KR20080042097A - 수포에 담긴 불완전 리보솜 생성물（ＤＲｒｉｂｂｌｅ） 및면역 반응을 자극하기 위해 이를 이용하는 방법 - Google Patents

수포에 담긴 불완전 리보솜 생성물（ＤＲｒｉｂｂｌｅ） 및면역 반응을 자극하기 위해 이를 이용하는 방법 Download PDF

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Abstract

세포를 프로테아솜 억제제, 및 일부 실시예에서 자가포식 유도제와 접촉시키고, 그에 의해 처리된 세포를 생성하는 것에 의해 수포에 담긴 불완전 리보솜 생성물(DRiP)(DRibble)을 생성하는 방법이 개시된다. DRibble은 항원 제시 세포(APC)를 적재하고, 그에 의해, 상기 APC가 상기 DRiP 및 그의 항원성 단편을 제시할 수 있게 하기 위해 이용될 수 있다. 처리된 세포, 분리된 DRibble, 또는 DRibble-적재된 APC를 포함하는 면역원성 조성물이 개시된다. 또한, 예를 들면, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위해 처리된 세포, 분리된 DRibble, 또는 DRibble-적재된 APC를 이용하는 방법이 제공된다. 예를 들면, 종양 세포로부터 수득된 DRibble이 개체에 있는 종양 세포와 동일한 종류의 종양 세포에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 이용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 병원체-감염된 세포 또는 병원체의 하나 이상의 항원을 발현하도록 조작된 세포로부터 수득된 DRibble이 개체에서 상기 병원체에 대한 면역반응을 자극하기 위해 이용될 수 있다.
불완전 리보솜 생성물(DRiP), 항원제시세포, 자가포식 유도제, 프로테오솜 억제제.

Description

수포에 담긴 불완전 리보솜 생성물（ＤＲｒｉｂｂｌｅ） 및 면역 반응을 자극하기 위해 이를 이용하는 방법{Defective ribosomal products in blebs(DRibbles) and methods of use to stimulate an immune response}
본 출원은 참조에 의해 그 칼레티큘린가 본 명세서에 포함된 2005년 7월 29일에 출원된 출원 제60/703,675호에 기초해 우선권을 주장한다.
본 출원은 면역 반응을, 예를 들면, 수포에 담긴 불완전 리보솜 생성물(DRibble: defective ribosomal products in blebs)을 사용하는 것에 의해 자극 또는 강화하는 방법, 및 세포로부터, 예를 들면, 프로테아솜(proteasome) 억제제를 사용하는 것에 의해 DRibble을 제조하는 방법에 관한 것이다.
수지상 세포(DC)에 의한 세포용해성 T 세포(CTL)에 대한 외인성 항원의 교차-제시(cross-presentation)는 긴 폴리펩티드를 T-세포 활성화를 유발하는 특이적 리간드를 형성하는 세포 표면 분자(MHC 클래스 I)와 결합될 수 있는 짧은 단편들로 분해하기 위해, 주요한 세포 단백질분해 기구인 프로테오솜(proteosome)에 의존적이다. 이와 대조적으로, 수지상 세포에 의한 보조 T-림프구(HTL)에 대한 외인성 항원의 제시는 주로 리소솜 경로(lysosomal pathway)에 의존한다; 리소솜 내부의 단백질 분해효소가 내재화된 단백질의 소화에 기여하고 그 후 소화된 짧은 펩티드 단편들이 MHC 클래스 II 분자 상에 적재되어 자극되지 않은 원형의(naive) HTL을 활성화시킨다.
종양 세포는 끊임없이 순환하고 종양 세포를 파괴시키려고 하는 T 림프구(T 세포) 및 활성화된 세포용해성 T 세포(CTL)에 의해 인식될 수 있다(Hu, H. M., Chu, Y. & Urba, W. J. Undefined-antigens as vaccines. Cancer Treatment and Research (ed Kheif, S.) 207-226, Kluwer Academic Publishers, New York, 2005). 그러므로, 암 면역요법을 이용하여 암을 치료하는 방법이 확립된 종양(established tumor)의 퇴행(regression)을 매개하고 종양 재발을 방지하기 위해 요구되는 역치 수준(threshold level)을 초과하여 종양-관련(tumor-associated) 항원에 반응하는 치료적 T 세포를 생성하기 위해 제안되었다.
안타깝게도, 수년 동안 다수의 연구자들에 의한 상당한 노력에도 불구하고, 암 백신에 의한 특이적 활성 면역화(specific active immunization)는 동물 모델 또는 임상 시험에서 매우 효과적이지 않았다(Rosenberg et at, Nat. Med. 10:909-15, 2004). 암 면역요법의 성공에 대한 일차 장애는 백신이 먼저 대규모 증식(large expansion)을 유도하고 뒤이어 종양-반응성 CTL의 존속을 유도할 수 없다는 점이다(Rosenberg et al, Nat. Med. 10:909-15, 2004). 현재 이용가능한 종양 면역요법에 대한 또 다른 장애는 흑색종을 제외한 대부분의 암에 대해 잠재적인 종양 거부 항원이 알려져 있지 않고, 우성 종양 거부 항원(dominant tumor rejection antigen)은 종양-특이적 또는 환자-특이적일 것이라는 것이다.
근년에 유전자-변형 종양 백신(gene-modified tumor vaccine), 종양으로부터 유래된 열 충격 단백질, 종양 용해물이 적재된 수지상 세포(dendritic cell loaded with tumor lysate) 또는 종양-유래 RNA로 형질감염된 수지상 세포, 종양 세포와 수지상 세포의 융합; 및 종양 세포로부터 분비된 엑소솜(exosome)을 포함한 다양한 전략들이 개발되었으나, 종양을 가진 숙주에서 고 수준의 종양-특이적 T-세포를 유도할 수 있는 그들의 능력은 아직 입증되지 않았다. 따라서, 암 치료를 위해 신규한 면역원성(immunogenic) 접근방법이 필요하다.
요약
본 발명자는 프로테아솜(proteasome) 억제제에 의해 세포 단백질의 분해를 감소시키거나 또는 억제하는 것은 불완전 리보솜 생성물(DRiP: Defective Ribosomal Product) 및 단수명 단백질(Short Lived Protein: SLiP)(및 그들의 면역원성 단편)의 세포 축적 및 "수포(bleb)"로의 분비, 본 발명에서 DRibble(수포 내의 DRiP)로 지칭되는 구조를 초래한다는 것을 결정하였다. 본 명세서에서, 프로테아솜 억제제-유도 자가포식(autophagy) 후에 세포(예를 들면, 종양 또는 병원체에 감염된 세포)로부터 방출된 DRibble은 자가포식체(autophagy body)에서 DRiP 및 SLiP(및 그들의 단편)을 축적하고 교차초회항원자극(cross-priming)을 통해 강한 면역을 유도할 수 있다는 것이 입증된다. 개시된 DRibble은 면역요법에서 종양을 가진 숙주(또는 병원체로 감염된 숙주)에서 종양(또는 병원체)의 퇴행을 매개하거나 또는 종양(또는 병원체)의 재발을 방지하기 위해 요구되는 역치 수준(threshold level)을 초과하여 충분한 수의 종양- 또는 병원체-반응성 작동(effector)/메모 리(memory) T 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 마찬가지로, DRibble의 인 비보(in vivo) 생성(예를 들면, 프로테아솜 기능을 억제하는 작용제 및 자가포식을 유도하는 작용제의 투여에 의해)이 면역요법에서 사용될 수 있다.
예를 들면, 종양-유래 DRibble, 및 종양-유래 DRibble이 적재된 APC(예를 들면, 수지상 세포)는 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo) 모두에서, 살아있는 종양 세포 또는 죽은 종양 세포와 인큐베이션된 APC보다 더 효율적으로 종양-반응성(tumor-reactive) CTL 및 HTL을 활성화시킬 수 있다. 특정한 실시예에서, 개체에 대한 (예를 들면, 분리된 DRibble 집단, DRibble을 생성하는 세포의 집단, 또는 DRibble-적재된 수지상 세포로서)DRibble의 투여는 CD4 및 CD8 세포들의 생성을 증가시키고 하나 이상의 IL-6, IL-12, 및 TNF-α와 같은 염증성 시토킨(cytokine) 또는 케모킨(chemokine)의 생산을 촉진한다. 또한, 폐암의 동물 모델에서, DRibble가 적재된 수지상 세포(DC)는 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 생산하도록 조작된 전종양 세포 백신(whole tumor cell vaccine)에 비해 확립된 종양의 퇴행을 매개하는데 훨씬 더 효과적이라는 것이 입증되었다. 유사하게, 폐암의 동물 모델에서, 화학요법제(예를 들면, 항-OX40 항체)의 존재 시 종양-유래 DRibble은 화학요법제 단독의 경우에 비해 잘 확립된 종양의 퇴행을 매개하기에 훨씬 더 효과적인 것으로 입증되었다.
이와 같은 관찰에 근거하여, 종양-특이적 DRiP(또는 SLiP) 항원 또는 병원체-특이적 DRiP(또는 SLiP) 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법이 개시된다. 특 정한 실시예에서, 그와 같은 방법은 암 개체에서 CD4+ 및 CD8+ 종양-특이적 T 세포의 신속한 증식(expansion)을 유도하거나, 개체(예를 들면, 병원체로 감염된 개체)에서 CD4 및 CD8 병원체-특이적 T 세포의 대규모 증식(large expansion)을 유도한다.
하나 이상의 DRiP(또는 SLiP), 예를 들면, 종양-특이적 DRiP 또는 병원체-특이적 DRiP와 같은 면역원성 DRiP 또는 SLiP 단편에 대한 면역 반응을 자극하거나 또는 강화하는 방법이 제공된다. 특정한 실시예에서, 상기 방법은 세포를, 실질적으로 세포의 아포토시스(apoptosis)를 유도하지 않는 양의 프로테아솜 억제제와 상기 세포가 DRibble를 생산하기에 충분한 조건 하에서 접촉시키는 단계, 및 상기 DRiP가 항원 제시 세포(APC)에 의해 제시되어, 그에 의해 하나 이상의 DRiP(예를 들면, DRiP 항원)에 대한 면역 반응을 자극하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 세포들은 또한 자가포식을 유도하는 작용제, 예를 들면, 라파마이신, 또는 상기 세포를 아사시키는 배양 배지(예를 들면, HBSS 배지)의 다량과 접촉된다. 특정한 실시예에서, 세포는 또한 프로테아솜 억제제의 존재 하에 DRibble 생산을 강화하기에 충분한 양의 단백질의 글리코실화를 감소시키는 작용제, 예를 들면, 투니카마이신(tunicamycin)과 접촉된다.
세포들은 인 비보에서 예를 들면, 개체에게 프로테아솜 억제제를 투여하는 것에 의해 프로테아솜 억제제 및 다른 작용제와 접촉된다. 또 다른 실시예에서, 세포들은 엑스 비보(ex vivo)(예를 들면, 조직 배양)에서 프로테아솜 억제제와 접 촉되고, 결과물인 DRibble은 인 비보에서 (예를 들면, 치료량의 DRibble의 개체로의 투여에 의해) APC와 접촉되거나 또는 결과물인 처리된 세포(treated cell) 또는 그로부터 분리된 DRibble은 엑스 비보에서 APC와 접촉되고 결과물인 적재된 APC가 치료량으로 개체에게 투여된다.
특정한 실시예에서, 본 발명의 방법은 개체에게 분리된 DRibble 또는 DRibble-적재된 APC를 투여하는 단계를 포함한다. DRibble은 원하는 DRiP 및 그의 단편을 포함하는 세포로부터 수득되어, 개체에서 하나 이상의 DRiP에 대한 면역 반응을 자극한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 방법은 개체에게 프로테아솜의 활성을 억제하고(및 일부 실시예에서, 자가포식을 유도하며) 세포(처리된 세포로 지칭됨)에 의한 DRibble를 생산하기에 충분한 양의 프로테아솜 억제제(및 일부 실시예에서, 또한 자가포식을 유도하는 작용제)와 접촉된 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 개체는 종양을 가지며, 상기 DRibble은 동일한 종류의 종양 세포로부터 수득되거나, 또는 상기 처리된 세포는 동일한 종류의 세포이다. 예를 들면, 개체가 유방암을 갖는 경우, DRibble은 유방암 세포(예를 들면, 동일한 개체로부터의 유방암 세포, 또는 또 다른 개체로부터의 유방암 세포, 예를 들면, 유방암 세포주)로부터 수득되거나 또는 처리된 세포는 유방암 세포이다. 그러나, 양성 종양 세포와 같은, 비-악성(non-malignant) 종양 세포가 또한 DRibble의 원천(source)으로 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, DRibble은 병원체로 감염된 세포로부터 수득된다.
특정한 실시예에서, 처리된 세포, 분리된 DRibble, 또는 DRibble-적재된 APC는 다른 작용제, 예를 들면, 면역자극제(아주반트(adjuvant), 예를 들면, 모노포스포릴 리피드 A(MPL), CpG, 또는 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF)와 같은 시토킨), 항-종양 화학요법제(예를 들면, 탁소테르), T-세포 공동자극 분자에 대한 항체(예를 들면, 항-OX40 항체), 종양 또는 간질 세포 억제성 리간드(stromal cell inhibitory ligand)를 억제하는 작용제(예를 들면, PD-1 신호전달을 억제하는 작용제), 또는 그들의 조합과 조합되어 투여된다. 일부 실시예에서, 처리된 세포, DRibble, 또는 DRibble-적재된 APC를 투여하기 전에 개체에 림프구고갈제(lymphodepletion agent)가 투여된다.
특정한 실시예에서, 상기 방법은 개체에서 종양 세포에 대한 면역 반응을 자극하는 방법이다. 예를 들면, 상기 방법은 세포가 DRibble을 생산하기에 충분한 양으로 프로테아솜 억제제(및 일부 실시예에서, 자가포식을 유도하는 작용제)에 종양 세포를 노출시키는 단계를 포함하며, 상기 종양 세포는 상기 개체에 존재하는 종양 세포와 동일한 종류이다. 일부 실시예에서, 이 처리된 종양 세포가 개체에, 예를 들면, 전세포 종양 제제(whole-cell tumor preparation)로 투여되어, 그에 의해 하나 이상의 종양 DRiP에 대한 면역 반응을 자극한다. 다른 실시예에서, 결과물인 DRibble가 분리되고, 그에 의해 분리된 DRibble의 집단을 생산하고, 개체에게 투여되어, 그에 의해 하나 이상의 DRiP에 대한 면역 반응을 자극한다. 일부 실시예에서, 분리된 DRibble이 APC가 하나 이상의 DRiP를 제시하기에 충분한 조건하에, 개체로부터의 말초혈액 단핵세포(PBMC)로부터 수득된 APC(예를 들면, 수지상 세포) 와 함께 엑스 비보로 인큐베이션되고, 그에 의해 DRibble-적재된 APC를 생산한다. 그와 같은 실시예에서, 결과물인 DRibble-적재된 APC가 개체에게 투여되어, 그에 의해 하나 이상의 종양 DRiP에 대한 면역 반응을 자극한다.
피하(s.c.), 피내(i.d.), 정맥내(i.v.), 복막내(i.p.) 또는 근육내(i.m) 투여와 같은 임의의 적합한 투여 방법이 사용될 수 있다. 특정한 실시예에서, 처리된 세포, 분리된 DRibble, 또는 DRibble-적재된 APC를 포함하는 것들과 같은 개시된 면역원성 조성물이 180 이상의 기간과 같은 일정한 기간 동안, 3회 이상의 투여량과 같은, 2회 이상의 투여량으로 투여된다.
세포, 예를 들면, 포유동물 세포에 의해 DRibble을 생산하는 방법이 제공된다. 그와 같은 방법은 DRibble 생산을 자극하기 위해, 예를 들면, 세포에 의한 DRibble 생산을 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 특정한 실시예에서, 본 발명의 방법은 DRibble을 생산하기에 충분한 양 및 조건 하에서, 가역적 프로테아솜 억제제와 같은 프로테아솜 억제제와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 세포는 또한 상기 세포에 의한 DRibble 생산을 강화시키기에 충분한 조건 하에서, 라파마이신과 같은 자가포식을 유도하는 작용제 또는 세포를 아사시키는 배지와 접촉된다. 일부 구체예에서, 세포는 또한 상기 세포에 의한 DRibble 생산을 강화시키기에 충분한 조건 하에서, 투니카마이신과 같은 단백질의 글리코실화를 감소시키는 작용제와 접촉된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 방법은 또한 예를 들면, 전세포(whole cell) 및 큰 세포 찌꺼기로부터 상기 DRibble을 실질적으로 분리시키는 것에 의해, 결과물인 DRibble을 수집하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시 예에서, 세포에 의해 분비된 DRibble이 회수된다. 대안적으로(또는 추가적으로), 세포내 DRibble이 수집될 수 있다. 특정한 실시예에서, 수집된 DRibble은 50% 이상의 순도, 예를 들면, 90% 이상의 순도로 분리된다. DRibble은 그로부터 면역원성 DRiP를 얻고자 하는 임의의 세포로부터 생산될 수 있다. 일 실시예에서, 세포는 유방암 세포, 흑색종 세포, 신세포 암 세포(renal cell carcinoma cell) 또는 간암 세포와 같은 종양 세포이다. 또 다른 실시예에서, 세포는 바이러스, 세균, 원생동물, 균류, 또는 그들의 조합과 같은 하나 이상의 병원체로 감염된 세포이다. 일부 실시예에서, 세포는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 단백질과 같은, 하나 이상의 병원성 항원을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 형질감염된 세포이다.
특정한 실시예에서, DRibble을 생산하는 방법은 종양 세포를 세포에서 단백질 분해를 실질적으로 억제하기에 충분한 조건 하에서, 예를 들면, 4시간 이상, 6시간 이상, 24시간 이상, 또는 48시간 이상 동안 프로테아솜 억제제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, DRibble을 생산하는 방법은 종양 세포를 실질적으로 상기 세포의 자가포식을 유도하기에 충분한 조건 하에서, 예를 들면, 4시간 이상, 6시간 이상, 24시간 이상, 또는 48시간 이상 동안 자가포식을 유도하는 작용제와 접촉시키는 단계를 더 포함한다. DRibble의 분리 또는 정제를 원하는 경우, 종양 세포는 상기 세포를 침전(pellet)시키나, DRibble은 침전시키지 않기에 충분한 조건 하에서 원심분리될 수 있다(저속 원심분리). 결과물인 DRibble을 포함하는 상층액이 회수되고 상기 DRibble을 침전시키기에 충분한 조건 하에서 원심분리 된다(예를 들면, 고속 원심분리). 그 후, 예를 들면, 항원 제시 세포(APC)에 적재하거나 또는 면역원성 조성물을 생성하기 위해, 상기 DRibble을 포함하는 침전물(pellet)이 회수된다.
또한, 상기 개시된 방법을 이용하여 생산된 분리된 DRibble, 및 분리된 DRibble을 포함하는 면역원성 조성물이 본 명세서의 개시에 의해 제공된다.
면역원성 조성물을 생산하는 방법이 개시된다. 특정한 실시예에서, 상기 방법은 분리된 DRibble을 수지상 세포(DC)와 같은 APC와 접촉시켜, 그에 의해, DRibble-적재된 APC를 포함하는 면역원성 조성물을 생성하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 면역원성 조성물을 형성하기 전에 DRibble로부터 DRibble-적재된 APC를 분리하는 방법을 더 포함할 수 있다. 또한, 그와 같은 방법에 의해 생산된 면역원성 조성물이 본 명세서의 개시에 의해 제공된다.
본 발명의 개시의 전술된 목적, 특징 및 장점 및 기타 목적, 특징 및 장점은 첨부된 도면을 참조하여 기술되는 하기의 상세한 설명으로부터 보다 명확해질 것이다.
용어 및 방법의 하기의 설명은 본 명세서의 개시를 보다 명확하게 기술하고 본 명세서의 개시의 실시에서 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자를 인도하기 위해 제공된다. 단수형인 "하나의 ("a," "an," 및 "the")"는 문맥이 달리 명확하게 표시하지 않는 한, 하나 이상을 의미한다. 예를 들면, 용어 "자가포식 유도제를 포함하는(comprising an autophagy inducer)"은 하나 또는 복수 개의 자가포식 유도제를 포함하고, 구 "하나 이상의 자가포식 유도제를 포함하는(comprising at least autophagy inducers)"과 동등한 것으로 간주된다. 용어 "또는(or)"은 문맥상 명확하게 달리 표시되지 않으면, 기술된 선택적인 요소들 중 하나의 요소, 또는 둘 이상의 요소의 조합을 의미한다. 본 명세서에서 사용된, "포함한다(comprises)"는 "내포한다(includes)"를 의미한다. 따라서, "A 또는 B를 포함하는(comprising A or B)"은 추가적인 요소를 배제하지 않으면서, "A, B, 또는 A 및 B를 포함하는(including A, B, or A and B)"을 의미한다.
달리 설명되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 전문 용어 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
APC 항원 제시 세포(antigen-presenting cell)
CM 완전 배지(complete medium)
CTL 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte)
DC 수지상 세포(dendritic cell)
DRiP 불완전 리보솜 생성물(defective ribosomal product)
DRibble 수포에 담긴 DRiP(DRiP in Bleb)
ER 소포체(endoplasmic reticulum)
ERAD ER-관련 분해(ER-associated degradation)
GM-CSF 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자
(granulocyte macrophage-colony stimulating factor)
HTL 보조 T 림프구(helper T lymphocyte)
IFN-γ 인터페론 감마(interferon gamma)
MHC 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)
PBMC 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell)
PD-1 예정사-I(programmed death-1)
SLiP 단수명 단백질(short lived protein)
아주반트(Adjuvant): 본 명세서에 개시된 면역원(예를 들면, 처리된 세포, 분리된 DRibble, 또는 DRibble-적재된 APC)은 아주반트와 조합되어 사용될 수 있다. 아주반트는 면역원성 작용제와 함께 사용되는 경우, 결과적인 면역 반응을 강화하거나 또는 변화 또는 변형시키는 작용제이다. 일부 실시예에서, 아주반트는 면역원성 작용제에 의해 개체에서 유도된 항체의 역가(titer)를 증가시킨다. 또 다른 실시예에서, 항원성 작용제가 다가 항원성 작용제(multivalent antigenic agent)인 경우, 아주반트는 개체에서 유도된 항체에 의해 특이적으로 결합되는 특정한 에피토프 서열을 변화시킨다.
본 명세서에 개시된 임의의 면역원(예를 들면, 종양- 또는 병원체-감염된 세포 유래 DRibble)과 함께 사용될 수 있는 대표적인 아주반트는 프로인드 불완전 아주반트(Freund's Incomplete Adjuvant: IFA), 프로인드 완전 아주반트, B30-MDP, LA-15-PH, 몬타니드(montanide), 사포닌, 수산화알루미늄(Amphogel, Wyeth Laboratories, Madison, NJ)과 같은 알루미늄 염, 알룸(alum), 지질, 키홀 림펫 단백질(keyhole lympet protein), 헤모시아닌, 이데스틴(edestin), MF59 미세유제(microemulsion), 미코박테리아성 항원(mycobacterial antigen), 비타민 E, 비-이온성 블록 중합체(non-ionic block polymer), 무라밀 디펩티드(muramyl dipeptide), 다가음이온(polyanion), 양친매성 물질(amphipatic substance), ISCOM(면역 자극성 복합체(immune stimulating complexe), 예를 들면, 유럽 특허 EP 109942에 개시된 것), 식물성 오일, 카르보폴, 알루니늄 옥시드, 오일-유제(예를 들면, Bayol F 또는 Marcol 52), 세균성 독소(예를 들면, 탄저균 보호성 항원(B. anthracis protective antigen), 대장균 열-분해성 독소(heat-labile toxin: LT), 콜레라 독소, 파상풍 독소/변성독소(toxoid), 디프테리아 독소/변성독소, 슈도모나스 에어루기노사(P. aeruginosa) 외독소(exotoxin)/변성독소, 백일해 독소/변성독소, 및 클로스트리디움 퍼프린겐스(C. perfringens) 외독소/변성독소), 세균벽 단백질 및 기타 생성물(예를 들면, 세포벽 및 리포폴리사카라이드(LPS)) 및 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시예에서, 아주반트는 면역 활성화, 예를 들면, T-세포, B-세포, 단핵세포, 수지상 세포 및 자연 살해 세포(natural killer cell)에 의한 선천성 면역 반응 또는 후천선 면역 반응을 자극하는 DNA 모티프를 포함한다. 면역 활성화를 자극하는 DNA 모티프의 특정한, 비-한정적인 예는 미국특허 제6,194,388호; 제6,207,646호; 제6,214,806호; 제6,218,371호; 제6,239,116호; 제6,339,068호; 제6,406,705호; 및 제6,429,199호에 기재된 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 GM-CSF 또는 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21과 같은 면역조절성 시토킨(immunomodulatory cytokine)를 포함한다.
일 실시예에서, 아주반트는 ssRNA 또는 dsRNA, 예를 들면, ssRNA 단일 가닥 올리고리보뉴클레오티드(ORN)를 포함한다. 예를 들면, 아주반트는 HIV로부터 유래된 GU-풍부 RNA(예를 들면, GCCCGUCUGUUGUGUGACUC; 서열번호 1; Science 303(5663): 1526-9, 2004)를 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 합성 아주반트는 R848(TLR7/8 리간드)(3M pharmaceutical) 또는 α-갈세르(galcer)(NKT 세포 리간드)를 포함한다.
투여: 개체에게 임의의 효과적인 경로에 의해 본 명세서에 개시된 면역원성 조성물 또는 프로테아솜 억제제 조성물과 같은 작용제를 제공하거나 또는 투여하는 것을 의미한다. 대표적인 투여 경로는 경구 투여, 주사(예를 들면, 피하, 근육내, 피내, 복막내, 및 정맥내 주사), 설하(sublingual), 직장, 경피, 비강내, 질 및 흡입 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
항체: 항원을 특이적으로 결합하는(항원과 면역반응하는) 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 의미한다. 면역글로불린 분자 및 그의 면역학적 활성 부분을 포함한다. 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론, 및 뮤(mu) 불변 영역(constanct region) 유전자, 및 다수의 면역글로불린 가변 영역(variable region) 유전자를 포함한다. 경쇄(light chain)는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄(heavy chain)는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 이들은 각각 면역글로불린 클래스, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다.
항원: 포유동물로 주사 또는 흡수된 조성물을 포함한, 포유동물에서 항체의 생성 또는 T-세포 반응을 자극할 수 있는 물질을 의미한다. 항원은 이종 면역원(heterologous immunogen)에 의해 의도된 면역을 포함한, 특정한 체액성 또는 세포성 면역의 생성물과 반응한다. 용어 "항원(antigen)"은 모든 관련된 항원성 에피토프를 포함한다. 일 실시예에서, 항원은 DRiP 또는 SLiP (또는 그의 면역원성 단편), 또는 DRiP 또는 SLiP를 포함하는 DRibble이다. 표적 항원은 예를 들면, 종양 퇴행 또는 감염의 치료와 같은 치료 효과를 달성하기 위해, 목적하는 면역 반응의 대상인 항원이다.
항원 제시 세포(APC): 그 표면에 MHC 클래스 I 또는 클래스 II에 결합된 항원을 가지며 이 상황에서 상기 항원을 T 세포에 제시하는 세포를 의미한다. APC는 단핵세포, 대식세포, 수지상 세포, B 세포, 및 랑게르한스(Langerhans) 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이 세포들 중에서, 수지상 세포 및 B 세포가 특화된(professional) APC로 간주된다.
항원-특이적 T 세포: 특정한 항원을 인식하는 CD8+ 또는 CD4+ 림프구를 의미한다. 일반적으로, 항원-특이적 T 세포는 MHC 분자에 의해 제시되는 특정한 항원에 특이적으로 결합하나, 동일한 MHC에 의해 제시되는 다른 항원에는 결합하지 않는다.
자가포식(autophagy): 세포질 및 소기관(organelle)이 이중막 소포(double-membrance vesicle)인 자가포식소체(autophagosome) 내에 포식되고, 분해를 위해 리소솜과 융합되는 것인 세포 재생 경로(cellular recycling pathway)를 의미한다. 자가포식은 세포 생존 및 사망에서 역할을 수행하며 발달, 노화, 신경퇴행 및 암과 세포내 병원체에 대한 선천성 방어, 후천성 면역(예를 들면, 내생(endogenous) 항원의 MHC II 제한 항원 가공(restricted antigen processing)), 및 바이러스 복제에 관여하고 있다.
세포가 자가포식 유도제(autophagy inducer)와 접촉되는 경우 자가포식의 속도가 증가된다. 예를 들면, 세포가 예를 들면, HBSS 배지에서의 인큐베이션에 의해 영양 고갈(nutrient deprivatoin)을 겪는 경우 및 소기관 증식을 초래하는 자극을 받는 경우, 자가포식의 속도가 증가된다. 예를 들면, 세포를 연장된 기간 동안 프로테아솜 기능을 차단하는 것을 저해하는 작용제와 접촉시키면, 자가포식을 유도할 수 있다(예를 들면, 20-1000 nM 벨케이드에서 세포의 인큐베이션에 의해). 유사하게, 라파마이신, 타목시펜, IFN-γ 및 빈블라스틴과 같은 작용제는 자가포식을 유도할 수 있다. 일 실시예에서, 세포는 상기 세포에 의한 자가포식의 유도를 초래하는 허혈성 조건(ischemic condition) 하에서 인큐베이션된다.
암: 분화의 상실, 증가된 성장 속도, 주변 조직의 침식과 함께 특징적인 역형성(anaplasia)을 거치고 전이될 수 있는 악성 신생물(malignant neoplasm)을 의미한다.
화학요법(chemotherapy): 암 치료에서, 화학요법은 종양 세포 또는 암 세포와 같은 빠르게 증식하는 세포들을 죽이거나 또는 그들의 증식을 둔화시키는 하나 이상의 작용제의 투여를 의미한다. 특정한 실시예에서, 화학요법은 개체에서 종양 세포의 수를 유의성 있게, 예를 들면, 10% 이상, 20% 이상 또는 50% 이상 감소시키기 위한 하나 이상의 항신생물제(anti-neoplastic agent)의 투여를 의미한다. 세포독성 항신생물 화학요법제는 5-플루오로우라실(5-FU), 아자티오프린, 시클로포스파미드, 항대사물질(예를 들면, 플루다라빈), 및 에토포시드(Etoposide), 독소루비신, 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 카르보플라스틴, 시스-플라티늄 및 탁산(예를 들면, 탁솔)과 같은 다른 항신생물제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
감소(decrease): 특정 대상(something)의 품질, 양, 또는 강도를 감소시키는 것을 의미한다.
일 실시예에서, 치료법은 종양(예를 들면, 종양의 크기, 종양의 수, 종양의 전이, 또는 이들의 조합), 또는 종양과 관련된 하나 이상의 증상을, 예를 들면, 치료법의 부재 시의 반응에 비해 감소시킨다. 특정한 실시예에서, 치료법은 그 치료법의 적용 후에, 종양의 크기, 종양의 수, 종양의 전이, 또는 그들의 조합을 10% 이상, 20% 이상, 50% 이상, 또는 심지어 90% 이상 감소시킨다. 그와 같은 감소는 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
일 실시예에서, 치료법은 예를 들면, 상기 치료법의 부재에 비해, 병원체 감염의 발생율, 또는 병원체 감염과 관련된 하나 이상의 증상을 감소시킨다. 특정한 실시예에서, 치료법의 적용 후에 병원체 감염의 발생률 또는 그와 관련된 하나 이상의 증상을 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 50% 이상, 또는 심지어 약 50% 이상 감소되는 경우, 치료법은 병원체 감염의 발생률, 또는 병원체 감염과 관련된 하나 이상의 증상을 감소시킨다. 그와 같은 감소는 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
수지상 세포(DC): 외래 항원을 인식하고 가공하여 T 세포에 제시하는 것에 의해 원형의 T 세포를 자극하는 능력을 갖는 항원 제시 세포를 의미한다. 수지상 세포의 하나의 특정한 예는 피부에 존재하는 수지상 세포의 종인 랑게르한스 세포이다.
DRiP(Defective ribosomal product): 번역의 오류로부터 초래된 펩티드, 또는 적합하게 번역되었으나 잘못 폴딩된 단백질, ER-관련 단백질 분해(ERAD)와 같은 품질 관리 시스템을 거치는 단백질을 의미한다. DRiP는 단백질 합성 및 폴딩에 내재된 불완전성 때문에, 엔트로피적으로(entrophically) 생성된다. DRiP는 그들의 합성 30분 이내에 프로테아솜에 의해 분해되는 새로 합성된 단백질의 1/3을 차지할 수 있다. DRiP는 MHC 클래스 I 분자와 관련된 펩티드의 주요한 원천(source)을 제공한다. 일부 실시예에서, DRiP에 대한 언급은 그들의 면역원성 단편을 포함한다.
DRibble(DRiP in Bleb): 세포에 의해 형성된 DRiP 또는 SLiP-충진된 구조물을 의미하며, 그 형성은 세포가 프로테아솜 억제제에 노출되는 경우 증가될 수 있다. 그와 같은 구조물, 예를 들면, 소포(vesicle)는 일부 실시예에서 프로테아솜 억제제에 노출된 세포에 의해 분비되고, 그에 의해 배양액의 상층액으로부터, 예를 들면, 원심분리를 사용하여 DRibble의 분리를 가능하게 한다. 특정한 실시예에서, DRibble은 자가포식체(autophagy body)이다.
에피토프: 특이적 면역 반응을 유발하는 화학적 작용기 또는 펩티드 서열과 같은 항원 결정기(antigenic determinant)를 의미한다. 항체는 특정한 항원성 에피토프에 결합하거나, 또는 T-세포는 특정한 MHC 분자에 결합된 특정한 항원성 에피토프와 반응한다. 일부 실시예에서, 에피토프는 MHC 클래스 I에 대해 6-10개의 아미노산, 예를 들면, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산으로 구성된 최소 서열을 가지거나, 또는 MHC 클래스 II에 대해, 훨씬 더 긴 서열(예를 들면, 약 100개의 아미노산으로 구성된 최대 서열)을 갖는다. 특정한 실시예에서, 에피토프는 종양-관련 항원 또는 병원체-관련 항원에 존재한다.
강화(Enhance): 특정 대상(something)의 품질, 양, 또는 강도를 개선하는 것을 의미한다.
일 실시예에서, 면역계가 치료법의 부재시 면역 반응에 비해, 감염 또는 종양과 싸우는데 보다 효과적인 경우, 치료법은 면역계를 강화하는 것이다. 예를 들면, 치료법의 존재 시 개체의 생존 시간이 연장되거나, 개체에서 종양의 크기가 감소되거나, 개체에서 종양의 전이가 감소되거나, 개체에서 감염이 치료되거나, 또는 그들의 조합인 경우, 치료법은 면역계를 강화할 수 있다.
특정한 실시예에서, 종양-특이적 T-세포에 의해 분비된 IFN-γ의 양이 치료법의 적용 후에, 10% 이상, 20% 이상, 50% 이상, 또는 90% 이상 증가되는 경우, 치료법은 면역계를 강화하는 것이다. 그와 같은 강화는 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여, 예를 들면, ELISA 분석법 또는 유동 세포측정법(flow cytometry)을 이용하여 INF-γ의 양을 결정하는 것에 의해 측정될 수 있다.
특정한 실시예에서, 치료법의 적용 후에 림프구의 수가 예를 들면, 10% 이상, 20% 이상, 50% 이상, 심지어 90% 이상 증가되는 경우, 치료법은 면역계를 강화하는 것이다. 그와 같은 강화는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 방법을 사용하여, 예를 들면, 치료법의 적용 전 및 후에 유동 세포측정법을 이용하여 림프구의 수를 결정하는 것에 의해 측정될 수 있다.
또 다른 특정한 실시예에서, 치료법은 종양 세포 또는 병원체 감염된 세포와 같은 세포로부터 DRibble의 생성 또는 분비를 예를 들면, 10% 이상, 20% 이상, 50% 이상, 또는 심지어 90% 이상 강화한다. 그와 같은 강화는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 방법을 사용하여, 예를 들면, 치료법의 적용 전 및 후에 DRibble의 양을 결정하는 것에 의해 측정될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 치료법은 개체에서 종양-특이적 T 세포의 빈도를 예를 들면, 20% 이상, 30% 이상, 50% 이상, 또는 90% 이상 증가시켜 강화한다. 특정한 실시예에서, 치료법의 부재시, 종양-특이적 T 세포의 빈도는 검출가능하지 않거나 또는 0.1% 미만이나, 효과적인 치료법의 존재시 T 세포의 수는 0.1% 이상, 예를 들면, 10% 이상이며, 상기에서 백분율은 포유동물로부터 수득된 생물학적 시료와 같은 시료에서 T 세포의 총 수 대비 백분율이다.
수집(Harvest): 수집하는 것을 의미한다. 예를 들면, 분비된 DRibble을 수집하는 경우, 그 방법은 세포로부터 예를 들면, 원심분리에 의해 DRibble을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
면역 반응(immune response): 개체에서, 면역, 예를 들면, B-세포, T-세포, 대식세포, 단핵세포, 또는 다형핵 세포(polymorphonucleocyte)와 같은 면역계의 세포의 면역원성 작용제에 대한 반응의 변화를 의미한다. 반응은 종양-특이적 또는 병원체-특이적 DRiP 또는 SLiP와 같은 특정한 항원에 대해 특이적일 수 있다("항원-특이적 반응"). 특정한 실시예에서, 면역 반응은 CD4+ 반응 또는 CD8+ 반응과 같은 T 세포 반응이다. 또 다른 실시예에서, 반응은 B-세포 반응이고, 면역원성 작용제에 대한 특이적 항체의 생성을 초래한다.
일부 실시예에서, 그와 같은 면역 반응은 개체에 면역원성 작용제 또는 면역원성 작용제의 원천으로부터의 보호를 제공한다. 예를 들면, 면역 반응은 사람 또는 동물(veterinary subject)과 같은 개체를 병원체에 의한 감염으로부터 보호할 수 있고, 또는 병원체에 의한 감염의 진행을 방해할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 면역 반응은 종양을 가진 개체를, 예를 들면, 종양의 전이를 방해하는 것에 의해 치료할 수 있다. 면역 반응은 능동적(active)이고 개체의 면역계의 자극을 포함할 수 있거나, 또는 수동적으로 후천성 면역으로부터 유발된 반응일 수 있다.
특정한 실시예에서, 증가되거나 또는 강화된 면역 반응은 개체가 병원체 감염 또는 종양과 같은 질병과 싸워내는 능력의 증가이다.
면역(Immunity): 면역원성 작용제에 대한 노출 시 보호성 반응(protective response)를 일으킬 수 있는 상태를 의미한다. 보호성 반응은 항체-매개이거나 또는 면역 세포-매개될 수 있고, 특정한 병원체 또는 종양을 대상으로 하는 것일 수 있다(병원체 특이적 또는 종양 특이적 DRiP). 면역은 능동적으로(예를 들면, 자연적으로 면역원성 작용제에 노출되거나 또는 DRibble을 포함하는 조성물과 같은 약제학적 조성물에 담긴 면역원성 작용제에 노출되는 것에 의해), 또는 수동적으로(예를 들면, 항체의 투여, 또는 인 비트로 자극되고 증식된 T 세포의 투여에 의해) 획득될 수 있다.
면역원(immunogen): 개체의 면역계에 의해 면역 반응을 자극하거나 또는 유도할 수 있는, 예를 들면, 개체에서 항체의 생성 또는 T-세포 반응을 자극할 수 있는 작용제(예를 들면, 화합물, 조성물, 또는 물질)를 의미한다. 면역원성 작용제는 DRibble에 존재하는 것과 같은, DRiP 및 SLiP를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 면역원성 조성물의 하나의 특정한 예는 백신(예를 들면, DRibble을 포함하는 백신)이다.
면역원성(immunogenicity): 면역원이 체액성 면역 반응 또는 세포성 면역 반응을 유도하는 능력을 의미한다. 면역원성은 예를 들면, 적합한 MHC 분자(예를 들면, MHC 클래스 I 또는 II 분자)에 결합하고 T-세포 반응을 유도하거나 또는 B-세포 또는 항체 반응, 예를 들면, 측정가능한 세포독성 T-세포 반응 또는 주어진 에피토프에 대한 혈청 항체 반응을 유도하는 능력에 의해 측정될 수 있다. 면역원성 분석법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있고 예를 들면, Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993) 및 본 명세서에서 인용된 참조문헌에 기재된다.
면역학적 유효 투여량(Immunologically Effective Dose): 질병 또는 상태, 예를 들면, 종양, 병원체에 의한 감염, 또는 감염성 질환을 예방하거나, 치료하거나, 경감시키거나, 또는 그의 심각도, 정도 또는 지속기간을 감소시키는 면역원(예를 들면, DRibble 또는 DRibble 형성을 촉진하는 작용제로 처리된 세포)의 치료적 유효량(therapeutically effective amount)을 의미한다.
면역자극제(immunostimulant): 본 명세서에 개시된 면역원은 면역자극제와 조합되어 사용될 수 있다. 면역자극제는 항원에 대한 면역 반응을 자극할 수 있는 작용제이다. 일 예는 아주반트이다. 다른 특정한 예는 T-세포 증식 및 생존의 공동자극성(costimulatory) 항체, 예를 들면, 항-CTLA-4(madarex) 또는 항-OX-40 항체를 포함한다.
감염(Infection): 경쟁적 대사, 독소, 세포내 복제, 또는 항원-항체 반응 때문에 국소적 세포 손상을 유발할 수 있는, 개체로의 병원체의 침입 및 증식을 의미한다.
감염성 질환(infectious disease): 감염성 병원체에 의해 유발된 임의의 질환을 의미한다. 특정한 실시예에서, 감염성 질환은 하나 이상의 종류의 감염성 병원체에 의해 유발된 질환이다. 또 다른 실시예에서, 감염성 질환은 둘 이상의 상이한 종류의 감염성 병원체에 의해 유발된 질환이다. 감염성 질환은 신체 시스템에 영향을 미칠 수 있고, 급성(단시간에 작용함)이거나 또는 만성(장시간에 걸쳐 작용함)일 수 있고, 열을 동반하거나 또는 열 없이 발생하며, 임의의 연령군에 일어나며, 상호 간에 중첩될 수 있다.
인터페론-감마(IFN-γ): 특정한 항원 또는 분열촉진(mitogenic) 자극에 대한 반응에서 T 림프구에 의해 생산되는 단백질을 의미한다. 인터페론-감마는 천연 IFN-γ 펩티드 및 핵산 분자 및 완전한 또는 부분적인 IFN-γ 생물학적 활성을 갖는 IFN-γ 단편 및 변이체를 포함한다. IFN-γ에 대한 서열은 공개적으로 이용가능하다(예를 들면, 대표적인 IFN-γ mRNA 서열은 GenBank Accession Nos: BC070256; AF506749; 및 J00219로부터 이용가능하고, 대표적인 IFN-γ 단백질 서열은 GenBank Accession Nos: CAA00226; AAA72254; 및 0809316A로부터 이용가능하다).
기능성 IFN-γ를 측정하는 방법이 공지되어 있으며, 면역분석법(immunoassay)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, IFN-γ를 인식하는 항체의 일반적인 이용가능성(public availability)은 IFN-γ를 생성하는 세포를 검출하기 위한 ELISA 및 유동 세포측정법의 이용을 허용한다. 또 다른 방법은 활성화된 T 세포에 의한 종양 표적의 살상 수준을 측정하는 세포독성 분석법(cytotoxicity assay)이다(예를 들면, Hu et al, J. Immunother. 27:48-59, 2004, 및 Walker et al., Clin. Cancer Res. 10:668-80, 2004 참조).
분리된(Isolated): "분리된" 생물학적 성분(예를 들면, 혈액학적 물질의 부분, 혈액 성분, 또는, DRibble과 같은 세포의 부분)은 그 내부에서 상기 성분이 자연적으로 발생하는 개체(또는 세포)의 다른 생물학적 성분으로부터 실질적으로 분리 또는 정제된 것이다.
분리된 세포는 그 내부에 상기 세포가 자연적으로 발생하는 개체의 다른 생물학적 성분들로부터 실질적으로 분리되거나 또는 정제된 세포이다. 예를 들면, 분리된 말초혈액 단핵 세포(PBMC)는 적혈구 또는 다핵 세포와 같은, 혈액 세포로부터 실질적으로 분리되거나 또는 정제된 PBMC의 집단이다.
분리된 DRibble은 전세포 또는 큰 세포 파편과 같은 다른 생물학적 성분들로부터 실질적으로 분리되거나 또는 정제된 DRibble이다.
림프구고갈제(Lymphodepletion agent): 포유 동물에 투여되는 경우, 포유 동물에서 기능성 림프구의 수를 감소시킬 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 의미한다. 그와 같은 작용제의 일 예는 하나 이상의 항-신생 화학요법제이다. 특정한 실시예에서, 개체에 대한 림프구고갈제의 투여는 50% 이상 T-세포를 감소시킨다. 특정한 실시예에서, 림프구고갈제는 면역원의 투여 후에 CTL 및 HTL 증식 및 존속(persistence)을 강화시키기 위해 면역원(예를 들면, DRibble을 포함하는 면역원성 조성물)의 투여 전에 개체에게 투여된다.
악성(Malignant): 역형성 침습(anaplasia invasion) 및 전이의 특성을 갖는 세포를 의미한다.
신생물(Neoplasm): 비정상적인 세포 성장을 의미한다.
병원체(Pathogen): 질병-유발 매개체(disease-producing agent)를 의미한다. 예는 바이러스, 세균, 균류 및 원생동물과 같은 미생물, 예를 들면, 인플루엔자, 리스테리아 및 HIV를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, 병원체는 세포를 감염시키기 위해 이용되며, 그로부터 DRibble이 생성된다.
약제학적 작용제 또는 약물(Pharmaceutical agent or drug): 단독으로, 또는 또 다른 치료제(들), 또는 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합되어 개체에게 투여되는 경우, 원하는 치료적 효과 또는 예방적 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 의미한다. 특정한 실시예에서, 약제학적 작용제는 예를 들면, 종양의 크기(예를 들면, 종양의 용적 또는 종양 세포의 수)를 감소시키거나, 종양의 전이를 감소시키거나, 또는 그들의 조합에 의해 종양을 치료한다. 특정한 실시예에서, 약제학적 작용제는 바이러스와 같은 병원체에 의한 감염을 치료(예를 들면, 예방)한다.
약제학적으로 허용가능한 담체(Pharmaceutically Acceptable Carrier): 본 명세서의 개시에서 유용한 약제학적으로 허용가능한 담체(비히클)는 통상적인 것이다. E. W. Martin에 의한 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition)(1975)는 본 명세서에서 제공된 하나 이상의 면역원성 조성물과 같은 하나 이상의 치료제의 약제학적 전달에 적합한 조성물 및 제제를 기재한다.
일반적으로, 담체의 속성은 이용되는 특정한 투여 양식에 의존적일 것이다. 예를 들면, 비경구 제제는 물, 생리적 식염수, 균형 염 용액(balanced salt solution), 수용성 덱스트로오스, 글리세롤, 또는 그 등가물과 같은 제약학적으로 및 생리학적으로 허용가능한 주사가능한 유체를 비히클로서 포함할 수 있다. 생물학적-중성 담체(biologically-neutral carrier) 외에, 투여되는 약제학적 조성물은 습윤제 또는 유제, 보존제, 및 pH 완충제 및 그 등가물과 같은 무독성 보조 물질, 예를 들면, 소디움 아세테이트 또는 소르비탄 모노라우레이트, 소디움 락테이트, 염화칼륨, 염화칼슘, 및 트리에탄올아민 올리에이트의 미량을 포함할 수 있다.
PD-1(Programmed Death-1): 활성화된 림프구의 표면상에서 발현되는 수용체로서, 상기 활성화된 림프구를 억제하기 위해 면역 기능의 음성 조절자(negative regulator)로 기능한다. 종양 세포는 숙주의 면역 반응으로부터 벗어나기 위해 PD-1을 이용할 수 있다. PD-1 리간드 PD-L1(B7-H1으로도 알려짐) 및 PD-L2(B7-DC로도 알려짐)와 PD-1 수용체 간의 상호작용은 T 세포 반응을 제한하고, 종료하고, 및/또는 감쇠시키기 위해 작용하며, T 세포 내성(T cell tolerance)을 조절할 수 있다. PD-1에 의해 매개되는 음성 조절성 신호의 억제는 종양 세포에 대한 면역 반응을 촉진할 수 있다.
PD-1(예를 들면, PD-1 항-인간 PD-1) 또는 PD-Ll 또는 PD-L2에 특이적인 항체 및 siRNA와 같은 PD-1 기능의 억제제가 알려져 있다. 예를 들면, 미국특허 제 7,029,674호, 제6,808,710호 또는 미국특허출원 제20050250106호 및 제20050159351호에 개시된 PD-1 생물학적 활성의 억제제(또는 그의 리간드)가 본 명세서에서 제공된 방법에서 이용될 수 있다.
프로테아솜(Proteasome): 제거를 위해 태깅된 단백질, 예를 들면, 손상되거나 또는 잘못 폴딩된 단백질 및 유비퀴틴화(ubiquitination)에 의해 태깅된 단백질과 같은 단백질을 분해하는, 세포의 핵 및 세포질에 존재하는 거대분자 복합체(macromolecular complex)를 의미한다.
프로테아솜 억제제(Proteasome inhibitor): 유비퀴닌화 단백질과 같은 세포내 단백질을 분해하는 프로테아솜-매개 이화대사 경로를 감소시키고, 일부 경우에 제거할 수 있는 작용제를 의미한다. 특정한 실시예에서, 그와 같은 프로테아솜 억제제는 MHC 클래스 I 항원 가공 경로를 차단한다. 프로테아솜 억제제는 가역적이거나(예를 들면, MG-132) 또는 비가역적(예를 들면, 락타시스틴 및 에폭소미신)일 수 있다.
프로테아솜 억제제의 특정한 예는 펩티딜 보론산 에스테르(peptidyl boronic acid ester) 및 산 화합물이다. 대표적인 프로테아솜 억제제는: 카르보벤질옥시-L-루이실-L-루이실-L-루이시날(MG-132), 카르보벤질옥시-L-루이실-L-루이실-L-노르발리날(MG-115), 에폭소미신, N-벤질옥시카르보닐-L-루이실-L-루이실-L-루이실 보론산(MG-262), N-벤질옥시카르보닐-Ile-Glu(O-t-부틸)-Ala-루이시날(PSI; 및 그의 에폭시드), N-아세틸-Leu-Leu-노르루이시날(MG-101, ALLN, 또는 칼파인 억제제 I), MLN519, N-피라진카르보닐-L-페닐알라닌-L-루이신보론산(보르테조미브(bortezomib), PS-341, 또는 벨케이드®), 락타시스틴(Calbiochem-[Nu]ovobiochem Co., La Jolla, CA), PS-273, N-아세틸-Leu-Leu-Met(ALLM 또는 칼파인 억제제 II), N-토실-Lys 클로로메틸 케톤(TLCK), N-토실-Phe 클로로메틸 케톤(TPCK), 피롤리딘 디티오카르바메이트(PDTC), [2S,3S]-트랜스-에폭시숙시닐-L-루이실아미도-3-메틸부탄 에틸 에스테르(EST), 및 펜톡시필린(PTX)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
정제된(Purified): 용어 "정제된"은 절대적 순도를 요구하지 않고; 상대적 용어로서 의도된다. 따라서, 예를 들면, 정제된 세포는 상기 세포가 개체 내와 같은 그의 자연적 환경에서보다 더 순수한 것인 세포이다. 유사하게, 정제된 DRibble은 세포 또는 배양 배지 내와 같은, 그의 자연적 환경에 있는 DRibble보다 더 순수한 DRibble이다.
특정한 실시예에서, DRibble의 정제된 집단은 75% 이상 순수하거나, 80% 이상 순수하거나, 90% 이상 순수하거나, 95% 이상 순수하거나, 97% 이상 순수하거나, 98% 이상 순수하거나, 또는 99% 이상 순수한 DRibble의 집단을 의미한다. 일 실시예에서, DRibble의 실질적으로 정제된 집단은 95% 이상의 DRibble로 구성되고, 즉, 상기 DRibble의 집단은 5% 미만의 전세포 또는 큰 세포 파편을 포함한다. DRibble 집단의 순도는 대조구 대비, 크기에 근거하여 또는 특정한 면역 반응을 자극하는 능력(예를 들면, ELISA 분석법에 의해 측정됨)에 의해 측정될 수 있다.
단수명 단백질(SLiP): 짧은 반감기를 갖는 정상적 단백질로서, 특정한 예에서, T 세포에 의해 인식되고 면역원성인 단백질을 의미한다. 일 실시예에서, SLiP는 AUG 대신 CUG와 같은 비통상적인 개시 코돈으로 번역된다. SLiP는 바이러스(예를 들면, HIV 및 다른 레트로바이러스) 및 종양 세포에서 확인되었다. SLiP의 하나의 특정한 예는 DRiP이다. 일부 실시예에서, SLiP에 대한 지칭은 그의 면역원성 단편을 포함한다.
특이적으로 결합한다(Specifically bind): 면역반응하는 특정한 항원/에피토프에 대해 단일의 결합 친화도로 실질적으로 또는 완전하게 선택적으로 결합하는 것을 의미한다. 예는 표적 항원(예를 들면, 종양- 또는 병원체-특이적 DRiP 또는 SLiP)과 선택적으로 면역반응하는 항원 및 T 세포를 포함한다. 특이적 결합의 특정한 예에서, 표적 항원-특이적 T 세포 상의 T 세포 수용체는 MHC 복합체와 같은, APC 상에 제시된 표적 항원을 특이적으로 인식하고 반응하며, 이때 결합은 상기 T 세포 수용체와 표적 항원 결정인자 간의 비-임의적(non-random) 결합 반응이다. 특정한 실시예에서, 원하는 표적 항원-특이적 T 세포의 결합 특이성은 표적-항원 특이적 T 세포 상에 있는 T 세포 수용체가 상기 표적 항원을 제시하는 APC에 결합하나, 관련되지 않은 항원을 제시하는 APC에는 결합하지 않아서, 두 개의 상이한 항원을 구별하는 능력의 기준점(reference point)으로부터 결정된다.
증식을 자극한다(Stimulate proliferation): 세포의 성장 또는 생식을 증가시키는 것, 예를 들면, DRibble 또는 DRibble을 생성하기에 충분한 양의 프로테아솜 억제제로 처리된 종양 세포가 투여된 개체에서 항원-특이적 T 세포의 수를 증가시키는 것을 의미한다.
개체(Subject): 인간 및 인간을 제외한 포유동물(예를 들면, 실험용 동물 또는 수의학적 개체)을 포함하는 범주인 살아있는 다세포 척추동물 개체를 의미한다.
치료적 유효량(Therapeutically effective amount): 원하는 반응을 유도하는, 단독이거나 또는 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합된 양을 의미한다. DRibble을 유도하는 면역원성 조성물과 같은 치료제는 예를 들면, 표적 항원에 대한 보호성 면역 반응을 자극하는 치료적 유효량으로 투여된다.
치료제의 유효량은 질병(예를 들면, 종양 또는 병원체 감염)을 갖는 개체의 생리적 상태의 개선을 분석하는 것에 의해 면역 반응의 증가를 분석하는 것과 같은 다수의 상이한 방법으로 결정될 수 있다. 유효량은 또한 다양한 인 비트로, 인 비보 또는 인 시투(in situ) 분석법을 통해 결정될 수 있다.
치료제는 치료기간 동안, 단일 투여량으로, 또는 복수 투여량으로, 예를 들면, 주별로, 월별로, 또는 2개월 간격으로 투여될 수 있다. 그러나, 치료제의 유효량은 적용되는 원천(source), 치료대상 개체, 치료대상 상태의 심각도 및 종류, 및 투여 방식에 따라 결정될 수 있다.
일 실시예에서, 치료제의 유효량은 개체 내에서 감염성 질환의 증상을 부분적으로 또는 완전히 경감시키거나, 또는 병원체에 의한 감염을 감소시키기에 충분한 양이다. 치료는 일시적으로 질병의 진행을 둔화시키는 것만을 포함할 수 있으나, 또한 질병의 진행을 영구적으로 중단 또는 역전시키는 것을 포함하고, 처음부터 질병을 예방하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 약제학적 제제는 감염성 질환의 하나 이상의 증상을 감소시킬 수 있고, 예를 들면, 상기 약제학적 제제의 부재 시의 양에 비해, 증상을 20% 이상, 50% 이상, 70% 이상, 90% 이상, 98% 이상, 또는 심지어 100% 감소시킬 수 있다.
또 다른 실시예에서, 유효량은 개체에서 종양의 증상을 부분적으로 또는 완전히 경감시키기에 충분한 양이다. 치료는 일시적으로 종양의 진행을 둔화시키는 것만을 포함할 수 있으나, 또한 종양의 진행을 영구적으로 중단 또는 역전시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 약제학적 제제는 종양의 하나 이상의 증상(예를 들면, 종양의 크기 또는 종양의 수)을 감소시킬 수 있고, 예를 들면, 상기 약제학적 제제의 부재 시의 양에 비해, 증상을 20% 이상, 50% 이상, 70% 이상, 90% 이상, 98% 이상, 또는 심지어 100% 감소시킬 수 있다.
형질유도된(Transduced): 형질유도된 세포는 분자생물학 기법에 의해 도입된 핵산 분자(예를 들면, 병원체 항원을 코딩하는 벡터)를 갖는 세포이다. 용어 형질유도(transduction)는 바이러스 벡터에 의한 형질감염(transfection), 플라스미드 벡터에 의한 형질전환(transformation), 및 전기천공(electroporation), 리포펙션(lipofection) 및 입자총 가속화(particle gun acceleration)에 의한 노출된(naked) DNA의 도입을 포함한, 핵산 분자를 세포 내로 도입할 수 있는 모든 기법을 포괄한다. 그와 같은 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 관용적이다.
처리된 세포(Treated cell): 원하는 반응을 위해 충분한 조건 하에서 충분한 양의 원하는 작용제와 접촉되었던 세포를 의미한다. 일 실시예에서, 처리된 세포는 세포가 DRibble을 생성하기에 충분한 조건 하에서 프로테아솜 억제제와 인큐베이션된 종양 또는 병원체에 의한 감염된 세포이고, 세포가 자가포식을 수행하는 조건 하에서 상기 세포를 자가포식 유도제와 인큐베이션시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
질병의 치료(Treating a disease): "치료(Treatment)"는 감염성 질환 또는 종양의 징후 또는 증상과 같은, 질병 또는 병리적 상태의 징후 또는 증상을 경감시키는 치료적 개입(therapeutic intervention)을 의미한다. 치료는 또한, 감염성 질환 또는 종양과 같은 상태의 쇠퇴(remission) 또는 치유를 유도할 수 있다. 특정한 실시예에서, 치료는 질병을 예방하는 것, 예를 들면, 감염성 질환 또는 종양(예를 들면, 전이)의 발생을 예방하는 것과 같은 완전한 발생을 억제하는 것에 의해 질병을 예방하는 것을 포함한다. 질병의 예방은 감염성 질환 또는 종양의 완전한 부재를 요구하지 않는다. 예를 들면, 50% 이상의 감소로 충분할 수 있다.
종양(Tumor): 신생물(neoplasm)을 의미한다. 고형 종양 및 혈액학적 종양을 포함한다. 혈액학적 종양(hematological tumor)의 예는 급성 백혈병(예를 들면, 급성 림프구성 백혈구, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 골수모세포성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 골수단핵구성 백혈병, 단핵구성 백혈병, 및 적백혈병), 만성 백혈병(예를 들면, 만성 골수구성 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병), 골수형성 이상 증후군 및 골수 이형성증, 진성적혈구 증가증, 림프종(예를 들면, 호지킨병, 모든 형태의 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)), 다발 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 및 중쇄 질환(heavy chain disease)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
육종 및 암종과 같은 고형 종양의 예는 섬유육종, 점액육종(myxosarcoma), 지방육종, 연골육종, 골육종(osteogenic sarcoma), 및 기타 육종, 활막종(synovioma), 중피종(mesothelioma), 유잉 종양(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포성 암종(hepatocellular carcinoma), 편평세포 암종, 기저세포 암종, 선암종(adenocarcinoma), 한선 암종(sweat gland carcinoma), 피지선 암종, 유두암종, 유두상 선암종(papillary adenocarcinoma), 수질 암종(medullary carcinoma), 기관지원성 암종(bronchogenic carcinoma), 신세포암종, 간암, 담관암종, 융모막 암종, 윌름 종양(Wilms' tumor), 자궁경부암, 고환 종양, 방광암종, 흑색종, 및 CNS 종양(예를 들면, 신경아교종, 성상세포종, 수모세포종(medulloblastoma), 두개인두종(craniopharyogioma), 뇌실막세포종(ependymoma), 송과체종(pinealoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 청신경종(oustic neuroma), 희소돌기 아교세포종(oligodendroglioma), 뇌암(menangioma), 수막종(meningioma), 신경모세포종 및 망막모세포종)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
종양-관련 항원(Tumor-associated antigen: TAA): 종양-특이적 T-세포 정의(T-cell defined) 면역 반응 또는 종양 세포에 대한 항체를 촉진할 수 있는 종양 항원을 의미한다. 일 실시예에서, TAA는 표적 항원이고, 상기 표적 항원은 치료대상 개체에서 종양에 존재한다.
투니카마이신(Tunicamycin): 돌리콜(dolichol) 포스페이트 공여체 분자로부터 14개의 잔기로 구성된 코어 올리고사카라이드의 단백질 상의 특정한 아스파라긴(Asn) 잔기로의 이전을 방지하는 것에 의해 새로 합성된 단백질의 글리코실화를 차단하는 항생제이다. 글리코실화를 차단하고 따라서 DRibble 생성을 강화하기 위해 이용될 수 있는 또 다른 항생제는 브레펠딘(Brefeldin) A이다.
충분한 조건 하에(Under conditions sufficient for): 원하는 활성을 허용하는 임의의 환경을 기술하기 위해 사용되는 구(phrase)이다.
일 실시예에서, 원하는 활성을 허용하기에 충분한 프로테아솜 억제제의 존재 하에 세포(예를 들면, 종양 세포 또는 표적 병원체로 감염된 세포)를 배양하는 단계를 포함한다. 특정한 실시예에서, 원하는 활성은 처리된 세포에 의한 DRibble의 생성이다. 다른 특정한 실시예에서, 원하는 활성은 상기 세포에 의한 DRibble의 분비를 더 포함한다.
또 다른 실시예에서, 원하는 활성을 허용하기에 충분한 DRibble의 존재 하에 APC를 배양하는 단계를 포함한다. 특정한 실시예에서, 원하는 활성은 APC에 의한 DRiP 항원, 예를 들면, TAA 또는 병원체 항원, 예를 들면, 바이러스-관련 항원(Virus-Associated Antigen: VAA)의 제시이다.
또 다른 실시예에서, 개체에게 원하는 활성을 허용하기에 충분한 처리된 세포, 분리된 DRibble, 또는 DRibble-적재된 APC를 투여하는 단계를 포함한다. 특정한 실시예에서, 원하는 활성은 DRiP 또는 SLiP 항원을 제시하는 APC와 감작된 T 세포(primed T cell) 간의 결합이다.
단위 투여량(Unit dose): 개별적으로 또는 칼레티큘린적으로(collectively) 면역원성 효과와 같은 원하는 효과를 생성하는 것으로 계산된 활성 물질의 미리 정해진 양을 포함하는 물리적인 개별 단위를 의미한다. 단일 단위 투여량 또는 복수 개의 단위 투여량이 면역원성 효과와 같은 원하는 효과를 제공하기 위해 이용될 수 있다.
백신(Vaccine): 질병 또는 다른 병리적 상태에 대한 능동 면역과 같은 면역을 부여하기 위해 인간과 같은 포유동물에 투여될 수 있는 면역원성 조성물을 의미한다. 백신은 예방적으로 또는 치료적으로 이용될 수 있다. 따라서, 백신은 감염의 가능성을 감소시키거나 또는 질병 또는 상태의 증상의 심각도를 경감시키기 위해 또는 질병 또는 상태(예를 들면, 종양)의 진행을 제한하기 위해 이용될 수 있다.
일 실시예에서, 백신은 종양 또는 병원체-감염된 세포로부터 수득된 분리된 DRibble을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 백신은 처리된 세포(예를 들면, 프로테아솜 억제제로 처리된 전세포 종양 조성물(whole cell tumor composition))를 포함한다.
벡터(Vector): 숙주 세포로 도입되어, 형질전환된 숙주 세포를 생성하는 핵산 분자를 의미한다. 벡터는 복제 원점(origin of replication)과 같은, 숙주 세포 내에서 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 하나 이상의 선택 마커 및 기타 유전적 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 그람 음성 세균 및 그람 양성 세균 세포에서의 발현을 위한 플라스미드를 포함한 플라스미드 벡터를 포함한다. 대표적인 벡터는 대장균 및 살모넬라에서의 발현을 위한 벡터를 포함한다. 벡터는 또한, 레트로바이러스, 오르토폭스(orthopox), 아비폭스(avipox), 포울폭스(fowlpox), 카프리폭스(capripox), 수이폭스(suipox), 아데노바이러스(adenoviral), 헤르페스 바이러스(herpes virus), 알파 바이러스(alpha virus), 바큘로바이러스(baculovirus), 신드비스 바이러스(Sindbis virus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 및 폴리오바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는 바이러스 벡터를 포함한다. 특정한 실시예에서, 벡터는 리스테리아(Listeria) 펩티드와 같은 하나 이상의 병원체 항원을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
바이러스-관련 항원(Viral-associated antigen: VAA): 바이러스-특이적 T-세포-정의 면역 반응을 자극할 수 있는 바이러스 항원을 의미한다.
면역 반응을 자극하는 방법
APC에 의한 항원 흡수(intake)는 세포-관련 항원 또는 특정한 항원의 포식작용(phagocytosis), 가용성 단백질의 포음작용(pinocytosis), 및 수용체-매개 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 일어난다. 대부분의 내재화된 항원(internalized antigen)은 교차-제시(cross-presentation)를 위해 프로테아솜-의존적 ER-연관 단백질 분해 경로(ERAD)를 이용한다. 그러나, 일부 항원은 엔도솜 프로테아제(endosomal protease)에 의해 가공되고 공포 경로(vacuolar pathway)를 통해 교차-제시되며 트랜스포터 관련 단백질(Transporter Associated Protein: TAP) 및 프로테아솜과 독립적으로 작동될 수 있다. 본 명세서에서, 세포 단백질 분해가 프로테아솜 억제제에 의해 감소되거나 또는 억제되는 경우, 세포는 DRiP를 축적하고 "수포(bleb)" 구조물 내로 DRiP를 분비(DRibble)한다는 것이 입증되었다. 프로테아솜의 이와 같은 억제는 자가포식 및 단수명 단백질(DRiP 및 SLiP)의 DRibble로 지칭되는 자가포식체(autophagy body)로의 분비를 유도하는 것으로 제안된다. 예기치않게, 본 발명자는 DRiP 및 SLiP(및 그의 면역원성 단편)를 포함하는 이와 같은 DRibble이 교차-제시를 위한 전구체 또는 자극제로 작용한다는 것을 관찰하였다. 교차-제시된 항원은 이상적으로는 고 수준으로 발현되고 안정하며 긴 반감기를 갖는다. 대조적으로, DRiP 및 SLiP는 단수명 단백질이고, 그들이 고 수준으로 합성되더라도, 그들은 교차-제시를 위해 DC로 전달될 수 있기 전에 빠르게 (예를 들면, 종양 세포에 의해) 파괴된다. 따라서, DRiP 및 SLiP의 프로테아솜-매개 분해를 억제하는 것은 DC와 같은, 숙주의 특화된(professional) APC에 의한 이 단수명 단백질의 종양 세포 또는 병원체로 감염된 세포로의 교차-제시를 크게 증가시킬 수 있다.
이와 같은 발견에 근거하여, 본 출원은 하나 이상의 DRiP 또는 그의 면역원성 단편과 같은 다른 SLiP에 대한 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 개시된 방법은 교차-감작(cross-priming)을 위해 DRiP 또는 SLiP(및 그의 면역원성 단편)을 이용할 수 있다. 특정한 실시예에서, 본 발명의 방법은 세포를 예를 들면, 상기 세포가 DRibble을 생성하기에 충분한 조건 하에서, 실질적으로 상기 세포의 아포토시스를 유도하지 않는 양의 하나 이상의 프로테아솜 억제제와 접촉시켜, DRiP가 APC에 의해 제시될 수 있게 하고, 그에 의해 하나 이상의 DRiP에 대한 면역 반응을 자극하는 단계를 포함한다. DRibble은 연장된 프로테아솜 억제 시 세포(예를 들면, 종양 세포 또는 표적 병원체로 감염된 세포)로부터 방출된 자가포식체인 것으로 제안된다. 상기 세포는 인 비보에서, 예를 들면, 치료 대상 개체에 대한 하나 이상의 프로테아솜 억제제의 투여에 의해, 하나 이상의 프로테아솜 억제제와 접촉될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 세포는 엑스 비보에서(ex vivo) 하나 이상의 프로테아솜 억제제와 접촉된다. 예를 들면, 종양 또는 병원체 감염 세포는 엑스 비보로 하나 이상의 프로테아솜 억제제와 인큐베이션될 수 있고, 상기 처리된 세포 또는 상기 처리된 세포로부터 분리된 DRibble이 치료적 유효량으로 개체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 종양 또는 병원체 감염 세포는 엑스 비보로 하나 이상의 프로테아솜 억제제와 인큐베이션되고, 상기 처리된 세포로부터 DRibble이 분리되고, 상기 DRibble이 APC와 인큐베이션되고, 상기 처리된 APC가 치료적 유효량으로 개체에게 투여될 수 있다.
세포는 단독의, 또는 하나 이상의 다른 작용제와 조합된, 하나 이상의 프로테아솜 억제제와 접촉될 수 있다. 예를 들면, 세포는 또한 뉴클레오시드 트랜스로카아제(nucleoside translocase) I 억제제와 같은, 글리코실화를 감소시키거나 또는 억제하는 하나 이상의 작용제와 접촉될 수 있다. 그와 같은 작용제의 예는 무레이도마이신, 리포시도마이신, 투니카마이신 및 브레펠딘 A와 같은 항생제, 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정한 실시예에서, 세포를 프로테아솜 억제제 및 글리코실화를 감소시키는 작용제와 접촉시키는 것은 상기 둘 중 하나의 작용제 단독의 경우에 비해 상기 세포에 의한 DRibble의 생성을 증가시킨다. 또 다른 또는 추가적인 실시예에서, 세포는 또한 아주반트(예를 들면, CpG, MLA)와 같은 면역자극제, 또는 시토킨, 예를 들면, GM-CSF와 접촉된다. 또 다른 또는 추가적인 실시예에서, 세포는 또한 상기 세포의 자가포식을 유도하기에 충분한 양의 자가포식 유도제와 접촉된다. 그와 같은 작용제는 상기 세포에 의한 자가포식을 유도한다. 자가포식 유도제의 예는 세포를 굶겨죽이는 배양 배지(예를 들면, HBSS) 및 라파마이신을 포함한다. 또 다른 또는 추가적인 실시예에서, 세포는 또한 NH4Cl과 같은, 리소솜 매개 단백질 분해를 억제하는 작용제와 접촉된다.
세포를 하나 이상의 프로테아솜 억제제(단독의 또는 본 명세서에 기재된 다른 작용제와 조합된 프로테아솜 억제제)와 접촉시키는 단계는 인 비보 또는 엑스 비보로 수행될 수 있다. 예를 들면, 세포가 개체 내에 있는 경우, 상기 세포를 프로테아솜 억제제와 접촉시키는 단계는 상기 개체에게 치료적 유효량의 프로테아솜 억제제를 투여하여, 그에 의해 하나 이상의 DRiP 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 단계를 포함할 수 있다. 특정한 실시예에서, 프로테오솜 억제제는 유의성 있게 세포의 아포토시스를 초래하지 않는 양, 예를 들면, 프로테아솜 억제제의 치사량-미만의 투여량(sub-lethal dose)으로 투여된다.
또 다른 실시예에서, 세포는 엑스 비보로 하나 이상의 프로테아솜 억제제(단독의 또는 본 명세서에 기재된 다른 작용제와 조합된 프로테아솜 억제제)와 접촉된다. 예를 들면, 종양 세포 또는 병원체로 감염된 세포와 같은, 배양 내의 세포는 상기 세포에 의한 단백질 분해를 실질적으로 감소시키기에 충분한 조건 하에서 하나 이상의 프로테아솜 억제제(단독의 또는 본 명세서에 기재된 다른 작용제와 조합된 프로테아솜 억제제)의 존재하에 인큐베이션되어, 그에 의해 DRibble을 생성할 수 있다. 생성된 DRibble은 하나 이상의 DRiP(또는 SLiP)에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 치료적 양으로 개체에게 투여되거나, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 APC를 적재하기 위해 이용될 수 있다. 대안적으로, 처리된 세포는 개체에서 DRiP에 대한 면역 반응을 자극하기에 충분한 양으로(먼저 DRibble을 분리하는 단계 없이), 예를 들면, 전세포 종양 면역원성 조성물로 직접 투여될 수 있다.
유사하게, 상기 DRiP이 APC에 의해 제시될 수 있게 하는 단계는 인 비보 또는 엑스 비보로 수행될 수 있다. 예를 들면, 엑스 비보로, 예를 들면, 조직 배양에서 생성된 DRibble이 APC가 DRibble을 적재하고 DRiP를 제시하기에 충분한 조건 하에서 엑스 비보로 APC(예를 들면, DC)와 인큐베이션될 수 있다. DRiP를 제시할 수 있는 DRibble-적재된 APC는 개체에서 DRiP에 대한 면역 반응을 자극하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 또 다른 실시예에서, DRibble-적재된 APC는 종양-반응성 T 세포를 자극하고 증식시키기에 충분한 조건 하에서 개체로부터 유래된 T 세포와 배양될 수 있다. 결과물인 종양-반응성 T 세포는 개체에서 종양 또는 병원체 감염을 치료하기에 충분한 투여량으로 개체에게 투여될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 엑스 비보로 생성된 DRibble이 하나 이상의 DRiP(또는 SLiP)에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 개체에게 투여된다. DRibble이 인 비보로 예를 들면, 개체로의 프로테아솜 억제제의 투여에 의해 생성되는 경우, DRiP은 인 비보로 APC에 의해 제시된다. 유사하게, 프로테아솜 억제제로 처리된 세포가 개체에게 투여되는 경우, DRiP는 인 비보로 APC에 의해 제시된다.
특정한 실시예에서, 본 발명의 방법은 개체에서 종양에 대한 면역 반응을 자극하는 방법이다. 그와 같은 실시예에서, 상기 방법은 종양 또는 기질 억제성 분자(stromal inhibitory molecule), 예를 들면, PD-1(Programmed Death-1) 및 그의 리간드 PD-1L1 및 PD-1L2의 활성을 감소시키거나 억제하는 작용제의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 그와 같은 작용제는 종양-침윤 T 세포의 수를 유의성 있게 증가시켜(예를 들면, 20% 이상, 또는 50% 이상), 그에 의해 종양의 치료를 강화시키는 양으로 투여될 수 있다. 특정한 실시예에서, 상기 방법은 종양-침윤 T 세포의 수를 유의성 있게 증가시키는, PD-1, PD-1L1, PD-1L2, 또는 그의 조합에 특이적인 항체 또는 siRNA 분자의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 방법은 PD-1, PD-1L1, PD-1L2, 또는 그의 조합에 특이적인 항체 또는 siRNA 분자의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 또는 추가적인 실시예에서, 상기 방법은 또한 프로테아솜 억제제 또는 DRibble 또는 DRibble-적재된 APC를 포함하는 면역원성 조성물의 투여 전에, 개체에서 기능성 림프구(functional lymphocyte)의 수를 유의성 있게 감소시키는 단계를 포함한다. 예를 들면, 하나 이상의 림프구고갈 작용제가 상기 개체에 존재하는 기능성 림프구의 수를 감소시키기 위해 상기 개체에게 투여될 수 있다. 또 다른 또는 추가적인 실시예에서, 상기 방법은 예를 들면, 개체로부터 이전에 수득된 기능성 림프구의 투여에 의해, 림프구고갈된(lymphodepleted) 개체의 면역계를 재구성하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 림프구고갈제의 투여 전에 개체로부터 혈액 세포를 수득하는 단계를 포함한다.
종양에 대한 면역 반응 자극
특정한 실시예에서, 본 발명의 방법은 종양-유래 DRiP와 같은, 종양에 대한 면역 반응을 자극하는 방법이다. 비-한정적인 종양은 뇌하수체선종(pituitary adenoma) 및 위장 선종성 폴립(gastrointestinal adenomatous polyp)과 같은 양성 종양을 포함한다. 대표적인 악성 종양은 유방암, 폐암, 신세포암, 또는 간암을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정한 실시예에서, 종양은 유방암이다.
종양 세포가 DRiP를 생성하나, DRiP는 프로테아솜에 의한 신속한 분해 때문에, 효율적으로 교차-제시되지 않는다. 대부분의 종양 세포는 그들의 표면상에 MHC 클래스 I을 발현하나, MHC 클래스 II를 발현하지 않기 때문에, 또한 교차-제시는 장수명(long-lived) 단백질을 선호하고 DRiP 및 SLiP를 놓치기 때문에, 종양 세포에 의해 제시되는 항원 레퍼토리(repertoire)의 보다 큰 어레이가 APC에 의해 교차-제시되지 않는다. 대조적으로, 프로테아솜 억제제(예를 들면, 자가포식 유도제와 조합된 억제제)와의 접촉 때문에 종양 세포에 의해 생성된 DRibble은 APC에 의해 적재되고, 그에 의해 상기 APC에 의한 종양-유래 DRiP의 교차-제시를 허용한다.
따라서, 특정한 실시예에서, 본 발명의 방법은 종양 세포(예를 들면, 유방암 세포, 폐암 세포, 신장암 세포, 또는 간암 세포, 또는 양성 종양 세포)에 의해 DRibble을 생성하기에 충분한 양으로 (단독의 또는 자가포식 유도제, 투니카마이신, 면역자극제, 또는 그의 조합과 조합된) 프로테아솜 억제제의 치료적 유효량을 개체에게 투여하여, 그에 의해 하나 이상의 종양-유래 DRiP에 대한 면역 반응을 자극하는 단계를 포함한다. 특정한 실시예에서, 프로테아솜 억제제는 프로테아솜 억제제에 의해 종양의 유의성 있는 아포토시스를 유발하지 않는 양과 같은, 치사 투여량 미만의 투여량으로 투여된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 라파마이신, 또는 그의 유사체 CCI-779, 빈블라스틴, 타목시펜, IFN-γ와 같은 자가포식 유도제의 치료적 유효량의 투여를 더 포함한다. 추가적인 실시예에서, 상기 방법은 종양을 감소 또는 억제하는 작용제, 또는 PD-1과 같은 기질 세포 억제성 분자의 치료적 유효량의 투여를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 상기 방법은 엑스 비보로 DRibble 또는 DRibble-적재 APC를 생성하는 단계, 및 그 후 하나 이상의 종양-유래 DRiP에 대한 면역 반응을 자극하기에 충분한 양으로 분리된 DRibble 또는 DRibble-적재된 APC를 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 그와 같은 실시예에서, DRibble은 예를 들면, 전술된 방법을 이용하여, 개체 내에 존재하는 것과 동일한 유형의 종양 세포로부터 생성된다. 예를 들면, 개체가 유방암을 가진 경우, DRibble은 유방암 세포로부터 생성된다. 일부 실시예에서, DRibble을 생성하기 위해 사용된 종양 세포는 치료 대상 개체로부터 수득된다. 따라서, 일부 실시예에서, 상기 방법은 개체로의 면역원성 조성물의 투여 전에, 상기 개체로부터 종양 세포를 포함하는 시료를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 종양 세포의 생존, 성장 또는 증식(expansion)을 허용하기에 충분한 조건 하에서 종양 세포를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 그러나, 전술된 바와 같이, 모든 일차 종양 세포가 배양에서 잘 증식하는 것은 아니다. 그 결과, 일부 실시예에서, DRibble을 생성하기 위해 사용된 종양 세포는 개체 내의 종양과 동일한 세포 종류의 종양 세포주로부터 수득된다.
특정한 실시예에서, 본 발명의 방법은 개체에서 종양 세포에 대한 면역 반응을 자극하는 방법이다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 종양 세포에 의해 DRibble을 생성하기에 충분한 조건 하에서 종양 세포를 엑스 비보로 프로테아솜 억제제에 노출시키는 단계를 포함하고, 상기에서 종양 세포는 상기 개체 내에 존재하는 종양 세포와 동일한 종류이다. 일부 실시예에서, 상기 종양 세포는 자가포식 유도제와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시예에서, 종양 세포는 치료 대상인 동일한 개체로부터 수득된다. 결과물인 처리된 종양 세포는 치료적 투여량으로, 예를 들면, 단독으로 또는 아주반트 또는 다른 면역자극제, 또는 항-종양제의 존재 하에 투여되어, 그에 의해 하나 이상의 DRiP에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. 대안적으로, DRibble이 처리된 종양 세포로부터 분리되고, 치료적 유효량으로, 예를 들면, 단독으로 또는 아주반트 또는 다른 면역자극제, 또는 항-종양제의 존재 하에 투여되어, 그에 의해 하나 이상의 DRiP에 대한 면역 반응을 자극한다. 일부 실시예에서, 결과물인 DRibble은 APC가 하나 이상의 DRiP를 제시하고, 그에 의해 DRibble-적재된 APC를 생성하기에 충분한 조건 하에서 개체의 말초 혈액 단핵세포(PBMC)로부터 수득된 APC와 인큐베이션된다. 결과물인 DRibble-적재된 APC는 (단독으로 또는 면역자극제 또는 항-종양제와 같은 또 다른 치료제의 존재 하에) 치료적 투여량으로 투여되고, 그에 의해 하나 이상의 DRiP에 대한 면역 반응을 자극한다.
개시된 방법은 하나 이상의 종양을 갖는 개체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 프로테아솜 억제제, 처리된 종양 세포, 분리된 DRibble, 또는 DRibble-적재된 APC는 종양의 크기, 종양의 수와 같은 종양의 하나 이상의 증상을 감소시키거나 또는 종양의 전이를 예방할 수 있다.
림프구고갈( Lymphodepletion ) 및 재구성( reconstitution )
종양-반응성 T 세포의 최초 활성화 외에, 인 비보에서 이와 같은 활성화된 T 세포의 장기적인 존속(persistence)이 수득될 수 있다. 예를 들면, 종양-반응성 CTL 및 HTL의 최초 증식 및 추후의 존속을 증가시키기 위해, 치료적 유효량의 프로테아솜 억제제, 처리된 종양 세포, 분리된 DRibble, DRibble-적재된 APC, 또는 그의 조합(예를 들면, 둘 이상의 이와 같은 작용제를 포함하는 면역원성 조성물)의 투여 전에, 단독으로 또는 조합된, 개체에서 림프구를 실질적으로 고갈시키는 작용제가 상기 개체에게 투여될 수 있다. 림프구고갈제는 개체에서 림프구고갈을 달성하기에 충분한 조건 하에 투여된다. 특정한 실시예에서, 개체 내의 림프구의 수가 림프구고갈제의 투여 후에 50% 이상, 예를 들면, 90% 이상 감소되는 경우, 개체는 실질적으로 림프구가 고갈된 것이다.
특정한 실시예에서, 프로테아솜 억제제의 투여 또는 처리된 종양 세포, 분리된 DRibble, 또는 DRibble-적재된 APC에 의한 백신접종 전에 종양을 갖는 개체에서 백혈구 수를 실질적으로 감소시키는 것은 림프구고갈제가 투여되지 않은 경우에 비해, 보다 강한 면역 반응을 유발하고 보다 많은 수의 종양 세포가 파괴된다.
일 실시예에서, 림프구고갈제는 항-신생성 화학요법제, 예를 들면, 하나 이상의 항-신생성 화학요법제이다. 그와 같은 작용제 및 투여량이 알려져 있으며, 치료 대상 개체에 따라 담당 의사에 의해 선택될 수 있다. 림프구고갈제의 예는 플루다라빈, 시클로포스파미드, 또는 그의 조합을 포함하나, 그에 한정되지 않는다.
특정한 실시예에서, 본 발명의 방법은 개체의 림프구를 고갈시키는 단계 및 뒤이어 개체의 면역계를 재구성하는 단계를 더 포함한다. 예를 들면, 림프구고갈 및 프로테아솜 억제제 또는 다른 면역원성 조성물의 투여 전에, 혈액 세포(예를 들면, 단핵 세포 및 대식 세포)가 예를 들면, 백혈구성분채집술(leukapheresis)을 이용하는 것에 의해, 개체로부터 수득된다. 분리된 세포는 상기 세포를 개체로 도입하기에 적합한 시점까지 동결될 수 있다. 예를 들면, 해동된 림프구가 면역원성 조성물과 동시에 투여되거나, 또는 프로테아솜 억제제 또는 다른 면역원성 조성물의 투여 직전 또는 직후에 투여된다. 그와 같은 면역계의 재구성은 특정한 실시예에서 면역계의 자극을 강화할 수 있다.
병원체에 대한 면역 반응 자극
특정한 실시예에서, 본 발명의 방법은 병원체-유래 DRiP와 같은, 병원체에 대한 면역 반응을 자극하는 방법이다. 병원체의 예는 HIV, 인플루엔자, 및 리스테리아와 같은 바이러스, 세균, 원생동물, 및 균류를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
따라서, 특정한 실시예에서, 상기 방법은 개체에게 치료적 유효량의 프로테아솜 억제제(예를 들면, 치료적 유효량의 자가포식 유도제와 조합된 프로테아솜 억제제), 처리된 병원체-감염된 세포, 분리된 DRibble, DRibble-적재된 APC, 또는 그의 조합을 투여하여, 그에 의해 하나 이상의 병원체-유래 DRiP에 대한 면역 반응을 자극하는 단계를 포함한다. 처리된 병원체-감염된 세포, 분리된 DRibble, 또는 DRibble-적재된 APC의 생성은 표적 항원에 의해 감염된 세포가 사용된다는 것을 제외하고는, 종양에 대해 전술된 상기 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들면, DRibble은 전술된 방법을 이용하여 하나 이상의 원하는 병원체로 감염된 세포(또는 하나 이상의 병원체-특이적 항원을 코딩하는 벡터로 형질도입된 세포)로부터 생성될 수 있다. DRibble이 엑스 비보로 생성되는 것인 실시예에서, 프로테아솜 억제제와 접촉된 세포는 목적 병원체(pathogen of interest)에 의존적일 수 있다. 이상적으로는, 세포는 병원체에 의해 감염될 수 있는 세포이다.
특정한 실시예에서, 프로테아솜 억제제(단독의 또는 자가포식 유도제 또는 세포에서 단백질의 글리코실화를 감소시키는 작용제, 예를 들면, 투니카마이신 또는 브레펠딘 A와 조합된 프로테아솜 억제제)의 치료적 유효량이 감염을 갖는 개체에게 투여된다. 예를 들면, 투여된 프로테아솜 억제제(예를 들면, 자가포식 유도제와 조합된 프로테아솜 억제제)의 양은 개체의 병원체-감염된 세포에 의한 DRibble의 생성을 허용하여, 그에 의해 상기 개체에서 병원체에 대한 면역 반응을 자극하기에 충분한 양일 수 있다.
개시된 방법은 예를 들면, 병원체에 의한 개체의 감염을 예방하거나, 또는 개체에서 감염성 질환과 같은 기존의 감염을 치료하는 것에 의해 개체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 개체의 치료는 예방적이어서, 예를 들면, 개체에서 미래의 감염 또는 미래의 감염성 질환을 예방한다. 또 다른 실시예에서, 치료는 구토, 설사, 열 또는 오한의 감소와 같은, 감염성 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 감소시키거나, 또는 기능성 림프구의 수를 증가시키는 것을 포함한다.
처리된 병원체-감염된 세포, 분리된 DRibble, 또는 DRibble-적재 APC가 개체에게 투여되는 것인 실시예에서, 사용된 DRibble 또는 DRibble-적재 APC는 치료 대상 감염성 질환에 의존적일 것이다. 즉, 사용된 DRibble 또는 DRibble-적재 APC는 치료대상 감염성 질환에 상응할 것이다. 세균에 의해 유발된 감염성 질환의 특정한 예는 결핵(마이코박테리움 투베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 의해 유발됨); 심장사상충 감염(디로플라리아 임미티스(Dirofllaria immitis)에 의해 유발됨); 위 질환(헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)에 의해 유발됨); 장 질환(예를 들면, 대장균에 의해 유발된 장 질환); 폐 질환(예를 들면, 헤모필루스 인플루엔자애(Haemophilus influenzae)에 의해 유발된 폐 질환) 및 폐렴(예를 들면, 스트렙토콕코스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 스태필로콕코스 오레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 및 클레브시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)에 의해 유발된 폐렴)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바이러스에 의해 유발되는 감염성 질환의 특정한 예는 시토메갈로바이러스(CMV) 폐렴, 장염 및 망막염; 엡스테인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus: (EBV)) 림프구증식성 질환; 수두(chicken pox)/대상포진(바리셀라 조스터 바이러스(Varicella zoster virus: VZV)에 의해 유발됨); HSV-1 및 -2 점막염; HSV-6 뇌염, BK-바이러스 출혈성 방광염; 바이러스성 인플루엔자; RSV(Respiratory Syncytial Virus)에 의한 폐렴; (HIV에 의해 유발된) AIDS; (파필로마바이러스에 의해 유발된) 자궁경부암; 및 A, B 또는 C형 간염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
원생동물에 의해 유발된 감염성 질환의 특정한 예는 말라리아(플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum)에 의해 유발됨); 트리파노소마(trypanosoma) 및 샤가병(Chaga's disease)(트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)에 의해 유발됨), 톡소플라즈마; 리슈만편모충증(leishmaniasisa) 및 칼라아자르(kalaazar)(리슈마니아(Leishmania)에 의해 유발됨); 편모충증(지아르디아(Giardia)에 의해 유발); 크립토스포리디움(Cryptosporidium); 대장섬모충증(발란티디움 콜리(Balantidium coli)에 의해 유발됨); 분선충증(스트론길로이데스 스테르코랄리스(Strongyloides stercoralis)에 의해 유발됨); 트리쿠리스(Trichuris)와 같은 회충, 구충 및 스트론길로이데스(Strongyloides); 및 모세선충증(capillariasis)(캐필라리아시스(Capillariasis)에 의해 유발됨)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
균류에 의해 유발되는 감염성 질환의 특정한 예는 아구창(thrush)(칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 의해 유발됨); 크립토콕코스혈증(cryptococcemia)(크립토콕코스(Cryptococcus)에 의해 유발됨); 히스토플라스마증(histoplasmosis)(히스토플라스마(됨)에 의해 유발됨), 및 아스페르길루스증(아스페르길루스 종(Aspergillus spp.)에 의해 유발됨)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
APC
APC는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합된 표면 항원을 T 세포에 제시하는 세포이다. APC는 단핵세포, 대식세포, 수지상 세포(DC), B 세포, 및 랑게르한스 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정한 실시예에서, APC는 DC이다. 개체로부터 APC를 수득하거나 또는 생성하는 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려져 있다. 일 실시예에서, APC는 포유동물로부터의 혈액 시료로부터 수득된다. 예를 들면, 혈액 시료로부터 수득된 단핵세포는 DC를 생성하기 위해 배양될 수 있다.
특정한 실시예에서, APC (또는 그의 전구체)는 면역원성 조성물을 투여하기 전에 면역 반응이 자극될 개체로부터 수득된다. 예를 들면, 상기 방법은 개체로부터 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 분리하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 PBMC는 APC를 수득하거나 생성하기 위해 이용된다. 특정한 실시예에서, 프로테아솜 활성을 억제하기에 충분한 양의 프로테아솜 억제제와 접촉된 세포(예를 들면, 종양 세포 또는 병원체로 감염된 세포)로부터 분리된 DRibble이 APC가 하나 이상의 DRibble을 제시하기에 충분한 조건 하에서 APC와 인큐베이션되어, 그에 의해 DRibble-적재된 APC를 생성한다. DRibble-적재된 APC는 개체(예를 들면, 종양 또는 감염을 갖는 개체)에게 투여되어, 그에 의해 하나 이상의 DRiP에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. 대안적으로, 처리된 세포 또는 상기 처리된 세포로부터의 분리된 DRibble은 개체에게 투여되어(인 비보로 세포 또는 DRibble이 APC에 접촉되게 하여), 그에 의해 하나 이상의 DRiP에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다.
투여
본 명세서에 개시된 프로테아솜 억제제, 자가포식 유도제, 처리된 세포, 분리된 DRibble, DRibble-적재된 APC 및 기타 조성물(예를 들면, 림프구고갈제)와 같은 치료제를 투여하기 위해 임의의 투여 방식이 이용될 수 있다. 프로테아솜 억제제, 자가포식 유도제, 처리된 세포, 분리된 DRibble, DRibble-적재된 APC 및 기타 조성물이 치료적 유효량으로 개체에게 투여된다. 임상의사와 같은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 적합한 투여 경로를 결정할 수 있다. 일 실시예에서, 면역원성 조성물의 투여는 피하 또는 피내 투여이다. 또 다른 실시예에서, 림프구고갈제의 투여는 정맥내 투여이다.
본 명세서에 개시된 처리된 세포, 분리된 DRibble 및 DRibble-적재된 APC 및 프로테아솜 억제제 및 자가포식 유도제는 개체에게 치료적 유효량으로 투여된다. 특정한 실시예에서, 치료적 유효량의 프로테아솜 억제제, 자가포식 유도제, 처리된 세포, 분리된 DRibble 및 DRibble-적재된 APC(또는 그의 조합)는 단일 단위 투여량(single unit dose)으로 투여된다. 또 다른 실시예에서, 치료적 유효량의 프로테아솜 억제제, 자가포식 유도제, 처리된 세포, 분리된 DRibble 및 DRibble-적재된 APC가 두 개 이상의 단위 투여량, 예를 들면, 세 개의 단위 투여량, 네 개의 단위 투여량, 또는 다섯 개의 단위 투여량으로 60일 이상, 90일 이상, 180 이상, 또는 365일 이상의 기간 동안 투여된다.
DRibble 생성 방법
본 명세서의 개시는 DRibble을 생성하는 방법을 제공한다. 그와 같은 방법은 일부 실시예에서, 세포에 의한 DRibble의 생성을 자극하기 위해 이용될 수 있다. DRibble은 포유동물 세포와 같은, DRiP 또는 SLiP를 생성하는 임의의 종류의 세포로부터 생성될 수 있다. 그와 같은 세포의 예는 종양 세포 및 하나 이상의 병원체로 감염된 세포를 포함하나, 그에 한정되지 않는다.
특정한 실시예에서, 상기 방법은 세포에서 단백질 분해를 실질적으로 억제하기에 충분한 조건과 같은, DRibble을 생성하기에 충분한 조건 하에서 충분한 양의 프로테아솜 억제제와 표적 세포를 접촉시키는(예를 들면, 인큐베이션시키는) 단계를 포함한다. 예를 들면, 상기 세포는 4시간 이상, 6시간 이상, 12시간 이상, 18시간 이상, 또는 24시간 이상, 예를 들면, 4-24 시간, 6-24시간, 12-24시간, 또는 12-18시간 동안 프로테아솜 억제제와 접촉될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 세포의 자가포식을 유도하기에 충분한 조건 하에서 충분한 양의 자가포식 유도제와 표적 세포를 접촉시키는(예를 들면, 인큐베이션시키는) 단계를 더 포함한다. 예를 들면, 세포는 프로테아솜 억제제 전에, 또는 프로테아솜 억제제와 접촉하는 동안, 또는 그 후에 자가포식 유도제와 접촉될 수 있다. 특정한 실시예에서, 세포는 4시간 이상(예를 들면, 6시간 이상 또는 24시간 이상) 동안 프로테아솜 억제제와 접촉되고, 뒤이어 자가포식 유도제와 4시간 이상 동안, 예를 들면, 12시간 이상 또는 18시간 이상 동안 접촉될 수 있다.
세포는 또한 상기 세포에 의한 DRibble의 생성을 자극하거나 또는 심지어 강화하기에 충분한 조건 하에서 프로테아솜 억제제 및, 단백질의 글리코실화를 감소시키는 하나 이상의 작용제(예를 들면, 무레이도마이신, 투니카마이신, 리포시도마이신 또는 그의 조합)의 충분한 양과 같은, 다른 작용제와 접촉될 수 있다. 일 실시예에서, 세포는 상기 세포에 의한 DRibble의 생성을 자극하거나 또는 심지어 강화하기에 충분한 조건 하에서 충분한 양의 프로테아솜 억제제(예를 들면, 20 nM 이상의 벨케이드), 자가포식 유도제(예를 들면, 라파마이신 또는 HBSS) 및 NH4Cl과 접촉된다.
DRibble은 인 비보, 엑스 비보, 또는 인 비보 및 엑스 비보 방법의 조합에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, DRibble은 치료적 유효량의 하나 이상의 프로테아솜 억제제(단독의, 또는 자가포식 억제제 또는 투니카마이신과 같은 다른 작용제와 조합된 프로테아솜 억제제)를 개체에게, 예를 들면, DRibble을 생성하기에 충분한 양(예를 들면, 종양 세포 또는 병원체로 감염된 세포에서 실질적으로 단백질 분해를 억제하는 양)으로 투여하는 것에 의해 생성될 수 있다. 전술된 바와 같이, 투여된 프로테아솜 억제제의 양은 특정한 실시예에서, 종양 세포와 같은 세포의 아포토시스를 유의성 있게 유도하지 않는 투여량이다. 또 다른 실시예에서, DRibble은 충분한 양의 하나 이상의 프로테아솜 억제제(단독의 또는 자가포식 유도제 또는 투니카마이신과 같은 다른 작용제와 조합된 프로테아솜 억제제)와 배양에서 성장하는 세포를, 예를 들면 DRibble을 생성하기에 충분한 양(예를 들면, 세포에서 단백질 분해를 실질적으로 억제하는 양)으로 인큐베이션시키는 것에 의해 엑스 비보로 생성된다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 세포에 의해 생성되는 DRibble을 수집(harvest)하는 단계를 더 포함한다. 예를 들면, 세포에 의해 생성된 DRibble은 상기 세포로부터 분리되고 수집된다. 특정한 실시예에서, DRibble을 세포 및 세포 파편으로부터 분리하는 것은 50% 이상 순수한 집단, 예를 들면, 90% 이상 순수하거나, 95% 이상 순수하거나, 또는 99% 이상 순수한 집단과 같은 분리된 DRibble의 집단을 가져온다.
엑스 비보로 DRibble의 정제된 집단을 생성하는 하나의 특정한 대표적인 방법은 세포에서 단백질 분해를 실질적으로 억제하기에 충분한 조건 하에서 프로테아솜 억제제를 포함하는 조성물의 충분한 양과 세포를 접촉시키는 단계, 예를 들면, 약 6-24시간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다. 상기 세포는 뒤이어 약 6-24시간의 인큐베이션과 같이, 세포에서 자가 포식을 유도하기에 충분한 조건 하에서 인큐베이션된다. 결과물인 세포와 DRibble은 상기 세포를 침전시키나, DRibble은 침전시키기 않는 조건 하에서 원심분리된다. DRibble을 포함하는 상층액이 DRibble을 침전시키기에 충분한 조건 하에서 원심분리된다. DRibble의 정제된 집단을 함유하는 결과물인 침전물이 회수된다. 상기 DRibble은 즉시 사용되거나, 또는 추후의 사용을 위해 동결보관된다.
종양 세포로부터의 DRibble
일 실시예에서, DRibble은 혈액학적 종양 또는 고형 종양으로부터의 세포와 같은 종양 세포에 의해 생성된다. 그와 같은 DRibble은 직접적으로 또는 간접적으로, 종양에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 이용될 수 있다(하기 참조). 일 실시예에서, 종양-유래 DRibble은 인 비보로 생성되고, 그에 의해 개체에서 상기 종양에 대한 면역 반응을 자극한다. 또 다른 실시예에서, 종양-유래 DRibble은 엑스 비보로 생성되고, 상기 종양-유래 DRibble이 개체에게 직접 투여되거나, 또는 개체에게 투여될 APC에 적재하기 위해 이용되고, 그에 의해 개체에서 상기 종양에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. 일부 실시예에서, DRibble은 분리되지 않고, 대신에 프로테아솜 억제제(일부 실시예에서는, 또한 자가포식 유도제)로 처리되어, 따라서, DRibble을 생성한 전종양 세포가 면역원성 조성물로 개체에게 투여되고, 투여되는 세포의 수는 면역 반응을 유도하고, 일부 실시예에서, 개체 내의 종양의 퇴행을 유발하기에 충분하다.
특정한 실시예에서, 세포는 포유동물 암세포와 같은, 포유동물 종양 세포이다. 특정한 실시예에서, 세포는 인간 암세포이다. 일부 실시예에서, 종양 세포는 치료대상 개체로부터 수득되고, DRibble은 이와 같은 세포들로부터 엑스 비보로 생성된다. 종양 세포는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 방법, 예를 들면, 외과수술에 의해 적출된 종양, 또는 생검(biopsy) 시료(예를 들면, 종양으로부터의 바늘 흡인 생검물(needle aspirate))를 이용하여 개체로부터 수득된다. 예를 들면, 종양 세포는 개체로부터 수득되어 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 조직 배양 방법을 이용하여 일차 배양물로 성장될 수 있다. 이상적으로는, 일차 종양 세포는 배양에서 성장하고 잘 증식될 수 있거나, 또는 수득된 종양 시료는 DRibble 생성을 위해 이용할 수 있을 정도로 충분한 수의 세포(예를 들면, 백만 개 이상의 세포)를 가질 정도로 크다. 그 세포가 배양에서 잘 성장하거나 또는 다수의 세포를 갖는 큰 크기의 종양을 생성하는 경향이 있어서 일차 배양(primary culture)으로 이용될 수 있는 종양의 예는 백혈병, 림프종, 흑색종, 폐암, 난소암, 위암 및 결장암, 및 신세포 육종을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
그러나, 일부 일차 종양 세포는 배양에서 성장 또는 증식시키기 어렵다. 그와 같은 실시예에서, 개체 내에 존재하는 것과 동일한 종류의 종양에 대해 수립된 세포주가 사용될 수 있거나, 또는 DRibble이 인 비보로 생성될 수 있다. 배양에서 성장시키기 어려운 세포의 종양의 예들은 유방암 및 전립선암을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 개체가 배양에서 잘 성장하지 않는 세포의 유방암 세포를 갖는 경우, DRibble은 또 다른 개체로부터 확립된 유방암 세포주로부터 생성될 수 있다. 유방암 세포에 대한(하기의 실시예 22 참조) MDA-MB-231 및 전립선암에 대한 PC3 및 LNCap와 같은, 그와 같은 세포주의 예들이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있다.
감염된 세포로부터의 DRibble
또 다른 실시예에서, DRibble은 하나 이상의 병원체로 감염된 포유동물 세포, 또는 병원성 항원을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터(예를 들면, 플라스미드 또는 바이러스 벡터)로 감염된 세포로부터 생성된다. 그와 같은 DRibble은 직접적으로 또는 간접적으로 병원체에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 사용될 수 있다(하기 참조). 일 실시예에서, 감염된 세포로부터 수득된 DRibble은 인 비보로 생성되고, 그에 의해, 개체에서 병원체에 대한 면역 반응을 자극한다. 또 다른 실시예에서, 감염된 세포로부터 수득된 DRibble은 엑스 비보로 생성되고, 상기 DRibble이 개체에게 직접 투여되거나, 또는 개체에게 투여될 APC에 적재되고, 그에 의해 개체에서 병원체에 대한 면역 반응을 자극한다. 일부 실시예에서, DRibble은 분리되지 않고, 그러나 프로테아솜 억제제( 및 일부 경우에 자가포식 유도제)로 처리되고 따라서, DRibble을 생성하는 병원체-감염된 전세포가 면역원성 조성물로 개체에게 투여되고, 상기 투여되는 세포의 수는 면역 반응을 유도하고, 일부 실시예에서, 개체에서 감염을 치료하거나 또는 병원체에 대한 예방적 보호를 제공하기에 충분하다.
대표적인 병원체는 바이러스, 세균, 균류, 원생동물, 및 그들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 바이러스는 포지티브-스트랜드(positive-strand) RNA 바이러스 및 네가티브-스트랜드 RNA 바이러스를 포함한다. 대표적인 포지티브-스트랜드 바이러스는 피코르나바이러스(Picornaviruses) (예를 들면, 아프토비리대(Aphthoviridae)(예를 들면, 수족구병 바이러스(foot-and-mouth- disease virus: FMDV))), 카르디오비리대(Cardioviridae); 엔테로비리대(Enteroviridae)(예를 들면, 콕사키(Coxsackie) 바이러스, 에코바이러스( Echoviruses), 엔테로바이러스(Enteroviruses), 및 폴리오(Polio) 바이러스); 리노비리대(Rhinoviridae)(리노바이러스)); 헤파타비리대(Hepataviridae)(A형 간염 바이러스(Hepatitis A viruses)); 토가바이러스(Togaviruses)(예를 들면, 루벨라(rubella); 알파바이러스(alphaviruses)(예를 들면, 웨스턴 에퀸 엔세팔리티스 바이러스(Western equine encephalitis virus), 이스턴 에퀸 엔세팔리티스 바이러스(Eastern equine encephalitis virus), 및 베네주엘란 에퀸 엔세팔리티스 바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus)를 포함함); 플라비바이러스(Flaviviruses)(예를 들면, 뎅귀(Dengue) 바이러스, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 및 재패니즈 엔세팔리티스 (Japanses encephalitis) 바이러스를 포함함); 및 코로나바이러스(Coronaviruses)(예를 들면, 우르바니(Urbani) 변종과 같은 사스 코로나바이러스(SARS coronavirus)를 포함함)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대표적인 네가티브-스트랜드 RNA 바이러스는 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviruses)(예를 들면, 인플루엔자 바이러스), 랍도바이러스(Rhabdoviruses)(예를 들면, 래비스(Rabies) 바이러스), 및 파라믹소바이러스(Paramyxoviruses)(예를 들면, 홍역(measles) 바이러스 및 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus)를 포함함)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바이러스는 또한 DNA 바이러스를 포함한다. DNA 바이러스는 헤르페스바이러스 (예를 들면, 바리셀라-조스터(Varicella-zoster) 바이러스, 예를 들면, 오카(Oka) 변종); 시토메갈로바이러스; 및 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 타입 1 및 2) 를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또 다른 그룹의 바이러스는 레트로바이러스를 포함한다. 레트로바이러스의 예는 서브타입 c와 같은 HIV-1(Human Immunodeficiency Virus Type 1), HIV-2; 말 전염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus); 고양이 면역결핍성 바이러스(FIV); 고양이 백혈병 바이러스(FeLV); SIV(simian immunodeficiency virus); 및 조류 육종 바이러스(avian sarcoma virus)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또 다른 종류의 병원체는 세균이다. 세균은 그람-음성 또는 그람-양성으로 분류될 수 있다. 대표적인 그람-음성 세균은 대장균(K-12 및 O157:H7) 및 쉬겔라 디센테리애(Shigella dysenteriae)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대표적인 그람-양성 세균은 바실러스 안트락시스(Bacillus anthracis), 스태필로콕코스 오레우스(Staphylococcus aureus), 스태필로콕코스 뉴모콕코스(S. pneumococcus), 스태필로콕코스 고노콕코스(S. gonococcus), 스트렙토코칼 메닌기티스(Streptococcal meningitis), 및 마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 원생동물 및 균류도 병원체의 일종이다. 대표적인 원생동물은 플라스모디움(Plasmodium), 레쉬마니아(Leishmania), 아칸트아메바(Acanthamoeba), 지아르디아(Giardia), 엔트아메바(Entamoeba), 크립토스포리디움(Cryptosporidium), 이소스포라(Isospora), 발란티디움(Balantidium), 트리코모나스(Trichomonas), 트립파노소마(Trypanosoma), 내글레리아(Naegleria), 및 톡소플라스마(Toxoplasma)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대표적인 균류는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 크립토콕커스(Cryptococcus), 콕시디오데스 이미티스(Coccidiodes immitis), 및 블라스토미세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
엑스 비보로 감염된-세포 유래 DRibble을 생성하기 위해, 병원체가 세포를 (예를 들면, 인 비트로로) 감염시키기 위해 이용될 수 있고, 상기 감염된 세포가 DRibble을 생성하기 위해 이용될 수 있다. 감염된 특정한 세포 종류는 사용된 병원체에 의존적일 수 있다. 세포를 특정한 병원체로 감염시키는 방법이 알려져 있다. 일반적으로, 상기 방법은 병원체가 세포를 감염시키기에 충분한 조건 하에, 병원체에 의해 감염될 수 있는 세포를 인큐베이션시키는 단계를 포함한다. 특정한 실시예에서, 병원체가 30분 이상, 예를 들면, 60분 이상 동안 배양 배지에서 세포들과 37℃에서 인큐베이션된다. 세포를 감염시키지 않은 병원체는 상기 세포를 세척하는 것에 의해 제거될 수 있다. 본 명세서에서 특정한 실시예가 제공되나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 세포와 병원체의 다른 조합들이 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일 실시예에서, 마이코박테리움 튜베르큘로시스 세균이 예를 들면, (Li et al, Infect. Immun. 70:6223-30, 2002)에 개시된 방법을 이용하여, 대식 세포(예를 들면, PBMC로부터 수득된 대식 세포)를 감염시키기 위해 이용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 플라스모디움 원생동물(예를 들면, 플라스모디움 팔시파룸)이 적혈구 또는 간세포(hepatocyte)를 감염시키기 위해 이용된다. 또 다른 실시예에서, 히스토플라스마(Histoplasma) 또는 크립토콕커스 균류가 거대핵세포(megakaryocyte)를 감염시키기 위해 이용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, HIV가 상피 세포 또는 림프구를 감염시키기 위해 이용된다.
그 후, 감염된 세포는 예를 들면, 단백질 분해를 실질적으로 억제하기에 충분한 조건 하에, 프로테아솜 억제제(단독의 또는 자가포식 유도제 또는 투니카마이신과 같은 다른 작용제의 존재 하의 프로테아솜 억제제)의 충분한 양과 함께 인큐베이션되고, 그에 의해 상기 세포가 DRibble을 생성할 수 있게 한다.
프로테아솜 억제제
프로테아솜 억제제는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있으며, 가역적 억제제 또는 비가역적인 억제제를 포함한다. 프로테아솜 억제제의 특정한 예는 MG132, ALLN, 및 PS341(벨케이드®)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 그와 같은 억제제는 세포에서 단백질 분해를 실질적으로 억제하는, 예를 들면, 90% 이상 그와 같은 분해를 억제하는 농도 및 조건 하에 사용되고, 그에 의해 세포에 의한 DRibble의 형성을 허용한다. 특정한 실시예에서, 프로테아솜 억제제는 세포의 아포토시스를 유의성 있게 유도하지 않는 농도, 예를 들면, 프로테아솜 억제제의 부재시 아포토시스의 양에 비해, 10%보다 높은 비율의 세포에서 아포토시스를 유도하지 않는 농도와 같은 치사 투여량 미만의 투여량(sub-lethal dose)에서 사용된다. 예를 들면, 이는 종양을 갖는 개체에 현재 투여되는 프로테아솜 억제제의 양에 대비되며, 상기 프로테아솜 억제제는 종양 세포의 아포토시스를 유발하기 위해 투여된다. 대조적으로, 본 출원에서 사용된 프로테아솜 억제제의 농도는 이 양들보다 낮아서, 종양 세포가 DRibble을 생성하고 뒤이어 종양-특이적 T 세포에 의해 살해될 수 있게 한다.
특정한 실시예에서, DRibble은 세포를 6시간 이상(예를 들면, 8시간 이상, 12시간 이상, 또는 16시간 이상, 예를 들면, 야간 처리) 동안 하나 이상의 프로테아솜 억제제와 접촉시키는 것에 의해 생성된다. 적합한 농도 및 인큐베이션 조건은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
자가포식 유도제
자가포식 유도제는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있다. 자가포식 유도제의 특정한 예는 세포의 영양 고갈(nutrient deprivation)(예를 들면, HBSS에서의 인큐베이션에 의한 영양 고갈), 허혈성(ischemic) 조건 하에서의 세포의 인큐베이션, 타목시펜, 라파마이신(예를 들면, 1 nM - 100 nM), 빈블라스틴(예를 들면, 체중 kg 당 5-100 mg의 빈블라스틴 술페이트, 예를 들면, 50 mg/kg 체중의 빈블라스틴 술페이트), 및 IFN-γ(예를 들면, 10-1000 U/ml)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 그와 같은 유도제는 세포에서 실질적으로 자가포식을 유도하는 농도 및 조건 하에서 사용되고, 그에 의해, 상기 세포에 의한 자가포식체의 형성을 가능하게 한다. 자가포식이 유도되었는지 여부를 결정하는 방법이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있으며, 특정한 방법이 본 명세서에서 제공된다(예를 들면, 실시예 2 및 6 참조).
특정한 실시예에서, DRibble은 6시간 이상(예를 들면, 48시간 이상) 동안 세포를 하나 이상의 프로테아솜 억제제와 접촉시키고, 뒤이어 상기 세포를 하나 이상의 자가포식 유도제와 6시간 이상(예를 들면, 18시간 이상) 동안 접촉시키는 것에 의해 생성된다. 적합한 농도 및 인큐베이션 조건이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
DRibble 수집
DRibble을 수집하는 것은 DRibble을 세포로부터 분리하는 단계, 예를 들면, 분비된 DRibble을 회수하는 단계, 세포를 용해시키고 세포내 DRibble을 회수하는 단계, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.
예를 들면, 세포에 의해 세포 배양 배지로 분비된 DRibble이 분리될 수 있다. 일 실시예에서, 원심분리가 이용된다. 예를 들면, 세포 및 배양 배지가 전세포 및 큰 세포 파편을 침전시키나, DRibble은 침전시키지 않기에 충분한 조건 하에서 원심분리된다(예를 들면, 저속 원심분리). 전세포의 침전물이 세포내 DRibble을 수득하기 위해 이용될 수 있다(하기 참조). 결과물인 DRibble을 포함하는 상층액이 상기 DRibble을 침전시키기에 충분한 조건 하에서 원심분리된다(예를 들면, 고속 원심분리).
일 실시예에서, 전술된 저속 및 고속 원심분리를 이용하여 수득된 DRibble은 Percoll 콜로이드 밀도 구배(colloidal density gradient)에서의 초원심분리(ultracentrifugation)에 의해 더 정제된다. 예를 들면, 침전물은 PBS에 담긴 22.5% Nycodenz(1.127 g/ml) 7 ml 위의 PBS에 담긴 33% Percoll 21 ml의 비연속 구배 상에 배치되고, SW28 로터에서 72,000 g로 30분간 원심분리된다. 자가포식체는 하층 인터페이스(lower interface)에서 밴드를 형성하고, 아포토시스체(apoptotic body) 또는 방출된 미토콘드리아는 튜브의 바닥 상에 침전될 것이다. ER 및 원형질막의 파편과 같은, 다른 가벼운 막들은 상층 인터페이스(upper interface)에서 밴드를 형성할 것이다. DRibble은 자가포식체일 것으로 예상된다.
세포내 DRibble은 예를 들면, 세포를 용해시키고 실질적으로 DRibble을 다른 세포 판편으로부터 분리하는 것에 의해 수득될 수 있다.
특정한 실시예에서, 결과물인, 실질적으로 분리된 DRibble의 집단은 70% 이상 순수하고, 예를 들면, 80% 이상 순수하거나, 90% 이상 순수하거나, 95% 이상 순수하거나, 또는 심지어 99% 이상 순수하다. DRibble은 즉시 사용되거나, 또는 사용시까지 (예를 들면, -20℃ 또는 -80℃에서)동결보존될 수 있다. 일 실시예에서, 분리된 DRibble은 DMSO의 존재 하에 보존된다.
분리된 DRibble
본 명세서의 개시는 또한 개시된 방법을 이용하여 생성된 분리된 DRibble을 제공한다. 특정한 실시예에서, 분리된 DRibble 집단은 실질적으로 정제된 것이고, 예를 들면, 70% 이상 순수하거나, 80% 이상 순수하거나, 90% 이상 순수하거나, 또는 심지어 95% 이상 순수하다. 그와 같은 DRibble은 면역원성 조성물일 수 있다. 일 실시예에서, 분리된 DRibble 집단은 예를 들면, 10% 이상의 DMSO의 존재 하에 동결된다. 분리된 DRibble은 키트의 일부일 수 있다. 예를 들면, 키트는 종양 세포로부터 수득된 DRibble의 하나 이상의 용기 및, 플루다라빈, 시클로포스파미드, 또는 그의 조합과 같은 하나 이상의 화학요법제 또는 림프구고갈제를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 키트는 분리된 DRibble 및 종양을 억제하는 작용제 또는 PD-1과 같은 기질 세포 억제성 분자를 포함한다. 예를 들면, 그와 같은 키트는 분리된 DRibble 및 하나 이상의 PD-1, PD-1L1, 또는 PD-1L2를 인식하는 항체 또는 siRNA를 포함할 수 있다.
면역원성 조성물
면역원성 조성물 및 그와 같은 조성물을 생성하는 방법이 본 출원에 의해 제공된다. 면역원성 조성물은 개체의 면역계에 의한 면역 반응을 자극 또는 유발할 수 있는 조성물, 예를 들면, 개체에서 T-세포 반응, 예를 들면, TAA 또는 병원체-관련 항원(예를 들면, VAA)에 대한 T-세포 반응의 생성을 자극할 수 있는 조성물이다. 대표적인 면역원성 조성물은 백신을 포함한다. 일 실시예에서, 면역원성 조성물은 종양 또는 세포에 의한 DRibble 생성을 자극하기에 충분한 프로테아솜 억제제로 처리된 병원체 감염 세포, 분리된 DRibble, DRibble-적재된 APC, 또는 그의 조합을 포함한다.
개시된 면역원성 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 면역자극제(예를 들면, 아주반트), 항신생성 화학요법제, 또는 그의 조합과 같은 다른 작용제를 포함할 수 있다. 아주반트는 결과적인 면역 반응을 강화할 수 있는 작용제를 포함한다. 아주반트는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있고, 특정한 예는 프로인드 불완전 아주반트(IFA), 프로인드 완전 아주반트, 세균성 독소, 및 핵산 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 면역자극제의 하나의 특정한 예는 GM-CSF와 같은 시토킨이다. 하나의 특정한 실시예에서, 아주반트는 ssRNA 단일 가닥 올리고리보뉴클레오티드와 같은 ssRNA이다.
일 실시예에서, 면역원성 조성물은 본 명세서에 개시된 방법(예를 들면, 프로테아솜 억제제 및 자가포식 유도제와의 인큐베이션)을 이용하여, 처리된 세포의 집단을 생성하는 단계, 및 상기 처리된 세포를 포함하는 조성물을 제조하는 단계에 의해 생성된다.
일 실시예에서, 면역원성 조성물은 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여, 분리된 DRibble의 집단을 생성하는 단계, 및 상기 분리된 DRibble을 포함하는 조성물을 제조하는 단계에 의해 생성된다.
일 실시예에서, 면역원성 조성물을 제조하는 방법은 분리된 DRibble의 집단을 APC와 접촉시키고, 그에 의해 DRibble-적재된 APC를 포함하는 면역원성 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 DRibble-적재된 APC는 DRibble로부터, 예를 들면, 적재된(loaded) APC를 세척하는 것에 의해 분리되고, 상기 분리된 DRibble-적재된 APC는 면역원성 조성물을 형성한다.
도 1a-c는 종양-유래 DRibble의 분비 및 분리를 보여주는 디지털 이미지이 다. (a) 프로테아솜 억제제에 의한 야간(overnight) 처리 후 F10 흑색종 세포의 DRibbling (b) 저속 원심분리에 의해 분리된 완전한 종양 세포(intact tumor cell); (c) 저속 원심분리 후의 상층액으로부터 고속 원심분리에 의해 분리된 DRibble.
도 1d-g는 프로테아솜 억제제 및 투니카마이신의 존재 하에 종양-유래된 DRibble의 증가된 생성을 보여주는 디지털 이미지이다. (d) 무처리(untreated) 3LL 종양 세포; (e) 프로테아솜 억제제 MG-132로 처리된 3LL 세포; (f) 투니카마이신으로 처리된 3LL 세포; 및 (g) MG-132 및 투니카마이신으로 처리된 3LL 세포.
도 2a 및 2b는 Sumo-M-OVA 또는 Sumo-R-OVA를 발현하는 F10 및 B78H1 흑색종 세포에 의한 OVA의 교차-제시의 유동 세포측정법(flow cytometry) 분석 및 F10-Sumo-R-OVA 세포로부터의 OVA의 교차-제시에 대한 프로테아솜 억제의 효과를 도시한다. (a) 인 비보에서 F10 및 B78H1에 의한 OVA의 교차-제시. (b) 프로테아솜 억제 후 F10-Sumo-R-OVA로부터의 OVA의 교차-제시. F78H1-Sumo-M-OVA가 대조구로 사용되었다. 히스토그램은 관문(gated) CD8+ T 세포의 CFSE-프로파일을 보여준다.
도 3은 교차-제시가 자가포식-의존성이라는 것을 보여주는 유동 세포측정법 분석을 도시한다.
도 4는 DRibble-적재된 DC가 항-CD40 및 IFN-γ의 존재 하에 IL-12 p70을 분비한다는 것을 보여주는 막대 그래프이다.
도 5a 및 5b는 인 비트로 및 인 비보에서 DRibble의 교차-제시가 종양 세포보다 더 효율적이라는 것을 보여주는 유동 세포측정법 분석을 도시한다.
도 6은 종양 세포 자체보다 종양 세포로부터 유래된 DRibble로 펄스된(pulsed) 수지상 세포에 의해 재자극된 종양-특이적 세포에 의한 더 많은 양의 IFN-γ 생성을 보여주는 그래프이다.
도 7a 및 7b는 DRibble-감작된(primed) T 세포가 종양-특이적이라는 것을 보여주는 막대 그래프이다. 자극되지 않은 원형의 (naive) 비장 세포를 (a) FlO-DRibble 또는 (b) 3LL-DRibble로 적재된 DC로 자극하고, TL-7 및 IL-15으로 5일간 증식시키고, 결과물인 T 세포를 방사선 조사된(irradiated) FlO, 3LL 또는 마우스 전립선암 세포(MPR4, MPR5, RMl 또는 RMl-OVA)로 재자극했다.
도 8a는 DRibble이 적재된 수지상 세포(DC)의 투여에 의해 유도된 3-일령 종양의 완전한 퇴행을 보여주는 그래프이다.
도 8b는 F10 DRibble이 적재된 DC의 투여에 의해 4일령 F10 흑색종 종양의 전이의 감소 및 3LL DRibble의 경우의 감소 부재를 보여주는 그래프이다.
도 9는 8일령의 확립된 종양 모델에서 항-OX40 항체와 조합된, DRibble-적재된 DC의 투여에 의해 유도된 완전한 종양 퇴행을 보여주는 그래프이다.
도 10a-d는 6-12일령의 확립된 3LL 루이스(lewis) 폐암 종양 모델에서 DRibble-적재된 DC 단독, 또는 항-OX40 항체와 조합된 DRibble-적재된 DC의 투여에 의해 유도된 종양 퇴행을 보여주는 그래프이다. 각 선은 단일 마우스에 대한 데이터를 나타낸다. 마우스에 5 x 106 3LL 종양 세포를 투여하고, (a)무처리이거나 또는 3LL 종양 세포로부터 유래된 DRibble이 적재된 DC로 (b)6일 차에 처리하거나, (c)9일 차에 처리하거나, 또는 (d)12일 차에 처리하였다. 12일차 그룹의 마우스들에만 100 ㎍의 항-마우스 OX40 항체를 더 투여하였다.
도 11a-d는 EMT-6 종양 모델(BALB/c 마우스로부터 유래된 유방암 세포주)에서 종양 퇴행을 보여주는 그래프이다. 마우스들에 2 x 105 EMT-6 종양 세포를 투여하였다. 종양 주사 후 7일 차에 마우스에 탁소테르(Taxotere)(5 mg/kg)를 투여하였다. 8일 차에, (a)대조구 마우스에는 아무런 치료를 적용하지 않았고, (b)100 ㎍의 항-마우스 OX40 항체; (c)EMT-6 종양 세포로부터 유래된 DRibble이 적재된 DC; 또는 (d)EMT-6 종양 세포로부터 유래된 DRibble이 적재된 DC 및 항-OX40 항체의 조합을 투여하였다. 각 그룹은 8 마리의 마우스로 구성되었고, 각 선은 한 마리의 마우스를 나타낸다.
도 11e-g는 6-12일령의 확립된 3LL 루이스(lewis) 폐암 종양 모델에서 DRibble-적재된 DC의 투여에 의해 유도된 연장된 생존을 보여주는 그래프이다. (e) 및 (f)에서, 각 선은 단일 마우스에 대한 데이터를 나타낸다.
도 12a 및 12b는 GplOO-DRibble이 (a)종양을 가진 마우스에서 pmel-1 T 세포를 증식시키고, (b) FlO 종양 진행을 억제했다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 13은 DRibble이 단독으로 마우스에서 pmel-1 T 세포의 증식(expansion)을 자극할 수 있다는 것을 보여주는 막대 그래프이다.
도 14는 종양-유래 DRibble이 적재된 DC의 투여에 의해 종양을 가진 포유동물을 준비하고 치료하기 위해 이용될 수 있는 방법을 보여주는 개략도(schematic drawing)이다.
실시예 1
프로테아솜 억제제를 이용한 DRibble 의 제조
본 실시예는 종양 세포로부터 DRibble의 생성을 자극하기 위해 이용되는 방법을 설명한다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 다른 종양 세포, 예를 들면, 고형 종양 또는 액체 종양(liquid tumor)을 갖는 개체로부터 수득된 종양 세포가 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 유사하게, 20-1000 nM 벨케이드에 의한 6 내지 48시간 동안의 인큐베이션과 같이, 다른 프로테아솜 억제제가 이용될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 HIV와 같은, 하나 이상의 표적 병원체로 감염된 세포로부터 DRibble 을 생성하기 위해 유사한 방법들이 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
8-12주령의 암컷 C57BL/6(H-2b) 마우스(Jackson Laboratory, ME)를 이용하였다. B16F10 및 3LL은 각각 암컷 C57BL/6 마우스로부터 유래된 자연 마우스 흑색종(spontaneous mouse melanoma) 및 루이스 폐암 세포주이다. RMl은 배아 전립선 상피(embryonic prostate epithelium)로부터 유래된 마우스 전립선암이다. RMl-Ova는 오브알부민(ovalbumin)을 코딩하는 플라스미드에 의한 안정적인 형질감염에 의해 오브알부민을 발현하는 RM1 세포주이다.
종양 세포주는 0.1 mM 비필수(nonessential) 아미노산, 1 mM 소디움 피루베 이트, 2 mM L-글루타민, 50 ㎍/ml 겐타미신 술페이트, 및 μM 2-ME(Aldrich, Milwaukee, WI) 및 10% FBS(Life Technologies, Grand Island, NY)로 보충된 완전 배지(CM) RPMI 1640(BioWhittaker, Walkersville, MD)에서 플라스틱 상에서 배양하였다. 트립신처리(trypsinization)에 의해 주당 2 내지 3회 종양 세포들을 수집하여 T-150 배양 플라스크에서 유지시켰다.
종양-유래된 DRibble을 제조하기 위해, 약 80% 합류점(confluence)의 배양된 종양 세포를 포함하는 T-150 플라스크(플라스크당 약 3천만 개의 세포)를 24시간 동안 가역적 프로테아솜 억제제 MG132(5 ㎍/ml) 또는 ALLN(5 ㎍/ml)으로 처리하여 유비퀴틴화된 단백질(ubiquitinated protein)의 프로테아솜-매개 분해를 차단하였다. 도 1a에 도시된 바와 같이, ALLN의 존재 하에 종양 세포의 인큐베이션은 핵선행 공포(prenuclear vacuole)의 형성 및 DRiP 함유 수포(DRibble)의 분비를 유도했다. 48시간 후에 배양 상층액을 50 ml 원추형 튜브에 회수하고 전종양 세포 및 큰 세포 파편을 저속 원심분리(250g에서 10분간)에 의해 제거하였다(도 1b). DRibble을 침전시키기 위해 결과물인 상층액을 고속(10,000g로 15분간)으로 더 원심분리하였다. 상기 침전물(DRibble 포함, 도 1c 참조)을 PBS(20 ml)에 재 현탁시키고 전술된 바와 같이 고속에서 침전시켜 1회 세척하였다. 상기 세척된 침전물을 300 ㎕ PBS(10 ㎕ DRibble = 1백만 개의 세포)에 재현탁시키고 액체 질소로 급속 동결(snap frozen)시키고 사용시까지 소량씩 -8O℃에 보관하였다.
MG-132(5 ㎍/ml)와 투니카마이신(5 ㎍/ml)의 조합은 MG-132(도 1e) 또는 투니카마이신(도 1f) 단독, 또는 무처리(도 1d)에 비해, DRibble 생성을 유의성 있게 증가시켰다(도 1g). 일부 실시예에서, 투니카마이신(5 ㎍/ml) 단독 또는 MG-132와 조합된 투니카마이신을 종양 세포와 인큐베이션한 것을 제외하고는, 3LL 종양 세포를 전술된 바와 같이 처리하였다.
Malvern Zetasizer Nano 장치(Particle Technology Lab, Ltd., Downers Grove, IL)를 이용하여 DRibble의 크기를 결정하였다. 강도-가중된 분포(intensity-weighted distribution)에 근거하여, DRibble의 평균 크기는 엑소솜(exosome)(70 nM)보다 유의성 있게 더 큰, 약 230 nM이었다. 이는 DRibble은 엑소솜이 아니라는 것을 의미한다.
실시예 2
프로테아솜 억제제는 자가포식을 유도한다.
본 실시예는 프로테아솜 억제제의 존재 하에서 종양 세포를 인큐베이션하면 자가포식을 유도한다는 것을 입증하기 위해 사용된 방법을 설명한다.
자가포식을 조절하고 그들이 V-GFP-TfR-OVA 융합체(돌연변이된 유비퀴틴, GFP(Green Fluorescent Protein), 트랜스페린(transferrin) 수용체의 막관통(transmembrane) 도메인 및 닭 오브알부민을 포함하는 펩티드)를 발현하는 인간 293T 종양 세포에 미치는 효과를 관찰하기 위해 자가포식 억제제 3-메틸아데노신(3-MA) 및 자가포식 유도제 라파마이신을 사용하였다. 또한, 리소솜 매개 단백질 분해를 억제하기 위해, 10 mM NH4Cl을 사용하였다. V-GFP-TfR-OVA를 발현하는 세포를 무처리 상태로 사용하거나, 24시간 동안 10 mM 3-MA로 처리하거나, 24시간 동안 10 mM 3-MA 및 1 μM 벨케이드로 처리하거나, 24시간 동안 50 nM 라파마이신으로 처리하거나, 24시간 동안 50 nM 라파마이신 및 1 μM 벨케이드로 처리하거나, 24시간 동안 10 mM NH4Cl로 처리하거나, 또는 24시간 동안 1 μM 벨케이드 및 10 mM NH4Cl로 처리하였다. 침전된 세포를 SDS를 함유한 시료 용해 완충액에 재현탁시켜 세포 용해물을 준비하고 항-GFP 항체에 의한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
무처리 대조구 세포에 비해, 융합 단백질의 전장(full-length) 및 짧은 단편은 모두 3-MA 처리에 의해 증가되었고, 3-MA와 벨케이드의 조합은 짧은 단편을 안정화시키는데 있어서 보다 큰 효과를 가져왔다. 따라서, DRiP 및 SLiP의 분해에 프로테아솜 및 자가포식이 모두 관여된다. 벨케이드 처리는 라파마이신의 존재 하에 짧은 단편의 양을 약간 증가시켰으며, 이는 대부분의 DRiP는 기능성 프로테아솜의 부재시 자가포식에 의해 분해될 것이라는 것을 나타낸다. 보다 짧은 단편의 훨씬 더 큰 안정화 효과는 NH4Cl 및 NH4Cl + 벨케이드에 의해 유도되며, 이는 자가포식 및 프로테아솜이 DRiP를 분해한다는 것을 의미한다. 그러나, 예상치 않게, NH4Cl과 조합된 벨케이드는 전장 단백질 및 DRiP 모두의 라파마이신-유도 분해를 구제하지 못했다. 하기의 실시예에서 입증되는 바와 같이, 완전한 단백질 또는 DRiP도 기질로 작용할 수 있으나, 완전한 단백질과 DRibble에서 발견되는 DRiP의 분해 산물이 교차-제시를 위한 보다 효율적인 기질이다. 따라서, 자가포식은 DRiP의 축적 및 DRiP의 보다 작은 단편들로의 예비-소화(pre-digestion)을 초래하여, APC로 의 제시를 가능하게 하는 것으로 보인다.
벨케이드가 자가포식을 유도했는지 여부를 확인하기 위해, LC-3의 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. LC-3은 자가포식 마커이고; LC-3은 그의 LC3-I-비지질화(nonlipidated) 형태로부터 PE-컨쥬게이트 형태인 LC3-II로 전환된다. 293T를 밤새 1 μM 벨케이드로 처리하고 칼레티큘린 세포 용해물(total cell lysate)을 대상으로 항-LC3 다중클론 항체에 의한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 대조구 세포로부터 LC3-I 형태만이 검출되나, 프로테아솜 억제는 LC3-I 및 새로 생성된 LC3-II 모두의 증가를 초래하여, 벨케이드가 293T 세포에서 자가포식을 유도했다는 것을 입증하였다.
이 결과는 프로테아솜 기능의 억제가 DRiP의 축적 및 세포 자가포식의 활성을 유도한다는 것을 입증한다.
실시예 3
프로테아솜 기능을 억제하는 것은 단수명 단백질의 교차-제시를 증가시킨다.
본 실시예는 단수명 OVA의 분해를 차단하는 것이 인 비보 교차-제시의 증가를 가져왔다는 것을 입증하기 위해 이용된 방법을 설명한다. 원래의 분해 메카니즘의 존재시, 단수명 단백질이 아닌 장수명(long-lived) 단백질이 인 비보에서 효율적으로 교차-제시되었다.
B3Z OVA-특이적 하이브리도마 세포를 자극할 수 있는 OVA의 장수명 또는 단수명 형태를 발현하는 세포주를 사용하여 그들이 원형의(naive) OT-I Tg T 세포에 오브알부민(OVA)을 교차-제시할 수 있는지 여부를 결정하였다. 유비퀴틴-유사 분자(ubiquitin-like molecule)인 Sumo를 N-말단 절단된(N-terminal truncated) OVA (41-386)와 융합시켰다. 작제물(construct)은 우성(dominant) CD4 및 CD8 에피토프를 포함하고, 그들의 제시는 OT-II 및 OT-I TCR Tg T 세포에 의해 모니터링하였다. 융합 단백질(Sumo-M-OVA 및 Sumo-R-OVA, 상기에서, M-OVA는 4 시간 이상의 반감기를 가지며, R-OVA는 10분 미만의 반감기를 가짐)을 코딩하는 cDNA를 이시스트론성 렌티바이러스 벡터(bicistronic lentiviral vector) pWPI에 클로닝하고 293T 세포에 형질감염시켜 렌티바이러스 상층액(lentiviral supernatant)를 생성하였다. GFP 발현은 Sumo-X-OVA 융합 단백질과 동일한 카세트에서 IRES의 제어하에 있었다. Sumo-R-OVA로 형질감염된 293T 세포에서 OVA 발현은 Sumo-M-OVA 형질감염된 세포에서보다 약 10배 더 낮았다. Bl6F10 및 B78H1 흑색종 세포를 형질유도(transduce)하기 위해 바이러스 상층액을 사용하였다. GFP 발현에 의해 판단된 바와 같이, 70% 이상의 종양 세포가 형질유도되었다.
OT-I 마우스로부터 유래된 5백만 개의 원형의 비장 세포를 B6 마우스로의 입양면역 전달(adoptive transfer) 전에 CFSE로 표지시키고, 뒤이어 Sumo-M-OVA 또는 Sumo-R-OVA 렌티바이러스 벡터로 형질유도된 1x106개의 살아있는 종양 세포(F10 또는 B78H1 세포)를 접종시켰다. 켰다. MG-132(5 μM)를 프로테아솜 활성 및 R-OVA의 분해를 차단하기 위해 방사선 조사 전에 24시간 동안 종양 세포에 첨가하였다. 종양 주입 후 10일 차에, 비장을 채취하고 유동 세포측정법에 의해 관문 CD8+ T 세 포 상의 CFSE 형광을 결정하였다.
도 2a에 도시된 바와 같이, 벡터 단독으로 형질도입된 종양 세포(F10 및 B78H1)는 CFSE 희석을 유도하지 못했다. 두 종류의 Sumo-M-OVA 형질도입된 종양 세포는 모두 OT-I T 세포의 유의성 있는 증식을 유발하였다. 상이한 종양 세포의 경우, Sumo-R-OVA에 대한 반응은 상이했으며, 이는 R-GFP에 대해 관찰된 바와 같이, F10 및 B78H1 종양 세포에서의 R-OVA의 상이한 반감기 때문인 것으로 보였다. 도 2b에 도시된 바와 같이(최우측 패널), F10-Sumo-R-OVA의 프로테아솜 기능을 차단하는 것은 OVA의 교차-제시의 효율성의 현저한 증가를 가져왔다.
이 결과는 단백질 항원의 반감기가 교차-제시를 위해 중요하나, 종양 항원의 직접적인 제시를 위해서는 그렇지 않다는 것을 보여준다. 따라서, 세포(예를 들면, 종양 세포 또는 표적 병원체로 감염된 세포)에서 프로테아솜 기능을 억제하는 것은 단수명 단백질(예를 들면, DRiP 및 SLiP)의 분해를 방지하고 그들의 효율적인 교차-제시를 가져올 수 있다.
실시예 4
RMA 종양 세포의 프로테아솜 기능 억제는
인 비보에서 Gag -특이적 T 세포의 교차-제시를 증가시킨다
본 실시예는 RMA 종양 세포에서 프로테아솜 기능의 억제가 gag 단백질의 교차-제시를 증가시킬 수 있다는 것을 입증하기 위해 사용된 방법을 설명한다.
단수명 단백질의 교차-제시의 실패의 사례는 레트로바이러스에 의해 유도된 종양(FBL-3, RMA, MBL-2, RBL-5)에 대한 우성 항원인 MuLV의 gag이다. 상기 우성 에피토프는 그의 번역을 위한 개시 코돈으로 비통상적인 CUG를 이용한 gag 유전자(gPr75gag)의 대안적인 번역된 더 큰 산물의 리더 펩티드(leader peptide)로부터 유래된다. FBL-3 또는 RMA-S/DC 융합 세포는 종양-특이적 T 세포 면역을 유도하나, TAP-결핍 RMA 세포(RMA-S)는 그렇지 못하다. CUG에서의 개시는 gPr75gag 단백질의 N-말단 아미노산으로 Leu을 가져온다. Leu은 타입 1 일차 불안정화 잔기(type 1 primary destabilizing residue)이고 그들의 합성 후에 유비퀴틴-프로테아솜 경로에 의해 매개되는 빠른 분해를 거치게 된다.
gPr75gag의 분해가 차단되는 경우, gag-특이적 T 세포가 감작(prime)될 수 있다는 것을 입증하기 위해, 5 μM MG 132의 프로테아솜 억제제에 의한 처리와 함께 또는 프로테아솜 억제제에 의한 처리 없이 24시간 동안 마우스에 RNA 종양 세포(천만 개)를 주사하였다. 7일 후에, 비장 세포를 6시간 동안 ER/골지(Golgi) 차단제(브레펠딘 A)의 존재 하에 관련없는(irrelevant) Db 결합 펩티드 또는 gag의 우성 에피토프로 재자극하였다. 그 후, CD8 T 세포에 의해 생성된 세포내 IFN-γ의 백분율을 CD3, CD8, 및 IFN-γ에 대한 항체에 의한 세포내 염색 및 유동 세포측정법에 의해 결정하였다.
프로테아솜 억제제 처리가 없는 경우, RMA 면역화된(immunized) 마우스로부터 유래된 CD8 T 세포는 단지 백그라운드 수준(0.44%)의 IFN-γ를 생성한 반면, MG 132에 의한 처리는 백그라운드(0.29%)보다 훨씬 더 높은 백분율(1.74%)의 IFN-γ-생성 세포를 유도했다. 따라서, 종양 세포(또는 표적 병원체로 감염된 세포)의 프로테아솜 기능을 억제하는 것은 단수명 단백질(예를 들면, DRiP 및 SLiP)의 분해를 감소시키거나 방지하고, 그에 의해 인 비보에서 그들의 효율적인 교차-제시를 촉진할 수 있다.
실시예 5
교차-제시에서 자가포식의 역할
본 실시예는 교차-제시에서 자가포식의 역할을 입증하기 위해 사용된 방법을 설명한다.
V-GFP-TfR-OVA를 발현하는 293T 종양 세포를 실시예 2에 기재된 바와 같이 처리하고, 방사선 조사(15,000 rad) 후 인 비트로에서 교차-제시를 위한 항원의 원천(source)으로 사용하였다. 백만 개의 종양 세포를 OVA 단백질로부터 유래된 펩티드를 인식하는 OT-I 형질전환 마우스로부터의 CFSE-표지된 원형의 T 세포의 첨가 전 6시간 동안 이백만 개의 DC와 인큐베이션시켰다. CFSE 표지의 희석에 의해 표시된 OT-I 분획(division)을 판독(readout)으로 이용하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 보다 많은 DRiP를 축적시키기 위해 벨케이드를 포함시켰는지 여부에 관계없이, 교차-제시는 종양 세포의 3-MA 처리에 의해 크게 단축되었다. 대조적으로, 자가포식 유도제인 라파마이신은 웨스턴 블롯(실시예 2)에 의해 검출된 항원 수준은 무처리 대조구 세포의 항원 수준보다 훨씬 낮았으나, 종 양 세포의 교차-제시를 크게 증가시켰다. NH4Cl은 단백질 수준을 증가시키고 교차-제시의 적당한(moderate) 증가를 유도했다. NH4Cl의 존재 하에 라파마이신은 최고-수준의 교차-제시를 유도했으나, 항원 수준은 최저인 것으로 관찰되었다.
이 결과는 종양 세포(또는 표적 병원체에 의해 감염된 세포)의 자가포식 활성이 교차-제시에 관여된다는 것을 나타낸다.
따라서, DRiP 및 SLiP는 프로테아솜 및 자가포식 시스템 모두에 의해 분해될 수 있고, 그들의 교차-제시는 프로테아솜 활성을 감소시키고 자가포식을 증가시키는 것에 의해 증가될 수 있다.
실시예 6
DRibble 은 분비성 자가포식체이다
본 실시예는 DRibble이 세포로부터 분비된 자가포식체(autophagy body)라는 것을 입증하기 위해 사용된 방법을 설명한다. 전술된 실시예에 기재된 바와 같이, 세포를 프로테아솜 억제제와 인큐베이션하면 자가포식을 유도하고, DRibble의 크기 및 형태는 능동 자가포식(active autophagy)를 수행하는 세포에서 발견되는 자가포식소체(autophagosome)와 유사하다.
293T 종양 세포를 Ub-M-GFP-OVA, GFP- LC3 융합 단백질, 또는 GFP-LC3 및 tdTomato-Ub 단백질을 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 24시간 후에 1 μM 벨케이드로 처리하였다. 형광 현미경을 이용하여 DRibble 내의 항원 또는 자가포식 막(autophagy membrane)을 가시화하기 위해 GFP-OVA 또는 GFP-LC3 융합 단백질을 사용하였다. GFP-LC3와 tdTomato-Ub 융합 플라스미드의 동시-형질감염(co-transfection)을 이용하여 LC3이 장식된(decorated) DRibble 내부에 유비퀴틴화된 DRiP의 축적을 가시화하였다.
벨케이드 처리는 GFP- OVA 또는 GFP-LC3에 대해 양성인 세포-관련 점(cell-associated punctate positive for GFP- OVA or GFP-LC3)의 형성을 가져왔다. 이와 같은 점 구조물의 다수는 유리된(free) 입자이거나 또는 세포에 느슨하게 부착되었다. tdTomato-Ub(dsRED 형광 단백질의 오렌지색 변이체)를 사용하여 유비퀴틴화된 단백질을 태깅하고, 유비퀴틴화된 단백질은 GFP-LC3 양성 소포에 캡슐화되는 것으로 발견되었다. 이 결과는 DRibble이 분비성 자가포식세라는 것을 나타낸다.
웨스턴 블롯 분석에 의한 DRibble 단백질의 특성 규명도 DRibble이 유비퀴틴화된 단백질을 포함하는 분비성 자가포식체라는 것을 나타낸다. 벨케이드 처리 후에 GFP-OVA 융합 단백질의 상이한 버전을 발현하는 293T 세포주로부터 생성된 DRibble로부터 용해물(10 ㎍)을 준비하였다. 상기 용해물을 GFP, LC3, 칼레티큘린(calrecticulin), HSP90α(세포질), 및 유비퀴틴에 대한 항체로 탐색하였다.
벨케이드 처리는 DRibble 내에 다량의 GFP-OVA 융합 단백질을 초래했다. 보다 많은 양의 융합 단백질의 짧은 단편이 벨케이드로 처리된 세포로부터 생성된 DRibble에서 발견되었다. 항-Ub 항체로 검출되는 바와 같이, 다른 유비퀴틴화된 단백질도 존재했다. DRibble이 자가포식체라는 견해와 일치하여, 가공된 LC3-II 단백질만이 DRibble의 용해물로부터 검출되었다. 또한, HSP90α, HSP94(Grp94), 및 칼레티큘린이 DRibble에서 검출되었다.
요약하면, 프로테아솜 기능과 자가포식의 활성화의 지속된 억제는 완전한 단백질, DRiP, HSP90, 칼레티큘린, 유비퀴틴화된 단백질, 및 가공된 LC3-II를 포함하는 자가포식체(DRibble)의 분비를 초래한다.
실시예 7
수지상 세포는 DRibble 을 흡수하고 염증유발성 시토킨
( proinflammatory cytokine )을 분비한다.
본 실시예는 DC에 의한 분리된 DRibble의 흡수 및 그와 같은 DC에 의해 생성된 시토킨의 분석을 수행하기 위해 사용된 방법을 설명한다.
Flt3 리간드 및 GM-CSF를 코딩하는 플라스미드 DNA의 수력학적 주사(hydrodynamic injection)에 의해 DC를 생성하였다. 1일 차에 마우스에 2 ml HBSS에 담긴 Flt3 리간드를 코딩하는 플라스미드 DNA 2 ㎍을 정맥내로 주사하고 뒤이어 10일 뒤에 GM-CSF를 코딩하는 플라스미드 DNA의 동량을 정맥내로 주사하였다. 15일 차에 주사된 마우스의 비장으로부터 DC를 채취하였다. 통상적으로, 비장 세포의 30-50%가 DC였다(CD11c 및 MHC II 양성).
실시예 1에 기재된 방법을 이용하여 293T 세포로부터 DRibble을 제조하였다. DRibble(3 ㎕/ml)을 1 x 106개의 DC 세포와 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 일부 실시예에서, 단독의 또는 IFN-γ(100 ng/ml)와 조합된, 10 ㎍/ml의 항-CD40 항체를 상기 DC 세포와 인큐베이션시켰다. ELISA를 이용하여 결과물인 DRibble-적재된 DC를 시토킨 분비에 대해 분석하였다.
DRibble은 투여량-의존적 방식으로, IL-6 및 IL-12 p40을 분비하도록 DC를 자극하였으나(도 4), IL-10 및 IL-12 p70에 대해서는 그렇지 않았다. IL-12 p70은 항-CD40 항체(10 ㎍/ml) 및 IFN-γ(100 ng/ml) 모두의 존재 하에 DRibble 자극된 DC에 의해서만 생성되었다. 종양 세포 또는 형질감염된 종양 세포로부터 유래된 소포/DRibble의 흡수(ingestion) 후 DC에 의한 IFN-α 및 IL-12 p40의 생성은 자연적인 감염을 모사(mimic)하는 방식을 나타낸다. 실험 결과는 또한 DC에 의한 DRibble의 세포내이입이 칼레티큘린/LRP 상호작용을 이용할 수 있다는 것을 나타낸다.
요약하면, DRibble은 염증유발성 시토킨을 분비하도록 DC를 활성화시키고 제거제 수용체(scavenger receptor)를 통해 DC에 의해 내재화될 수 있다. DC에 의한 IL-12 p70의 생성은 항-CD40 항체 및 IFN-γ로 조절될 수 있다. 또한, TRP-1 TCR 형질전환 T 세포 또는 α-GalCer을 갖는 NKT 세포로부터의 강력한 동종의 보조(cognate help)를 제공하는 작용제가 시토킨 생성을 강화하기 위해 이용될 수 있다.
실시예 8
DRibble 은 교차-제시를 위한 항원의 원천을 제공한다.
본 실시예는 DRibble과 전종양 세포(whole tumor cell)의 인 비트로 및 인 비보에서 교차-제시를 위해 항원을 제공하는 능력을 비교하기 위해 사용된 방법을 설명한다.
Sumo-M-OVA, gplOO, 또는 TRP-1을 발현하는 293T 세포를 24시간 동안 0.05 μM 벨케이드로 처리하여 DRibble을 생성하고 실시예 7에 기재된 방법을 이용하여 DC에 적재하였다. 비교를 위해, 적재된 DRibble의 양은 DC 상에 적재된 종양 세포와 동일한 수로부터 유도하였다. OVA 및 gplOO 단백질, 또는 TRP-1 펩티드를 양성 대조구로 이용하였다. DC 단독(CM) 및 GFP 벡터를 발현하는 293T 세포로부터 생성된 DRibble을 음성 대조구로 이용하였다. 세척 후에, 입양 면역 전달 후 인 비트로 또는 인 비보에서 OT-I 및 OT-II TCR Tg 마우스(OVA 모델의 경우), pmel-1(gplOO 모델의 경우), 또는 TRP-1 TCR Tg 마우스로부터 유래된 CFSE-표지된 원형의 T 세포를 자극하기 위해 DC를 사용하였다. T 세포의 CFSE 프로파일을 5일차(인 비트로) 및 7일차(인 비보)에 결정하였다.
도 5a에 도시된 바와 같이, DRibble이 적재된 DC는 OT-I, OT-II, pmel-1, 및 원형의 T 세포의 유의성 있는 CFSE 희석을 유도하였으나, 방사선 조사된 전종양 세포는 그렇지 않았다. 또한, TRP-1 플라스미드 DNA로 형질감염된 293T 세포로부터 유래된 DRibble은 TRP-1 흑색종 항원에 특이적인 TCR을 갖는 형질전환 마우스로부터의 CD4 원형의 T 세포의 증식을 촉진할 수 있었다.
도 5b에 도시된 바와 같이, GFP 벡터로 형질유도된 293T 세포로부터 생성된 DRibble로 적재된 DC 또는 DC 없이 DRibble만 포함하는 배양은 완전 배지 대조구 단독(CM)에서 관찰되는 수준 이상의 CFSE 희석을 유도하지 않았고, 이는 DRibble- 유도 T 세포 증식이 항원-특이적이라는 것을 의미한다.
인 비보에서 OVA, 종양 세포, 및 DRibble의 교차-제시의 상대적 효율성을 비교하기 위해, 형질전환 OT-I 원형의 T 세포를 CFSE로 표지하고 입양적으로(adoptively) B6 마우스에 전달하고, 그 후, 마우스를 OVA(10 ㎍/ml)가 적재된 DC, 종양 세포(종양: DC = 3:1). M-OVA를 발현하는 293T 세포로부터 제조된 DRibble(10 ㎕ = 106개의 세포 = 5 ㎍ 총 단백질)로 백신 접종하였다. 백신 접종 후 7일 차에, CFSE 희석은 DRibble이 인 비보에서 원형의 OT-I T 세포의 분열을 유도하기 위해 적어도 OVA 만큼 우수하고, 종양 세포보다 더 우수하다는 것을 보여주었다(도 5b).
OT-I 및 pmel-I 모델에 의한 교차-제시 분석에서 DRibble 및 정제된 OVA 단백질의 효율성을 비교하기 위해 역가측정(titration)을 수행하였다. 105개의 종양 세포 또는 0.5 ㎍/ml의 총 단백질과 동등한 1 ㎕/ml의 DRibble이 적재된 DC는 1 ㎍/ml 정제된 OVA 단백질보다 훨씬 더 우수했다. 형질유도된 293T 세포의 전체 용해물에서 OVA의 양은 106 개의 세포당 약 10 ng이었다. DRibble 내의 OVA의 절대량은 1 ng/㎕ DRibble을 초과하지 않을 것이다. 1 ㎕의 DRibble이 1 ㎍의 가용성 OVA 단백질보다 우수했기 때문에, DRibble은 교차-제시를 위한 항원의 원천으로서 가용성 OVA보다 1000배 이상 효율적이었다. gplOO/pmel-1 시스템에서, 3 ㎕의 DRibble(이 DRibble 제제에서 0.6 ㎍의 단백질)은 원형의 pmel-1 T 세포의 증식을 촉진하는데 있어서 3 ㎍의 재조합 gplOO 단백질만큼 우수했다. 흑색종 항원으로 형질감염된 세포로부터 분리된 DRibble은 또한 흑색종-특이적 T 세포를 자극하기 위해 전종양 세포 또는 재조합 단백질보다 더 우수한 것으로 발견되었다.
요약하면, CD4 및 CD8 T 세포 모두에 대해, DRibble의 교차-제시는 전종양 세포 또는 정제된 단백질보다 더 효율적이었다.
실시예 9
GM - CSF 를 이용한 T 세포의 민감화( sensitization )
본 실시예는 원형의 종양-반응성 T 세포를 실시예 1에서 생성된 DRibble을 이용하여 DRibble-적재된 DC로 민감화시키는 방법을 설명한다.
골수 유래 수지상 세포(DC)를 하기와 같이 제조하였다. C57BL/6(H-2b) 마우스로부터 유래된 골수 세포를 이전에 공개된 프로토콜(J. Exp. Med. 176(6): 1693 -70, 1992)에 따라 과립구-콜로니 자극 인자(GM-CSF) 함유 완전 배지(complete media)에서 배양하였다. 요약하면, 골수의 단일 세포 현탁액(single cell suspension)을 마우스의 대퇴골(femur)로부터 준비하고 세균용 페트리 디쉬(Petri dish)에서 50 ng/ml의 재조합 쥐(murine) GM-CSF(PeproTech)를 포함하는 완전 배지 1 ml 당 백만 개의 세포로 배양하였다. 3일차 및 6일차에, 신선한 GM-CSF 보충된 배지를 상기 디쉬에 첨가하고 통상적으로 50% 이상이 CD11c+ 수지상 세포인 비부착성(nonadherent) 세포 및 느슨하게 부착된 세포를 9일차에 채취하고 사용시까지 액체 질소에서 천만 개의 세포 분획으로 동결시켰다. 일반적으로, 이 방법에 의해 생성된 DC는 MHC II 및 공동자극성(costimulatory) 분자(CD80 및 CD86)의 발현에 대한 유동 세포측정법 분석에 의해 판단되는 바와 같이 미성숙(immature) DC 및 성숙 DC를 포함할 것이다.
원형의 종양-반응성 T 세포를 하기와 같이 DRibble-적재된 수지상 세포로 민감화시켰다. 동결된 DC를 해동시키고 완전 배지(CM) ml 당 2백만 개의 세포로 배양하였다. DC에 DRibble을 적재하고 동시에 10 ㎕/ml의 DRibble, 50 ng/ml GM-CSF, 및 1 ㎍/ml의 MPL(모노포스포릴 리피드 A, 리피드 A의 무독성 유도체)를 첨가하여 6시간 동안 활성화시켰다. 대조구로서, 또 다른 그룹의 DC를 방사선조사된 F10 종양 세포(2 x 106 DC 및 4 x 106 FlO 세포)와 6시간 동안 인큐베이션시켰다.
그 후, DC(2백만 개)를 세척하고 2-3일 동안 직립된(up-right) 위치의 배양 튜브에 담긴 10 ml의 CM에서 원형의(naive) 마우스로부터 유래된 2천만 개의 비장 세포를 자극하기 위해 이용하였다. 원형의 비장 세포를 골수 유래 DC 단독, 또는 F10 종양 세포와 예비-인큐베이션된 DC, 또는 F10 종양-유래 DRibble(2xlO6 DC 및 10 ㎍ DRibbles, 4xlO6 FlO 균등량)로 2일간 자극하였다. 그 후, 상기 배양 튜브를 원심분리시키고 세포를 HBSS로 1회 세척하였다. 세척 후에, 10 ng/ml IL-7 및 5 ng/ml IL-15를 포함하는 신선한 CM을 세포에 첨가하여 수평 위치로 상기 민감화된 T 세포를 3 내지 6일간 더 증식시켰다. 동일한 양의 IL-7 및 IL-15를 포함하는 신선한 배지를 필요한 경우, 3일차에 첨가하였다.
실시예 10
Flt3 을 이용한 T 세포의 민감화
본 실시예는 Flt3 리간드를 이용하여 DC를 생성하기 위해 사용될 수 있는 방법을 설명한다. 본 방법은 실시예 9에 기재된 방법에 대한 대안으로 사용될 수 있다. DC는 Flt3 리간드와 GM-CSF를 코딩하는 플라스미드 DNA의 수력학적 주입에 의해 생성하였다. 1일 차에 포유동물에 2 ml HBSS에 담긴 Flt3 리간드를 코딩하는 플라스미드 DNA 0.5-100 ㎍(예를 들면, 1-20 ㎍)을 정맥내로 주사하고 뒤이어 10일 뒤에 GM-CSF를 코딩하는 플라스미드 DNA의 동일한 양을 정맥내로 주사하였다. 15일 차에 DC를 예를 들면, 주사된 포유동물의 비장으로부터 채취할 수 있었다.
Flt3 리간드로 생성된 DC는 4개 이상의 주요한 집단을 포함한다(CDl1b+ 골수성 DC, B220+ pDC, CD8+ 림프구성 DC, 및 미지의 트리플 네가티브(triple negative) DC). 인 비트로 교차-제시 분석법에서, 4종의 상이한 서브세트의 DC 모두에 의해 DRibble이 교차-제시되었으며, 그들은 모두 효율적으로 OT-I 및 OT-II를 자극했다.
어느 서브세트의 DC가 인 비보에서 교차-제시를 담당하는지를 결정하기 위해, DiD 표지된 OVA-DRibble을 원형의 마우스에 피내로(i.d.) 투여했다. 24시간 후에, 흘러나오는 림프절을 채취하여 이를 대상으로 CDl1c, CDl1b, B220, CD8, F4/80, CD40, 및 CD80에 대한 항체로 다색 유동 세포측정법(multiple color flow cytometry)을 수행하였다. Dako CyAm 유동 세포측정기(flow cytometer)를 이용하여 Flt3 리간드에 의해 생성된 상이한 서브세트의 DC를 조사하기 위해 9색 패널을 사용할 수 있다. DiD 양성 DC를 분류하여 인 비트로에서 OT-I 및 OT-II T 세포를 자극하기 위해 사용하고 분리 후 그들의 교차-제시 능력을 확인할 수 있다. 대조구 293T DRibble이 주사된 마우스로부터의 DC를 음성 대조구로 사용할 수 있다.
실시예 11
DRibble -자극되고 증식된 T 세포의 종양-특이적 반응
본 실시예는 DRibble-자극되고 증식된(expanded) T 세포에 대한 종양-특이적 반응을 측정하기 위해 사용된 방법을 설명한다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 IFN-γ를 측정하는 다른 방법들이 사용될 수 있고, 면역 반응의 다른 지표들이 측정될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
IFN-γ의 종양-특이적 생성을 측정하기 위해, DRibble-표지된 DC(실시예 9 참조)에 의해 자극되고 증식된 T 세포(2 x 105)를 24시간 동안 방사선 조사된 종양 세포(3,000 - 30,000개의 세포)로 재자극하였다. 종양 세포들은 F10 흑색종, 루이스 폐 종양(3LL), MCA 섬유육종, 또는 마우스 전립선 육종 세포(MPR4 및 3)를 포함했다. 복수 개의 종양 세포가 사용된 테스트에서, 104개의 종양 세포를 사용하였다(도 7a 및 7b). F10 및 3LL 세포에서 MHC 클래스 II 발현을 유도하기 위해, 종양 세포를 MHC 클래스 II 트랜스액티베이터(transactivator)(CIITA)를 포함하는 플라스미드 또는 레트로바이러스 벡터로 형질감염시켰다. CM으로만 배양된 T 세포를 대조구로 사용하였다. 재자극은 96 웰 플레이트에서 3배수의(triplate) 웰에서 수 행하였다. 예를 들면, 105개의 T 세포를 200 ㎕의 CM에 담긴 104개의 종양 세포와 혼합하고 18시간 동안 배양하였다. 상층액을 회수하고 ELISA(ebioscience, CA)에 의해 IFN-γ의 수준을 결정하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, 흑색종 DRibble이 적재된 DC는 인 비트로에서 종양 CD8 T 세포를 유도한다. DC가 아포토시스체(apoptotic body), 엑소솜, 및 종양 세포의 동결/해동된 용해물 대비 DRibble과 인큐베이션되었을 때 최고 수준의 T-세포 활성화가 유도되었기 때문에, 이는 DRibble이 교차-제시를 위한 전구체를 포함한다는 것을 나타낸다.
도 7a 및 7b에 도시된 바와 같이, F10 종양 세포로부터 유래된 DRibble이 T-세포 자극을 위해 사용된 경우 F10 세포의 존재 하에 IFN-γ의 강력한 생성이 관찰되었으나, 다른 종양 세포의 경우에는 그렇지 않았기 때문에(도 7a), 이 효과는 종양-특이적이었다. 반대로, 3LL 종양 세포로부터 유래된 DRibble은 3LL-특이적 T 세포만을 자극하고 증식시켰다(도 7b).
실시예 12
DRibble -적재된 수지상 세포의 투여 후 종양 퇴행
본 실시예는 종양을 가진 포유동물에 대한 DRibble-적재된 DC 투여의 인 비보 효과를 보여주기 위해 사용된 방법을 설명한다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 다른 종양에 대해, 또는 다른 포유동물을 치료하기 위해 유사한 방법들이 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 포유동물에게 DRibble-적재된 DC 대신 DRibble을 투여하기 위해 유사한 방법이 사용될 수 있다.
DRibble-적재된 수지상 세포에 의한 백신 접종의 치료적 효능을 입증하기 위해, 피하 종양 모델(subcutaneous tumor model)을 이용하였다. 유선(mammary gland) 부근에 피하로(s.c.) 4 x 105개의 배양된 3LL 종양 세포가 접종된 원형의 C57BL6 마우스를 4개의 그룹으로 분류하였다(각 그룹당 5 마리의 마우스). 대조구 마우스에는 3일 차에 복막 내로(i.p.) 5 mg/kg의 도세탁셀(docetaxel)을 투여하고; 제2 그룹의 마우스는 3일 차에 도세탁셀(5 mg/kg i.p)을 투여하고, 5일 차에 마우스 GM-CSF를 생성하는 방사선조사된 3LL 종양 세포를 피하로 투여하였으며(2 x 106개의 세포, 1 ㎍ GM-CSF/106개의 세포/24 시간); 제3 그룹에는 3일 차에 도세탁셀(5 mg/kg i.p)을 투여하고 5일 차에 1 ㎍/mL MPL로 6시간 동안 활성화된 2 x 106개의 3LL 종양 세포로부터 유래된 DRibble이 적재된 2 x 106개의 수지상 세포를 피하로 양 옆구리(flank)에 투여하였고(부위당 백만 개씩); 제4 그룹은 제3 그룹과 동일한 백신을 투여하고 5일 차에 추가적인 항-CD4 고갈 GM-CSF-생성 항체를 투여하였다.
주사된 3LL 세포의 투여량에서, 통상적으로 접종 후 5-7일 차에 종양이 촉지되었다(palpable). 2 내지 3일 간격으로 디지털 캘리퍼(caliper)를 이용하여 종양 성장을 측정하였다. 종양의 최대 길이(dimension)에 최소 길이를 곱하여 종양 면 적을 계산하였다.
도 8a에 도시된 바와 같이, 3LL-DRibble이 적재된 DC는 CD4의 보조와 함께 또는 그 보조 없이 완전한 종양 퇴행을 유도하였고, GM-CSF 유전자 변형 전종양 세포 백신은 훨씬 더 낮은 효능을 보였다(종양 성장을 지연시킬 수만 있었다). 생존 마우스는 또한 제2의 종양 투여(challenge)를 견뎌냈고; CD8 T 세포는 보호를 매개하는 주요한 작동(effector) T 세포로 확인되었다.
DRibble의 효과가 특이적이고 종양의 전이를 감소시킬 수 있다는 것을 입증하기 위해, 파종(disseminated) F10 흑색종을 갖는 마우스에 F10 DRibble 또는 3LL DRibble이 적재된 DC를 투여하였다. C57B6 마우스에 2 x 105개의 FlO 흑색종 세포를 정맥내로 투여하였다. 정맥내 주사 후 FlO 흑색종 세포를 전신에 파종시켰다. 신장, 장, 림프절, 흉벽, 난소, 및 폐에서 전이가 발견되었다. 4일 후에, F10 또는 3LL로부터 유래된 DRibble이 적재된 DC(2 x 106개의 DC 세포)를 정맥내로 투여하였다. 도 8b에 도시된 바와 같이, F10 DRibble의 투여는 이 기관들에서 전이의 형성을 유의성있게 감소시켰으나, 3LL DRibble은 그렇지 않았다(폐 및 전체 전이에서의 차이는 유의성 있었다, t-검정에 의한 p<0.05). 이 데이터는 DRibble-유도 반응이 종양-특이적이라는 것을 보여준다.
요약하면, DRibble-적재된 DC의 투여는 전종양 백신보다 더 효율적으로 종양 퇴행을 매개할 수 있다. DRibble(예를 들면, 10-100 ㎍ DRibble)의 투여는 종양 퇴행을 매개하고 생존 시간을 증가시킬 것으로 예상된다. DRibble의 효능을 증가 시키기 위해, DRibble 또는 DRibble-적재된 DC 세포의 최적 투여량은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 관용적인 방법을 이용하여 파악될 수 있을 것으로 예상된다.
실시예 13
DRibble -적재된 DC에 의한 진행 종양의 치료
본 실시예는 진행 종양(advanced tumor)을 치료하기 위해 사용된 방법을 설명한다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 포유 동물에서 다른 진행 종양을 치료하기 위해 유사한 방법이 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 포유동물에 DRibble-적재된 DC 대신 DRibble을 투여하기 위해 유사한 방법들이 사용될 수 있다.
보다 진행된 종양 부하(burden)를 갖는 마우스를 치료하기 위해, 3LL 세포(5 x 104개의 세포)의 투여 후 6-9일 후, 마우스를 4개의 상이한 그룹으로 분류하였다(그룹당 6-7 마리의 마우스). 대조구 그룹인 그룹 1 (3LL/단독)에는 아무런 치료제를 투여하지 않았고, 그룹 2에는 150 ㎍의 항-OX40 항체(항-폐암 작용제로 사용된 OX40을 인식하는 항체, 예를 들면, Kjaergaard et al., J. Immunol. 167:6669-77, 2001 참조)를 투여하고, 그룹 3에는 3LL-DRibble-적재된 수지상 세포를 투여하였으며, 그룹 4에는 백신접종 직후에(백신 유도 면역 반응을 촉진하기 위해) 3LL-DRibble 적재된 수지상 세포 + 150 ㎍ 항-OX40 항체를 투여하였다(i.p.).
도 9에 도시된 바와 같이, 마우스에서 8일령의 확립된 3LL 종양(day 8 established 3LL tumor)은 공동자극성 항-OX40 항체와 조합된, 3LL 세포로부터 유래된 DRibble에 의해 펄스된 DC를 투여받은 마우스에서 퇴행했다. 도 6a-c에 도시된 바와 같이, DRibble-적재된 DC의 투여는 6일령의 확립된 종양을 갖는 마우스의 절반(6마리 중 3마리)을 치료했고 9일령의 종양을 가진 6마리의 마우스 중 한 마리를 치료했다. 또한, DRibble + 항-OX40 항체(12일차 종양 모델)로 처리된 마우스에서 12일령의 확립된 3LL 종양은 7마리의 마우스 중 6마리에서 종양을 제거하는데 효과적이었다(도 10d).
B6 마우스에 피하로(s.c.) 2 x 105 개의 3LL 세포를 주사하였다. 종양 주사 후 12일 차에, DRibble-적재된 DC 세포(2 x 106 개의 종양 세포와 동등량), 골수 유래 DC에 적재된 CpG 및 폴리 I:C(2.5 ㎍/ml) (1 xlO6/ml, 37℃에서 6시간)에 의해 마우스에 백신 접종을 수행하였다. CpG 및 폴리 I:C는 각각 TLR9 및 TLR3을 활성화시켰다. Balb/c 마우스에 피하로 2 x 105 EMT-6 세포(유선암종)를 주사하였다. 종양 주사 후 7일차에 탁소테르(Taxotere)(5 mg/kg)를 마우스에 투여하였다. 8일 차에, 마우스에 아무런 처치를 하지 않거나(대조구); 100 ㎍ 항-마우스 OX40 항체; EMT-6 종양 세포(2 x 106 세포)로부터 유래된 DRibble이 적재된 DC; 또는 EMT-6 종양 세포로부터 유래된 DRibble이 적재된 DC + 항-OX40 항체의 조합을 투여하였다.
도 11a-g에 도시된 바와 같이, DRibble-적재된 DC를 투여한 진행 종양을 갖 는 마우스는 백신을 투여받지 않는 대조구 마우스에 비해 유의성 있게 연장된 생존을 보였고(p<0.05)(Kaplan-Meier 플롯 및 로그 랭크 합 검정(Log rank sum test)) 약 20%의 마우스를 치료했다. 각각 폴리 I:C 및 CpG의 세포내 표적화에 의한 TLR 3 및 TLR 9의 동시 유발(concurrent triggering)은 통상적인 DC에 의한 IL-12 및 IFN-α의 생성을 초래했으나, 또한 종양 세포로부터 유래된 종양-관련 항원의 보다 효율적인 항원-제시를 가져왔다.
실시예 14
Dribble 및 PD-1 억제제에 의한 종양의 치료
본 실시예는 DRibble(예를 들면, DRibble을 생성하는 처리된 세포, 분리된 DRibble 단독, 또는 DRibble-적재된 DC로서) 및 PD-1 신호전달을 감소시키거나 또는 억제하는 작용제의 투여에 의해 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있는 방법을 설명한다. 특정한 실시예에서, 종양은 크거나 또는 잘-확립된 종양이다. PD-1 신호전달의 특정한 억제제가 기재되었으나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 PD-1, PD-1Ll, 및 L2에 특이적인 siRNA 분자와 같은 다른 작용제들이 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
전술된 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, DRibble-기반 조성물은 T-세포 매개 항종양 면역을 유도하는데 있어서 전종양 세포 백신보다 탁월하다. DRibble-기반 백신이 단독으로 소형 종양(small tumor)의 퇴행을 매개했으나, 대형의 확립된 종양은 지연되기만 했고, 낮은 비율의 마우스들만이 완치되었다(실시예 13 참조). 이는 종양 또는 예를 들면, PD-1 리간드와 같은 간질 세포의 발현과 같은, 종양 미세환경(microenvironment)의 면역 억제 메카니즘으로부터 유래될 수 있다. 종양 부위에서 PD-1의 억제성 역할과 일치하여, 대형의 확립된 FlO 종양으로부터 분리된 세포(종양 세포, 간질 섬유아세포, 및 APC 포함)은 높은 수준의 PD-1Ll (B7H1)을 발현했다. 종양 소화물(tumor digest)의 대부분의 세포들은 낮은 수준의 PD-1L2(B7H1)를 발현했으나, 작은 서브세트의 세포들(이들은 종양-관련 수지상 세포 또는 대식세포일 것임)은 높은 수준의 PD-1L2를 발현했다.
PD-1, PD-1Ll, 및 L2에 대한 항체는 PD-1 신호전달을 차단하기 위해 이용될 수 있다. 10-12일령의 확립된 F10 종양(종양은 약 50-100 mm2일 것임)을 갖는 마우스를 방사선조사하고 실시예 8에 기재된 바와 같이, pmel-1 및 TRP-1 TCR T 세포로 입양적으로 전달하고 gp100 및 TRP-1 단백질을 발현하는 293T 세포로부터 유래된 DRibble을 (예를 들면, 피하로 또는 피내로) 투여하였다. 백신 접종을 3일 및 6일 후에 반복하고, 마지막 백신 접종 후 3일차에 항체를 복막 내에 투여하였다. 혈액 내에서 pmel-1 및 TRP-1 TCR T 세포의 수를 모니터링하고 펩티드 자극 및 세포내 염색에 의해 IFN-γ를 생성하는 그들의 능력을 측정하였다. 종양을 채취하고 소화시킨다. 종양 내의 pmel-1 및 TRP-1 T 세포의 수를 결정하고 IFN-γ를 생성하는 능력을 측정하였다.
PDl 활성을 억제하는 항체(예를 들면, 항-PD-Ll)의 이용은 종양-침윤(tumor-infiltrating) T 세포의 수 및 기능성(functionality)을 증가시키고, 그에 의해 예 를 들면, 생존 시간을 연장하는 것에 의해 종양의 치료를 강화할 것이다. 또한, DRibble 단독 또는 DRibble이 적재된 DC는 종양-보유(tumor-bearing) 마우스에서 pmel-1 및 TRP-1 T 세포의 강한 증식을 유도하고, 그에 의해 종양-보유 마우스의 생존을 유의성 있게 연장시킬 것으로 예상된다.
실시예 15
프로테아솜 억제제 및 자가포식 유도제를 이용한 DRibble 의 생성
본 실시예는 프로테아솜 억제제 및 자가포식 유도제의 존재 하에 DRibble을 생성하기 위해 이용될 수 있는 방법을 설명한다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 다른 종양 세포, 예를 들면, 고형 종양 또는 액체 종양을 갖는 개체로부터 수득된 종양 세포가 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 마찬가지로, 다른 프로테아솜 억제제 및 다른 자가포식 유도제가 사용될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 또한 HIV와 같은 하나 이상의 표적 병원체로 감염된 세포로부터 DRibble을 생성하기 위해 유사한 방법들이 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
실시예 2-5 및 20에 개시된 바와 같이, 프로테아솜 억제제 및 자가포식 유도제에 의한 세포의 처리는 DRiP 및 SLiP의 교차-제시를 강화했고, 이는 그와 같은 접근방식이 DRibble의 수율을 증가시키기 위해 이용될 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들면, NH4Cl에 의한 리소솜 산성화의 차단과 조합된 프로테아솜 억제 후, 자가 포식의 유도는 전종양 세포의 교차-제시 활성을 증가시켰다.
종양 세포(예를 들면, 치료대상 개체에 존재하는 것과 동일한 종류의 종양 세포) 또는 병원체로 감염된 세포를 세포의 최대 생존력을 유지하면서 프로테아솜 활성의 억제를 허용하는 조건 및 자가포식을 유도하는 조건 하에서 프로테아솜 억제제(예를 들면, 가역적 프로테아솜 억제제)의 존재 하에 인큐베이션하였다. 프로테아솜 억제제와 자가포식 유도제에서의 인큐베이션은 순차적으로 또는 동시에 일어날 수 있다. 일 실시예에서, 세포를 자가포식 유도제 전에 프로테아솜 억제제와 인큐베이션시켰다. 또 다른 실시예에서, 세포를 자가포식 유도제와의 인큐베이션 후에 프로테아솜 억제제와 인큐베이션시켰다.
일부 실시예에서, 리소솜 매개 단백질 분해도 억제되었다(예를 들면, 1OmM NH4Cl에 의해). 일부 실시예에서, 세포를 또한 카스파아제(capase) 활성화의 억제제와 같은, 아포토시스를 감소시키거나 또는 억제하는 작용제의 존재 하에 인큐베이션하였다. 팬-카스파아제 억제제(pan caspase inhibitor)(Z-VAD-fmk, 예를 들면, 5 μM)가 프로테아솜 억제제의 존재 하에 카스파아제 활성화를 억제하기 위해 사용될 수 있다.
대표적인 조건은 세포를 6-48 시간 동안 20 nM 이상의 벨케이드(예를 들면, 20-1000 nM의 벨케이드)와 인큐베이션하는 것을 포함한다. 상기 인큐베이션 전에, 그 동안 또는 그 후에, 상기 세포를 자가포식을 유도하는 조건, 예를 들면, 1 nM - 100 nM 라파마이신, 10-1000 U/ml IFN-γ, 또는 5-100 mg/체중 kg의 빈블라스틴 술 페이트와의 야간(overnight) 인큐베이션, 또는 영양 고갈(예를 들면, HBSS) 하에서 인큐베이션시켰다. 특정한 실시예에서, 세포를 6시간 이상(예를 들면, 48시간 이상) 프로테아솜 억제제의 존재 하에 인큐베이션하고, 뒤이어 자가포식을 유도하기 위해 야간 영양 기아(overnight nutrient starvation) 상태로 인큐베이션시켰다. 또 다른 실시예에서, 세포를 프로테아솜 억제제(예를 들면, 벨케이드)의 첨가 전에 2시간 동안 HBSS(영양 기아)에서 인큐베이션하였다(24-48시간의 총 인큐베이션).
처리된 세포를 개체에게 직접 투여할 수 있다. 대안적으로, 결과물인 DRibble을 예를 들면, 실시예 1 또는 16에 기재된 원심분리 방법을 이용하여 분리하고, 개체에 투여하거나 또는 엑스 비보로 APC 세포를 자극하기 위해 이용할 수 있다.
실시예 16
구배 초원심분리( Gradient Ultracentrifugation )에 의한 DRibble 의 분리
본 실시예는 종양 세포 또는 병원체로 감염된 세포와 같은 세포로부터 DRibble을 분리하기 위해 이용될 수 있는 구배 초원심분리 방법을 설명한다. 특정한 실시예에서, 그와 같은 방법은 분별 원심분리(differential centrifugation)를 이용하여 수득된 것보다 더 순수한 DRibble의 집단을 생성한다.
Dribble을 침전시키고 결과물인 침전물을 예를 들면, 균질화된 세포로부터 자가포식소체를 정제하는 방법을 이용하여, Percoll 콜로이드 밀도 구배에서의 초원심분리에 의해 분리하였다(Stromhaug et ah, Biochem. J., 335(Pt 2), 217-24, 1998). 요약하면, 하나 이상의 프로테아솜 억제제에 의한 처리(예를 들면, 6-48시간 동안 1 μM의 벨케이드) 후에, 세포(예를 들면, 표적 종양 세포 또는 표적 병원체로 감염된 세포)의 투명한 상층액(cleared supernatant)으로부터 고속 원심분리에 의해 DRibble을 침전시켰다. 일부 실시예에서, 세포를 자가포식을 유도하거나, 리소솜 산성화를 차단하거나, 아포토시스를 감소시키는 작용제 또는 그의 조합과 같은, 다른 작용제와 함께 인큐베이션시켰다. 침전물을 PBS로 2회 세척하고 5 ml의 PBS에 재현탁시키고 PBS에 담긴 22.5% Nycodenz(1.127 g/ml) 7 ml 위에 놓인, PBS에 담긴 33% Percoll 21 ml의 비연속적 구배 상에 층상으로 배치하고 SW28 로터에서 72,000g로 30분간 원심분리하였다. 자가포식체는 하부 인터페이스에서 밴드를 형성하고, 아포토시스체 또는 분비된 미토콘드리아는 튜브의 바닥에 침전될 것이다. ER 및 원형질막의 파편과 같은 다른 가벼운 막은 상부 인터페이스에서 밴드를 형성할 것이다. DRibble은 하나 이상의 프로테아솜 억제제의 존재 하에 세포로부터 분비된 자가포식체인 것으로 예상되는 바와 같이, 일부 실시예에서, 자가포식체를 분리하였다(그 후, 본 명세서에 개시된 방법에서 사용할 수 있다).
세 개의 분획으로부터의 동량의 단백질을 대상으로 GFP(항원용 마커), LC3(자가포식소체 마커), HSP90 및 GAPDH(세포질 hsp 및 효소), 칼레티큘린 및 Grp94(ER hsp), Grp78(미토콘드리아 hsp), ly-HSP73 및 카텝신 B(리소솜 hsp 및 프로테아제), 및 프로테아솜 서브유닛(2OS 및 19S) 및 프로테아솜 활성제(REG 및 PA200)에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 수행하였다. 전체 세포 용해물로부터의 동량의 단백질을 이용하여 특정한 성분의 농축(enrichment) 여부를 결정하였다.
또한, 상기 세 개의 분획 각각을 교차-제시 활성이 자가포식체의 분획에서만 발견되는지 여부를 결정하기 위한 교차-제시 분석법의 항원의 원천으로 이용할 수 있다.
실시예 17
전세포 종양 면역자극제
본 실시예는 DRibble 또는 DRibble-적재된 DC 세포의 대안으로(또는 이에 추가하여) 사용될 수 있는 전세포 면역자극성 조성물을 생성하기 위해 사용될 수 있는 방법을 설명한다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 전세포 병원체 면역자극제(whole cell pathogen immunostimulatory agent)를 제조하기 위해, 예를 들면, 종양 세포 대신에 병원체로 감염된 세포, 또는 병원체 항원을 코딩하는 벡터를 사용하는 것에 의해 유사한 방법이 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
전종양 세포를 벨케이드와 같은 프로테아솜 억제제, 및 일부 실시예에서 또한 자가포식 유도제와 인큐베이션시킨다. 종양 세포는 치료 대상 개체로부터 수득되거나 또는 동일한 종양 종류의 또 다른 원천(예를 들면, 조직배양 세포 또는 또 다른 개체로부터 유래된 세포)으로부터 수득될 수 있다.
종양 세포를 세포의 최대 생존력을 유지하면서 프로테아솜 활성의 억제를 허용하는 조건 및 일부 실시예에서, 또한 자가포식을 유도하는 조건 하에서 프로테아솜 억제제(예를 들면, 가역적 프로테아솜 억제제) 존재 하에 인큐베이션하였다. 프로테아솜 억제제와 자가포식 유도제에서의 인큐베이션은 순차적으로 또는 동시에 일어날 수 있다. 일 실시예에서, 세포를 자가포식 유도제 전에 프로테아솜 억제제와 인큐베이션시켰다. 또 다른 실시예에서, 세포를 자가포식 유도제와의 인큐베이션 후에 프로테아솜 억제제와 인큐베이션시켰다.
특정한 실시예에서, 종양 세포를 2시간 이상, 예를 들면, 6시간 이상, 예를 들면, 2-6시간 동안 프로테아솜 억제제와 인큐베이션시키고 세포에서 자가포식을 유도하는 조건 하에서 야간 인큐베이션시켰다. 일부 실시예에서, 리소솜 매개 단백질 분해도 억제된다(예를 들면, 10 mM NH4Cl과 같은 1-50 mM NH4Cl에 의해). 일부 실시예에서, 세포를 또한 카스파아제 활성화의 억제제와 같은, 아포토시스를 감소시키거나 또는 억제하는 작용제의 존재 하에 인큐베이션하였다. 팬-카스파아제 억제제(pan caspase inhibitor)(Z-VAD-fmk, 예를 들면, 5 μM)가 프로테아솜 억제제의 존재 하에 카스파아제 활성화를 억제하기 위해 사용될 수 있다.
대표적인 조건은 세포를 6 시간 이상 동안 20 nM 이상의 벨케이드(예를 들면, 20-1000 nM의 벨케이드)와 인큐베이션하는 것을 포함한다. 상기 인큐베이션 전에, 그 동안 또는 그 후에, 상기 세포를 자가포식을 유도하는 조건, 예를 들면, 1 nM - 100 nM 라파마이신, 10-1000 U/ml IFN-γ, 또는 빈블라스틴 술페이트와의 야간 인큐베이션, 또는 영양 고갈(예를 들면, HBSS) 하에서 인큐베이션시켰다. 특정한 실시예에서, 세포를 6시간 이상(예를 들면, 48시간 이상) 프로테아솜 억제제의 존재 하에 인큐베이션하고, 뒤이어 자가포식을 유도하기 위해 야간 영양 기아 상태로 인큐베이션시켰다. 또 다른 실시예에서, 세포를 프로테아솜 억제제(예를 들면, 벨케이드)의 첨가 전에 2시간 동안 HBSS(영양 기아)에서 인큐베이션하였다(24-48시간의 총 인큐베이션).
처리된 세포를 면역 반응을 유도하기에 충분한 양, 예를 들면, 개체에서 종양을 치료하기에 충분한 양으로 개체에게 직접 투여할 수 있다. 일 실시예에서, 20-300 백만 개의 처리된 세포들을 예를 들면, 면역자극제 또는 PD-1 억제제와 같은 다른 작용제의 존재 하에 투여할 수 있다(실시예 14 참조).
실시예 18
DRibble -적재된 DC 또는 DRibble 단독의 T 세포로의 교차-제시
본 실시예는 분리된 DRibble이 림프구고갈된 개체에서 흑색종-특이적 T 세포의 큰 증식(large expansion)을 유도하고, 그에 의해 종양 퇴행을 매개할 수 있다는 것을 입증하기 위해 이용될 수 있는 방법을 설명한다.
원형의 CD45.1+ 유사유전자형(congenic) B6 마우스에 FlO 흑색종 세포(2 x 105)를 접종하고 6일 차에 방사선을 조사하였다(500 rads). 다음 날, 방사선 조사된 마우스에 104-105 개의 원형의 GFP+ pmel-1 T 세포를 단독으로 또는 TRP-1 TCR 형질전환 마우스로부터 유래된 동일한 수의 원형의 T 세포와 조합하여 입양적으로 전달하고 7일 차, 10일 차 및 12일 차에 2 x 106 개의 DC, 펩티드로 펄스된 2 x 106 개의 DC(양성 대조구), 재조합 단백질, 및 gplOO과 TRP-1 단백질을 발현하는 293T 세포로부터 생성된 상이한 양의 DRibble이 적재된 2 x 106 개의 DC를 백신 접종하였다. 2주 후에 백신 접종을 반복하였다.
pmel-1 T 세포 및 TRP-1의 수는 유동 세포측정법으로 추적하였다. 종양의 성장은 주당 3회씩 측정하였다. pmel-1 T세포는 GFP 및 CD8 항체에 의해 추적하고, TRP-1 TCR T 세포는 CD45.2 및 CD8 항체에 의해 추적하였다.
재조합 gp100 단백질, 흑색종으로부터의 내생 항원(endogenous antigen), 또는 gplOO 및 TRP-1으로 형질감염된 293T 세포가 입양적으로 전달된 pmel-1 및 TRP-1 T 세포를 상호-감작(cross-prime)하는 능력이 결정될 수 있다. 도 12a에 도시된 바와 같이, DRibble-펄스된(pulsed) DC(10 ㎕/ml)는 피하에(s.c.) F10 종양을 갖는 마우스에서 pmel-1 T 세포를 자극하는데 있어서 정제된 gplOO 단백질(10 ㎍/ml) 만큼 우수했다. 또한, 항-CD40 및 IFN-γ의 존재 하에 DRibble 단독, DRibble + α-GalCer(NKT 리간드), DRibble이 적재된 DC의 백신 효능을 결정했다.
도 13은 피내로 투여된 분리된 DRibble이 인 비보에서 DC로 표적화되어 외래의 DC 없이 원형의 T 세포 증식을 자극할 수 있다는 것을 보여준다.
투여된 DRibble의 최적량을 파악하기 위해, 상이한 경로(예를 들면, 정맥내, 피내, 피하)를 통해 원형의 형질전환 T 세포가 입양적으로 전달된 마우스에 상이한 양의 gplOO/TRP-1-DRibble을 전달했다. CFSE-표지된 pme-1 및 TRP-1 TCR 원형의 T 세포의 증식을 통상적인 방법 및 본 명세서에서 제공된 방법을 이용하여 모니터링할 수 있다. 인 비보에서 최대의 T 세포 증식을 가져오는 투여량 및 경로가 F10 종양을 갖는 마우스(또는 종양을 갖는 다른 개체)에 이용될 수 있다. 그 후, 종양 성장 및 T-세포 반응을 전술된 바와 같이 추적한다.
실시예 19
단백질의 교차-제시
본 실시예는 인 비보에서 종양 세포에 의해 합성된 장수명 단백질과 단수명 단백질의 교차-제시의 효율성을 비교하기 위해 이용될 수 있는 방법을 설명한다. 장수명 단백질은 인 비보에서 DC에 의해 효율적으로 교차-제시되나, 단수명 단백질은 그렇지 않을 것으로 예상된다.
LCMV의 gp33 및 흑색종 항원 gplOO을 발현하는 종양 모델을 생성하였다. 두 가지 형태의 gp33 및 gplOO이 생성되며, 하나는 긴 반감기를 가지며, 다른 하나는 짧은 반감기를 가졌다. Db 제한된(restricted) gp33 에피토프(KAVYNFATM)는 P14 TCR 형질전환 마우스(Taconic, Germantown, NY)로부터 유래된 T 세포에 의해 인식된다. 흑색종 gp100을 위한 TCR Tg 마우스가 상업적으로 이용가능하다.
세포주 293T, B78H1, 및 βKOS(β2m 넉아웃 마우스로부터 생성된 섬유육종 세포주)를 이용하였다. 293T는 인간 신장세포주이고 다른 세포주에 비해 통상적으로 보다 높은 수준의 항원 발현이 관찰된다. 마우스 T 세포의 활성화는 교차-제시를 통해 일어난다. B78H1(결함 TAP 및 N-말단 법칙(N-end rule), 따라서, N-말단 규칙을 표적화하는 단수명 단백질의 프로테아솜-매개 분해 및 펩티드의 ER로의 전 위의 부재), βKOS(β2m 넉아웃, 따라서, ER에서 MHC 클래스 I과 펩티드의 복합체 형성 부재)를 Ag 공여 세포(donor cell)로 사용하여 프로테아솜의 기질, 프로테아솜의 산물, ER로 전위된(translocated) 펩티드, 또는 MHC I/펩티드 복합체가 교차-제시를 위한 원천 물질(source material)인지 여부를 결정하였다. 이 모델 항원의 효과적인 교차-제시는 이 모델 항원을 발현하는 종양을 갖는 마우스로 입양적으로 전달된 원형의 TCR Tg T 세포의 CFSE 희석에 의해 측정하였다.
통상적인 방법을 이용하여 OVA, gplOO, 및 TRP-1을 발현하는 세포주를 생성했다. 방사선 조사된 293T-M-GFP-OVA 또는 293T-R-GFP-OVA를포(또는 비-293T 세포와 함께) Ag 공여 세포로 이용했다. 1-5 백만개의 원형의 TCR Tg T 세포가 미리 입양 전달되었던 유사유전자형 마우스로의 피하 주사 전에 종양 세포에 방사선 조사를 수행하였다. 교차-제시의 지표로서, 종양 주사 후 5일 차 및 14일 차에 백신 접종된 림프절(LN) 및 비장으로부터의 Tg T 세포의 CFSE 희석을 유동 세포측정법에 의해 모니터링하였다. OT-I, P14, 및 pmel-1 마우스로부터 유래된 CD8 T 세포를 이용하여 MHC I 제한된 교차-제시를 조사하고, 반면에 OT-II 및 TRP-1 TCR Tg 마우스로부터 유래된 CD4 T 세포를 이용하여 MHC II 제한된 교차-제시를 조사했다.
단수명 단백질의 프로테아솜-매개 분해의 억제가 그들의 교차-제시를 증가시킨다는 것을 입증하기 위해, 하기의 방법들이 이용될 수 있다. 모델 항원의 짧은 반감기 버전을 발현하는 종양 세포를 6, 12, 24, 48, 및 72 시간 동안 0.05 μM 벨케이드로 처리하고 방사선을 조사하였다. 이 종양 세포들을 전술된 바와 같이 교차-제시 분석법을 위해 Ag 공여 세포로 사용하였다.
인 비보에서 종양-유래 단백질의 교차-제시에서 내생 DC의 역할을 입증하기 위해, 하기의 방법을 이용할 수 있다. 종양 접종 후 일시적으로 내생 DC를 고갈시키기 위해 CDl1c 프로모터-제어(promoter-driven) 디프테리아 독소(DT)를 갖는 Tg 마우스를 이용한다. 그와 같은 모델은 Jackson laboratory로부터 입수가능하다(B6.FVB-Tg (CDllc-DTR-EGFP)57Lan/J). TAPl-의존성 교차-제시를 확인하기 위해, TAPl-결함 마우스를 수용체(recipient) 마우스로 이용한다.
인 비보 교차-제시는 내생 DC 및 MHC I 항원에 의존적이고, MHC II 항원에는 의존적이지 않으며, 수지상 세포의 TAP1에 의존적이나, 종양 세포의 TAP에 의존적이지 않을 것으로 예상된다.
실시예 20
HSP90 은 DRiP 및 SLiP 의 자가포식에 관여한다.
본 실시예는 DRiP 및 SLiP의 자가포식에서 HSP90의 역할을 입증하기 위해 사용된 방법을 설명한다.
모두는 아닐지라도, 대부분의 잘못폴딩된(misfolded) 단백질 또는 비정상 단백질은 프로테아솜에 의해 분해된다. 겔다나마이신 또는 라디시올(17-AAD)과 같은 HSP90 억제제의 존재 하에, 잘못폴딩되거나 또는 절단된 단백질(DRiP)이 보조-샤페론(co-chaperone) CHIP 또는 다른 E3 유비퀴틴 리가아제를 포함하는 과정에서 그들의 분해를 위해 프로테아솜으로 표적화된다.
종양-유래 항원의 교차-제시에서 HSP90의 역할을 입증하기 위해, V-GFP-TfR- OVA 융합 단백질을 발현하는 293T 세포를 1 μM 벨케이드(6 시간), 10 μM 라디시올(17-AAD, HSP90 억제제)(16 시간), 17-AAD(16 시간)와 벨케이드(16시간 중 마지막 6시간)로 처리하고 각 시료의 동량(10 ㎍의 용해물)에서 융합 단백질의 수준을 항-GFP 항체에 의한 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 교차-제시를 실시예 5에 기재된 바와 같이 분석하였다.
벨케이드는 GFP-TfR-OVA 융합 단백질의 짧은 단편을 크게 증가시켰으나, HSP90 억제제는 GFP-TfR-OVA 융합 단백질의 짧은 단편을 감소시켰다. 17-AAD 및 뒤이은 벨케이드에 의한 처리는 이와 같은 보다 짧은 단편의 축적을 회복시켰다. 이 결과는 HSP90-관련된 짧은 단편들이 효율적인 프로테아솜 기질이고 이와 같은 짧은 단편들이 진정한(bona fide) DRiP일 것이라는 것을 나타낸다.
17-AAD 처리된 세포를 교차-제시를 위한 원천으로 이용한 경우, 교차-제시가 감소되었다. 놀랍게도, 벨케이드의 첨가는 DRiP을 구제(rescue)했으나, 교차-제시는 구제하지 않았다. 무처리(nontreated) 세포 대비, 17-AAD의 훨씬 더 현저한 억제성 효과가 벨케이드 처리 세포에서 관찰되었고, 자가포식 억제제인 3-MA에 의해 동일한 현상을 관찰하였다. 이 결과는 HSP90이 DRiP의 자가포식에 관여된다는 것을 의미한다. 벨케이드의 존재시, 프로테아솜 기능의 억제는 DRiP을 구제했으나, 자가포식을 유도하지 않아, 3-MA 및 벨케이드의 효과를 모사했으나, 자가포식소체에 DRiP를 축적하고 뒤이어 DRibble로서 방출하지 못했다.
HSP90α가 교차-제시 기질을 위한 담체라는 것을 확인하기 위해, HSP90α에 대한 siRNA를 이용하여 V-GFP-TfR-OVA 융합 단백질을 발현하는 293T 세포를 형질감 염시켰다. 세포를 벨케이드로 처리하고 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 상층액으로부터 DRibble을 제조하였다. 루시페라아제 및 HSP90β에 대한 siRNA를 음성 대조구로 이용했다. HSP90 넉 다운의 자가포식에 대한 효과는 형질감염된 세포에서 LC3의 웨스턴 블롯 분석 및 GFP-LC3 또는 tdTomato-LC3의 점 형성(punctate formation)에 의해 결정하였다. DRiP을 웨스턴-블롯 분석에 의해 조사하였다. GFP-Ub 또는 tdTomato-Ub 융합 단백질을 이용하여 응집된 유비퀴틴화 단백질을 태깅하고 공초점 현미경 분석에 의해 HSP90의 억제가 Ub-양성 응집체(aggregate)에 미치는 효과를 조사하였다. HSP90 넉 다운을 갖는 세포로부터 분리된 DRibble을 인 비트로에서 OT-I 및 OT-II 세포를 이용한 교차-제시 분석법을 위한 항원의 원천으로 이용된다. HSP90α는 유비퀴틴화 DRiP의 자가포식 및 프로테아솜 억제된 종양 세포로부터의 DRibble 내의 DRiP의 축적제 및 방출에 관여하나, HSP90β는 그렇지 않을 것으로 예상된다.
실시예 21
DRiP 및 SLiP 의 교차-제시에서 폴딩된 완전한 단백질의 역할
본 실시예는 DRiP의 교차-제시에서 폴딩된 완전한 단백질 또는 응집된 DRiP의 기여를 결정하기 위해 이용될 수 있는 방법을 설명한다. 폴딩된 완전한 단백질 및 응집된 DRiP는 DRibble에서 발견되며, 그들 모두는 교차-제시될 수 있다.
이 두 개의 상이한 단백질 분획의 교차-제시에서의 상대적 기여를 결정하기 위해, 디기토닌(digitonin)이 이용되어 가용성의 GFP 융합 단백질을 방출하고 디기 토닌의 불용성 때문에, 잘못 폴딩된 DRiP는 DRibble 내에 남기도록 DRibble을 투과화(permeablize)시킨다. 그와 같은 방법은 세포질 효소, GAPDH의 자가포식을 검출하기 위해 이용되었다(Lorenz et ah, Nat. Methods 3: 205-10, 2006). M-GFP-OVA 또는 V-GFP-TfR-OVA를 발현하는 293T 세포로부터 생성된 DRibble을 얼음 상에서 10분간 20 μM 디기토닌으로 처리한다. 투과화(permeablization) 후에, DRibble을 침전시키고, 상층액 및 침전물을 대상으로 가용성 항원과 다른 성분들의 방출을 결정하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행한다. V-GFP-TfR-OVA는 막결합 단백질(membrane bound protein)이기 때문에, 디기토닌 처리시 소실이 관찰되지 않으며, 반면에 세포질 M-GFP-OVA는 소실될 것으로 예상된다. 디기토닌 처리 후에, DRibble을 교차-제시 분석을 위해 이용한다. DRiP가 주요한 항원 공여체라면, 교차-제시 활성의 미량의 소실만이 있을 것으로 예상된다.
실시예 22
전이성 유방암의 치료
여러 새로운 능동적(active) 화학요법 및 호르몬 요법 약물의 최근 개발에도 불구하고, 전이성 유방암은 여전히 90% 이상의 사례에서 불치병(incurable disease)으로 남아있다. 본 실시예는 분리된 DRibble, 종양-유래 DRibble 또는 DRibble을 생성하는 종양 세포(예를 들면, 프로테아솜 억제제, 자가포식 유도제, 또는 양자 모두와의 접촉에 의해)가 적재된 DC의 투여에 의해 전이성 유방암을 치료하기 위해 이용될 수 있는 방법을 설명한다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당 업자는 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여 종양 세포를 치료하는 것에 의해 임의의 종류의 종양을 치료하기 위해, 유사한 방법들이 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 다른 APC가 DC에 대한 대안으로 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 DRibble이 적재된 DC 대신에, DRibble을 생성하는 처리된 종양 세포 또는 그와 같은 세포로부터 분리된 DRibble이 개체에게 투여될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 개체가 PD-1 억제제의 투여와 같은 다른 치료법을 받을 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일반적으로, 상기 방법은 비-골수제거성 림프구고갈(non-myloablative lymphodepletion)의 유도 및 자가 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 의한 재구성 후에, 사전에 치료되지 않은 전이성 유방암을 갖는 대상자에게 유방암 세포주로부터 유래된 DRibble이 적재된 자가(autologous) DC(또는 분리된 DRibble 또는 DRibble을 생성하는 처리된 유방암 세포)를 백신 접종하는 단계 및 뒤이은 을 포함한다. 일반적인 체계는 도 14에 도시된다.
예를 들면, 소량의 유방 종양을 외과수술에 의해 절제하고, 배양으로 증식시키며 나중에 치료 전과 후에 개체의 종양 세포에 대한 면역 반응을 측정하기 위해 동결시켰다. 또한, 개체를 대상으로 백혈구성분채집술(leukapheresis)을 수행하였다. 결과물인 WBC를 동결시키고 나중에 다시 개체에게 복귀시켰다. 상기 세포들 중 일부를 DC를 생성하기 위해 이용할 수 있다. 종양 세포의 채취 및 백혈구성분채집술 후에, 개체를 정맥으로의 치료적 유효량의 플루다라빈 및 시클로포스파미드 화학요법제 주입으로 치료하였다. 6일 차에, 개체의 동결된 백혈구를 정맥 내로 개체에 주입시켰다. 다음날, DRibble-적재된 APC(또는 분리된 DRibble 또는 DRibble을 생성하는 처리된 종양 세포)를 함유한 백신을 예를 들면, 복부의 피부 아래로의 4회 이하의 주사로 투여하였다. 종양을 모니터링하기 위해 적어도 13주 간격으로 X-레이 및 스캔을 수행하였다.
대상자 기준
IV기 유방암을 가지며 18개월 이내에 화학요법 또는 방사선치료를 받지 않았던 대상자(20-24명)를 선정하였다(이전의 호르몬 요법 및 항체 요법은 허용가능함). 이상적으로는 개체는 18세 이상이고, 3개월 이상의 기대 수명을 가지며, 2 미만의 ECOG 활동도(performance status)를 갖는다(Karnofsky >60%; 표 1 참조).
표 1: 활동도 기준(Performance Status Criteria)
ECOG 활동도 척도 Karnofsky 활동 척도
등급(grade) 내용 퍼센트 내용
0 정상적인 활동, 완전히 활동적이고, 제한 없이 발병 이전의 모든 활동을 수행할 수 있음. 100 정상이고 불평 없으며, 질병의 징후 없음.
90 정상적인 활동을 수행할 수 있음; 질병의 미약한 징후 또는 증상.
1 증상이 있으나, 보행 가능. 신체적으로 격심한 활동은 제한되나, 보행 가능하고 가볍거나 또는 정적인(sedentary) 작업 수행 가능(예를 들면, 가벼운 가사, 사무 업무). 80 노력으로 정상적인 활동 수행 가능; 질병의 일부 징후 또는 증상.
70 스스로 관리하나, 정상적인 활동을 수행하거나 또는 활동적인 업무는 수행할 수 없음.
2 50% 미만의 시간을 침상에서 보냄. 보행가능하고 모든 자가 관리(self-care)가 가능하나, 업무 활동은 수행할 수 없음. 깨어있는 시간의 50% 이상 활동함(up and about). 60 가끔 보조를 필요로 하나, 자신의 필요의 대부분을 충족시킬 수 있음.
50 상당한 보조 및 빈번한 의료적 치료를 필요로 함.
3 50% 이상의 시간을 침상에서 보냄. 제한적인 자가-관리만 가능하며, 깨어있는 시간의 50% 이상을 침상이나 의자에서 보냄. 40 활동 불가능하며, 특별한 관리 및 보조를 필요로 함.
30 심하게 무능력하며(severely disabled), 입원이 요구됨. 사망이 임박하지는 않음
4 100% 침상에서 보냄. 완전히 활동불가능함. 어떠한 자가-관리도 수행할 수 없음. 완전히 침상이나 의자에서만 생활함. 20 심하게 아프고, 입원이 요구됨. 사망이 임박하지는 않음.
10 빈사 상태(moribund)이고, 사망을 초래하는 과정이 빠르게 진행됨.
5 사망 0 사망
또한, 개체는 이상적으로는 정상적인 기관 및 골수 기능을 기능을 가지며, 예를 들면, 3,000/uL이상의 WBC; l,500/uL 이상의 절대적 호중구 수(absolute neutrophil count); 500/uL을 초과한 절대적 림프구 수; 100,000/uL 이상의 혈소판 수; 10g/dl 이상의 Hgb(이 수준에 도달하기 위해, 환자는 수혈을 받을 수 있음); 24% 이상의 Hct; 2 미만의 총 빌리루빈치, (길버트 질병이 아닌 경우) 3 미만의 AST(SGOT)/ALT(SGPT); 및 2 mg/dl 미만의 크레아티닌을 갖는다. 기준선 CBC는 절차 전 14일 이내에 수행한다. 이상적으로, 개체는 2000을 초과하는 WBC; 50,000보 다 큰 혈소판 수; 8보다 큰 Hgb; 및 24보다 큰 Hct를 갖는다.
이상적으로, 개체는 HIV-I, HIV-2, B형 간염 표면 항원, C형 간염 항체, HTLV 1 및 2, 및 매독에 대해 음성이다. 개체는 CMV 및 EBV에 대해 양성이거나 또는 음성일 수 있고, 43 유닛/㎕ 미만의 류마티스 인자(rheumatoid factor) 및 11 유닛/㎕ 미만의 항핵 항체값(anti-nuclear Antibody value)을 가질 수 있다. 환자가 최근에 수술을 받은 경우, 이상적으로 그들은 그 수술의 효과로부터 완전히 회복된 상태이다.
이상적으로, 개체는 임신이나 수유 중인 여성; 3주 이내에 화학요법을 받거나 또는 2주 이내에 방사선 요법을 받은 개체; 스테로이드 요법(2주 이내에 대체 스테로이드(replacement steroid) 및 흡입 스테로이드 이외의 다른 요법)를 받은 개체; 방사선 요법 및/또는 외과적 수술로 치료되고, 치료 후 1개월 이상 안정적인 것으로 나타나지 않은, 알려진 뇌 전이를 갖는 개체; 다발성 경화증, 전신홍반 루푸스, 또는 중증근육무력증의 병력을 갖는 개체; 임의의 형태의 일차 또는 이차 면역결핍증을 갖는 개체(예를 들면, HIV 양성혈청(seropositive), C형 간염 양성혈청, 또는 B형 간염 항원 양성); 활동 감염(active infection), 능동 출혈(active bleeding)(예를 들면, 객혈 또는 GI 출혈), 징후성 울혈심부전증(symptomatic congestive heart failure), 불안정 협심증, 심부정맥, 기관지경련, 고혈압, 고혈당증, 또는 고칼슘혈증을 포함하나, 이에 한정되지 않는 비조절성 병발 질환을 갖는 개체가 아니다. 향후 3개월간 대체 스테로이드가 아닌 전신성 코르티코스테로이드를 필요로 하는 개체는 이상적으로 고려되지 않는다.
기준선 백혈구성분채집술(Baseline Leukapheresis)
개체를 대상으로 재구성 및 면역 모니터링을 위한 PBMC를 수득하기 위해 림프구고갈의 개시 후 2주 이내에 백혈구성분채집술을 시행했다. 1 x 1010개 이상의 PBMC를 수득했다. 3-6 시간 동안 약 10 리터의 혈액을 처리했다. 중앙값(median) 7.7 리터의 혈액을 처리한 2.5 시간의 백혈구성분채집술로부터 PBMC 수율의 중앙값은 8.35 x 109 PBMC였고, 그 중 25%는 단핵세포였다.
상기 절차 동안, 100 ml의 생리 식염수(NS)에 담긴 칼슘 글로코네이트(10 ml)를 0.5 ml/분 또는 30 ml/시로 주입하였다. 말초 접근(peripheral access)이 부적합한 개체에서는 직접적인 초음파 유도 하에 일시적인 혈액투석 카테터를 배치할 수 있다. 백혈구성분채집술 후에 상기 카테터를 제거한다.
성분수혈(pheresis) 후에, 산출물(product)을 개조된 MNC 프로토콜에 따른 정화(elutriation)에 의해 림프구 분획과 단핵세포 분획으로 분리했다(Rouard et al, Transfusion 43:481-7, 2003). 조혈모세포(Hematopoietic Progenitor Cell) 처리, 보관 및 재-주입을 위한 ARC 표준 절차에 따라 향후의 자가 재-주입을 위해 림프구를 처리하고 동결시켰다. 재주입시, 산출물의 시료를 이용하여 감별 CBC(CBC with differential)로 각 개체에 재주입된 림프구의 수를 결정하였다.
백혈구성분채집술 동안 가벼운 증후성 저칼슘혈증이 일어나는 경우(입술/안면의 저림, 사지의 무감각, 근육 경련), 필요에 따라 경구 투른스(oral Turns)를 투여했다. 호중구감소성(neutropenic)이고 열이 있는 개체의 경우, 세프타자다 메(ceftazadime) 또는 이미페넴(imipenem)에 의한 실험적인 항생제 치료가 적용될 수 있다. 개체가 증후성 빈혈을 갖거나 또는 그들의 Hgb가 8 g/dl 미만인 경우 농축 적혈구 수혈(packed red blood cell transfusion)이 적용된다. 혈소판 수가 10,000 /㎕ 미만으로 저하되거나 또는 보다 높은 수준에서 출혈의 징후가 존재하는 경우 혈소판 수혈이 적용될 수 있다.
CMV 양성 및 CMV 음성인 개체 모두는 절대적 림프구 수가 ㎕ 당 500 미만으로 감소되는 경우 림프구 수가 일정하게 이 수준 이상으로 될 때까지 CMV 예방제(prophylaxis)를 지속적으로 투여받을 수 있다.
심각한 감염을 갖는 호중구감소 상태인 개체 또는 지속된 과립구감소증(granulocytopenia)을 갖는 개체에게 G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor)를 투여할 수 있다.
상기 절차의 3일 이내에 기준선 CBC를 수행할 수 있다. 이상적으로, 백신을 투여받은 개체는 3,000 이상의 WBC; 100,000 이상의 혈소판 수; 8g/dl 이상의 Hgb; 및 24%보다 높은 Hc를 갖는다.
화학요법(Chemotherapy)
DRibble에 노출된 DC(또는 분리된 DRibble, 또는 DRibble을 생성하는 처리된 종양 세포)에 의한 면역자극 및 PBMC의 주입 전에, 초기의 입양적 면역요법 시도에 근거한 가이드라인에 따라 화학요법제가 투여될 수 있다(Dudley et al. Science 298:850-4, 2002; Rosenberg and Dudley, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 14639- 45, 2004). 요약하면, 2일 연속(-7일 차 및 -6일 차)으로 매일 30분간 시클로포스파미드 60 mg/Kg/일 IV 및 뒤이어 5일간(-5, -4, -3, -2, 및 -1일 차) 30분씩 플루다라빈 25 mg/m2/일 IV을 개체에게 투여한다. 담당 의사의 재량에 따라, 수화(hydration) 및 항구토제(덱사메타손 제외)를 예를 들면, 구토를 예방하기 위해 사용될 수 있다.
시클로포스파미드(2-[비스(2-클로로에틸)아미노]테트라히드로-2H-l,3,2 옥사자포스포린 2-옥시드 모노히드레이트)는 분자식이 C7H15C2N2O2P·H2O이고 분자량이 279.1인 합성 항신생물성 약물이다. 동결건조된 CYTOXAN®(주사용 시클로포스파미드, USP)은 100 mg의 시클로포스파미드(무수물) 당 75 mg의 만니톨을 포함하고 멸균수 또는 생리적 식염수로 재구성될 수 있다. 예를 들면, CYTOXAN®은 약 150 cc의 생리적 식염수로 희석되어 30-60분 동안 정맥내로(IV) 투여된다. 추가적인 투여량의 정맥내 수액(IV fluid)은 방광 독성(bladder toxicity)을 예방하는 데 기여할 수 있다. 재구성된 시클로포스파미드는 냉장 상태로 6일간 안정하나, 보존제를 포함하지 않으며, 따라서, 이상적으로는 6시간 이내에 사용된다.
CYTOXAN® 정제(시클로포스파미드 정제, USP)는 경구 투여용이며 25 mg 또는 50 mg의 시클로포스파미드(무수물)를 포함한다. 시클로포스파미드는 경구 투여 후 75%를 초과하는 생체이용률로 잘 흡수된다. 무변형(unchanged) 약물은 3 내지 12시간의 제거 반감기(elimination half-life)를 갖는다.
플루다라빈 포스페이트(FAMP)(9H-푸린-6-아민, 2-플루오로-9-(5-0-포스포노- D-아라비노푸라노실), 분자식 C10H13FN5O7P는 항바이러스제인 비데라빈의 합성 뉴클레오티드 유사체이다. 문헌에서, 플루다라빈 포스페이트, 2-플루오로-Ara-AMP, 2-플루오로아데닌 아라비노시드-5-포스페이트, 2-FAMP로도 지칭된다. 주사의 경우, 50 mg의 플루다라빈 포스페이트를 주사용 멸균수, USP 2 ml에 용해시킨다. 결과물인 용액은 25 mg/ml의 플루다라빈 포스페이트를 포함한다. 상기 약물을 5% 덱스트로오스 주사 USP 또는 0.9% 염화나트륨 USP로 더 희석할 수 있다. 예를 들면, 주사용 멸균수 USP(Sterile Water for Injection USP)를 무균 조건 하에 첨가하여 비경구 용도를 위해 주사용 플루다라(Fludara for Injection)를 준비한다. 최종 제품의 pH 범위는 7.2-8.2이다. 결과물인 플루다라빈 포스페이트 용액을 100 cc 또는 125 cc의 5% 덱스트로오스 주사 USP 또는 0.9% 염화나트륨 USP로 희석하고, 결과물인 용액을 30분간 IV를 통해 개체에게 투여할 수 있다.
주사용의 재구성된 플루다라는 항균성 보존제(antimicrobial perservative)를 포함하지 않으며, 따라서, 재구성 후 8시간 이내에 사용되어야 한다. 이상적으로, 플루다라빈은 치료일에 ANC가 1500 이상이고 혈소판 수가 100,000이상이 아니면 투여되지 않는다.
DRibble 및 DRibble-적재된 수지상 세포(DC)의 제조
MDA-MB-231 세포 은행으로부터 생성된 DRibble(Dols et al. Hum. Gene Ther. 14: 1117-23, 2003)을 제조한다. 이전에, 복수 개의 공지된 항원(Her2, Cycling Bl)을 발현하는 임상적(working) 유방암 세포 은행(MDA-MB-231)을 이용하여 유방암을 가진 36명의 여성에 백신접종하고 108개까지의 세포들을 안전하게 투여하였다(DoIs et al. Hum. Gene Ther. 14:1117-23, 2003). 자가 유방암 세포주를 구축하는 것이 어렵기 때문에, 이 세포은행으로부터 DRibble을 생성할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 자가 유방암 세포(autologous breast cancer cell)가 수적으로 충분하거나 또는 그와 같은 세포를 배양으로 증식할 수 있다면 자가 유방암 세포로부터 DRibble을 생성할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
MDA-MB-231 세포로부터의 DRibble 생성은 20 nM 벨케이드®(보르테조미브)(프로테아제 억제제)에 의한 야간 처리에 의해 유도된다. 일부 실시예에서, 이는 아사 조건(예를 들면, HBSS의 존재)하에서 수행된다. 바람직한 경우, 그와 같은 처리된 세포들을 DRibble의 분리 없이 (면역자극하기 위해) 개체에게 투여할 수 있다. 바람직한 경우, DRibble은 하기와 같이 분리될 수 있다. 저속 원심분리 후에, 결과물인 DRibble을 9,000 rpm (10,000g)에서의 15분간 원심분리에 의해 상층액으로부터 수집한다. 결과물인 DRibble을 포함하는 침전물을 PBS로 3회 세척하여 프로테아제 억제제를 제거한다. 단백질 함량은 1% NP-PBS에 용해시킨 후 RCA 방법에 의해 결정한다. DRibble을 최종 농도 1 mg/ml까지 PBS로 희석하고 분량씩 -80℃에서 동결시킨다. 바람직한 경우, DRibble을 개체를 직접 면역자극하기 위해(예를 들면, 10 ㎍, 100 ㎍, 또는 1 mg과 같은 1-1,000 ㎍의 농도로) 사용하거나 또는 APC(예를 들면, DC)를 적재하기 위해 사용하고, 상기 적재된 APC를 하기에 기술된 바와 같이 개체에 투여한다.
단핵세포는 Elutra®(Gambro BCT) 폐쇄 분리 시스템(closed separation system)을 사용하여 성분수혈 산출물로부터 농축한다. 원심분리 속도를 일정하게 유지하면서, 유속의 단계별 증가로 분획을 수집하였다. 이 절차의 전형적인 순도 및 수율은 각각 90% 이상 및 70% 이상이다.
단핵세포 분획(CellGro® DC 배지 250 ml 당 1-2 x 109, CellGenix USA)을 6일 동안 세포 팩토리(Nalge Nunc)에서 배양했다. 예상되는 수율은 2억-3억 개의 미성숙 DC이다. DC를 생성하기 위해 6일 동안 단핵세포를 배양하기 위해 GM-CSF(100 U/ml) 및 IL-4(10 ng/ml)를 사용했다. GM-CSF 및IL-4를 제거하기 위해 동결 전에 DC를 세척했다.
DC 배양 6일 차에, DC를 수집하고 DC 배지 ml 당 5 x 106 개의 세포로 재현탁시키고 유방암 세포주 MDA-MB-231(전술 참조)로부터 유래된 10-50 ㎍/ml DRibble과 함께 6시간 동안 인큐베이션하였다. DRibble과의 인큐베이션 후에, DC를 PBS로 2회 세척하고 25 x 106 분량으로 동결시켰다. 예상되는 수율은 2억 개의 항원-적재된 DC였다.
백신 접종(Vaccination)
0일 차(플루다라빈의 마지막 투여량 후 1일 차)에 개시하여 PBMC 주입 전에, 개체에 피하로 총 20 x 106 개의 DRibble-적재된 DC(또는 1-1000 ㎍의 분리된 DRibble 또는 2천만 개 이상(예를 들면, 2천만 개 내지 2억 개)의 DRibble을 생성하는 처리된 종양 세포)를 백신 접종하였다. 요약하면, 전술된 바와 같이 제조된 DRibble-적재된 DC(또는 분리된 DRibble 또는 DRibble을 생성하는 처리된 종양 세포)를 37℃ 건조 배스(bath)에서 (이전에 동결된 경우) 신속하게 해동하고 PBS로 2회 세척하고 주사용 염수 2 ml에 재현탁시켰다. 2개의 튜베르큘린 주사기(tuberculin syringe)에 담긴 총 용량 2 mL DC를 투여를 위해 두 개의 별개의 부위에서 피하 조직으로의 10 x 106 DC 1 ml의 2회 주사로 사용하였다. 주사제는 해동 후 2시간 이내에 투여하였다. 백신 접종은 사지들 간에 교대로(rotate) 수행될 수 있다. 복부 및 옆구리를 이용할 수 있다. 개체는 각 백신 접종 후 15분간 관찰하였다.
중단을 위한 조건이 충족되지 않으면(하기 참조), 총 5회의 백신 접종을 위해 2주 간격으로 백신 접종을 반복하였다. 백신 투여에 따른 등급 2보다 높은 급성 전신성 독성이 일어나면, 백신 접종을 반복하지 않았다. 피부 발진, 열, 권태감, 선병증(adenopathy), 및 국소 반응을 포함한 통상적으로 백신과 연관된 등급 2의 독성의 경우, 개체는 백신 접종을 지속할 수 있었다. 궤양 또는 무균 농양과 같은 심각한 국소 독성이 일어나는 경우, 후속 백신에서 DC의 수를 최초 투여량의 50%까지 감소시켰다. 보다 낮은 투여량에서 독성이 재발하는 경우, 백신을 중단했다. 임상적으로 검출된 불명의(unexplained) 시각적 변화가 일어나면 백신이 망막 내에서 색소침착 세포에 대한 반응을 유도했을 가능성 때문에 백신 접종을 중단했한다.
자가-면역성 질환의 소견(예를 들면, 염증성 관절염, 혈관염, 심막염, 사구체신염, 결절 홍반)이 일어나는 경우, 비-스테로이드성 항 염증제, 스테로이드, 또는 임상적 상태 및 중단된 백신에 근거하여 지시된 다른 면역억제제를 포함한 적합한 의료적 관리를 제공했다.
자가 말초혈액 단핵세포 주입
0일 차에, 개체에 이전에 동결시켰던 자가 PBMC를 투여했다. 전투약(premedication)은 PBMC 투여 30분 전에 구강에 의한 아세타미노펜(650 mg) 및 디펜히드라민(50 mg)을 포함할 수 있다. 주입될 PBMC의 최소 수는 4 x 109개였다. 일 실시예에서, 주입될 PBMC의 최대 수는 1011개였다. 각 50 cc 주사기의 경우, 5분간 정맥 투여(IV push)를 통해 PBMC를 주입했다. 여과 없는 혈액 수혈을 위해 적합한 큰 구경(bore)의 IV 라인을 통해 세포 주입을 수행했다.
신부전으로부터 개체를 보호하기 위해 PBMC 주입 전 4시간 동안 및 주입 후 4-6 시간 동안 개체를 수화시켰다. 수화는 100 ml/시 이상의 소변 배출을 확보하도록 조정하였다. 수화는 리터 당 D5W1/2NS + 20 mEq KCl + 50 mEq NaHCO3를 150 ml/시의 속도로 주입하는 것에 의해 수행하였다.
기준시점(baseline), 20 cc가 주입된 후 및 주입의 종료시에 바이털 사 인(vital sign)을 측정했다. 그 후, 2시간 동안 30분 간격으로 및 그 후 4시간 동안 1시간 간격으로 바이털 사인을 측정한다. 재주입 일부터 호중구가 1,000/㎕이상으로 회복되고 림프구가 500/㎕ 이상으로 회복될 때까지, 개체를 대상으로 감염 여부를 모니터링했다.
치료법의 지속기간
부작용에 따른 치료 지연이 없는 경우, 하기 중 하나 이상이 일어날 때까지 치료를 지속할 수 있다: 질병 진행(진행(progression)이 없는 개체는 1년 이상 치료를 지속할 수 있음); 치료제의 추가적인 투여를 방해하는 병발성 질환; 허용될 수 없는 부작용; 대상자에 의한 치료중단 결정; 또는 개체가 더 이상의 치료를 허용할 수 없게 하는 개체의 상태의 변화. 특정한 실시예에서, 치료를 예를 들면, 수년 간(예를 들면, 5년까지) 예를 들면, 2주 간격으로 반복한다.
개체가 하기의 독성을 경험하는 경우, 개체는 추가적인 백신 접종을 받지 않는다: 등급 3 알레르기/면역학(allergy/immunology), 등급 3 용혈(hemolysis), 등급 3 심장(cardiac), 등급 3 응고(coagulation), 등급 3 내분비(endocrine), 등급 3 위장(gastrointestinal), 등급 4 감염(infection), 등급 3 대사(metabolic), 등급 3 신경학(neurology), 등급 3 눈(ocular), 등급 3 폐(pulmonary), 및 등급 3 신장(renal).
PBMC의 이차 수집(second collection)
바람직한 경우, 면역 기능의 분석을 위해 개체를 대상으로 단핵세포의 2차 수집을, 예를 들면, 5차 백신 접종 후 약 2주 후에 수행할 수 있다. 그 산출물은 개체로의 재-주입을 위해 처리될 필요가 없다. 백신 접종 후 약 2주 후에, PBMC의 수집을 위한 백혈구성분채집술이 2-3시간 동안 수행된다. PBMC를 3% 미만의 컬러그램(colorgram)에서 1 ml/분의 속도로 최소 2시간 동안 수집한다. 상기 절차는 정맥내 수화를 필요로 하지 않으며 일반적으로 잘 수용된다.
임상적 평가(Clinical evaluation)
과거의 암 병력 및 치료를 포함한 완전한 의학적 기록(medical history)을 수득한다. 신장, 체중 및 바이털 사인을 포함한 완전한 신체 검사를 수행한다.
종양을 하기와 같이 평가할 수 있다. 전이성 질환의 공지된 부위의 방사선 병기결정 평가(radiographic staging assessment)를 화학요법 1일차 후 4주 이내에 수행한다. 또한, 조영제(contrast)와 함께 및 조영제 없이 두부(head)의 MRI를 수행할 수 있다.
각각의 백혈구성분채집술 절차 전에, CBC 파라미터를 평가한다.
5차 백신 접종 후 약 2주 후에, 항-종양 반응을 평가하기 위해 개체를 대상으로 재-병기결정 이미징 연구(re-staging imaging study)를 수행할 수 있다. 매 2회의 추가적인 백신 접종 후(2개월 간격으로) 병기결정을 반복한다. 안정한 질병을 갖거나 양호한 상태인 개체는 1년 동안 백신 접종을 지속할 수 있다(총 16회까지의 백신 접종).
모든 백신 접종이 완료된 후, 개체는 그들의 생애 동안 장기적인 독성 및 생존에 대해 3개월 간격으로 추적된다.
종양 분석 방법
최초의 5회의 백신접종 후 및 그 후, 매 2회의 백신 접종 후에(2개월 간격으로) 반응에 대해 개체를 재평가할 수 있다. 기준선 스캐닝(baseline scan) 외에, 확인 스캐닝(confirmatory scan)을 객관적인 반응의 최초 기록 후 4-8주에 수행할 수 있다.
참조에 의해 본 명세서에 포함된 Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST) Committee (JNCI 92(3):205-16, 2000)에 의해 제안된 국제적 기준을 이용하여 반응과 진행을 평가할 수 있다. 종양 병변의 가장 큰 직경(일차원적 측정)에서의 변화만이 RECIST 기준에서 이용된다. 병변은 하기에 제공된 기준을 이용하여 측정가능하거나 또는 측정가능하지 않다. 측정가능성(measurability)과 관련하여 용어 "평가가능한(evaluable)"은 사용되지 않을 것이다.
백신에 대한 병변 반응의 평가
표적 병변의 경우, 완전한 반응(CR)은 모든 표적 병변의 소실(disappearance)이다. 부분적 반응(PR)은 기준선의 합(baseline sum) LD를 기준으로 표적 병변의 가장 긴 직경(LD)의 합의 30% 이상 감소이다. 진행성 질병(PD)은 치료가 시작된 이후 또는 하나 이상의 새로운 병변의 출현 이후 기록된 최소의 합 LD를 기준으로, 표적 병변의 LD의 합의 20% 이상의 증가의 관찰이다. 안정한 질병(SD)은 치료가 시작된 이후 최소의 합 LD를 기준으로 PR로 인정되기 위한 충분한 수축(shrinkage)도, PD로 인정되기 위한 충분한 증가도 관찰되지 않는 상태이다.
비-표적 병변의 경우, 완전한 반응(CR)은 모든 비-표적 병변의 소실 및 종양 마커 수준의 정상화이다. 불완전한 반응은 안정한 질병(SD)의 관찰, 하나 이상의 비-표적 병변의 존속(persistence) 및/또는 정상 한계를 초과한 종양 마커 수준의 유지이다. 진행성 질병(PD)은 하나 이상의 새로운 병변의 출현 및/또는 기존의 비-표적 병변의 명확한 진행이다.
PR 또는 CR 상태가 부여되기 위해서는, 종양 측정값의 변화가 반응에 대한 기준이 최초로 충족된 후 4주 내지 8주 사이에 수행된 반복 평가에 의해 확인될 수 있어야 한다. SD의 경우, 후속(follow-up) 측정값은 이상적으로 6주 내지 8주의 최소 간격으로 연구 개시 후 1회 이상 SD 기준을 충족해야 한다.
전체 반응의 지속기간은 CR 또는 PR(어느 것이든 최초로 기록된 것)에 대한 측정값 기준이 충족된 때부터 재발성 또는 진행성 질환이 객관적으로 기록된 최초 일자까지(치료가 시작된 이후 기록된 최소의 측정값 변화를 진행성 질환의 기준으로 함)로 측정된다.
전체적인 CR의 지속기간은 CR에 대한 측정값 기준이 최초로 충족된 시점부터 재발성 질환이 객관적으로 기록된 최초 일자까지로 측정된다.
안정한 질환은 치료가 시작된 이후 기록된 최소의 측정값을 기준으로, 치료 의 개시부터 진행에 대한 기준이 충족될 때까지 측정된다.
모든 개체는 치료에 대한 반응에 대해 평가된다. 각 개체는 하기 중 하나의 범주로 분류된다: 1) 완전한 반응, 2) 부분적 반응, 3) 안정한 질환, 4) 진행성 질환, 5) 악성 질환에 의한 조기 사망(early death from malignant disease), 6) 독성에 의한 조기 사망(early death from toxicity), 7) 다른 원인에 의한 조기 사망(early death because of other cause), 또는 9) 미지(평가 불능, 데이터 부족). 반응 범주 4-9의 개체는 치료에 반응하지 못한 것으로 간주된다(질병 진행).
종말점(Endpoint)(면역 파라미터, 독성 파라미터, 종양 반응)
독성 파라미터는 주로 과립구와 림프구의 수에 의해 측정된다(마이크로리터 당 세포의 수). 200개보다 많은 수의 림프구/㎕ 및 1000개의 호중구/㎕를 회복할때까지의 시간의 양을 결정한다.
T 림프구 반응의 특징을 규명하기 위해 이용될 수 있는 여러 분석법이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있다. 이와 같은 분석법으로부터의 데이터는 일반적으로, 문헌에서 종종 "2-파라미터 히스토그램(2-parameter histogram)"으로 지칭되는, 로그 스케일의 이변량 산포도(bivariate scatter plot)로 표시된다. 수직 및 수평의 기준선(보정된(calibrated) 통계적 "커서(cursor)")이 산포도를 4개의 사분면으로 나누고, 양성/양성 사건이 우측 상단 사분면에 표시된다. 면역 파라미터에 대한, 하나의 일차적 종말점(primary endpoint), 또는 기준 척도(criterion measure)는 세포내 IFN-γ를 생성하는 관문(gated) CD8+ T 림프구의 총 수 대비 CD8+ T 세포의 수(백분율로 표현됨)로 나타낸 백분율 값(또는 빈도)이다. 분석은 환자-내(개체 내) 점수의 쌍(pairwise) 비교(예를 들면, 백신접종-전 대 백신접종-후 빈도)를 포함한다. 연속적인 무작위 변수들, 통상적으로 0.05% 내지 5.0%에서 변하는 작은 수가 있다.
치료 전과 후(예를 들면, 최초 백신접종 후 60일)에 항-종양 면역 반응을 측정한다. 치료 전과 후의 백혈구성분채집술 산출물로부터의 T 세포를 네가티브 선택에 의해 MACS 비드로 분리한다. 세포 내에 시토킨의 축적을 허용하는 골지 차단제(Golgi blocker)의 존재 하에, T 세포를 백신을 위해 사용된 DRibble/DC 또는 입수가능하다면 자가 종양(autologous tumor)으로 자극한다.
T 세포에 의한 IFN-γ 생성을 CD4 및 CD8 항체에 의한 세포 표면 염색 후 세포내 염색(intracellular staining) 기법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들면, 특정한 종양(유방암) 세포 및 비-특정 종양 세포(예를 들면, 전립선 또는 흑색종 세포)로 자극한 T 세포를 CD4, CD8, 및 IFN-γ에 대한 표지된 항체로 염색할 수 있다. 유동 세포측정법을 이용하여, 자극의 존재 또는 부재시 IFN-γ를 생성하는 CD4 및 CD8 T 세포의 백분율을 결정하기 위해 신호를 검출한다. 종양-특이적 반응은 CD8 및 CD4 세포가 유방 종양 세포의 존재 하에 IFN-γ를 생성하나, 비-특이적 종양 세포의 존재시에는 생성하지 않는 경우이다.
실시예 23
프로테아솜 억제제의 투여에 의한 종양의 치료
본 실시예는 개체(예를 들면, 인간 또는 수의학 개체)에서 종양을 치료하기 위해 이용될 수 있는 방법을 설명하며, 상기 방법은 상기 개체에게 하나 이상의 프로테아솜 억제제를 투여하고, 그에 의해 인 비보로 DRibble을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 또한 치료적 유효량의 다른 작용제, 예를 들면, 자가포식을 유도하는 작용제(예를 들면, 라파마이신)의 투여를 포함한다.
종양을 가진 개체에 상기 개체에서 종양에 의한 DRibble의 생성을 자극 또는 강화하기에 충분한 양으로 벨케이드®와 같은 하나 이상의 프로테아솜 억제제를 투여한다. 특정한 실시예에서, 프로테아솜 억제제는 종양 세포의 아포토시스를 유의성 있게 유발하지 않으나, 대신에 종양을 치료하기 위해 T 세포를 통한 면역 반응을 허용하는 양으로 투여된다. 특정한 실시예에서, 개체에 0.1 mg/m2/투여량 이하 또는 0.01 mg/m2/투여량 이하의 벨케이드®와 같이, 1 mg/m2/투여량 이하의 벨케이드®가 투여된다.
프로테아솜 억제제 외에, 다른 치료제가 예를 들면, 상기 프로테아솜 억제제의 투여 전, 투여 동안 또는 투여 후에 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 투니카마이신 또는 단백질의 글리코실화를 감소시키는 다른 작용제가 치사량 미만의 투여량으로 프로테아솜 억제제와 조합되어(또는 상기 프로테아솜 억제제의 투여 직전 또는 직후에), 예를 들면, 상기 개체에서 종양 세포에 의한 DRibble의 생성을 강화하기 위해 투여될 수 있다. 또 다른 또는 추가적인 실시예에서, 시토킨과 같은 면역자극제 또는 아주반트를 예를 들면, 개체에서 DRibble의 형성 후에, 종양-유래 DRiP에 대한 면역 반응을 강화하기 위해 투여한다. 또 다른 실시예에서, PD-1 신호전달을 억제하는 하나 이상의 작용제(예를 들면, 항체 또는 siRNA 분자)를 치료적 유효량으로 개체에게 투여한다(실시예 14 참조). 또 다른 실시예에서, 자가포식을 유도하는 하나 이상의 작용제를 개체에게 투여한다. 예를 들면, 20 mg/kg CCI-779를 정맥내 주입을 통해 투여할 수 있다(예를 들면, 1-5회의 투여량과 같은 하나 이상의 투여량으로). 또 다른 실시예에서, 이와 같은 다른 치료제의 조합이 투여된다.
실시예 24
종양-유래 DRibble 의 투여에 의한 종양의 치료
본 실시예는 개체에서 종양을 치료하기 위해 이용될 수 있는 방법을 설명하며, 상기 방법은 엑스 비보로 생성된 종양-세포 유래 DRibble의 투여를 포함한다.
종양 세포는 치료대상 개체로부터 수득될 수 있거나, 또는 또 다른 개체로부터 수득된 동일한 종류의 종양 세포(예를 들면, 조직 배양 세포주)일 수 있다. 종양 세포를 수득하는 방법이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되어 있다. 세포의 생존력을 지지하는 조건 하에서, 표준 조직 배양 방법을 이용하여 종양 세포를 배양한다. 세포를 단백질의 프로테아솜-매개 분해를 차단하기에 충분한 조건 하에서 프로테아솜 억제제, 예를 들면, 5 ㎍/ml MG132 또는 ALLM, 또는 20-1000 nM 벨케이드®의 존재 하에 인큐베이션하고, 그에 의해 상기 종양 세포가 DRibble을 생성하게 한다. 예를 들면, 종양 세포를 6-48시간 동안, 예를 들면 야간에, 37℃에서 프로테아솜 억제제와 함께 배양할 수 있다.
특정한 실시예에서, 종양 세포를 또한 자가포식을 촉진하는 조건 하에서, 예를 들면, 상기 세포를 아사시키는 조건 하에서 인큐베이션하거나, 또는 상기 세포를 자가포식을 촉진하는 다량의 라파마이신, NH4Cl, 또는 그의 조합과 인큐베이션한다. 예를 들면, 프로테아솜 억제제로 처리된 종양 세포를 뒤이어 자가포식을 촉진하는 조건, 예를 들면, 세포를 아사시키는 조건(예를 들면, HBSS에서의 야간 인큐베이션)하에서 인큐베이션하거나, 또는 10-100 nM 라파마이신 또는 1OmM NH4Cl의 존재 하에 인큐베이션할 수 있다.
세포를 투니카마이신 또는 DRibble 생성을 강화하기에 충분한 치사 미만(sub-lethal) 조건 하에서 글리코실화를 감소시키는 다른 작용제(예를 들면, 브레펠딘 A)와 함께 동시-인큐베이션할 수 있다. 예를 들면, 세포를 37℃에서 6-48 시간 동안 5 ㎍/ml 투니카마이신과 조합된, 5 ㎍/ml MGl32 또는 ALLM, 또는 20-1000 nM 벨케이드®의 존재 하에 인큐베이션할 수 있다.
종양 세포에 의해 생성된 DRibble을 하기와 같이 수집할 수 있다. 저속 원심분리(250g에서 10분간)로 세포 및 배양 상층액을 회수하고 전세포 및 큰 세포 파편을 제거한다. DRibble을 침전시키기 위해 결과물인 상층액을 고속에서 더 원심분리한다(10,000g에서 15분간). 침전물(DRibble을 포함)을 PBS(20 ml)에 재현탁하고 상기와 같이 고속에서 침전시켜 1회 세척한다. 세척된 침전물을 300 ㎕ PBS (10 ㎕ DRibble = 백만 개의 세포)에 재현탁하고 소량씩 액체 질소로 급속 동결시키고 사용시까지 -8O℃에서 유지한다. 대안적으로, 실시예 16에 기재된 초원심분리 방법을 이용할 수 있다. 종양-유래 DRibble을 투여량 당 1 - 1000 mg의 DRibble 농도로 직접 개체에게 투여할 수 있다. DRibble 조성물에 대한 개체의 반응에 따라, 개체에 복수 투여량을 투여할 수 있다. 일 실시예에서, 개체에 3개월 이상의 기간 동안(예를 들면, 6개월 이상 또는 12개월 이상) 2주 간격으로 DRibble을 투여할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 개체에 1개월 동안 2주 간격으로 DRibble을 투여하고, 그 후 1년 이상 매월 투여한다.
DRibble 조성물 외에, 개체에 DRibble의 투여 동안, 투여 전, 또는 투여 후의 한 시점에 다른 치료제를 투여할 수 있다. 예를 들면, 개체에 또한 면역억제제, 항-종양제(예를 들면, 화학요법제), 또는 그들의 조합을 투여할 수 있다.
또 다른 실시예에서, PD-1 신호전달을 억제하는 하나 이상의 작용제(예를 들면, 항체 또는 siRNA 분자)를 치료적 유효량으로 개체에게 투여한다(실시예 14 참조).
실시예 25
DRibble -적재된 APC의 투여에 의한 종양의 치료
본 실시예는 개체에서 종양을 치료하기 위해 이용될 수 있는 방법을 설명하고, 상기 방법은 엑스 비보로 생성된 종양 세포-유래 DRibble이 적재된 APC의 투여를 포함한다.
실시예 1, 15, 또는 16에서 설명된 방법을 이용하여 종양 세포로부터 DRibble을 생성하고 엑스 비보로 수지상 세포에 적재하기 위해 이용한다. 수지상 세포를 실시예 22에 기재된 바와 같이 PBMC로부터 수득한다. DC 배양의 6일 차에, DC를 수집하고 DC 배지 ml당 5 x 106개의 세포로 재현탁시키고 6시간 동안 10-50 ㎍/ml와 함께 인큐베이션한다. DRibble과의 인큐베이션 후에, DC를 PBS에서 2회 세척하고 25 x 106개의 분량으로 동결할 수 있다. 예상되는 수율은 2억 개의 항원-적재된 DC이다.
투여 시, 필요한 경우, DRibble-적재된 DC를 37℃에서 신속하게 해동시키고, PBS로 2회 세척하고 주사용 염수 2 ml에 재현탁한다. DRibble-적재된 DC 조성물을 개체에게 20 x 106 DRibble-적재된 DC의 투여량으로, 예를 들면, 두 개의 별개의 부위에 피하 조직에서 10 x 106 DRibble-적재된 DC의 1 ml의 2회의 주사로 직접 투여한다. DRibble 조성물에 대한 개체의 반응에 따라, 개체에 복수 투여량을 투여할 수 있다. 일 실시예에서, 개체에 3개월 이상의 기간 동안 2주 간격으로 DRibble을 투여할 수 있다.
DRibble-적재된 DC 조성물 외에, 개체에 DRibble-적재된 DC 조성물의 투여 동안, 투여 전, 또는 투여 후의 한 시점에 다른 치료제를 투여할 수 있다. 예를 들면, 개체에 또한 면역자극제(예를 들면, 아주반트), 항-종양제(예를 들면, 화학요법제), 또는 그들의 조합을 투여할 수 있다.
또 다른 실시예에서, PD-1 신호전달을 억제하는 하나 이상의 작용제(예를 들면, 항체 또는 siRNA 분자)를 치료적 유효량으로 개체에게 투여한다(실시예 14 참조).
실시예 26
프로테아솜 억제제 및 자가포식 유도제와 접촉된
종양 세포의 투여에 의한 종양의 치료
본 실시예는 개체에서 종양을 시료하기 위해 이용될 수 있는 방법을 설명하며, 상기 방법은 개체에 존재하는 것과 동일한 종류의 종양 세포와 프로테아솜을 억제하는 하나 이상의 작용제 및 자가포식을 유도하는 하나 이상의 작용제를 접촉시키는 단계를 포함한다.
종양 세포를 프로테아솜 억제제를 억제하는 하나 이상의 작용제 및 자가포식을 유도하는 하나 이상의 작용제와 함께 인큐베이션시킨다. 상기 종양 세포는 개체에 존재하는 것과 동일한 종류의 세포이다. 예를 들면, 상기 개체가 폐암을 가진 경우, 상기 종양 세포는 동일한 종류의 폐암 세포이다. 일부 실시예에서, 종양 세포는 개체로부터, 예를 들면, 생검 시료로부터 수득한다. 다른 실시예에서, 종양 세포는 또 다른 개체로부터 수득된다. 종양 세포를 수득하는 방법이 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지되어 있다.
일 실시예에서, 종양 세포를 프로테아솜을 억제하는 하나 이상의 작용제 및 엑스 비보로 자가포식을 유도하는 하나 이상의 작용제의 존재 하에 인큐베이션한 다. 예를 들면, 개체에 존재하는 것과 동일한 종류의 종양 세포를 프로테아솜을 억제하는 하나 이상의 작용제 및 자가포식을 유도하는 하나 이상의 작용제의 존재 하에 배양한다. 프로테아솜을 억제하는 하나 이상의 작용제 및 자가포식을 유도하는 하나 이상의 작용제와의 인큐베이션은 동시에 일어나거나 또는 순차적으로 하나 다음에 다른 하나와 인큐베이션될 수 있다. 그와 같은 작용제는 자가포식 및 종양 세포에 의한 DRibble의 생성을 자극 또는 강화하기에 충분한 양으로 이용된다.
생존력을 지지하는 조건 하에서, 표준 조직 배양 방법을 이용하여 종양 세포를 배양한다. 특정한 비-한정적 실시예에서, 5백만 내지 2천만 개의 종양 세포(예를 들면, 천만 개의 세포)를 20-1000 nM 벨케이드의 존재 하에 6시간 이상 동안 인큐베이션하고, 세척하고, HBSS 배지(이는 세포를 아사시킴)에서 야간(overnight) 인큐베이션한다. 바람직한 경우, 처리된 종양 세포를 사용 전에 (예를 들면, 20 x 106개의 세포/분량(aliquot)으로) 동결보존할 수 있다. 투여 시, 필요한 경우, 처리된 종양 세포 DRibble-적재된 DC를 37℃에서 신속하게 해동시키고, PBS로 2회 세척하고 주사용 염수 2 ml에 재현탁한다. 처리된 종양 세포(2천만-3억 개, 예를 들면, 5백만 -2천만 개 또는 2천만-2억 개의 세포)를 개체에게 (예를 들면, 피내 또는 피하 주사 또는 펌프를 통해) 투여한다. 조성물에 대한 개체의 반응에 따라, 개체에 복수 투여량을 투여할 수 있다. 일 실시예에서, 개체에 3개월 이상의 기간(예를 들면, 6개월 이상 또는 12개월 이상) 동안 2주 간격으로 DRibble을 투여할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 개체에 조성물을 2주 간격으로 투여하고, 그 후 1 년 동안 매달 투여한다. 또 다른 실시예에서, 개체에 조성물을 매주, 예를 들면, 3개월 이상 동안, 6개월 이상 또는 12개월 이상 동안 투여한다. 특정한 투여량 및 투여 요법(regimen)은 숙련된 임상의에 의해 결정될 수 있다.
처리된 종양 세포 외에, 개체에 종양 세포의 투여 동안, 투여 전, 또는 투여 후의 한 시점에 다른 치료제를 투여할 수 있다. 예를 들면, 개체에 또한 면역자극제(예를 들면, 아주반트), 항-종양제(예를 들면, 화학요법제), 또는 그들의 조합을 투여할 수 있다.
실시예 27
병원체-감염된 세포로부터의 DRibble 의 생성
본 실시예는 DRibble을 생성하기 위해 병원체(또는 병원체 항원을 코딩하는 벡터)로 엑스 비보로 감염된 세포를 치료하기 위해 이용될 수 있는 방법을 설명한다. 특정한 병원체 및 세포가 본 실시예에 설명되나, 이 개시 및 다른 공지된 방법을 이용하여, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 통상적인 방법을 이용하여 세포와 병원체의 다른 조합을 이용할 수 있다.
바이러스
일 실시예에서, 신장세포주 293(ATCC)를 아데노바이러스로, 예를 들면, 아데노바이러스 벡터의 형태의 아데노바이러스로 감염시킨다. 293T 세포를 37℃에서 10의 M.O.I로 재조합 아데노바이러스로 감염시킨다.
또 다른 실시예에서, 인간 T 세포를 예를 들면, HIV 벡터의 형태인 HIV로 감염시킨다. 세포(예를 들면, 2 x 105 - 2 x 106 개의 세포)를 37℃에서 24시간 이상 동안 HIV에 의한 세포의 감염을 허용하기에 충분한 조건 하에서, 50 이상 또는 100 이상과 같은, 20 이상의 감염 다중도(Multiplicity Of Infection :MOI)로 감염시킨다.
세균(Bacteria)
또 다른 실시예에서, 대식세포를 세균, 예를 들면, 마이코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)와 같은 세균으로 감염시킨다. 세균 현탁액을 23 게이지(guage) 니들을 통해 10회 통과시키고 상기 현탁액을 짧은 시간 동안 볼텍스 교반(vortex agitate)하는 것에 의해 마이코박테리움 튜베르큘로시스(예를 들면, 균주 H37Rv(ATCC 27294) 또는 에르드만(Erdman)(ATCC 35801))를 108 개의 세균/ml로 조정한다. 상기 현탁액을 15-ml 폴리스티렌 튜브에서 5분간 방치하고 상층의 5 ml를 제거하여 접종원(inoculum)으로 이용한다. 상기 접종원을 Ziehl-Neelson 기법에 의해 염색하고 광학 현미경으로 관찰하여 분산된 제제(dispersed preparation)이 이용된다는 것을 확인할 수 있다. 세균의 생존력은 LIVE-DEAD 분석법(Molecular Probes, Eugene, OR)을 이용하여 확인될 수 있다. 통상적인 방법을 이용하여 PBMC로부터 단핵세포-유래 대식세포를 수득할 수 있다. 예를 들면, Ficoll-Histopaque(Sigma Chemicals, St. Louis, MO) 구배 상의 헤파린처리된 혈액으로부터 분리된 PBMC를 20% 자가 혈청이 보충된 RPMI 1640의 존재 하에 (예를 들면, 24-웰 조직 배양 디쉬에서) 배양한다. 3 내지 4일 후에 단핵세포가 대식세포로 성숙된다. 37℃에서 1시간 이상동안 10% 자가 혈청을 포함한 RPMI 1640에서 대식세포 단일층(monolayer)(약 5 X 105 개의 세포)을 마이코박테리움 튜베르큘로시스(약 5 x 105 - 5 x 106 개의 세균/단일층)와 인큐베이션한다. 상기 단일층을 세척하여 결합되지 않은 세포외 세균을 제거할 수 있다.
균류(Fungus)
또 다른 실시예에서, 대식세포를 히스토플라스마(Histoplasma) 세포와 같은 균류로 감염시킨다. 약 102 내지 105 개의 균사 입자(mycelial particle)를 37℃에서 24시간 이상과 같은 12시간 이상 동안, 상기 균류에 의한 세포의 감염을 허용하기에 충분한 조건 하에서 1 x 105 개의 세포에 노출시킨다.
원생동물(Protozoa)
또 다른 실시예에서, 적혈구를 통상적인 방법(예를 들면, Trager and Jensen, Science 193:673-5, 1976 참조)을 이용하여, 플라스모디움(Plasmodium)과 같은 원생동물로 감염시킨다. 예를 들면, 1% 기생충혈증(parasitemia)과 2% 적혈 구의 배양을 18-24 시간 동안 37℃-38℃, 저-산소 대기(1-5 % O2, 3 % -7% CO2, 밸런스(balance) N2)와 같은, 원생동물에 의한 적혈구의 감염을 허용하기에 충분한 조건 하에서 인큐베이션한다. 바람직한 경우, 원생동물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 표준 방법(예를 들면, 5% 소르비톨 또는 아피디콜린 1.5 ㎍/ml를 사용함)을 이용하여 동조화될 수 있다.
DRibble의 생성
그 후, 감염된 세포를 프로테아솜 억제제에 노출시킨다. 예를 들면, 배양된 감염 세포(예를 들면, 약 3천만 개의 세포)를 단백질의 프로테아솜-매개 분해를 차단하기 위해 6-48시간 동안 ALLM 또는 MG132(5 ㎍/ml) 또는 20-1000 nM 벨케이드®로 처리한다. 또한, 투니카마이신(예를 들면, 5 ㎍/ml에서) 또는 단백질의 글리코실화를 감소시키는 다른 작용제를 DRibble 생성을 강화하기 위해 상기 감염된 세포와 동시-인큐베이션시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 그 후, 상기 세포를 자가포식을 유도하는 조건, 예를 들면, 12-24시간 동안 HBSS 배지에서 또는 1-100 nM 라파마이신에(예를 들면, 리소솜 기능을 감소시키기 위해 10 mM NH4Cl의 존재 하에) 노출시킨다. 상기 세포를 프로테아솜 억제제(및 일부 실시예에서 자가포식 유도제)에 노출시킨 후, DRibble을 생성하는 세포를 병원체 또는 벡터에 의해 코딩된 항원성 펩티드에 대해 면역자극하기 위해, 예를 들면, 실시예 28에 기재된 바와 같이, 개체에 투여한다.
일부 실시예에서, DRibble을 하기와 같이 수집한다. 저속 원심분리(250g에서 10분간)로 배양 상층액을 회수하고 전체 세포 및 큰 세포 파편을 제거한다. DRibble을 침전시키기 위해 결과물인 상층액을 고속에서 더 원심분리한다(10,000g에서 15분간). 상기와 같이 침전물(DRibble을 포함)을 PBS(20 ml)에 재현탁하고 고속에서 침전시켜 1회 세척한다. 세척된 침전물을 300 ㎕ PBS (10 ㎕ DRibble = 백만 개의 세포)에 재현탁하고 소량씩 액체 질소로 급속 동결시키고 사용시까지 -8O℃에서 유지한다.
결과물인 DRibble을 개체에게 투여하여 감염을 치료하거나 또는 엑스 비보로 APC를 자극할 수 있고, 예를 들면, 실시예 28에 기재된 바와 같이, 상기 DRibble-자극된 APC를 개체에게 투여할 수 있다.
실시예 28
감염을 치료하기 위한 면역자극제의 투여
본 실시예는 실시예 27에 기재된 면역자극제(처리된 세포, 분리된 DRibble, 또는 DRibble-자극된 APC)를 이용하여 병원체에 대한 면역 반응을 자극하는 방법을 설명한다. DRibble을 직접 개체에게 투여하거나 또는 APC에 적재하기 위해 이용하고 상기 적재된 APC를 개체에게 투여할 수 있다. 그와 같은 방법은 미래에 병원체 감염을 예방하거나 또는 감염의 심각도를 경감시키기 위해 예방적으로 이용되거나, 또는 병원체 감염을 갖는 개체를 치료하기 위해 이용될 수 있다.
일 실시예에서, 병원체 감염된 세포(또는 펩티드 항원을 발현하는 형질유도 된 세포)는 프로테아솜 억제제, 자가포식 유도제, 또는 프로테아솜 억제제 및 자가포식 유도제와의 인큐베이션에 의해 DRibble을 생성한다. 예를 들면, 천만 개 이상의 그와 같은 처리된 세포(예를 들면, 2천만 개, 또는 5천만 개의 세포, 예를 들면, 1천만개-2억만 개 또는 2천만-3억만 개의 처리된 세포)를 개체에 투여하거나, 항균성 화합물(예를 들면 항바이러스 작용제 또는 항세균 작용제)와 같은 치료제 또는 약제학적으로 허용가능한 담체의 존재 하에 투여할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 처리된 세포를 아주반트 또는 다른 면역자극제의 존재 하에 투여한다. 대표적인, 비-한정적인 투여 양식은 피하(s.c.), 피내(i.d.), 정맥내(i.v.) 및 복막내(i.p.) 투여를 포함한다.
일 실시예에서, DRibble을 직접 개체에게 투여한다. 예를 들면, 1 - 1,000 ㎍(예를 들면, 10 ㎍, 100 ㎍, 또는 1 mg)의 DRibble을 단독으로 개체에게 투여하거나 또는 항균성 화합물(예를 들면 항바이러스 작용제 또는 항세균 작용제)와 같은 치료제 또는 약제학적으로 허용가능한 담체의 존재 하에 투여할 수 있다. 또 다른 실시예에서, DRibble을 아주반트 또는 다른 면역자극제의 존재 하에 투여한다. 대표적인, 비-한정적인 투여 양식은 피하(s.c.), 피내(i.d.), 정맥내(i.v.) 및 복막내(i.p.) 투여를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 개체에게 투여될 때 인 비보로 원형의 T 세포를 자극할 APC에 적재하기 위해 DRibble을 이용한다. 본 실시예는 DC의 APC로서 용도를 설명하나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 다른 APC가 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 실시예 22에 기재된 바와 같이, 개체로부터 수득된 PBMC로부터 DC 를 생성할 수 있다. 대안적으로, 실시예 9 또는 10에 일반적으로 기재된 바와 같이, 골수 유래 DC를 제조할 수 있다.
실시예 22에 기재된 바와 같이, DRibble-적재된 수지상 세포를 제조한다. 요약하면, 배양 배지 ml 당 2백만 - 6백만 개의 세포로 배양된 DC를 6시간 이상 동안 10 -100 ㎕/ml의 DRibble과 인큐베이션한다.
결과물인 DRibble-적재된 APC를 개체로의 투여 전에 세척할 수 있다. DRibble-적재된 APC를 단독으로 개체에게 투여하거나 또는 약제학적으로 허용가능한 담체의 존재 하에 투여할 수 있다. 또 다른 실시예에서, DRibble-적재된 APC를 아주반트 또는 다른 면역자극제의 존재 하에 투여한다. 대표적인, 비-한정적인 투여 양식은 피하(s.c.), 피내(i.d.), 정맥내(i.v.) 및 복막내(i.p.) 투여를 포함한다. 일 실시예에서, 5 -50 x 106개의 DRibble-적재된 APC를 예를 들면, 하나 이상의 단위 투여량(unit dose)으로 투여한다.
실시예 29
프로테아솜 억제제의 투여에 의한 감염의 치료
본 실시예는 개체(예를 들면, 인간 또는 수의학 개체)에서 감염을 치료하기 위해 이용될 수 있는 방법을 설명하고, 상기 방법은 상기 개체에게 치료적 유효량의 하나 이상의 프로테아솜 억제제, 자가포식 유도제, 또는 양자 모두를 투여하고, 그에 의해 인 비보에서 DRibble을 생성하고 상기 개체를 치료하는 것을 포함한다. 감염을 가진 개체에게 벨케이드®와 같은 프로테아솜 억제제를 상기 개체에서 병원체 감염 세포에 의한 DRibble의 생성을 자극하거나 또는 강화하기에 충분한 양으로 투여한다. 특정한 실시예에서, 프로테아솜 억제제를 감염된 세포의 아포토시스를 유의성있게 유발하지 않으나, 대신에, 감염을 치료하기 위해 T-세포를 통한 면역 반응을 허용하는 양으로 투여한다. 특정한 실시예에서, 0.1 mg/m2/투여량 이하 또는 0.01 mg/m2/투여량 이하의 벨케이드®와 같이, 1 mg/m2/투여량 이하의 벨케이드®가 투여된다.
프로테아솜 억제제 외에, 다른 치료제가 예를 들면, 상기 프로테아솜 억제제의 투여 전, 투여 동안 또는 투여 후에 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 투니카마이신 또는 단백질의 글리코실화를 감소시키는 다른 작용제가 치사량 미만의 투여량으로 프로테아솜 억제제와 조합되어(또는 상기 프로테아솜 억제제의 투여 직전 또는 직후에), 예를 들면, 상기 개체에서 감염된 세포에 의한 DRibble의 생성을 강화하기 위해 투여될 수 있다. 또 다른 또는 추가적인 실시예에서, 시토킨과 같은 면역자극제를 개체에서 예를 들면, 상기 감염된 세포-유래 DRiP에 대한 면역 반응을 강화하기 위해 투여한다. 특정한 실시예에서, 개체에서 DRibble의 형성 후에 아주반트를 투여한다.
또 다른 실시예에서, 자가포식을 유도하는 하나 이상의 작용제를 개체에게 투여한다. 예를 들면, 20 mg/kg CCI-779를 정맥내 주입을 통해 투여할 수 있다(예를 들면, 1-5회의 투여량과 같은 하나 이상의 투여량으로). 또 다른 실시예에서, 이와 같은 다른 치료제의 조합이 투여된다.
개시된 발명의 원칙들이 적용될 수 있는 다수의 가능한 구체예를 고려하여, 예시된 구체예는 본 발명의 실시예에 불과하며 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 받아들여져서는 안된다는 것이 인식될 것이다. 오히려, 본 발명의 범위는 하기의 청구항에 의해 정의된다. 따라서, 본 발명자는 이 청구항들의 범위 및 원리 내에 속하는 모든 것을 본 발명으로 청구한다.

Claims (45)

  1. 표적 세포가 수포(bleb)에 담긴 표적 항원의 불완전 리보솜 생성물(DRiP)(DRiP in bleb: DRibble)을 생성하도록 표적 세포를 자극하기에 충분한 조건 하에서 상기 표적 세포를 유효량의 프로테아솜(proteasome) 억제제와 접촉시키는 단계; 및
    상기 DRiP가 항원 제시 세포(APC)에 의해 제시되게 하여, 상기 표적 항원의 하나 이상의 DRiP에 대한 면역 반응을 자극하는 단계를 포함하는, 표적 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로테아솜 억제제의 유효량은 실질적으로 상기 표적 세포의 아포토시스(apoptosis)를 유도하지 않는 양인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 표적 세포를 상기 하나 이상의 DRiP에 대한 면역 반응을 자극하는 면역자극제와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 면역자극제는 아주반트(adjuvant)인 것인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 면역자극제는 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포를 단백질의 글리코실화를 감소시키는 작용제, 자가포식(autophagy) 유도제, 리소솜-매개 단백질 분해를 감소시키기에 충분한 양의 NH4Cl, 또는, 그들의 조합과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 종양 세포인 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 종양 세포는 암 세포인 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 종양 세포는 양성 종양 세포인 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 세포는 병원체 또는 병원체-특이적 항원을 발현하는 벡터로 감염된 포유동물 세포인 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 프로테아솜 억제제는 가역적 프로테아솜 억제제를 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 표적 세포는 개체에 존재하고, 상기 표적 세포를 상기 프로테아솜 억제제와 접촉시키는 단계는 상기 프로테아솜 억제제를 상기 개체에 투 여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 표적 세포는 상기 개체 내의 종양 세포이고, 상기 프로테아솜 억제제를 투여하기 전에 상기 개체에 치료적 유효량의 림프구고갈제(lymphodepletion agent)를 투여하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 표적 세포를 상기 프로테아솜 억제제와 접촉시키는 단계는 상기 표적 세포를 엑스 비보로(ex vivo) 상기 프로테아솜 억제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 표적 세포로부터 상기 DRibble를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 DRiP가 APC에 의해 제시되게 하는 단계는 상기 DRibble을 엑스 비보로 상기 APC와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 DRiP가 APC에 의해 제시되게 하는 단계는 개체에 치료적 유효량의 상기 DRibble을 투여하여, 그에 의해 인 비보(in vivo)로 상기 DRiP가 APC에 의해 제시되게 하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 DRibble은 상기 개체에게 DRibble를 투여하기 전에 분리되는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 DRiP가 APC에 의해 제시되게 하는 단계는 상기 프로테아솜 억제제와 접촉된 표적 세포를 개체에 투여하여, 그에 의해 인 비보로 상기 DRiP가 APC에 의해 제시되게 하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 표적 세포는 엑스 비보로 상기 프로테아솜 억제제와 접촉되는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 APC는 수지상 세포(DC)인 것인 방법.
  22. 개체에서 종양 세포에 대한 면역 반응을 자극하는 방법으로서,
    DRibble을 생성하고 자가포식을 유도하기에 충분한 조건 하에서 상기 개체 내에 존재하는 종양 세포와 동일한 종류의 종양 세포를 프로테아솜 억제제 및 자가포식 유도제에 노출시키는 단계;
    상기 DRibble을 분리하여, 그에 의해 분리된 DRibble의 집단을 생성하는 단계;
    상기 분리된 DRibble을 상기 개체로부터 유래된 말초혈액 단핵세포(PBMC)로 부터 수득된 항원 제시 세포(APC)와 함께 상기 APC가 하나 이상의 DRiP를 제시하기에 충분한 조건하에서 인큐베이션하여, 그에 의해 DRibble-적재된 APC를 생성하는 단계; 및
    상기 개체에게 치료적 유효량의 상기 DRibble-적재된 APC를 투여하여, 그에 의해 하나 이상의 DRiP에 대한 면역 반응을 자극하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 종양 세포는 상기 개체로부터 수득되는 것인 방법.
  24. 개체에서 종양 세포에 대한 면역 반응을 자극하는 방법으로서,
    DRibble를 생성하기에 충분한 조건 하에서 상기 개체 내에 존재하는 종양 세포와 동일한 종류의 종양 세포를 프로테아솜 억제제 및 자가포식 유도제에 노출시키는 단계;
    상기 DRibble을 분리하여, 그에 의해 분리된 DRibble의 집단을 생성하는 단계; 및,
    상기 개체에게 상기 분리된 DRibble의 치료적 유효량을 투여하여, 그에 의해 하나 이상의 DRiP에 대한 면역 반응을 자극하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 개체에게 면역자극제를 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 개체에게 치료적 유효량의 PD-1 신호전달 억제제를 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  27. 세포에 의해 수포 내에 담긴 불완전 리보솜 생성물(DRiP)(DRibble)을 생성하는 방법으로서,
    상기 세포가 DRibble을 생성하기에 충분한 조건 하에서 상기 세포를 프로테아솜 억제제와 접촉시켜, 그에 의해 상기 세포에 의해 DRibble을 생성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 세포에 의한 DRibble의 생성을 강화시키기에 충분한 조건 하에서, 상기 세포를 글리코실화를 감소시키는 작용제, 자가포식 유도제, 리소솜-매개 단백질 분해를 감소시키기에 충분한 양의 NH4Cl, 또는, 그들의 조합과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 세포에 의해 분비된 DRibble을 수집하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 종양 세포인 것인 방법.
  31. 제27항에 있어서, 상기 세포는 병원체에 의해 감염된 포유동물 세포인 것인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 상기 수집하는 단계는 상기 세포로부터 DRibble을 분리하는 단계, 및 상기 DRibble을 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 DRibble은 90% 이상 순수한 것인 방법.
  34. 제27항의 방법을 이용하여 생성된 분리된 DRibble.
  35. 제34항의 분리된 DRibble을 포함하는 면역원성 조성물.
  36. 제37항에 있어서, 항-종양 화학요법제, 면역자극제, 상기 DRibble로 적재된 APC, 또는 그들의 조합을 더 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  37. 제35항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 백신인 것인 방법.
  38. DRibble의 정제된 집단을 제조하는 방법으로서,
    세포 내에서 실질적으로 단백질 분해를 억제하기에 충분한 조건 하에 상기 세포를 프로테아솜 억제제와 접촉시키는 단계;
    상기 세포에서 자가포식을 실질적으로 증가시키기에 충분한 조건 하에 상기 세포를 자가포식 유도제와 접촉시키는 단계;
    상기 세포를 침전시키나 DRibble은 침전시키지 않기에 충분한 조건 하에 상기 세포를 원심분리하는 단계;
    DRibble을 포함하는 상층액을 회수하는 단계;
    상기 DRibble을 침전시키기에 충분한 조건 하에서 상기 상층액을 원심분리하는 단계; 및
    상기 DRibble을 포함하는 침전물을 회수하여, 그에 의해 DRibble의 정제된 집단을 제조하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  39. 개체에게 치료적 유효량의 제35항의 면역원성 조성물을 투여하여, 상기 개체에서 하나 이상의 DRiP에 대한 면역 반응을 자극하는 단계를 포함하는, 개체에서 하나 이상의 DRiP에 대한 면역 반응을 자극하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 개체는 종양을 가지며, 상기 세포는 종양 세포인 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 개체에 상기 면역원성 조성물의 투여 전에 치료적 유효량의 림프구고갈제(lymphdepletion agent)를 투여하는 것인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 상기 DRibble은 병원체로 감염된 세포로부터 분리되는 것인 방법.
  43. 제39항에 있어서, 상기 개체에게 상기 면역원성 조성물을 투여하는 단계는 180일 이상의 기간 동안 상기 면역원성 조성물의 3회 이상의 투여량의 투여를 포함하는 것인 방법.
  44. DRibble을 생성하는 종양 세포를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 종양 세포는 프로테아솜 기능을 억제하기에 충분한 양의 프로테아솜 억제제 및 상기 종양 세포에서 자가포식을 유도하기에 충분한 양의 자가포식 유도제의 존재하에 인큐베이션된 것인 면역원성 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 면역자극제를 더 포함하는 것인 면역원성 조성물.
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