MX2007008013A

MX2007008013A - Metodos para producir, mejorar y sostener respuestas inmunes contra epitopos i-restringidos clase mhc por propositos profilacticos o terapeuticos.

Info

Publication number: MX2007008013A
Application number: MX2007008013A
Authority: MX
Inventors: Adrian Ion Bot; Xiping Liu; Kent Andrew Smith
Original assignee: Mannkind Corp
Priority date: 2004-12-29
Filing date: 2005-12-29
Publication date: 2008-02-07
Also published as: SG158154A1; WO2006071989A2; IL184273A; AU2005321904A1; CN101146550A; AU2005321904B2; EP1835932A2; US20060165711A1; CA2594224A1; HK1120722A1; WO2006071989A3; KR101294290B1; KR20070094641A; JP2008526763A; WO2006071989A9; IL184273A0; CN101146550B

Abstract

Modalidades de la invencion aqui descrita se refieren a metodos y composiciones para desviar la participacion de celulas CD4+ cuando se generan respuestas inmunes I-restringidas de clase MHC y anticuerpo, controlando la naturaleza y magnitud de la respuesta, y promoviendo intervencion inmunologica efectiva en patogenesis viral. Mas especificamente, modalidades se refieren a composiciones inmunogenicas para vacunacion particularmente vacunacion terapeutica, contra VIH (HIV) y otros patogenos microbianos, que impactan el funcionamiento del sistema inmune, su naturaleza, y el orden, sincronizacion y ruta de administracion por los cuales se emplean efectivamente.

Description

MÉTODOS PARA PRODUCIR, MEJORAR Y SOSTENER RESPUESTAS INMUNES CONTRA EPÍTOPOS I-RESTRINGIDOS CLASE MHC POR PROPÓSITOS PROFILÁCTICOS O TERAPÉUTICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Las modalidades de la invención revelada en la presente son concernientes con métodos y composiciones para inducir una respuesta inmune restringida de Clase I de MHC y controlar la naturaleza y magnitud de la respuesta, promover intervención inmunológica efectiva en procesos patogénicos. Más en particular las modalidades son concernientes con composiciones inmunogénicas, su naturaleza y el orden, sincronización y ruta de administración mediante los cuales son usadas efectivamente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El complejo de histocompatibilidad mayor y reconocimiento de objetivo de célula T Los linfocitos T (células T) son células inmune antígeno-específicas que funcionan en respuesta a señales de antígeno específicas. Los linfocitos B y los anticuerpos que producen son también entidades antígeno-específicas . Sin embargo, a diferencia de los linfocitos B, las células T no responden a antígenos en una forma libre o soluble. Para que una célula T responda a un antígeno, se requiere que el antígeno sea enlazado a un complejo de presentación conocido como el complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) . Las proteínas de MHC proporcionan el medio mediante el cual las células T diferencian las células naturales o "auto" células de las células extrañas. Las moléculas de MHC son una categoría de receptores inmunes que presentan epítopos de péptido potenciales a ser verificados subsecuentemente por las células T. Hay dos tipos de MHC, MHC Clase I y MHC Clase II. Las células T de CD4+ interactúan con las proteínas de MHC de Clase II y tienen predominantemente un fenotipo auxiliar en tanto que las células T de CD8+ interactúan con las proteínas de MHC de Clase I y tienen predominantemente un fenotipo citolítico, pero cada uno de ellos puede también exhibir función reguladora, particularmente supresora. Ambos MHC son proteínas de transmembrana con una mayoría de su estructura sobre la superficie externa de la célula. Adicionalmente, ambas clases de MHC tienen una hendidura de enlace de péptido sobre sus porciones externas. Es en esta hendidura que los fragmentos pequeños de proteína, naturales o extrañas, son enlazadas y presentadas al ambiente extracelular. Las células llamadas células que presentan antígeno (APC) exhiben antígenos a células T utilizando el MHC. Las células T pueden reconocer un antígeno, si es presentado sobre el MHC. Este requerimiento es llamado restricción de MHC. Si un antígeno no es mostrado por un MHC reconocible, la célula T no reconocerá y actuará sobre la señal de antígeno. Las células específicas para el péptido enlazado a un MHC reconocible se enlazan a estos complejos de MHC-péptido y proceden a las siguientes etapas de la respuesta inmune. Los correspondientes a los epítopos restringidos Clase I o Clase II de MHC nominales están entre las formas más simples de antígeno que puede ser administradas para el propósito de inducir, amplificar o manipular de otra manera la respuesta de célula T. A pesar del hecho de que los epítopos de péptido han mostrado ser efectivos in vitro en la re-estimulación de líneas de célula T cebadas in vivo, clones o hibridomas de célula T, su eficacia in vivo ha estado muy limitada. Esto es debido a dos factores principales: (1) El perfil farmacocinético (PK) deficiente de péptidos, provocado por el despeje renal rápido y/o degradación in vivo, dando como resultado acceso limitado a APC; (2) La insuficiencia de señalización receptor de célula T (TCR) -dependiente antígeno-inducida (señal 1) para inducir o amplificar una respuesta inmune fuerte o sostenida y particularmente una respuesta que consiste de células Tcl o Thl (que producen IFN-? y TNF-alfa) . Además, el uso de dosis grandes de péptido o adyuvantes de depósito con el fin de circunvenir la PK limitada asociada con péptidos, puede disparar un grado variable de insensibilidad o "desviación inmune" a no ser que ciertos adyuvantes de potenciación o modulación inmunes sean usados en conjunción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Modalidades de la presente invención incluyen métodos y composiciones para manipular y en particular para inducir, ocasionar y/o amplificar, la respuesta inmune a epítopos restringidos de Clase I de MHC. Algunas modalidades son concernientes con métodos de inmunización. Los métodos pueden incluir, por ejemplo, administrar a un mamífero una primera composición que incluye un inmunógeno, el inmunógeno puede incluir o codificar por lo menos una porción de un primer antígeno; y administrar una segunda composición, que puede incluir un péptido de amplificación, directamente a un sistema linfático del mamífero, en donde el péptido corresponde a un epítopo del primer antígeno, en donde la primera composición y la segunda composición no son las mismas. Los métodos pueden incluir además la etapa de obtener, analizar o detectar la respuesta de célula T efectora. La primera composición puede incluir un ácido nucleico que codifica el antígeno o un fragmento inmunógeno del mismo. La primera composición puede incluir un ácido nucleico capaz de expresar el epítopo en pAPC . El ácido nucleico puede ser administrado como un componente de un protozoario, bacteria, virus o vector viral. La primera composición puede incluir un polipéptido inmunógeno y un inmunopotenciador, por ejemplo. El inmunopotenciador puede ser una citocina, un ligando receptor semejante a taza y los semejantes. Los adyuvantes pueden incluir una secuencia inmunoestimuladora, un ARN y los semejantes. El polipéptido inmunógeno puede ser un péptido de amplificación. El polipéptido inmunógeno puede ser un primer antígeno. El polipéptido inmunógeno puede ser administrado como un componente de un protozoario, bacteria, virus, vector viral o partícula semejante a virus o los semejantes. El adyuvante puede ser administrado como un componente de un protozoario, bacteria, virus, vector viral o partícula semejante a virus o los semejantes. La segunda composición puede estar libre de adyuvante y libre de inmunopotenciador. La etapa de administración puede incluir administración directa al sistema linfático del mamífero. La administración directa al sistema linfático del mamífero puede incluir administración directa a un nodo linfático o vaso linfático. La administración directa puede ser a dos o más nodos linfáticos o vasos linfáticos. El nodo linfático puede ser, por ejemplo, nodos inguinales, axilares, cervicales o tonsilares. La respuesta de célula T efectora puede ser una respuesta de célula T citotóxica. La respuesta de célula T efectora puede incluir producción de una citocina pro-inflamatoria y la citocina puede ser por ejemplo, (gamma) ?-IFN o TNFa (alfa). La respuesta de célula T efectora puede incluir la producción de una quimiocina de célula T, por ejemplo, RANTES o MlP-la o los semejantes. El epítopo puede ser un epítopo de mantenimiento o un epítopo inmune, por ejemplo. La etapa de administración o la etapa de administración puede incluir una inyección de un solo bolo, inyecciones de bolo repetidas, por ejemplo. La etapa de alimentación o la etapa de administración puede incluir una infusión continua, que por ejemplo puede tener una duración de entre aproximadamente 8 a aproximadamente 7 días. El método puede incluir un intervalo entre la terminación de la etapa de administración y el comienzo de la etapa de administración, en donde el intervalo puede ser de por lo menos aproximadamente siete días. También, el intervalo puede ser de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 14 días, aproximadamente 17 días, aproximadamente 20 días, aproximadamente 25 días, aproximadamente 30 días, aproximadamente 40 días, aproximadamente 50 días o aproximadamente 60 días, por ejemplo. El intervalo puede ser de más de aproximadamente 75 días, aproximadamente 80 días, aproximadamente 90 días, aproximadamente 100 días o más. El primer antígeno puede ser un antígeno asociado con la enfermedad y el antígeno asociado con la enfermedad puede ser un antígeno asociado al tumor, un antígeno asociado al patógeno. Modalidades incluyen métodos de tratamiento de la enfermedad utilizando el método descrito de inmunización. El primer antígeno puede ser un antígeno objetivo-asociado. El objetivo puede ser una célula neoplásica, una célula patógeno-infectada y los semejantes. Por ejemplo, cualquier célula neoplásica puede ser apuntada. Las células patógeno-infectadas pueden incluir, por ejemplo, células infectadas por una bacteria, un virus, un protozoario, un hongo y los semejantes o afectada por un prión, por ejemplo. La respuesta de célula T efectora puede ser detectada mediante por lo menos un indicador por ejemplo, una análisis de citocina, un análisis de Elispot, un análisis de citotoxicidad, un análisis de tetrámero, una respuesta DTH, una respuesta clínica, encogimiento de tumor, despeje de tumor, inhibición de avance de tumor, título de patógeno disminuido, despeje de patógeno, mejora de un síntoma de la enfermedad y los semejantes. Los métodos pueden incluir además obtener, detectar o analizar una respuesta de célula T efectora al primer antígeno . Modalidades adicionales son concernientes con métodos de inmunización que incluyen alimentar a un mamífero una primera composición que incluye un ácido nucleico que codifica un primer antígeno o un fragmento inmunógeno del mismo; administrar una segunda composición, que incluye un péptido, directamente al sistema linfático del mamífero, en donde el péptido corresponde a un epítopo del primer antígeno. Los métodos pueden incluir además obtener, detectar o analizar una respuesta de célula T efectora al antígeno.

También, modalidades son concernientes con métodos para aumentar una respuesta inmune antígeno-específica existente. Los métodos pueden incluir administrar una composición que incluye un péptido, directamente al sistema linfático de un mamífero, en donde el péptido corresponde a un epítopo del antígeno y en donde la composición no fue usada para inducir la respuesta inmune. Los métodos pueden incluir además obtener, detectar o analizar el aumento de una respuesta inmune antígeno-específica . El aumento puede incluir sostener la respuesta con el paso del tiempo, reactivar células T quiescentes, expandir la población de células T antígeno-específicas y los semejantes. En algunos aspectos, la composición no incluye un inmunopotenciador. Otras modalidades son concernientes con métodos de inmunización que pueden incluir alimentar a un mamífero una primera composición que comprende un inmunógeno, el inmunógeno puede incluir o codificar por lo menos una porción de un primer antígeno y por lo menos una porción de un segundo antígeno; administrar una segunda composición que incluye un primer péptido y un tercera composición que incluye un segundo péptido, directamente al sistema linfático del mamífero, en donde el primer péptido corresponde a un epítopo del primer antígeno y en donde el segundo péptido corresponde a un epítopo del segundo antígeno, en donde la primera composición puede no ser la misma como la segunda o tercera composiciones. Los métodos pueden incluir además obtener, detectar o analizar una respuesta de célula T efectora a los primeros y segundos antígenos. Cada una de las segundas y terceras composiciones pueden incluir los primeros y los segundos péptidos. Las segundas y terceras composiciones pueden ser parte de una sola composición . Todavía modalidades adicionales son concernientes con métodos para generar una respuesta inmune tolerogénica o regulatoria antígeno-específica . Los métodos pueden incluir administrar periódicamente una composición, que incluye un péptido libre de adyuvante, directamente al sistema linfático de un mamífero, en donde el péptido corresponde a un epítopo del antígeno, y en donde el mamífero puede ser epitópicamente natural. Los métodos pueden incluir además obtener, detectar y analizar una respuesta inmune de célula T tolerogénica o regulatoria. La respuesta inmune puede ayudar en el tratamiento de una alteración inflamatoria, por ejemplo. La alteración inflamatoria puede ser, por ejemplo, de una respuesta inmune MHC-restringida de Clase II. La respuesta inmune puede incluir la producción de una citocina inmunosupresora, por ejemplo, IL-5, IL-10 o TGB-ß y los semejantes. Modalidades son concernientes con métodos de inmunización que incluyen la administración de una serie de dosis inmunogénicas directamente al sistema linfático de un mamífero, en donde la serie puede incluir por lo menos 1 dosis de arrastre y por lo menos 1 dosis de amplificación y en donde la dosis de arrastre puede incluir un ácido nucleico que codifica un inmunógeno y en donde la dosis de amplificación puede estar libre de cualquier virus, vector viral o vector de replicación-competente . Los métodos pueden incluir además obtener una respuesta inmune antígeno-específica . Los métodos pueden incluir, por ejemplo, 1 a 6 o más dosis de arrastre. El método puede incluir administrar una pluralidad de dosis de arrastre, en donde las dosis son administrados en el curso de uno a aproximadamente siete días. Las dosis de arrastre, dosis de amplificación o dosis de arrastre y amplificación pueden ser administradas en múltiples pares de inyecciones, en donde un primer miembro de un par puede ser administrado en el transcurso de aproximadamente 4 días de un segundo miembro del par, y en donde un intervalo entre primeros miembros de pares diferentes puede ser de por lo menos aproximadamente 14 días. Un intervalo entre una última dosis de arrastre y una primera dosis de amplificación puede ser de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 100 días, por ejemplo. Otras modalidades son concernientes con conjuntos de composiciones inmunogénicas para inducir una respuesta inmune en un mamífero que incluye 1 a 6 o más dosis de arrastre y por lo menos una dosis de amplificación, en donde las dosis de arrastre pueden incluir un ácido nucleico que codifica un inmunógeno y en donde la dosis de amplificación puede incluir un epítopo de péptido, y en donde el epítopo puede ser presentado o es presentable mediante pAPC que expresa el ácido nucleico. La dosis puede incluir además un adyuvante, por ejemplo, ARN. Las dosis de arrastre y amplificación pueden estar en un portador apropiado para administración directa al sistema linfático, un nodo linfático y los semejantes. El ácido nucleico puede ser un plásmido. El epítopo puede ser un epítopo de HLA de Clase I, por ejemplo, el enlistado en las Tablas 1-4. El HLA puede ser preferiblemente HLA-A2. El inmunógeno puede incluir un arreglo de e'pítopos, tal arreglo puede incluir una secuencia de liberación. El inmunógeno puede consistir esencialmente de un antígeno objetivo-asociado. El antígeno objetivo-asociado puede ser un antígeno tumor-asociado, un antígeno microbiano, cualquier otro antígeno y los semejantes. El inmunógeno puede incluir un fragmento de un antígeno objetivo-asociado que puede incluir un grupo de epítopos. Modalidades adicionales pueden incluir conjuntos de composiciones inmunogénicas para inducir una respuesta inmune MHC-restringida de Clase I en un mamífero. que incluye 1-6 dosis de arrastre y por lo menos una dosis de amplificación, en donde las dosis de arrastre pueden incluir un inmunógeno o un ácido nucleico que codifica un inmunógeno y un inmunopotenciador y en donde la dosis de amplificación puede incluir un epítopo de péptido y en donde el epítopo puede ser presentado mediante pAPC. El ácido nucleico que codifica el inmunógeno puede incluir además una secuencia inmunoestimuladora que puede ser capaz de funcionar como el agente inmunopotenciador . El inmunógeno puede ser un virus o vector de replicación competente que puede incluir o puede inducir un agente inmunopotenciador . El inmunógeno puede ser una bacteria, lisado bacteriano o componente de pared celular purificado. También, el componente de pared celular bacteriana puede ser capaz de funcionar como el agente inmunopotenciador . El agente mmunopotenciador puede ser, por ejemplo, un ligando TLR, una secuencia mmunoestimuladora, ADN que contiene CpG, un dsARN, un ligando de receptor de reconocimiento de patrón endocítico (PRR), un LPS, una quillaja saponina, tucaresol, una citocina pro-inflamatoria y los semejantes. En algunas modalidades preferidas para promover respuestas multivalentes, los conjuntos pueden incluir múltiples dosis de arrastre y/o múltiple dosis de amplificación correspondientes a varios individuales o combinaciones de antígenos, para cada administración. Las múltiples dosis de arrastre pueden ser administradas como parte de una sola composición o como parte de más de una composición. Las dosis de amplificación pueden ser administradas a tiempos disparatados y/o a más de un sitio, por ejemplo. Otras modalidades son concernientes con métodos para generar varios perfiles de citocina. En algunas modalidades de la presente invención, la administración intranodal de péptido puede ser efectiva en la amplificación de una respuesta inducida ínicialmente con una vacuna de ADN de plásmido. Además, el perfil de citocina puede ser distinto, con la inducción de ADN de plásmido/amplificacion de péptido que da como resultado en general mayor producción de quimiocina (citocina quimioatrayente) y menor producción de citocina inmunosupresora que ya sea uno u otro de protocolos ADN/ADN o peptido/péptido . Un peptido de amplificación usado en las varias modalidades corresponde a un epitopo del antígeno de inmunización. En algunas modalidades, la correspondencia puede incluir iteración fielmente de la secuencia natural del epitopo. En algunas modalidades, la correspondencia puede incluir la correspondencia correspondiente puede ser un análogo de la secuencia natural en la cual uno o mas de los aminoácidos han sido modificados o reemplazados o longitud del epítopo alterada. Tales análogos pueden retener la función inmunologica del epítopo (esto es, son funcionalmente similares) . En modalidades preferidas el análogo tiene enlace similar o mejorado con una o más moléculas de MHC de Clase I en comparación con la secuencia natural. En otras modalidades preferidas el análogo tiene inmunogenicidad similar o mejorada en comparación con la secuencia natural . Estrategias para fabricar análogos son ampliamente conocidas en el arte. Discusiones ejemplares de tales estrategias se pueden encontrar en las solicitudes de patente estadounidense No. 10/117,937 (publicación No. 2003-0220239 Al), presentada el 4 de abril de 2002; y 10/657,022 (publicación No. 20040180354), presentada el 5 de septiembre de 2003, ambas de EPITOPE SEQUENCES; y la solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/581,001, presentada el 17 de junio de 2004 y la solicitud de patente estadounidense No. 11/156,253 (Pub. No. ), presentada el 17 de junio de 2005, ambas de SSX-2 PEPTIDE ANALOGS; y solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/580,962 y solicitud de patente estadounidense No. 11/155,929 (Pub. No. ), presentada el 17 de junio de 2005, ambas de NY-ESO PEPTIDE ANALOGS; cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Todavía modalidades adicionales son concernientes con usos de un péptido en la manufactura de un medicamento libre de adyuvante para en un protocolo de inmunización de arrastre y amplificación. Las composiciones, equipos, inmunógenos y compuestos pueden ser usados en medicamentos para el tratamiento de varias enfermedades, para amplificar respuestas inmunes, para generar perfiles de citocina particulares y los semejantes, como se describe en la presente. Modalidades son concernientes con el uso de péptido libre de adyuvante en un método de amplificación de una respuesta inmune. Modalidades son concernientes con métodos, usos, terapias y composiciones relacionadas con epítopos con especificidad para MHC, en los que se incluyen, por ejemplo, aquellos enlistados en las Tablas 1-4. Otras modalidades incluyen uno o más de los MHC enlistados en las Tablas 1-4, en los que se incluyen combinaciones los mismos, en tanto que otras modalidades excluyen específicamente cualquiera de uno o más de los MHC o combinaciones de los mismos. Las Tablas 3-4 incluyen frecuencias para los antígenos de HLA enlistados. Algunas modalidades son concernientes con métodos para generar una respuesta inmune. Los métodos pueden incluir administrar a un mamífero una primera composición (composición 1) que puede incluir un inmunógeno que incluye o codifica por lo menos una porción de un primer antígeno (antígeno A) y por lo menos una porción de un segundo antígeno (antígeno B) ; y administrar una segunda composición (composición 2) que puede incluir un primer péptido (péptido A) y una tercera composición (composición 3) que puede incluir un segundo péptido (péptido B) , directamente al sistema linfático del mamífero, en donde el péptido A corresponde a un epítopo del antígeno A, y en donde el péptido B corresponde a un epítopo de antígeno B, en donde composición 1 no es la misma como al composición 2 o la composición 3. Los métodos pueden incluir además obtener una respuesta de célula T efectora a uno o ambos de los antígenos. En algunos aspectos cada una de la composición 2 y composición 3 pueden incluir péptido A y péptido B. los péptidos A y B pueden ser administrados a sitios separados o al mismo sitio incluyendo a tiempos diferentes, por ejemplo. La composición 1 puede incluir una molécula de ácido nucleico que codifica tanto el antígeno A como el antígeno B o porciones de los mismos. También, la composición 1 puede incluir dos moléculas de ácido nucleico una que codifica antígeno A o porción del mismo y una que codifica el antígeno B o porción del mismo, por ejemplo. Los primeros y segundos antígenos pueden ser cualquier antígeno. Preferiblemente, los primeros y segundos antígenos son antígenos de melanoma, antígenos CT, antígenos carcinoma-asociados, un antígeno CT y un antígeno estromal, un antígeno CT y un antígeno de neovasculatura, un antígeno CT y un antígeno de diferenciación, un antígeno carcinoma-asociado y un antígeno estromal y los semejantes. Varias combinaciones de antígeno son proporcionadas en la solicitud de patente estadounidense No. 10/871,708 (Pub. No. 20050118186), presentada el 17 de junio de 2004, intitulada COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS; y la solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/640,598, presentada el 29 de diciembre de 2004 y en la solicitud de patente estadounidense No. / , (publicación No J . (No. de expediente del abogado MANNK.049A) presentada en la misma fecha como en la presente solicitud, ambas también tituladas COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Preferiblemente, el antígeno, en los que se incluyen el antígeno A o B puede ser SSX-2, Melan-A, tirosinasa, PSMA, PRAME, NY-ESO-I o los semejantes. Muchos otros antígenos son conocidos para aquellos de habilidad ordinaria en el arte. Se debe entender que en estas y otras modalidades, más de dos composiciones, inmunógenos, antígenos, epítopos y/o péptidos pueden ser usados. Por ejemplo, tres, cuatro, cinco o más de cualquiera o más de los anteriores puede ser usados. Otras modalidades son concernientes con métodos para generar una respuesta inmune, que pueden incluir, por ejemplo, administrar a un mamífero una primera composición (composición 1) que incluye un inmunógeno (inmunógeno 1), tal inmunógeno 1 puede incluir o codificar por lo menos una porción de un primer antígeno (antígeno A) y una segunda composición (composición 2) que puede incluir un segundo inmunógeno (inmunógeno 2) que puede incluir o codificar por lo menos una porción de un segundo antígeno (antígeno B) ; y administrar una tercera composición (composición 3) que puede incluir un primer péptido (péptido A) y una cuarta composición (composición 4) que puede incluir un segundo péptido (péptido B) , directamente al sistema linfático del mamífero, en donde péptido A corresponde a un epítopo de antígeno A y en donde el péptido B corresponde a un epítopo de antígeno B, en donde la composición 1 no es la misma como composición 2 o la composición 3. En algunos aspectos la composición 2 no es la misma como la composición 3, por ejemplo. La composición 1 y composición 3 pueden ser administradas a un mismo sitio, por ejemplo, el sitio puede ser un nodo linfático inguinal. También, las composiciones 2 y 4 pueden ser administradas a un sitio diferente que las composiciones 1 y 3, por ejemplo, a otro nodo linfático inguinal. Todavía modalidades adicionales son concernientes con métodos para generar una respuesta inmune que puede incluir, por ejemplo, administrar una primera composición que incluye medios para arrastrar una respuesta inmune a un primer antígeno y un segundo antígeno; y administrar una segunda composición que incluye un primer péptido y una tercera composición que incluye un segundo péptido, directamente al sistema linfático del mamífero, en donde el primer péptido corresponde a un epítopo del primer antígeno, y en donde el segundo péptido corresponde a un epítopo del segundo antígeno, en donde la primera composición no es la misma como la segunda o tercera composiciones. Los medios para ocasionar una respuesta inmune pueden incluir, por ejemplo, medios para expresar los antígenos o porciones de los mismos. También, algunas modalidades son concernientes con métodos de inmunización, que pueden incluir, por ejemplo, administrar a un mamífero una primera composición que incluye un inmunógeno, tal inmunógeno puede incluir o codificar por lo menos una porción de un primer antígeno y por lo menos una porción de un segundo antígeno; y una etapa de amplificar la respuesta a los antígenos. Preferiblemente, la etapa de amplificar la respuesta a los antígenos puede incluir administrar un primer péptido que corresponde a por lo menos una porción de un primer antígeno a un órgano linfoide secundario y administrar un segundo péptido correspondiente a por lo menos una porción de un segundo antígeno a un órgano linfoide secundario diferente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras 1 A-C: Inducción de respuestas inmunes mediante inmunización intra-linfática . La figura 2 ilustra ejemplos de protocolos para controlar o manipular la inmunidad a epítopos restringidos de Clase I de MHC mediante la administración apuntada (nodo linfático) de antígeno. La figura 3 representa una perspectiva visual sobre cavidades representativas correspondiente a los datos descritos en la figura 4. La figura 4 ilustra la magnitud de respuesta inmune resultante de la aplicación de protocolos descritos en la figura 2, medida mediante ELISPOT y expresada como número (frecuencia) de células T que produce IFN-? (gamma) que reconocen el péptido. La figura 5 muestra el perfil citotóxico de células T generadas mediante la administración apuntada de antígeno, como se describe en la figura 2. La figura 6 ilustra la reactividad cruzada de células T restringidas de Clase I de MHC generadas por el protocolo ilustrado en la figura 2. La figura 7A muestra el perfil de inmunidad, expresado como habilidad de los linfocitos para producir miembros de tres clases de modificadores de respuesta biológica (citocinas proinflamatorias, quimiocinas o quimioatrayentes y citocinas reguladoras o supresoras inmunes), subsecuente a la aplicación de los protocolos de inmunización descritos en la figura 2. La figura 7B muestra el fenotipo de marcador de superficie celular mediante citometría de flujo para célula T generada por los protocolos de inmunización descritos en la figura 2. La administración repetida de péptido a los nodos linfáticos induce desviación inmune y células T regulatorias. Las figuras 8A y B muestran la frecuencia de células T específicas medida mediante tetrámero, en ratones inmunizados con ADN, péptido o una secuencia de arrastre/amplificación de ADN y péptido. La figura 8C muestra la citotoxicidad específica que ocurre in vivo, en varios órganos linfoides y no linfoides, en ratones inmunizado con ADN ( "pSEM'J , péptido ("ELA" ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 1)) o una secuencia de arrastre/amplificación de ADN y péptido. La figura 9A muestra la persistencia / decaimiento de células T teñidas de tetrámero circulantes en animales inmunizados con péptido y amplificadas con péptido, junto con la respuesta de recuerdo enseguida de un refuerzo de péptido. La figura 9B muestra la persistencia / decaimiento de células T teñidas de tetrámero circulantes en animales arrastrados con ADN y amplificados con péptido, junto con la respuesta de recuerdo enseguida de una amplifica de péptido. La figura 9C muestra la persistencia / decaimiento de células T teñidas de tetrámero circulantes en animales inmunizados con ADN y amplificados con ADN, junto con la respuesta de recuerdo enseguida de un refuerzo de péptido. La figura 10A muestra la expansión de células T de CD8+ antígeno-específicas utilizando varios protocolos de inmunización de dos ciclos. La figura 10B muestra la expansión de células T de CD8+ antígeno-específicas utilizando varios protocolos de inmunización de tres ciclos. La figura 10C muestra la expansión de células T antígeno-específicas circulantes detectadas mediante teñido de tetrámero, en animales cebados utilizando varios protocolos y amplificados con péptido.

La figura 10D muestra la expansión de células T antígeno-específicas subsecuente a varios regímenes de inmunización y detectadas mediante teñido de tetrámero, en órganos linfoides y no linfoides. La figura HA muestra un ejemplo de un programa de inmunización de ratones con ADN de plásmido y péptidos. La figura 11B muestra la respuesta inmune determinada mediante análisis de ELISPOT disparada mediante varios protocolos de inmunización (ADN alternante y péptido' en orden respectivo u orden inverso) . La figura 12A muestra el agotamiento in vivo de células objetivo antigénicas, en sangre y nodos linfáticos, en ratones inmunizados con plásmido y péptido. La figura 12B muestra el agotamiento in vivo de células objetivo antigénicas, en bazo y pulmones, en ratones inmunizados con plásmido y péptido. La figura 12C muestra un resumen de los resultados presentados en las figuras 12A,B. La figura 12D muestra una correlación entre la frecuencia de células T específicas y el despeje in vivo de células objetivo antigénicas en ratones inmunizados por los varios protocolos . La figura 13A muestra el programa de inmunización de ratones con ADN de plásmido y péptidos, también como la naturaleza de mediciones efectuadas en aquellos ratones.

La figura 13B muestra el programa asociado con el protocolo usado para la determinación del despeje in vivo de células de tumor humanas en ratones inmunizados. La figura 13C muestra el agotamiento in vivo de células objetivo antigénicas (células de tumor humanas) en pulmones de ratones inmunizados con plásmido y péptido. La figura 14A muestra el protocolo de inmunización usado para generar la respuesta anti-SSX-2 mostrada en la figura 14B. La figura 14B muestra la expansión de células T específicas de SSX-2 circulantes subsecuente a la aplicación del régimen de arrastre de ADN/amplificación de péptido, detectadas mediante teñido de tetrámero. La figura 15A muestra el despeje in vivo de células objetivo antigénicas en bazos de ratones que sufrieron varios protocolos de arrastre y amplificación para inmunizar simultáneamente contra epítopos de Melan A (ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 1)) y SSX2 (KASEKIFYV (SEQ ID NO: 2)). La figura 15B muestra el despeje in vivo de células • objetivo antigénicas en la sangre de ratones que sufrieron varios protocolos de arrastre y amplificación para inmunizar simultáneamente contra epítopos de Melan A (ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 1)) y SSX2 (KASEKIFYV (SEQ ID NO: 2)). La figura 15C resume los resultados mostrados en detalle en las figuras 15A,B.

La figura 16 muestra la expansión de las células T CD8+ antígeno-específica circulantes medida mediante teñido de tetrámero, en ratones que sufren dos ciclos de varios protocolos de arrastre y amplificación. La figura 17A y la figura B muestran la persistencia de células T antígeno-específicas circulantes en animales que sufren dos ciclos de protocolos de arrastre y amplificación que consisten de ADN/ADN/péptido (A) o ADN/péptido/péptido (B) . La figura 18 muestra la memoria de larga vida en animales que sufren dos ciclos de un protocolo de arrastre y amplificación consistente de ADN/ADN/ADN. La figura 19 muestra un esquema de práctica clínica para reclutamiento y tratamiento de pacientes con protocolos de arrastre y amplificación de ADN/péptido. La figura 20 muestra un programa de inmunización utilizando dos plásmidos: pCBP que expresa SSX2 41-49 y pSEM que expresa Melan A 26-35 (A27L) . La figura 21 muestra la citotoxicidad específica inducida por la administración de dos plásmidos como una mezcla contra la administración a individualmente sitios separados. La figura 22 muestra la adición de etapas de refuerzo de péptido al protocolo de inmunización descrito en la figura 20. La figura 23 presenta datos que muestran que el refuerzo de péptido rescata la inmunogenicidad de un epítopo menos dominantes aún cuando los vectores y péptidos respectivamente, son usados como una mezcla. Las figuras 24 A y B ilustran protocolos de inmunización alternativos para inducir fuertes respuestas multivalentes en práctica clínica. La figura 25 ilustra un plásmido capaz de producir respuestas multivalentes. La figura 26 presenta un protocolo para iniciar una respuesta inmune con un plásmido multivalente y rescata de la respuesta a un epítopo subdominante mediante administración intranodal de péptido. La figura 27A muestra la frecuencia de células T específicas obtenidas mediante cebado con plásmido multivalente y amplificación de respuesta contra un epítopo dominante (Melan-A) mediante administración intranodal del péptido. La figura 27B muestra la frecuencia de células T específicas obtenidas mediante cebado de plásmido multivalente y amplificación de respuesta contra un epítopo subdominante (Tirosinasa 369-377) mediante administración intranodal de péptido. La figura 28A muestra la citotoxicidad específica obtenida mediante cebado con plásmido multivalente y amplificación de respuesta contra un epítopo dominante (Melan- A) mediante administración intranodal de péptido. La figura 28B muestra la citotoxicidad específica obtenida mediante cebado con plásmido multivalente y amplificación de respuesta contra un epítopo subdominante (Tirosinasa 369-377) mediante administración intranodal de péptido . La figura 29 ilustra un cebado de protocolo de inmunización con un plásmido multivalente y amplificación de la respuesta contra un epítopo dominante y subdominante, simultáneamente . La figura 30A muestra la frecuencia de células T específicas de Melan-A obtenidas mediante cebado con plásmido multivalente y amplificación de respuesta contra un epítopo dominante (Melan- A) y un epítopo subdominante (Tirosinasa) mediante administración intranodal de péptido. La figura 30B muestra la frecuencia de células T específicas de tirosinasa obtenidas mediante cebado con plásmido multivalente y amplificación de respuesta contra un epítopo dominante (Melan-A) y un epítopo subdominante (Tirosinasa) mediante administración intranodal de péptido. La figura 30C muestra la frecuencia tanto de células T específicas de Melan-A y Tirosinasa en ratones cebados con pSEM y amplificados tanto con péptidos de Melan-A y tirosinasa. Se muestran resultados de dos ratones individuales. La figura 31 muestra datos de citotoxicidad in vivo para células T co-iniciadas y amplificada mediante un plásmido multivalente seguido por administración intranodal de péptidos, correspondientes a un epítopo dominante (Melan A 26-35) y un epítopo subdominante (Tirosinasa 369-377), como una mezcla. Figura 32: análisis de tetrámero de multicolores dual de animales inmunizados con pSEM/pBPL antes de la amplificación. Figura 33: análisis de tetrámero de multicolores dual de la respuesta inmune de ratones inducidos con una mezcla de los plásmidos pSEM y pBPL y amplificados con SSX2 y análogos de epítopo de péptido de tirosinasa. Figura 34: análisis de tetrámero de multicolores dual de la respuesta inmune de 3 ratones individuales inducidos con una mezcla de los plásmidos pSEM y pBPL y amplificados con SSX2 y análogos de epítopo de tirosinasa. Figura 35A: análisis de ELISpot de IFN-? después de la primera ronda de amplificación. Figura 35B: análisis de ELISpot de IFN-? después de las segundas rondas de amplificación. Figura 36: tratamiento in vivo con CFSE con células de tumor de melanoma humanos que expresan todos los cuatro antígenos asociados al tumor. Cada uno de los paneles A-D muestran análisis de tetrámero, análisis de ELISpot de IFN-?, y exterminio de células de tumor in vivo en ratones individuales enseguida de la consumación del protocolo. El panel A muestra datos de un ratón de control nativo, los paneles B-C muestran datos de dos ratones, del grupo 3 y 2, respectivamente, que obtienen inmunidad tetravalente sustancial y el panel D muestra datos de un ratón del grupo 3, cuya inmunidad fue sustancialmente monovalente. La figura 37 ilustra un método global para inducir inmunidad multivalente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA MODALIDAD PREFERIDA Modalidades de la presente invención proporcionan métodos y composición, por ejemplo para generar células inmunes específicas a una célula objetivo, para dirigir una respuesta inmune efectiva contra una célula objetivo o para afectar/tratar alteraciones inflamatorias. Los métodos y composiciones pueden incluir, por ejemplo, composiciones inmunogénicas tales como vacunas y terapéuticos y también métodos profilácticos y terapéuticos. Se revela en la presente el nuevo e inesperado descubrimiento que al seleccionar la forma de antígeno, la secuencia y sincronización con la cual es administrado y la administración del antígeno directamente a órganos linfoides secundarios, no solamente la magnitud, sino la naturaleza cualitativa de la respuesta inmune puede ser manejada . Algunas modalidades preferidas son concernientes con composiciones y métodos para arrastrar y amplificar una respuesta de célula T. Por ejemplo tales métodos pueden incluir una etapa de arrastre en donde una composición que comprende un inmunógeno codificado por acido nucleico es administrado a un animal. La composición puede ser administrada a varios sitios sobre el animal, pero preferiblemente es administrada al sistema linfático, por ejemplo, un nodo linfático. La etapa de arrastre puede incluir una o más administraciones de la composición, por ejemplo, dispersión en un período de tiempo o en una forma continua en un período de tiempo. Preferiblemente, los métodos pueden incluir además una etapa de amplificación que comprende administrar una composición que comprende un inmunógeno de péptido. La etapa de amplificación puede ser efectuada una o más veces, por ejemplo, a intervalos en un periodo de tiempo, en un bolo o continuamente en un período de tiempo. Aunque no se requiere en todas las modalidades, algunas modalidades pueden incluir el uso de composiciones que incluyen un inmunopotenciador o adyuvante. Cada una de las revelaciones de las siguientes solicitudes, incluyen todos los métodos, figuras y composiciones, se incorpora en la presente por referencia en su totalidad: solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/479,393, presentada el 17 de junio de 2003, intitulada METHODS TO CONTROL MHC CLASS I-RESTRICTED IMMUNE RESPONSE; solicitud de patente estadounidense No. 10/871,707 presentada el 17 de junio de 2004 (Pub. No. 20050079152), solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/640,402, presentada el 29 de diciembre de 2004 y solicitud de patente estadounidense No. / , (Pub. No ). (No. de expediente del abogado MANNK.047A), presentada en la misma fecha esta solicitud, todas las tres de las cuales son intituladas "METHODS TO ELICIT, ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES"; solicitud de patente estadounidense No. 10/871,708 (Pub. No. 20050118186), presentada el 17 de junio de 2004, intitulada "COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS"; y solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/640,598, presentada el 29 de diciembre de 2004 y solicitud de patente estadounidense No. / , (publicación No. ), (No. de expediente del abogado MANNK.049A), presentada en la misma fecha como esta solicitud, ambas de las cuales son intituladas "COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS", y cada una de las cuales son incorporadas por referencia en su totalidad. También, las siguientes solicitudes incluyen métodos y composiciones que pueden ser usados con los métodos y composiciones presentes. Plásmidos y principios de diseño de plásmido son revelados en la solicitud de patente estadounidense No. 10/292,413 (Pub. No. 20030228634 Al), intitulada "EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN", que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad; metodología adicional, composiciones, péptidos y análogos de péptido son revelados en la solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/581,001, presentada el 17 de junio de 2004, solicitud de patente estadounidense No. 11/156,253 (publicación No. ), intitulada "SSX-2 PEPTIDE ANALOGS"; cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad; solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/580,962, presentada el 17 de junio de 2004, solicitud de patente estadounidense No. 11/155,929 (publicación No. ), presentada el 17 de junio de 2005, intitulada "NY-ESO PEPTIDE ANALOGS"; cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad; y solicitudes de patente estadounidense Nos. 10/117,937 (Pub. No. 20030220239), presentada el 4 de abril de 2002 y 10/657,022 (Pub. No. 20040180354), presentada el 5 de septiembre de 2003, ambas de las cuales son intituladas EPITOPE SEQUENCES y cada una de las cuales es incorporada por referencia en la presente en su totalidad. En algunas modalidades, dependiendo de la naturaleza del inmunógeno y el contexto en el cual es encontrado, la respuesta inmune producida puede diferir en su actividad y composición particular. En particular, en tanto que la inmunización con péptido puede generar una respuesta de célula T citotóxica/citolítica (CTL) , intentos por amplificar adicionalmente esta respuesta con inyecciones adicionales puede conducir en lugar de esto a la expansión de una población de célula T reguladora y una disminución de actividad de CTL observable. Así, composiciones que confieren altas concentraciones de MHC/péptido sobre la superficie celular dentro del nodo linfático, sin actividad inmunopotenciadora adicional, pueden ser usados para promover propuestamente una respuesta reguladora o tolerogénica. En contraste, composiciones inmunogénicas que proporcionan amplias señales de inmunopotenciación (por ejemplo, ligandos receptores semejantes a toll ++++ [o los factores de citocina/autócrino que inducirían] ) aún si proporcionan solamente antígeno limitante, no solamente inducen una respuesta, sino que arrastran también, de tal manera que encuentros subsecuentes con antígeno amplio (por ejemplo, péptido inyectado) amplifica la respuesta sin cambiar la naturaleza de la actividad observada. Por consiguiente, algunas modalidades son concernientes con el control del perfil de respuesta inmune, por ejemplo, la clase de respuesta obtenida y las clases de citocinas producidas. Algunas modalidades son concernientes con métodos y composiciones para promover la expansión o expansión adicional de CTL y hay modalidades que son concernientes con métodos y composiciones para promover la expansión de células reguladoras de preferencia a CTL, por ejemplo. Los métodos revelados son ventajosos con respecto a muchos protocolos que usan solamente péptido y no permite la metodología de arrastre y amplificación. Como se resume anteriormente, muchos protocolos de inmunización a base de péptido y protocolos a base de vector tienen deficiencias. No obstante, si son exitosos, una inmunización a base de péptido o estrategia de amplificación inmune tiene ventajas con respecto a otros métodos, particularmente ciertos vectores microbianos, por ejemplo. Esto es debido al hecho de que muchos vectores complejos, tales como vectores virales o bacterianos atenuados vivos pueden inducir efectos secundarios perjudiciales, por ejemplo, en replicación o recombinación in vivo o volverse inefectivos después de la administración repetida debido a la generación de anticuerpos neutralizantes contra el vector mismo. Adicionalmente, cuando son provistos de tal manera para convertirse en inmunógenos fuentes, los péptidos pueden circunvenir la necesidad de procesamiento moderada por proteasoma (como con proteína o antígenos más complejos, en el contexto de "procesamiento cruzado" o subsecuente a la infección celular) . Esto es debido a que el procesamiento de antígeno celular para la presentación restringida de MHC-Clase I es un fenómeno que selecciona inherentemente epítopos dominantes (favorecidos) con respecto a los epítopos subdominantes, que interfieren potencialmente con la inmunogenicidad de epítopos correspondientes a objetivos válidos. Finalmente, la inmunización a base de péptido efectiva simplifica y acorta el proceso de desarrollo de inmunoterapéuticos . Así, métodos de amplificación inmunes a base de péptido efectivos, particularmente que incluyen aquellos descritos en la presente, puede ser de considerable beneficio para la inmunoterapia (tal como para cáncer e infecciones crónicas) o vacunación profiláctica (contra ciertas enfermedades infecciosas). Beneficios adicionales pueden ser obtenidos al evitar el uso simultáneo de técnicas adyuvantes molestas, no seguras o complejas, aunque tales técnicas pueden ser utilizadas en varias modalidades descritas en la presente.

Definiciones : A no ser que sea claro del contexto del uso del término en la presente, los siguientes términos enlistados tendrán en general los significados indicados por propósitos de esta descripción. CÉLULA QUE PRESENTA ANTÍGENO PROFESIONAL (pAPC) - una célula que posee moléculas co-estimuladora de célula T y es apta de inducir una respuesta de célula T. las pAPC bien caracterizadas incluyen células dendríticas, células B y macrófagos . CÉLULA PERIFÉRICA - una célula que no es una pAPC . PROTEASOMA DE MANTENIMIENTO - un proteasoma normalmente activo en células periféricas y en general no presente o no fuertemente activo en pAPC .

INMUNOPROTEASOMA - una proteasoma normalmente activa en pAPC; el inmunoproteasoma está también activo en algunas células periféricas en tejidos infectados o enseguida de exposición a interferón. EPÍTOPO - una molécula o sustancia capaz de estimular una respuesta inmune. En modalidades preferidas, los epítopos de acuerdo con esta definición incluyen pero no están necesariamente limitados a un polipéptido y un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido es capaz de estimular una respuesta inmune. En otras modalidades preferidas, epítopos de acuerdo con esta definición incluyen pero no están limitados necesariamente a péptidos presentes sobre la superficie de células, los péptidos no son enlazados covalentemente a la hendidura de enlace de MHC de Clase I, de tal manera que pueden interactuar con receptores de célula T (TCR) . Los epítopos presentados por MHC de Clase I pueden estar en forma inmadura o madura. "Madura" se refiere a un epítopo de MHC en distinción a cualquier precursor ("inmaduro") que puede incluir o consistir esencialmente de un epítopo de mantenimiento, pero también incluye otras secuencias en un producto de traducción primario que son removidos mediante procesamiento, en los que se incluyen sin limitación, solos o en cualquier combinación, digestión proteasomal, recorte N-terminal o la acción de actividades enzimáticas exógenas. Así, un epítopo maduro puede ser provisto embebido en un polipéptido un tanto más largo, el potencial inmunológico del cual es debido, por lo menos en parte, al epítopo embebido; asimismo, el epítopo maduro puede ser provisto en su forma final que se puede enlazar a la hendidura de enlace de MHC para ser reconocida por TCR. EPÍTOPO DE MHC - un polipéptido que tiene una afinidad de enlace conocida o predicha para una molécula compleja de histocompatibilidad mayor (MHC) de Clase I o Clase II mamífera. Algunas moléculas de MHC de Clase I particularmente bien caracterizadas son presentadas en las Tablas 1-4. EPÍTOPO DE MANTENIMIENTO - En una modalidad preferida, un epítopo de mantenimiento es definido como un fragmento de polipéptido que es un epítopo de MHC y que es desplegado sobre una célula en la cual los proteosomas de mantenimiento son predominantemente activos. En otra modalidad preferida, un epítopo de mantenimiento es definido como un polipéptido que contiene un epítopo de mantenimiento de acuerdo con la definición anterior, que está flanqueado por uno a varios aminoácidos adicionales. En otra modalidad preferida, un epítopo de mantenimiento es definido como un ácido nucleico que codifica un epítopo de mantenimiento de acuerdo con las definiciones anteriores. Epítopos de mantenimiento ejemplares son proporcionados en la solicitud de patente estadounidense No. 10/117,937, presentada el 4 de abril de 2002 (Pub. No. 20030220239 Al), 11/067,159 (Pub. No. 2005-0221440 Al), presentada el 25 de febrero de 2005, 11/067,064 (Pub. No. 2005-0142144 Al), presentada el 25 de febrero de 2005 y 10/657,022 (Pub. No. 2004-0180354 Al), presentada el 5 de septiembre de 2003 y en la solicitud de PCT No. PCT/US2003/027706 (Pub. No. WO 2004/022709 A2 ) , presentado el 9/5/2003; y solicitudes provisionales de patente estadounidense Nos. 60/282,211, presentada el 6 de abril de 2001; 60/337,017, presentada el 7 de noviembre de 2001; 60/363,210 presentada el 7 de marzo de 2002; y 60/409,123, presentada el 6 de septiembre de 2002. Cada una de las solicitudes enlistadas es titulada como EPITOPE SEQUENCES. Cada una de las solicitudes mencionadas en este párrafo es incorporado en la presente por referencia en su totalidad . EPÍTOPO INMUNE - En una modalidad preferida, un epítopo inmune es definido como un fragmento de polipéptido que es un epítopo de MHC, y que es mostrado sobre una célula en la cual los inmunoproteasomas son predominantemente activos. En otra modalidad preferida, un epítopo inmune es definido como un polipéptido que contiene un epítopo inmune de acuerdo con la definición anterior que es flanqueado por uno a varios aminoácidos adicionales. En otra modalidad preferida, un epítopo inmune es definido como un polipéptido que incluye una secuencia de grupo de epítopos, que tiene por lo menos dos secuencia de polipéptidos que tiene una afinidad conocida o predicha para un MHC de Clase I. En todavía otra modalidad preferida, un epítopo inmune es definido como un ácido nucleico que codifica un epítopo inmune de acuerdo con cualquiera de las definiciones anteriores. CÉLULA OBJETIVO - En una modalidad preferida, una célula objetivo es una célula asociada con una condición patogénica sobre la que se puede actuar por los componentes del sistema inmune, por ejemplo, una célula infectada con un virus u otro parásito intracelular o una célula neoplásica. En otra modalidad, una célula objetivo es una célula a ser apuntada por las vacunas y métodos de la invención. Ejemplos de células objetivos de acuerdo con esta definición incluyen pero no están limitadas necesariamente a: una célula neoplásica y una célula que alberga un parásito intracelular, tal como por ejemplo, un virus, una bacteria o un protozoario. Las células objetivos pueden también incluir células que son apuntadas por CTL como parte de un análisis para determinar o confirmar la liberación de epítopo apropiada y procesamiento por una célula que expresa inmunoproteasoma, para determinar especificidad de célula T o inmunogenicidad por un epítopo deseado. Tales células pueden ser transformadas para expresar la secuencia de liberación o las células pueden simplemente ser pulsada con péptido/epítopo. ANTÍGENO OBJETIVO-ASOCIADO (TAA) - una proteína o polipéptido presente en una célula objetivo. ANTÍGENO TUMOR-ASOCIADOS (TuAA) - un TAA, en donde la célula objetivo es una célula neoplásica. EPÍTOPO HLA - un polipéptido que tiene una afinidad de enlace conocida o predicha para una molécula compleja de HLA de Clase I o Clase II humana. HLA de Clase I particularmente bien caracterizados son presentados en las Tablas 1-4. ANTICUERPO - una inmunoglobulina natural (Ig), poli-o mono-clonal o cualquier molécula compuesta en todo o en parte de un dominio de enlace de Ig, ya sea derivado bioquímicamente o mediante el uso de ADN recombinante o mediante cualquiera otros medios. Ejemplos incluyen inter alia, F(ab), Fv de una sola cadena y fusiones de proteína de recubrimiento de región de fago variable. SIMILARIDAD SUSTANCIAL - este término es usado para referirse a secuencias que difieren de una secuencia de referencia de manera consecuencial, como se juzga por el examen de la secuencia. La secuencia de ácido nucleico que codifica la misma secuencia de aminoácidos son sustancialmente similares a pesar de diferencias en posiciones degeneradas o diferencias menores en longitud o composición de cualesquier regiones sin codificación. Las secuencias de aminoácido que difieren solamente mediante sustitución conservadora o variaciones de longitud menores son sustancialmente similares. Adicionalmente, las secuencias de aminoácidos que comprenden epítopos de mantenimiento que difieren en el número de residuos de franqueo N-terminales o epítopos inmunes y grupo de epítopos que difieren en el número de residuos de flanqueo ya sea en un término o en otro, son sustancialmente similares. Los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos sustancialmente similares son por sí mismos también sustancialmente similares. SIMILARIDAD FUNCIONAL - este término es usado para referirse a secuencias que difieren de una secuencia de referencia de manera inconsecuencial como se juzga mediante examen de una propiedad biológica o bioquímica, aunque las secuencias pueden no ser sustancialmente similares. Por ejemplo, dos ácidos nucleicos pueden ser útiles como sondas de hibridización para la misma secuencia pero codifican diferentes secuencias de aminoácidos. Dos péptidos que inducen respuestas de CTL de reactividad cruzada son funcionalmente similares aún si difieren por sustituciones de aminoácido no conservadoras (y así pueden no estar dentro de la definición sustancialmente similar) . Pares de anticuerpos o TCR, que reconocen el mismo epítopo pueden ser funcionalmente similares entre sí a pesar de cualesquier diferentes estructurales que existan. Las pruebas en cuanto a similaridad funcional de inmunogenicidad se pueden llevar a cabo mediante inmunización con el antígeno "alterado" y probar la habilidad de una respuesta producida, en los que se incluyen pero no limitados a una respuesta de anticuerpo, una respuesta CTL, producción de citocina y los semejantes, para reconocer el antígeno objetivo. Así, dos secuencias pueden ser diseñadas para diferir en ciertos aspectos en tanto que retienen la misma función. Tales variantes de secuencia diseñadas de secuencias reveladas o reivindicadas están entre las modalidades de la presente invención. CASET DE EXPRESIÓN - una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido, enlazada operativamente a un promotor y otros elementos de control de transcripción y traducción, en los que se incluyen pero no limitados a mejoradores, codones de terminación, sitios de entrada de ribosoma internos y sitios de poliadenilación. El caset puede también incluir secuencias que facilitan moverlo de una molécula huésped a otra. EPÍTOPO EMBEBIDO - en algunas modalidades, un epítopo embebido es un epítopo que está contenido totalmente dentro de un polipéptido más largo; en otras modalidades, el término puede también incluir un epítopo en el cual solamente el término N o el término C está embebido, de tal manera que el epítopo no está completamente en una posición interior con respecto al polipéptido más largo. EPÍTOPO MADURO - un péptido sin ninguna secuencia adicional más allá de la presente cuando el epítopo está enlazado en la hendidura de enlace de péptido de MHC. GRUPO DE EPÍTOPOS - un polipéptido o secuencia de ácido nucleico que lo codifica, que es un fragmento de una secuencia de proteína, que incluye una secuencia de proteína natural, que comprende dos o más epítopos conocidos o predichos con afinidad de enlace por un elemento de restricción de MHC compartido. En modalidades preferidas, la densidad de epítopos dentro del grupo es mayor que la densidad de todos los epítopos conocidos o predichos con afinidad de enlace por el elemento de restricción MHC compartido dentro de la secuencia de proteína completa. Grupos de epítopos son revelados y más definidos más plenamente en solicitud de patente estadounidense No. 09/561,571, presentada el 28 de abril de 2000, intitulada EPITOPE CLUSTERS, que incorporada en la presente por referencia en su totalidad. SECUENCIA DE LIBERACIÓN - una secuencia diseñada que comprende o codifica un epítopo de mantenimiento embebido en una secuencia más grande que proporciona un contexto que permite que el epítopo de mantenimiento sea liberado mediante actividades de procesamiento en las que se incluyen, por ejemplo actividad de inmunoproteasoma, recorte N-terminal y/u otros procesos o actividades, solos o en cualquier combinación. CTLp - precursores de CTL son células T que pueden ser inducidas para exhibir actividad citolítica. Actividad lítica in vitro secundaria, mediante la cual CTLp son en general observados, puede surgir de cualquier combinación de CTL natural, efectora y de memoria in vivo. CÉLULA T DE MEMORIA - Una célula T, sin consideración de su ubicación en el cuerpo, que ha sido previamente activada mediante antígeno, pero que está en un estado fisiológico quiescente que requiere re-exposición a antígeno, con el fin de ganar función efectora. Fenotípicamente son en general CD62L-CD44hi CD107a- IGN-? - LTß- TNF-a- y está en GO del ciclo celular. CÉLULA T EFECTORA - Una célula T que, al encontrar antígeno, exhibe fácilmente función efectora. Las células T efectoras son en general capaces de salir del sistema linfático y entrar a la periferia inmunológica. Fenotípicamente son en general CD62L- CD44hi CD107a+ IGN-?+ LTß+ TNF-a+ y de ciclos activamente . FUNCIÓN EFECTORA - En general, activa de célula T, que incluye adquisición de actividad citolítica y/o secreción de citocina. INDUCIR una respuesta de célula T - Incluye en muchas modalidades el proceso de generar una respuesta de célula T a partir de células T activadoras naturales o en algunos contextos, células quiescentes. AMPLIFICACIÓN DE UNA RESPUESTA DE CÉLULA T - Incluye en muchas modalidades un proceso para incrementar el número de células, el número de células activadas, el nivel de actividad, velocidad de proliferación o parámetro similar de células T involucrado en una respuesta específica. ARRASTRE - Incluye en muchas modalidades una inducción que confiere estabilidad particular sobre el perfil inmune del linaje inducido de células T. En varias modalidades, el término "arrastra" puede corresponder a "inducir", y/o "iniciar" . RECEPTOR SEMEJANTE A TOLL (TLR) - Receptores semejantes a toll (TLR) son una familia de receptores de reconocimiento de patrón que son activados mediante componentes específicos de microbios y ciertas moléculas huésped. Como parte del sistema inmune innato, contribuyen a la primera línea de defensa contra muchos patógenos, pero también juegan un papel en la inmunidad adaptable. LIGANDO DE RECEPTOR SEMEJANTE A TOLL (TLR) Cualquier molécula capaz de enlazar y activar un receptor semejante a toll. Ejemplos incluyen, sin limitación: poli IC A sintético, ARN de doble hebra conocido por inducir interferón. El polímero está compuesto de una hebra cada una de ácido poliinosínico y ácido policitidílico, ARN de doble hebra, Cpg oligodesoxirribonucleótido sin metilar u otras secuencias inmunoestimuladoras (ISS), lipopolisacárido (LPS), ß-glucanas e imidazoquinolinas, también como derivados y análogos de los mismos . ADYUVANTES INMUNOPOTENCIADORES - Adyuvantes que activan pAPC o células T que incluyen, por ejemplo: Ligandos TLR, ligandos de receptor de reconocimiento de patrón endocítico (PRR), quillaja saponinas, tucaresol, citocinas y los semejantes. Algunos adyuvantes preferidos son revelados en Marciani, D.J. Drug Discovery Today 8:934-943, 2003, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad. SECUENCIA INMUNOESTIMULADORA (ISS) - En general un oligodesoxirribonucleótido que contiene una secuencia CpG sin metilar. La CpG puede también estar embebida en ADN producido bacterianamente, particularmente plásmidos. Modalidades adicionales incluyen varios análogos; entre modalidades preferidas se encuentran moléculas con uno o más enlaces de fosforotioato o bases no fisiológicas. VACUNA - En modalidades preferidas una vacuna puede ser una composición inmunogénica que proporciona o ayuda en la prevención de enfermedad. En otras modalidades, una vacuna es una composición que puede proporcionar o ayudar en un cura de una enfermedad. En otras, una composición de vacuna puede proporcionar o ayudar en la mejora de una enfermedad. Modalidades adicionales de una composición inmunogénica de vacuna pueden ser usadas como agentes terapéuticos y/o profilácticos. INMUNIZACIÓN - un proceso para inducir protección parcial o completa contra una enfermedad. Alternativamente, un proceso para inducir o amplificar una respuesta de sistema inmune a un antígeno. En la segunda definición puede connotar una respuesta inmune protectora, particularmente proinflamatoria o inmunidad activa, pero puede también incluir una respuesta reguladora. Así, en algunas modalidades la inmunización es distinguida de la tolepzación (un proceso mediante el cual el sistema inmune evita producir inmunidad proinflamatopa o inmunidad activa) en tanto que en otras modalidades este término incluye tolerización .

Tabla 1 Moléculas de MHC de Clase I Clase I Humano HLA-A1 HLA-A*0101 HLA-A*0201 HLA-A*0202 HLA-A*0203 HLA-A*0204 HLA-A*0205 HLA-A*0206 HLA-A*0207 HLA-A*0209 HLA-A*0214 HLA-A3 HLA-A*0301 HLA-A*1101 HLA -A23 HL -A24 HLA -A25 HLA' -A*2902 HL -A*3101 HLA' -A*3302 HLA' -A*6801 HLA' -A*6901 HLA' -B7 HLA- -B*0702 HLA- -B*0703 HLA- -B*0704 HLA- -B*0705 HLA- -B8 HLA- -B13 HLA- -B14 HLA- -B*1501 (B62) HLA- -B17 HLA- -B18 HLA- -B22 HLA- -B27 HLA- -B*2702 HLA- -B*2704 HLA- -B*2705 HLA- •B*2709 HLA-B35 HLA-B*3501 HLA-B*3502 HLA-B*3701 HLA-B*3801 HLA-B*39011 HLA-B*3902 HLA-B40 HLA-B 0012 (B60¡ HLA-B*4006 (B61) HLA-B44 HLA-B 402 HLA-B 403 HLA-B 501 HLA-B 601 HLA-B51 HLA-B*5101 HLA-B*5102 HLA-B*5103 HLA-B*5201 HLA-B*5301 HLA-B*5401 HLA-B*5501 HLA-B*5502 HLA-B*5601 HLA-B*5801 HLA-B*6701 HLA-B*7301 HLA-B*7801 HLA-Cw*0102 HLA-Cw*0301 HLA-Cw*0304 HLA-Cw*0401 HLA-Cw*0601 HLA-Cw*0602 HLA-C *0702 HLA-Cw8 HLA-Cw*1601 M HLA-G Murino (Ratón) H2-Kd H2-Da H2-Ld H2-Kb H2-Dc H2-K? H2_?kmi Qa-la Qa-2 H2-M3 Rata RTl.Aa RTLA1 Bovino (Vaca) Bota-All Bota-A20 Pollo B-F4 B-F12 B-F15 B-F19 Chimpancé Patr-A*04 Patr-A*ll Patr-B*01 Patr-B*13 Patr-B*16 Baboon Papa-A*06 Macaco Mamu-A*01 Puerco (Puerco) SLA (haplotipo d/d) Homólogo de virus hCMV Clase I homólogo UL1I Tabla 2 Moléculas de MHC de Clase Clase I Humano HLA-A1 HLA-A*0101 HLA-A*0201 HLA-A*0202 HLA-A*0204 HLA-A*0205 HLA-A*0206 HLA-A*0207 HLA-A*0214 HLA-A3 HLA-A*1101 HLA-A24 HLA-A*2902 HLA-A*3101 HLA-A*3302 HLA-A*6801 HLA-A*6901 HLA-B7 HLA-B*0702 HLA-B*0703 HLA-B*0704 HLA-B*0705 HLA-B8 HLA-B14 HLA-B*1501 (B62) HLA-B27 HLA-B*2702 HLA-B*2705 HLA-B35 HLA-B*3501 HLA-B*3502 HLA-B*3701 HLA-B*3801 HLA-B*39011 HLA-B*3902 HLA-B40 HLA-B 0012 (B60i HLA-B*4006 (B61) HLA-B44 HLA-B*4402 HLA-B* 4403 HLA-B 601 HLA-B51 HLA-B*5101 HLA-B*5102 HLA-B*5103 HLA-B*5201 HLA-B*5301 HLA-B*5401 HLA-B*5501 HLA-B*5502 HLA-B*5601 HLA-B*5801 HLA-B*6701 HLA-B*7301 HLA-B*7801 HLA-C *0102 HLA-Cw*0301 HLA-Cw*0304 HLA-Cw*0401 HLA-Cw*0601 HLA-Cw*0602 HLA-Cw*0702 HLA-G Murino H2-Kd H2-Dd H2-Ld H2-Kc H2-D H2-Kk H2_?kml Qa-2 Rata RTl.Aa RTI. A1 Bovino Bota-All Bota-A20 Pollo B-F4 B-F12 B-F15 B-F19 Homólogo de virus hCMV Clase I homólogo UL18 Tabla 3 Frecuencias genéticas estimadas de antígenos de HLA-A recuencd e gen En oí estándar Tabla 4 Frecuencias de gen estimadas para antígenos HLA-B Frecuencia de gen Error estándar El conteo de gen observado fue cero Tabla 5 Listado de genes CT" * Véase Scalan et al , "The cancer/testis genes Review, standardizaron, and commentary", Cáncer Immumty, vol 4, p 1 (23 de enero de 2004), que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad La siguiente discusión resume el entendimiento o creencia presente de la operación de aspectos de la invención, sin embargo, no se propone que esta discusión límite la patente a alguna teoría de operación particular no resumida en las reivindicaciones . El control inmune-moderado efectivo de procesos tumorales o infecciones microbianas involucra en general inducción y expansión de células T antígeno-específicas dotadas con múltiples capacidades tales como migración, funciones efectoras y diferenciación a células de memoria. La inducción de respuestas inmunes puede ser intentada mediante varios métodos e involucra la administración de antígeno en diferentes formas, con efecto variable sobre la magnitud y calidad de la respuesta inmune. Un factor limitante en obtener un control de la respuesta inmune es apuntamiento de pAPC apto de procesar y presentar efectivamente los epítopos resultantes a células T específicas . Una solución a este problema es la administración antígeno directa a órganos linfoides secundarios, un microambiente abundante en pAPC y células T. El antígeno puede ser administrado, por ejemplo, ya sea como polipéptido o como un antígeno expresado mediante cualquiera de una variedad de vectores. El resultado en términos de magnitud y calidad de inmunidad puede ser controlado por factores en los que se incluyen, por ejemplo, la dosificación, la formulación, la naturaleza del vector y el ambiente molecular. Modalidades de la presente invención pueden mejorar el control de la respuesta inmune. El control de la respuesta inmune incluye la capacidad de inducir diferentes tipos de respuestas inmunes como sea necesario, por ejemplo de respuestas regulatorias a pro-inflamatorias. Modalidades preferidas proporcionan control mejorado de la magnitud y calidad de respuestas a epítopos de Clase I-restringidos de MHC que son de interés mayor por inmunoterapia activa. Los métodos de inmunización previos mostraban ciertas limitaciones importantes: en primer lugar, muy frecuentemente, conclusiones con respecto a la potencia de vacunas eran extrapoladas de datos de inmunogenicidad generados a partir de uno o de un panel muy limitado de análisis de lectura ultrasensible. Frecuentemente, a pesar de la potencia inferida de un régimen de vacunación, la respuesta clínica no era significativa o era a lo más moderada. En segundo lugar, subsecuente a la inmunización, la célula reguladora T, junto con células efectoras T más convencionales, pueden ser generadas y/o expandidas y tales células pueden interferir con la función de la respuesta inmune deseada. La importancia de tales mecanismos en inmunoterapia activa ha sido reconocida solo recientemente. La administración intranodal de inmunógenos proporciona una base para el control de la magnitud y perfil de respuestas inmunes. La carga in vivo efectiva de pAPC llevada a cabo como resultado de tal administración, permite una magnitud sustancial de inmunidad, aún al utilizar un antígeno en su forma más simple - un epítopo de péptido - de otra manera en general asociado con farmacocinética deficiente. La calidad de respuesta puede ser controlada adicionalmente vía la naturaleza de inmunógenos, vectores y protocolos de inmunización. Tales protocolos pueden ser aplicados para mejorar/modificar la respuestas en infecciones crónicas o procesos tumorales. La inmunización ha dependido tradicionalmente de la administración repetida de antígeno para aumentar la magnitud de la respuesta inmune. El uso de vacunas de DNA ha dado como resultado respuestas de alta calidad, pero ha sido difícil obtener respuestas de alta magnitud utilizando tales vacunas, aún con dosis de refuerzo repetidas. Ambas características de la respuesta, alta calidad y baja magnitud, son probablemente debidas a niveles relativamente bajos de carga de epítopo sobre MHC obtenido con estos vectores. En lugar de esto se ha vuelto más común reforzar tales vacunas utilizando antígeno codificado en un vector de virus vivo con el de obtener la alta magnitud de respuesta necesaria para utilidad clínica. Sin embargo, el uso de vectores vivos puede abarcar varias deficiencias en las que se incluyen cuestiones de seguridad potencial, efectividad disminuida de refuerzos posteriores debido a una respuesta humoral al vector inducida por administraciones previas y los costos de creación y producción. Así, el uso de vectores vivos o ADN solo, aunque produce respuestas de alta calidad, puede dar como resultado una magnitud limitada o sustentabilidad de respuesta . Se revelan modalidades que son concernientes con protocolos y métodos que, cuando son aplicados a péptidos, los vuelven efectivos como herramientas terapéuticas inmunes. Tales métodos evitan la PK deficiente de péptidos y si son aplicados en contexto de regímenes específicos y frecuentemente más complejos, dan como resultado amplificación robusta y/o control de respuesta inmune. En modalidades preferidas, la administración directa de péptido a órganos linfoides da como resultado una amplificación inesperadamente fuerte de respuestas inmunes, enseguida que un agente de cebado que induce una respuesta inmune fuerte, moderada o aún suave (en o niveles menores de detección mediante técnicas convencionales) que consisten de células Tcl . En tanto que modalidades preferidas de la invención pueden emplear la administración intralinfática de antígeno en todas las etapas de inmunización, la administración intralinfática es el modo de administración más preferido para el péptido libre de adyuvante. La amplificación de péptido utilizando administración intralinfática puede ser aplicada a respuestas inmune existentes que pueden haber sido previamente inducidas. La inducción previa puede ocurrir por medio de exposición natural al antígeno o por medio de rutas de administración comúnmente usadas, en las que se incluyen sin limitación, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intramuscular y mucosal. También como se muestra en la presente, el inicio óptimo, que da como resultado expansión subsecuente de células T específicas, puede ser obtenido mejor al exponer las células T naturales a cantidades limitadas de antígeno (como puede resultar de la expresión frecuentemente limitada de antígeno plásmido-codificado) en un contexto co-estimulatorio rico (tal como en un nodo linfático) . Aquello puede dar como resultado la activación de células T que portan receptores de célula T que reconocen con alta afinidad los complejos de MHC-péptido sobre células que presentan antígeno y puede dar como resultado la generación de células de memoria que son más reactivas para estimulación subsecuente. El ambiente co-estimulatorio puede ser aumentado o asegurado por medio del uso de agentes inmunopotenciadores y así la administración intralinfática, en tanto que es ventajosa, no es en todas las modalidades requerida para el inicio de la respuesta inmune. En modalidades que involucran el uso de péptido epitópico para inducción/arrastre es preferido que una dosificación relativamente baja de péptido (en comparación con una dosis de amplificación o con una concentración de saturación de MHC) sea usada de tal manera que la presentación sea limitada, especialmente si se usa administración intralinfática directa. Tales modalidades involucrarán en general la inclusión de un inmunopotenciador para obtener el arrastre. En tanto que la farmacocinética deficiente de los péptidos libres ha impedido su uso en la mayoría de las rutas de administración, la administración directa a órganos linfoides secundarios, particularmente nodos linfáticos, ha probado ser efectiva cuanto el nivel de antígeno es mantenida más o menos continuamente mediante infusión continua o inyección frecuente (por ejemplo, diariamente) . Tal administración intranodal para la generación de CTL es enseñada en la solicitud de patente estadounidense Nos. 09/380,534, 09/776,232 (Pub. No. 20020007173 Al), ahora patente estadounidense No. 6,977,074 y / , (publicación No. ). (No. de expediente del abogado MANNK.001CP2C1) , presentada el 19 de diciembre de 2005) y en la solicitud de patente PCT No. PCTUS98/14289 (Pub. No. O9902183A2) , cada una intitulada METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. En algunas modalidades de la presente invención, la administración intranodal de péptido fue efectiva en la amplificación de una respuesta inicialmente inducida con una vacuna de ADN de plásmido. Además, el perfil de citocina fue distinto, la inducción de ADN de plásmido/amplificación de péptido da como resultado en general una producción de quimiocina mayor (citocina quimioatrayente) y menor producción de citocina inmunosupresora que ya sea uno u otro de los protocolos de ADN/ADN o péptido/péptido . Así, tales protocolos de amplificación de inducción ADN/péptido pueden mejorar la efectividad de composiciones, en las que se incluyen vacunas terapéuticas para cáncer e infecciones crónicas. Principios de selección de epítopos beneficios para tales inmunoterapéuticos son revelados en las solicitudes de patente estadounidenses Nos. 09/560,465, 10/026,066 (Pub. No. 20030215425 Al), 10/005,905, presentada el 7 de noviembre de 2001, 10/895,523 (Pub. No. 2005-0130920 Al), presentada 20 de julio de 2004 y 10/896,325 (Pub No. ), presentada el 20 de julio de 2004, toda tituladas EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS; 09/561,074, ahora patente estadounidense No. 6,861,234 y 10/956,401 (Pub. No. 2005-0069982 Al), presentada el 1 de octubre de 2004, ambas intituladas METHOD OF EPITOPE DISCOVERY; 09/561,571, presentada el 28 de abril de 2000, intitulada EPITOPE CLUSTERS; 10/094,699 (Pub. No. 20030046714 Al), presentada el 7 de marzo de 2002, 11/073,347, (publicación No. ), presentada el 30 de junio de 2005, cada una intitulada ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CÁNCER; y 10/117,937 (Pub. No. 20030220239 Al), presentada el 4 de abril de 2002, 11/067,159 (Pub. No. 2005-0221440A1) , presentada el 25 de febrero de 2005, 10/067,064 (Pub. No. 2005-0142114 Al), presentada el 25 de febrero de 2005 y 10/657,022 (Publicación No. 2004-0180354 Al) y solicitud de patente PCT No. PCT/US2003/027706 (Pub. No. WO 04/022709 A2), cada una intitulada EPITOPE SEQUENCES y cada una de las cuales es incorporada por referencia en su totalidad. Aspectos de diseño global de plásmidos de vacuna son revelados en las solicitudes de patente estadounidense Nos. 09/561,572, presentada el 28 de abril de 2000 y 10/225,568 (Pub. No. 2003-0138808 Al), presentada el 20 de agosto de 2002, ambas tituladas EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS y solicitudes de patente estadounidenses Nos. 10/292,413 (Pub. No .20030228634 Al), 10/777,053 (Pub. No. 2004-0132088 Al), presentada el 10 de febrero de 2004 y /837,217 (publicación No. ), presentada el 30 de abril de 2004, todas tituladas EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN; 10/225,568 (Pub No. 2003-0138808 Al), solicitud de PCT No. PCT/US2003/026231 (Pub. No. WO 2004/018666) y patente estadounidense No. 6,709,844 y solicitud de patente estadounidense No. 10/437,830 (Pub. No. 2003-0180949 Al), presentada el 13 de mayo de 2003, cada una titulada AVOIDANCE OF UNDESIRABLE REPLICATION INTERMEDIATES IN PLASMID PROPAGATION, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Combinaciones antigénicas específicas de beneficio particular para dirigir una respuesta inmune contra cánceres particulares son revelados en la solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/479,554, presentada el 17 de junio de 2003, solicitud de patente estadounidense No. 10/871,708 (Pub. No. 2005-0118186 Al), presentada el 17 de junio de 2004, solicitud de patente PCT No. PCT/US2004/019571 (Pub. No. WO 2004/112825), solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/640,598, presentada el 29 de diciembre de 2005 y solicitud de patente estadounidense No / , (publicación No. ), (No. de expediente del abogado MANNK.049A), presentada en la misma fecha como esta solicitud, todas tituladas COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN VACCINES FOR VARIOS TYPES OF CANCERS, cada una de las cuales es también incorporada en la presente por referencia en su totalidad. El uso y ventajas de administración intralinfática de BRM son revelados en la solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/640,727, presentada el 29 de diciembre de 2005 y solicitud de patente estadounidense No. / , (publicación No. ) . (No. de expediente del abogado MANNK.046A), presentada en la misma fecha como esta solicitud, ambas tituladas Methods to trigger, maintain and manipúlate immune responses by targeted administration of biological response modifiers into lymphoid organs, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Metodología adicional, composiciones, péptidos y análogos de péptido son revelados en solicitud de patente estadounidense No. 09/999,186, presentada el 7 de noviembre de 2001, intitulada METHODS OF COMMERCIALIZING AN ANTIGEN; y solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/640,821, presentada el 29 de diciembre de 2005 y Solicitud de patente estadounidense No. / , (publicación No. ). (No. de expediente del abogado MANNK.048A), presentada el en la misma fecha como esta solicitud, ambas intituladas METHODS TO BYPASS CD4+ CELLS IN THE INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Otras revelaciones relevantes son presentadas en la solicitud de patente estadounidense No. 11/156,369 (publicación No. ), y solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/691,889, ambas presentadas el 17 de junio de 2005, ambas intituladas EPITOPE ANALOGS, y cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. También relevantes son las solicitudes de patente estadounidenses provisionales Nos. 60/691,579, presentada el 17 de junio de 2005, intitulada METHODS AND COMPOSITIONS TO ELICIT MULTIVALENT IMMUNE RESPONSES AGAINST DOMINANT AND SUBDOMINANT EPITOPES, EXPRESSED ON C NCER CELLS AND TUMOR STROMA, y 60/691,581, presentada el 17 de junio de 2005, intitulada MULTIVALENT ENTRAIN-AND-AMPLIFY IMMUNOTHERAPEUTICS FOR CARCINOMA, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Sorprendentemente, la inyección intranodal repetida de péptido de acuerdo con el programa de cebado-refuerzo tradicional dio como resultado reducción de la magnitud de la respuesta citolítica en comparación con la respuesta observada después de la dosificación inicial sola. El examen del perfil de respuesta inmune muestra que este es el resultado de la inducción de regulación inmune (supresión) en lugar de insensibilidad. Esto es en contraste a protocolos de inducción y amplificación que abarca inmunógenos ADN-codificaos, comúnmente plásmidos. La carga directa de pAPC mediante inyección intranodal de antígeno disminuye en general o elimina la necesidad de adyuvantes que son usados comúnmente para corregir la farmacocinética de antígenos administrados vía otras rutas parenterales. El uso de tales adyuvantes, que son en general proinflamatorios, puede así facilitar la inducción de un perfil de respuesta inmune diferente (esto es, regulatoria o tolerogénica) que ha sido previamente observado con inmunización de péptido. Puesto que la respuesta, como se muestra en los ejemplos posteriormente en la presente, es medida en órganos linfoides secundarios alejados del sitio de inyección inicial, tales resultados soportan los métodos de uso y composiciones de acuerdo con modalidades de la invención para modificar (suprimir) reacciones inflamatorias en marcha. Este procedimiento puede ser útil aún con alteraciones inflamatorias que tienen una etiología de MHC de Clase II-restringida, ya sea mediante apuntamiento del mismo antígeno o cualquier antígeno apropiado asociado con el sitio de inflamación y depender de efectos de espectador moderados por las citocinas inmunosupresoras . A pesar del hecho de que la administración de péptido repetida da como resultado una respuesta inmune citolítica gradualmente disminuida, la inducción con un agente tal como un ADN recombinante sin replicación (plásmido) tiene un impacto sustancial sobre las dosis subsecuentes, permitiendo la amplificación robusta de inmunidad a epítopos expresados por el ADN recombinante y péptido y que ocasiona su naturaleza citolítica. En efecto, cuando administraciones individuales o múltiples administraciones de vector de ADN recombinante o péptido obtienen separadamente ninguna respuesta inmune o respuestas inmune moderadas, la inducción con ADN y amplificación con péptido obtuvieron respuestas sustancialmente más altas, tanto como una velocidad de respondedores y como una magnitud de respuesta. En los ejemplos mostrados, la velocidad de respuesta fue por lo menos duplicada y la magnitud de respuesta (media y mediana) fue por lo menos triplicada al utilizar un protocolo de inducción de ADN recombinante/amplificación de péptido. Así, los protocolos preferidos dan como resultado inducción de inmunidad (inmunidad Tcl) que es apta de tratar con células antigénicas in vivo, dentro de órganos linfoides y no linfoides. Un factor limitante en la mayoría de inmunoterapia de cáncer es la susceptibilidad limitada de células de tumor al ataque inmune-moderado, posiblemente debido a la presentación de MHC/péptido reducida. En modalidades preferidas, la expansión robusta de inmunidad mediante inducción de ADN/amplificación de péptido, con una magnitud que en general es igual o excede la respuesta inmune observada en general subsecuente a la infección con microbios virulentos. Esta magnitud elevada puede ayudar a compensar la presentación de MHC/péptido deficiente y da como resultado el despeje de células de tumor humanas como se muestra en modelos pre-clínicos especializados, tales como por ejemplo ratones transgénicos HLA. Tales protocolos de inducción y amplificación involucran secuencias específicas de dosis de arrastre de ADN recombinante, seguidas por refuerzos de péptido administrados a órganos linfoides, son así útiles por el propósito de inducción, amplificación y mantenimiento de respuestas de célula T fuertes, por ejemplo para profilaxis o terapia de infecciones o enfermedades neoplásicas. Tales enfermedades pueden ser carcinomas (por ejemplo renal, ovario, pecho, pulmón, colorrectal, próstata, cabeza y cuello, vejiga, uterino, piel), melanoma, tumores de varios origines y en general tumores que expresan antígenos tumor-asociados definidos o definibles, tales como oncofetal (por ejemplo CEA, CA 19-9, CA 125, CRD-BP, Das-1, 5T4, TAG-72 y los semejantes), diferenciación de tejido (por ejemplo, Melan-A, tirosinasa, gplOOO, PSA, PSMA y los semejantes) o antígenos cáncer-testis (por ejemplo, PRAME, MAGE, LAGE, SSX2, NY-ESO-I y los semejantes; véase Tabla 5) . Los genes de cáncer-testis y su relevancia para tratamiento de cáncer son revisados en Scanlon et al., Cáncer Immunity 4: 1-15, 2004, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad) . Antígenos asociados con neovasculatura de tumor (por ejemplo, PSMA, VEGFR2, Tie-2) son también útiles en relación con enfermedades cancerosas, como se revela en la solicitud de patente estadounidense No. 10/094,699 (Pub. No. 20030046714 Al) y 11/073,347 (publicación No. ), presentada el 30 de junio de 2005, intitulada ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CÁNCER, cada una de las cuales es incorporada por referencia en la presente en su totalidad. Los métodos y composiciones pueden ser usados para apuntar varios organismos y condiciones de enfermedad. Por ejemplo, los organismos objetivo pueden incluir bacterias, virus, protozoarios, hongos y los semejantes. Las enfermedades objetivo pueden incluir aquellas provocadas por priones, por ejemplo. Enfermedades ejemplares, organismos y antígenos y epítopos asociados con los organismos objetivo, células y enfermedades son descritos en la solicitud de patente estadounidense No. 09/776,232 (Pub. No. 20020007173 Al), ahora patente estadounidense No. 6,977,074, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad. Entre las enfermedades infecciosas que pueden ser tratadas son aquellas provocadas por agentes que tienden a establecer infecciones crónicas (HIV, virus de herpes simplex, CMV, virus Hepatitis B y C, virus de papiloma y los semejantes) y/o aquellos que están relacionados con infecciones agudas (por ejemplo, virus de influenza, sarampión, RSV, virus de Ebola) . De interés son los virus que tienen potencial oncogénico - desde la perspectiva de profilaxis o terapia - tales como virus de papiloma, virus de Epstein Barr y HTLV-1. Todos estos agentes infecciosos tienen antígenos definidos o definibles que pueden ser usados como base para diseñar composiciones tales como epítopos de péptido. Aplicaciones preferidas de tales métodos (Véase, por ejemplo, figura 19) incluyen inyección o infusión a uno o más nodos linfáticos, que inician con un número (por ejemplo 1 a 10 o más, 2 a 8, 3 a 6, de preferencia aproximadamente 4 o 5) administraciones de ADN recombinante (intervalo de dosis de 0.001 - 10 mg/Kg, de preferencia 0.005-5 mg/Kg) seguida por una o más (de preferencia aproximadamente 2) administraciones de péptido, de preferencia en un vehículo inmunológicamente inerte o formación inmunológicamente inerte (intervalo de dosis de 1 ng/Kg - 10 mg/Kg, preferido 0.005-5 mg/Kg). Debido a que la dosis no necesariamente se escala linealmente con el tamaño del sujeto, las dosis para humanos pueden tender hacia las más bajas y las dosis para ratones pueden tender hacia las más altas, porciones de estos intervalos. La concentración preferida de plásmido y péptido en la inyección es en general de aproximadamente 0.1 µg/ml-10 mg/ml y la concentración más preferida es aproximadamente 1 mg/ml, en general sin consideración del tamaño o especie del sujeto. Sin embargo, péptidos particularmente potentes pueden tener concentraciones óptimas hacia el extremo inferior de este intervalo, por ejemplo entre 1 y 100 µg/ml. Cuando se utilizan protocolos de solamente péptidos para promover tolerancias las dosis hacia el extremo más alto de estos intervalos son en general preferidas (por ejemplo, 0.5-10 mg/ml). Esta secuencia puede ser repetida en tanto que sea necesario para mantener una respuesta inmune fuerte ín vivo. Además, el tiempo entre la última dosis de arrastre de ADN y la primera dosis de amplificación de péptido no es crítico. De preferencia es de aproximadamente 7 días o más y puede exceder de varios meses. La multiplicidad de inyecciones del ADN y/o el péptido puede ser reducida al sustituir infusiones que duran varios días (de preferencia 2-7 días) . Puede ser ventajoso iniciar la infusión con un bolo de material similar al que podría ser dado como una inyección, seguido por una infusión lenta (24-12000 µl/día para administrar aproximadamente 25-2500 µg/día para ADN, 0.1 10,000 µg/día para péptido). Esto se puede llevar a cabo manualmente o por medio del uso de una bomba programable, tal como una bomba de insulina. Tales bombas son conocidas en el arte y permiten picos periódicos y otros perfiles de dosificación, que pueden ser deseables en algunas modalidades. La invención ha en general sido descrita como un solo ciclo de inmunización que comprende administración de una o más dosis de inicio seguidas de administración de una o más dosis de amplificación. Modalidades adicionales de la invención abarcan ciclos repetidos de inmunización. Tales ciclos repetidos pueden ser usados para aumentar adicionalmente la magnitud de la respuesta. También cuando se busca una respuesta multivalente no todos los individuos obtendrán necesariamente una respuesta sustancial a cada uno de los antígenos apuntados como resultado de un solo ciclo de inmunización. Los ciclos de inmunización pueden ser repetidos hasta que un individuo particular obtiene una respuesta apropiada a cada antígeno apuntado. Los ciclos de inmunización individuales pueden también ser modificados para obtener una respuesta más equilibrada al ajustar el orden, sincronización o número de dosis de cada componente individual que son dados. Múltiples ciclos de inmunización pueden también ser usados para mantener la respuesta con el paso del tiempo, por ejemplo, para sostener una fase efectora activa de la respuesta para ser sustancialmente co-extensa en tiempo con y puede ser ventajosa para, el tratamiento de una enfermedad u otra condición médica. Se deben notar que mientras que este método hace uso exitosamente de péptido, sin conjugación a proteínas, la adición del adyuvante, etc., en la etapa de amplificación, la ausencia de tales componentes no es requerida. Así, se pueden usar péptido conjugado, adyuvantes, inmunopotenciadores, etc. en modalidades. Composiciones más complejas de péptido administrado al nodo linfático o con la habilidad de alojarse al sistema linfático, incluyen células dendríticas péptido-pulsadas, suspensiones tales como formulaciones de liposomas, agregados, emulsiones, micropartículas, nanocristales, compuestos de o que abarcan epítopos de péptido o antígeno en varias formas, pueden ser sustituidos por el péptido libre en el método. Inversamente, el refuerzo de péptido mediante administración intranodal puede seguir el cebado vía cualesquier medios o ruta que obtenga inducción de células de memoria T aún a niveles moderados. Con el fin de reducir la presencia de resistencia debido a mosaicismo de expresión de antígeno o a mutación o pérdida del antígeno, es ventajoso inmunizar a múltiples, de preferencia aproximadamente 2-4 antígenos, concomitantemente. Cualquier combinación de antígeno puede ser usada. Un perfil de la expresión de antígeno de un tumor particular puede ser usado para determinar cual antígeno o combinación de antígenos usar. Metodología ejemplar es encontrada en la solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/580,969, presentada el 17 de junio de 2004, solicitud de patente estadounidense No. 11/155,288 presentada el 17 de junio de 2005 y solicitud de patente estadounidense No. / , (publicación No. ) (No. de expediente del abogado MANNK.050CP1 ) presentado en la misma fecha con la presente solicitud, todas tituladas COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOSTICS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS; y cada una de las cuales es incorporada por referencia en la presente en su totalidad. Combinaciones específicas de antígenos particularmente apropiados a tratamiento de cánceres seleccionados son revelados en las solicitudes de patente estadounidense provisionales No. 60/479,554 y solicitudes de patente estadounidense No. 10/871,708 (Pub. No. 2005-0118186 Al) y solicitud de PCT No. PCT/US2004/019571, citadas e incorporadas por referencia anteriormente. Para disparar respuestas inmunes a una pluralidad de antígenos o a epítopos de un solo antígeno, estos métodos pueden ser usados para administrar múltiples entidades inmunogénicas, ya sea individualmente o como mezclas. Cuando los inmunógenos son administrados individualmente, es preferido que las diferentes entidades sean administradas a diferentes nodos linfáticos o al (los) mismo(s) nodo(s) linfático(s) a diferentes veces o al (los) mismo(s) nodo(s) linfático(s) al mismo tiempo. Esto puede ser particularmente relevante para la administración de péptidos para los cuales una sola formulación que proporciona solubilidad y estabilidad a todos los péptidos componentes puede ser difícil de idear. Una sola molécula de ácido nucleico puede codifica múltiples inmunógenos. Alternativamente, múltiples moléculas de ácido nucleico que codifican uno o un subconjunto de todos los inmunógenos componentes para la pluralidad de antígenos puede ser mezcladas conjuntamente en tanto que la dosis deseadas pueda ser proporcionada sin necesitar tal alta concentración de ácido nucleico que la viscosidad se vuelva problemática. En modalidades preferidas, el método requiere la administración directa al sistema linfático. En modalidades preferidas esta es a un nodo linfático. Los vasos linfáticos aferentes son similarmente preferidos. La elección del nodo linfático no es crítica. Los nodos linfáticos inguinales son preferidos por su tamaño y acceso, pero nodos axilares y cervicales y tonsiles pueden ser similarmente ventajosos. La administración a un solo nodo linfático puede ser suficiente para inducir o amplificar una respuesta inmune. La administración a múltiples nodos puede incrementar la confiabilidad y magnitud de la respuesta. Para modalidades que promueven la respuesta equivalente y en las cuales los péptidos de amplificación múltiples son usados para las mismas, puede ser preferible que solamente un solo péptido sea administrado a cualquier nodo linfático particular en cualquier ocasión particular. Así, un péptido puede ser administrado al nodo linfático inguinal derecho y un segundo péptido al nodo linfático inguinal izquierdo al mismo tiempo, por ejemplo. Péptidos adicionales pueden ser administrados a otros nodos linfáticos aún si no fueran sitios de inducción, ya que no es esencial que dosis de inicio y amplificación sean administradas al mismo sitio, debido a la migración de linfocitos T. Alternativamente, cualesquier péptidos adicionales pueden ser administrados unos pocos días más tarde, por ejemplo a los mismos nodos linfáticos usados para los péptidos de amplificación administrados previamente, puesto que el intervalo de tiempo entre inducción y amplificación en general no es un parámetro crucial, aunque en modalidades preferidas el intervalo de tiempo puede ser mayor de aproximadamente 1 semana. La segregación de administración de péptidos de amplificación es en general de menos importancia si sus afinidades de enlaces de MHC son similares, pero pueden crecer en importancia a medida que las afinidades se vuelven más disparadas. Formulaciones incompatibles de varios péptidos pueden también hacer la administración segregada preferible. Los pacientes que se pueden beneficiar de tales métodos de inmunización pueden ser reclutados utilizando métodos para definir su perfil de expresión de proteína MHC y nivel general de sensibilidad inmune. Además, su nivel de inmunidad puede ser verificado utilizando técnicas estándar en conjunción con acceso a sangre periférica. Finalmente, los protocolos de tratamiento pueden ser ajustados en base a la sensibilidad a inducción o fases de amplificación y variación en expresión de antígeno. Por ejemplo, una dosis de arrastre repetidas preferiblemente pueden ser administradas hasta que se tiene una respuesta detectable y luego administrar la(s) dosis de péptido de amplificación, en lugar de amplificación después de algún número establecido de dosis de arrastre. Similarmente, las dosis de amplificación o mantenimiento programadas de péptido pueden ser discontinuadas si su efectividad fluctúa, número de célula T regulatoria antígeno-específica se eleva o se observa alguna otra evidencia de tolerización y el arrastre adicional puede ser administrado antes de reanudar la amplificación con el péptido. La integración de técnicas de diagnóstico para determinar y verificar sensibilidad inmune con métodos de inmunización es revelada más plenamente en la solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/580,964, que fue presentada el 17 de junio de 2004 y solicitud de patente estadounidense No. 11/155,928 (publicación No. ), presentada el 17 de junio de 2005, ambas tituladas IMPROVED EFFICACY OF ACTIVE IMMUNOTHERAPY BY INTEGRATING DIAGNOSTIC WITH THERAPEUTIC METHODS, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. La práctica de muchas de las modalidades metodológicas de la invención involucra el uso de por lo menos dos composiciones diferentes y especialmente cuando hay más de un solo antígeno objetivo, puede involucrar varias composiciones a ser administradas conjuntamente y/o a tiempos diferentes. Así, modalidades de la invención incluyen conjuntos y sub-conjuntos de composiciones inmunogénicas y dosis individuales de las mismas. La multivalencia puede ser obtenida utilizando composiciones que comprenden inmunógenos multivalentes, combinaciones de inmunógenos monovalentes, uso coordinado de composiciones que comprenden uno o más inmunógenos monovalentes o varias combinaciones de los mismos. Múltiples composiciones, manufacturadas para uso en un régimen o protocolo de tratamiento particular de acuerdo con tales métodos, definen un producto inmunoterapéutico. En algunas modas todas o un subconjunto de las composiciones del producto son empacadas conjuntamente en un equipo. En algunas instancias, las composiciones de inducción y amplificación que apuntan a un solo epítopo o conjunto de epítopos, pueden ser empacadas conjuntamente. En otras instancias, múltiples composiciones de inducción pueden ser ensambladas en un equipo y las composiciones de amplificación correspondientes ensambladas en otro equipo. Alternativamente, las composiciones pueden ser empacadas y vendidas individuales junto con instrucciones, en forma impresa o en medios que se pueden leer por la máquina, que describen como pueden ser usadas en conjunción entre sí para obtener los resultados benéficos de los métodos de la invención. Variaciones adicionales serán evidentes para el experimentado en el arte. El uso de varios esquemas de empaque que comprenden menos de todas las composiciones que podrían ser empleadas en un protocolo particular o régimen facilita la personalización del tratamiento, por ejemplo a base de expresión de antígeno de tumor o respuesta observada al inmunoterapéutico o sus varios componentes, como se describe en la solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/580,969, presentada el 17 de junio de 2004, solicitud de patente estadounidense No. 11/155,288 (publicación No. ), presentada el 17 de junio de 2005 y solicitud de patente estadounidense No. / , (No. de expediente del abogado MANNK.050CP1 ) presentada el 12/29/05, todas tituladas COMBINATION OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOSTICS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS; y solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/580,964 y solicitud de patente estadounidense No. 11/155,928 (publicación No. ), ambas tituladas IMPROVED EFFICACY OF ACTIVE IMMUNOTHERAPY BY INTEGRATING DIAGNOSTIC WITH THERAPEUTIC METHODS, cada una de las cuales es incorporada por referencia en la presente en su totalidad.

En algunas modalidades, los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como peso molecular, condiciones de reacción y así resumidos usados para describir y revindicar ciertas modalidades de la invención se comprenderá que están modificados en algunas instancias por el término "aproximadamente". Así, en algunas modalidades, los parámetros numéricos resumidos en la descripción escrita y reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca ser obtenidas por una modalidad particular. En algunas modalidades, los parámetros numéricos deben ser interpretados a la luz del número de dígitos significativos reportados y mediante aplicación de técnicas de redondeo ordinarias. A pesar de que los intervalos numéricos y parámetros que resumen el amplio alcance de algunas modalidades de la invención, son aproximaciones, los valores numéricos resumidos en los ejemplos específicos son reportados tan precisamente como sea practicable. Los valores numéricos presentados en algunas modalidades de la invención pueden contener ciertos errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus mediciones de prueba respectivas. En algunas modalidades, los términos "uno" y "una" y "el" y referencias similares usadas en el contexto de la descripción de una modalidad particular de la invención (especialmente en el contexto de ciertas de las siguientes reivindicaciones) pueden ser interpretados para cubrir tanto singular como plural) . La cita de intervalo de valores en la presente se propone solamente para servir como un método breve de referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del intervalo. A no ser que se indique de otra manera en la presente, cada valor individual es incorporado a la especificación como si fuera citado individualmente en la presente, todos los métodos descritos en la presente pueden ser efectuados en cualquier orden apropiado a no ser que se indique de otra manera en la presente o de otra manera sea contradicho claramente por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como" proporcionado con respecto a ciertas modalidades de la presente se propone solamente iluminar mejor la invención y no posee una limitación en cuanto al alcance de la invención reivindicada de otra manera. Ningún lenguaje en la especificación debe ser interpretado como indicación de que algún elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención. Agrupaciones de elementos o modalidades alternativas de la invención revelados en la presente no serán interpretados como limitaciones. Cada miembro de grupo puede ser referido a y revindicado individualmente o en cualquier combinación con otros elementos del grupo u otros elementos encontrados con la presente. Se anticipa que uno o más miembros de un grupo puede ser incluidos en o cancelados de un grupo por razones de conveniencia y/o patentabilidad. Cuando cualquiera de tal inclusión o cancelación ocurre, la especificación es considerada en la presente que contiene el grupo tal como es modificado satisfaciendo así la descripción escrita de todos los grupos de Markush usados en las reivindicaciones adjuntas. Modalidades preferidas de esta invención son descritas en la presente, en las que se incluyen el mejor conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Variaciones en cuanto aquellas modalidades preferidas se harán evidentes para aquellos de habilidad ordinaria en el arte después de la lectura de la descripción anterior. Se contempla que aquellos experimentados en el arte pueden emplear tales variaciones como se apropiado y la invención se puede llevar a la práctica de otra manera que como se describe específicamente en la presente. Así, muchas modalidades de la invención incluyen todas las modificaciones y equivalentes de la materia citada en las reivindicaciones adjuntas a la presente en tanto que sea permitido por la ley aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas las variaciones posibles es abarcada por la invención a no ser que se indique de otra manera en la presente o sea contradicha claramente de otra manera por el contexto. Además, se han realizado numerosas referencias a patentes y publicaciones impresas en toda esta especificación. Cada una de las referencias citadas anteriormente y publicaciones impresas son incorporadas individualmente en la presente por referencia en su totalidad. En el cierre, se comprenderá que las modalidades de la invención reveladas en la presente son ilustrativos de los principios de la presente invención. Otras modificaciones que pueden ser usadas pueden estar dentro del alcance de la invención. Así, a manera de ejemplo, pero no de limitación, configuraciones alternativas de la presente invención pueden ser utilizadas de acuerdo con las enseñanzas en la presente. Así, la presente invención no está limitada a aquella precisamente como se muestra y describe. Los siguientes ejemplos son por propósitos ilustrativos solamente y no pretenden limitar el alcance de la invención o sus varias modalidades de ninguna manera.

Ejemplo 1. Inducción altamente efectiva de respuestas inmune mediante inmunización intra-linfática Ratones que portan un transgen que expresa una versión de una sola cadena quimérica de MHC humano Clase I (A*0201, designado "HHD"; véase Pascólo et al. J. Exp. Med. 185 ( 12) : 2043-51, 1997, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad) fueron inmunizado mediante administración intranodal como sigue. Cinco grupos de ratones (n=3) fueron inmunizados con plásmido que expresa ángulo de Melan-A 26-35 A27L (pSEM) para inducción y amplificado una semana más tarde, al emplear diferentes rutas de inyección: subcutánea (se), intramuscular (im) e intralinfática (usando inoculación directa a los nodos linfáticos inguinales) . El programa de inmunización y dosificación es mostrado en la figura ÍA. Una semana después de la amplificación, los ratones fueron sacrificados; los esplenocitos fueron preparados y teñido utilizando mAbs anti-CD8 marcados y tetrámeros que reconocen receptores de célula T Melan-A 26-35-especí fieos . Los datos representativos son mostrados en la figura IB: en tanto que la administración subcutánea e intramuscular obtuvo frecuencias de células T de tetrámero+CD8+ de aproximadamente o menos de 1%, la administración intralinfática de plásmido obtuvo una frecuencia de más de 6%. Además, los esplenocitos fueron estimulados ex vivo con péptido de Melan-A y probados contra células objetivo 51Cr-marcadas (células T2) a varias proporciones de E:T (figura 1C) . Los esplenocitos de animales inmunizados mediante inyección de nodo intralinfático mostraron el nivel más alto de lisis in vitro a varias proporciones de E:T, utilizando este análisis de citotoxicidad estándar.

Ejemplo 2. Efectos del orden en el cual diferentes formas de inmunógeno son administradas Ratones HHD fueron inmunizados mediante administración intranodal de plásmido (pSEM) o péptido (Mel A; ELAGIGILTV; SEQ ID NO: 1) en varias secuencias. El polipéptido inmunogénico codificado por pSEM es revelado en la solicitud de patente estadounidense 10/292,413 (Pub. No. 20030228634 Al) intitulada Expression Vectors Encoding Epitopes of Target-Associated Antigens and Methods for their Design incorporado en la presente por referencia en su totalidad anteriormente. El protocolo de inmunización (figura 2) consistía de: (i) Fase de inducción/dosis de inducción: inyección bilateral a los nodos linfáticos e inguinales de 25 µl (microlitros) de solución salina estéril que contiene ya sea 25 µg (microgramos) de plásmido o 50 µg (microgramos) de péptido, en el día 0 y día 4. (ii) Dosis de amplificación: como se describe anteriormente en el ejemplo 1 e iniciadas a 2 semanas después de la consumación de la fase de inducción. La respuesta inmune fue medida mediante técnicas estándar, después del aislamiento de esplenocitos y estimulación in vitro con péptido cognato en presencia de pAPC . Es preferible que el perfil de respuesta inmune sea delineado al tomar en cuenta resultados que se derivan de múltiples análisis, facilitando la determinación de varias funciones efectoras y reguladoras y que proporcionan una vista más global de la respuesta. Se puede dar consideración al tipo de análisis usado y no solamente su número; por ejemplo, dos análisis para diferentes citocinas pro-inflamatorias no es tan informativo como un análisis más para una quimiocina o una citocina inmunosupresora .

Ejemplo 3. Análisis de ELISPOT de ratones inmunizados como se describe en el ejemplo 2 El análisis de ELISPOT mide la frecuencia de células T que producen citocina, péptido-específicas, la figura 3 presenta ejemplos representativos en duplicados y la figura 4 presenta un resumen de datos expresados individualmente como número de células que producen citocina/células respondedoras 106. Los resultados muestran que, en contraste con ratones inmunizados con péptido, los ratones plásmido-inmunizados o plásmido-arrastrados / péptido-amplificados desarrollaron frecuencias elevadas de células T que producen IFN-? (gamma) que reconocen el péptido Melan-A. Cuatro de cuatro ratones, arrastrados con plásmido y amplificados con péptido, desplegaron frecuencias en exceso de 1/2000. En contraste, dos de cuatro ratones inmunizados en todo el protocolo con plásmido, exhibieron frecuencias en exceso de 1/2000. Ninguno de los ratones que usan solamente péptido como un inmunógeno mostraron respuesta elevada que consiste de células T que producen IFN-?. Por supuesto, la administración repetida de péptido disminuyó la frecuencia de tales células, en contraste agudo con el péptido administrado después del arrastre con plásmido .

Ejemplo 4. Análisis de actividad citolítica de ratones inmunizados como se describe en el ejemplo 2 Esplenocitos acumulados fueron preparados (los bazos cosechados, cortados, sometidos a lisis de células de sangre rojo de cada grupo e incubados con pAPC singénico LPS-estimulado, recubierto con péptido de Melan-A durante 7 días, en presencia de rIL-2. Las células fueron lavadas e incubadas a diferentes proporciones con células objetivo T2 51Cr-marcadas pulsadas con péptido de Melan-A (ELA), durante 4 horas. La radioactividad liberada en el sobrenadante fue medida utilizando un contador y (gamma) . La respuesta fue cuantificada por % de lisis = (señal de muestra - fondo) / (señal máxima -fondo) por 100, en donde el fondo representa la radioactividad liberada por las células objetivo solas cuando son incubadas en el medio de análisis y la señal máxima es la radioactividad liberada por las célula objetivo sometidas a lisis con detergente. La figura 5 ilustra los resultados del análisis de citotoxicidad descrito anteriormente, los niveles de actividad citolítica obtenidos, después de estimulación in vitro con péptido, fue mucho mayor para aquellos grupos que habían recibido ADN como la dosis de inducción in vivo que aquellos que habían recibido péptido como la dosis de inducción. Consistente con los datos de ELISPOT anteriores, la inducción de una respuesta inmune con una composición de ADN condujo a función efectora estable amplificable, mientras que la inmunización utilizando solamente péptido dio como resultado una respuesta menor, la magnitud de la cual disminuyó adicionalmente después de la administración repetida.

Ejemplo 5. Reactividad Cruzada Los esplenocitos fueron preparados y usados como antes en el ejemplo 4 contra células objetivo recubiertas con tres péptidos diferentes: el inmunógeno análogo de Melan-A y aquellos que representan los epítopos humanos y murinos correspondiente al mismo. Como se muestra en la figura 6, se observó actividad citolítica similar en todos los tres objetivos, demostrando reactividad cruzada de la respuesta a las secuencias naturales.

Ejemplo 6. Administración repetida de péptido a los nodos linfáticos induce desviación inmune y células T regulatorias El perfil de citocina de células T específicas generado por los procedimientos de inmunización descritos anteriormente (y en la figura 2) fue determinado mediante ELISA o Luminex®. (El análisis de Luminex® es un método para medir la citocina producida por células T en cultivo en una forma multiplex) . Sobrenadantes de siete días de cultivos de linfocito mezclados generados como se describe anteriormente fueron usados para medir los siguientes modificadores de respuesta biológica: MlP-la, RANTES y TGF-ß (ELISA de captura, utilizando placas recubiertas con anticuerpo anti-citocina y reactivos específicos tales como anticuerpo biotina-marcado, peroxidasa de estreptavidina-rábano y sustrato colorimétrico; R&D Systems). Las otras citocinas fueron medidas mediante Luminex®, utilizando el T1/T2 y los kits inflamatorios T provistos por el fabricante especializado (BD Pharminigen) . Los datos de la figura 7A comparan los tres protocolos de inmunización diferentes y muestran un efecto inesperado del protocolo sobre el perfil de respuesta inmune: mientras que el arrastre de plásmido permitió la inducción de células T que segregan citocinas pro-inflamatorias, la administración de péptido repetida dio como resultado la generación de citocinas regulatorias o inmunosupresoras tales como IL-10, TGF-beta e IL-5. Se debe apreciar que el programa de inmunización usado para el protocolo de solamente péptido proporciona presencia periódica en lugar de continua del epítopo dentro del sistema linfático que prolonga en lugar de esto la fase efectora de la respuesta. Finalmente, el arrastre del plásmido seguido por amplificación de péptido dio como resultado la producción de cantidades elevadas de quimiocinas de células T MlP-la y RANTES. Las quimiocinas de células T tal como MlP-la y RANTES pueden jugar un papel importante para regular el tráfico a tumores o sitios de infección. Durante el estudio inmune, células T específicas para antígeno específico-asociados pueden encontrar ligando cognato, proliferar y producir mediadores en los que se incluyen quimiocinas. Estas pueden amplificar el reclutamiento de células T en el sitio en donde el antígeno es reconocido, permitiendo una respuesta más potente. Los datos fueron generados a partir de sobrenadantes obtenidos de cultivos globales (medias + SE de duplicados, dos mediciones independientes) . Las células fueron recuperadas del tejido intersticial del pulmón y bazo mediante métodos estándar y teñidos con anticuerpos contra CD8, CD62L y CD45RB, junto con agente de tetrámero que identifica células T Melan-A-específicas. Los datos en la figura 7B representan poblaciones de compuerta de CD8+ tetrámero + células T (eje y CD45RB y eje x CD62L) . Conjuntamente, los resultados demuestran desviación inmune en animales inyectados con péptido solamente (IFN-gamma reducido, producción de TNF-alfa, IL-10 incrementado, TGF-beta e IL-5, inducción robusta de CD62L-CD45Rblow CD8+ tetrámero+ células regulatorias). Ejemplo 7. Inducción altamente efectiva de respuestas inmunes mediante plásmido no replicante alternante (arrastre) con péptido (amplificación) administrado al nodo linfático Tres grupos de ratones HHD, transgénicos para el gen de HLA.A2 de Clase I de MHC humano, fueron inmunizados mediante administración intralinfática contra el antígeno asociado al tumor Mulan-A. Los animales fueron cebados (inducido) mediante inoculación directa a los nodos linfáticos inguinales ya sea con plásmido pSEM (25 µg/nodo linfático) o péptido de ELA (ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 1), análogo de Melan A 26-35 A27L) (25 µg/nodo linfático) seguido por una segunda inyección tres días más tarde. Después de diez días, los ratones fueron reforzados con pSEM o ELA de la misma manera seguido por un refuerzo final tres días más tarde para amplificar la respuesta (véase figura HA para un programa de inmunización similar) , dando como resultado las siguientes combinaciones de inducción y amplificación: pSEM + pSEM, pSEM + ELA y ELA + ELA (12 ratones por grupo) . Diez días más tarde, la respuesta inmune fue verificada utilizando un reactivo de tetrámero de Melan-A específico (HLA-A*0201 MARTI (ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 1))-PE, Beckman Coulter) . Ratones individuales fueron sangrados vía la vena de retro-orbital sinus y PBMC fueron aislados utilizando centrifugación de densidad (Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs) a 2000 rpm durante 25 minutos. Los PBMC fueron co-teñidos con un anticuerpo específico de ratón a CD8 (BD Biosciences) y el reactivo de tetrámero de Melan-A y porcentajes específicos fueron determinados mediante citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo de calibre FACS (BD) . Los porcentajes de células CD8+ Melan-A específicas, generadas por las diferentes combinaciones de cebado/refuerzo, son mostrados en las figuras 8A y 8B. El grupo de plásmido-cebado/péptido-refuerzo (pSEM + ELA) produjo una respuesta inmune robusta con un porcentaje de tetrámero promedio de 4.6 entre todos los animales. Los animales respondedores fueron definidos por tener porcentajes de tetrámero de 2 o mayor que representó un valor equivalente al promedio del grupo de control sin inmunizar más tres veces la desviación estándar (SE) . Tales valores son considerados respuestas muy robustas en el arte y pueden usualmente ser obtenidos solamente al utilizar vectores replicantes. El grupo de inmunización de pSEM + ELA contenía 10 de 12 ratones que fueron encontrados ser respondedores y esto representó una diferencia estadísticamente significativa en comparación con el go de control (p (Fisher) = 0.036) . Las otras dos series de inmunización, pSEM + pSEM y ELA + ELA, produjeron 6 de 12 respondedores pero tuvieron valores de p mayor de 0.05 volviéndolos estadísticamente menos significativos. Para medir la inmunidad de estos ratones, los animales fueron tratados con células objetivo recubiertas de péptido in vivo. Los esplenocitos fueron aislados de ratones de HHD de control de camada e incubados con 20 µg/ml de péptido de ELA por 2 horas. Luego estas células fueron teñidas con CFSEhi fluorescente (4.0 µM por 15 minutos) y co-inyectadas intravenosamente a ratones inmunizados con una proporción igual de esplenocitos de control que no habían sido incubados con péptido, teñidos con fluorescencia de CFSElo (0.4 µM) . Dieciocho horas más tarde la eliminación específica de células objetivo fue medida al remover el bazo, nodo linfático, PBMC y pulmón de los animales tratados (5 ratones por grupo) y al medir la fluorescencia de CFSE mediante citometría de flujo. Los resultados son mostrados en la figura 8c. En el grupo de cebado/refuerzo de pSEM + ELA, 4 de 5 ratones demostraron una respuesta inmune robusta y despejaron exitosamente aproximadamente 50% de los objetivos en cada uno de los tejidos probados. Histogramas representativos para cada uno de los grupos experimentales son mostrados también (PBMC) Ejemplo 8. El refuerzo de péptido reactiva efectivamente las células de memoria inmune en animales inducidos con ADN y permanecieron hasta que los niveles de tetrámero estuvieron cercanos a la referencia Los niveles de tetrámero de Melan-A fueron medidos en ratones (5 ratones por grupo) enseguida de la inmunización como se describe en la figura 9A. A las 5 semanas después de la consumación del programa de inmunización, los niveles de tetrámero habían regresado cerca de la referencia. Los animales fueron reforzados a 6 semanas con péptido de ELA para determinar si las respuestas inmunes podrían ser restauradas. Los animales que reciben inmunizaciones previas de plásmido de pSEM (ADN/ADN, figura 9C) demostraron una expansión sin precedente de células CD8+ T Melan-A específicas enseguida de la amplificación de ELA, con niveles en el intervalo mayor de 10%. Por otra parte, los animales que reciben inyecciones previas de péptido de ELA (figura 9A) derivaron poco beneficio del refuerzo de ELA tal como se indica por la frecuencia más baja de células de teñido de tetrámero. Los ratones que recibieron ADN seguido por péptido como la inmunización inicial exhibieron una expansión significativa pero intermedia, después de recibir la amplificación de péptido, en comparación con los otros grupos (figura 9B) . Estos resultados demuestran claramente una lógica fuerte por un arrastre de ADN/ADN y estrategia de inmunización de péptido-amplificación .

Ejemplo 9. Optimización de inmunización para obtener altas frecuencias de células T específicas en órganos linfoides y no linfoides Como se describe en las figuras 9A-C, los ratones que fueron sometidos a una inmunización de arrastre con una serie de dos grupos de inyecciones de plásmido seguida por amplificación con péptido produjeron una respuesta inmune potente. Evidencia adicional para esto es mostrado en las figuras 10A-C que ilustran niveles de tetrámero antes (figura 10A) y enseguida de la administración de péptido (figura 10B) . Los niveles de tetrámero en ratones individuales pueden ser vistos claramente y representan hasta 305 de la población de CD8+ de células T en ratones que reciben el protocolo de inmunización de ADN/ADN/péptido . Estos resultados son resumidos en las gráfica en la figura 10C. Además, los niveles de tetrámero altos son claramente evidentes en sangre, nodo linfático, bazo que y pulmón de animales que reciben este protocolo de inmunización refinado (figura 10D) . Múltiple experimentos adicionales se han llevado a cabo para caracterizar el fenotipo de CTL generadas mediante este protocolo. El perfil inmune iniciado en tales condiciones fue impreso, puesto que el refuerzo de péptido dio como resultado expansión sustancial de una población de célula T CD43+, CD44+, CD69+, CD62L-, CD45RBdim, péptido-MHC de Clase I-específica. Estas células T específicas colonizaron órgano sin linfoides y después de estimulación específica adicionalmente, adquirieron rápidamente la expresión de CD107a y IFN-?, de manera dependiente de la densidad de complejos de péptido estimulantes .

Ejemplo 10. Una secuencia de administración precisa de plásmido e inmunógeno de péptido determina la magnitud de respuesta inmune Seis grupos de ratones (n=4) fueron inmunizados con plásmido que expresa análogo de Melan-A 26-35 A27L (pSEM) o péptido de Melan-A utilizando cebado y amplificación mediante inoculación directa a los nodos linfáticos inguinales. El programa de inmunización es mostrado en la figura HA (dosis de 50 µg de plásmido o péptido/nodo linfático, bilateralmente) . Dos grupos de ratones fueron iniciados utilizando plásmido y amplificados con plásmido o péptido. Inversamente, dos grupos de ratones fueron iniciados con péptido y amplificados con péptido o plásmido. Finalmente, dos grupos de ratones de control fueron iniciados ya sea con péptido o plásmido pero no amplificados. A cuatro semanas después de la última inoculación, los bazos fueron cosechados y se prepararon suspensiones de esplenocito, se acumularon y estimularon con péptido de Melan-A en cajas de ELISPOT recubiertas con anticuerpo anti-IFN-?. A 48 horas después de la incubación, el análisis fue desarrollado y la frecuencia de células T que producen citocina que reconoce Melan-A fue contado automáticamente. Los datos fueron representados en la figura 5B como frecuencia de células T específicas/1 millón de células respondedoras (media de triplicados + SD) . Los datos muestran que al invertir el orden de inicio y dosis de amplificación de plásmido y péptido tiene un efecto sustancial sobre la magnitud global de la respuesta: en tanto que el arrastre de plásmido seguido por amplificación de péptido dio como resultado la respuesta más alta, las dosis de inicio de péptido seguidas por amplificación de plásmido generaron una respuesta significativamente más débil similar a la administración repetida de péptido. Ejemplo 11. Correlación de respuestas inmunes con el protocolo de inmunización y eficacia in vivo - manifestada por el despeje de células objetivo dentro de órganos linfoides y no linfoides . Para evaluar la respuesta inmune obtenida mediante el protocolo de arrastre y amplificación, 4 grupos de animales (n=7) fueron tratados con células objetivo Melan-A-recubiertas in vivo. Los esplenocitos fueron aislados de ratones de HHD de control de camada e incubados con 20 µg/ml de péptido de ELA por 2 horas. Luego estas células fueron teñidas con fluorescencia de CFSEhi (4.0 µM por 15 minutos) y co-inyectadas intravenosamente a ratones inmunizados con una proporción igual de esplenocitos de control teñidos con fluorescencia de CFSElo (0.4 µM) . Dieciocho horas más tarde la eliminación específica de células objetivo fue medida al remover el bazo, nodo linfático, PBMC y pulmón de los animales tratados y medición de fluorescencia de CFSE mediante citometría de flujo. Las figuras 12A y 12B muestran gráficas de histograma de CFSE de tejidos de animales de control sin inmunizar o animales que reciben un protocolo de inmunización de péptido/péptido, ADN/péptido o ADN/ADN (dos ratones representativos son mostrados de cada grupo) . El grupo de arrastre de ADN-amplificación de péptido demostró altos niveles de exterminio específico de células objetivo en órganos linfoides también como órganos no litoides (figura 12C) y representó el único protocolo de inmunización que demostró una correlación específica con los niveles de tetrámero (figura 12D, r2 = 0.81 o más alto para todos los tejidos probados).

Ejemplo 12. Despeje de células de tumor humano en animales inmunizados mediante el protocolo de arrastre y amplificación refinado La inmunidad al antígeno Melan-A fue probada adicionalmente al tratar ratones con células de tumor de melanoma humano enseguida de la inmunización con el protocolo refinado. La figura 13A muestra la estrategia de inmunización refinada para los 3 grupos probados. Ratones inmunizados recibieron dos inyecciones intravenosas de células objetivo humanas, 624.38 HLA.A2+, marcadas con fluorescencia de CFSEhi mezclada con una proporción igual de células de control 624.28 HLA.A2+ marcadas con CFSElo como se ilustra en la figura 13B. Catorce horas más tarde, los ratones fueron sacrificados y los pulmones (el órgano en el cual los objetivos humanos se acumulan) fueron analizados en cuanto a la lisis específica de células objetivo mediante citometría de flujo. La figura 13C muestra gráficas de histograma de CFSE representativas derivadas de un ratón de cada grupo. El arrastre de ADN seguido por una amplificación de péptido inmunizó claramente los ratones contra las células de tumor humano como se demuestra por casi 80% de exterminio específico de los objetivos en el pulmón. La serie más larga de inyecciones de arrastre de ADN también condujo a una frecuencia incrementada adicional de células CD8+ reactivas con el tetrámero de MelanA.

Ejemplo 13. La estrategia de arrastre de ADN, amplificación de péptido da como resultado inmunidad robusta contra un epítopo SSX2-derivado, KASEKIFYY (SSX24?-49) Animales inmunizados contra el antígeno asociado a tumor SSX2 utilizando el programa de inmunización definido en la figura 14A, demostraron una respuesta inmune robusta. La figura 14B muestra el teñido de tetrámero representativo de ratones cebado (arrastrados) con el plásmido pCBP y reforzados (amplificado) ya sea con el análogo de péptido SSX241-49 K41F o K41Y. Estos análogos son reactivos de manera cruzada con células T específicas para el epítopo SSX241-49. Estos ejemplos ilustran que el protocolo de arrastre y amplificación puede producir una especificidad de antígeno de SSX2 que se aproxima al 80% de las células T de CD8 disponibles. El plásmido de pCBP y principios de su diseño son revelados en la solicitud de patente estadounidense No. 10/292,413 (Pub. No. 20030228634 Al) intitulada Expression Vector Encoding Epitopes of Target-Associated Antigens and Methods for their Design, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad. Metodología adicional, composiciones, péptidos y análogos de péptido son revelados en solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/581,001, presentada el 17 de junio de 2004 y solicitud de patente estadounidense No. 11/156,253, presentada el 17 de junio de 2005, ambas tituladas SSX-2 PEPTIDE ANALOGS; cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Metodología adicionalmente, composiciones, péptidos y análogos de péptido son revelados en solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/580,962, presentada el 17 de junio de 2004 y solicitud de patente estadounidense No. 11/155,929, presentada el de junio de 2005, cada titulada NY-ESO PEPTIDE ANALOGS; y cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad.

Ejemplo 14. La estrategia de arrastre y amplificación puede ser usada para producir respuestas inmunes contra epítopos localizados sobre antígenos diferentes simultáneamente Cuatro grupos de ratones HHD (n=6) fueron inmunizados vía inyección intranodo linfático a sea con pSEM solo; pCBP solo; pSEM y pCBP como una mezcla; o con pSEM en el LN izquierdo y pCBP en el LN derecho. Estas inyecciones fueron seguidas 10 días más tarde ya sea con un refuerzo de ELA o péptido de SSX2 de la misma manera. Todos los ratones inmunizados fueron comparados con controles sin inmunizar. Los ratones fueron tratados con esplenocitos de camada de HHD recubiertos con ELA o péptido de SSX2, usando un análisis de citotoxicidad in vivo de CFSE de triple pico que permite la determinación de la lisis específica de dos objetivos de antígeno simultáneamente. Iguales números de células de control CFSE10, SSX2-CFSEmed y ELA-CFSEhl fueron sometidas a infusión intravenosamente a ratones inmunizados y 18 horas más tarde los ratones fueron sacrificados y la eliminación de célula objetivo fue medida en el bazo (figura 15A) y sangre (figura 15B) mediante fluorescencia de CFSE utilizando un citómetro de flujo. Las figuras 15A y 15B muestran el por ciento de lisis específica del SSX2 y objetivos de antígeno de Melan-A de ratones individuales y la figura 15C resume los resultados en formato de gráfica de barras. La inmunización de los animales con una mezcla de dos vacunas generó inmunidad para ambos antígenos y dio como resultado la respuesta inmune más alta, que representa un por ciento de lisis específica de SSX2 promedio en bazo de 30+/-11 y 97+/- 1 para Melan-A. Variaciones en inducir respuestas multivalentes, en las que se incluyen respuestas a epítopos subdominantes, son ejemplificados adicionalmente en los ejemplos 24-34. Ejemplo 15: Ciclos repetidos de arrastre de ADN y amplificación de péptido obtienen y mantienen fuerte inmunidad Tres grupos de animales (n=12) recibieron dos ciclos de los siguientes protocolos de inmunización: ADN/ADN/ADN; DNA/péptido/péptido; o ADN/ADN/péptido. Los niveles de tetrámero de Melan-A fueron medidos en los ratones enseguida de cada ciclo de inmunización y son presentados en la figura 16. El ciclo de inmunización inicial de ADN/ADN/péptido dio como resultado un promedio de 21.1 +/- 3.8 por ciento de tetrámero+células CD8 T casi dos veces más alta que los otros dos grupos. Enseguida del segundo ciclo de inmunización de arrastre y amplificación, el porcentaje de tetrámero promedio para el grupo de ADN/ADN/péptido se incrementó por 54.5% a 32.6 +/- 5.9 - 2.5 veces más alto que los niveles de ADN/péptido/péptido y 8.2 veces más alto que los niveles del grupo ADN/ADN/ADN. Además, bajo estas condiciones, los otros programas de inmunización obtuvieron poco incremento en la frecuencia de células T tetrámero positivas.

Ejemplo 16. Las células T de memoria de larga vida disparadas mediante regímenes de inducción y amplificación inmune, que consisten de plásmido y vectores de péptido alternantes Cuatro animales transgénicos HHD (3563, 3553, 3561 y 3577) recibieron dos ciclos del siguiente protocolo de arrastre y amplifica: ADN/ADN/péptido. El primer ciclo involucró inmunización en los días -31, -28, -17, -14, -3, 0; el segundo ciclo involucró inmunizaciones en el día 14, 17, 28, 31, 42 y 45. Los ratones fueron reforzados con péptido en el día 120. Los niveles de tetrámero de Melan-A fueron medidos en los ratones a 7-10 días enseguida de cada ciclo de inmunización y periódicamente hasta 90 días después del segundo ciclo de inmunización. Las flechas en el diagrama corresponden a la consumación de los ciclos. (Figura 17A) . Todos los cuatro animales mostraron una respuesta después del último refuerzo (amplificación) , demostrando persistencia de memoria inmune en lugar de inducción de tolerancia. Cinco animales transgénicos HHD (3555, 3558, 3566, 3598 y 3570) recibieron dos ciclos del siguiente protocolo de arrastre y amplificación: ADN/péptido/péptido. Como antes, el primer ciclo consistió de inmunización en los días -31, -28, -17, -14, -3, 0; el segundo ciclo consistió de inmunizaciones en el día 14, 17, 28, 31, 42 y 45. Los ratones fueron reforzados con péptido en el día 120. Los niveles de tetrámero de Melan-A fueron medidos en los ratones a 7-10 días enseguida de cada ciclo de inmunización y periódicamente hasta 90 días después del segundo ciclo de inmunización (figura 17B) . Por comparación de este protocolo de arrastre y amplificación la sustitución de péptido por las inyecciones de ADN más tarde en cada ciclo dieron como resultado, en este evento, memoria inmune disminuida o sensibilidad reducida. Ejemplo 17. Células T de memoria de larga vida con capacidad de expansión sustancial son generadas mediante administración de ADN intranodal Siete animales transgénicos HHD recibieron dos ciclos del siguiente protocolo de inmunización: ADN/ADN/ADN. El primer ciclo involucró inmunización en los días -31, -28, -17, -14, -3, 0; el segundo ciclo involucró inmunizaciones en el día 14, 17, 28, 31, 42 y 45. Los ratones fueron reforzados con péptido en el día 120. Los niveles de tetrámero de Melan-A fueron medidos en los ratones a 7-10 días enseguida de cada ciclo de inmunización y periódicamente hasta 90 días después del segundo ciclo de inmunización. (Figura 18). Todos los siete animales mostraron % de frecuencias de frontera de tetrámero + células durante y después de los ciclos de inmunización pero mostraron respuestas fuertes después de un refuerzo de péptido, demostrando memoria inmune sustancial .

Ejemplo 18. Varias combinaciones de antígeno más adyuvante inmunopotenciador son efectivas para el arrastre de una respuesta de CTL La administración intranodal de péptido es un medio muy potente para amplificar respuestas inmune disparadas por la administración intralinfática de agentes (replicantes o no replicantes) que comprenden o en asociación con adyuvantes tales como TLR. Sujetos (tales como ratones, humanos u otros mamíferos) son arrastrados mediante infusión intranodal o inyección con vectores tales como plásmidos, virus, péptido más adyuvante (CpG, dsARN, ligandos TLR) , proteína recombinante más adyuvante (CpG, dsARN, ligandos TLR) , microbios exterminados o antígenos purificados (por ejemplo, componentes de pared celular que tienen actividad inmunopotenciadora) y amplificados mediante inyección intranodal de péptido sin adyuvante. La respuesta inmune medida antes y después de refuerzo mediante teñido de tetrámero y otros métodos muestra incremento sustancial en magnitud. En contraste, un refuerzo utilizando péptido sin adyuvante mediante otras rutas no obtiene el mismo incremento de la respuesta inmune. Ejemplo 19. La administración intranodal de péptido es un medio muy potente para amplificar respuestas inmune disparadas por antígeno más adyuvante inmunopotenciador por medio de cualquier rutina de administración. Sujetos (tales como ratones, humanos u otros mamíferos) son inmunizados mediante administración parenteral o mucosal de vectores tales como plásmidos, virus, péptido más adyuvante (CpG, dsARN, ligandos de TLR) , proteína recombinante más adyuvante (CpG, dsARN, ligandos de TLR) , microbios exterminado o antígenos purificados (por ejemplo, componentes de pared celular que tienen actividad inmunopotenciadora) y amplificados mediante inyección intranodal de péptido sin adyuvante. La respuesta inmune medida antes y después de refuerzo mediante teñido de tetrámero y otros métodos muestra incremento sustancial en magnitud. En contraste, un refuerzo que utiliza péptido sin adyuvante mediante otras rutas que la intranodal no obtienen el mismo incremento de la respuesta inmune .

Ejemplo 20. Rompimiento de tolerancia utilizando un protocolo de inmunización de arrastre y amplificación Con el fin de romper la tolerancia o restaurar la sensibilidad inmune contra anti-antígenos (tales como antígenos asociados al tumor) sujetos (tales como ratones, humanos u otros mamífero) son inmunizados con vectores tales como plásmidos, virus, péptido más adyuvante (CpG, dsARN, imitadores de TLR) , proteína recombinante más adyuvante (CpG, dsARN, imitadores de TLR) , microbios exterminados o antígenos purificados y reforzados mediante inyección intranodal con péptido (correspondiente a un auto-epítopo) sin adyuvante. La respuesta inmune medida antes y después de refuerzo mediante teñido de tetrámero y otros métodos muestra incremento sustancial en la magnitud de respuesta inmune ("rompimiento de tolerancia") .

Ejemplo 21. Práctica clínica de inmunización de arrastre y amplificación Los pacientes son diagnosticados en necesidad del tratamiento por una enfermedad neoplásica o infecciosa utilizando criterios clínicos y de laboratorio; tratados o no utilizando terapia de primera línea y referidos a evaluación por inmunoterapia activa. El reclutamiento se hace en base a criterios adicionales (perfilado de antígeno, haplotipificación de MHC, sensibilidad inmune) dependiendo de la naturaleza de la enfermedad y características del producto terapéutico. El tratamiento (figura 19) es llevado a cabo mediante inyección intralinfática o infusión (bolo, bomba programable u otro medio) de vector (plásmidos) y antígenos de proteína (péptidos) en una secuencia precisa. El protocolo más preferido involucra ciclos repetidos que abarcan arrastre de plásmido seguido por dosis de amplificación de péptido. La frecuencia y continuación de tales ciclos pueden ser ajustados dependiendo de la respuesta medida medios inmunológicos, clínicos y otros medios. La composición a ser administrada puede ser monovalente o polivalente, que contiene múltiples vectores, antígenos o epítopos. La administración puede ser a uno o múltiples nodos linfáticos simultáneamente o de manera escalonada. Los pacientes que reciben esta terapia demuestran mejora de los síntomas.

Ejemplo 22. Práctica clínica para inducción de desviación inmune o desactivación de células T patógenas Los pacientes con alteraciones autoinmunes o inflamatorias son diagnosticadas utilizando criterios clínicos y de laboratorio, tratados o no utilizando terapia de primera línea y referidos a evaluación por inmunoterapia activa. El reclutamiento se hace a base de criterios adicionales (perfilado de antígeno, haplotipificación de MHC, sensibilidad inmune) dependiendo de la naturaleza de la enfermedad y características del producto terapéutico. El tratamiento es llevado a cabo mediante inyección intralinfática o infusión (bolo, bomba programable u otros medios) de péptido desprovisto de adyuvantes que promueven TI y/o junto con moduladores inmunes que amplifican la desviación inmune. Sin embargo, las inyecciones de bolo periódicas son el modo preferido para generar desviación inmune mediante este método. Los tratamientos con péptido pueden ser llevados semanalmente, bi-semanalmente, o menos frecuentemente (por ejemplo, mensualmente) , hasta que se obtiene un efecto deseado sobre la inmunidad o estatus clínico. Tales tratamientos pueden involucrar una sola administración o múltiples administraciones espaciadas estrechamente como en la figura 2, grupo 2. La terapia de mantenimiento puede ser después de esto iniciada, utilizando un régimen ajustado que involucra inyecciones menos frecuentes. La composición a ser administrada puede ser monovalente o polivalente, que contiene múltiples epítopos. Es preferido que la composición esté libre de cualquier componente que programaría la resistencia del péptido en el sistema linfático. La administración puede ser a uno o múltiples nodos linfáticos simultáneamente o de manera escalonada y la respuesta verificada al medir células T específicas para inmunizar péptidos o epítopos sin relacionar ("espaciamiento de epítopo"), además de métodos clínicos pertinentes.

Ejemplo 23. Composiciones inmunogénicas (por ejemplo, vacunas virales) Seis grupos (n=6) de ratones transgénicos HLA-A2 son inyectados con 25 µg de vector de plásmido bilateralmente en los nodos linfáticos inguinales, de acuerdo con el siguiente programa: día 0, 3, 14 y 17. El vector codifica tres epítopos A2 restringidos de HIV gag (SLYNTVATL (SEQ ID NO: 3), VLAEAMSQV (SEQ ID NO: 4), MTNNPPIPV (SEQ ID NO: 5)), dos de pol (KLVGKLNWA (SEQ ID NO: 6), ILKEPVHGV (SEQ ID NO: 7)) y uno de env (KLTPLCVTL (SEQ ID NO: 8) ) . Dos semanas después del último ciclo de arrastre, los ratones son inyectados con mezclas que abarcan todos estos cinco péptidos (5 µg/péptido/nodo bilateralmente tres días aparte). En paralelo, cinco grupos de ratones son inyectados con péptidos individuales (5 µg/péptido/nodo bilateralmente tres días aparte) . Siete días más tarde los ratones son sangrados y la respuesta es determinada mediante teñido de tetrámero contra cada péptido. Después de esto, la mitad de los ratones son tratados con virus de vacuna recombinante que expresan env, gag o pol (103 TCID50/ratón) y a 7 días, el título viral es medido en los ovarios al utilizar un análisis de placa convencional. La otra mitad son sacrificados, los esplenocitos son estimulados con péptidos por 5 días y la actividad citotóxica es medida contra células objetivo recubiertas con péptidos. Los ratones arrastrados con plásmido y amplificados con péptidos muestran inmunidad más fuerte contra todos los cinco péptidos, mediante teñido de tetrámero y citotoxicidad. Más en general, con el fin de romper la tolerancia, restaurar sensibilidad inmune o inducir inmunidad contra no auto-antígenos tales como virales, bacterianos, parásitos o microbianos, sujetos (tales como ratones, humanos u otros mamíferos) son inmunizado con vectores tales como plásmidos, virus, péptido más adyuvante (CpG, dsARN, imitadores de TLR) , proteína recombinante más adyuvante (CpG, dsARN, imitadores de TLR) , microbios exterminados o antígenos purificados (tales como componentes de pared celular) y reforzados mediante inyección intranodal con péptido (correspondiente a un epítopo objetivo) sin adyuvante. La respuesta inmune medida antes y después de los refuerzos mediante teñido de tetrámero y otros métodos muestra incremento sustancial en la magnitud de respuesta inmune. Tal estrategia puede ser usada para proteger contra infección o tratar infecciones crónicas provocadas por agentes tales como HBV, HCV, HPV, CMV, virus de influenza, HIV, HTLV, RSV, etc.

Ejemplo 24. Programa de inmunización con dos plásmidos: pCBR que expresa SSX2 41-49 y pSEM que expresa Melan-A 26-35 (A27L) Dos grupos de ratones HHD (n=4) fueron inmunizados vía inyección de nodo intralinfático ya sea con pSEM y pCBP como una mezcla; o con pSEM en el nodo linfático inguinal izquierdo y pCBP en el nodo linfático inguinal derecho, dos veces en el día 0 y 4 como se muestra en la figura 20. La cantidad del plásmido fue de 25 µg/plásmido/dosis . Dos semanas más tarde, los animales fueron sacrificados y la citotoxicidad fue medida contra células T2 y usadas o no con péptido.

Ejemplo 25. La segregación de vector rescata la inmunogenicidad del epítopo menos dominante Los animales inmunizados como se describe en el ejemplo 24 fueron sacrificados y los esplenocitos acumulados por grupo y estimulados con uno de los dos péptidos, Melan-A 26-35 (A27L) o SSX2 41-49, en paralelo. La citotoxicidad fue medida mediante incubación con células objetivo T2 51Cr-cargadas, péptido-pulsadas . Los datos de la figura 21 muestran el promedio de citotoxicidad específica (n=4/grupo) contra varias células objetivo. Los resultados muestran que el uso de la mezcla de plásmidos interfirió con la respuesta producida por el plásmido de pCBP; sin embargo, la segregación de los dos plásmidos en relación con el sitio de administración rescató la actividad de pCBP. La co-administración de diferentes vectores que portan antígenos distintos da como resultado el establecimiento de una jerarquía con respecto a inmunogenicidad. La segregación del vector rescata la inmunogenicidad del componente menos dominante, dando como resultado una respuesta multivalente.

Ejemplo 26. Adición de etapas de amplificación de péptido al protocolo de inmunización Cuatro grupos de ratones HHD (n=6) fueron inmunizados vía inyección del nodo intralinfático con ya sea pSEM y pCBP como una mezcla; o con pSEM en el nodo linfático inguinal izquierdo y pCBP en el nodo linfático inguinal derecho, dos veces, en el día 0 y 4 como se muestra en figura 22. Como control, los ratones fueron inmunizados ya sea con plásmido de pSEM o pCBP solo. La cantidad del plásmido fue de 25 µg/plásmido/dosis. Dos semanas más tarde en los días 14 y 17, los animales fueron reforzados con Melan-A y/o péptidos de SSX2, que reflejan la inmunización de plásmido con respecto a la dosis y combinación. Dos semanas más tarde el día 28, los animales fueron tratados con esplenocitos teñidos con CFSE y pulsados o no con Melan-A (ELA) o péptido de SSX2, para evaluación de citotoxicidad in vivo.

Ejemplo 27. El refuerzo de péptido rescata la inmunogenicidad de un epítopo menos dominante aún cuando los vectores y péptidos respectivamente, son usados como mezcla Los animales fueron inmunizados como se describe en el ejemplo 26 y tratados con esplenocitos de camada de HHD recubiertos con péptido de ELA o SSX2, utilizando un análisis de citotoxicidad in vivo de CFSE de triple pico que permite la determinación de la lisis específica de dos objetivos de antígeno simultáneamente. Números iguales de células de control-CFSE10, SSX2-CFSEmed y ELA-CFSEhi fueron infusionadas intravenosamente a ratones inmunizados y 18 horas más tarde los ratones fueron sacrificados y la eliminación de célula objetivo fue medida en el bazo (figura 23) mediante fluorescencia CFSE utilizando citometría de flujo. La figura muestra el por ciento de lisis específica de los objetivos de antígeno de SSX2 y Melan-A de ratones individuales, la media y desviación estándar para cada grupo. Interesantemente, la inmunización de los animales con una mezcla de dos vacunas que comprende plásmidos primero y péptido después de esto, generó inmunidad para ambos antígenos y dio como resultado la respuesta inmune más alta, representando un por ciento de lisis específica de SSX2 promedio en el bazo de 30±11 y 97±1 para Melan-A. Así, como se ilustra en la figura 23, el refuerzo de péptido puede rescatar la inmunogenicidad de un epítopo menos dominante aún cuando los vectores y péptidos respectivamente son usados como una mezcla.

Ejemplo 28. Práctica clínica para inmunización de arrastre y amplificación Dos escenarios son mostrados en la figura 24 para inducción de fuertes respuestas multivalentes: en el primero (A) , el uso de péptidos para amplificación restaura respuestas inmunes multivalentes aún si los plásmidos y péptidos son usados como mezclas. En el segundo escenario (B) , la segregación de componentes de plásmido y péptido respectivamente, permite la inducción de respuestas inmunes multivalentes. Es preferido que el péptido sea administrado al mismo nodo linfático al cual el plásmido de arrastre para el epítopo común es administrado. Sin embargo esto no es absolutamente requerido puesto que las células de memoria T pierde la expresión de CD62L y así colonizan otros órganos linfoides. El intervalo de tiempo entre el arrastre amplificación mostrada en la figura 24 es conveniente, pero no se considera crítico. Intervalos sustancialmente más cortos son menos preferidos pero los intervalos mucho más largos son bastante aceptables.

Ejemplo 29. Un solo plásmido produce una respuesta multivalente El plásmido pSEM, descrito en la figura 25 y en la tabla a continuación, abarca dentro de un marco de lectura abierta ("secuencia de codificación de polipéptido sincrótopo) múltiples péptidos de dos difusión antígenos (Melan-A y tirosinasa) unidos conjuntamente. Así tiene potential de expresar e inducir inmunización contra más de un solo epítopo. Las secuencias de péptido codificadas son las siguientes: tirosinasa 1-9; Melan-A/MART-1 26-35 (A27L); tirosinasa 369-377; y Melan-A/M ART-I 31-96. La secuencia de cADN para el polipéptido en el plásmido está bajo el control de la secuencia de promotor/mejorador del citomegalovirus (CMVp) que permite la transcripción eficiente de mensajero para el polipéptido después de la absorción mediante las células que presentan antígeno. La señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina (BHG polyA) en el extremo 3' de la secuencia de codificación proporciona la señal para la poliadenilación del mensajero para incrementar su estabilidad, también como translocación de nucleótido al citoplasma. Para facilitar el transporte de plásmido al núcleo, una secuencia de importación nuclear (NIS) del virus de simio 40 ha sido insertado a la cadena fundamental del plásmido. Una copia de una porción inmunoestimuladora de CpG es diseñada al plásmido para reforzar adicionalmente respuestas inmunes. Finalmente, dos elementos genéticos procarionticos en el plásmido son responsables por la amplificación de E. coli, gen de resistencia de canamicina (Kan R) y el origen bacteriano pMB de replicación. Descripción adicional de pSEM se puede encontrar en la solicitud de patente estadounidense No. 10/292,413, que es nombrado de manera variada pMA2M y pVAXM3, incorporada en la presente por referencia .

Ejemplo 30. Protocolo para "rescatar" o amplificar una respuesta inmune contra un epítopo subdominante subsecuente al inicio al utilizar un vector multivalente. Una limitación notoria de vectores que co-expresan epítopos de relevancia terapéutica es aquella dentro del contexto recién diseñado, un epítopo asumirá un papel dominante con respecto a inducción de inmunidad, mientras que los otros serán subdominantes (particularmente cuando tales epítopos se enlazan a los mismos elementos de restricción de MHC) . En la figura 26, se describe tal protocolo: ocho grupos de ratones HHD (n=4) fueron inmunizados vía inyección de nodo intralinfático con pSEM, en los días 0, 3, 14 y 17. La cantidad del plásmido fue de 25µg de plásmido/dosis . En los días 28 y 31, los ratones fueron administrados intranodalmente con péptidos de amplificación correspondientes ya sea a Melan-A 26-35 (figura 27A) o tirosinasa 369-377 (figura 27B) , también a 25µg de péptido/dosis . La respuesta inmune fue medida mediante teñido de tetrámero de células T CD8+ en la sangre periférica a dos semanas después de la consumación de la inmunización, utilizando reactivos específicos de Melan-A o tirosinasa. Los resultados en la figura 27 muestran que en tanto que cebado con pSEM produjo una respuesta significativa contra Melan-A, la respuesta contra tirosinasa no fue detectable. En paralelo, los animales inmunizados con péptido solamente no mostraron respuesta de tetrámero detectable ya sea a uno u otro epítopo. Conjuntamente, estos datos demuestran que el epítopo de Melan-A asumió un papel dominante inmune en relación con el epítopo de tirosinasa. Sin embargo, después del refuerzo con tirosinasa ("péptido natural"), la respuesta inmune contra tirosinasa (figura 27B, primer agrupamiento) fue de magnitud similar en comparación con los niveles obtenidos contra Melan-A (figura 27A, los segundos y cuartos agrupamientos), en animales inmunizados con péptido de Melan-A subsecuente al cebado con pSEM. En resumen, la administración intralinfática de péptido de tirosinasa rescató la respuesta inmune iniciada por pSEM contra este epítopo, superando su subdominación en relación con el epítopo de Melan-A en el contexto del vector (pSEM) usado para iniciar la respuesta.

Ejemplo 31. Protocolo para "rescatar" o amplificar una respuesta inmune contra un epítopo subdominante subsecuente al inicio al utilizar un vector multivalente: evaluación de inmunidad citotóxica. La inmunización fue llevada a cabo como se describe en el ejemplo 30: ocho grupos de ratones HHD (n=4) fueron inmunizados vía inyección de nodo intralinfático con pSEM, en los días 0, 3, 14 y 17. La cantidad del plásmido fue de 25 µg/dosis. En los días 28 y 31, los ratones fueron inmunizados con péptidos correspondientes ya sea a epítopos de Melan-A 26-35 (figura 28A) o tirosinasa 369-377 (figura 28B) , administrados a los nodos linfáticos (25 µg de péptido/dosis ) . La inmunidad fue determinada mediante análisis de citotoxicidad 14 días después de la consumación de la inmunización, enseguida de la re-estimulación ex vivo de esplenocitos ya sea con péptido de epítopo de Melan-A o tirosinasa. En breve, los esplenocitos fueron preparados (los bazos cosechados, cortados, sometidos a lisis de célula de sangre ro a) e incubados con pAPC singenico recubierto con peptido de Melan-A (figura 28A) o tirosmasa (figura 28B) LPS-estimulado por 7 días en presencia de rIL-2. Las células fueron lavadas e incubadas a diferentes proporciones con células objetivo 624.38 51Cr-marcadas Melan-A+, tirosinasa+ durante 4 horas. La radioactividad liberada al sobrenadante fue medida utilizando un contador ? (gamma) . La respuesta fue cuantificada como % de lisis = (señal de muestra - fondo) / (señal máxima - fondo) x 100, en donde el fondo representa la radioactividad liberada por las células objetivo solas cuando son incubadas en medio de análisis y la señal máxima es la radioactividad liberada por las células objetivo sometidas a lisis con detergente. Como en el ejemplo 30, los resultados de la figura 28 demuestran el rescate / amplificación de inmunidad mediante el refuerzo de péptido intranodal, contra un epítopo (tirosinasa) que es subdominante en el contexto del vector que inicia la inmunidad (pSEM) .

Ejemplo 32. Protocolo para co-inducir y amplificar respuestas inmune contra dos epítopos - uno dominante y uno subdominante dentro del contexto del vector de inicio - simultáneamente En los dos ejemplos previos el rescate de la respuesta al epítopo subdominante fue demostrado en ausencia de amplificación de la respuesta al epítopo dominante. Enseguida, se intentó la amplificación simultánea de ambas respuestas. En la figura 29, se describe tal protocolo: cuatro grupos de ratones HHD (n=6) fueron inmunizados vía inyección del nodo intralinfático con pSEM, en los días 0, 3, 14 y 17. La cantidad del plásmido fue de 25 µg/dosis. En los días 28 y 31, los ratones fueron inmunizado simultáneamente con péptidos correspondientes a los epítopos de Melan A 26-35 (nodo linfático inguinal izquierdo) y tirosinasa 369-377 (nodo linfático inguinal derecho), a 25 µg de péptido/dosis . La respuesta inmune fue medida mediante teñido de tetrámero de células T CD8+ en la sangre periférica a dos semanas después de la consumación de inmunización, utilizando reactivos específicos de Melan A (figura 30A) o Tirosinasa (11B). Los datos fueron representados como % promedio de tetrámero + células dentro del subconjunto de CD8+. Los animales cebados con el plásmido pSEM y amplificados con análogos de péptido Melan A 26-35 A27Nva {E (Nva) AGIGILTV; SEQ ID NO: 9} (nodo linfático izquierdo) y tirosinasa 369-377 V377Nva (YMDGTMSQ(Nva) ; SEQ ID NO: 10} (nodo linfático derecho) mostraron una respuesta inmune multivalente específica a cada epítopo tal como se mide mediante teñido de tetrámero de multicolores (figura 30C) . Gráficas de puntos fueron recolectadas en el total de células positivas CD8 de sangre periférica y representan respuestas inmunes dobles en ratones individuales. Los niveles de tetrámero fueron calculados como el por ciento de células T CD8 positivas. Los resultados de la figura 30 muestran que mediante la co-administración de los péptidos de Melan A y tirosinasa, se podría co-amplificar la respuesta inmune contra ambos epítopos de Melan A y tirosinasa que tienen una relación dominante / subdominante en el contexto del vector que inicia la inmunización (pSEM) .

Ejemplo 33. Co-inducción y amplificación de respuestas citolíticas contra dos epítopos - uno dominante y uno subdominante - dentro del contexto de vector de inicio utilizando mezclas de péptidos Para explorar adicionalmente formulaciones de período simplificadas, se probó un método alternativo, que integra el uso de un plásmido bivalente que expresa un epítopo dominante y un epítopo subdominante, seguido por amplificación de respuesta a cada epítopo mediante administración de una mezcla de péptidos dominantes y subdominantes, en lugar de la administración separada de péptidos - como se describe en el ejemplo previo. Seis grupos de ratones HHD (n=6) fueron inmunizados como se describe en los ejemplos previos con plásmido de pSEM (o no inmunizados respectivamente) y reforzados con péptidos (como una mezcla entre Melan-A + varios péptidos de tirosinasa), en el nodos linfáticos, a una dosis de 12.5 µg/péptido/dosis, utilizando el siguiente programa: plásmido en los días 0, 3; péptido días 14 y 17 con una repetición de este ciclo dos semanas más tarde. Los péptidos de tirosinasa usados fueron: Tyr 369-377, como antes; Tyr 1-9, que es codificado por el plásmido pero no presentado por las células transformadas; y Tyr 207-215, que es no es codificado por el plásmido. La respuesta inmune fue medida dos semanas después de la consumación del régimen de inmunización, mediante análisis de CFSE, como se describe anteriormente. Brevemente: los esplenocitos fueron aislados de ratones de HHD de control de camada e incubados con 20µg/mL ELA o 20 µg/ml de péptido de tirosinasa por 2 horas. Luego estas células fueron teñidas con fluorescencia de CFSEhi y CFSEmed y co-inyectadas intravenosamente a ratones inmunizados con una proporción igual de esplenocitos de control teñidos con fluorescencia de CFSE10.

Dieciocho horas más tarde los bazos fueron removidos y la eliminación específica de células objetivo fue medida utilizando citometría de flujo y calculando el % de lisis específica in vivo mediante la siguiente fórmula: { [l-(%CFSEhi ° med/ %CFSEls) ] - [1- (%CFSEhi ° raed Control / %CFSE10 Control) ] JxlOO en donde cada término de % en la ecuación representa la proporción de la muestra total representada por cada pico. En general, los resultados mostrados en la figura 31 (% de lisis específica in vivo contra esplenocitos recubiertos con epítopo de Melan-A o tirosinasa; el eje x ilustra los péptidos utilizados para el refuerzo) muestran que la co-amplificación de inmunidad contra los epítopos dominantes (Melan-A) y subdominantes (tirosinasa 369-377) ocurrió utilizando una mezcla de los péptidos en la etapa de amplificación de un régimen de inicio de plásmido / amplificación de péptido. Además, el uso de péptidos solos no dio como resultado una respuesta efectiva. Para esta combinación de péptidos respuestas significativas fueron obtenidas para ambos epítopos. Sin embargo, se debe notar que las esperanzas de éxito de mezclas de péptidos son mayores cuado las afinidades de enlace de MHC de los varios puntos son similares y menor a medida que las afinidades se vuelven más disparatadas .

Ejemplo 34. Inducción de una respuesta con multivalencia de orden superior En este estudio la inmunidad fue inducida con dos plásmidos bivalentes y amplificada con cuatro análogos de epítopo de péptido. El plásmido pSEM fue usado para inducir inmunidad a epítopos de Melan-A y tirosinasa y la respuesta amplificada utilizando los análogos de Melan-A (A27Nva) y tirosinasa (V377Nva) como antes. La inmunidad fue también inducida a los epítopos SSX2 41-49, NY-ESO-1 157-165 utilizando el plásmido pBPL. El polipéptido inmunogénico codificado por pBPL es revelado en la solicitud de patente estadounidense No. 10/292,413 (Pub. No. 20030228634 Al) intitulada EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN incorporado en la presente por referencia en su totalidad. La amplificación utilizó los análogos de epítopo de péptido SSX2 41-49 (A42V) y NY-ESO-1 157-165 (L158Nva, C165V) . Discusión adicional de análogos de epítopo es proporcionada en las solicitudes de análogos de epítopo citadas e incorporadas por referencia anteriormente. Estos análogos tienen en general afinidad superior y estabilidad de enlace a MHC en comparación con la secuencia natural, pero son de reactividad cruzada con TCR que reconoce la secuencia natural. [0215] Tres grupos de ratones HHD-A2 hembra fueron inmunizados con una mezcla de pSEM/pBPL (100 µg cada plásmido/día; 25 µl/nodo inyectado) administrados bilateralmente a los nodos linfáticos inguinales. El grupo 1 (n=10) recibió plásmido solamente, en todo el protocolo, con inyecciones en los días 1, 4, 15, 18, 28, 32, 49 y 53. El grupo 2 y grupo 3 (n=25 cada grupo) recibieron inyecciones de plásmido en los días 1, 4, 15 y 18 y péptidos en los días subsecuentes. En el día 25, la sangre fue recolectada de los animales inmunizados y las células T de CD8+ fueron analizados mediante citometría de flujo utilizando un análisis de MHC-tetrámero. Las respuestas fueron comparadas con ratones de control de camada naturales (n=5) . Los ratones en el grupo 2 fueron reforzados al administrar los péptidos tirosinasa V377Nva (25 µg/día) al nodo linfático derecho y con SSX2 A42V (25 µg/día) al nodo linfático izquierdo en los días 28, 32, 49 y 53. Los animales del grupo 3 fueron reforzados al administrar los péptidos tirosmasa V377Nva (25 µg/día) al nodo linfático derecho y SSX2 A42V (25 µg/día) al nodo linfático izquierdo en los días 28 y 32 seguido por NY-ESO-1 L158Nva, C165V (12.5 µg/día) al nodo linfático derecho y Melan-A A27Nva (25 µg/día) al nodo linfático izquierdo en los días 49 y 53. Todas las inyecciones fueron de 25 µl/nodo inyectado. En los días 39 y 60, la sangre fue recolectada de cada grupo y se efectuó el análisis de célula T CD8+ utilizando un análisis de tetrámero. Las respuestas fueron comparadas con ratones de control de camada naturales (n=5). En los días 41 y 63, animales seleccionados de cada uno grupo fueron sacrificados y los bazos fueron removidos para el análisis de ELISPOT IFN? sobre suspensiones celulares de esplenocito . En el día 62, animales seleccionados de cada grupo recibieron, vía inyección intravenosa, células de melanoma humano 624.38 CFSE-marcadas que expresan todos los cuatro antígenos tumor-asociados y usados como objetivos para CTL SSX2, NY-ESO-1, tirosinasa y Melan A específicas en ratones inmunizados . Los plásmidos fueron formulados en solución reguladora del pH clínica (127 mM NaCl, 2.5 mM Na2HP04, 0.88 mM KH2P04, 0.25 mM Na2EDTA, 0.5% ETOH, en H20; 2 mg/ml cada plásmido, 4 mg/ml total) . Los análogos de Melan-A 26-35 (A27Nva), tirosinasa 369-377 (V377Nva) y SSX2 41-49 (A42V) fueron formulados en PBS a 1.0 mg/ml. El análogo del péptido NY-ESO 157-165 (Ll58Nva, C 165V) fue preparado para inmunización en PBS que contiene DMSO a 5% a una concentración de 0.5 mg/ml. Datos de citometría fueron recolectados utilizando un citómetro de flujo BD FACS Calibur y analizados utilizando elementos de programación de CellQuest mediante clasificación sobre la población de linfocitos. Los PBMC fueron co-teñidos con anticuerpo monoclonal CD8a anti-ratón de rata FITC conjugado (Ly-2) (BD Biosciences, 553031) y un tetrámero de MHC: HLA-A*0201 SSX2 (KASEKIFY (SEQ ID NO: 11)) -PE MHC tetrámero (Beckman Coulter, T02001), HLA-A*0201 NY-ESO (SLLMWITQC) (SEQ ID NO: 12) -APC MHC tetrámero (Beckman Coulter, T02001), HLA-A*0201 Melan-A (ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 1))-PE MHC tetrámero (Beckman Coulter, T02001) o HLA-A*0201 Tirosinasa (YMDGTMSQV (SEQ ID NO: 13)) -APC MHC tetrámero (Beckman Coulter, T02001) . Un análisis de ELISpot de IFN-? fue llevado a cabo como sigue. Los bazos fueron removidos en los días 27 y de animales sometidos a eutanasia y las células mononucleares aisladas mediante centrifugación de densidad (Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs) y resuspendidos en un medio HL-1. Los esplenocitos (5 ó 3 xlO5 células/cavidad) fueron incubados con 10 µg de péptido de Melan-A 26-35 A27L, Tirosinasa 369-377, SSX2 41-49 o NY-ESO-1 157-165 en cavidades por triplicado de cajas de membrana de filtro de 96 cavidades (caja de 96 cavidades de Multiscreen IP, Millipore) . Las muestras fueron incubadas por 42 horas a 37°C con 5% de C02 y 100% de humedad antes del revelado. Anticuerpo de recubierto de IFN-? de ratón fue usado para recubrir los filtros antes de la incubación con esplenocitos y anticuerpo de detección biotmilado fue agregado para revelar la señal después de la lisis y el lavado de las células del filtro con agua (para de IFN-? anticuerpo, Ucytech) . El conjugado de GABA y sustratos patentados de Ucytech fueron usados para el revelado del punto de IFN-?. La respuesta de CTL en animales inmunizados fue medida 24 horas después del revelado y sobre el lector de placa de AID International utilizando elementos de programación de lector de ELISpot versión 3.2.3 calibrada para el análisis de punto de IFN-?. Un análisis de citotoxicidad ín vivo fue llevado a cabo en el día 61 como sigue. Células de tumor de melanoma cultivadas humanas 624.38 (HLA A*0201pos) fueron teñidas con fluorescencia de CFSEhl (equipo trazador de células Vybrant CFDA SE, Molecular Probes) (1.0 µM por 15 minutos) y 624.28 HLA-A2 (HLA A*0201neg) teñido con fluorescencia CFSE10 (0.1 µM por 15 minutos) . Dos ratones de cada grupo (grupo 1, 2 y 3) seleccionados en base a altos niveles de tetrámero y 2 ratones de control naturales recibieron 20xl06 células de melanoma humano CFSEhl-marcadas 624.38 (HLA A*0201pos) mezcladas con un número igual de CFSElo-marcadas 624.28 (HLA A*0201neg) vía inyección intravenosa divididas en dos alícuotas alimentadas 2 horas aparte. La eliminación específica de células objetivo humanas HLA A*0201pos fue medida después de aproximadamente 14 horas al sacrificar los ratones, remover el tejido del pulmón, elaborar una sola suspensión de células y medir la fluorescencia de CFSE mediante citometría de flujo. El por ciento de lisis específica fue calculado como se muestra anteriormente. La respuesta inmune obtenida fue determinada en varios puntos en el protocolo. La figura 32 muestra la respuesta obtenida tal como se juzga mediante análisis de tetrámero 7 días después de la cuarta de las inyecciones de plásmido, que fueron comunes para todos los tres grupos. Respuestas sustanciales fueron observadas para todos excepto el epítopo de tirosinasa. Melan-A 26-35 y NY-ESO-1 157-165 fueron revelados ser epítopos dominantes. Con el fin de generar una respuesta inmune tetravalente más equilibrada, la respuesta a los epítopos subdominantes fue amplificada mediante administración de los análogos de epítopo de péptido de tirosinasa V377Nva y SSX2 A42V a grupos 2 y 3. El grupo 1 recibió otra ronda de inmunización con la mezcla de plásmido. Como se ve en la figura 33 después de la inmunización con los plásmidos (grupo 1) solamente reforzó la respuesta a los epitopos dominantes. En contraste, la administración de peptidos correspondientes a los dos epítopos subdominantes dio como resultado respuestas sustanciales y más equilibradas a todos los cuatro epítopos. La figura 34 muestra la respuesta de animales similares seleccionados que demuestran que una respuesta verdaderamente tetravalente puede ser generada. El análisis de ELISpot de IFN-? de un subconjunto de ratones sacrificados en el día 27 confirmo el patrón general observado de los datos de tetramero (figura 35A) . Otro grupo de ratones fue sacrificado en el día 62 enseguida de una ronda adicional de amplificación que concluyó en el día 59 y sometidos a análisis de ELISpot de IFN-? (figura 35b) . Para el grupo 1 esta ronda final de inmunización otra vez usó la mezcla de plásmidos y el patrón de respuesta siguió siendo similar a aquel observado enseguida de las rondas anteriores. Utilizando solamente aquellos péptidos correspondientes a los epítopos subdominantes (grupo 2) mantuvieron una respuesta relativamente equilibrada a los cuatro epítopos. Los péptidos correspondientes a todos los cuatro epitopos fueron administrados al grupo 3. Un grado de la dominación del epítopo de Melan-A re-surgió a expensas evidentes de la respuesta del epítopo de tirosmasa, aunque todavía se observo una respuesta significativa a aquel epítopo. Se debe notar que debido a que la sensibilidad general de los grupos de animales sacrificados en los dos puntos en el tiempo difirieron, la magnitud absoluta de las respuestas ilustradas en las figuras 35A y B no son directamente comparables. La actividad citolítica in vivo fue también determinada mediante tratamiento con célula de tumor humano CFSE marcadas que expresan todos los cuatro antígenos apuntados. Estas células de tumor fueron un derivado de la línea celular 624.38, que expresa naturalmente SSX2, PRAME, tirosinasa y melan-A, que había sido transformado utilizando un vector de plásmido para expresar establemente NY-EOS-1 también. Como se esperaría en un ratón natural, con solamente niveles de fondo de tetrámero o respuesta de IFN-? mediante análisis de ELISpot, no hay ninguna agotación específica de células de tumor HLA-A2+ en comparación con los controles de HLA-A2* (figura 36A) . Sin embargo en ratones con respuestas sustancialmente tetravalentes se observó agotamiento específico y respuesta más equilibrada obtuvo el mejor resultado. Al comparar las respuestas específicas de epítopo vistas por el tetrámero y análisis de ELISpot para la figura 36B (71% de lisis específica) y 36C (95% lisis específica). Ninguna lisis específica fue también observada para un ratón con una respuesta sustancialmente monovalente. La citotoxicidad in vivo debida a una respuesta monovalente fue vista anteriormente (en el ejemplo 7), pero las células objetivo en aquel experimento tuvieron una expresión de epítopo significativamente mayor. Así, se vio que una respuesta multivalente en la presente supera el efecto protector de niveles de expresión de antígeno objetivo bajos.

Ejemplo 35. Método global para inducir inmunidad multivalente El método puede comprender las siguientes etapas (ilustradas en la figura 37): Identificación de epítopos de diferentes antígenos o el mismo antígeno. Tales epítopos pueden tener una relación de dominación/subdominación (por ejemplo, debido a expresión o presentación a extensiones ampliamente diferentes, polarización de repertorio de TCR, etc.) entre sí pueden ser co-dominantes en su contexto natural. Recuperación de la secuencia asociada con tales epítopos y diseño de vectores de expresión que abarcan dentro del mismo cuadro de lectura o dentro del mismo vector, tales epítopos. El nuevo contexto, puede crear o alterar la relación de dominación/subdominación inmune entre sí en comparación con su contexto natural. La inmunización con el vector, que da como resultado un inicio de respuesta que puede ser dominada por una especificidad (epítopo dominante) en relación con otros. La amplificación de la respuesta a epítopos subdominantes mediante administración de un péptido correspondiente. El péptido puede ser la secuencia natural o ser un análogo de la misma. El péptido puede ser administrado solo o concurrentemente con otros péptidos correspondientes a epítopos dominantes y/o subdominantes, en el mismo sitio o más preferidos en sitios separados. Cualquiera de los métodos descritos en los ejemplos y en cualquier parte en la presente pueden ser y son modificados para incluir diferentes composiciones, antígenos, epítopos, análogos, etc. Por ejemplo, cualquier otro antígeno de cáncer puede ser usado. También, muchos epítopos pueden ser intercambiados y los análogos de epítopo, en los que se incluyen aquellos revelados, descritos o incorporados en la presente pueden ser usados. Los métodos pueden ser usados para generar respuesta inmunes, en las que se incluyen respuestas inmune multivalentes contra varias enfermedades y condiciones. Muchas variaciones y elementos alternativos de la invención han sido revelados. Todavía variaciones y elementos alternativos adicionales serán evidentes para aquel experimentado en el arte. Varias modalidades de la invención pueden incluir o excluir específicamente cualquiera de estas variaciones o elementos. Cada referencia citada en la presente es incorporada en la presente por referencia en su totalidad.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método de inmunización caracterizado porque comprende : administrar a un mamífero una primera composición que comprende un primer inmunógeno, el primer inmunógeno comprende o codifica por lo menos una porción de un primer antígeno y una segunda composición que comprende un segundo inmunógeno, el segundo inmunógeno comprende o codifica por lo menos una porción de un segundo antígeno; y subsecuentemente; administrar una tercera composición que comprende un primer péptido directamente al sistema linfático del mamífero, en donde el primer péptido corresponde a un epítopo del primer antígeno, donde la tercera composición no es la mismo como las primeras o segundas composiciones.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las primeras y segundas composiciones son las mismas.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque una sola macromolécula comprende el primero y segundo inmunógeno.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además administrar, subsecuentemente a la etapa de administración, una cuarta composición que comprende un segundo péptido directamente al sistema linfático del mamífero, en donde el segundo péptido corresponde a un epítopo del segundo antígeno, en donde la cuarta composición no es la misma como las primeras o segundas composiciones .
5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque las terceras y cuartas composiciones comprenden cada una los primeros y segundos péptidos .
6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque las primeras y segundas composiciones son administradas a sitios separados.
7. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque los primeros y segundos péptidos son administrados a sitios separados.
8. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el primer inmunógeno es administrado en el mismo sitio como el primer péptido es administrado.
9. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque los primeros y segundos péptidos son administrados a aproximadamente el mismo tiempo.
10. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque los primeros y segundos péptidos son administrados en días diferentes.
11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer antígeno es seleccionado del grupo que consiste de tirosinasa, Melan-A, SSX-2, NY-ESO-1, PRAME, PSMA, VEGFR2, VEGF-A y PLK1.
12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la administración directamente al sistema linfático comprende administración a un nodo linfático inguinal .
13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la inmunización comprende inducción de una respuesta de CTL.
14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de administración comprende la administración de un péptido epitópico que es el mismo como el primer péptido de la etapa de administración, y en donde la tercera composición difiere de la primera o segunda composición por comprender al menos una dosis más grande del péptido epitópico .
15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de administración comprende administrar un inmunopotenciador.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el inmunopotenciador es administrado con por lo menos una de la primera composición y la segunda composición .
17. Un método de inmunización caracterizado porque comprende : administrar a un mamífero para ocasionar una respuesta inmune a múltiples antígenos; y subsecuentemente administrar uno o más péptidos directamente al sistema linfático del mamífero, en donde cada uno de los péptidos corresponde a un epítopo de uno de los antígenos, en donde una composición usada en la etapa de administración no es la misma como cualquier composición usada en la etapa de administración .
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque los medios ocasionan una respuesta inmune a 3 ó 4 antígenos.
19. Un método de inmunización caracterizado porque comprende : alimentar a un mamífero una o más composiciones que comprenden o que codifican por lo menos una porción de múltiples antígenos; y una etapa subsecuente para amplificar la respuesta a los antígenos.
20. Un método de tratamiento caracterizado porque comprende ciclos repetidos de inmunizaciones de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 1.
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la repetición del ciclo continúa por tiempo suficiente para mantener una respuesta inmune efectiva para obtener una necesidad médica.
22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la repetición del ciclo mejora la multivalencia de una respuesta inmune.
23. Un conjunto de composiciones inmunógenas para inducir una respuesta inmune en un mamífero, caracterizado porque comprende una o más dosis de arrastre para cada uno de 2 o más antígenos y por lo menos una dosis de amplificación, en donde las dosis de arrastre para cada antígeno comprenden un inmunógeno o un ácido nucleico que codifica el inmunógeno, en donde el inmunógeno comprende por lo menos una porción del antígeno; y un inmunopotenciador; y en donde la dosis de amplificación comprende un epítopo de péptido.
24. El conjunto de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque por lo menos una composición es multivalente .
25. El conjunto de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica el inmunógeno comprende además una secuencia inmunoestimuladora que sirve como el agente inmunopotenciador.
26. El conjunto de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el agente inmunopotenciador es seleccionado del grupo que consiste de un ligando de LTR, una secuencia inmunoestimuladora, un ADN que contiene CpG, un dsARN, un ligando de receptor de reconocimiento endocítico-socio (PRR) , un LPS, una saponina quillaja, tucaresol y una citocina pro-inflamatoria.
27. El conjunto de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque las dosis son adaptadas para administración intranodal.
28. El conjunto de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque por lo menos una de las dosis de arrastre comprende un ácido nucleico.
29. El conjunto de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque una dosis de un día de ácido nucleico es de aproximadamente 25- 2500 µg .
30. El conjunto de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la dosis de amplificación es de aproximadamente 5-5000 µg de péptido/Kg del receptor propuesto.