CN101146550A - 用于预防或治疗目的的激发、增强和维持对i类mhc-限制性表位的免疫应答的方法 - Google Patents

用于预防或治疗目的的激发、增强和维持对i类mhc-限制性表位的免疫应答的方法 Download PDF

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Abstract

实施方案涉及用于激发、增强和维持免疫应答的方法和组合物，所述免疫应答优选多价应答，优选针对I类MHC－限制性表位的应答。该方法和组合物可用于预防或治疗目的。

Description

用于预防或治疗目的的激发、增强和维持对I类MHC-限制性表位的免疫应答的方法
对相关申请的交叉参考
根据35U.S.C.[章节]119(e)，本申请要求美国临时申请No.60/640,402的优先权，其在2004年12月29日提交，标题为“METHODS TOELICIT，ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHCCLASS I-RESTRICTED EPITOPES，FOR PROPHYLACTIC ORTHERAPEUTIC PURPOSES”；其公开内容在此全部引入作为参考。
发明背景
发明领域
在此公开的本发明的实施方案涉及用于在致病过程中诱导I类MHC-限制性免疫应答和调节应答的性质和强度，提高有效的免疫干预的方法和组合物。更详细地，实施方案涉及免疫原组合物，其性质和有效利用其的顺序、时间和施用途径。
相关技术的描述
主要组织相容性复合物和T细胞目标识别
T淋巴细胞(T细胞)为应答特异性抗原信号而起作用的抗原-特异性免疫细胞。B淋巴细胞和其产生的抗体也是抗原-特异性实体。然而，不同于B淋巴细胞，T细胞对游离或溶解形式的抗原不应答。对于T细胞应答抗原，其需要抗原结合至称为主要组织相容性复合物(MHC)的呈递复合物。
MHC蛋白提供T细胞区分天然或“自体”细胞与外源细胞的方法。MHC分子为免疫受体类，其呈递随后由T细胞监测的潜在的肽表位。存在两种类型的MHC，I类MHC和II类MHC。CD4+T细胞与II类MHC蛋白相互作用并且主要具有辅助表型而CD8+T细胞与I类MHC蛋白相互作用并且主要具有细胞溶解表型，但其每种还可以呈现调节的，尤其是抑制的作用。MHC均为跨膜蛋白质，其大部分结构在细胞外表面。此外，两类MHC在其外部都具有肽结合性狭缝。内源或外源蛋白质的小片段结合在该狭缝中并呈递于胞外环境中。
称作抗原呈递细胞(APCs)的细胞利用MHC将抗原展示给T细胞。如果抗原呈现在MHC上，T细胞可识别抗原。这种需要称为MHC限制。如果抗原不能通过可识别的MHC呈递，T细胞就不会识别并作用于该抗原信号。对结合于可识别MHC的肽特异的T细胞，结合这些MHC-肽复合物并且进入免疫应答的下一阶段。
对应于指名的MHCI类或II类限制性表位的肽在最简单的抗原形式中，其可用于诱导、增强或者操纵T细胞应答而递送。尽管已证明肽表位在体外对再刺激体内主要的T细胞系、克隆或T细胞杂交瘤是有效的，其体内效力非常有限。此归因于两个主要因素：
(1)差的肽药物代谢动力学(PK)模式，由快速的肾清除和/或体内降解引起，导致到达APC受限；
(2)仅仅抗原-诱导的T细胞受体(TCR)-依赖的信号传导(信号1)不足以诱导或扩大强的并且持续的免疫应答，以及尤其是由Tc1或Th1细胞(产生IFN-γ和TNF-α)组成的应答。此外，除非结合利用某些免疫加强或调节佐剂外，利用大剂量肽或贮存佐剂以规避与肽有关的有限PK可引发不同程度的无反应或“免疫偏离”。
发明概述
本发明的实施方案包括用于调节并且尤其用于诱导、引发和/或增强对I类MHC限制性表位免疫应答的方法和组合物。
一些实施方案涉及免疫方法。该方法可包括例如，将包括免疫原的第一组合物递送至哺乳动物，该免疫原可包括或编码第一抗原的至少一部分；和将可包括增强肽的第二组合物直接给予哺乳动物的淋巴系统，其中该肽与所述第一抗原的表位对应，其中第一组合物和第二组合物不相同。该方法可进一步包括获得、分析或检测效应T细胞应答的步骤。
第一组合物可包括编码抗原或其免疫原性片段的核酸。第一组合物可包括能在pAPC中表达表位的核酸。核酸可作为原生动物、细菌、病毒或病毒载体的组分而递送。第一组合物可例如包括免疫原性多肽和免疫增强剂。免疫增强剂可以是细胞因子、toll样受体配体等等。佐剂可包括免疫刺激序列、RNA等等。
免疫原性多肽可以是增强肽。免疫原性多肽可以是第一抗原。免疫原性多肽可作为原生动物、细菌、病毒、病毒载体或病毒样颗粒等等的组分而递送。佐剂可作为原生动物、细菌、病毒、病毒载体或病毒样颗粒等等的组分而递送。第二组合物可以是无佐剂的和无免疫增强剂的。递送步骤可包括直接施用于哺乳动物的淋巴系统。直接施用于哺乳动物的淋巴系统可包括直接施用于淋巴结或淋巴管。直接施用可以至两种或多种淋巴结或淋巴管。淋巴结可以是例如腹股沟、腋窝、子宫颈和扁桃体淋巴结。效应T细胞应答可以是细胞毒性T细胞应答。效应T细胞应答可包括促炎症细胞因子的产生，并且该细胞因子可以是例如，(gamma)γ-IFN或TNFα(alpha)。效应T细胞应答可包括T细胞趋化因子的产生，例如RANTES或MIP-1α等等。
表位例如可以是持家表位或免疫表位。递送步骤或施用步骤例如可包括单一的弹丸注射(bolus injection)，重复的弹丸注射。递送步骤或施用步骤可包括连续的输注，其例如可具有约8至约7天之间的持续期间。该方法可包括递送步骤终止和施用步骤开始之间的时间间隔，其中该时间间隔可以是至少约7天。并且，该时间间隔例如可以在约7和约14天、约17天、约20天、约25天、约30天、约40天、约50天或约60天之间。该时间间隔可超过约75天、约80天、约90天、约100天或更多。
第一抗原可以是疾病-相关抗原，并且该疾病-相关抗原可以是肿瘤-相关抗原、病原体-相关抗原。实施方案包括利用所述的免疫方法治疗疾病的方法。第一抗原可以是靶-相关抗原。靶可以是肿瘤细胞、病原体一感染的细胞等等。例如，任何肿瘤细胞可以被靶向。比如，病原体-感染的细胞例如可包括由细菌、病毒、原生动物、真菌等等感染的细胞或例如由朊病毒感染的细胞。
效应T细胞应答可通过至少一种指示物而检测，例如细胞因子测定、Elispot测定、细胞毒性测定、四聚体测定、DTH-应答、临床应答、肿瘤收缩、肿瘤清除、肿瘤发展的抑制、降低的病原体滴度、病原体清除、病征改善等等。该方法可进一步包括获得、检测或分析对第一抗原的效应T细胞应答。
另外的实施方案涉及免疫方法，其包括将包括编码第一抗原或其免疫原性片段的核酸的
第一组合物递送至哺乳动物；将包括肽的第二组合物直接施用于哺乳动物的淋巴系统，其中该肽与第一抗原的表位相对应。该方法可进一步包括获得、检测或分析对该抗原的效应T细胞应答。
此外，实施方案涉及增强现有抗原-特异性免疫应答的方法。该方法可包括将包括肽的组合物直接施用于哺乳动物的淋巴系统，其中该肽与抗原的表位对应，并且其中该组合物不用于诱导免疫应答。该方法可进一步包括获得、检测或分析抗原-特异性免疫应答的增强。该增强可包括随着时间维持应答、复活休眠的T细胞、扩大抗原-特异性T细胞群等等。一些方面中，该组合物不包括免疫增强剂。
其它的实施方案涉及免疫方法，其可包括将包括免疫原的第一组合物递送至哺乳动物，该免疫原可包括或编码第一抗原的至少一部分以及第二抗原的至少一部分；将包括第一肽的第二组合物以及包括第二肽的第三组合物直接施用于哺乳动物的淋巴系统，其中第一肽与第一抗原的表位对应，并且其中第二肽与第二抗原的表位对应，其中第一组合物可不与第二或第三组合物相同。该方法可进一步包括获得、检测或分析对第一以及第二抗原的效应T细胞应答。第二和第三组合物每种可包括第一和第二肽。第二和第三组合物可以是单一组合物的一部分。
更进一步的实施方案涉及产生抗原-特异性致耐受性或调节免疫应答的方法。该方法可包括周期性地将包括无佐剂肽的组合物直接施用于哺乳动物的淋巴系统，其中该肽与抗原的表位对应，并且其中该哺乳动物对于该表位是首次用于实验的。该方法可进一步包括获得、检测和分析致耐受性或调节T细胞免疫应答。该免疫应答例如可有助于治疗炎症病症。该炎症病症例如可以来自II类MHC-限制性免疫应答。免疫应答可包括免疫抑制细胞因子，例如IL-5、IL-10或TGB-β等等的产生。
实施方案涉及免疫方法，其包括将一系列免疫原性剂量直接施用于哺乳动物的淋巴系统中，其中该系列可包括至少1种引发(entraining)剂量和至少1种增强剂量，并且其中该引发剂量可包括编码免疫原的核酸以及其中该增强剂量可无任何病毒、病毒载体或可复制型载体。该方法可进一步包括获得抗原-特异性免疫应答。该方法例如可包括1至6种或更多的引发剂量。该方法可包括施用多个引发剂量，其中该剂量1至约7天的时程施用。引发剂量、增强剂量、或引发和增强剂量可以多对注射递送，其中对的第一成员可在对的第二成员的约4天内施用，并且其中不同对的第一成员之间的时间间隔可以是至少约14天。例如，最后的引发剂量和第一次增强剂量之间的时间间隔可以在约7和约100天之间。
其它的实施方案涉及用于诱导哺乳动物中免疫应答的免疫原组合物组，包括1至6种或更多引发剂量和至少一种增强剂量，其中引发剂量可包括编码免疫原的核酸，并且其中增强剂量可包括肽表位，以及其中该表位可通过表达核酸的pAPC呈递或是可呈递的。一种剂量可进一步包括佐剂，例如RNA。引发和增强剂量可在适于直接施用于淋巴系统、淋巴结等等的载体中。核酸可以是质粒。表位可以是I类HLA表位，例如表1-4中所列的一种。HLA优选可以是HLA-A2。免疫原可包括表位阵列，其阵列可包括释放序列。免疫原可基本上由靶-相关抗原组成。靶-相关抗原可以是肿瘤-相关抗原、微生物抗原、任何其它的抗原等等。免疫原可包括靶-相关抗原的片段，其可包括表位簇。
另外的实施方案可包括用于诱导哺乳动物中I类MHC-限制性免疫应答的免疫原组合物组，包括1-6种引发剂量和至少一种增强剂量，其中引发剂量可包括免疫原或编码免疫原的核酸以及免疫增强剂，并且其中增强剂量可包括肽表位，其中该表位可通过pAPC呈递。编码免疫原的核酸可进一步包括免疫刺激序列，其能够作为免疫增强剂起作用。免疫原可以是病毒或可复制型载体，其可包括或可诱导免疫增强剂。免疫原可以是细菌、细菌裂解物或纯化的细胞壁组分。此外，细菌细胞壁组分能够作为免疫增强剂而起作用。免疫增强剂例如可以是TLR配体、免疫刺激序列、含CpG的DNA、dsRNA、内吞-模式识别受体(PRR)配体、LPS、皂树皂苷、苯甲酸衍生物(tucaresol)、促炎症细胞因子等等。在用于促进多价应答的一些优选实施方案中，用于每次施用，该组可包括对应于各个单个抗原或抗原组合的多个引发剂量和/或多个增强剂量。多个引发剂量可作为单一组合物的一部分或一种以上组合物的一部分而施用。增强剂量例如可以不同的时间施用和/或给至一个以上部位。
其它的实施方案涉及产生各种细胞因子模式的方法。本发明的一些实施方案中，肽的结内(intranodal)施用对于增强最初用质粒DNA疫苗诱导的应答可以是有效的。此外，细胞因子模式可以是不同的，因质粒DNA诱导/肽扩增通常比DNA/DNA或肽/肽方案产生更多的趋化因子(化学引诱物细胞因子)和更少的免疫抑制细胞因子产生。
各种实施方案中所用的增强肽与免疫抗原的表位对应。一些实施方案中，对应可包括如实地重复天然的表位序列。一些实施方案中，对应可包括对应序列可以是天然序列的类似物，其中一个或多个氨基酸已被改变或代替，或表位的长度已改变。所述类似物可保留表位的免疫功能(即，其功能类似)。优选实施方案中，与天然的序列相比类似物具有与一种或多种I类MHC分子类似的或提高的结合。其它的优选实施方案中与天然的序列相比类似物具有类似的或提高的免疫原性。用于制备类似物的策略是本领域广泛所知的。所述策略例示性的论述可在2002年4月4日提交的美国专利申请号10/117,937(公开号2003-0220239 A1)；以及2003年9月5日提交的10/657,022(公开号20040180354)，两者题为表位序列；和2004年6月17日提交的美国临时专利申请号60/581,001以及2005年6月17日提交的美国专利申请号11/156,253(公开号No.No._)，两者题为SSX-2肽类似物；和2005年6月17日提交的美国临时专利申请号60/580,962和美国专利申请号11/155，929(公开号No._)，两者题为NY-ESO肽类似物中找到；每篇在此整体引入作为参考。
更进一步的实施方案涉及肽在用于引发-和-增强免疫方案中的无佐剂药物制备中的用途。如此处所述的，组合物、试剂盒、免疫原和化合物可用于用于各种疾病治疗的药物中，以增强免疫应答，以产生特定的细胞因子模式等等。实施方案涉及无佐剂肽在增强免疫应答的方法中的用途。
实施方案涉及与表位有关的方法、用途、疗法和组合物，该表位具有MHC特异性，例如包括列于表1-4中的那些。其它的实施方案包括列于表1-4中的一种或多种MHC，包括相同物的组合，而其它的实施方案明确排除任何一种或多种MHC或其组合。表3-4包括所列HLA抗原的频率。
一些实施方案涉及产生免疫应答的方法。该方法可包括将第一组合物(组合物1)递送至哺乳动物，其可包括包括或编码第一抗原(抗原A)的至少一部分和第二抗原(抗原B)至少一部分的免疫原；以及将可包括第一肽(肽A)的第二组合物(组合物2)，和可包括第二肽(肽B)的第三组合物(组合物3)直接施用于哺乳动物的淋巴系统，其中肽A与抗原A的表位对应，并且其中肽B与抗原B的表位对应，其中组合物1与组合物2或组合物3不同。该方法可进一步包括获得对一种或两种抗原的效应T细胞应答。
一些方面中组合物2和组合物3每种可包括肽A和肽B。肽A和B例如可给至分开的部位或相同的部位，包括在不同时期。组合物1可包括编码抗原A和抗原B或其部分的核酸分子。此外，组合物1例如可包括两种核酸分子，一种编码抗原A或其部分，一种编码抗原B或其部分。
第一和第二抗原可以是任何抗原。优选，第一和第二抗原为黑色素瘤抗原、CT抗原、癌-相关抗原、CT抗原和基质抗原、CT抗原和新生血管抗原、CT抗原和分化抗原、癌-相关抗原和基质抗原等等。各种抗原组合提供于2004年6月17日提交的美国申请号10/871,708(公开号20050118186)，题为用于各种类型癌症的组合物中肿瘤-相关抗原的组合；和2004年12月29日提交的美国临时申请号60/640,598和与本申请同时提交的美国申请No._/_，_(公开号_)(代理卷号MANNK.049A)中，两者也题为用于各种类型癌症的组合物中肿瘤-相关抗原的组合，每篇在此整体引入作为参考。优选包括抗原A或B的抗原可以是SSX-2、Melan-A、酪氨酸酶、PSMA、PRAME、NY-ESO-1等等。许多其它的抗原为本领域普通技术人员所知。应该理解的是在这个和其它的实施方案中可使用两种以上组合物、免疫原、抗原、表位和/或肽。例如可利用上述任何一种或多种的三种、四种、五种或更多。
其它的实施方案涉及产生免疫应答的方法，其可包括例如，将包括免疫原(免疫原1)的第一组合物(组合物1)和包括第二免疫原(免疫原2)的第二组合物(组合物2)递送至哺乳动物，所述免疫原1可包括或编码第一抗原(抗原A)的至少一部分，所述免疫原2可包括或编码第二抗原(抗原B)的至少一部分；以及将包括第一肽(肽A)的第三组合物(组合物3)和包括第二肽(肽B)的第四组合物(组合物4)直接施用于哺乳动物的淋巴系统，其中肽A与抗原A的表位对应，并且其中肽B与抗原B的表位对应，其中组合物1与组合物2或组合物3不同。
例如，在一些方面中组合物2与组合物3不同。组合物1和组合物3例如可递送至相同的部位，该部位可以是腹股沟淋巴结。此外，组合物2和4例如可递送至与组合物1和3不同的部位，递送至另外的腹股沟淋巴结。
更进一步的实施方案涉及产生免疫应答的方法，其可包括例如将包括产生对第一抗原和第二抗原免疫应答的方式的第一组合物递送至哺乳动物；以及将包括第一肽的第二组合物和包括第二肽的第三组合物直接施用于哺乳动物的淋巴系统，其中第一肽与第一抗原的表位对应，并且其中第二肽与第二抗原的表位对应，其中第一组合物不与第二种或第三组合物相同。引导免疫应答的方法可例如包括用于表达抗原或其部分的方法。
此外，一些实施方案涉及免疫方法，其例如可包括将包括免疫原的第一组合物递送至哺乳动物，免疫原可包括或编码第一抗原的至少一部分和第二抗原的至少一部分；以及用于增强对该抗原应答的步骤。优选，用于增强对该抗原应答的步骤可包括将与第一抗原的至少一部分对应的第一肽施用于二级淋巴器官以及将与第二抗原的至少一部分对应的第二肽施用于不同的二级淋巴器官。
附图简述
图1A-C：免疫应答通过淋巴管内免疫的诱导
图2描述了用于通过抗原的靶向(淋巴结)递送控制或操纵对I类MHC-限制性表位免疫的方案的实施例。
图3表示对应于图4中所述数据的代表性孔的可视透视图。
图4描述了通过ELISPOT测量的应用图2中所述方案产生的免疫应答的强度，并且表示为识别该肽的产生IFN-γ(gamma)的T细胞数目(频率)
图5显示了如图2中所述的，通过抗原的靶向递送产生的T细胞的细胞毒特征。
图6描述了通过图2中所述的方案产生的I类MHC-限制性T细胞的交叉反应性。
图7A显示了免疫特征，表示为在应用图2中所述的免疫方案后淋巴细胞产生三种类别生物应答调节物(促炎症细胞因子、趋化因子或化学引诱剂和免疫调节或抑制细胞因子)的成员的能力。
图7B显示了通过图2中所述免疫方案产生的T细胞经流式细胞术的细胞表面标记物表型。肽重复施用于淋巴结诱导免疫偏离和调节T细胞。
图8A和B显示了在用DNA、肽或DNA和肽的产生/增强序列免疫的小鼠中通过四聚体测量的特异性T细胞的频率。
图8C显示了在用DNA(“pSEM”)、肽(“ELA”＝ELAGIGILTV(SEQ IDNO：1))或DNA和肽的产生/增强序列免疫的小鼠的各种淋巴和非-淋巴器官中体内存在的特定的细胞毒性。
图9A显示了随着肽加强(boost)后的回忆应答，在用肽免疫并且用肽增强免疫的动物中循环的四聚体染色T细胞的存留/衰减。
图9B显示了随着肽加强后的回忆应答，在用DNA引发并且用肽增强的动物中循环的四聚体染色T细胞的存留/衰减。
图9C显示了随着肽加强后的回忆应答，在用DNA免疫并且用DNA增强的动物中循环的四聚体染色T细胞的存留/衰减。
图10A显示了抗原-特异性CD8+T细胞利用不同的两-周期免疫方案的扩展。
图10B显示了抗原-特异性CD8+T细胞利用不同的三-周期免疫方案的扩展。
图10C显示了在利用不同的方案引发并且用肽增强的动物中，通过四聚体染色检测的循环的抗原-特异性T细胞的扩展。
图10D显示了在淋巴和非-淋巴器官中，在不同的免疫方案之后并且通过四聚体染色检测的抗原-特异性T细胞的扩展。
图11A显示了用质粒DNA和肽免疫小鼠的计划表的实施例
图11B显示了通过ELISPOT分析测定的由不同的免疫方案(以各自的或反向顺序变换DNA和肽)引发的免疫应答。
图12A显示了抗原靶细胞在用质粒和肽免疫的小鼠血液和淋巴结中的体内消耗。
图12B显示了抗原靶细胞在用质粒和肽免疫的小鼠脾脏和肺中的体内消耗。
图12C显示了12A、B中呈现的结果的总结。
图12D显示了在通过不同的方案免疫的小鼠中特异性T细胞的频率和抗原靶细胞的体内清除之间的相关性。
图13A显示了用质粒DNA和肽免疫小鼠的计划表，以及在那些小鼠中进行的测量的性质。
图13B描述了与用于确定在免疫的小鼠中人肿瘤细胞体内清除的方案有关的计划表。
图13C显示了抗原靶细胞(人肿瘤细胞)在用质粒和肽免疫的小鼠肺中的体内消耗。
图14A显示了用于产生14B中所示抗SSX-2应答的免疫方案。
图14B显示了在应用DNA引发/肽增强方案之后通过四聚体染色检测的循环SSX-2特异性T细胞的扩展。
图15A显示在经受不同的引发-和-增强方案以同时对Melan A(ELAGIGILTV(SEQ ID NO：1))和SSX2(KASEKIFYV(SEQ ID NO：2))的表位免疫的小鼠的脾脏中抗原靶细胞的体内清除。
图15B显示在经受不同的引发-和-增强方案以同时对Melan A(ELAGIGILTV(SEQ ID NO：1))和SSX2(KASEKIFYV(SEQ ID NO：2))的表位免疫的小鼠血液中抗原靶细胞的体内清除。
图15C总结了图15A、B中详细显示的结果。
图16显示了在经受两轮不同的引发-和-增强方案的小鼠中，由四聚体染色测定的循环抗原-特异性CD8+T细胞的扩展。
图17A和B显示了在经受由DNA/DNA/肽(A)或DNA/肽/肽(B)组成的两轮引发-和-增强方案的动物中循环抗原-特异性T细胞的存留。
图18显示了经受由DNA/DNA/DNA组成的两轮引发-和-增强方案的动物中的长时记忆。
图19显示了用DNA/肽引发-和-增强方案患者的参与和治疗的临床实践图解。
图20描述了利用两种质粒：表达SSX2 41-49的pCBP和表达Melan A26-35(A27L)的pSEM的免疫计划表。
图21显示了通过两种质粒作为混合物施用对比分别施用至单独的部位而诱导的特异性细胞毒性。
图22描述了添加肽加强免疫步骤至图20中所述的免疫方案。
图23呈现了表明即使在载体和肽分别用作混合物时肽加强免疫挽救次优势表位免疫原性的数据。
图24A和B描述了在临床实践中诱导强的、多价应答的替代免疫方案。
图25描述了能引起多价应答的质粒。
图26呈现了用多价质粒起始免疫应答以及通过肽的结内施用而挽救对次优势表位应答的方案。
图27A显示了通过用多价质粒起始以及通过肽的结内施用而增强对优势(Melan-A)表位应答而获得的特异性T细胞的频率。
图27B显示了通过用多价质粒起始以及通过肽的结内施用而增强对次优势表位(酪氨酸酶369-377)应答而获得的特异性T细胞的频率。
图28A显示了通过用多价质粒起始以及通过肽的结内施用而增强对优势(Melan-A)表位应答而获得的特异性细胞毒性。
图28B显示了通过用多价质粒起始以及通过肽的结内施用而增强对次优势表位(酪氨酸酶369-377)应答而获得的特异性细胞毒性。
图29描述了用多价质粒起始并且同时增强对优势和次优势表位应答的免疫方案。
图30A显示了通过用多价质粒起始以及通过肽的结内施用而增强对优势(Melan-A)表位和次优势(酪氨酸酶)表位应答而获得的Melan-A特异性T细胞的频率。
图30B显示了通过用多价质粒起始以及通过肽的结内施用而增强对优势(Melan-A)表位和次优势(酪氨酸酶)表位应答而获得的酪氨酸酶特异性T细胞的频率。
图30C显示了在用pSEM起始并且用Melan-A和酪氨酸酶肽二者增强的小鼠中Melan-A和酪氨酸酶特异性T细胞的频率。显示来自两个个体小鼠的结果。
图31显示通过多价质粒后肽的结内施用而共-起始和增强的T细胞的体内细胞毒性数据，该肽对应于作为混合物的优势(Melan A 26-35)和次优势(酪氨酸酶369-377)表位。
图32：增强之前pSEM/pBPL免疫动物的双多色四聚体分析。
图33：用质粒pSEM和pBPL的混合物诱导并且用SSX2和酪氨酸酶肽表位类似物增强的小鼠免疫应答的双多色四聚体分析。
图34：用质粒pSEM和pBPL的混合物诱导并且用SSX2和酪氨酸酶肽表位类似物增强的3只小鼠免疫应答的双多色四聚体分析。
图35A：第一轮增强后的IFN-γELISpot分析
图35B：第二轮增强后的IFN-γELISpot分析
图36：用表达全部四种肿瘤相关抗原的人黑色素瘤肿瘤细胞的CFSE体内激发。版A-D每个显示四聚体分析，IFN-γELISpot分析，并且该方案完成后的体内肿瘤细胞杀死个体小鼠。版A显示来自纯对照小鼠的数据，版B-C显示分别来自获得实质上四价免疫的组3和2的两个小鼠的数据，并且版D显示来自组3小鼠的数据，其免疫基本上是单价的。
图37描述了诱导多价免疫的通用方法。
优选实施方案的详述
本发明的实施方案提供例如用于产生对靶细胞特异性的免疫细胞，用于引导对靶细胞有效的免疫应答，或用于影响/治疗炎症病症的方法和组合物。所述方法和组合物可包括例如，如疫苗和治疗剂(therapeutics)的免疫原组合物以及预防和治疗方法。在此公开的为新的和意想不到的发现，即通过选择抗原形式，施用其的顺序和时间，以及将抗原直接递送进入二级淋巴器官，不仅可控制免疫应答的强度还可控制其定性性质。
一些优选实施方案涉及用于引发和增强T细胞应答的组合物和方法。例如所述方法可包括其中将包括编码免疫原的核酸的组合物递送至动物的引发步骤。组合物可递送至动物的不同部位，但优选递送至淋巴系统，例如淋巴结。引发步骤可包括组合物的一次或多次递送，例如在一个时期内散布或在一个时期内以连续的方式散布。优选，该方法可进一步包括包括施用含肽免疫原的组合物的增强步骤。增强步骤可一次或多次进行，例如在一个时期的时间间隔内以一个丸剂进行或一个时期内连续进行。虽然不是所有实施方案中都需要，一些实施方案可包括包括免疫增强剂或佐剂的组合物的使用。
下列申请的每篇公开内容，包括所有方法、图和组合物在此整体引入作为参考：2003年6月17日提交的美国临时申请号60/479,393，题为控制I类MHC-限制性免疫应答的方法；2004年6月17日提交的美国申请号10/871，707(公开号20050079152)，2004年12月29日提交的美国临时申请号60/640，402和与本申请同时提交的美国申请No._/_，_(公开号)(代理卷号MANNK.047A)，所有这三篇题为“在用于预防或治疗目的的激发、增强和维持对I类MHC-限制性表位免疫应答的方法”；2004年6月17日提交的美国申请No.10/871,708(公开号20050118186)，题为“用于各种类型癌症的组合物中肿瘤-相关抗原的组合”；和2004年12月29日提交的临时申请No.60/640,598，和与本申请同时提交的美国专利申请No._/_，_(公开号)，(代理卷号No.MANNK.049A)，两者题为“在用于各种类型癌症的组合物中肿瘤-相关抗原的组合”，每篇整体引入作为参考。此外，下列申请包括可与本发明的方法和组合物一起使用的方法和组合物。质粒和质粒设计原理在美国专利申请号10/292,413(公开号20030228634 A1)，题为“编码靶相关抗原表位的表达载体和其设计方法”中公开，其在此整体引入作为参考；另外的方法、组合物、肽和肽类似物在以下文献中公开：2004年6月17日提交的美国临时申请号60/581,001，美国申请号11/156,253(公开号_)，题为“SSX-2肽类似物”；每篇在此整体引入作为参考；2004年6月17日提交的美国临时申请号60/580,962，2005年6月17日提交的美国申请号11/155,929(公开号_)，题为“NY-ESO肽类似物”；每篇在此整体引入作为参考；以及2002年4月4日提交的美国申请号10/117,937(公开号20030220239)和2003年9月5日提交的10/657,022(公开号20040180354)，两者题为“表位序列”，每篇在此整体引入作为参考。
在一些实施方案中，取决于免疫原的性质以及其遇到的环境，激发的免疫应答其具体的活性和组成可不同。尤其，虽然用肽免疫可产生细胞毒/溶细胞T细胞(CTL)应答，用另外的注射进一步增强该应答的尝试反而可引起调节T细胞群体的扩展以及可见的CTL活性的减低。因此给予淋巴结内细胞表面上高MHC/肽浓度的组合物，无另外的免疫增强活性，可用于有目的地提高调节或致耐受性的应答。相反提供丰富的免疫强化作用信号(例如toll样受体配体[或它们将诱导的细胞因子/自分泌因子])的免疫原组合物，即使仅提供有限抗原，不仅诱导应答，而且同样引发其，以使随后与丰富的抗原(例如，注射的肽)的遭遇在不改变观察到的活性性质下增强应答。因此，一些实施方案涉及控制免疫应答模式，例如获得的应答种类和产生的细胞因子种类。例如，一些实施方案涉及用于促进CTL扩展或进一步扩展的方法和组合物，并且有涉及用于促进优先于CTL的调节细胞扩展的方法和组合物的实施方案。
公开的方法比仅使用肽或不遵循引发-和-增强方法的许多方案有利。如以上所述，许多基于肽的免疫方案和基于载体的方案有缺陷。然而，如果成功，基于肽的免疫或免疫增强策略比其它的方法，尤其例如某些微生物载体有优势。这应归于这样的事实，即更复杂的载体，如活的减毒病毒或细菌载体例如，在体内复制或重组时可诱导有害副作用；或在重复施用时由于产生针对该载体本身的中和抗体而变得无效。另外，当利用这样的方法成为强的免疫原时，肽可绕过对蛋白酶体-介导的过程的需求(如对于蛋白质或更复杂的抗原，在“交叉加工”的环境中或在细胞感染后)。那是因为对I类MHC限制性呈递的细胞抗原加工是固有地选择优势(有利的)表位而不是次优势表位，可能干涉对应于有效靶标表位免疫原性的现象。最后，有效的基于肽的免疫简化和缩短了免疫疗法的开发过程。
因此，有效的基于肽的免疫增强方法，尤其包括本文所述的那些，非常利于免疫疗法(诸如用于癌症和慢性感染的)或预防接种(针对某些传染病的)。通过避免同时使用麻烦的、不安全的或复杂的佐剂技术可获得另外的益处，虽然所述技术可在本文所述的不同实施方案中使用。
定义：
除非另外从使用这里的术语的上下文中清楚得知，对于本说明书来说下面列出的术语应该通常具有指明的含义。
专职抗原呈递细胞(pAPC)-具有T细胞共刺激分子并能够诱导T细胞应答的细胞。完全表征的pAPCs包括树突细胞、B细胞和巨噬细胞。
周围细胞-不是pAPC的细胞。
持家蛋白酶体-通常在周围细胞中活跃的蛋白酶体，通常在pAPCs中不存在或没有强活性。
免疫蛋白酶体-通常在pAPCs中活跃的蛋白酶体；免疫蛋白酶体在感染组织的一些周围细胞中或在暴露于干扰素后也是活跃的。
表位-能够刺激免疫应答的分子或物质。在优选的实施方案中，按照该定义的表位包括但不一定限于多肽和编码多肽的核酸，其中所述多肽能够刺激免疫应答。在其它优选的实施方案中，按照该定义的表位包括但不一定限于呈递于细胞表面的肽，所述肽非共价地与I类MHC的结合狭缝结合，使得其可以与T细胞受体(TCR)相互作用。通过I类MHC呈递的表位可以是未成熟的或成熟的形式。“成熟的”指区别于任何前体(“未成熟的”)的MHC表位，其可包括持家表位或基本上由其组成，还包括通过加工除去的初始翻译产物中的其它序列，所述加工包括但不限于单独或任何组合的，蛋白酶体酶切消化、N-末端修整或外源酶促活性的作用。因此，成熟的表位可嵌入在有些更长的多肽中而提供，其免疫潜力至少部分取决于嵌入的表位；同样地，成熟的表位可以其最终的形式提供，其可结合于TCR识别的MHC结合狭缝中。
MHC表位-对哺乳动物I类或II类主要组织相容性复合物(MHC)分子具有已知或预期的结合亲和力的多肽。一些尤其充分表征的I类MHC分子存在于表1-4中。
持家表位-在优选的实施方案中，将持家表位定义为多肽片段，其是MHC表位，并且展示在其中持家蛋白酶体活性突出的细胞上。在另一个优选实施方案中，将持家表位定义为含有按照前述定义的持家表位的多肽，其两侧具有一个至几个另外的氨基酸。在另一个优选实施方案中，将持家表位定义为编码按照前述定义的持家表位的核酸。例示性的持家表位提供于2002年4月4日提交的美国专利申请号10/117,937(公开号20030220239 A1)，2005年2月25日提交的11/067,159(公开号2005-0221440 A1)，2005年2月25日提交的11/067,064(公开号2005-0142144 A1)以及2003年9月5日提交的10/657,022(公开号2004-0180354 A1)，以及2003年9月5日提交的PCT申请号PCT/US2003/027706(公开号WO 2004/022709 A2)；以及2001年4月6日提交的美国临时申请号60/282,211；2001年11月7日提交的60/337,017；2002年3月7日提交的60/363,210和2002年9月6日提交的60/409,123中。所列申请的每篇题为表位序列。本段落中提及的每篇申请在此整体引入作为参考。
免疫表位-在优选实施方案中，将免疫表位定义为多肽片段，其是MHC表位，并且展示在其中免疫蛋白酶体活性突出的细胞上。在另一个优选实施方案中，将免疫表位定义为含有按照前述定义的免疫表位的多肽，其两侧具有一个至几个另外的氨基酸。在另一个优选实施方案中，将免疫表位定义为包括表位簇序列，含有至少两种对I类MHC具有已知或预期亲和力的多肽序列的多肽。在又一个优选实施方案中，将免疫表位定义为编码按照上述定义中任何一种的免疫表位的核酸。
靶细胞-在优选实施方案中，靶细胞为与致病情况有关的细胞，其可被免疫系统的组分作用，例如感染病毒或其它细胞内寄生物的细胞或肿瘤细胞。在另一实施方案中，靶细胞为被本发明的疫苗和方法靶向的细胞。根据该定义的靶细胞的实例包括但不一定限于：肿瘤细胞和具有细胞内寄生物的细胞，诸如，例如病毒、细菌或原生动物。靶细胞还可以包括这样的细胞，其被作为确定或证实适当的表位释放的分析一部分的CTL靶向，并且通过表达免疫蛋白酶体的细胞加工而确定对所需表位的T细胞特异性或免疫原性。所述细胞可被转化以表达释放序列，或者该细胞可简单地用肽/表位脉冲输送。
靶相关抗原(TAA)-在靶细胞中存在的蛋白质或多肽。
肿瘤相关抗原(TuAA)-TAA，其中靶细胞是肿瘤细胞。
HLA表位-对人I类或II类HLA复合物分子具有已知或预期结合亲和力的多肽。尤其充分表征的I类HLAs呈现于表1-4中。
抗体-多克隆或单克隆天然免疫球蛋白(Ig)，或任何完全或部分由Ig结合结构域组成的分子，不管生物化学衍生的或通过使用重组DNA或通过任何其它方法得到。实例包括，特别是F(ab)，单链Fv和Ig可变区-噬菌体外被蛋白融合体。
基本相似性-该术语用来指如通过检查序列判断以不连贯的方式不同于参考序列的序列。编码相同氨基酸序列的核酸序列基本上相似，尽管存在在简并位点的差异或在长度或任何非编码区组成上的微小差异。只是通过保守置换或小的长度变化而不同的氨基酸序列基本上是相似的。另外，包含在N-末端侧翼残基数量不同的持家表位，或在任一末端侧翼残基数量不同的免疫表位和表位簇的氨基酸序列基本上是相似的。编码基本上相似的氨基酸序列的核酸其本身也基本上相似。
功能相似性-该术语用于指如通过检测生物或生物化学特性判断以不连贯的方式不同于参考序列的序列，尽管序列可能不是基本上相似的。例如，可将两种核酸用作针对相同序列的杂交探针但编码不同氨基酸序列。即使其通过非保守氨基酸置换而不同(因此不符合基本相似性的定义)，诱导交叉反应性CTL应答的两种肽在功能上相似。识别相同表位的成对抗体或TCRs可以是在功能上彼此相似，尽管存在任何结构差异。测试免疫原性的功能相似性可以通过用“改变的”抗原免疫并测试激发应答识别靶抗原的能力来进行，所述应答包括但不限于抗体应答、CTL应答、细胞因子产生等等。因此，可以设计在某些方面不同而保持相同功能的两种序列。这样设计的公开或要求保护的序列的序列变体在本发明的实施方案中。
表达盒-编码多肽的多核苷酸序列，可操纵地与启动子和其它的转录和翻译调控元件连接，所述调控元件包括但不限于增强子、终止密码子、内部核糖体进入位点和聚腺苷酸化位点。该盒还可以包括促进其从一种宿主分子迁移至另一种的序列。
嵌入表位-在一些实施方案中，嵌入表位为全部包含在更长多肽中的表位；在其它的实施方案中，该术语也可包括其中仅N-末端或C-末端嵌入而使得该表位并不全部在更长多肽内部位置中的表位。
成熟表位-当表位结合于MHC肽-结合狭缝中时，除了现有的以外无另外的序列的肽。
表位簇-多肽或编码其的核酸序列，其为蛋白质序列的片段，包括天然蛋白质序列，包含对共有MHC限制性元件具有结合亲和力的两种或更多种已知或预期表位。在优选实施方案中，簇内表位的密度大于对全长蛋白质序列内对共有MHC限制性元件具有结合亲和力的所有已知或预期表位的密度。表位簇在2000年4月28日提交的题为表位簇的美国专利申请号09/561,571中公开并且更充分地定义，其在此整体引入作为参考。
释放序列-包含或编码持家表位的嵌入更大序列中的被设计或改造的序列，所述更大序列提供允许持家表位通过加工活性而被释放的环境，包括例如，单独的或任何组合的免疫蛋白酶体活性、N端修整和/或其它的加工或活性。
CTLp-CTL前体为可诱导而呈现细胞溶解活性的T细胞。通过其通常观察到CTLp的次要的体外溶解活性，可由初始的，效应物和记忆CTL在体内的任何组合产生效应子功能。
记忆T细胞-不管其在体内的部位，之前已由抗原活化的T细胞，但处于需要再暴露于抗原以获得效应子功能的休眠生理状态。表型上他们通常为CD62L-CD44hi CD107 α-IGN-γ-LTβ-TNF-α-并且处于细胞周期的G0期。
效应T细胞-当遭遇抗原时容易呈现效应子功能的T细胞。效应T细胞通常能够退出淋巴系统并且进入免疫周边。表型上其通常为CD62L-CD44hiCD107α+IGN-γ+LTβ+TNF-α+并且活跃地循环。
效应子功能-通常为T细胞活化，通常包括细胞溶解活性和/或细胞因子分泌的获得。
诱导T细胞应答-在许多实施方案中包括从幼稚的细胞或在一些环境下，从休眠细胞中产生T细胞应答；活化T细胞的过程。
增强T细胞应答-在许多实施方案中包括提高细胞数目、活化细胞数目、活性水平、增殖速率或参与特异性应答的T细胞相似参数的过程。
引发-在许多实施方案中包括给予诱导的T细胞谱系免疫模式以特定稳定性的诱导。在不同的实施方案中，该术语“引发”可与“诱导”和/或“起始”对应。
TOLL-样受体(TLR)-Toll-样受体(TLRs)为模式识别受体的家族，其由微生物的特定组分和某些宿主分子活化。作为先天免疫系统的一部分，其有助于针对许多病原体的第一道防线，而且在获得性免疫中起作用。
TOLL-样受体(TLR)配体-能够结合和活化toll-样受体的任何分子。实例包括但不限于：已知诱导干扰素的poly IC A合成的、双链RNA。该聚合物由聚肌胞苷酸和聚胞苷酸的一条链、双链RNA、未甲基化的CpG寡脱氧核糖核苷酸或其它的免疫刺激序列(ISSs)、脂多糖(LPS)、β-葡聚糖和咪唑喹林，及其衍生物和类似物组成。
免疫增强佐剂-活化pAPC或T细胞的佐剂，包括例如：TLR配体、内吞-模式识别受体(PRR)配体、皂树皂苷、苯甲酸衍生物、细胞因子等等。一些优选的佐剂在Marciani，D.J.Drug Discovery Today 8：934-943，2003中公开，其在此整体引入作为参考。
免疫刺激序列(ISS)-通常为包含未甲基化CpG序列的寡脱氧核糖核苷酸。CpG也可以嵌入细菌产生的DNA，尤其是质粒中。另外的实施方案包括各种类似物；优选实施方案中为具有一个或多个硫代磷酯键或非-生理碱基的分子。
疫苗-在优选实施方案中，疫苗可以是提供或帮助预防疾病的免疫原组合物。在其它的实施方案中，疫苗为可提供或帮助疾病治愈的组合物。在其它的实施方案中，疫苗组合物可提供或帮助疾病的改善。疫苗免疫原组合物另外的实施方案可用作治疗和/或预防剂。
免疫-诱导对疾病的部分或完全的保护的过程。或者，诱导或增强对抗原的免疫系统应答的过程。在第二种定义中，其可包含保护性免疫应答，尤其促炎或自动免疫，但也可以包括调节应答。因此在一些实施方案中，免疫与耐受(免疫系统避免产生促炎或自动免疫的过程)不同，而在其它的实施方案中该术语包括耐受。
表1
I类MHC分子
I类
人
HLA-A1
HLA-A*0101
HLA-A*0201
HLA-A*0202
HLA-A*0203
HLA-A*0204
HLA-A*0205
HLA-A*0206
HLA-A*0207
HLA-A*0209
HLA-A*0214
HLA-A3
HLA-A*0301
HLA-A*1101
HLA-A23
HLA-A24
HLA-A25
HLA-A*2902
HLA-A*3101
HLA-A*3302
HLA-A*6801
HLA-A*6901
HLA-B7
HLA-B*0702
HLA-B*0703
HLA-B*0704
HLA-B*0705
HLA-B8
HLA-B13
HLA-B14
HLA-B*1501(B62)
HLA-B17
HLA-B18
HLA-B22
HLA-B27
HLA-B*2702
HLA-B*2704
HLA-B*2705
HLA-B*2709
HLA-B35
HLA-B*3501
HLA-B*3502
HLA-B*3701
HLA-B*3801
HLA-B*39011
HLA-B*3902
HLA-B40
HLA-B*40012(B60)
HLA-B*4006(B61)
HLA-B44
HLA-B*4402
HLA-B*4403
HLA-B*4501
HLA-B*4601
HLA-B51
HLA-B*5101
HLA-B*5102
HLA-B*5103
HLA-B*5201
HLA-B*5301
HHLA-B*5401
HLA-B*5501
HLA-B*5502
HLA-B*5601
HLA-B*5801
HLA-B*6701
HLA-B*7301
HLA-B*7801
HLA-Cw*0102
HLA-Cw*0301
HLA-Cw*0304
HLA-Cw*0401
HLA-Cw*0601
HLA-Cw*0602
HLA-Cw*0702
HLA-Cw8
HLA-Cw*1601 M
HLA-G
鼠(小鼠)
H2-Kd
H2-Dd
H2-Ld
H2-Kb
H2-Db
H2-Kk
H2-Kkml
Qa-1a
Qa-2
H2-M3
大鼠
RT1.Aa
RT1.A1
牛(母牛)
Bota-A11
Bota-A20
鸡
B-F4
B-F12
B-F15
B-F19
黑猩猩
Patr-A*04
Patr-A*11
Patr-B*01
Patr-B*13
Patr-B*16
狒狒
Papa-A*06
猕猴
Mamu-A*01
猪(猪)
SLA(单倍型d/d)
病毒同源物
hCMVI类同源物UL18
表2
I类MHC分子
I类
人
HLA-A1
HLA-A*0101
HLA-A*0201
HLA-A*0202
HLA-A*0204
HLA-A*0205
HLA-A*0206
HLA-A*0207
HLA-A*0214
HLA-A3
HLA-A*1101
HLA-A24
HLA-A*2902
HLA-A*3101
HLA-A*3302
HLA-A*6801
HLA-A*6901
HLA-B7
HLA-B*0702
HLA-B*0703
HLA-B*0704
HLA-B*0705
HLA-B8
HLA-B14
HLA-B*1501(B62)
HLA-B27
HLA-B*2702
HLA-B*2705
HLA-B35
HLA-B*3501
HLA-B*3502
HLA-B*3701
HLA-B*3801
HLA-B*39011
HLA-B*3902
HLA-B40
HLA-B*40012(B60)
HLA-B*4006(B61)
HLA-B44
HLA-B*4402
HLA-B*4403
HLA-B*4601
HLA-B51
HLA-B*5101
HLA-B*5102
HLA-B*5103
HLA-B*5201
HLA-B*5301
HLA-B*5401
HLA-B*5501
HLA-B*5502
HLA-B*5601
HLA-B*5801
HLA-B*6701
HLA-B*7301
HLA-B*7801
HLA-Cw*0102
HLA-Cw*0301
HLA-Cw*0304
HLA-Cw*0401
HLA-Cw*0601
HLA-Cw*0602
HLA-Cw*0702
HLA-G
鼠
H2-Kd
H2-Dd
H2-Ld
H2-Kb
H2-Db
H2-Kk
H2-Kkml
Qa-2
大鼠
RT1.Aa
RT1.A1
牛
Bota-A11
Bota-A20
鸡
B-F4
B-F12
B-F15
B-F19
病毒同源物
hCMVI类同源物UL18
表3
HLA-A抗原的估计的基因频率
 抗原  CAU  AFR  ASI  LAT  NAT
 Gfa  SEb  Gf  SE  Gf  SE  Gf  SE  Gf  SE
 A1A2A3A28A36  15.184328.653513.38904.46520.0221  0.04890.06190.04630.02800.0020  5.725618.88498.44069.92691.8836  0.07710.13170.09250.09970.0448  4.481824.63522.64541.76570.0148  0.08460.17940.06550.05370.0049  7.400728.11988.07898.94460.1584  0.09780.17000.10190.10670.0148  12.031629.340811.02935.38560.1545  0.25330.35850.24370.17500.0303
 A23A24A9整体的A9总的 1.82879.32510.080911.2347  0.01810.03950.00380.0429  10.20862.96680.036713.2121  0.10100.05600.00630.1128  0.325622.03910.085822.4505  0.02310.17220.01190.1733  2.926913.26100.053716.2416  0.06280.12710.00860.1382  1.990312.66130.035614.6872  0.10800.25900.01450.2756
 A25  2.1157  0.0195  0.4329  0.0216  0.0990  0.0128  1.1937  0.0404  1.4520  0.0924
 A26A34A43A66A10整体的A10总的 3.87950.15080.00180.01730.07906.2441  0.02620.00520.00060.00180.00380.0328  2.82843.52280.03340.22330.09397.1348  0.05470.06100.00600.01550.01010.0850  4.66281.35290.02310.04780.12556.3111  0.08620.04700.00620.00890.01440.0993  3.26120.49280.00550.03990.06475.0578  0.06620.02600.00280.00740.00940.0816  2.42920.31500.00590.05340.02984.2853  0.11910.04320.00590.01780.01330.1565
 A29A30A31A32A33A74A19整体的A19总的 3.57962.50672.73863.69561.20800.0277.0.056713.8129  0.02520.02120.02210.02560.01480.00220.00320.0468  3.207113.09691.65561.53846.56071.99490.205728.2593  0.05820.11290.04200.04050.08220.04610.01490.1504  1.12332.20253.60051.03319.27010.05610.099017.3846  0.04290.05980.07610.04110.11910.00960.01280.1555  4.51564.4873.4.83282.70642.65930.20270.121119.5252  0.07740.07720.08000.06040.05990.01670.01290.1481  3.43452.53146.08812.55211.07540.10680.047515.8358  0.14100.12150.18550.12200.07960.02520.01680.2832
 AX  0.8204  0.0297  4.9506  0.0963  2.9916  0.1177  1.6332  0.0878  1.8454  0.1925
a基因频率
b标准差
表4
估计的HLA-B抗原的基因频率
抗原  CAU  AFR  ASI  LAT  NAT
 Gfa SEb  Gf  SE  Gf  SE  Gf  SE  Gf  SE
 B7B8B13B14B18B27B35B37B41B42B46B47B48B53B59B67B70B73  12.17829.40772.30614.34814.79804.38319.66141.40320.92110.06080.00990.20690.08650.46200.00200.00400.32700.0108  0.04450.03970.02030.02770.02900.02780.04020.01590.01290.00330.00130.00610.00400.00920.00060.00090.00770.0014  10.59603.83150.81033.03313.20571.29188.51720.59160.81835.69910.01510.13050.131610.95290.00320.00867.35710.0032  0.10240.06340.02950.05660.05820.03720.09270.02520.02960.07680.00400.01190.01190.10390.00190.00300.08660.0019  4.26911.33224.92220.50041.12462.23558.12031.23270.13030.08414.92920.09562.02760.43150.42770.22760.89010.0132  0.08270.04670.08860.02870.04290.06030.11220.04490.01470.01180.08860.01260.05750.02660.02650.01940.03820.0047  6.44773.82251.26995.41664.23492.372414.65160.78071.28180.58660.02340.18321.59151.69820.00550.00551.92660.0261  0.09180.07150.04160.08460.07520.05670.13290.03270.04180.02840.00570.01590.04660.04810.00280.00280.05120.0060 10.98458.57891.74952.98233.34225.197010.11980.97550.47660.28560.02380.21391.02671.08040c0.00590.69010c 0.24320.21760.10130.13160.13910.17210.23450.07590.05310.04110.01190.03560.07780.0798——0.00590.0639
 B51B52B5整体的B5总的 5.42150.96580.15656.5438  0.03070.01320.00530.0435  2.59801.37120.15224.1214  0.05250.03830.01280.0747  7.47513.51210.128811.1160  0.10800.07520.01460.1504  6.81472.24470.15469.2141 0.09430.05520.01460.1324  6.90770.69600.13077.7344  0.19680.06410.02780.2784
 B44B45B12整体的B12总的 13.48380.57710.078814.1440  0.04650.01020.00380.0474  7.01374.80690.028011.8486  0.08470.07080.00550.1072  5.68070.1 8160.00495.8673  0.09480.01 730.00290.0963  9.92531.88120.019311.8258  0.11210.05060.00510.1210 11.80240.76030.065412.6281  0.25110.06700.01970.2584
 B62B63B75B76B77B15整体的B15总的 5.91170.43020.01040.00260.00570.13056.4910  0.03200.00880.00140.00070.00100.00490.0334  1.52671.88650.02260.00650.01190.06913.5232  0.04040.04480.0049.0.00260.00360.00860.0608  9.22490.44381.96730.08740.05770.430112.2112  0.11900.02700.05660.01200.00980.02660.1344  4.18250.80830.11010.00550.00830.18205.2967  0.07470.03330.01230.00280.00340.01580.0835  6.94210.37380.035600c0.00590.07157.4290 0.19730.04710.0145——0.00590.02060.2035
 B38B39B16整体的B16总的 2.44131.96140.06384.4667  0.02090.01880.00340.0280  0.33231.28930.02371.6453  0.01890.03710.00510.0419  3.28182.03520.06445.3814  0.07280.05760.01030.0921  1.96526.30400.12268.3917  0.05170.09090.01300.1036  1.10174.55270.05935.7137  0.08060.16150.01880.1797
 B57B58B17整体的B17总的 3.59550.71520.28454.5952  0.02520.01140.00720.0284  5.67465.95460.324811.9540  0.07660.07840.01870.1076  2.57824.01890.37516.9722  0.06470.08030.02480.1041  2.18001.24810.14463.5727  0.05440.04130.01410.0691  2.72650.93980.26743.9338  0.12600.07450.03980.1503
 B49B50B21整体的B21总的 1.64521.05800.07022.7733  0.01720.01380.00360.0222  2.62860.86360.02703.5192  0.05280.03040.00540.0608  0.24400.44210.01320.6993  0.02000.02700.00470.0339  2.33531.88830.07714.3007  0.05620.05070.01030.0755 1.54620.78620.03562.3680  0.09530.06810.01450.1174
 B54B55B56B22整体的B22总的 0.01241.90460.55270.16822.0852  0.00150.01850.01000.00550.0217  0.01830.48950.26860.04960.8261  0.00440.02290.01700.00730.0297  2.68732.24440.82600.27306.0307  0.06600.06040.03680.02120.0971  0.02890.95150.35960.03721.3771  0.00630.03610.02220.00710.0433  0.05341.40540.33870.12461.9221  0.01780.09090.04480.02720.1060
抗原  CAU  AFR  ASI  LAT  NAT
 Gfa SEb  Gf  SE  Gf  SE  Gf  SE  Gf  SE
 B60B61B40整体的B40总的 5.22221.19160.26966.6834  0.03020.01470.00700.0338  1.52990.47090.03882.0396  0.04040.02250.00650.0465  8.32546.20720.320514.8531  0.11350.09890.02300.1462  2.25384.66910.24737.1702  0.05530.07880.01840.0963  5.72182.60230.22718.5512  0.18010.12310.03670.2168
 BX  1.0922  0.0252  3.5258  0.0802  3.8749  0.0988  2.5266  0.0807  1.9867  0.1634
a基因频率
b标准差
c观察到的基因计数为零。
表5
CT基因列表 * ：
CT标识 转录物/转录物家族 家族成员/CT标识(异名)
 CT1  MAGEA  MAGEA1/CT1.1，MAGEA2/CT1.2，MAGEA3/CT1.3，MAGEA4/CT1.4，MAGEA5/CT1.5，MAGEA6/CT1.6，MAGEA7/CT1.7,MAGEA8/CT1.8,MAGEA9/CT1.9,MAGEA10/CT1.10,MAGEA11/CT1.11,MAGEA12/CT1.12
 CT2  BAGE  BAGE/CT2.1,BAGE2/CT2.2,BAGE3/CT2.3,BAGE4/CT2.4,BAGE5/CT2.5
 CT3  MAGEB  MAGEB1/CT3.1,MAGEB2/CT3.2,MAGEB5/CT3.3.MAGEB6/CT3.4
 CT4  GAGE1  GAGE1/CT4.1,GAGE2/CT4.2,GAGE3/CT4.3,GAGE3/CT4.4,GAGE5/CT4.5,GAGE6/CT4.6,GAGE7/CT4.7,GAGE8/CT4.8
CT5 ssx SSX1/CT5.1,SSX2/CT5.2a,SSX2/CT5.2b,SSX3/CT5.3,SSX4/CT5.4
CT6 NY-ESO-1 NY-ESO-1/CT6.1,LAGE-1a/CT6.2a,LAGE-1b/CT6.2b
CT7 MAGEC1 MAGEC1/CT7.1，MAGEC3/CT7.2
CT8 SYCP1 SYCP1/CT8
CT9 BRDT BRDT/CT9
CT10 MAGEE1 MAGEE1/CT10
 CT11  CTp11/SPANX  SPANXA1/CT11.1，SPANXB1/CT11.2，SPANXC/CT11.3，SPANXD/CT11.4
 CT12  XAGE-l/GAGED  XAGE-1a/CT12.1a,XAGE-1b/CT12.1b,XAGE-1c/CT12.1c,XAGE-1d/CT12.1d,XAGE-2/CT12.2,XAGE-3a/CT12.3a,XAGE-3b/CT12.3b,XAGE-4/CT12.4
CT13 HAGE HAGE/CT13
CT14 SAGE SAGE/CT14
CT15 ADAM2 ADAM2/CT15
CT16 PAGE-5 PAGE-5/CT16.1，CT16.2
CT17  LIP1 LIP1/CT17
CT18 NA88 NA88/CT12
 CT19  IL13RA1  1L13RA1/CT19
CT20 TSP50 TSP50/CT20
CT21 CTAGE-1 CTAGE-1/CT21.1,CTAGE-2/CT21.2
CT22 SPA17 SPA17/CT22
 CT23  OY-TES-1  OY-TES-1/CT23
CT24 CSAGE CSAGE/CT24.1,TRAG3/CT24.2
 CT25  MMA1DSCR8  MMA-1a/CT25.1a,MMA-1b/CT25.1b
CT26 CAGE CAGE/CT26
CT27 BORIS BORIS/CT27
 CT28  HOM-TES-85  HOM-TES-85/CT28
CT29  AF15q14/D40  D40/CT29
 CT30  E2F-样/HCA661  HCA661/CT30
CT31 PLU-1 PLU-1/CT31
CT32 LDHC LDHC/CT32
CT33 MORC MORC/CT33
 CT34  SGY-1  SGY-1/CT34
CT35 SPO11 SPO11/CT35
CT36 TPX1 TPX-1/CT36
CT37 NY-SAR-35 NY-SAR-35/CT37
 CT38  FTHL17  FTHL17/CT38
CT39 NXF2 NXF2/CT39
 CT40  TAF7L  TAF7UCT40
 CT41  TDRD1  TDRD1/CT41.1,NY-CO-45/CT41.2
 CT42  TEX15  TEX15/CT42
CT43 FATE  FATE/CT43
CT44 TPTE TPTE/CT44
 PRAME  (MAPE,DAGE)
*参见Scanlan等.，“The cancer/testis genes：Review，standardization，andcommentary，”Cancer Immunity，Vol.4，p.1(2004年1月23日)，其在此整体引入作为参考。
以下讨论阐明了对本发明方面操作的理解或看法。然而，不意图用本讨论将本专利限制于在后附权利要求中未提出的任何具体操作理论。
有效的免疫-介导的肿瘤进程或微生物感染通常包括具有多种能力如迁移、效应子功能和分化为记忆细胞的抗原-特异性T细胞的诱导和扩展。免疫应答的诱导可通过各种方法尝试并且包括不同形式抗原的施用，其对免疫应答的强度和性质有可调的影响。获得免疫应答调控的一种限制因素为靶向能加工并且有效呈递得到的表位至特异性T细胞的pAPC。
该问题的解决方法为将抗原递送定向于二级淋巴器官，其为pAPC和T细胞丰富的微环境。抗原可例如作为多肽或作为由多种载体的任一种表达的抗原而递送。根据免疫的强度和性质的结果可通过包括例如剂量、制剂、载体的性质以及分子环境的因素所调控。本发明的实施方案可增强免疫应答的控制。免疫应答的控制包括根据需要诱导不同类型免疫应答的能力，例如从调控至促炎应答。优选的实施方案提供对I类MHC-限制性表位应答的强度和性质的增强的控制，其是主动免疫疗法的主要目的。
以前的免疫方法呈现某些重要的局限性：第一，经常涉及疫苗效力的结论推断自从一种或一组非常有限的超敏感的读数测定法产生的免疫原性数据。常常，不管接种方案的推断效力，临床应答并不显著或是最适度的。其次，在免疫后，可产生和/或扩展与更常规的T效应细胞一起的T调节细胞，并且这些细胞可干涉所需免疫应答的功能。在主动免疫疗法中这些机制的重要性仅在最近才被认识到。
免疫原的结内施用提供免疫应答强度和模式控制的基础。作为所述施用的结果而实现的pAPC有效的体内负载使得甚至通过利用最简单形式的抗原-肽表位-或者通常与差的药物代谢动力学有关而能够实现高强度的免疫。应答的性质可进一步受免疫原，载体的性质和免疫方案的控制。这些方案可用于增强/修饰慢性传染或肿瘤进程中的应答。
免疫一般依赖于重复的抗原施用以增强免疫应答的强度。DNA疫苗的使用产生高质量的应答，但利用所述疫苗难以获得高强度的应答，即使重复加强剂量。应答的两种特性，高质量和低强度，可能应归于用这些载体获得的MHC上装载的相对低水平的表位。反而更常见的是利用活病毒载体中编码的抗原加强所述疫苗以获得用于临床有效性所需的高强度应答。然而，活载体的使用必然伴有一些缺点，包括潜在的安全问题、由于由之前的施用诱导的对载体的体液应答所带来的后来的加强免疫的减少的有效性、以及产生和生产的成本。因此，仅仅活载体或DNA的使用，虽然激发高质量的应答，但可能产生有限的应答强度或持续性。
本文公开的是涉及方案和方法的实施方案，当其应用于肽时，使它们作为有效的免疫治疗工具。这些方法绕过差的肽的PK，并且如果在具体的常常更复杂的方式背景下应用时，产生强的免疫应答的增强和/或控制。在优选实施方案中，在诱导强的、中等的或甚至轻微的(等于或低于常规方法检测的水平)由Tc1细胞组成的免疫应答的引发剂后，肽直接施用于淋巴器官产生出乎意料强的免疫应答的增强。虽然本发明的优选实施方案可在免疫的整个阶段应用抗原的淋巴管内(intralymphatic)施用，淋巴管内施用为无佐剂肽施用的最优选方式。利用淋巴管内施用的肽增强可应用于现有的免疫应答，其已在之前被诱导。之前的诱导可通过天然暴露于抗原或通过通常所用的给药途径而发生，所述给药途径包括但不限于皮下的、皮内的、腹膜内的、肌内的和粘膜的。
还如本文所示，导致特异性T细胞的随后扩展的最优激发，可通过将幼稚T细胞在丰富的共-刺激环境中(如淋巴结中)暴露于有限量抗原(如可产生自由质粒编码的抗原的常常有限的表达)而更好地获得。其可引起运载T细胞受体的T细胞的活化，其以高亲和力识别抗原呈递细胞上的MHC-肽复合物，并且其可导致记忆细胞的产生，所述记忆细胞对随后的刺激更具反应性。有益的共-刺激环境可通过使用免疫增强剂而增强或确保，并且因此淋巴管内施用虽然有利，但不在起始免疫应答所需的所有实施方案中。在涉及利用用于诱导/引发的表位肽的实施方案中，优选使用相对低剂量的肽(与增强剂量或MHC-饱和浓度相比)以使呈递受限，尤其是如果利用直接的淋巴管内施用。这些实施方案通常涉及包括免疫增强剂以实现引发。
虽然游离肽的差的药物代谢动力学阻止了其在大多数给药途径中的应用，直接施用到二级淋巴器官尤其是淋巴结，已证实在通过连续输注或频繁(例如每天)注射而或多或少连续地维持抗原水平时是有效的。所述用于产生CTL的结内施用在美国专利申请号09/380,534、09/776,232(公开号.20020007173 A1)，目前的美国专利号6,977,074和2005年12月19日提交的_/_,_(公开号_)(代理卷号No.MANNK.001CP2C1)，以及PCT申请号PCTUS98/14289(公开号WO9902183A2)中教导，每篇题为诱导CTL应答的方法，每篇在此整体引入作为参考。在本发明的一些实施方案中，肽的结内施用对于增强最初用质粒DNA疫苗诱导的应答是有效的。此外，细胞因子模式是独特的，其中质粒DNA诱导/肽增强通常比DNA/DNA或肽/肽方案导致更多的趋化因子(化学引诱物细胞因子)和更少的免疫抑制细胞因子产生。
因此，这样的DNA诱导/肽增强方案可提高组合物的有效性，所述组合物包括用于癌症和慢性感染的治疗疫苗。用于这些免疫治疗的有利的表位选择原理公开于2001年11月7日提交的美国专利申请号09/560,465、10/026，066(公开号20030215425 A1)、10/005,905，2004年7月20日提交的10/895，523(公开号2005-0130920 A1)和2004年7月20日提交的10/896,325(公开号)，所有的都题为抗原呈递细胞中的表位同步化；2004年10月1日提交的09/561,074、目前为美国专利号6,861,234和10/956,401(公开号2005-0069982 A1)，两者题为发现表位的方法；2000年4月28日提交的09/561,571，题为表位簇；2002年3月7日提交的10/094,699(公开号.20030046714 A1)，2005年6月30日提交的11/073,347，(公开号_)，每篇题为用于癌症的抗-新生血管制剂；和2002年4月4日提交的10/117,937(公开号20030220239 A1)，2005年2月25日提交的11/067,159(公开号2005-0221440A1)，2005年2月25日提交的10/067,064(公开号2005-0142114A1)，以及10/657,022(公开号2004-0180354 A1)和PCT申请号PCT/US2003/027706(公开号WO 04/022709 A2)，每篇题为表位序列，并且每篇在此整体引入作为参考。全部疫苗质粒设计的方面公开于2000年4月28日提交的美国专利申请号09/561,572，以及2002年8月20日提交的10/225,568(公开号2003-0138808 A1)，两者题为编码靶-相关抗原表位的表达载体，以及2004年2月10日提交的美国专利申请号10/292,413(公开号20030228634 A1)、10/777,053(公开号2004-0132088 A1)和2004年4月30日提交的10/837,217(公开号_)，所有的题为编码靶-相关抗原表位的表达载体和其设计方法；2003年5月13日提交的10/225,568(公开号2003-0138808 A1)、PCT申请号PCT/US2003/026231(公开号WO2004/018666)和美国专利号6,709,844以及美国专利申请号10/437,830(公开号2003-0180949 A1)，每篇题为质粒增殖中不需要的复制中间体的避免，每篇在此整体引入作为参考。特异性抗原组合在引导针对具体癌症的免疫应答的特定的利益公开于2003年6月17日提交的美国临时申请号60/479，554，2004年6月17日提交的美国专利申请号10/871,708(公开号2005-0118186 A1)，2005年12月29日提交的PCT专利申请号PCT/US2004/019571(公开号WO 2004/112825)，美国临时申请号60/640,598以及与本申请同时提交的美国专利申号_/_,_(公开号_)(代理卷号MANNK.049A)，所有的题为用于各种类型癌症的疫苗中肿瘤-相关抗原的组合，每篇也在此整体引入作为参考。BRMs的淋巴管内施用的应用和优点公开于2005年12月29日提交的美国临时专利申请号60/640,727和与本申请同时提交的美国专利申请号_/_,_(公开号_)(代理卷号MANNK.046A)，两者题为通过生物应答修饰物质靶向施用于淋巴器官而触发、维持以及操纵免疫应答的方法，每篇在此整体引入作为参考。另外的方法、组合物、肽和肽类似物公开于2001年11月7日提交的美国专利申请号09/999,186，题为商品化抗原的方法；以及2005年12月29日提交的美国临时专利申请号60/640,821和与本申请同时提交的申请号_/_,_(公开号_)(代理卷号MANNK.048A)，两者题为免疫应答诱导中绕过CD4+细胞的方法，每篇在此整体引入作为参考。
其它的相关的公开内容呈现在2005年6月17日提交的美国专利申请号11/156,369(公开号_)和美国临时专利申请号60/691,889，两者题为表位类似物，并且每篇在此整体引入作为参考。此外相关的为，2005年6月17日提交的美国临时专利申请号60/691,579，题为对在癌细胞和肿瘤基质上表达的优势和次优势表位引起多价免疫应答的方法和组合物，以及2005年6月17日提交的60/691,581，题为用于癌的多价引发-和-增强免疫治疗，每篇在此整体引入作为参考。
令人惊讶的是，根据常规激活-加强计划表的肽的重复结内注射与仅仅初始剂量给药后观察到的应答相比，导致降低了溶细胞应答的数量。免疫应答模式的检查显示此为免疫调控诱导(抑制)而不是无应答的结果。此与包含编码免疫原的DNA，通常为质粒的诱导-和-增强方案相反。通过抗原的结内注射的pAPC的直接负载通常减弱或避免对佐剂的需要，所述佐剂通常用于校正经其它的肠胃外途径递送的抗原的药物代谢动力学。这样的佐剂的缺少，其通常为致炎的，与之前用肽免疫观察到的相比，可因此促进不同(即，调控的或致耐受性的)免疫应答模式的诱导。如以下实施例所示，由于应答在远离最初注射部位的二级淋巴器官中测定，所述结果支持用于改变(抑制)进行中炎症反应的根据本发明实施方案的使用方法和组合物。通过靶向相同的抗原或任何与炎症部位有关的合适抗原，并且依赖由免疫抑制细胞因子介导的旁观者效应，该方法甚至对于具有II类MHC-限制性病因学的炎症病症也是有用的。
尽管重复的肽施用导致逐步降低溶细胞免疫应答的事实，用试剂诸如非复制的重组DNA(质粒)的诱导对随后的剂量具有相当大的影响，使得能够对由重组DNA表达的表位和肽产生强的免疫增强，并且引发其溶细胞性质。事实上，当重组DNA载体或肽分别单次或多次施用没有获得或获得不大的免疫应答，用DNA的诱导和用肽的增强基本上获得更高的应答，无论是应答速率还是应答强度。在所示的实施例中，通过利用重组DNA诱导/肽-增强方案，应答速率至少加倍并且应答强度(平均值和中位值)至少成三倍。因此，优选的方案引起免疫诱导(Tc1免疫)，其能处理体内，淋巴和非-淋巴器官内的抗原细胞。大多数癌症免疫疗法中的一种限制因素为肿瘤细胞对免疫-介导的攻击的有限易感性，可能归因于降低的MHC/肽呈递。在优选实施方案中，通过DNA诱导/肽增强获得强的免疫扩大，其强度通常等于或超过用有毒力微生物感染后通常观察到的免疫应答。该提高的强度有助于弥补差的MHC/肽呈递并且确实导致如专业化临床前模式，诸如，例如HLA转基因小鼠中所示的人肿瘤细胞的清除。
因此这种包括重组DNA引发剂量后接施用给淋巴器官的肽加强的特定顺序的诱导-和-加强方案，可用于强T细胞应答的诱导、增强和维持的目的，例如用于感染性或肿瘤疾病的预防或治疗。这些疾病可以是癌(例如，肾、卵巢、乳房、肺、结肠直肠、前列腺、头部-和-颈、膀胱、子宫、皮肤)、黑色素瘤、不同来源的肿瘤和通常表达确定的或可确定的肿瘤相关抗原的肿瘤，所述抗原如癌胚抗原(例如CEA、CA19-9、CA125、CRD-BP、Das-1、5T4、TAG-72等等)、组织分化抗原(例如Melan-A、酪氨酸酶、gp100、PSA、PSMA等等)或癌症-睾丸抗原(例如PRAME、MAGE、LAGE、SSX2、NY-ESO-I等等；参见表5)。癌症-睾丸基因及其对于癌症治疗的关联性在Scanlon等.，Cancer Immunity 4：1-15，2004中综述，其在此整体引入作为参考。与肿瘤新生血管有关的抗原(例如PSMA、VEGFR2、Tie-2)也可用于与癌症疾病相联系，如2005年6月30日提交的美国专利申请号10/094,699(公开号20030046714 A1)和11/073,347(公开号_)中公开的，题为用于癌症的抗-新生血管制剂，每篇在此整体引入作为参考。该方法和组合物可用于靶向不同的生物体和疾病状况。例如，靶生物可以包括细菌、病毒、原生动物、真菌等等。靶疾病可包括由例如朊病毒引起的疾病。例示性的疾病、生物和抗原以及与靶生物、细胞和疾病有关的表位在美国申请号09/776,232(公开号20020007173 A1)，目前为美国专利号6,977,074中描述，其在此整体引入作为参考。可阐明的感染性疾病为由趋于产生慢性感染的病原体(HIV、单纯疱疹病毒、CMV、乙肝和丙肝病毒、乳头状瘤病毒等等)引起的和/或与急性感染有关的那些(例如流感病毒、麻疹、RSV、Ebola病毒)引起的。从预防或治疗的前景看，令人感兴趣的是具有致癌潜力的病毒-如乳头状瘤病毒、Epstein Barr病毒和HTLV-I。所有这些感染性病原体都具有确定的或可确定的抗原，其可用作设计组合物如肽表位的基础。
所述方法的优选应用(参见，例如，图19)包括注射或输注入一种或多种淋巴结，以多次(例如1至10次或更多，2至8次，3至6次，优选约4或5次)施用重组DNA(剂量范围0.001-10mg/kg，优选0.005-5mg/kg)起始，随后为肽的一次或多次(优选约2次)施用，优选以免疫学惰性载体或制剂(剂量范围1ng/kg-10mg/kg，优选0.005-5mg/kg)施用。因为剂量不一定与受试者体重成线性比例，在这些范围的各部分中，用于人的剂量可倾向于较低，并且用于小鼠的剂量可倾向于较高。注射时优选的质粒和肽的浓度通常为约0.1μg/ml-10mg/ml，并且最优选的浓度为约1mg/ml，通常不管受试者的体重或物种。然而，特别有效的肽可具有趋于该范围低端的最适浓度，例如在1和100μg/ml之间。当仅仅肽的方案用于提高耐受性时通常优选趋于这些范围较高端的剂量(例如0.5-10mg/ml)。只要需要，可以重复该顺序以维持体内的强免疫应答。另外，DNA的最后一次引发剂量和肽的第一次增强剂量之间的时间并不关键。优选其为约7天或更长，并且可超过数月。DNA和/或肽注射的重复次数可通过替代以连续数天(优选2-7天)的输注而减少。用类似于注射施用的丸剂材料起始输注，随后缓慢输注(24-12000μl/天以递送约25-2500μg/天的DNA，对于肽为0.1-10,000μg/天)可以是有利的。这可以通过人工实现或通过程序可控泵，如胰岛素泵的使用而实现。所述泵是本领域已知的并且能够产生周期性的峰值和其它的剂量模式，这在一些实施方案中是有利的。
本发明一般性地描述了单循环免疫作用，其包括一次或起始剂量的施用，后接一次或多次增强剂量的施用。本发明的其它实施方案需要反复循环的免疫作用。这种反复循环可以用于进一步增强应答的强度。另外，当寻求多价应答时，作为单循环免疫作用的结果，并非所有个体都必定实现对每种靶抗原的显著应答。可以重复免疫循环，直至特定个体实现对每种靶抗原的充分的应答。还可以通过调节给定的每种单一组分的顺序、时间或剂量数而改进单次免疫循环以实现更平衡的应答。多轮免疫循环也可以用于随着时间维持应答，例如维持有效的应答效应期为基本上随时间一直存在的，并且可以对疾病或其他医学状况的治疗是有利的。
应当注意的是虽然该方法在增强步骤中成功地使用了肽，而没有缀合至蛋白质上、添加佐剂等，但并非必需缺少这些组分。因此，缀合的肽、佐剂、免疫增强剂等可用于实施方案中。更复杂的施用到淋巴结，或具有达到淋巴系统能力的肽组合物在该方法中可用游离肽代替，所述肽组合物包括由不同形式的肽表位或抗原组成或包含其的肽-脉冲的树突状细胞，混悬液如脂质体制剂、聚集体、乳剂、微粒、纳米晶体。反之，通过结内施用进行的肽加强可以在通过实现甚至在低水平的T记忆细胞诱导的任何方法/或途径激活之后。
为了减少由于抗原表达拼嵌现象，或抗原突变或丧失而出现抗性的机会，同时对多种，优选大约2-4种抗原免疫是有利的。可使用任何抗原组合。特定肿瘤抗原表达的模式可用于确定所用的抗原或抗原组合。例示性的方法见于2004年6月17日提交的美国临时申请号60/580,969，2005年6月17日提交的美国专利申请号11/155,288以及与本申请同时提交的美国专利申请号._/_，_(公开号_)(代理卷号MANNK.050CP1)中，全部都题为“用于各种类型癌症诊断方法中的肿瘤-相关抗原的组合”；并且每篇在此整体引入作为参考。特别适于选定癌症治疗的具体的抗原组合在美国临时专利申请号.60/479,554和美国专利申请号10/871,708(公开号2005-0118186 A1)以及PCT申请号PCT/US2004/019571中公开，以上引用和引入作为参考。为了触发对多个抗原或来自单个抗原的多个表位的免疫应答，这些方法可用于递送多个免疫原实体，无论是分别地或作为混合物。当免疫原分别递送时，优选不同实体施用到不同的淋巴结或在不同的时期施用到相同的淋巴结，或同时施用相同的淋巴结。这可与肽递送尤其相关，对此很难能够设计对所有组分肽提供溶解性和稳定性的单个制剂。单个核酸分子可编码多个免疫原。或者，对于多个抗原，编码所有组分免疫原的一个或子集的多个核酸分子可以混合在一起，只要可提供所需的剂量而无需高浓度的核酸，如此高的浓度导致其粘度变成问题。
在优选的实施方案中，该方法要求直接施用到淋巴系统中。在优选实施方案中这是施用到淋巴结。类似地优选输入性淋巴管。淋巴结的选择并不关键。由于其大小和可接近性，优选腹股沟淋巴结，但腋窝和子宫颈结节和扁桃体类似地有利。施用至单个淋巴结足以诱导或增强免疫应答。施用至多个结节可提高应答的可靠性和强度。对于促进多价应答并且因此使用多种增强肽的实施方案，优选在任何特定的场合仅仅施用单个肽到任何特定的淋巴结上。因此例如，一种肽可施用到右侧腹股沟淋巴结并且同时第二种肽施用到左侧腹股沟淋巴结。另外的肽可施用到其它的淋巴结，即使其不是诱导部位，因为由于T淋巴细胞的迁移，起始和增强剂量不必一定施用到相同的部位。
或者例如任何另外的肽可以晚几天施用到相同的淋巴结，其用于之前增强肽的施用，因为虽然在优选实施方案中该时间间隔可大于约一周，诱导和增强之间的时间间隔通常不是关键参数。如果它们的MHC-结合亲和力类似，则增强肽的分开施用通常是比较不重要的，但在亲和力变得更加不同时，其重要性增强。各种肽的不相容制剂也可以令分开施用成为优选。
可征集利用确定其MHC蛋白表达模式和免疫响应的一般水平的方法，可受益于这些免疫方法的患者。此外，可以结合进入外周血来利用标准技术监测其免疫水平。最后，治疗方案可以基于对诱导或增强阶段的应答和抗原表达的变化进行调节。例如，优选可施用重复的引发剂量直至获得可检测的应答，并且随后施用增强肽剂量，而不是在一组引发剂量后就施用增强剂量。类似地，如果其有效性衰退，抗原-特异性调节T细胞数量上升或观察到一些其它的耐受证据，预定的肽的增强或维持剂量可以停止，并且在用该肽恢复增强之前进一步施用引发剂量。利用免疫方法评估和监测免疫应答的诊断技术的整合在2004年6月17日提交的临时美国专利申请号60/580,964和2005年6月17日提交的美国专利申请号11/155,928(公开号_)中更充分地讨论，两者题为“通过整合诊断和治疗方法而提高主动免疫疗法的效力”，每篇在此整体引入作为参考。
本发明许多方法实施方案的实践包括至少两种不同组合物的使用以及，尤其在存在一个以上靶抗原时，其可包括在一起和/或在不同时期施用的数个组合物。因此本发明的实施方案包括免疫原组合物的组和子集及其各自剂量。多价性可利用包括多价免疫原、单价免疫原组合的组合物、包括一种或多种单价免疫原或其不同组合的组合物的协同使用而获得。根据这些方法制造用于特定治疗方案或方法的多个组合物确定了免疫治疗性产品。在一些实施方案中全部产品组分或其亚组被一起包装在试剂盒中。在有些情况下靶向单个表位或表位组的诱导和增强组合物可包装在一起。在其他情况中多个诱导组合物可配装在一个试剂盒中并且对应的增强组合物配装在另一个试剂盒中。或者组合物可以分别与印刷形式的或在机器可读媒介上的说明书一起包装和销售，所述说明书描述其如何互相结合使用以实现本发明方法的有利结果。进一步的改变对本领域技术人员将是显而易见的。不包括以特定的方案或方式应用的全部组合物的各种包装方案的使用有利于治疗的个性化，例如以肿瘤抗原表达或以观察到的对免疫治疗或其各种组分的应答为基础，如在2004年6月17日提交的美国临时申请号60/580,969，2005年6月17日提交的美国专利申请号11/155,288(公开号_)以及2005年12月29日提交的美国专利申请No._/_,_ (代理卷号No.MANNK.050CP1)，全部都题为“用于各种类型癌症诊断的肿瘤-相关抗原的组合”；和临时美国专利申请号60/580，964和美国专利申请号11/155,928(公开号_)，两者题为“通过将诊断与治疗方法整合而提高主动免疫疗法的效力”中所述，以上每篇整体引入作为参考，。
在一些实施方案中，用于描述并且要求保护本发明的某些实施方案的表示组分的量，性质如分子量、反应条件等等的数字要理解为在有些情况下通过术语“大约”而改变。因此，一些实施方案中，书面说明书和附加的权利要求中所述的数值参数为近似值，其可根据通过特定的实施方案设法获得的所需性质而变化。在一些实施方案中，数值参数应当根据报道的显著数字的数目并且通过应用常规的舍入方法而分析。尽管列出本发明一些实施方案宽范围的数值范围和参数为近似值，但尽可能精确地报道具体实施例中所述的数值。在本发明一些实施方案中，给出的数值可包含必然由在其各自的检验测量中发现的标准偏差而产生的某些误差。
在一些实施方案中，术语“一”和“一种”以及“所述”和用于描述本发明具体实施方案的上下文中所用的类似表示(尤其在下列某些权利要求的上下文中)可解释为覆盖单数和复数。在此数值范围的列举仅仅意在用作分别涉及落入该范围的每个单独值的简写形式。除非在此另有陈述，每个单独的值并入说明书中，就如其在此分别列举一样。除非在此另有陈述或明显与上下文矛盾，在此描述的所有方法可以任何合适的顺序进行。对于本文的某些实施方案提供的任何和所有实施例，或例示性语言(例如“如”)的使用仅是想更好地阐明本发明并且除另外要求的外，不造成对本发明范围的限制。说明书中的语言都不应被视为表示本发明的实践所必需的任何未要求的要素。
在此公开的替代要素的组或本发明的实施方案不被视为是限制。每组成员可分别或以与本文发现的组的其它成员或其它要素任何组合的形式而提及和要求保护。可以预料为了方便和/或专利性一个或多个组成员可包括在组内或从组中删除。当任何所述包括或删除存在时，在此认为说明书包含进行修改而因此符合后附的权利要求中所用的所有马库什组书面描述的组。
本文描述了本发明优选的实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。通过阅读上述说明书，对那些优选实施方案的改变对本领域普通技术人员是显而易见的。预期熟练的技术人员可酌情应用所述改变，并且可以在除本文明确描述之外来实施本发明。因此，本发明的许多实施方案包括如适用法允许的在后附的权利要求中陈述的所述主题的所有改进和等同形式。另外，除非在此另有陈述或明显与上下文矛盾，其所有可能的改变中任何上述要素的组合由本发明所包括。
另外，在整个本说明书中参考了许多专利和印刷出版物。每篇上面引用的参考文献和印刷出版物在此分别整体引入作为参考。
最后，可理解本文公开的本发明的实施方案为本发明原理的例示。可采用的其它改进在本发明的范围内。因此是举例，而不是限制，可根据本文的教导而利用本发明的替代形式。因此，本发明不限于仅仅如所示和所述的那些。
下列实施例仅仅用于例示性的目的，并非意在以任何方式限制本发明或其各种实施方案的范围。
实施例1.通过淋巴管内免疫的免疫应答的高效诱导。
负载表达人I类MHC嵌合单链型转基因(A*0201，命名为“HHD”；参见Pascolo等.J.Exp.Med.185(12)：2043-51，1997，其在此整体引入作为参考)的小鼠通过如下结内施用而免疫。通过应用不同的注射途径：皮下的(sc)、肌内的(im)和淋巴管内的(in，利用直接接种于腹股沟淋巴结)，对五组小鼠(n＝3)用表达Melan-A 26-35 A27L类似物的质粒(pSEM)免疫以诱导，并在一周后增强。免疫和剂量计划表在图1A中显示。增强一周后，处死小鼠；制备脾细胞并且用标记的抗-CD8 mAbs和识别Melan-A 26-35-特异性T细胞受体的四聚体染色。代表性数据在图1B中显示：虽然皮下和肌内施用获得约或少于1％的四聚体+CD8+T细胞的频率，质粒的淋巴管内施用获得6％以上的频率。此外，在体外用Melan-A肽刺激脾细胞并且在各种E∶T比率检测51Cr-标记的靶细胞(T2细胞)(图1C)。利用此标准的细胞毒性测定法，来自经淋巴结内注射免疫的动物的脾细胞在各种E∶T比率显示最高水平的体外裂解。
实施例2.不同形式免疫原施用顺序的影响。
HHD小鼠通过质粒(pSEM)或肽(MelA；ELAGIGILTV；SEQ ID NO：1)以不同的顺序结内施用而免疫。pSEM编码的免疫原性多肽在美国专利申请10/292,413(公开号20030228634 A1)中公开，题为编码靶-相关抗原表位的表达载体和其设计方法，在此整体引入作为参考。
免疫方案(图2)包括：
i)诱导阶段/诱导剂量：在第0天和第4天25μl(微升)无菌盐水双侧注射入腹股沟淋巴结，其包含25μg(微克)质粒或50μg(微克)肽。
ii)增强剂量：如上实施例1中所述并且在诱导阶段完成后2周起始。
在分离脾细胞并且在pAPC存在时，在体外用同源肽刺激后通过标准技术测量免疫应答。优选免疫应答的模式通过考虑源自多个测定法的结果，有利于各种效应物和调控功能的评估并且提供更全面的应答观察而描述。可考虑所用测定法的类型而不单是其数目；例如，用于不同促炎症细胞因子的一种测定法加上用于趋化因子或用于免疫抑制细胞因子的测定法比用于不同促炎症细胞因子的两种测定法更加有益。
实施例3.如实施例2中所述免疫的小鼠的ELISPOT分析
ELISPOT分析测量产生细胞因子、肽-特异性的T细胞的频率。图3表示重复的代表性的实施例；并且图4呈现分别表示为细胞因子产生细胞的数目/106效应器细胞数目的数据的总结。结果表明与用肽免疫的小鼠相反，质粒-免疫的或质粒-引发的/肽-增强的小鼠发展识别Melan-A肽的产生IFN-γ(gamma)的T细胞提高的频率。用质粒引发并且用肽增强的四只小鼠中有四只呈现超过1/2000的频率。相反，整个方案用质粒免疫的四只小鼠中的两只，呈现超过1/2000的频率。仅利用肽作为免疫原的小鼠没有得到升高的由IFN-γ-产生T细胞组成的应答。实际上，肽的重复施用减低这些细胞的频率，与质粒引发后施用肽形成鲜明的对照。
实施例4.如实施例2中所述免疫的小鼠的溶细胞活性分析
从每组制备混合的(pooled)脾细胞(收集脾脏，切碎，裂解红血细胞)并且在rIL-2存在下与LPS-刺激的，Melan-A肽-包被的同源pAPC温育7天。洗涤细胞并且与用Melan-A肽(ELA)脉冲输送的51Cr-标记的T2靶细胞以不同的比率温育4小时。利用γ(gamma)-计数器测量上清液中释放的放射性。应答定量为％裂解＝(样品信号-背景)/(最大信号-背景)x100，其中背景表示当在测定培养基中温育时仅仅由靶细胞释放的放射性，而最大信号为由用去污剂裂解的靶细胞释放的放射性。图5举例说明了以上-所述的细胞毒性测定的结果。在体外用肽刺激后获得的溶细胞活性的水平，对于那些已接受DNA作为体内诱导剂量的组而言，比那些已接受肽作为诱导剂量的组更高。与以上ELISPOT数据一致，用DNA组合物诱导的免疫应答产生稳定的、可扩大的效应子作用，而仅利用肽的免疫产生较少的应答，其数值在重复施用时进一步减少。
实施例5.交叉-反应性
如以上实施例4制备和使用脾细胞，针对用三种不同的肽包被的靶细胞：Melan-A类似物免疫原和代表与其对应的人和鼠表位的那些。如图6所示，所有三种靶标上观察到类似的溶细胞活性，证实对天然序列的应答的交叉-反应性。
实施例6.肽重复施用于淋巴结诱导免疫偏离和调节T细胞。
通过ELISA或Luminex(R)评估由上述免疫方法产生的特异性T细胞的细胞因子模式(并且在图2中)。(Luminex分析为以多重方式测量由培养物中T细胞产生的细胞因子的方法。)将如上所述产生的混合淋巴细胞培养物七天的上清液用于测量下列生物应答调节物：MIP-1α、RANTES和TGF-β(捕获ELISA，利用涂有抗-细胞因子抗体和特异性试剂如生物素-标记的抗体、链霉抗生物素-辣根过氧化物酶和比色底物的平板；R&D Systems)。利用专业制造商(BD Pharmingen)提供的T1/T2和T炎症试剂盒通过Luminex测量其它的细胞因子。
图7A中的数据比较了三种不同的免疫方案并且显示该方案对免疫应答模式的意想不到的效果：尽管质粒引发能够诱导分泌促炎症细胞因子的T细胞，重复的肽施用导致调节或免疫抑制细胞因子如IL-10、TGF-β和IL-5的产生。应该理解用于仅肽方案的免疫计划表提供淋巴系统内周期性的而不是连续的表位存在，其反而延长应答的效应期。最后，质粒引发后肽增强导致T细胞趋化因子MIP-1α和RANTES提高的产量。T细胞趋化因子如MIP-Iα和RANTES可在调节对肿瘤或感染部位的运输中起重要作用。免疫监视期间，特异于靶-相关抗原的T细胞可遭遇同源配体，增殖并且产生包括趋化因子的介质。这些可增强在识别抗原的部位上的T细胞的招募，产生更有效的应答。数据从获自大批培养物的上清得到(重复的平均值±SE，两次独立测量)。
通过标准方法从肺间质组织和脾脏回收细胞并且用抗CD8、CD62L和CD45RB的抗体与识别Melan-A-特异性T细胞的四聚体试剂一起染色。图7B中的数据代表CD8+四聚体+T细胞的选通(gated)群体(Y轴CD45RB以及X轴CD62L)。
该结果一起证实仅用肽注射的动物中的免疫偏差(降低的IFN-γ、TNF-α产生、提高的IL-10、TGF-β和IL-5、CD62L-CD45Rblow CD8+四聚体+调节细胞的强诱导)。
实施例7.通过将非-复制质粒(引发)与肽(增强)交替施用于淋巴结而 高效诱导免疫应答
通过Melan-A肿瘤相关抗原的淋巴管内施用对人I类MHC HLA.A2基因转基因的三组HHD小鼠进行免疫。动物用pSEM质粒(25μg/淋巴结)或ELA肽(ELAGIGILTV(SEQ ID NO：1)，MelanA26-35 A27L类似物)(25μg/淋巴结)直接接种入腹股沟淋巴结而激活(诱导)，三天后第二次注射。十天后，小鼠用pSEM或ELA以相同的方式加强，三天后最后加强以增强应答(参见图11A类似的免疫程序)，产生下列诱导&增强组合：pSEM+pSEM、pSEM+ELA以及ELA+ELA(每组12只小鼠)。十天后，利用Melan-A特异性四聚体试剂(HLA-A*0201 MART1(ELAGIGILTV(SEQ ID NO：1))-PE，Beckman Coulter)监测免疫应答。单只小鼠经后眼窝窦静脉采血并且利用密度离心(Lympholyte Mammal，Cedarlane Labs)以2000rpm25分钟分离PBMC。用小鼠特异性CD8抗体(BD Biosciences)和Melan-A四聚体试剂共-染色PBMC并且利用FACS口径流式细胞仪(BD)通过流式细胞术确定特异性百分比。通过不同的激活/加强组合产生的Melan-A特异性CD8+细胞的百分比在图8A和8B中显示。质粒-激活/肽-加强组(pSEM+ELA)引起强的免疫应答，其中在所有动物之间的平均四聚体百分比为4.6。应答小鼠定义为具有2或更大的四聚体百分比，其代表等于未免疫对照组的平均值加3倍标准差(SE)的数值。这些数值在本领域中认为是非常强的应答并且通常可仅通过利用复制载体而获得。pSEM+ELA免疫组12只中包含10只作为效应物的小鼠，并且与对照组相比(p(Fisher)＝0.036)，这代表统计学上显著的差异。另外两种免疫系列，pSEM+pSEM和ELA+ELA，12只小鼠中产生作为效应物的6只小鼠，但具有大于0.05的p值，使其在统计上不显著。为了测量这些小鼠的免疫，用肽包被的靶细胞体内激发动物。从同窝出生的对照HHD小鼠分离脾细胞并且与20μg/mL ELA肽一起温育2小时。这些细胞随后用CFSEhi荧光染色(4.0μM15分钟)并且与未与肽温育的等比率的对照脾细胞静脉内共-注射入免疫的小鼠，用CFSEIo荧光染色(0.4μM)。18小时后通过从激发的动物(每组5只小鼠)除去脾脏、淋巴结、PBMC和肺并且通过流式细胞术测量CFSE荧光而测量靶细胞的特异性消除。结果在图8C中显示。在pSEM+ELA激活/加强组中，5只小鼠中的4只表现强的免疫应答并且成功地清除所检测的每一组织中大致50％的靶标。同样显示每个实验组的代表性直方图(PBMC)。
实施例8.肽加强有效地恢复用DNA诱导的并且休眠至四聚体水平接近 于基线的动物中的免疫记忆细胞。
如图9A中所述，免疫后测量小鼠中的(每组5只小鼠)Melan-A四聚体水平。免疫程序完成后5周，四聚体水平恢复接近于基线。在第6周用ELA肽加强免疫动物以确定是否可恢复免疫应答。ELA增强后接受先前pSEM质粒(DNA/DNA，图9C)免疫的动物表现出Melan-A特异性CD8+T细胞前所未有的扩展，水平在大于10％的范围内。另一方面，如通过四聚体染色细胞的较低频率所示，接受先前ELA肽(图9A)注射的动物几乎没有从ELA加强中获得利益。当接受肽增强时，与另一组相比，接受DNA，随后接受肽作为首次免疫的小鼠呈现显著的但中等的扩展。(图9B)。这些结果清楚地证实DNA/DNA-引发和肽-增强免疫策略的强的理论基础。
实施例9.优化免疫以在淋巴和非-淋巴器官中获得高频率的特异性T细 胞。
如图9A-C中所述，经受用一系列两组质粒注射引发免疫，随后用肽增强的小鼠产生有效的免疫应答。对此进一步的证据在图10A-C中显示，其举例说明了肽施用之前(图10A)和之后(图10B)的四聚体水平。可清楚地观察到单只小鼠中的四聚体水平并且代表多至30％的在接受DNA/DNA/肽免疫方案的小鼠中总CD8+的T细胞群体。这些结果概括在图10C的图表中。此外，接受该精选的免疫方案的动物血液、淋巴结、脾脏和肺中的高四聚体水平非常明显(图10D)。
已进行了多个另外的实验以鉴定通过该方案产生的CTL的表型。标记以所述条件起始的免疫模式，因为肽加强导致CD43+、CD44+、CD69+、CD62L-、CD45RBdim、肽-I类MHC-特异性T细胞群体的显著的扩展。这些特异性T细胞居于非-淋巴器官并且当另外进行特异性刺激时，以依赖于刺激肽复合物的密度的方式，迅速实现CD107α和IFN-γ的表达。
实施例10.质粒和肽免疫原精确的施用顺序决定免疫应答的强度。
用表达Melan-A 26-35 A27L类似物(pSEM)或Melan-A肽的质粒，利用通过直接接种入腹股沟淋巴结的激活和增强来免疫六组小鼠(n＝4)。免疫计划表在图11A中显示(50μg质粒或肽的剂量/淋巴结，双侧)。两组小鼠利用质粒激活并且用质粒或肽增强。反之，两组小鼠利用肽起始并且用肽或质粒增强。最后，两组对照小鼠用肽或质粒起始但不增强。最后一次接种后四周，采集脾并且制备、合并脾细胞混悬液并且将其在涂布有抗-IFN-γ抗体的ELISPOT平皿中用Melan-A肽刺激。温育后48小时，开展分析并且自动计数识别Melan-A的产生细胞因子的T细胞的频率。数据在图5B中表示为特异性T细胞/1百万应答细胞的频率(三次重复的平均值+SD)。数据表明逆转质粒和肽的起始和增强剂量顺序对总的应答强度有相当大的影响：以质粒引发，随后肽增强产生最强的应答，而以肽剂量起始，随后质粒增强产生明显较弱的应答，类似于肽的重复施用。
实施例11.免疫应答与免疫方案的相关性以及通过在淋巴和非-淋巴器官 内靶细胞的清除而证实的体内效力。
为了评估通过引发-和-增强方案获得的免疫应答，4组动物(n＝7)用Melan-A包被的靶细胞体内激发。从同窝出生的对照HHD小鼠分离脾细胞并且与20μg/mL ELA肽一起温育2小时。这些细胞随后用CFSEhi荧光染色(4.0μM15分钟)并且与用CFSE1o荧光染色(0.4μM)的等比率的对照脾细胞静脉内共-注射入免疫的小鼠。18小时后通过从被激发的动物除去脾脏、淋巴结、PBMC和肺并且通过流式细胞术测量CFSE荧光而测量靶细胞的特异性消除。图12A和12B显示来自未免疫的对照动物或接受肽/肽、DNA/肽或DNA/DNA免疫方案的动物组织的CFSE直方图(每组显示两只代表性的小鼠)。DNA-引发/肽-增强组显示在淋巴以及非-淋巴器官中高水平的靶细胞的特异性杀死(图12C)并且显示表现与四聚体水平特定的相关性的唯一的免疫方案(图12D，对于所有检测的组织r2＝0.81或更高)。
实施例12.在通过精选的引发-和-增强方案免疫的动物中人肿瘤细胞的 清除
对Melan-A抗原的免疫通过用人黑色素瘤肿瘤细胞激发小鼠，随后用精选的方案免疫而进一步检测。图13A显示了用于所检测的3组的精选免疫策略。如图13B中举例说明的，免疫的小鼠接受人靶细胞的两次静脉内注射，用CFSEhi荧光标记的624.38 HLA.A2+混合以等比率的用CFSE1o标记的624.28 HLA.A2-对照细胞。14小时后，处死小鼠并且通过流式细胞术分析肺(其中人靶标累积的器官)的特异性靶细胞溶解。图13C显示源自每组小鼠的代表性的CFSE直方图。如通过肺中靶标几乎80％的特异性杀死所证实的，DNA-引发，随后肽-增强清楚地免疫小鼠抗人肿瘤细胞。更长系列的DNA-引发注射也引起与Melan-A四聚体反应的CD8+细胞的进一步提高的频率。
实施例13.DNA-引发，肽-增强策略引起对 SSX2-来源的表位， KASEKIFYV(SSX2 41-49 )的强免疫。
利用图14A中定义的免疫程序针对SSX2肿瘤相关抗原免疫动物，表现了强的免疫应答。图14B显示用pCBP质粒激活(引发)并且用SSX241-49K41F或K41Y肽类似物加强(增强)的小鼠代表性的四聚体染色。这些类似物与对SSX241-49表位特异性的T细胞交叉-反应。这些实施例举例说明了引发-和-增强方案可引起SSX2抗原特异性，其达到有效CD8T细胞的80％。pCBP质粒和其设计原理在美国专利申请号10/292,413(公开号20030228634A1)中公开，题为编码靶-相关抗原表位的表达载体和其设计方法，其在此整体引入作为参考。另外的方法、组合物、肽和肽类似物在2004年6月17日提交的美国临时申请号60/581,001和2005年6月17日提交的美国申请号11/156,253中公开，两者题为SSX-2肽类似物；每篇在此整体引入作为参考。另外的方法、组合物、肽和肽类似物在2004年6月17日提交的美国临时申请号60/580,962和2005年6月17日提交的美国申请号11/155,929中公开，每篇题为NY-ESO肽类似物；并且每篇在此整体引入作为参考。
实施例14.引发-和-增强策略可用于同时激发对位于不同抗原上的表位 的免疫应答。
四组HHD小鼠(n＝6)经仅仅pSEM；仅仅pCBP；pSEM和pCBP的混合物；或左边LN用pSEM并且右边LN用pCBP的淋巴结内注射而免疫。这些注射在ELA或SSX2肽以相同的方式加强10天后进行。所有免疫的小鼠与未免疫的对照比较。小鼠用包被了ELA或SSX2肽的HHD同窝出生小鼠的脾细胞激发，应用三峰CFSE体内细胞毒性分析，其允许同时评估两种抗原靶标的特异性溶解。等量的对照-CFSElo、SSX2-CFSEmed和ELA-CFSEhi细胞被静脉内注入免疫的小鼠，并且18小时后处死小鼠，利用流式细胞仪通过CFSE荧光在脾(图15A)和血液(图15B)中测量靶细胞的消除。图15A和15B显示来自单独小鼠的SSX2和Melan-A抗原靶标的特异性溶解百分比并且图15C以柱状图格式概述结果。用两种疫苗的混合物免疫动物产生对两种抗原的免疫并且引起最高的免疫应答，显示对于Melan-A在30+/-11和97+/-1的脾脏中的平均SSX2百分比的特异性溶解。
诱导多价应答的变化，包括对次优势表位的应答在实施例24-34中进一步举例说明。
实施例15.DNA引发和肽增强的重复循环获得并且维持强的免疫。
三组动物(n＝12)接受两个循环的下列免疫方案：DNA/DNA/DNA；DNA/肽/肽或DNA/DNA/肽。在进行每轮免疫后，在小鼠中测量Melan-A四聚体水平并且呈现在图16中。最初的DNA/DNA/肽免疫循环产生百分之21.1+/-3.8的四聚体+CD8+T细胞的平均值-比另两组几乎高2倍。第二轮引发-和-增强免疫后，DNA/DNA/肽组的平均四聚体百分比提高54.5％至32.6+/-5.9-比DNA/肽/肽水平高2.5倍并且比DNA/DNA/DNA组水平高8.25倍。此外，在这些条件下其它的免疫程序几乎没有获得四聚体阳性T细胞频率的提高。
实施例16.通过存在于交替质粒和肽载体的免疫诱导和增强方式触发长 时的记忆T细胞。
四只HHD转基因动物(3563、3553、3561和3577)接受下列两个循环的引发-和-增强方案：DNA/DNA/肽。第一个循环包括在第-31、-28、-17、-14、-3、0天免疫；第二个循环包括在第14、17、28、31、42和45天免疫。在第120天用肽加强小鼠。在每轮免疫后7-10天并且在第二轮免疫后90天之前定期测量小鼠中的Melan-A四聚体水平。图表中的箭头对应于每个循环完成。(图17A)。所有四只动物在最后一次加强(增强)后发动应答，证实免疫记忆的持续而不是耐受性的诱导。
五只HHD转基因动物(3555、3558、3566、3598和3570)接受下列两个循环的引发-和-增强方案：DNA/肽/肽。如前所述，第一个循环包括在第-31、-28、-17、-14、-3、0天免疫；第二个循环包括在第14、17、28、31、42和45天免疫。在第120天用肽加强小鼠。每轮免疫后第7-10天并且在第二轮免疫后90天之前定期测量小鼠中的Melan-A四聚体水平(图17B)。该实验中，通过比较该引发-和-增强方案，每轮中将肽代替稍后的DNA注射引起减弱的免疫记忆或减少的应答。
实施例17.通过结内DNA施用产生具有相当大扩展能力的长时记忆T细 胞。
七只HHD转基因动物接受两个循环的下列免疫方案：DNA/DNA/DNA。第一个循环包括在第-31、-28、-17、-14、-3、0天免疫；第二个循环包括在第14、17、28、31、42和45天免疫。在第120天用肽加强小鼠。在每轮免疫后7-10天并且在第二轮免疫后90天之前定期测量小鼠中的Melan-A四聚体水平。(图18)。所有七只动物显示两轮免疫期间和之后四聚体+细胞的临界％频率，但在肽加强后发动强的应答，证实了显著的免疫记忆。
实施例18.抗原加免疫增强佐剂的不同组合有效用于CTL应答的引发。
肽的结内施用是增强试剂(复制型的或非-复制型的)通过淋巴管内施用而引发的免疫应答的非常有效的方法，所述试剂包括佐剂如TLRs或与其结合。
受试者(如小鼠、人或其它的哺乳动物)通过载体如质粒、病毒、肽加佐剂(CpG、dsRNA、TLR配体)、重组蛋白加佐剂(CpG、dsRNA、TLR配体)、灭活的微生物或纯化的抗原(例如，具有免疫增强活性的细胞壁组分)结内输注或注射而引发并且通过无佐剂的肽的结内注射而增强。通过四聚体染色和其它方法测量的加强前后的免疫应答显示强度的显著增长。相反，通过其它途径利用无佐剂肽的加强没有实现免疫应答的同样的增长。
实施例19.肽的结内施用是增强由抗原加免疫增强佐剂通过任何施用途 径而触发的免疫应答的非常有效的方法。
受试者(如小鼠、人或其它哺乳动物)通过载体如质粒、病毒、肽加佐剂(CpG、dsRNA、TLR配体)、重组蛋白加佐剂(CpG、dsRNA、TLR配体)、灭活的微生物或纯化的抗原(例如，具有免疫增强活性的细胞壁组分)的肠胃外或粘膜施用而被免疫并且通过无佐剂的肽结内注射而增强。通过四聚体染色和其它方法测量的加强前后的免疫应答显示强度的显著增长。相反，通过其它非结内途径利用无佐剂肽的加强没有实现免疫应答同样的增长。
实施例20.利用引发-和-增强免疫方案破坏耐受性。
为了破坏对自体-抗原(如肿瘤-相关抗原)的耐受性或恢复免疫应答，受试者(如小鼠、人或其它哺乳动物)用载体如质粒、病毒、肽加佐剂(CpG、dsRNA、TLR模拟物)、重组蛋白加佐剂(CpG、dsRNA、TLR模拟物)、灭活的微生物或纯化的抗原进行免疫并且通过无佐剂肽(对应于自体表位)的结内注射而加强。通过四聚体染色和其它方法测量的加强前后的免疫应答显示免疫应答(“耐受性破坏”)强度的显著增长。
实施例21.用于引发-和-增强免疫的临床实践。
利用临床和实验室标准诊断患者为需要用于肿瘤或传染病的治疗；患者进行治疗或不利用第一线(first line)的治疗；并且涉及用于主动免疫疗法的评估。取决于疾病的性质和治疗产品的特征，以另外的标准(抗原特征、MHC单元型、免疫应答)为基础进行参与。通过载体(质粒)和蛋白质抗原(肽)以精确的顺序通过淋巴管内的注射或输注(丸剂、程序可控的泵或其它的方法)进行治疗(图19)。最优选的方案包括包含质粒引发，随后肽的增强剂量的重复循环。这些循环的频率和延续可依据通过免疫、临床和其它的方法测量的应答而调节。所施用的组合物可以是单价或多价的，包含多个载体、抗原或表位。施用可以同时或以交错方式至一个或多个淋巴结。接受该治疗的患者表现症状的改善。
实施例22.免疫偏差的诱导或致病T细胞失活的临床实践。
具有自体免疫或炎症病症的患者利用临床和实验室标准诊断，进行治疗或不利用第一线的治疗，并且涉及主动免疫疗法的评估。取决于疾病的性质和治疗产品的特征，以另外的标准(抗原特征、MHC单元型、免疫应答)为基础进行参与。通过缺少T1-促进佐剂的肽和/或与增强免疫偏差的免疫调节剂一起进行淋巴管内的注射或输注(丸剂、程序可控的泵或其它方法)而进行治疗。然而，定期的弹丸注射是用于通过该方法产生免疫偏差的优选方式。用肽的治疗可每周、双周或更不频繁(例如，每月)进行，直至获得对免疫或临床状态的预期效果。如图2中的组2，所述治疗可包括单次施用或多次密集的施用。维持治疗可在起始之后，利用包括更不频繁注射的调节方式进行。所施用的组合物可以是单价或多价的，包含多个表位。优选该组合物无延长肽在淋巴系统中滞留的任何组分。除恰当的临床方法之外，施用可同时或以交错方式至一个或多个淋巴结，并且通过测量对免疫肽或无关表位(“表位散布”)具有特异性的T细胞而监测应答。
实施例23.免疫原组合物(例如病毒疫苗)
根据下列计划表：第0、3、14和17天，六组(n＝6)HLA-A2转基因小鼠用25μg质粒载体双侧注射入腹股沟淋巴结。载体编码来自HIV gag的三种A2限制性表位(SLYNTVATL(SEQ ID NO：3)，VLAEAMSQV(SEQ IDNO：4)，MTNNPPIPV(SEQ ID NO：5))，来自pol的两种(KLVGKLNWA(SEQ ID NO：6)，ILKEPVHGV(SEQ ID NO：7))和来自env的一种(KLTPLCVTL(SEQ ID NO：8))。最后一轮引发后两周，小鼠用包含所有这些五种肽的混合物注射(双侧5μg/肽/结三天间隔)。作为平行，五组小鼠用单一的肽注射(双侧5μg/肽/结三天间隔)。七天后，对小鼠采血并且通过对每种肽进行四聚体染色而评估应答。然后，一半小鼠用表达env、gag或pol的重组牛痘病毒激发(103 TCID50/小鼠)并且在第7天，通过利用常规的噬菌斑分析在卵巢中测量病毒滴度。将另一半处死，用肽刺激脾细胞5天并且对包被肽的靶细胞测量细胞毒活性。作为对照，小鼠仅用质粒或肽注射。通过四聚体染色和细胞毒性，用质粒引发并且用肽增强的小鼠显示对所有五种肽更强的免疫。
更一般地，为了破坏对非-自体抗原如病毒、细菌、寄生虫或微生物的耐受性，恢复免疫应答或诱导免疫，受试者(如小鼠、人或其它哺乳动物)用载体如质粒、病毒、肽加佐剂(CpG、dsRNA、TLR模拟物)、重组蛋白加佐剂(CpG、dsRNA、TLR模拟物)、灭活的微生物或纯化的抗原(如细胞壁组分)免疫并且通过无佐剂肽(对应于靶表位)的结内注射而加强。通过四聚体染色和其它的方法测量的加强前后的免疫应答显示免疫应答强度的显著增加。所述策略可用于保护免于感染或治疗由病原体如HBV、HCV、HPV、CMV、流感病毒、HIV、HTLV、RSV等等引起的慢性感染。
实施例24.用两种质粒：表达SSX2 41-49的pCBP和表达Melan-A26-35 (A27L)的pSEM的免疫计划表。
如图20所示，两组HHD小鼠(n＝4)用pSEM和pCBP作为混合物；或左边腹股沟淋巴结用pSEM并且右边腹股沟淋巴结用pCBP的淋巴结内注射而在第0天和第4天进行免疫两次。质粒的量为25μg/质粒/剂量。两周后，处死动物，并且测量对T2细胞的细胞毒性，用或不用肽来以脉冲方式递送进入所述T2细胞。
实施例25.载体分离挽救次优势表位的免疫原性。
处死如实施例24所述免疫的动物，将脾细胞合并归组，并且平行地用两种肽其中之一，Melan-A 26-35(A27L)或SSX2 41-49的进行刺激。通过与51Cr负载的，肽-脉冲进入的T2靶细胞一起温育而测量细胞毒性。图21中的数据显示对各种靶细胞的特异性细胞毒性的平均值(n＝4/组)。
结果表明质粒混合物的使用干扰了由pCBP质粒激发的应答；然而，对施用部位分离两种质粒挽救了pCBP的活性。运载不同抗原的不同载体的共同-施用导致涉及免疫原性层次的建立。载体分离挽救了次优势组分的免疫原性，产生多价应答。
实施例26.增加肽增强步骤至免疫方案。
如图22所示，用pSEM和pCBP作为混合物；或左边腹股沟淋巴结用pSEM并且右边腹股沟淋巴结用pCBP的淋巴结内注射而在第0天和第4天免疫四组HHD小鼠(n＝6)两次。作为对照，小鼠仅用pSEM或pCBP质粒免疫。质粒的量为25μg/质粒/剂量。两周后在第14天和第17天，动物用Melan-A和/或SSX2肽加强，反应关于剂量和组合的质粒免疫。两周后在第28天，用CFSE染色和用或没用Melan-A(ELA)或SSX2肽脉冲击发(pulse)的脾细胞激发动物，用于体内细胞毒性的评估。
实施例27.甚至在当载体和肽分别用作混合物时肽加强挽救次优势表位 的免疫原性。
动物如实施例26所述进行免疫并且用包被了ELA或SSX2肽的HHD同窝出生的仔畜的脾细胞激发，应用三峰CFSE体内细胞毒性分析，其允许同时评估两种抗原靶标的特异性溶解。等量的对照-CFSElo、SSX2-CFSEmed和ELA-CFSEhi细胞被静脉内输注入被免疫的小鼠，并且18小时后处死小鼠，通过利用流式细胞仪的CFSE荧光测量脾中(图23)靶细胞的消除。该图显示了来自单只小鼠的SSX2和Melan-A抗原靶标特异性溶解的百分比，对于每组的平均值和SEM。
令人感兴趣的是，用包括首先为质粒然后为肽的两种疫苗的混合物免疫动物对两种抗原产生免疫并且产生最高的免疫应答，显示对于Melan-A，脾中30±11和97±1的平均SSX2特异性溶解百分比。因此，如图23中举例说明的，即使在当载体和肽分别用作混合物时肽加强可挽救次优势表位的免疫原性。
实施例28.用于引发-和-增强免疫的临床实践。
图24显示用于诱导强的多价应答的两种方案：在第一种方案(A)中，即使将质粒和肽用作混合物，使用用于增强的肽恢复多价免疫应答。在第二种方案(B)中，质粒和肽组分分离分别提供多价免疫应答的诱导。优选将肽施用于用于常见表位的引发质粒所施用的同样的淋巴结。然而这并不是绝对需要的，因为T记忆细胞丧失CD62L表达并且因此居于其它的淋巴器官中。显示于图24中的引发和增强之间的时间间隔是适合的，但并不认为是关键。基本上较少优选较短的时间间隔而更长的时间间隔是完全可接受的。
实施例29.单个质粒引发多价应答。
在图25和以下表中所述的质粒pSEM，在开放阅读框(“同步多肽编码序列”)中，包含邻接在一起的来自两种不同抗原(Melan-A和酪氨酸酶)的多个肽。因此其具有表达和诱导针对单个以上表位免疫的潜力。编码的肽序列如下：酪氨酸酶1-9；Melan-A/MART-1 26-35(A27L)；酪氨酸酶369-377；以及Melan-A/M ART-1 31-96。
质粒中多肽的cDNA序列在来自巨细胞病毒(CMVp)的启动子/增强子序列调控下，其在由抗原呈递细胞吸收时允许多肽信使的有效转录。在编码序列3′端的牛生长激素聚腺苷酸化信号(BGH polyA)提供信使的聚腺苷酸化的信号以增强其稳定性以及从细胞核转移进入胞质。为了促进质粒转运入细胞核，来自猿猴病毒40的核输入序列(NIS)插入质粒主链中。将CpG免疫刺激基序的一个拷贝设计入该质粒中以进一步加强免疫应答。最后，质粒中两种原核遗传元件负责大肠杆菌中卡那霉素抗性基因(Kan R)和pMB细菌复制起点的扩增。pSEM的进一步描述可在美国专利申请号10/292,413中找到，在其中pSEM被不同地命名为pMA2M和pVAXM3，以上引入作为参考。
遗传元件名称 描述
CMV增强子/启动子 整个巨细胞病毒即时早期基因增强子和启动子区域
BGH聚腺苷酸化区域 牛生长激素聚腺苷酸化区域。包含已知延长信使1/2寿命的共有序列
卡那霉素抗性基因 能赋予细菌宿主细胞(top10)卡那霉素抗药性的转座子Tn10所述宿主细胞用于克隆和发酵该质粒
PMB复制起点(反向) PMB复制起点与ColE1类似但质粒的细菌来源稍有不同。其为能支持质粒DNA/细菌细胞100-1500拷贝的高拷贝复制起点。相对于原pVAX质粒，我们反转其定向以消除我们的质粒疫苗构建体中不需要的复制中间体的产生。参见美国专利号6,709,844，其在此整体引入作为参考。
ISS序列(大肠杆菌中天然存在的) 序列GTCGTT为高度优选的和天然存在的CpG序列，报道其能够在人免疫细胞中引起抗-细菌DNA佐剂的反应。
第二种ISS序列(合成的/ACLI位点) 序列AACGTT为ACLI位点和优选的CpG序列，报道其能够在鼠免疫细胞中引起抗-细菌DNA佐剂的反应。
核输入序列(NIS)，SV4072 bp重复 报道SV40 72碱基对重复充当有效的核输入序列(NIS)，其允许较高水平的转录从质粒进入靶标真核细胞中。整个SV40复制起点不包括在NIS中并且不应支持在哺乳动物细胞中的游离型复制。
实施例30.通过利用多价载体在激发之后“挽救”或增强对次优势表位 免疫应答的方案。
共-表达治疗相关性表位的载体的众人皆知的限制为在新设计的环境内，一个表位将承担关于免疫诱导的主要作用，而其余的将是次要的(尤其当所述表位结合至相同的MHC限制元件时)。
在图26中，这样的方案描述为：八组HHD小鼠(n＝4)用pSEM在第0、3、14和17天通过淋巴结内注射而免疫。质粒的量为25μg的质粒/剂量。在第28和31天，小鼠经结内施用对应于Melan-A26-35(图27A)或酪氨酸酶369-377(图27B)的增强肽，也是25μg的肽/剂量。在免疫完成后两周利用Melan-A或酪氨酸酶特异性试剂在外周血中通过CD 8+T细胞的四聚体染色测量免疫应答。
在图27中的结果表明用pSEM的激活引起对Melan-A的显著应答，而对酪氨酸酶的应答则检测不到。平行地，仅用肽免疫的动物没有显示对任一表位的可检测的四聚体应答。这些数据一起表明Melan-A表位承担与酪氨酸酶表位有关的免疫主要作用。然而用酪氨酸酶(“天然肽”)加强后，在用pSEM激活后用Melan-A肽免疫的动物中，对酪氨酸酶(图27B，第一组)的免疫应答与对Melan-A(图27A，第二和第四组)获得的水平相比强度类似。
总之，酪氨酸酶肽的淋巴管内施用挽救了通过pSEM起始的对该表位的免疫应答，克服了在用于起始该应答的载体(pSEM)环境中与Melan-A表位有关的次要性。
实施例31.激发之后通过利用多价载体“挽救”或增强对次优势表位的免 疫应答的方案：对细胞毒免疫的评估。
免疫如实施例30所述进行：八组HHD小鼠(n＝4)用pSEM在第0、3、14和17天经淋巴结注射而免疫。质粒的量为25μg/剂量。在第28和31天，小鼠用施用于淋巴结(25μg的肽/剂量)对应于Melan-A 26-35(图28A)或酪氨酸酶369-377(图28B)的肽进行免疫。在离体用Melan-A或酪氨酸酶表位肽再刺激脾细胞后，在免疫完成后14天，通过细胞毒性分析评估免疫。总之，制备脾细胞(收集脾脏，切碎，裂解红血细胞)并且在rIL-2存在下与LPS-刺激的，Melan-A(图28A)或酪氨酸酶(图28B)肽-包被的同源pAPC温育7天。冲洗细胞并且以不同比率与51Cr-标记的Melan-A+，酪氨酸酶+624.38靶细胞一起温育4小时。利用γ(gamma)-计数器测量释放入上清的放射性。将应答定量为％溶解＝(样品信号-背景)/(最大信号-背景)x100，其中背景表示当在测定培养基中温育时仅仅由靶细胞释放的放射性，而最大信号为由用去污剂裂解的靶细胞释放的放射性。
如在实施例30中，图28的结果表明通过结内肽加强挽救/增强对表位(酪氨酸酶)的免疫，其在免疫起始载体(pSEM)背景中是次要的。
实施例32.在起始载体环境内同时共-诱导和增强对两个表位-一个优势 的和一个次优势的表位的免疫应答的方案。
在之前的两个实施例中，证实了在不存在对优势表位应答的增强时对次优势表位应答的挽救。接着，尝试同时增强两种应答。
在图29中，将所述方案描述为：四组HHD小鼠(n＝6)用pSEM在第0、3、14和17天通过淋巴结内注射而免疫。质粒的量为25μg/剂量。在第28天和31天，小鼠用对应于Melan A26-35(左腹股沟淋巴结)和酪氨酸酶369-377(右腹股沟淋巴结)表位的肽以25μg的肽/剂量同时免疫。在免疫完成后两周利用Melan-A(图30A)或酪氨酸酶(11B)特异性试剂在外周血中通过CD 8+T细胞的四聚体染色测量免疫应答。数据表示为CD8+亚组内四聚体+细胞的平均值％。如通过多色四聚体染色测定的，用pSEM质粒激活并且用肽类似物Melan A 26-35 A27Nva{E(Nva)AGIGILTV；SEQ ID NO：9}(左淋巴结)和酪氨酸酶369-377 V377Nva{YMDGTMSQ(Nva)；SEQ IDNO：10}(右淋巴结)增强的动物显示对每种表位特异性的多价免疫应答(图30C)。对来自外周血的总CD8阳性细胞绘制点曲线图并且表示单只小鼠中的竞争免疫应答。四聚体水平计算为CD8阳性T细胞的百分比。
图30中的结果表明通过Melan A和酪氨酸酶肽的共同-施用，其中一种可共-增强对Melan A和酪氨酸酶表位二者的免疫应答，两者在免疫起始载体(pSEM)的背景中具有优势/次优势关系。
实施例33.在起始载体环境内利用肽混合物共-诱导和增强对两个表位- 一个优势的和一个次优势的表位的溶细胞应答。
为了进一步研究简化的产品制剂，测试了替代方法，结合利用表达优势和次优势表位的二价质粒，随后通过优势和次优势肽混合物的施用而不是肽的单独施用而增强对每种表位的应答-如之前的实施例所述。
六组HHD小鼠(n＝6)如之前的实施例所述，在淋巴结中用pSEM质粒免疫(或分别未免疫)，并且用肽(作为Melan-A+各种酪氨酸酶肽的混合物)加强，剂量为12.5μg/肽/剂量，计划表如下：在第0、3天用质粒；第14和17天用肽，两周后重复该循环。所用的酪氨酸酶肽为：如上，Tyr 369-377；Tyr 1-9，其由质粒编码但不由转化的细胞呈递；以及Tyr 207-215，其不由质粒编码。
如上所述，免疫方法完成后两周通过CFSE测定测量免疫应答。简要地：从同窝出生的对照HHD小鼠分离脾细胞并且将其与20μg/mL ELA或20μg/mL酪氨酸酶肽一起温育2小时。这些细胞随后用CFSEhi和CFSEmed荧光染色并且与等比率的用CFSElo荧光染色的对照脾细胞一起静脉内共-注射入免疫的小鼠。18小时后摘除脾脏并且利用流式细胞术测量靶细胞的特异性消除且通过下列公式计算体内特异性溶解的％：
{[1-(％CFSEhi或med/％CFSElo)]-[1-(％CFSEhi或med对照/％CFSElo对照)]}x100
其中方程式中每个％术语代表由每个峰表示的总样品的比例。
总的说来，图31中呈现的结果(对Melan-A表位包被的或酪氨酸酶表位包被的脾细胞的体内特异性溶解％；X轴描述用于加强所用的肽)表明在质粒激发/肽增强方式的增强阶段中利用肽混合物产生对优势(Melan-A)和次优势(酪氨酸酶369-377)表位的免疫的共-增强。此外，仅仅肽的利用不产生有效的应答。对于肽的这种组合，获得对两种表位的显著应答。然而，应当注意的是当各种肽的MHC-结合亲和力类似时对来自肽混合物的成功期望更大，而亲和力变得更加不同时成功的期望减少。
实施例34.具有更高级多价性的应答的诱导
在本研究中，免疫用两种二价质粒诱导并且用四种肽表位类似物增强。如之前的，质粒pSEM用于诱导对Melan-A和酪氨酸酶表位的免疫并且利用类似物Melan-A(A27Nva)和酪氨酸酶(V377Nva)增强应答。也利用质粒pBPL诱导对表位SSX2 41-49、NY-ESO-1 157-165的免疫。由pBPL编码的免疫原性多肽在美国专利申请10/292,413(公开号20030228634 A1)中公开，题为编码靶-相关抗原表位的表达载体和其设计方法，将其在此整体引入作为参考。增强利用肽表位类似物SSX2 41-49(A42V)和NY-ESO-1 157-165(L158Nva，C 165V)。表位类似物的进一步论述在以上作为参考而引用和陈述的表位类似物申请中提供。与天然序列相比，这些类似物通常具有结合至MHC的优良的亲和力和稳定性，但与识别天然序列的TCR交叉反应。
将三组雌性HHD-A2小鼠用pSEM/pBPL的混合物双侧施用于腹股沟淋巴结而免疫(100μg每种质粒/天；25μl/注射的结节)。在整个方案中，组1(n＝10)仅接受质粒，在第1、4、15、18、28、32、49和53天进行注射。组2和组3(n＝25每组)在第1、4、15和18天接受质粒注射并且在随后的一天接受肽注射。在第25天，从免疫的动物收集血液，并且通过利用MHC-四聚体测定的流式细胞术分析CD8+T细胞。应答与幼稚的同窝出生对照小鼠(n＝5)相比较。
组2中的小鼠通过在第28、32、49和53天施用肽酪氨酸酶V377Nva(25μg/天)至右淋巴结并且用SSX2 A42V(25μg/天)至左淋巴结来加强。组3动物通过在第28和32天施用肽酪氨酸酶V377Nva(25μg/天)至右淋巴结和SSX2 A42V(25μg/天)至左淋巴结，随后在第49和53天施用NY-ESO-1L158Nva，C165V(12.5μg/天)至右淋巴结和Melan-A A27Nva(25μg/天)至左淋巴结而加强。所有的注射为25μl/注射的结。在第39和60天，从每组收集血液并且利用四聚体测定进行CD8+T细胞的分析。应答与幼稚的同窝对照小鼠(n＝5)相比较。
在第41和63天，处死来自每组的选定动物并且除去脾脏用于对脾细胞细胞混悬液的IFNγ ELISPOT分析。
在第62天，来自每组的选定动物经静脉内注射接受CFSE-标记的624.38人黑色素瘤细胞，其表达所有四种肿瘤相关抗原，并且在免疫的小鼠中被用作SSX2、NY-ESO-1、酪氨酸酶和Melan A特异性CTLs的靶标。
将质粒配制在临床缓冲液中(在H2O中127mM NaCl，2.5mM Na2HPO4，0.88mM KH2PO4，0.25mMNa2EDTA，0.5％ETOH；2mg/ml每种质粒，总4mg/ml)。Melan-A 26-35(A27Nva)，酪氨酸酶369-377(V377Nva)和SSX241-49(A42V)类似物以1.0mg/ml配制在PBS中。以0.5mg/ml的浓度在包含5％DMSO的PBS中制备用于免疫的NY-ESO 157-165(L158Nva，C165V)肽类似物。利用BD FACS Calibur流式细胞仪收集细胞计量数据并且利用CellQuest软件通过选通淋巴细胞群体而分析。PBMCs用FITC缀合的大鼠抗-小鼠CD8a(Ly-2)单克隆抗体(BD Biosciences，553031)和MHC四聚体：HLA-A*0201 SSX2(KASEKIFY(SEQ ID NO：11))-PE MHC四聚体(Beckman Coulter，T02001)，HLA-A*0201 NY-ESO(SLLMWITQC)(SEQID NO：12)-APC MHC四聚体(Beckman Coulter，T02001)，HLA-A*0201Melan-A(ELAGIGILTV(SEQ ID NO：1))-PE MHC四聚体(Beckman Coulter，T02001)或HLA-A*0201酪氨酸酶(YMDGTMSQV(SEQ ID NO：13))-APCMHC四聚体(Beckman Coulter，T02001)共-染色。
如下进行IFN-γELISpot分析。在第27和62天从安乐死的动物摘除脾脏，并且通过密度离心(Lympholyte Mammal，Cedarlane Labs)分离单核细胞且将其重悬浮于HL-1培养基中。将脾细胞(每孔5或3×105细胞)与10μg Melan-A26-35 A27L、酪氨酸酶369-377、SSX2 41-49或NY-ESO-1157-165肽在96孔滤膜平皿(Multiscreen IP membrane 96-孔平皿，Millipore)中一式三份温育。显影之前将样品在37℃，5％CO2和100％湿度下温育42小时。将小鼠IFN-γ包被抗体用于在与脾细胞温育之前包被滤器并且添加生物素化的检测抗体以在溶细胞和将细胞用水从滤器冲下后显影信号(IFN-γ抗体对，Ucytech)。将来自Ucytech的GABA缀合物和专有底物用于IFN-γ斑点显影。在显影后24小时，在AID International平皿读数器上利用标定IFN-γ斑点分析的ELISpot阅读软件版本3.2.3测量免疫的动物中的CTL应答。
在第61天如下进行体内细胞毒性测定。人624.38(HLA A*0201pos)培养的黑色素瘤肿瘤细胞用CFSEhi(Vybrant CFDA SE细胞示踪试剂盒，MolecularProbes)荧光染色(1.0μM15分钟),624.28 HLA-A2(HLA A*0201neg)用CFSElo荧光染色(0.1μM15分钟)。在高四聚体水平基础上选择的来自每组(组1、2和3)的两只小鼠和经静脉内注射接受与等量CFSElo-标记的624.28(HLAA*0201neg)混合的20×106CFSEhi-标记的624.38(HLA A*0201pos)人黑色素瘤细胞的2只幼稚对照小鼠分成2小时间隔递送的两等分。在大约14小时后通过处死小鼠，除去肺组织，制备单细胞混悬液并且通过流式细胞术测量CFSE荧光而测定HLAA*0201pos人靶细胞的特异性消除。如上所示计算特异性溶解的百分比。
在该方案的各个点评估获得的免疫应答。图32显示了第四次质粒注射后7天通过四聚体分析判断而获得的应答，其为所有三组共有的。观察到对所有除了酪氨酸酶表位的显著的应答。揭示Melan-A 26-35和NY-ESO-1 157-165为优势表位，为了产生更平衡的四价免疫应答，通过将酪氨酸酶V377Nva和SSX2 A42V肽表位类似物施用于组2和3而增强对次优势表位的应答。组1接受用质粒混合物的另一轮免疫。如图33所示用质粒的进一步免疫(组1)仅加强对优势表位的应答，相反对应于两种次优势表位的肽的施用对所有四种表位产生显著的和更平衡的应答。图34显示了所选择的单个动物的应答，表明可产生真正的四价应答。在第27天处死的小鼠亚组的IFN-γELISpot分析证实从四聚体数据观察到的常规模式(图35A)。另一组小鼠在第59天进行进一轮的增强后在第62天处死并且进行IFN-γELISpot分析(图35b)。对于组1最后一轮免疫再次利用质粒混合物并且应答的模式维持与在早一轮后观察到的类似。仅利用对应于次优势表位的那些肽(组2)维持对四种表位的相对平衡的应答。对应于所有四种表位的肽施用组3。虽然仍然观察到对那些表位的显著的应答，Melan-A表位的优势程度在明显损失对酪氨酸酶表位应答的情况下再次呈现。应当注意的是因为处死动物的组在两个不同时间点的常规应答，图35A和B中所述的应答的绝对强度并不可直接比较。还通过用表达所有四种靶抗原的CFSE标记的人肿瘤细胞激发而评估体内的溶细胞活性。这些肿瘤细胞为细胞系624.38的衍生物，其天然表达SSX2、PRAME、酪氨酸酶和Melan-A，其已利用质粒载体进行转化而同样稳定地表达NY-EOS-1。如在通过ELISpot分析其仅具有背景水平的四聚体或IFN-γ应答的幼稚小鼠中可预期的，与HLA-A2-对照相比，不存在HLA-A2+肿瘤细胞的特异性消耗(图36A)。然而在具有显著四价应答的小鼠中观察到特异性的消耗，并且获得的应答越平衡，结果越好。比较通过四聚体和ELISpot分析见到的图36B(71％特异性溶解)和36C(95％特异性溶解)的表位特异性应答。在具有显著单价应答的小鼠也没有观察到特异性溶解。由于单价应答产生的体内细胞毒性参见以上(实施例7中)，但该实验中的靶细胞具有明显更强的表位表达。因此，在此看到多价应答克服了低靶抗原表达水平的保护作用。
实施例35.诱导多价免疫的通用方法。
该方法可包括下列步骤(图37中描述)：
鉴定来自不同抗原或相同抗原的表位。所述表位可具有相对于彼此的优势/劣势关系(例如，由于宽泛的不同程度的表达或呈递，TCR技能偏差等等)，或在其天然的环境中为共显性的。
回收与所述表位有关的序列并且设计在相同的阅读框架或相同的载体中包含这些表位的表达载体。与其天然的环境相比，新的环境可以建立或改变相互之间的免疫优势/劣势的关系。
用导致起始应答的载体免疫可使一种特异性(优势表位)相对于彼此占据优势地位。
通过施用相应的肽增强对次优势表位的应答。肽可以是天然序列或其类似物。该肽可单独或同时与对应于优势和/或次优势表位的其它肽一起施用于相同的位点，或更优选在不同的位点。
在实施例中和在本文别处所述的任何方法可以并且被改进以包括不同的组合物、抗原、表位、类似物等等。例如，可利用任何其它的癌抗原。此外，许多表位可互换，并且可利用包括在此公开的，已描述的或引入的那些的表位类似物。该方法可用于产生免疫应答，包括对各种疾病和病症的多价免疫应答。
本发明的许多改变和替代要素已经公开。更进一步的改变和替代要素对本领域技术人员是显而易见的。本发明不同的实施方案可明确包括或排除任何这些改变或要素。
本文引用的每一参考文献在此整体引入作为参考。
序列表
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<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成制备的氨基酸序列
<400>  1
Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
 1               5                   10
<210>  2
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
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<223>  合成制备的氨基酸序列
<400>  2
Lys Ala Ser Glu Lys Ile Phe Tyr Val
 1               5
<210>  3
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<212>  PRT
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<223>  合成制备的氨基酸序列
<400>  3
Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu
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<212>  PRT
<213>  人工序列
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<223>  合成制备的氨基酸序列
<400>  4
Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val
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<212>  PRT
<213>  人工序列
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<223>  合成制备的氨基酸序列
<400>  5
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<223>  合成制备的氨基酸序列
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<220>
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<223>  Xaa＝Nva
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<223>  合成制备的氨基酸序列
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  9
<223>  Xaa＝Nva
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Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Xaa
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<220>
<223>  合成制备的氨基酸序列
<400>  12
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
 1               5
<210>  13
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成制备的氨基酸序列
<400>  13
Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val
 1                   5

Claims (30)

1.一种免疫方法，包括：将包含第一免疫原的第一组合物和包含第二免疫原的第二组合物递送至哺乳动物，所述第一免疫原包含或编码第一抗原的至少一部分，所述第二免疫原包含或编码第二抗原的至少一部分，并且随后将包含第一肽的第三组合物直接施用于所述哺乳动物的淋巴系统，其中所述第一肽与所述第一抗原的表位对应，其中所述第三组合物与所述第一或第二组合物不同。
2.权利要求1的方法，其中所述第一和第二组合物相同。
3.权利要求2的方法，其中单个大分子包括所述的第一和第二免疫原。
4.权利要求1的方法，进一步包括在所述递送步骤之后将包括第二肽的第四组合物直接施用于所述哺乳动物的淋巴系统，其中所述第二肽与所述第二抗原的表位对应，其中所述第四组合物与所述第一或第二组合物不同。
5.权利要求4的方法，其中所述第三和第四组合物每种包括所述第一和第二肽。
6.权利要求4的方法，其中将所述第一和第二组合物递送至分开的部位。
7.权利要求4的方法，其中将所述第一和第二肽施用到分开的部位。
8.权利要求4的方法，其中将所述第一免疫原递送至与所述第一肽施用至的相同的部位。
9.权利要求4的方法，所述第一和第二肽大约同时施用。
10.权利要求4的方法，所述第一和第二肽在不同的日子施用。
11.权利要求1的方法，其中所述第一抗原选自由酪氨酸酶、Melan-A、SSX-2、NY-ESO-1、PRAME、PSMA、VEGFR2、VEGF-A和PLK1组成的组。
12.权利要求1的方法，其中直接施用于淋巴系统包括施用于腹股沟淋巴结。
13.权利要求1的方法，其中免疫包括CTL应答的诱导。
14.权利要求1的方法，其中所述递送步骤包括与所述施用步骤的第一肽相同的表位肽的递送，并且其中所述第三组合物与所述第一或第二组合物至少通过包括更大剂量的表位肽而不同。
15.权利要求1的方法，其中所述递送步骤包括递送免疫增强剂。
16.权利要求15的方法，其中所述免疫增强剂与所述第一组合物和所述第二组合物的至少一种一起递送。
17.一种免疫方法，包括：
将引发对多个抗原的免疫应答的工具(means)递送至哺乳动物；并且随后将一种或多种肽直接施用于所述哺乳动物的淋巴系统，其中所述肽的每种与所述抗原其中之一的表位对应，其中所述施用步骤中所用的组合物与所述递送步骤中所用的任何组合物不同。
18.权利要求17的方法，其中所述工具(means)引发对3或4种抗原的免疫应答。
19.一种免疫方法，包括：
将包括或编码多个抗原的至少一部分的一种或多种组合物递送至哺乳动物；和
随后用于增强对所述抗原应答的步骤。
20.一种治疗方法，其包括根据权利要求1方法的免疫的重复循环。
21.权利要求20的方法，其中循环重复持续足够的时间以维持免疫应答有效从而实现医疗需求。
22.权利要求21的方法，其中循环重复提高免疫应答的多价性。
23.一组用于诱导哺乳动物中免疫应答的免疫原组合物，其包括对2种或更多抗原的每种的1份或更多的引发剂量以及至少1份增强剂量，其中对每种抗原的引发剂量包括免疫原或编码所述免疫原的核酸，其中所述免疫原包括所述抗原的至少一部分；和免疫增强剂；并且其中所述增强剂量包括肽表位。
24.权利要求23的组，其中至少一种组合物为多价的。
25.权利要求23的组，其中编码所述免疫原的核酸进一步包括用作免疫增强剂的免疫刺激序列。
26.权利要求23的组，其中所述免疫增强剂选自由TLR配体、免疫刺激序列、包含CpG的DNA、dsRNA、内吞-模式识别受体(PRR)配体、LPS、皂树皂苷、苯甲酸衍生物(tucaresol)和促炎症细胞因子组成的组。
27.权利要求23的组，其中所述剂量适于结内递送。
28.权利要求27的组，其中所述引发剂量的至少一种包括核酸。
29.权利要求28的组，其中核酸一天的剂量约为25-2500μg。
30.权利要求27的组，其中所述增强剂量约为5-5000μg肽/千克指定受体。
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