los pocillos se estimularon con el péptido del CMV durante 2 horas a temperatura ambiente. El péptido del CMV utilizado fue HCMV pp65495-504 (NLVPMVATV).

- Después de 2 horas, se añadió IDO5, IO102 o un péptido del VIH que no tenía nada que ver como control de acuerdo con la tabla X y las placas se incubaron durante 2 horas adicionales a temperatura ambiente.

- Se añadieron 1500 pl de X-VIVO/HS al 5 % a cada pocillo y se colocaron las placas en una incubadora a 37 °C.

Día 2 y 9:

- Se añadió IL2 (120 U/pl).

Día 8:

- Los pocillos se reestimularon con IDO5, IO102 o péptidos del VIH, añadidos de acuerdo con la tabla X antes de la incubación durante 2 horas a temperatura ambiente.

- Después de la reestimulación, el contenido de cada pocillo se dividió en dos y se añadieron 1,5 ml de X-VIVO HS al 5 %/pocillo.

- Las placas se colocaron en una incubadora a 37 °C.

Día 15:

- Las células se recogieron y se analizaron mediante citometría de flujo.

- El porcentaje de linfocitos T CD8 específicos de CMV en cada pocillo se identificó utilizando un anticuerpo monoclonal (AcM) CD8 así como los complejos tetrámeros HLA-A2/CMV pp65495-504.

- Como control, las células se tiñeron además con el complejo tetrámero HLA-A2/VIH-1 pol476-484 y AcM CD8 (datos no mostrados).

T l X

continuación

Resultados

Los resultados (véase la figura 5) muestran que la adición de IO102 a cultivos celulares estimulados por CMV da como resultado la inducción de una fracción mayor de linfocitos T específicos de CMV en comparación con la adición de IDO5/IO101. Por lo tanto, se demuestra que IO102 es un inductor superior de linfocitos T específicos que IDO5/IO101.

Ejemplo 3 - Caracterización adicional de los componentes de la vacuna peptídica IDO (2)

Prueba del efecto de la adición de IO102 en combinación con el inhibidor de molécula pequeña (SMI) IDO 1-metiltriptófano (1 MT) a PBMC estimuladas con péptido del CMV.

Método

El esquema general del método se resume en la tabla Y.

Día 1:

- Las muestras de la capa leucoplaquetaria se descongelaron, se lavaron dos veces y resuspendieron en medio. Se contaron las células.

- A continuación, se añadieron las células a los pocillos de las placas de cultivo celular a 5 * 106/2 ml en X-VIVO HS al 5 %

- Los pocillos se estimularon con péptidos y SMI como se muestra en la tabla Y. El péptido del CMV utilizado fue HCMV pp65495-504 (NLVPMVATV).

- Las placas se colocaron en una incubadora a 37 grados.

Día 2 y 9:

- Se añadió IL2 (100 U/pl).

Día 8:

- Se retiró 1 ml de cada pocillo y se añadió 1 ml de medio fresco.

- Se reestimularon los pocillos con péptidos y SMI de acuerdo con la tabla Y

- Las placas se colocaron en una incubadora a 37 °C.

Día 15:

- Las células se recogieron y se analizaron mediante citometría de flujo.

- El porcentaje de linfocitos T CD8 específicos de CMV en cada pocillo se identificó utilizando un anticuerpo monoclonal (AcM) CD8 así como los complejos tetrámeros HLA-A2/CMV pp65495-504.

- Como control, las células se tiñeron además con el complejo tetrámero HLA-A2/VIH-1 pol476-484 y AcM CD8 (datos no mostrados).

T l Y

Resultados

Los resultados (véase la figura 6) muestran que potenciar la estimulación de linfocitos T específicos de CMV con IO102 en combinación con el inhibidor de molécula pequeña IDO 1MT es más potente que 1MT solo. Por lo tanto, el tratamiento simultáneo de IDO con IO102 y SMI es más eficaz que el tratamiento único con inhibidores de IDO, tal como 1MT. IO102 mejora el refuerzo inducido por IDO SMI de linfocitos T específicos

Ejemplo 4 - Caracterización adicional de los componentes de la vacuna peptídica IDO (3)

La adición de IO102, pero no de un péptido que contenga los mismos aminoácidos que IO102 en secuencia desordenada, mejoró la destrucción alogénica de la estirpe celular de leucemia monocítica aguda THP-1 por parte de PBMC.

Método

El esquema general del método se resume en la tabla Z4.

Las capas leucoplaquetarias se descongelaron (día 0), se lavaron dos veces y resuspendieron en medio, se contaron y sembraron en pocillos como se establece en la tabla Z4. Las células THP-1 se irradiaron con 30 Gy y se lavaron dos veces en medio. Las células THP-1 se contaron y se añadieron a pocillos que contenían PBMC como se establece en la tabla Z4 (volumen total 2 ml). Las placas se colocaron en una incubadora a 37 grados. Se añadieron péptidos y citocinas en los intervalos y concentraciones que se muestran en la tabla Z5. Los días 7 y 14, se eliminó 1 ml de sobrenadante/pocillo. Se prepararon células THP-1 recién irradiadas y se contaron como se indicó anteriormente y se añadió 1 ml a los pocillos como se muestra en la tabla Z4. Las células se recogieron y analizaron para determinar su actividad citotóxica el día 17. Se utilizó un ensayo de liberación de<51>Cr convencional para medir el potencial citotóxico de las PBMC tratadas con péptido. Se utilizaron células THP-1 marcadas con<51>Cr como células diana y PBMC tratadas con péptidos como células efectoras. Se utilizaron pocillos tratados con Triton-X como lisis máxima medible y medio solo como lisis mínima.

% de lisis específica = ((cpm<muestra>- cpm<mínimo>)/(cpm<máximo>- cpiTI<mínimo>)) x 100 %

T l Z4

Resultados

La adición de IO102 a un cultivo de PMBC y células cancerosas THP-1 mejoró la destrucción alogénica de las células THP-1. La citotoxicidad potenciada es específica para el péptido IO102, ya que un péptido que contiene los mismos aminoácidos que IO102 pero en una secuencia desordenada (CILDSKLEVEALAQLLTFALK (SEQ ID NO: 15), figura 7, barras negras) indujo menos lisis de células THP-1 en un intervalo de diferentes proporciones efector diana (E/D) en comparación con IO102 (Figura 7, barras grises).

Ejemplo 5 - Caracterización adicional de los componentes de la vacuna peptídica IDO (4)

IO102 induce una mejor citotoxicidad mediada por PBMC de las células THP-1 en comparación con un péptido que contiene los mismos aminoácidos que IO102 en secuencia desordenada (control, IDO desordenada). Además, IO102 produce una mejor destrucción de las células THP-1 a bajas proporciones efector-diana (E/D) en comparación con IDO5.

Método

El esquema general del método se resume en la tabla Z5.

Las capas leucoplaquetarias se descongelaron (día 0), se lavaron dos veces y resuspendieron en medio, se contaron y sembraron en pocilios como se establece en la tabla Z5. Las células THP-1 se irradiaron con 30 Gy y se lavaron dos veces en medio. Las células THP-1 se contaron y se añadieron a pocillos que contenían PBMC como se establece en la tabla Z5 (volumen total 2 ml). Las placas se colocaron en una incubadora a 37 grados. Se añadieron péptidos y citocinas en los intervalos y concentraciones que se muestran en la tabla Z5. El día 7, se eliminó 1 ml de sobrenadante/pocillo. Se prepararon células THP-1 recién irradiadas y se contaron como se indicó anteriormente y se añadió 1 ml a los pocillos como se muestra en la tabla Z5. Las células se recogieron y se analizaron para determinar su actividad citotóxica el día 23. Se utilizó un ensayo de liberación de<51>Cr convencional para medir el potencial citotóxico de las PBMC tratadas con péptido. Se utilizaron células THP-1 marcadas con<51>Cr como células diana y PBMC tratadas con péptidos como células efectoras. Se utilizaron pocillos tratados con Triton-X como lisis máxima medible y medio solo como lisis mínima.

% de lisis específica = ((cpm<muestra>- cpm<mínimo>)/(cpm<máximo>- cp<iTImínimo>)) x 100 %

T l Z

Resultados

La adición de IO102 (Figura 8, barras de color gris oscuro) a un cultivo de PMBC y células cancerosas THP-1 mejoró la destrucción alogénica de las células THP-1 en comparación con el péptido de control, IDO desordenada (Figura 8, barras negras) en todas las proporciones E/D probadas (2:1 a 60:1). Además, la adición de IO102 al cultivo de PBMC induce una lisis más eficaz de las células THP-1 en comparación con la adición del péptido IDO5 (Figura 8, barras de color gris claro), con proporciones E/D bajas. Esto indicó que los linfocitos T específicos de IO102 apoyan de manera más eficaz una respuesta alogénica de linfocitos T contra el cáncer.

Ejemplo 6 - Caracterización de la vacuna peptídica IDO en combinación con un inhibidor del punto de control adicional

IO102+anti-PD1 induce una mejor citotoxicidad mediada por PBMC de las células THP-1 en comparación con el péptido de control+anti-PD-1.

El esquema general del método se resume en la tabla Z6.

Las capas leucoplaquetarias se descongelaron (día 0), se lavaron dos veces y resuspendieron en medio, se contaron y sembraron en pocillos como se establece en la tabla Z6. Las células THP-1 se irradiaron con 30 Gy y se lavaron dos veces en medio. Las células THP-1 se contaron y se añadieron a pocillos que contenían PBMC como se establece en la tabla Z5 (volumen total 2 ml). Las placas se colocaron en una incubadora a 37 grados. Se añadieron péptidos, el anticuerpo (pembrolizumab, Merck) y citocinas en los intervalos y concentraciones que se muestran en la tabla Z6. El día 7, se eliminó 1 ml de sobrenadante/pocillo. Se prepararon células THP-1 recién irradiadas y se contaron como se indicó anteriormente y se añadió 1 ml a los pocillos como se muestra en la tabla Z6. Las células se recogieron y analizaron para determinar su actividad citotóxica el día 23. Se utilizó un ensayo de liberación de<51>Cr convencional para medir el potencial citotóxico de las PBMC tratadas con péptido. Se utilizaron células THP-1 marcadas con<51>Cr como células diana y PBMC tratadas con péptidos como células efectoras. Se utilizaron pocillos tratados con Triton-X como lisis máxima medible y medio solo como lisis mínima.

% de lisis específica = ((cpm<muestra>- cpm<mínimo>)/(cpm<máximo>- cpm<mínimo>)) x 100 %

Tabla Z6

Resultados

La adición de una combinación de IO102 y anticuerpo anti-PD-1 a un cultivo de PMBC mejoró la destrucción alogénica de las células diana THP-1, en comparación con la lisis mediante PBMC cultivadas con una combinación de péptido de control IDO desordenada y anticuerpo anti-PD-1 (Figura 9) en todas las proporciones E/D (0,7:1 a 20:1).

Ejemplo 7 - Prueba de un modelo de ratón para vacunas peptídicas IDO

Se trataron ratones C57BL/6 que portaban el tumor TC-1 con péptido E7 específico de TC-1 (RAHYNIVTF; SEQ ID NO: 35) o IDO-Pep1 (MTYENMDIL; SEQ ID NO: 33) y se evaluó la eficacia de las vacunas peptídicas mediante la carga tumoral y la supervivencia. La secuencia peptídica IDO de ratón (IDO-Pep1) se seleccionó para proporcionar un análogo murino para los péptidos IDO humanos probados en los ejemplos anteriores, porque la secuencia de la IDOI murina difiere de la de la IDO1 humana.

Método

A ratones C57BL/6 de 4 a 6 semanas de edad se les inyectaron 70.000 células/ratón de células TC-1. El tratamiento en los grupos respectivos se inició cuando el tumor alcanzó un tamaño promedio de aproximadamente 0,075 cm3 (aproximadamente 10 días después de la inoculación del tumor). Los péptidos utilizados para la vacunación incluyeron el péptido E7 específico de TC1 (RAHYNIVTF; SEQ ID NO: 35) e IDO-Pep1 (MTYENMDIL; SEQ ID NO: 33). El péptido IDO de ratón se diseñó basándose en el algoritmo de unión del MHC de clase I y II. Los ratones se vacunaron por vía subcutánea con los péptidos respectivos en una dosis de 100 pg/ratón administrados en combinación con un epítopo de unión a Pan-HLADR (PADRE; aK-Cha-VAAWTLKAAa, 20 pg/ratón) y QuilA (10 pg/ratón). Se vacunaron a los ratones dos o tres veces con un intervalo de una semana y se evaluó la eficacia de las vacunas peptídicas mediante la medición del volumen del tumor y/o la supervivencia general.

Resultados

La vacunación con el péptido IDO de ratón demostró un efecto protector antitumoral en el modelo de tumor TC-1, proporcionando una mayor protección que cuando se vacuna con antígeno peptídico específico del tumor, el péptido E7. Véase la figura 10.

Ejemplo 8 - Prueba de la vacuna peptídica IDO en un modelo de ratón en combinación con una vacuna de antígeno tumoral

Se trataron ratones C57BL/6 que portaban el tumor TC-1 con péptido E7 específico de TC-1 (RAHYNIVTF; SEQ ID NO: 35) o IDO-Pep1 (MTYENMDIL; SEQ ID NO: 33) o una combinación de E7 e IDO-Pep1. La eficacia de las vacunas se evaluó mediante la supervivencia global. El método fue el mismo que para el ejemplo 7, excepto por la inclusión de la combinación de péptidos.

Resultados

La vacunación de ratones con el péptido E7 tiene eficacia terapéutica en el modelo TC-1, como se esperaba (y se muestra en la figura 10). Sin embargo, cuando el péptido E7 se administró junto con IDO-Pep1 proporciona una protección aún mayor que el E7 o el péptido IDO solos. Véase la figura 11.

Ejemplo 9 - Prueba de la vacuna peptídica IDO en un modelo de ratón en combinación con un inhibidor del punto de control adicional

Se trataron ratones C57BL/6 que portaban el tumor TC-1 con IDO-Pep1 (MTYENMDIL; SEQ ID NO: 33) solo, 1-metiltriptófano (1-MT) solo o una combinación de IDO-Pep1 y 1-MT. La eficacia de las vacunas se evaluó mediante la supervivencia global.

Método

A ratones C57BL/6 de 4 a 6 semanas de edad se les inyectaron 70.000 células/ratón de células TC-1. El tratamiento en los grupos respectivos se inició cuando el tumor alcanzó un tamaño promedio de aproximadamente 0,075 cm3 (aproximadamente 10 días después de la inoculación del tumor). Para el epítopo IDO de ratón de vacunación, se utilizó IDO-Pep1. Se vacunaron a los ratones por vía subcutánea con IDO Pep-1 a una dosis de 100 pg/ratón en combinación con un epítopo de unión a Pan-HLADR (PADRE; aK-Cha-vAAWTLKAAa, 20 pg/ratón) y QuilA (10 pg/ratón). Se vacunaron a los ratones dos o tres veces con un intervalo de una semana y se evaluó la eficacia de las vacunas peptídicas mediante la medición del volumen del tumor y/o la supervivencia. Un grupo de ratones se trató con 1-metiltriptófano (1-MT) administrado en agua potable (2 mg/ml) durante la duración del estudio, y un grupo adicional de ratones se trató tanto con IDO-Pep1 como con 1-MT.

Resultados

Se logra una eficacia terapéutica modesta cuando se tratan ratones que portan TC-1 con a-MT oral. La eficacia mejoró cuando a estos ratones se les coadministró IDO Pep-1, como lo demuestra la supervivencia prolongada. Véase la figura 12.

Ejemplo 10 - Prueba de un modelo de ratón alternativo para vacunas peptídicas IDO

Se vacunaron profilácticamente ratones BALB/c con un péptido IDO de ratón IDO-EP2 (LPTLSTDGL; SEQ ID NO: 34) y se expusieron a tumores CT26 7 días después. La eficacia de la vacuna peptídica se evaluó mediante la carga tumoral. La secuencia peptídica IDO de ratón (IDO-EP2) se seleccionó para proporcionar un análogo murino para los péptidos IDO humanos probados en los ejemplos anteriores, porque la secuencia de la IDOl murina difiere de la de la IDOl humana.

Método

Se inmunizaron ratones BALB/c de 6 a 10 semanas de edad mediante inyección subcutánea en la base de la cola con 100 pg de péptido IDO-EP2 30 pg de CpG en 100 pl de adyuvante Montanide [Montanide ISA 51 VG (Seppic)] preparado como una emulsión 1:1. Se utilizó Montanide solo (Vehículo) como control. Algunos ratones no se trataron como control adicional. Las inmunizaciones se llevaron a cabo 7 días antes de la exposición al tumor. Para el injerto de células tumorales CT26, cada ratón recibió dos inyecciones subcutáneas (una en cada flanco) de 1 * 105 CT26 en 100 pl de DMEM libre de suero. Las mediciones con calibrador de la longitud y el ancho del tumor se registraron cada 3 a 4 días a partir del día 6. El volumen del tumor se calculó con la fórmula 0,52(L * W2). Se sacrificaron los ratones cuando el volumen tumoral combinado alcanzó el criterio de valoración definido de aproximadamente 2.000 mm3.

Resultados

La vacunación profiláctica con péptido IDO de ratón demostró un efecto protector antitumoral en el modelo de tumor CT26. Véase la figura 13.

Ejemplo 11 - Ensayo clínico de la vacuna peptídica PD-L1/IDO combinada con el anticuerpo anti-PD1

El objetivo principal es evaluar la tolerabilidad y seguridad de una vacuna peptídica que contiene los péptidos IDO largos (DTLLKALLEIASCLEKALQVF; SEQ ID NO: 3) y PD-L1 largo 1 (FMTYWHLLNAFTVTVPKDL; SEQ ID NO: 32) con Montanide ISA 51 como adyuvante, cuando se administra a pacientes con melanoma maligno metastásico (MM) en combinación con el anticuerpo bloqueador del punto del punto control inmunitario nivolumab (específico para PD1 humano). El criterio de valoración son los acontecimientos adversos (AA) evaluados por CTCAE 4.0.

El objetivo secundario es evaluar la respuesta inmunitaria antes, durante o después del tratamiento. Se tomarán muestras de sangre antes del tratamiento y posteriormente cada tres meses hasta 5 años. La reactividad inmunitaria específica de antígeno se probará mediante el uso de un grupo de ensayos inmunológicos oportunos que incluyen ELISPOT, ensayos de proliferación, ensayos de citotoxicidad, tinción intracelular (TIC) y tinción multimérica de linfocitos T CD8 específicos de PD-L1 e IDO. Se harán esfuerzos para tomar biopsias de las lesiones tumorales disponibles o de los ganglios linfáticos afectados antes de la primera vacuna y después de la sexta vacuna. El objetivo es evaluar el microambiente inmunitario tumoral de cada paciente. Se llevará a cabo inmunohistoquímica, cuantificación de la expresión génica en diferentes genes inmunitarios y secuenciación completa del exoma para evaluar el estado mutacional inicial.

El objetivo terciario es evaluar la eficacia clínica del tratamiento. Los criterios de valoración serán la respuesta objetiva (RO), la supervivencia exenta de progresión (SEP) y la supervivencia global (SG).

El estudio está diseñado como un ensayo abierto de fase I/II. En la fase I, se tratarán 6 pacientes con MM. Antes de que pueda comenzar la fase II, los 6 pacientes deben recibir los primeros 4 tratamientos sin ningún acontecimiento adverso de grado 3-4, distintos de los esperados con nivolumab.

Si 3 o más pacientes experimentan AA de grado 3-4 en la fase I asociados con la vacunación, el ensayo se detendrá. En la fase II, además se incluirán 26 pacientes.

Los pacientes incluidos en el ensayo se tratarán con nivolumab de acuerdo con el régimen convencional, que por el momento implica infusiones intravenosas ambulatorias de 3 mg/kg cada dos semanas, siempre que haya un efecto clínico. La vacuna PD-L1/IDO se administra desde el inicio de nivolumab y cada dos semanas durante las primeras 6 vacunas y posteriormente cada cuatro semanas hasta las 47 semanas. En total se administrarán 15 vacunas. Al final de la vacunación, los pacientes que no estén excluidos del protocolo debido a la progresión continuarán el tratamiento con nivolumab de acuerdo con las pautas habituales.

SECUENCIAS DE PROTEÍNAS DE LONGITUD COMPLETA

SEQ ID NO: 1 (IDO1)

SEQ ID NO: 14 (PD-L1)

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunoterapéutica para usar en un método para la prevención o el tratamiento del cáncer en un sujeto, comprendiendo el método administrar a dicho sujeto:

(i) dicha composición inmunoterapéutica, que comprende el péptido de secuencia DTLLKALLEIASCLEKALQVF (SEQ ID NO: 3) y el péptido de secuencia FMTYWHLLNAFTVTVPKDL (SEQ ID NO: 32); y

(ii) un agente inmunomodulador que es un anticuerpo inhibidor que se une a PD1.

2. La composición inmunoterapéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-PD1 es pembrolizumab o nivolumab.

3. La composición inmunoterapéutica para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que incluye un adyuvante o vehículo, opcionalmente en donde dicho adyuvante se selecciona de un adyuvante de ADN bacteriano, un adyuvante de aceite/tensioactivo, un adyuvante de ARNbc vírico, una imidazoquinolina y GM-CSF.

4. La composición inmunoterapéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho adyuvante es un adyuvante Montanide ISA, opcionalmente seleccionado de Montanide ISA 51 o Montanide ISA 720.