JP2003521245A - ペプチドおよび核酸組成物を使用する、前立腺癌抗原に対する細胞性免疫応答の誘導 - Google Patents

ペプチドおよび核酸組成物を使用する、前立腺癌抗原に対する細胞性免疫応答の誘導

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エステバン セリス，
エリッサ ケオグ，
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、抗原が、Ｔ細胞によって認識される機構に関する、本発明者らによる知見を使用することによって、前立腺癌関連抗原エピトープを同定し、そして前立腺癌関連抗原エピトープを調製し、そして前立腺癌関連抗原を保有する腫瘍に対して指向される、エピトープベースのワクチンを開発する。より詳細には、本出願は、薬学的組成物に関する本発明者らの知見、ならびに癌の予防および癌の処置において使用する方法に関する本発明者らの知見を伝える。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （Ｉ．発明の背景） 増加中の証拠群が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が腫瘍細胞に対する免疫
応答において重要であることを示唆する。ＣＴＬは、ほとんどすべての有核細胞
の表面上で発現されるＨＬＡクラスＩ分子の状況でペプチドエピトープを認識す
る。内因的に合成された腫瘍抗原の細胞内プロセシング後、抗原由来ペプチドエ
ピトープが、小胞体においてクラスＩ ＨＬＡ分子に結合し、次いで、生じた複
合体が、細胞表面に輸送される。ＣＴＬは、このペプチド−ＨＬＡクラスＩ複合
体を認識し、次いでこのことは、このＨＬＡ−ペプチド複合体を保有する細胞の
、直接このＣＴＬによる破壊、および／または非破壊的機構の活性化（例えば、
免疫応答を増強しそして腫瘍細胞の破壊を促進するリンホカイン（例えば、腫瘍
壊死因子α（ＴＮＦ−α）またはインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の活性化）を
介する破壊を生じる。
【０００２】 腫瘍特異的ヘルパーＴリンパ球ＨＴＬもまた、有効な抗腫瘍免疫を維持するた
めに重要であることが公知である。抗腫瘍免疫におけるその役割が、これらの細
胞がＣＴＬおよび抗体応答の誘導の補助を提供するだけでなく、エフェクター機
能も提供するように作用する動物モデルにおいて示されており、これは、直接の
細胞接触により媒介され、そしてリンホカイン（例えば、ＩＦＮγおよびＴＮＦ
−α）の選択によっても媒介される。
【０００３】 有効な腫瘍ワクチンの開発における基本的難題は、生じ得る免疫抑制または免
疫寛容である。従って、進行を妨げそして／または腫瘍を除去するに十分な範囲
および強さの免疫応答を惹起するワクチン実施形態を確立する必要が存在する。
【０００４】 本発明者らが記載しているようなエピトープアプローチは、それが、１つ以上
の標的腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の別個の領域からの種々のＣＴＬエピトープ、Ｈ
ＴＬエピトープ、および抗体（必要な場合）エピトープを単一のワクチン組成物
に組み込み可能にするという点で、この難題に対する解決を示す。このような組
成物は、複数のドミナント（ｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープおよびサブドミナン
トエピトープを同時に標的とし得、それにより種々の集団における有効な免疫を
達成するために使用され得る。
【０００５】 前立腺癌は、男性において最も一般的な悪性疾患である。今の治療（すなわち
、男性ホルモン遮断、抗男性ホルモン撤退、および他の二次的なホルモン治療と
組み合わせられる化学療法）は、限定的な成功を受けている。従って、より効能
のある治療を開発することが必要である。本発明の多エピトープの免疫治療ワク
チン組成物は、この必要性を満たす。
【０００６】 前立腺癌に関連する抗原として、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的
膜抗原（ＰＳＭ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、およびヒトカリクレ
イン２（ｈＫ２またはＨｕＫ２）が挙げられる。これらの抗原は、本発明のポリ
エピトープワクチン組成物に対して重要な抗原標的を示す。
【０００７】 ＰＳＭはまた、前立腺癌治療に対して重要な候補である。これは、前立腺腺癌
において高レベルで発現される２型膜タンパク質である。発現のレベルは、転移
およびホルモン治療に対して難治性である癌において増加する。ＰＳＭは、一般
的に正常な組織上で存在しないが、結腸陰窩および十二指腸において低いレベル
が検出されており、そしてＰＳＭは、正常な雄性血清および精液において検出さ
れ得る（例えば、Ｓｉｌｖｅｒら、Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．３：８１−
８５，１９９７を参照のこと）。ＰＳＭに対するＣＴＬ応答はまた、文書で説明
されている（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ２９：３７１−３８０
，１９９６；およびＳａｌｇａｌｌｅｒら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３５：１４４−
１５１，１９９８を参照のこと）。
【０００８】 ＰＡＰは、前立腺における細胞によって専ら分泌される組織特異的な分化抗原
である（例えば、Ｌａｍら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ １５：１３−２１，１９８９を
参照のこと）。ＰＡＰは、血清において検出され得、レベルは、前立腺癌を有す
る患者において増加する（例えば、Ｊａｃｏｂｓら、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂｌ．Ｃ
ａｎｃｅｒ １５：２９９−３６０，１９９１を参照のこと）。ＰＡＰタンパク
質配列は、タンパク質中の至る所に分布される相同性領域を有する他の酸性ホス
ファターゼと最高で４９％の配列相同性を有する。従って、ＰＡＰ特異的エピト
ープは、同定され得、そしていくつかの異なるＣＴＬエピトープが記載されてい
る（例えば、Ｐｅｓｈｗａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３６：１２９−１３８，１９
９８を参照のこと）。
【０００９】 ｈＫ２タンパク質は、ポリペプチドの翻訳後プロセシングに関与する機能的な
セリンプロテアーゼである。ｈＫ２タンパク質は、前立腺上皮の側で専ら発現さ
れ、そして良性前立腺癌組織および悪性前立腺癌組織の両方において見出される
。正常な前立腺細胞の５０％において発現されるが、ｈＫ２を発現する細胞のパ
ーセンテージは、腺癌および前立腺上皮内の新形成（ＰＩＮ）において増加する
（例えば、Ｄａｒｓｏｎら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ４９：８５７−８６２，１９９７
を参照のこと）。前立腺ガン細胞上のこの抗原の好ましい発現に基づいて、ｈＫ
２はまた、免疫治療について重要な標的である。
【００１０】 前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）（ｈＫ３ともいわれる） は、分泌されるセリンプロテアーゼおよびタンパク質のカリクレインファミリー
のメンバーである。ＰＳＡ遺伝子は、ｈＫ２遺伝子と８０％の相同性であるが、
ｈＫ２の組織発現は、ＰＳＡと独立して調節される（例えば、Ｄａｒｓｏｎら、
Ｕｒｏｌｏｇｙ ４９：８５７−８６２，１９９７を参照のこと）。ＰＳＡの発
現は、前立腺上皮細胞（良性および悪性の両方）に対して制限される。この抗原
は、ほとんどの前立腺癌患者の血清および精液血漿において検出され得る。ＰＳ
Ａ由来のいくつかのＴ細胞エピトープは、同定されており、そして免疫原性であ
ることが見出されており、そして抗体応答は、患者において報告されている（例
えば、Ｃｏｒｒｅａｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３１８６，１９９８
；およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ５１：１５０−１５７，１９
９８を参照のこと）。従って、この前立腺制限発現および免疫応答を刺激する能
力に基づいて、ＰＳＡは、前立腺癌の免疫治療に対する誘引標的である。
【００１１】 この節において提供される情報は、本出願の出願日時点で現在理解されている
技術水準を開示することが意図される。本出願の優先日後に得られた情報は、こ
の節に含まれる。従って、この節の情報は、いかようにも、本発明の優先日で線
引きすることが意図されない。
【００１２】 （ＩＩ．発明の要旨） 本発明は、例えば、ＴＡＡに対するエピトープベースワクチンを開発するため
に、抗原がＴ細胞によって認識される機構についての本発明者らの知識を適用す
る。より詳細には、本願は、診断的および／または薬学的組成物における含有物
のためのエピトープならびに、免疫応答の評価および癌の処置かつ／予防に対す
るエピトープの使用方法を同定する。
【００１３】 このエピトープベースワクチンの使用は、特に、ワクチン組成物における抗原
全体の使用と比較した場合に、現在のワクチンを超えるいくつかの利点を有する
。例えば、抗原全体中に存在し得る免疫抑制エピトープが、エピトープベースワ
クチンの使用により回避され得る。このような免疫抑制エピトープは、例えば、
抗原全体におけるイムノドミナントエピトープに対応し得、これは、非ドミナン
ト領域からペプチドエピトープを選択することによって回避され得る（例えば、
Ｄｉｓｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３１５１〜３１５８、１９９６を
参照のこと）。
【００１４】 エピトープベースワクチンのアプローチのさらなる利点は、選択されたエピト
ープ（ＣＴＬおよびＨＴＬ）を組み合わせる能力であり、さらに（例えば、増強
された免疫原性を達成する）これらのエピトープの組成を改変する能力である。
従って、免疫応答は、標的疾患について適切なように調節され得る。この応答の
類似の操作は、従来のアプローチでは可能でない。
【００１５】 エピトープベース免疫刺激ワクチンの別の主な利点は、その安全性である。そ
れ自体の固有の生物学的活性を有し得る病原菌（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｇｅ
ｎｔ）またはタンパク質抗原全体によって引き起こされる、可能性のある病理学
的副作用は、排除される。
【００１６】 エピトープベースワクチンはまた、同じ病原体（「病原体」とは、病原菌また
は腫瘍関連分子であり得る）由来の複数の選択された抗原に対して免疫応答を指
向し焦点を合わせる能力を提供する。従って、特定の病原体に対する免疫応答に
おける患者間の変動性は、ワクチン組成物に、この病原体由来の複数の抗原由来
のエピトープを含めることによって軽減され得る。
【００１７】 さらに、エピトープベース抗腫瘍ワクチンはまた、複数の腫瘍関連分子に由来
するエピトープを組み合わせる機会を提供する。従って、この能力は、所定の腫
瘍型について広く標的とする抗腫瘍ワクチンを開発する場合に生じる腫瘍間の変
動性という問題に取り組み得、そしてまた、抗原損失に起因する腫瘍の逸脱の可
能性を減少し得る。例えば、１人の患者中の乳癌腫瘍は、別の患者中の乳癌腫瘍
と異なる標的ＴＡＡを発現し得る。複数のＴＡＡに由来するエピトープが、両方
の乳癌腫瘍を標的とするポリエピトープワクチンに含まれ得る。
【００１８】 しかし、広く効果的なエピトープベース免疫療法剤の開発に対する最も困難な
障壁の１つは、ＨＬＡ分子の極度な多型性であった。今日まで、非遺伝学的偏向
がない有効な集団適用範囲は、かなり複雑な課題であり；このような適用範囲は
、各々個々のＨＬＡ対立遺伝子に対応するＨＬＡ分子に特異的なエピトープを使
用することを必要とした。従って、民族的に多様な集団をカバーするためには、
実行不可能に多くの数のエピトープを使用しなければならなかった。従って、エ
ピトープベースワクチンにおける使用のための、複数のＨＬＡ抗原分子が結合し
たペプチドエピトープの必要性が存在していた。結合するＨＬＡ抗原分子数が多
いほど、ワクチンによる集団の適用範囲の広さは大きくなる。
【００１９】 さらに、より詳細に本明細書中に記載されるように、ペプチド結合特性を（例
えば、複数のＨＬＡ抗原に結合し得るペプチドが、免疫応答を刺激する親和性で
複数のＨＬＡ抗原に結合するように）調節する必要性が存在していた。免疫原性
に相関する親和性で１つより多くＨＬＡ対立遺伝子によって拘束されるエピトー
プの同定が、十分な集団適用範囲を提供するため、そしてその集団の多様な部分
において感染を予防または排除するに十分に強力な応答の誘発を可能にするため
に、重要である。このような応答はまた、広範な多くのエピトープを標的し得る
。本明細書中に開示される技術は、このような好ましい免疫応答を提供する。
【００２０】 好ましい実施形態において、本発明のワクチン組成物に含むためのエピトープ
は、既知の抗原のタンパク質配列を、モチーフ保有エピトープまたはスーパーモ
チーフ保有エピトープの存在について評価するプロセスによって、選択される。
次いで、モチーフ保有エピトープまたはスーパーモチーフ保有エピトープに対応
するペプチドを合成し、そしてそれらのペプチドを、その選択されたモチーフを
認識するＨＬＡ分子に結合する能力について試験する。中程度の親和性または高
い親和性（すなわち、ＨＬＡクラスＩ分子ついては、ＩＣ５０（またはＫＤ値）
５００ｎＭ以下、またはＨＬＡクラスＩＩ分子については、ＩＣ５０１０００ｎ
Ｍ以下で結合するこれらのペプチドを、ＣＴＬ応答またはＨＴＬ応答を誘導する
それらの能力についてさらに評価する。免疫原性ペプチドエピトープを、ワクチ
ン組成物に含むために選択する。
【００２１】 スーパーモチーフ保有ペプチドを、ＨＬＡスーパータイプファミリー内の複数
の対立遺伝子に結合する能力について、さらに試験し得る。さらに、ペプチドエ
ピトープを、ＨＬＡスーパータイプ内の複数の対立遺伝子に対する結合親和性お
よび／またはこれら複数の対立遺伝子に結合する能力を改変するために、アナロ
グ化し得る。
【００２２】 本発明はまた、既知のＨＬＡ型を有する患者において、ＴＡＡに対する免疫応
答をモニターまたは評価するための方法を含む、実施形態を包含する。このよう
な方法は、患者由来のＴリンパ球サンプルを、ＴＡＡエピトープを含むペプチド
組成物と共にインキュベートする工程、および、このペプチドに結合するＴリン
パ球の存在について検出する工程を包含し、このＴＡＡエピトープは、スーパー
モチーフまたはモチーフを含み、そしてその患者に存在する少なくとも１つのＨ
ＬＡ対立遺伝子の産物を結合するアミノ酸配列を有する。ＣＴＬペプチドエピト
ープは、例えば、この型の分析のためのテトラマー複合体の成分として使用され
得る。
【００２３】 本発明に従うペプチドエピトープを規定するための代替的様式は、特定の対立
遺伝子特異的ＨＬＡ分子または対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子のグループへの結合
に相関される、物理的特性（例えば、長さ；一次構造；または電荷）を記載する
ことである。ペプチドエピトープを規定するためのさらなる様式は、ＨＬＡ結合
ポケットの物理的特性またはいくつかの対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合ポケットに
共有される特性（例えば、ポケットの形状および電荷分布）を記載すること、お
よびこのペプチドエピトープがポケット（単数または複数）に適合しそして結合
することを記載することである。
【００２４】 以下の議論から明らかなように、他の方法および実施形態もまた意図される。
さらに、本明細書中の方法のいずれかによって生成された新規合成ペプチドもま
た、本発明の一部である。
【００２５】 （ＩＩＩ．図面の簡単な説明） 適用されず。
【００２６】 （ＩＶ．発明の詳細な説明） 本発明のペプチドエピトープおよび対応する核酸組成物は、ＣＴＬ応答または
ＨＴＬ応答の生成を刺激することによって、ＴＡＡに対する免疫応答を刺激する
ために有用である。これらのペプチドエピトープは、ネイティブＴＡＡタンパク
質アミノ酸配列に直接的または間接的に由来し、ＨＬＡ分子に結合し得そしてＴ
ＡＡに対する免疫応答を刺激し得る。分析されるＴＡＡタンパク質の完全配列は
、Ｇｅｎｂａｎｋより入手され得る。以下に提供する開示から明らかなように、
ペプチドエピトープおよびそのアナログはまた、配列情報から容易に決定され得
、配列情報は、今後、以前に未知であった特定のＴＡＡの改変体について発見さ
れるかもしれない。
【００２７】 標的ＴＡＡの一覧としては、以下の抗原が挙げられるが、これらに限定されな
い：ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ−１１、ＭＡＧＥ−Ａ１０
、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＬＡＧＥ−１、ＣＡＧ−３
、ＤＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ１８、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＵＭ−１、
ＣＤＫ４、ＢＲＣＡ１、ＮＹ−ＬＵ−１、ＮＹ−ＬＵ−７、ＮＹ−ＬＵ−１２、
ＣＡＳＰ８、ＲＡＳ、ＫＩＡＡ−２−５、ＳＣＣ、ｐ５３、ｐ７３、ＣＥＡ、Ｈ
ｅｒ２／ｎｅｕ、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ２、ｇｐ
７５／ＴＲＰ１、カリクレイン、ＰＳＭ、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＴ１−１、Ｂ−カ
テニン、ＰＲＡＭＥ、テロメラーゼ、ＦＡＫ、サイクリンＤ１タンパク質、ＮＯ
ＥＹ２、ＥＧＦ−Ｒ、ＳＡＲＴ−１、ＣＡＰＢ、ＨＰＶＥ７、ｐ１５、葉酸レセ
プターＣＤＣ２７、ＰＡＧＥ−１およびＰＡＧＥ−４。これらの抗原由来のエピ
トープは、特異的な腫瘍型（例えば、前立腺腫瘍）を標的とする、または腫瘍の
複数の型を標的とする１つの別のものと組み合わせて使用され得る、 本発明のペプチドエピトープは、以下で議論されるように、多くの方法で同定
された。特定のアミノ酸残基を改変して、変化した免疫原性を示すペプチドアナ
ログを作製することによって、アナログペプチドを誘導し、そしてＨＬＡ分子の
結合活性が調節されることもまた、より詳細に議論する。さらに、本発明は、種
々の対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子と相互作用し得るエピトープベ
ースワクチンに、先行技術のワクチンよりも広い集団適用範囲を提供させ得る、
組成物および組成物の組み合わせを提供する。
【００２８】 （ＩＶ．Ａ．定義） 本発明は、アルファベット順に列挙した、以下の定義を参照してより良好に理
解され得る。
【００２９】 本明細書中で使用される場合、「構築物」は、一般に、天然に存在しない組成
物を示す。構築物は、核酸またはアミノ酸についての合成技術（例えば、組換え
ＤＮＡの調製および発現または化学合成技術）によって、生成され得る。構築物
はまた、結果としてその形態が天然において見い出されないように、ある材料へ
の別の材料の付加または添加（ａｆｆｉｌｉａｔｉｏｎ）によって生成され得る
。
【００３０】 「コンピューター」または「コンピューターシステム」は、一般に、以下を備
える：プロセッサー；少なくとも１つの情報記憶／検索装置（例えば、ハードド
ライブ、ディスクドライブまたはテープドライブなど）；少なくとも１つの入力
装置（例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーン、またはマイクロホンな
ど）；およびディスプレイ構造。さらに、コンピューターは、ネットワークと連
絡する通信チャネルを備え得る。このようなコンピューターは、多かれ少なかれ
、上記に列挙したものを備え得る。
【００３１】 「交差反応結合」とは、１より多いＨＬＡ分子がペプチドに結合することを示
し；同義語は、縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）結合である。
【００３２】 「潜在（ｃｒｉｐｔｉｃ）エピトープ」は、単離されたペプチドでの免疫によ
って応答を誘導するが、そのエピトープを含むインタクトなタンパク質全体が抗
原として使用される場合に、その応答は、インビトロで交差反応性でない。
【００３３】 「ドミナント（ｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープ」は、ネイティブ抗原全体での
免疫に際して免疫応答を誘導するエピトープである（例えば、Ｓｅｒｃａｒｚら
、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：７２９−７６６，１９９３を参照
のこと）。このような応答は、単離されたペプチドエピトープとは、インビトロ
で交差反応性である。
【００３４】 特定のアミノ酸配列に関して、「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによ
る認識に関与するアミノ酸残基のセットであるか、またはＴ細胞の状況下では、
Ｔ細胞レセプタータンパク質および／または主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ
）レセプターによる認識に必要な残基である。インビボまたはインビトロでの免
疫系の設定において、エピトープは、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたは
ＨＬＡ分子によって認識される部位を共に形成する、分子の集団的特徴（例えば
、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造および三次ペプチド構造および電荷のよ
うな）である。本開示全体を通して、エピトープおよびペプチドは、しばしば、
交換可能に使用される。
【００３５】 本発明のエピトープおよびさらなるアミノ酸を含むタンパク質またはペプチド
分子が、本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。特定の実施形態に
おいて、さもなければ本明細書で規定されるような構築物ではないとする、本発
明のペプチドの長さに関する制限が存在する。長さが制限される実施形態は、本
発明のエピトープを含むタンパク質／ペプチドがネイティブ配列と１００％同一
性を有する領域（すなわち、一連の連続するアミノ酸）を含む場合に、生じる。
例えば、天然分子全体に対する読み取り枠由来の具陳したエピトープの定義を回
避するために、ネイティブペプチド配列との１００％同一性を有する任意の領域
の長さが制限される。従って、本発明のエピトープおよびネイティブペプチド配
列との１００％同一性を有する領域を含む（そして、さもなければ構築物ではな
い）ペプチドについて、ネイティブ配列に対する１００％同一性を有するその領
域は、一般に、６００アミノ酸以下、しばしば、５００アミノ酸以下、しばしば
、４００アミノ酸以下、しばしば、２５０アミノ酸以下、しばしば、１００アミ
ノ酸以下、しばしば、８５アミノ酸以下、しばしば、７５アミノ酸以下、しばし
ば、６５アミノ酸以下、そしてしばしば、５０アミノ酸以下の長さを有する。特
定の実施形態において、構築物ではない本発明の「エピトープ」は、ネイティブ
ペプチド配列に対して１００％同一性を有する５１アミノ酸未満（任意の変化量
（５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９
、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７
、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５
、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５）のアミノ酸から５アミ
ノ酸まで）の領域を有するペプチドに含まれる。
【００３６】 ６００アミノ酸より長い特定のペプチドまたはタンパク質配列は、本発明の範
囲内である。このような長い配列は、それらが、ネイティブペプチド配列との１
００％同一性を有する６００アミノ酸よりも大きい任意の連続配列を含まない限
り、または、６００アミノ酸より長い場合には、それらが構築物である限り、本
発明の範囲内にある。ネイティブ配列に対応する５以下連続する残基を有する任
意のペプチドについては、本発明の範囲内にあるための、そのペプチドの最大長
さに対する制限は存在しない。本発明のＣＴＬエピトープは、６００未満の任意
の変化分の残基長から８アミノ酸残基であることが、現在では好ましい。
【００３７】 「ヒトリンパ球抗原」または「ＨＬＡ」は、ヒトクラスＩまたはクラスＩＩの
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質（例えば、Ｓｔｉｔｅｓら、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８版、Ｌａｎｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｓ Ａ
ｌｔｏｓ，ＣＡ（１９９４）を参照のこと）である。
【００３８】 本明細書中で使用される場合、「ＨＬＡスーパータイプまたはファミリー」と
は、共有するペプチド結合特異性に基づいてグループ化したＨＬＡ分子のセット
を記載する。特定のアミノ酸モチーフを保有するペプチドに対して幾分類似した
結合親和性を共有するＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡスーパータイプにグループ
化される。用語ＨＬＡスーパーファミリー、ＨＬＡスーパータイプファミリー、
ＨＬＡファミリーおよびＨＬＡ ｘｘ様分子（ここで、ｘｘは、特定のＨＬＡ型
を示す）は、同義である。
【００３９】 本開示全体を通して、結果を、用語「ＩＣ５０」で表す。ＩＣ５０は、参照ペ
プチドの結合の５０％阻害が観察される、結合アッセイにおけるペプチドの濃度
である。アッセイを行う条件（すなわち、律速のＨＬＡタンパク質濃度および標
識ペプチド濃度）を考慮すると、これらの値は、ＫＤ値と近似する。結合を測定
するためのアッセイは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２０１２７およびＷＯ９
４／０３２０５に、詳細に記載される。ＩＣ５０値が、アッセイ条件が変化する
場合に、そして使用する特定の試薬（例えば、ＨＬＡ調製物など）に依存して、
（しばしば、劇的に）変化し得ることに留意するべきである。例えば、過剰濃度
のＨＬＡ分子は、所定のリガンドの見かけ上測定されるＩＣ５０を増加させる。
【００４０】 あるいは、結合は、参照ペプチドと関連して表される。特定のアッセイが、よ
り高感度またはより低感度になるにつれて、試験するペプチドのＩＣ５０は、幾
分変化し得るが、参照ペプチドに対する結合は、有意には変化しない。例えば、
参照ペプチドのＩＣ５０が１０倍増加するような条件下で行うアッセイにおいて
、試験ペプチドのＩＣ５０値もまた、約１０倍シフトする。従って、あいまい性
を回避するために、ペプチドが良好な結合因子であるか、中程度の結合因子であ
るか、弱い結合因子であるかまたはネガティブな結合因子であるかの評価は、一
般に、標準ペプチドのＩＣ５０と相対的な、そのＩＣ５０に基づく。
【００４１】 結合はまた、以下を使用するアッセイ系を含む、他のアッセイ系を使用して測
定され得る：生細胞（例えば、Ｃｅｐｐｅｌｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９
：３９２，１９８９；Ｃｈｒｉｓｔｎｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６７、
１９９１；Ｂｕｓｃｈら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４３、１９９９０；
Ｈｉｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１８９、１９９１；ｄｅｌ Ｇｕｅ
ｒｃｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５，１９９５）、界面活性剤溶
解物を使用する無細胞系（例えば、Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．２１：２０６９，１９９１）、固定した精製ＭＨＣ（例えば、Ｈｉｌｌら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２８９０，１９９４；Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１５２：４９４６，１９９４）、ＥＬＩＳＡ系（例えば、Ｒｅａ
ｙら、ＥＭＢＯ Ｊ．１１：２８２９，１９９２）、表面プラズモン共鳴（例え
ば、Ｋｈｉｌｋｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５４２５，１９９３
）；高フラックス可溶相アッセイ（ｈｉｇｈ ｆｌｕｘ ｓｏｌｕｂｌｅｐｈａ
ｓｅ ａｓｓａｙ）（Ｈａｍｍｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３５３
，１９９４）、およびクラスＩ ＭＨＣの安定化またはアセンブリの測定（例え
ば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４７６、１９９０；Ｓｃｈ
ｕｍａｃｈｅｒら、Ｃｅｌｌ ６２：５６３、１９９０；Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、
Ｃｅｌｌ ６２：２８５、１９９０；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
４９；１８９６，１９９２）。
【００４２】 本明細書中で使用される場合、ＨＬＡクラスＩ分子に関する「高親和性」とは
、５０ｎＭ以下のＩＣ５０またはＫＤ値での結合として定義され；「中程度の親
和性」とは、約５０ｎＭと約５００ｎＭとの間のＩＣ５０またはＫＤ値での結合
である。ＨＬＡクラスＩＩ分子への結合に関する「高親和性」とは、１００ｎＭ
以下のＩＣ５０またはＫＤ値での結合として定義され；「中程度の親和性」とは
、約１００ｎＭと約１０００ｎＭとの間のＩＣ５０またはＫＤ値での結合である
。
【００４３】 ２以上のペプチド配列の状況下で、用語「同一」またはパーセント「同一性」
とは、配列比較アルゴリズムを使用してかまたは手動の整列化および目視検査に
よって測定されるように、比較ウインドウにわたる最大一致について比較および
整列化した場合に、同じであるかまたは特定のパーセンテージの同一アミノ酸残
基を有する、２以上の配列または部分配列をいう。
【００４４】 「免疫原性ペプチド」または「ペプチドエピトープ」とは、そのペプチドがＨ
ＬＡ分子を結合しそしてＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答を誘導するような
、対立遺伝子特異的モチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドである。従
って、本発明の免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ分子に結合し得、そしてその
後、免疫原性ペプチドが由来する抗原に対する、細胞傷害性Ｔ細胞応答またはヘ
ルパーＴ細胞応答を誘導し得る。
【００４５】 句「単離された」または「生物学的に純粋」とは、そのネイティブ状態におい
て見い出される場合に通常その物質に付随する成分を、実質的または本質的に含
まない物質をいう。従って、本発明に従う単離されたペプチドは、好ましくは、
そのインサイチュ環境下でそのペプチドに通常会合する物質を含まない。
【００４６】 「連結」または「結合」とは、ペプチドを機能的に接続するための当該分野で
公知の任意の方法をいい、これらには、組換え融合、共有結合、ジスルフィド結
合、イオン結合、水素結合、および静電結合が挙げられるが、これらに限定され
ない。
【００４７】 「主要組織適合遺伝子複合体」または「ＭＨＣ」は、生理的免疫応答を担う細
胞性相互作用の制御において役割を担う遺伝子のクラスターである。ヒトにおい
て、ＭＨＣ複合体はまた、ＨＬＡ複合体として公知である。ＭＨＣ複合体および
ＨＬＡ複合体の詳細な説明については、Ｐａｕｌ、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ Ｉ
ＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第３版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１
９９３を参照のこと。
【００４８】 用語「モチーフ」は、規定された長さのペプチドにおける残基のパターンをい
う。一般に、クラスＩ ＨＬＡモチーフについて約８〜約１３アミノ酸およびク
ラスＩＩ ＨＬＡモチーフについて約６〜約２５アミノ酸のペプチドであり、こ
れは、特定のＨＬＡ分子によって認識される。ペプチドモチーフは、代表的には
、各々のヒトＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる各々のタンパク質について
異なり、そして一次アンカー残基および二次アンカー残基のパターンにおいて異
なる。
【００４９】 「陰性な（ｎｅｇａｔｉｖｅ）結合残基」または「有害な（ｄｅｔｅｒｉｏｕ
ｓ）残基」は、ペプチドエピトープにおける特定の位置（代表的には一次アンカ
ー位置ではない）に存在する場合に、対応するＨＬＡ分子に対するペプチドの結
合親和性の減少を生じさせるアミノ酸である。
【００５０】 「非ネイティブ」な配列または「非ネイティブ」な「構築物」は、天然には見
出されない（すなわち、「天然には存在しない」）配列をいう。このような配列
としては、例えば、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅ）されるかさもなくば改変された
ペプチド、およびネイティブなタンパク質配列中では連続しないエピトープを含
むポリエピトープ性（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）組成物が挙げられる。
【００５１】 用語「ペプチド」は、本明細書中において「オリゴペプチド」と相互変換可能
に使用され、（代表的には、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基
との間のペプチド結合によって）互いに連結される一連の残基（代表的にはＬ−
アミノ酸）を示す。本発明の好ましいＣＴＬ誘導ペプチドは、１３以下の残基長
であり、そして通常、約８残基と約１１残基との間（好ましくは９または１０残
基）からなる。好ましいＨＴＬ誘導オリゴペプチドは、約５０残基長未満であり
、そして通常、約６残基と約３０残基との間からなり、より通常には、約１２残
基と２５残基との間、そしてしばしば約１５残基と２０残基との間からなる。
【００５２】 「薬学的に受容可能な」は、一般に、非毒性の、不活性な、および／または薬
理学的に適合性の組成物をいう。
【００５３】 「薬学的賦形剤」は、アジュバント、キャリア、ｐＨ調整剤、および緩衝剤の
ような物質、張度調整剤、湿潤剤、防腐剤などを含む。
【００５４】 「一次アンカー残基」は、免疫原性ペプチドとＨＬＡ分子との間の接触点を提
供することが理解されるペプチド配列に沿った特定位置におけるアミノ酸である
。規定された長さのペプチド内の１〜３個（通常は２個）の一次アンカー残基は
、一般に、免疫原性ペプチドについての「モチーフ」を規定する。これらの残基
は、結合溝（ｇｒｏｏｖｅ）自身の特定のポケットにおいて埋没するこれらの側
鎖を有する、ＨＬＡ分子のペプチド結合溝（ｇｒｏｏｖｅ）と密接に接触して適
合することが理解される。１つの実施形態において、例えば、一次アンカー残基
は、本発明に従って９残基ペプチドエピトープの位置２（アミノ末端位から）お
よびカルボキシル末端位に配置される。各々のモチーフおよびスーパーモチーフ
についての一次アンカー位置は、表１に示される。例えば、アナログペプチドは
、これらの一次アンカー位置における特定の残基の存在または非存在を変更する
ことによって作製され得る。このようなアナログを使用して、特定のモチーフま
たはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を調節する。
【００５５】 「乱雑な認識」は、種々のＨＬＡ分子の状況下において、別々のペプチドが同
一のＴ細胞クローンによって認識されることである。乱雑な認識または結合は、
交差反応性結合と同義である。
【００５６】 「防御免疫応答」または「治療的免疫応答」は、感染性因子または腫瘍抗原由
来の抗原に対するＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答をいい、これは、疾患の
症状または進行を予防するかまたは少なくとも部分的に抑制する。免疫応答はま
た、ヘルパーＴ細胞の刺激によって促進された抗体応答を含み得る。
【００５７】 用語「残基」は、アミド結合またはアミド結合模倣物によってオリゴペプチド
に組み込まれるアミノ酸またはアミノ酸模倣物をいう。
【００５８】 「二次アンカー残基」は、ペプチドにおける一次アンカー位置以外の位置での
、ペプチド結合に影響し得るアミノ酸である。二次アンカー残基は、結合したペ
プチドの中である位置でのアミノ酸の無秩序な分布によって期待されるより有意
に高い頻度で生じる。二次アンカー残基は、「二次アンカー位置」で生じるとい
われる。二次アンカー残基は、高い親和性もしくは中程度の親和性で結合するペ
プチドの中でより高頻度で存在する残基、またはさもなくば高い親和性もしくは
中程度の親和性の結合と関連する残基として同定され得る。例えば、アナログペ
プチドは、これらの二次アンカー位置における特定の残基の存在または非存在を
変更することによって作製され得る。このようなアナログを使用して、特定のモ
チーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を良好に調節する。
【００５９】 「サブドミナント（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープ」は、エピトープを
含む抗原全体での免疫に際して応答をほとんど引き起こさないかまたは全く引き
起こさないが、単離されたペプチドでの免疫によって応答が得られ得るエピトー
プであり、そして（潜在エピトープの場合とは異なり）この応答は、タンパク質
全体を使用してインビトロまたはインビボでの応答をリコール（ｒｅｃａｌｌ）
する場合に、検出される。
【００６０】 「スーパーモチーフ」は、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる
ＨＬＡ分子によって共有されるペプチド結合特異性である。好ましくは、スーパ
ーモチーフ保有ペプチドは、２つ以上のＨＬＡ抗原によって高い親和性または中
程度の親和性（本明細書中に規定される）で認識される。
【００６１】 「合成ペプチド」は、化学合成または組換えＤＮＡ技術のような方法を使用し
てヒトが作製したペプチドをいう。
【００６２】 本明細書中で使用される場合、「ワクチン」は、本発明の１つ以上のペプチド
を含む組成物である。本発明に従うワクチンの実施形態（例えば、１つ以上のペ
プチドのカクテルによって；ポリエピトープ性のペプチドによって含まれる本発
明の１以上のエピトープ；または、このようなペプチドもしくはポリペプチドを
コードする核酸（例えば、ポリエピトープ性のペプチドをコードするミニジーン
（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）））が数多く存在する。「１つ以上のペプチド」は、１〜
１５０の単位整数全体のいずれか（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７
、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２
０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３
２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６
０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１
１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５もしくは１５０または
それより多く）の本発明のペプチドを含み得る。これらのペプチドまたはポリペ
プチドは、必要ならば、例えば、脂質化、標的化配列もしくは他の配列の付加に
よって改変され得る。本発明のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは、細胞傷害性Ｔリ
ンパ球およびヘルパーＴリンパ球の両方の活性化を促進するために、ＨＬＡクラ
スＩＩ結合ペプチドと混合され得るかまたは連結され得る。ワクチンはまた、ペ
プチドでパルス（ｐｕｌｓｅ）された抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含み
得る。
【００６３】 ペプチド化合物を記載するために使用される命名法は、慣用的な実践に従い、
ここで、アミノ基は各々のアミノ酸残基の左（Ｎ末端）そしてカルボキシル基は
右（Ｃ末端）に示される。アミノ酸残基位置がペプチドエピトープにおいて言及
される場合、これらは、エピトープ、または一部分であり得るペプチドもしくは
タンパク質のアミノ末端に近接する位置である位置により、アミノからカルボキ
シルの方向において番号付けられる。本発明の選択された特定の実施形態を示す
形式において、特には示されないが、アミノ末端基およびカルボキシル末端基は
、さもなくば特定されない場合に生理学的ｐＨ値でとる形態である。アミノ酸構
造の形式において、各残基は、一般に、標準的な３文字表記または１文字表記に
よって示される。Ｌ−型のアミノ酸残基は、大文字の１文字または３文字記号の
最初の文字の大文字によって示され、そしてＤ−型を有するこれらのアミノ酸に
ついてのＤ−型は、小文字の１文字または小文字の３文字記号によって示される
。グリシンは、非対称の炭素原子を有さず、そして単に「Ｇｌｙ」またはＧとし
ていわれる。本明細書中で示されるペプチドのアミノ酸配列は、一般的に、標準
的な１文字記号を使用して示される（Ａ，アラニン；Ｃ，システイン；Ｄ，アス
パラギン酸；Ｅ，グルタミン酸；Ｆ，フェニルアラニン；Ｇ，グリシン；Ｈ，ヒ
スチジン；Ｉ，イソロイシン；Ｋ，リジン；Ｌ，ロイシン；Ｍ，メチオニン；Ｎ
，アスパラギン；Ｐ，プロリン；Ｑ，グルタミン；Ｒ，アルギニン；Ｓ，セリン
；Ｔ，トレオニン；Ｖ，バリン；Ｗ，トリプトファン；およびＹ，チロシン）。
これらの記号に加えて、本明細書中で使用される１文字略語「Ｂ」は、α−アミ
ノ酪酸を示す。
【００６４】 （ＩＶ．Ｂ．ＣＴＬ応答およびＨＴＬ応答の刺激） Ｔ細胞が抗原を認識するメカニズムは、過去１０年間に記述されている。免疫
系についての本発明者等の理解に基づいて、広範な集団におけるＴＡＡに対する
治療的または予防的な免疫応答を誘発し得る有効なペプチドエピトープワクチン
組成物を本発明者等は開発してきた。特許請求した組成物の価値および効力を理
解するために、免疫学関連技術についての簡単な概説を提供する。この概説は、
本出願の出願日の時点での、当該分野の目下の理解水準を開示することが意図さ
れる。本出願の優先日後に発生した情報は、本節に含まれる。したがって本節の
情報は、いかなる点でも、本発明に関する優先日を記述するよう意図されない。
【００６５】 ＨＬＡ分子とペプチド抗原との複合体は、ＨＬＡ拘束Ｔ細胞により認識される
リガンドとして作用する（Ｂｕｕｓ，Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ ４７：１０７１，１９
８６；Ｂａｂｂｉｔｔ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７：３５９，１９８５
；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ａ．ａｎｄ Ｂｏｄｍｅｒ，Ｈ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．７：６０１，１９８９；Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．，Ａｎｎｕ．
Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：４０３，１９９３）。単一アミノ酸置換抗原ア
ナログの研究、ならびに内因的結合した天然でプロセシングされたペプチドの配
列決定により、ＨＬＡ抗原分子に特異的に結合するために必要とされるモチーフ
に対応する重要な残基が同定されており、本明細書中に記載され、表Ｉ、表ＩＩ
および表ＩＩＩに示されている（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１６０：３３６３，１９９８；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１７８，１９９５；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、ＳＹＦＰＥ
ＩＴＨＩ、ｈｔｔｐ：／／１３４．２．９６．２２１／ｓｃｒｉｐｔｓ．ｈｌａ
ｓｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍにてウェブを介するアクセス；Ｓｅｔ
ｔｅ，Ａ．ａｎｄ Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１０：４７８，１９９８；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｖ．Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１３，１９９４；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．ａｎｄ Ｇｒｅｙ，
Ｈ．Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：７９，１９９２；Ｓｉｎ
ｉｇａｇｌｉａ，Ｆ．ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：５
２，１９９４；Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７，１９９３
；Ｋｏｎｄｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７−４３１２，１９９５
；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０，１９９
６；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１９９
６；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．ａｎｄ Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ １９９９ Ｎｏｖ；５０（３−４）：２０１−１２，Ｒｅｖｉｅｗも参照の
こと）。
【００６６】 さらにＨＬＡペプチド複合体のＸ線結晶解析は、ペプチドリガンドにより運ば
れたされる残基を対立遺伝子特異的様式で収容するＨＬＡ分子のペプチド結合裂
溝（ｃｌｅｆｔ）内のポケットを明示した。これらの残基は次に、それらが存在
するペプチドのＨＬＡ結合能力を決定する（例えば、Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｒ．、
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５８７，１９９５；Ｓｍｉｔｈら、
Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：２０３，１９９６；Ｆｒｅｍｏｎｔら、Ｉｍｍｕｎｉｔ
ｙ ８：３０５，１９９８；Ｓｔｅｒｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：２４５，
１９９４；Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：
７５，１９９７；Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６４：３３，１９
９３；Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９０：８０５３，１９９３；Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：３６
４，１９９２；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：３６７，１
９９２；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９２７，１９
９２；Ｍａｄｄｅｎら、Ｃｅｌｌ ７０：１０３５，１９９２；Ｆｒｅｍｏｎｔ
，Ｄ．Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９１９，１９９２；Ｓａｐｅｒ，Ｍ．
Ａ．，Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ．２１９：２７７，１９９１を参照のこと）。
【００６７】 したがって、クラスＩ対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合モチーフおよびクラスＩＩ
対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合モチーフの規定、あるいはクラスＩスーパーモチー
フまたはクラスＩＩスーパーモチーフの規定は、特定のＨＬＡ分子を結合する可
能性を有するタンパク質内の領域の同定を可能にする。
【００６８】 本明細書中に開示する結合親和性と免疫原性との相関は、候補ペプチドを評価
する場合に考えられるべき重要な因子であるということを本発明者等は見出した
。したがって、モチーフ検索とＨＬＡ−ペプチド結合アッセイとの組合せにより
、エピトープベースのワクチンのための候補物が同定された。それらの結合親和
性を決定後、さらなる確認作業を実行して、これらのワクチン候補物の中で、集
団適用範囲、抗原性および免疫原性に関して好ましい特徴を有するエピトープを
選択し得る。
【００６９】 免疫原性を評価するために種々の戦略が利用され得る。それらの例を以下に挙
げる： １）正常個体由来の初代Ｔ細胞培養物の評価（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，
Ｐ．Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６０３，１９９５；Ｃｅｌｉｓ，
Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２１０５，１
９９４；Ｔｓａｉ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１７９６，１９９７
；Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：１，１９
９８を参照のこと）。これらの手順は、数週間の期間に亘るインビトロでの抗原
提示細胞の存在下での、正常被験者由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の試験ペプ
チドによる刺激を包含する。このペプチドに特異的なＴ細胞は、この時間中に活
性化され、例えばペプチド感作標的細胞を包む５１Ｃｒ放出アッセイを用いて検
出される。
【００７０】 ２）ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，
Ｐ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７，１９９６；Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ
，Ｐ．Ａ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５１，１９９６；Ａｌｅｘａｎ
ｄｅｒ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３，１９９７を参照のこ
と）。この方法では、不完全フロイントアジュバント中のペプチドが、ＨＬＡト
ランスジェニックマウスに皮下投与される。免疫後数週間目に、脾臓細胞が取り
出され、試験ペプチドの存在下で約１週間、インビトロで培養される。例えばペ
プチド感作標的細胞と内因的に生成された抗原を発現する標的細胞とを包む、５ １ Ｃｒ放出アッセイを用いて、ペプチド特異的Ｔ細胞が検出される。
【００７１】 ３）効果的にワクチン接種された患者または腫瘍を有する患者からのリコール
（ｒｅｃａｌｌ）Ｔ細胞応答の立証（例えば、Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ，Ｂ．ら、Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１０４７，１９９５；Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．ら、
Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：９７，１９９７；Ｂｅｒｔｏｎｉ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３，１９９７；Ｔｈｒｅｌｋｅｌｄ，Ｓ．Ｃ．
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１６４８，１９９７；Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒ，
Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６０１１，１９９７；Ｔｓａｎｇら、Ｊ．
Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８７：９８２−９９０，１９９５；Ｄｉｓ
ｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３１５１−３１５８，１９９６を参照の
こと）。この戦略の適用に際しては、リコール応答は、「自然に」免疫応答を生
じていた癌患者由来のＰＢＬ、あるいは腫瘍抗原ワクチンでワクチン接種された
患者由来のＰＢＬを培養することにより検出される。被験者由来のＰＢＬは、試
験ペプチドおよび抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で１〜２週間インビトロで培
養されて、「ナイーブ」Ｔ細胞と比較した場合、「記憶」Ｔ細胞の活性化を可能
にする。培養期間終了時に、ペプチド感作標的、Ｔ細胞増殖またはリンホカイン
放出を包含する５１Ｃｒ放出を含めたＴ細胞活性に関するアッセイを用いて、Ｔ
細胞活性が検出される。
【００７２】 本発明のペプチドエピトープおよび対応する核酸を以下で説明する。
【００７３】 （ＩＶ．Ｃ．ＨＬＡ分子に関するペプチドエピトープの結合親和性） 本明細書中で示されているように、ＨＬＡ多型の大きな程度は、ワクチン開発
に対するエピトープベースのアプローチに関して考慮されるべき重要な因子であ
る。この因子に対処するために、複数のＨＬＡ分子に高親和性または中親和性で
結合し得るペプチドの同定を包含するエピトープ選択が好ましくは利用され、最
も好ましくはこれらのエピトープは、高親和性または中親和性で２つ以上の対立
遺伝子特異的ＨＬＡ分子に結合する。
【００７４】 ワクチン組成物のための目的のＣＴＬ誘導性ペプチドとしては、クラスＩ Ｈ
ＬＡ分子についてのＩＣ５０または結合親和性値、好ましくは５００ｎＭまたは
それより優れた値（すなわち、その値は５００ｎＭ以下である）を有するものが
挙げられる。ＨＴＬ誘導性ペプチドとしては、クラスＩＩ ＨＬＡ分子について
のＩＣ５０または結合親和性、、好ましくは１０００ｎＭまたはそれより優れた
値（すなわち、その値は１０００ｎＭ以下である）を有するものが挙げられる。
例えばペプチド結合は、インビトロで精製ＨＬＡ分子に結合する候補ペプチドの
能力を試験することにより評価される。次に、高親和性または中親和性を示すペ
プチドが、さらなる分析のために考慮される。選択されたペプチドは、スーパー
タイプファミリーの他のメンバーに対して試験される。好ましい実施形態では、
交差反応結合を示すペプチドは次に、細胞スクリーニング分析またはワクチンに
て用いられる。
【００７５】 高いＨＬＡ結合親和性は、高い免疫原性と相関する（例えば、Ｓｅｔｔｅら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：５５８６−５５９２，１９９４；Ｃｈｅｎら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２８７４−２８８１，１９９４；およびＲｅｓｓｉ
ｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９３４−５９４３，１９９５）。より
高い免疫原性は、いくつかの異なる方法で表示され得る。免疫原性は、免疫応答
が少しでも惹起されるのか否か、および任意の特定の応答の強さ、ならびに応答
が惹起される集団の程度に対応している。例えばペプチドは、多様な群の集団に
て免疫応答を惹起し得るが、しかし強力な応答を生じることはない。さらに高結
合親和性ペプチドほど、より強力な免疫原性応答を引き起こす。その結果、高親
和性結合ペプチドまたは中親和性結合ペプチドが用いられる場合には、同様の生
物学的作用を惹起するために、より少ないペプチドしか必要とされない。したが
って本発明の好ましい実施形態では、高親和性結合エピトープまたは中親和性結
合エピトープが、特に有用である。
【００７６】 ＨＬＡクラスＩ分子に対する結合親和性と結合した抗原上の別々のペプチドエ
ピトープの免疫原性との関係は、本発明人等により当該分野で初めて決定された
。結合親和性と免疫原性との相関は、２つの異なる実験アプローチで分析された
（例えば、Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：５５８６−５５９２，
１９９４を参照のこと）。最初のアプローチでは、ＨＬＡ結合親和性における１
０，０００倍の範囲を超える潜在エピトープの免疫原性が、ＨＬＡ−Ａ＊０２０
１トランスジェニックマウスで分析された。第二のアプローチでは、全てＡ＊０
２０１結合モチーフを保有している約１００個の異なるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢ
Ｖ）由来潜在エピトープの抗原性が、急性肝炎患者由来のＰＢＬを用いて評価さ
れた。これらのアプローチにしたがって、親和性閾値約５００ｎＭ（好ましくは
５０ｎＭ以下）がＣＴＬ応答を惹起するペプチドエピトープの能力を決定すると
いうことを決定した。これらのデータは、天然でプロセシングされたペプチドに
ついてのクラスＩ結合親和性測定値、ならびに合成Ｔ細胞エピトープについての
クラスＩ結合親和性測定値に関しては、正しい。これらのデータは、Ｔ細胞応答
の決定に際しての決定基選択の重要な役割も示す（例えば、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４６４９−４６５
３，１９８９を参照のこと）。
【００７７】 ＨＬＡクラスＩＩ ＤＲ分子の状況での免疫原性に関連した親和性閾値も記述
されている（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６
０：３３６３−３３７３，１９９８および同時係属中の米国特許出願第０９／０
０９，９５３号（１９９８年１月２１日出願）を参照のこと）。ＤＲ結合親和性
の生物学的に有意の閾値を規定するために、それらの拘束エレメント（すなわち
モチーフを結合するＨＬＡ分子）に対する３２ＤＲ拘束エピトープの結合親和性
のデータベースが編集された。約半数の例（３２個のうちの１５個のエピトープ
）において、ＤＲ拘束は高結合親和性（すなわち、１００ｎＭ以下の結合親和性
値）に関連した。他の半数の例（３２個のうち１６個）では、ＤＲ拘束は中親和
性（１００〜１０００ｎＭ範囲の結合親和性値）に関連した。３２例のうちの１
例のみにおいて、ＤＲ拘束は１０００ｎＭ以上のＩＣ５０に関連した。したがっ
て１０００ｎＭは、ＤＲ分子の状況での免疫原性に関連した親和性閾値と規定さ
れ得る。
【００７８】 腫瘍関連抗原の場合、ペプチドパルスされた標的細胞およびそのエピトープを
内因的に発現する腫瘍細胞標的を溶解するＣＴＬを誘導することが示されている
多数のＣＴＬペプチドエピトープが、２００ｎＭ以下の結合親和性またはＩＣ５ ０ 値を示す。このようなＴＡＡエピトープの小さな組の結合親和性および免疫原
性の関連を評価した研究では、高結合剤（すなわち５０ｎＭ以下の親和性で結合
するペプチドエピトープ）の１００％（１０／１０）が免疫原性であり、それら
の８０％（８／１０）が、腫瘍細胞を特異的に認識するＣＴＬを惹起した。５１
〜２００ｎＭ範囲で、非常によく似た数値が得られた。アナログペプチドのつい
ては、野生型ペプチドおよび腫瘍細胞に対して陽性であるＣＴＬ誘導は、それぞ
れペプチドの８６％（６／７）および７１％（５／７）認められた。２０１〜５
００ｎＭ範囲では、ほとんどのペプチド（４／５野生型）が、野生型ペプチドを
認識するＣＴＬの誘導に関して陽性であったが、腫瘍認識は検出されなかった。
【００７９】 ＨＬＡ分子に対するペプチドの結合親和性は、以下の実施例１に記載されてい
るように決定され得る。
【００８０】 （ＩＶ．Ｄ．ペプチドエピトープ結合モチーフおよびスーパーモチーフ） 単一アミノ酸置換抗原アナログの研究、ならびに内因的に結合された天然でプ
ロセシングされたペプチドの配列決定により、ＨＬＡ分子との対立遺伝子特異的
結合に必要とされる重要残基が同定されている。これらの残基の存在は、ＨＬＡ
分子に対する結合親和性と相関する。高親和性結合および中親和性結合と相関す
るモチーフおよび／またはスーパーモチーフの同定は、ワクチン中の含入物のた
めの免疫原性ペプチドエピトープの同定に関して重要な問題である。Ｋａｓｔ等
（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９０４−３９１２，１９９４）は、モチーフ
保有ペプチドが対立遺伝子特異的ＨＬＡクラスＩ分子に結合するエピトープの９
０％を占めることを示した。この研究では、ヒトパピローマウイルス１６型のＥ
６タンパク質およびＥ７タンパク質の全体配列を網羅する、９アミノ酸長の、か
つ、８個のアミノ酸を重複する考え得る全てのペプチド（２４０ペプチド）が、
異なる民族群間で高頻度で発現される５つの対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子との結
合に関して評価された。このペプチドの偏りのない組が、ＨＬＡクラスＩモチー
フの予測値の評価を可能にした。２４０ペプチドの組から、２２ペプチドが、高
親和性または中親和性で対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子に結合すると同定された。
これら２２ペプチドのうち、２０ペプチド（すなわち９１％）がモチーフ保有性
であった。したがって、この研究は、ワクチン中に含めるためのペプチドエピト
ープの同定に関するモチーフの値を立証する。モチーフベースの同定技法の適用
は、標的抗原タンパク質配列中の潜在エピトープの約９０％を同定する。
【００８１】 このようなペプチドエピトープは、下記の表中で確認される。
【００８２】 本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩＤＲ分子に結合するエピトープも含み
得る。そのペプチドのＮ末端およびＣ末端と比較して、モチーフのサイズおよび
結合フレーム位置の両方における、より度合いの高い不均一性が、クラスＩＩペ
プチドリガンドに存在する。ＨＬＡクラスＩＩペプチドリガンドのこの不均一性
の増大は、そのクラスＩ対応部分と違って両端で開いている、ＨＬＡクラスＩＩ
分子の結合溝（ｇｒｏｏｖｅ）の構造によるものである。ＨＬＡクラスＩＩＤＲ
Ｂ＊０１０１ペプチド複合体の結晶解析は、結合の主エネルギーが、ＤＲＢ＊０
１０１分子上の相補的ポケットと複合体化されたペプチド残基によるものである
ことを示した。重要なアンカー残基は、最も深い疎水性ポケットにかみ合い（例
えば、Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｒ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５８７
，１９９５を参照のこと）、位置１（Ｐ１）と呼ばれる。Ｐ１はクラスＩＩ結合
ペプチドエピトープのＮ末端残基を表し得るが、さらに典型的には、１つ以上の
残基によりＮ末端方向に隣接される。他の研究は、種々のＤＲ分子との結合に関
して、Ｐ１に対して、Ｃ末端方向への６番目の位置のペプチド残基に関する重要
な役割もまた指摘している。
【００８３】 過去数年間、ほぼ重複するペプチド結合レパートリーならびに主ペプチド結合
ポケットのコンセンサス構造により各々特徴づけされる、多くのＨＬＡクラスＩ
分子およびＨＬＡクラスＩＩ分子が、比較的少数のスーパータイプに分類され得
ることを立証する証拠が蓄積されてきた。したがって本発明のペプチドは、いく
つかのＨＬＡ特異的アミノ酸モチーフ（例えば表Ｉ〜ＩＩＩを参照のこと）のい
ずれか１つによってか、またはそのモチーフの存在がいくつかの対立遺伝子特異
的ＨＬＡ分子を結合する能力に対応する場合には、スーパーモチーフにより、同
定される。特定のアミノ酸スーパーモチーフを保有するペプチドに結合するＨＬ
Ａ分子は、集合的にＨＬＡ「スーパータイプ」と呼ばれる。
【００８４】 下記の、ならびに表Ｉ〜ＩＩＩに要約されたペプチドモチーフおよびスーパー
モチーフは、本発明に従ったペプチドエピトープの同定および使用に関する指針
を提供する。
【００８５】 スーパーモチーフまたはモチーフ保有ペプチドエピトープの例は、表ＸＸに示
されている。ペプチドエピトープ配列を得るために、前立腺癌抗原ＰＡＰ、ＰＳ
Ａ、ＰＳＭ、およびｈＫ２に対するタンパク質配列データ（表ＶＩＩ〜ＸＸにお
いてカリクレインとして示される）は、示されたスーパーモチーフまたはモチー
フの存在について評価された。「位置」欄は、推定の第１のアミノ酸残基に対応
するタンパク質配列における位置を示す。「アミノ酸の数」は、エピトープ配列
における残基の数を示す。表はまた、上部の欄に示される対立遺伝子特異的ＨＬ
Ａ分子に対するいくつかのペプチドエピトープについて列挙される結合親和性比
を含む。その比は、以下の式を用いてＩＣ５０に変換され得る：標準ペプチドの
ＩＣ５０／比＝試験ペプチド（すなわちペプチドエピトープ）のＩＣ５０。クラ
スＩペプチドに関する結合親和性を決定するために用いられる標準ペプチドのＩ
Ｃ５０値は、表ＩＶに示されている。クラスＩＩペプチドに関する結合親和性を
決定するために用いられる標準ペプチドのＩＣ５０値は、表Ｖに示されている。
本明細書中に記載した結合アッセイのための標準として用いられるペプチドは、
標準の例である。代替的標準ペプチドも、結合試験を実施する場合に用いられ得
る。
【００８６】 表ＶＩＩ〜ＸＸの各々に列挙したペプチドエピトープ配列を得るために、ＰＳ
Ａ、ＰＳＭ、ＰＡＰ、およびｈＫ２のアミノ酸は入れるは、示されるスーパーモ
チーフまたはモチーフについて評価された。すなわち、それぞれのモチーフまた
はスーパーモチーフの各々に関して表Ｉ（クラスＩモチーフに関して）または表
ＩＩＩ（クラスＩＩモチーフに関して）に記述されたような一次アンカー残基の
存在に関して、アミノ酸配列が検索された。
【００８７】 表中、モチーフおよび／またはスーパーモチーフ保有アミノ酸配列は、前立腺
抗原アミノ酸配列、および下に提供される番号付けに関して位置の数およびエピ
トープの長さによって同定される。「ｐｏｓ」（位置）欄は、エピトープの最初
のアミノ酸残基に対応する下の前立腺抗原配列タンパク質配列中のアミノ酸位置
を示す。「アミノ酸の数」は、エピトープ配列中の残基の数を、ひいてはエピト
ープの長さを示す。例えば表ＶＩＩに列挙した最初のペプチド配列は、ＰＡＰの
位置１２２で始まる１１残基長の配列である。したがって、このエピトープのア
ミノ酸配列は、ＡＬＦＰＰＥＧＶＳＩＷである。同様に、表ＶＩＩにおける第１
のカリクレインは、位置１４７で始まり、そして１１残基長である。従って、ア
ミノ酸配列は、ＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷである。
【００８８】 表ＶＩＩ〜ＸＸに示される結合データは、対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子と標識
された欄において相対結合比（上記）として表される。
【００８９】 ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）
【００９０】
【化１】 ＰＡＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）
【００９１】
【化２】 ＰＳＭ（前立腺特異的膜抗原）
【００９２】
【化３】 カリクレイン（ヒトカリクレイン２、受託ＮＭ００５５５１）
【００９３】
【化４】 （ＣＴＬ誘導ペプチドエピトープを示すＨＬＡクラスＩモチーフ） 下記のＨＬＡクラスＩペプチドエピトープスーパーモチーフおよびＨＬＡクラ
スＩペプチドエピトープモチーフの一次アンカー残基は、表Ｉに概説されている
。表Ｉ（ａ）に記述されたＨＬＡクラスＩモチーフは、本明細書中で特許請求さ
れる本発明に最も特に関連があるものである。一次アンカー位置および二次アン
カー位置は、表ＩＩに概説されている。ＨＬＡクラスＩスーパータイプファミリ
ーを含む対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表ＶＩに列挙されている。いくつかの
場合、ペプチドエピトープは、重複一次アンカー特異性が原因で、モチーフおよ
びスーパーモチーフの表の両方に列挙される。特定のモチーフおよびそれぞれの
スーパーモチーフの関係は、個々のモチーフの説明中に示されている。
【００９４】 （ＩＶ．Ｄ．１．ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフは、このエピトープの第２位における小さい（
ＴまたはＳ）または疎水性の（Ｌ、Ｉ、ＶまたはＭ）一次アンカー残基、ならび
にＣ末端位置での芳香族（Ｙ、ＦまたはＷ）一次アンカー残基の、ペプチドリガ
ンド中の存在によって特徴付けられる。Ａ１スーパーモチーフに結合するＨＬＡ
分子のこの対応するファミリー（すなわち、ＨＬＡ−Ａ１スーパータイプ）は、
少なくとも：Ａ＊０１０１、Ａ＊２６０１、Ａ＊２６０２、Ａ＊２５０１および
Ａ＊３２０１からなる（例えば、ＤｉＢｒｉｎｏ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１５１：５９３０，１９９３；ＤｉＢｒｉｎｏ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１５２：６２０，１９９４；Ｋｏｎｄｏ，Ａ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ４５：２４９，１９９７を参照のこと）。このＡ１スーパーファミリーの
メンバーであると予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す
。これらの個々のＨＬＡタンパク質の各々に結合するペプチドは、一次および／
または二次アンカー位置での置換（好ましくは、このスーパーモチーフに特定化
された各々の残基を選択して）によって調節され得る。
【００９５】 Ａ１スーパーモチーフを含む代表的ペプチドエピトープを、添付の表ＶＩＩに
示す。
【００９６】 （ＩＶ．Ｄ．２．ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ） 対立遺伝子特異的ＨＬＡ−Ａ２．１分子に対する一次アンカー特異性（例えば
、Ｆａｌｋら，Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６，１９９１；Ｈｕｎｔら
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−１２６３，１９９２；Ｐａｒｋｅｒら，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−３５８７，１９９２；Ｒｕｐｐｅｒｔ
ら，Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７，１９９３参照）、ならびにＨＬＡ−Ａ２
およびＨＬＡ−Ａ２８分子間の交差反応結合は、記載されている（関連データの
総説については、例えば、Ｆｒｕｃｉら，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：
１８７−１９２，１９９３；Ｔａｎｉｇａｋｉら，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｎｏｌ．
３９：１５５−１６２，１９９４；Ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１５４：６８５−６９３，１９９５；Ｋａｓｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５２：３９０４−３９１２，１９９４を参照のこと）。これらの一次アンカー
残基は、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフを規定し；ペプチドリガンド中のその存
在は、いくつかの異なるＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２８分子を結合する能力
に対応する。このＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフは、このエピトープの第２位の
一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＱおよびこのエピトープ
のＣ末端位置の一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＴを有する、
ペプチドリガンドを含む。
【００９７】 ＨＬＡ分子のこの対応するファミリー（すなわち、これらのペプチドを結合す
るＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ）は、少なくとも：Ａ＊０２０１、Ａ＊０２０２
、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０４、Ａ＊０２０５、Ａ＊０２０６、Ａ＊０２０７、
Ａ＊０２０９、Ａ＊０２１４、Ａ＊６８０２およびＡ＊６９０１からなる。この
Ａ２スーパーファミリーのメンバーであると予測される他の対立遺伝子特異的Ｈ
ＬＡ分子を、表ＶＩに示す。以下で詳細に説明するように、これらの個々の対立
遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々への結合は、一次アンカー位置および／または二
次アンカー位置での置換（好ましくは、このスーパーモチーフに特定化された各
々の残基を選択して）によって調節され得る。
【００９８】 Ａ２スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表ＶＩＩ
Ｉに示す。第２位に一次アンカー残基Ｖ、Ａ、ＴまたはＱおよびＣ末端位置に一
次アンカー残基Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＡまたはＴを含むこれらのモチーフは、本明細書中
の特許請求された本発明に最も特に関連があるモチーフである。
【００９９】 （ＩＶ．Ｄ．３．ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフは、このエピトープの第２位の一次アンカーと
してのＡ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳまたはＴおよびこのエピトープのＣ末端位置（例
えば、９マーの第９位）の正荷電残基ＲまたはＫの、ペプチドリガンド中の存在
により特徴付けられる（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４
５：７９，１９９６を参照のこと）。このＡ３スーパーモチーフに結合するＨＬ
Ａ分子のこの対応するファミリー（すなわち、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ）の
メンバーの例としては、少なくとも：Ａ＊０３０１、Ａ＊１１０１、Ａ＊３１０
１、Ａ＊３３０１およびＡ＊６８０１が挙げられる。このＡ３スーパータイプの
メンバーであると予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す
。以下で詳細に説明されるように、これらの個々の対立遺伝子特異的ＨＬＡタン
パク質の各々に結合するペプチドは、そのペプチドの一次および／または二次ア
ンカー位置でのアミノ酸の置換（好ましくは、このスーパーモチーフに特定化さ
れた各々の残基を選択して）によって調節され得る。
【０１００】 このＡ３スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表Ｉ
Ｘに示す。
【０１０１】 （ＩＶ．Ｄ．４．ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフは、このエピトープの第２位の一次アンカー
としての芳香族残基（Ｆ、ＷまたはＹ）または疎水性脂肪族残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、
ＭまたはＴ）およびこのエピトープのＣ末端位置の一次アンカーとしてのＹ、Ｆ
、Ｗ、Ｌ、ＩまたはＭの、ペプチドリガンド中の存在により特徴付けられる（例
えば、ＳｅｔｔｅおよびＳｉｄｎｅｙ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９
９ Ｎｏｖ；５０（３−４）：２０１−１２，Ｒｅｖｉｅｗを参照のこと）。こ
のＡ２４スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子のこの対応するファミリー（す
なわち、Ａ２４スーパータイプ）としては、少なくとも：Ａ＊２４０２、Ａ＊３
００１およびＡ＊２３０１が挙げられる。このＡ２４スーパータイプのメンバー
であると予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。これら
の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々に結合するペプチドは、一次および／また
は二次アンカー位置での置換（好ましくは、このスーパーモチーフに特定化され
た各々の残基を選択して）によって調節され得る。
【０１０２】 このＡ２４スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表
Ｘに示す。
【０１０３】 （ＩＶ．Ｄ．５．ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフは、このエピトープの一次アンカーとして第２
位におけるプロリンならびにこのエピトープのＣ末端位置での一次アンカーとし
て疎水性または脂肪族アミノ酸（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｆ、ＷまたはＹ）を保有
するペプチドによって、特徴付けられる。このＢ７スーパーモチーフに結合する
ＨＬＡ分子のこの対応するファミリー（すなわち、ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプ
）は、少なくとも：Ｂ＊０７０２、Ｂ＊０７０３、Ｂ＊０７０４、Ｂ＊０７０５
、Ｂ＊１５０８、Ｂ＊３５０１、Ｂ＊３５０２、Ｂ＊３５０３、Ｂ＊３５０４、
Ｂ＊３５０５、Ｂ＊３５０６、Ｂ＊３５０７、Ｂ＊３５０８、Ｂ＊５１０１、Ｂ ＊ ５１０２、Ｂ＊５１０３、Ｂ＊５１０４、Ｂ＊５１０５、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊ ５４０１、Ｂ＊５５０１、Ｂ＊５５０２、Ｂ＊５６０１、Ｂ＊５６０２、Ｂ＊６
７０１およびＢ＊７８０１を含む、少なくとも２６個のＨＬＡ−Ｂタンパク質か
らなる（関連データの総説については、例えば、Ｓｉｄｎｅｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１５４：２４７，１９９５；Ｂａｒｂｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５
：１７９，１９９５；Ｈｉｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ ３６０：４３４，１９９２；
Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１７８，１９９
５を参照のこと）。このＢ７スーパータイプのメンバーであると予測される他の
対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。以下で詳細に説明されるように
、これらの個々の対立遺伝子特異的ＨＬＡタンパク質の各々に結合するペプチド
は、このペプチドの一次および／または二次アンカー位置での置換（好ましくは
、スーパーモチーフに特定化された各々の残基を選択して）によって調節され得
る。
【０１０４】 このＢ７スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表Ｘ
Ｉに示す。
【０１０５】 （ＩＶ．Ｄ．６．ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフは、このエピトープの第２位での一次アンカ
ーとしての正荷電（Ｒ、ＨまたはＫ）残基およびこのエピトープのＣ末端位置で
の一次アンカーとしての疎水性（Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ｉ、ＡまたはＶ）残基の
、ペプチドリガンド中の存在により特徴付けられる（例えば、Ｓｉｄｎｅｙおよ
びＳｅｔｔｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９９ Ｎｏｖ；５０（
３−４）：２０１−１２，Ｒｅｖｉｅｗを参照のこと）。このＢ２７スーパーモ
チーフに結合するＨＬＡ分子のこの対応するファミリー（すなわち、Ｂ２７スー
パータイプ）の例示的メンバーとしては、少なくとも：Ｂ＊１４０１、Ｂ＊１４
０２、Ｂ＊１５０９、Ｂ＊２７０２、Ｂ＊２７０３、Ｂ＊２７０４、Ｂ＊２７０
５、Ｂ＊２７０６、Ｂ＊３８０１、Ｂ＊３９０１、Ｂ＊３９０２およびＢ＊７３
０１が挙げられる。このＢ２７スーパータイプのメンバーであると予測される他
の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。この対立遺伝子特異的ＨＬＡ
分子の各々に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位置での置
換（好ましくは、スーパーモチーフに特定化された各々の残基を選択して）によ
って調節され得る。
【０１０６】 このＢ２７スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表
ＸＩＩに示す。
【０１０７】 （ＩＶ．Ｄ．７．ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフは、このエピトープの第２位での一次アンカ
ーとしての負荷電（ＤまたはＥ）残基およびこのエピトープのＣ末端位置での一
次アンカーとしての疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、ＶまたはＡ）の、ペ
プチドリガンド中の存在によって特徴付けられる（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら，Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：２６１，１９９６を参照のこと）。このＢ４
４スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子のこの対応するファミリー（すなわち
、Ｂ４４スーパータイプ）の例示的なメンバーとしては、少なくとも：Ｂ＊１８
０１、Ｂ＊１８０２、Ｂ＊３７０１、Ｂ＊４００１、Ｂ＊４００２、Ｂ＊４００
６、Ｂ＊４４０２、Ｂ＊４４０３およびＢ＊４４０４が挙げられる。これらの対
立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々に結合するペプチドは、一次および／または二
次アンカー位置での置換（好ましくは、このスーパーモチーフに特定化された各
々の残基を選択して）によって調節され得る。
【０１０８】 （ＩＶ．Ｄ．８．ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフは、このエピトープの第２位での一次アンカ
ー残基としての小さい脂肪族残基（Ａ、ＳまたはＴ）およびこのエピトープのＣ
末端位置での一次アンカー残基としての芳香族または疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＡ）の、ペプチドリガンド中の存在によって特徴付けられ
る（例えば、ＳｉｄｎｅｙおよびＳｅｔｔｅ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ
１９９９ Ｎｏｖ； ５０（３−４）：２０１−１２，Ｒｅｖｉｅｗを参照のこ
と）。このＢ５８スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子のこの対応するファミ
リー（すなわちＢ５８スーパータイプ）の例示的なメンバーとしては、少なくと
も：Ｂ＊１５１６、Ｂ＊１５１７、Ｂ＊５７０１、Ｂ＊５７０２およびＢ＊５８
０１が挙げられる。このＢ５８スーパータイプのメンバーであると予測される他
の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。これらの対立遺伝子特異的Ｈ
ＬＡ分子の各々に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位置で
の置換（好ましくは、このスーパーモチーフに特定化された各々の残基を選択し
て）によって調節され得る。
【０１０９】 このＢ５８スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表
ＸＩＩに示す。
【０１１０】 （ＩＶ．Ｄ．９．ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフは、このエピトープの第２位での一次アンカ
ーとしての極性脂肪族残基Ｑまたは疎水性脂肪族残基（Ｌ、Ｖ、Ｍ、ＩまたはＰ
）およびこのエピトープのＣ末端位置での一次アンカーとしての疎水性残基（Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、ＬまたはＡ）の、ペプチドリガンド中の存在によって特
徴付けられる（例えば、ＳｉｄｎｅｙおよびＳｅｔｔｅ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ １９９９ Ｎｏｖ；５０（３−４）：２０１−１２，Ｒｅｖｉｅｗを
参照のこと）。このＢ６２スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子のこの対応す
るファミリー（すなわち、Ｂ６２スーパータイプ）の例示的なメンバーとしては
、少なくとも：Ｂ＊１５０１、Ｂ＊１５０２、Ｂ＊１５１３およびＢ＊５２０１
が挙げられる。このＢ６２スーパータイプのメンバーであると予測される他の対
立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。これらの対立遺伝子特異的ＨＬＡ
分子の各々に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位置での置
換（好ましくは、このスーパーモチーフに特定化された各々の残基を選択して）
によって調節され得る。
【０１１１】 このＢ６２スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表
ＸＩＶに示す。
【０１１２】 （ＩＶ．Ｄ．１０．ＨＬＡ−Ａ１モチーフ） ＨＬＡ−Ａ１モチーフは、このエピトープの第２位での一次アンカー残基とし
てのＴ、ＳまたはＭおよびこのエピトープのＣ末端位置での一次アンカー残基と
してのＹの、このペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。代替
的な対立遺伝子特異的Ａ１モチーフは、第２位ではなくむしろ第３位での一次ア
ンカー残基によって特徴付けられる。このモチーフは、このエピトープの第３位
での一次アンカー残基としてのＤ、Ｅ、ＡまたはＳおよびこのエピトープのＣ末
端位置での一次アンカー残基としてのＹの存在によって特徴付けられる（関連デ
ータの総説については、例えば、ＤｉＢｒｉｎｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１
５２：６２０，１９９４；Ｋｏｎｄｏら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５
：２４９，１９９７；およびＫｕｂｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１
３， １９９４を参照のこと）。ＨＬＡ−Ａ１に結合するペプチドは、一次およ
び／または二次アンカー位置での置換（好ましくは、このモチーフに特定化され
た各々の残基を選択して）によって調節され得る。
【０１１３】 いずれかのＡ１モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表ＸＶ
に示す。第２位にＴ、ＳまたはＭそしてＣ末端位置にＹを含むエピトープはまた
、これらの残基が、Ａ１スーパーモチーフのサブセットであるので、表ＶＩＩに
列挙されるＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープのリストに含
まれる。
【０１１４】 （ＩＶ．Ｄ．１１．ＨＬＡ−Ａ＊０２０１モチーフ） ＨＬＡ−Ａ２＊０２０１モチーフは、９残基ペプチドの第２位での一次アンカ
ー残基としてのＬまたはＭおよび９残基ペプチドのＣ末端位置での一次アンカー
残基としてのＬまたはＶの、ペプチドリガンド中の存在によって特徴付けられる
ことが決定され（例えば、Ｆａｌｋら，Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６
，１９９１を参照のこと）、そしてさらに、９アミノ酸ペプチドの第２位でＩお
よびＣ末端位置でＩまたはＡを含むことが見出された（例えば、Ｈｕｎｔら，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−１２６３，Ｍａｒｃｈ ６，１９９２；Ｐａ
ｒｋｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−３５８７，１９９２を参
照のこと）。このＡ＊０２０１対立遺伝子特異的モチーフは、このエピトープの
第２位に一次アンカー残基としてＶ、Ａ、ＴまたはＱおよびこのエピトープのＣ
末端位置に一次アンカー残基としてＭまたはＴをさらに含むことが、本発明者ら
によって規定された（例えば、Ｋａｓｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９
０４−３９１２，１９９４を参照のこと）。従って、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１モチ
ーフは、このエピトープの第２位に一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ
、ＴまたはＱおよびこのエピトープのＣ末端位置に一次アンカー残基としてＬ、
Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＴを有する、ペプチドリガンドを含む。このＨＬＡ−Ａ＊ ０２０１モチーフの一次アンカー位置を特徴付ける、これらの好ましくかつ許容
される残基は、Ａ２スーパーモチーフを説明する残基と同一である（関連データ
の総説については、例えば、ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５４：６８５−６９３，１９９５；Ｒｕｐｐｅｒｔら，Ｃｅｌｌ ７４：９２
９−９３７，１９９３；Ｓｉｄｎｅｙら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：
２６１−２６６，１９９６；ＳｅｔｔｅおよびＳｉｄｎｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ
ｎ．ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４７８−４８２，１９９８を参照のこと）。
このＡ＊０２０１モチーフを特徴付ける二次アンカー残基が、さらに規定されて
いる（例えば、Ｒｕｐｐｅｒｔら，Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７，１９９３
を参照のこと）。これらは、表ＩＩに示されている。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子
に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位置での置換（好まし
くは、このモチーフに特定化された各々の残基を選択して）によって調節され得
る。
【０１１５】 Ａ＊０２０１モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表ＶＩＩ
Ｉに示す。第２位に一次アンカー残基Ｖ、Ａ、ＴまたはＱおよびＣ末端位置に一
次アンカー残基Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＡまたはＴを含むＡ＊０２０１モチーフは、本明細
書における特許請求された本発明に最も特に関連があるモチーフである。
【０１１６】 （ＩＶ．Ｄ．１２．ＨＬＡ−Ａ３モチーフ） ＨＬＡ−Ａ３モチーフは、このエピトープの第２位での一次アンカー残基とし
てのＬ、Ｍ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｃ、ＧまたはＤおよびこのエピトープの
Ｃ末端位置での一次アンカー残基としてのＫ、ｓＹ、Ｒ、Ｈ、ＦまたはＡの、ペ
プチドリガンド中の存在によって特徴付けられる（例えば、ＤｉＢｒｉｎｏら，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１５０８，１９９３；
およびＫｕｂｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３−３９２４，１９９
４を参照のこと）。ＨＬＡ−Ａ３に結合するペプチドは、一次および／または二
次アンカー位置での置換（好ましくは、このモチーフに特定化された各々の残基
を選択して）によって調節され得る。
【０１１７】 このＡ３モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表ＸＶＩに示
す。このＡ３スーパーモチーフも含むペプチドエピトープはまた、表ＩＸに列挙
される。このＡ３スーパーモチーフ一次アンカー残基は、Ａ３−およびＡ１１−
対立遺伝子特異的モチーフのサブセットを含む。
【０１１８】 （ＩＶ．Ｄ．１３．ＨＬＡ−Ａ１１モチーフ） ＨＬＡ−Ａ１１モチーフは、このエピトープの第２位での一次アンカー残基と
してのＶ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｃ、ＤまたはＦおよびこのエピト
ープのＣ末端位置での一次アンカー残基としてのＫ、Ｒ、ＹまたはＨの、ペプチ
ドリガンドにおける存在によって特徴付けられる（例えば、Ｚｈａｎｇら，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２２１７−２２２１，１
９９３；およびＫｕｂｏら， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３−３９２
４，１９９４を参照のこと）。ＨＬＡ−Ａ１１に結合するペプチドは、一次およ
び／または二次アンカー位置での置換（好ましくは、このモチーフに特定化され
た各々の残基を選択して）によって調節され得る。
【０１１９】 このＡ１１モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表ＸＶＩＩ
に示す。Ａ３対立遺伝子特異的モチーフを含むペプチドエピトープもまた、Ａ３
モチーフ一次アンカー特異性とＡ１１モチーフ一次アンカー特異性との間の広範
な重複に起因してこの表に示される。さらにＡ３スーパーモチーフを含むペプチ
ドエピトープもまた、表ＩＸに列挙される。
【０１２０】 （ＩＶ．Ｄ．１４．ＨＬＡ−Ａ２４モチーフ） ＨＬＡ−Ａ２４モチーフは、このエピトープの第２位での一次アンカー残基と
してのＹ、Ｆ、ＷまたはＭおよびこのエピトープのＣ末端位置での一次アンカー
残基としてのＦ、Ｌ、ＩまたはＷの、ペプチドリガンドにおける存在によって特
徴付けられる（例えば、Ｋｏｎｄｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７
−４３１２，１９９５；およびＫｕｂｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９
１３−３９２４，１９９４を参照のこと）。ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプ
チドは、一次および／または二次アンカー位置での置換（好ましくは、このモチ
ーフに特定化された各々の残基を選択して）によって調節され得る。
【０１２１】 このＡ２４モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表ＸＶＩＩ
Ｉに示す。これらのエピトープは、このＡ２４対立遺伝子特異的モチーフを特徴
付ける一次アンカー残基が、Ａ２４スーパーモチーフ一次アンカー残基のサブセ
ットを含むので、表Ｘ（ＨＬＡ−Ａ２４−スーパーモチーフ保有ペプチドエピト
ープを示す）にも列挙される。
【０１２２】 （クラスＩＩ ＨＴＬ誘導ペプチドエピトープを示すモチーフ） 以下で記載されるＨＬＡクラスＩＩペプチドエピトープスーパーモチーフおよ
びＨＬＡクラスＩＩペプチドエピトープモチーフの一次および二次アンカー残基
を、表ＩＩＩに要約する。
【０１２３】 （ＩＶ．Ｄ．１５．ＨＬＡ ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフ） ３つの共通ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子：ＨＬＡ ＤＲＢ１ ＊ ０４０１、ＤＲＢ１＊０１０１およびＤＲＢ１＊０７０１に結合するペプチド
に関しても、モチーフは同定されている（例えばＳｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：３３６３−３３７３，１９９８による概説を参照
）。集合的に、これらのモチーフからの共通の残基は、ＨＬＡ ＤＲ−１−４−
７スーパーモチーフを記述する。これらのＤＲ分子に結合するペプチドは、位置
１における一次アンカー残基としての大型芳香族または疎水性残基（Ｙ、Ｆ、Ｗ
、Ｌ、Ｉ、ＶまたはＭ）、ならびに９マーコア領域の位置６における一次アンカ
ー残基としての小非荷電残基（Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ａ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、ＬまたはＭ）によ
り特徴付けられるスーパーモチーフを保有する。対立遺伝子特異的二次作用およ
びこれらのＨＬＡ型の各々に関する二次アンカーも同定されている（Ｓｏｕｔｈ
ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．、上記）。これらは、表ＩＩＩに記載されている。ＨＬ
Ａ−ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０１０１および／またはＤＲＢ１＊０７０
１に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位置での置換により
調整されることができ、好ましくはスーパーモチーフに特異化されるそれぞれの
残基を選択する。
【０１２４】 ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフを含む代表的な９マーペプチド配列（スー
パーモチーフの位置１が９残基コアの位置１にある）は、表ＸＩＸに示す。各配
列について、「タンパク質」欄は、前立腺関連抗原（すなわち、ＰＳＡ、ＰＳＭ
、ＰＡＰ、またはＨｕＫ２（カリクレイン））を示す。「位置」欄は、コア配列
の第１のアミノ酸残基に対応する前立腺抗原タンパク質配列におけるアミノ酸位
置を示す。コア配列は、全て９残基長である。例えば、表ＸＩＸに列挙される第
１のＰＳＭ配列は、９残基長のコア配列であり、本明細書中に提供されるＰＳＭ
アミノ酸配列の位置６１１で開始する。従って、コア配列のアミノ酸配列は、Ｉ
ＹＳＩＳＭＫＨＰである。９残基コアを含む１５アミノ酸長の例示的なエピトー
プは、、９残基コアの側面にある各側で３残基を含む。例えば、ＰＳＭの位置６
１１でコアエピトープを含む、１５アミノ酸残基長の例示的エピトープは、ＡＤ
ＫＩＹＳＩＳＭＫＨＰＱＥＭである。
【０１２５】 コア配列を含むＨＴＬエピトープはまた、１５アミノ酸以外の長さであり得る
（上記）。例えば、本発明のエピトープは、各側で９残基のすぐ近くに隣接する
９残基コアおよび１，２，３（例示的な１５マーにおいて）、４、または５個の
フランキング残基を含む配列を含む。
【０１２６】 （ＩＶ．Ｄ．１６．ＨＬＡ ＤＲ３モチーフ） ２つの代替的モチーフ（すなわちサブモチーフ）は、ＨＬＡ−ＤＲ３分子に結
合するペプチドエピトープを特徴付ける（例えば、Ｇｅｌｕｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１５２：５７４２，１９９４参照）。第一のモチーフ（サブモチーフＤ
Ｒ３ａ）では、大型疎水性残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＦまたはＹ）が９マーコアの
アンカー位置１に存在し、そしてＤがエピトープのカルボキシル末端に向けて、
位置４にアンカーとして存在する。その他のクラスＩＩモチーフの場合と同様に
、コア位置１がペプチドＮ末端位置を占めることもあるし、そうでないこともあ
る。
【０１２７】 代替的ＤＲ３サブモチーフは、エピトープのカルボキシル末端に向かう位置６
での正電荷の存在により、アンカー位置１での大型疎水性残基の欠如に、および
／または位置４での負荷電またはアミド様アンカー残基の欠如に備える。従って
代替的対立遺伝子特異的ＤＲ３モチーフ（サブモチーフＤＲ３ｂ）に関しては：
Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、ＡまたはＹがアンカー位置１に存在し；Ｄ、Ｎ、Ｑ、
Ｅ、ＳまたはＴがアンカー位置４に存在し；そしてＫ、ＲまたはＨがアンカー位
置６に存在する。ＨＬＡ−ＤＲ３に結合するペプチドは、一次および／または二
次アンカー位置での置換により調整されることができ、好ましくはそのスーパー
モチーフに特異化されるそれぞれの残基を選択する。
【０１２８】 ＤＲ３ａまたはＤＲ３ｂサブモチーフ（モチーフの位置１が９残基コアの位置
１である）を含む９残基配列に対応する、考え得るペプチドエピトープ９マーコ
ア領域は、表ＸＸａおよびｂに記載されている。「タンパク質」欄は、前立腺関
連抗原（すなわち、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＡＰ、またはＨｕＫ２（カリクレイン）
）を示す。「位置」欄は、コア配列の第１のアミノ酸残基に対応する前立腺抗原
タンパク質配列におけるアミノ酸位置を示す。コア配列は、全て９残基長である
。例えば、表ＸＸａに列挙される第１の配列は、９残基長のコア配列であり、本
明細書中に提供されるＰＡＰアミノ酸配列の位置１２４で開始する。従って、コ
ア配列のアミノ酸配列は、ＦＰＰＥＧＶＳＩＷである。９残基コアを含む１５ア
ミノ酸長の例示的なエピトープは、９残基コアの側面にある各側で３残基を含む
。例えば、ＰＡＰの位置１２４でコアエピトープを含む、１５アミノ酸長の例示
的エピトープは、ＡＡＬＦＰＰＥＧＶＳＩＷＮＰＩである。
【０１２９】 コア配列を含むＨＴＬエピトープはまた、１５アミノ酸以外の長さであり得る
（上記）。例えば、本発明のエピトープは、各側で９残基のすぐ近くに隣接する
９残基コアおよび１，２，３（例示的な１５マーにおいて）、４、または５個の
フランキング残基を含む配列を含む。
【０１３０】 本明細書中に記載されているように同定されたＨＬＡクラスＩまたはクラスＩ
Ｉペプチドエピトープの各々は、単にこの出願の本発明の一態様であるとみなさ
れる。さらに各ペプチドエピトープが任意のその他のペプチドエピトープと組合
せて用いられ得るということも、本発明の一態様である。
【０１３１】 （ＩＶ．Ｅ．ワクチンの強化集団適用範囲） 商業的により発展可能であり、そして一般的にほとんどの人々に適用可能であ
るために、広範な集団適用範囲を有するワクチンが好ましい。広範な集団適用範
囲は、全体的に考えた場合に、ほとんどの集団に存在するＨＬＡ対立遺伝子に結
合するペプチドエピトープを選択することにより、本発明のペプチド（ならびに
／またはこのようなペプチドをコードする核酸組成物）を用いて得られる。表Ｘ
ＸＩは、種々の民族におけるＨＬＡクラスＩスーパータイプの全体的頻度（表Ｘ
ＸＩａ）およびＡ２−、Ａ３−およびＢ７−スーパータイプ（表ＸＸＩｂ）によ
り達成された併合集団適用範囲を示す。Ａ２−、Ａ３−およびＢ７スーパータイ
プは、これら５つの主要民族群の各々において平均で４０％を超えて各々存在す
る。８０％という過剰の適用範囲は、これらのスーパーモチーフの組合せにより
達成される。これらの結果は、有効かつ民族的偏りのない集団適用範囲が、限定
数の交差反応性ペプチドの使用時に達成されることを示唆する。これら３つの主
要ペプチド特異性により達成された集団適用範囲は高いが、付加的スーパーモチ
ーフまたは対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの使用時には、９５％および
それ以上の集団適用範囲に達するよう、そして真の多特異的応答をさらに容易に
達成するよう、適用範囲は拡張され得る。
【０１３２】 Ｂ４４−スーパータイプ、Ａ１−スーパータイプおよびＡ２４−スーパータイ
プは、これらの主要民族集団中に平均で２５％〜４０％の範囲で各々存在する（
表ＸＸＩａ）。全体的に低流布性であるが、しかしＢ２７−、Ｂ５８−およびＢ
６２スーパータイプは各々、少なくとも１つの主要民族群中に２５％より大きい
頻度で存在する（表ＸＸＩａ）。表ＸＸＩｂは、５つの主要民族群で同定された
ＨＬＡスーパータイプの組合せの流布概算値を概説する。Ａ２、Ａ３およびＢ７
適用範囲へのＡ１スーパータイプ、Ａ２４スーパータイプおよびＢ４４スーパー
タイプの含入により得られた適用範囲増分、ならびに本明細書中に記載された全
てのスーパータイプを用いて得られた適用範囲が示されている。
【０１３３】 Ａ２−、Ａ３−およびＢ７スーパータイプの従来の定義と一緒に本明細書中に
提示されたデータは、全ての抗原（Ａ２９、Ｂ８およびＢ４６は考え得る例外と
して）が全部で９つのＨＬＡスーパータイプに分類され得ることを示す。６つの
最も高頻度のスーパータイプからのエピトープを含入することにより、９９％と
いう平均集団適用範囲が５つの主要民族群に関して得られる。
【０１３４】 （ＩＶ．Ｆ．免疫応答刺激ペプチドアナログ（類似体、類縁体）） 概して、全体の抗原に対するＣＴＬおよびＨＴＬ応答は、全ての考え得るエピ
トープに対して向けられるというわけではない。むしろそれらは２〜３の「腫瘍
抗原」決定基（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）に拘
束される（Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，ら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５１
５９，１９７９；Ｂｅｎｎｉｋ，ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１９３５−
１９３９，１９８８；Ｒａｗｌｅ，ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３９７７
−３９８４，１９９１）。イムノドミナント（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）
（Ｂｅｎａｃｅｒｒａｆ，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １７５：２７３−２７９，１９
７２）は、特定のＨＬＡタンパク質を選択的に結合する（決定因子選択理論）（
Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：１６３５，１９８３；Ｒ
ｏｓｅｎｔｈａｌら、Ｎａｔｕｒｅ ２６７：１５６〜１５８，１９９７）また
は既存のＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）特異性により選択的に認識される（レパートリ
ー理論）（Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ
ＯＦ ＳＥＬＦ／ＮＯＮＳＥＬＦ ＤＩＳＣＲＩＭＩＮＡＴＩＯＮ，Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２７０−３１０，１９
８２）所定のエピトープの能力のいずれかにより説明され得る。主としてプロセ
シング事象に結び付けられる付加的因子も、厳密な免疫原性を越えて、多数の考
え得る決定因子が主要抗原決定基として存在することを指令する場合に重要な役
割を演じ得る、ということが立証されている（Ｓｅｒｃａｒｚ，ら、Ａｎｎｕ．
Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：７２９−７６６，１９９３）。
【０１３５】 組織特異性および発生性ＴＡＡは、少なくともいくつかの時点で、または身体
内の少なくともいくつかの位置で正常組織上に発現されるため、それらに対する
Ｔ細胞、特にドミナント（ｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープは免疫監視中に排除さ
れ、そして寛容が誘導される、と予測され得る。しかしながら正常ドナーと癌患
者の両方において腫瘍エピトープに対するＣＴＬ応答が検出されており、これは
寛容が不完全であることを示し得る（例えば、Ｋａｗａｓｈｉｍａら、Ｈｕｍ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：１，１９９８；Ｔｓａｎｇ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｉｎｓｔ．８７：８２−９０，１９９５；Ｒｏｎｇｏｕｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１６３：１０３７，１９９９参照）。従って免疫寛容は、高親和性ＨＬ
ＡクラスＩ結合ペプチドを認識し得るＣＴＬ前駆体を完全には排除または不活性
化しない。
【０１３６】 寛容を克服するためのさらに別の戦略は、アナログ（類似体）ペプチドを用い
ることである。理論によって束縛されることを意図しないが、ドミナント（ｄｏ
ｍｉｎａｎｔ）エピトープに対するＴ細胞はクローン的に欠失されているため、
サブドミナント（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープの選択が既存のＴ細胞を
必要にさせ、これが次に治療的または予防的応答をもたらすことが考えられる。
しかしながらサブドミナント（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープとのＨＬＡ
分子の結合は、しばしばドミナント（ｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープとの結合よ
りも低強硬（ｖｉｇｏｒｏｕｓ）である。従って、１つまたはそれ以上のＨＬＡ
分子に対する特定の免疫原性エピトープの結合親和性を調整し、それにより、例
えばより強力な（ｖｉｇｏｒｏｕｓ）応答を引き出すアナログ（類似体）ペプチ
ドを調製するよう、ペプチドにより引き出される免疫応答を調整し得る必要があ
る。
【０１３７】 上記のスクリーニング手法により、スーパーファミリーの全ての対立遺伝子間
の適切な交差反応性を有するペプチドが同定されているが、しかし交差反応性は
いつもできるだけ完全であるというわけではなく、ある場合には、ペプチドの交
差反応性を増大するための手法が有用であり得る。さらにこのような手法は、結
合親和性またはペプチド安定性のようなペプチドの他の特性を改質するためにも
用いられ得る。所定のモチーフまたはスーパーモチーフ内のＨＬＡ対立遺伝子に
対するペプチドの交差反応性を支配する一般原則が確立されれば、より広範な（
あるいはそうでなければ修飾された）ＨＬＡ結合能力を達成するために、当該特
定の目的のペプチドの構造の修飾（すなわちアナログ（類似体）化）が実施され
得る。より詳細には、最も広範な交差反応性パターンを示すペプチドが、本明細
書中の教示に従って生成され得る。アナログ（類似体）生成に関連した本発明の
概念は、米国同時係属出願の第０９／２２６，７７５号（１９９９年１月６日提
出）に詳細に記載されている。
【０１３８】 要するに、用いられる戦略は、ある種のＨＬＡ分子との結合と相関するモチー
フまたはスーパーモチーフを利用する。モチーフまたはスーパーモチーフは、一
次アンカーを、多くの場合には、二次アンカーを有することにより規定される。
アナログ（類似体）ペプチドは、一次アンカー、二次アンカーでのまたは一次お
よび二次アンカー位置のアミノ酸残基を置換することにより作製され得る。一般
にアナログ（類似体）は、モチーフまたはスーパーモチーフをすでに保有するペ
プチドに対して作製される。ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ結合ペプチドに関
して規定されていたスーパーモチーフおよびモチーフの好ましい二次アンカー残
基は、それぞれ表ＩＩおよびＩＩＩに示される。
【０１３９】 本発明の多数のモチーフまたはスーパーモチーフに関して、対立遺伝子特異的
ＨＬＡ分子、またはそれぞれのモチーフまたはスーパーモチーフを結合するＨＬ
Ａスーパータイプのメンバーに結合することが有害である残基が規定される（表
ＩＩおよびＩＩＩ）。従って結合に有害であるこのような残基の除去が、本発明
に従って実施され得る。例えばＡ３スーパータイプの場合には、このような有害
残基を有する全てのペプチドが、分析に用いられるペプチドの集団から除去され
ると、交差反応性の発生率は、２２％から３７％に増大した（例えば、Ｓｉｄｎ
ｅｙ，Ｊ．ら、Ｈｕ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９，１９９６参照）。従って、
所定のスーパーモチーフ内のペプチドの交差反応性を改善するための一戦略は、
単に、ペプチド内に存在する１つ以上の有害残基を欠失させ、小「中性」残基、
例えばＡｌａ（ペプチドのＴ細胞認識に影響を及ぼし得ない）を置換することで
ある。ペプチド内の有害残基の排除とともに、対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子との
またはスーパーファミリー内の多数のＨＬＡ分子との高親和性結合に関連した「
好ましい」残基が挿入される場合に、交差反応性強化の可能性が、予期される。
【０１４０】 アナログ（類似体）ペプチドが、ワクチンとして用いられる場合、インビボで
ネイティブな（ｎａｔｉｖｅ）エピトープに対するＣＴＬ応答を実際に惹起する
（またはクラスＩＩエピトープの場合は、野生型ペプチドと交差反応するヘルパ
ーＴ細胞を惹起する）ことを保証するために、アナログ（類似体）ペプチドが、
適切なＨＬＡ対立遺伝子を有する個体からインビトロでＴ細胞を免疫化するため
に用いられ得る。その後、野生型ペプチド感作標的細胞の溶解を誘導する免疫化
細胞の能力が評価される。それは、内因的に産生された抗原が関連Ｔ細胞によっ
ても認識されるか否かを確定するために、適切な遺伝子で感染されたかまたはト
ランスフェクトされた細胞であるか、あるいはクラスＩＩエピトープのみの場合
には、全タンパク質抗原でパルスされたことのある細胞のいずれかである抗原提
示細胞として用いるのが望ましい。
【０１４１】 本発明の別の実施形態は、弱結合ペプチドのアナログ（類似体）を作製し、そ
れにより適正数の交差反応性細胞結合剤を保証することである。５００〜５００
０ｎＭの結合親和性を示し、かつ許容可能であるが、一方または両方の位置に最
適下限の一次アンカー残基を保有するクラスＩ結合ペプチドは、それぞれのスー
パータイプに従って好ましいアンカー残基を置換することにより「固定」され得
る。次に、アナログ（類似体）ペプチドは交差結合活性に関して試験され得る。
【０１４２】 有効なペプチドアナログ（類似体）を生成するための別の実施形態は、例えば
液体環境中でのペプチド安定性または溶解性に悪影響を及ぼす残基の置換を包含
する。この置換は、ペプチドエピトープの任意の位置で起こり得る。例えばシス
テインはαアミノ酪酸（本明細書中に列挙したペプチド配列に関する一文字略語
で「Ｂ」）を選択して置換され得る。その化学的性質のために、システインはジ
スルフィド架橋を形成する傾向を有し、そして結合能力を低減するのに十分なだ
けペプチドを構造的に変える。システインの代わりにα−アミノ酪酸を置換する
と、この問題が改善されるだけでなく、ある場合には結合および交差結合能力が
実際に改良される（例えば、Ｓｅｔｔｅら、Ｉｎ：Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ Ｖｉ
ｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，Ｅｄｓ．Ｒ．Ａｈｍｅｄ ａｎｄ Ｉ．Ｃｈｅ
ｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９９による概
説を参照）。
【０１４３】 （ＩＶ．Ｇ．スーパーモチーフ保有ペプチドまたはモチーフ保有ペプチドに関
する疾患関連抗原からのタンパク質配列のコンピュータースクリーニング） 標的抗原中のスーパーモチーフ保有ペプチドまたはモチーフ保有ペプチドを同
定するために、ネイティブなタンパク質配列、例えば腫瘍関連抗原、または感染
生物体、または移植用ドナー組織由来の配列は、配列内のスーパーモチーフまた
はモチーフの存在を確定するために、知的計算またはコンピューターのような演
算のための手段を用いて、スクリーニングされる。ネイティブなペプチドの分析
から得られる情報は、ネイティブなペプチドの状態を評価するために直接用いら
れ得るか、またはその後ペプチドエピトープを生成するために利用され得る。
【０１４４】 対象スーパーモチーフまたはモチーフの発生に関するタンパク質配列の迅速ス
クリーニングを可能にするコンピュータープログラムが、アナログ（類似体）ペ
プチドの生成を可能にするプログラムと同様に、本発明に包含される。これらの
プログラムは、任意の同定されたアミノ酸配列を分析するか、あるいは未知の配
列に関して作動し、同時に配列を確定して、そのモチーフ保有エピトープを同定
するために実行される。アナログ（類似体）も同様に同時に確定され得る。一般
に同定された配列は、病原性生物体または腫瘍関連ペプチド由来である。本発明
において、標的ＴＡＡ分子としては、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＡＰ、およびｈＫ２が
挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】 ペプチド結合の予測のために利用される選択判定基準は、実際の結合と最も効
率的に相関するためにできるだけ正確であることが重要である。適切な一次アン
カーの存在に基づいた、例えばＨＬＡ−Ａ＊０２０１に結合するペプチドの予測
は、約３０％の割合で有望である（例えば、Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ
７４：９２９，１９９３参照）。しかしながら、本明細書中に開示するペプチ
ド−ＨＬＡ結合データ、関連特許出願中のデータおよび当該技術のデータを広範
に分析することにより、本発明者らは、一次アンカー残基の単独での存在を基礎
にした同定を上回って予測値を劇的に増大する多数の対立遺伝子特異的多項式ア
ルゴリズムを開発した。これらのアルゴリズムは、一次アンカーの存在または非
存在だけでなく、二次アンカー残基（異なる位置での異なるアミノ酸の影響を説
明するため）の肯定的または有害な存在も考慮に入れる。アルゴリズムは本質的
には、ペプチド−ＨＬＡ相互作用の全親和性（または△Ｇ）が以下の型の一次多
項式関数として概算され得るという仮定に基づく： △Ｇ＝ａ１ｉｘａ２ｉｘａ３ｉ・・・・ｘａｎｉ （式中、ａ１ｉは、ｎ個のアミノ酸のペプチドの配列に沿って所定位置（ｉ）で
の所定アミノ酸（ｊ）の存在の影響を表す係数である）。この方法の重要な仮定
は、各位置での影響が本質的に互いに無関係であるということである。この仮定
は、ペプチドがＨＬＡ分子に結合され、本質的に拡張配座におけるＴ細胞により
認識されることを立証する研究により正当化される。特定のアルゴリズム係数の
誘導は、例えば、Ｇｕｌｕｋｏｔａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７：
１２５８，１９９７に記載されている。
【０１４６】 また特異的モチーフを使用する好ましいペプチド配列を同定するためのさらに
別の方法としては、ニューラルネットワークおよび分子モデリングプログラムの
使用が挙げられる（例えば、Ｍｉｌｉｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ １６：７５３，１９９８；Ａｌｔｕｖｉａら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．５８：１，１９９７；Ａｌｔｕｖｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：
２４４，１９９５；Ｂｕｕｓ，Ｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１
：２０９−２１３，１９９９；Ｂｒｕｓｉｃ，Ｖ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔ
ｉｃｓ １４：１２１−１３０，１９９８；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１５２：１６３，１９９３；Ｍｅｉｓｔｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ １３：５
８１，１９９５；Ｈａｍｍｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３５３，１
９９４；Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：
５５５，１９９９参照）。
【０１４７】 例えば、少なくとも１つの好ましい二次アンカー残基を含有するＡ＊０２０１
モチーフ保有ペプチドのセット中では、任意の有害な二次アンカー残基の存在を
回避する一方で、ペプチドの６９％がＡ＊０２０１を結合し、ＩＣ５０は５００
ｎＭ未満である、ということが示されている（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ら、Ｃｅｌ
ｌ ７４：９２９，１９９３）。これらのアルゴリズムはまた、カットオフスコ
アが所望により、より大きいまたはより低い予測結合特性を有するペプチド組を
選定するよう調整され得るという点で、融通性がある。
【０１４８】 ペプチドエピトープを同定するためにコンピュータースクリーニングを利用す
る際、タンパク質配列または翻訳配列は、モチーフを検索するために開発された
ソフトウェア、例えば「ＦＩＮＤＰＡＴＴＥＲＮＳ」プログラム（Ｄｅｖｅｒｅ
ｕｘ，ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５，１９８４）
、あるいは適切なＨＬＡ結合モチーフを含有する潜在性ペプチド配列を同定する
ためのＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈ１．４ソフトウェアプログラム（Ｄ．Ｂｒｏｗｎ
，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて分析され得る。同定ペプチドは、特異的
ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ対立遺伝子を結合するそれらの能力を予測する
ために、カスタマイズド多項式アルゴリズムを用いてスコア付けされ得る。当業
者に理解されるように、既知または未知のペプチド配列を評価するために（例え
ばエピトープを同定するために、ペプチド長当たりのエピトープ濃度を同定する
ために、またはアナログ（類似体）を生成するために、ただし、これらに限定さ
れない）、コンピュータープログラミングソフトウェアおよびハードウェアオプ
ションの大型アレイが、本発明のモチーフを実行するために用いられ得る関連業
界で利用可能である。
【０１４９】 上記の手法に従って、ＨＬＡスーパータイプ群または対立遺伝子特異的ＨＬＡ
分子を結合することが可能である前立腺癌関連抗原ペプチドエピトープおよびそ
のアナログが同定されている。
【０１５０】 （ＩＶ．Ｈ．ペプチドエピトープの調製） 本発明によるペプチドは、組換えＤＮＡ技術または化学合成により合成的に、
あるいはネイティブの腫瘍または病原性生物体のような天然供給源から調製され
得る。ペプチドエピトープは、別々に、またはポリエピトープペプチドとして合
成されてもよい。ペプチドは好ましくは他の天然に存在する宿主細胞タンパク質
およびそれらのフラグメントを実質的に含まないが、いくつかの実施形態では、
ペプチドはネイティブのフラグメントまたは粒子と合成的に結合され得る。
【０１５１】 本発明によるペプチドは、種々の長さであり得、それらの中性（非荷電）形態
または塩である形態であり得る。本発明によるペプチドは、グリコシル化、側鎖
の酸化またはリン酸化のような修飾を含まないか、あるいはそれらは、修飾が本
明細書中に記載するようなペプチドの生物活性を破壊しないという条件で、これ
らの修飾を含有する。
【０１５２】 可能な場合は、約８〜約１３、多くの場合８〜１１、好ましくは９〜１０のア
ミノ酸残基の長さに、ポリエピトープ構築物中で用いられ得るように、本発明の
ＨＬＡクラスＩ結合エピトープを最適化するのが望ましい。本発明のＨＬＡクラ
スＩＩ結合ペプチドエピトープは、約６〜約３０のアミノ酸長の長さ、好ましく
は約１３〜約２０の残基に最適化され得る。好ましくは、ペプチドエピトープは
、関連ＨＬＡ分子に結合される内因的処理病原体由来ペプチドまたは腫瘍細胞ペ
プチドとサイズが同等であるが、本発明のエピトープを含むペプチドの同定およ
び調製はまた、本明細書中に記載する技法を用いて実行され得る。
【０１５３】 代替的実施形態では、本発明のエピトープは、ポリエピトープペプチド、また
はポリエピトープペプチドをコードするミニジーンとして連結され得る。
【０１５４】 別の実施形態では、高濃度のクラスＩおよび／またはクラスＩＩエピトープを
含有するネイティブのペプチド領域を同定するのが好ましい。このような配列は
一般に、それがアミノ酸長当たり最大数のエピトープを含有することを基礎にし
て選択される。エピトープは入れ子式または重複様式で存在し、例えば１０アミ
ノ酸長ペプチドは２つの９アミノ酸長エピトープおよび１つの１０アミノ酸長エ
ピトープを含有し得、細胞内プロセシング時には各エピトープは露出され得、こ
のようなペプチドの投与時にはＨＬＡ分子により結合され得ると理解されるべき
である。このより大きい、好ましくは多エピトープのペプチドは、合成的に、組
換え的に、またはネイティブの供給源からの切断により生成され得る。
【０１５５】 本発明のペプチドは、多種多様の方法で調製され得る。好ましい比較的短いサ
イズに関しては、ペプチドは慣用的技法にしたがって溶液中でまたは固体支持体
上で合成され得る。種々の自動合成機が市販されており、既知のプロトコールに
したがって用いられ得る（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ，ＳＯＬＩ
Ｄ ＰＨＡＳＥ ＰＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，２Ｄ，ＥＤ．，Ｐｉｅ
ｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，１９８４参照）。さらに個々のペプチドエ
ピトープは、化学的連結を用いて連結されて、やはり本発明の範囲内である大型
ペプチドを生成し得る。
【０１５６】 あるいは、目的の免疫原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が、発現ベ
クターに挿入され、適切な宿主細胞中に形質転換されるかまたはトランスフェク
トされ、そして発現に適した条件下で培養される組換えＤＮＡ技術が用いられ得
る。これらの手法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮ
Ｇ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ（１９８９）に記載されているように、一般に当該技術で既知である。した
がって、本発明の１つまたはそれ以上のペプチド配列を含む組換えポリペプチド
は、適切なＴ細胞エピトープを提示するために用いられ得る。
【０１５７】 本明細書中で意図される好ましい長さのペプチドエピトープに関する配列をコ
ードするヌクレオチドは、化学的技法により、例えばＭａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ
．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５ （１９８１）のホスホトリエス
テル法により合成され得る。ペプチドアナログは、ネイティブのペプチド配列を
コードするものの代わりに、適切なかつ所望の核酸塩基（単数または複数）を単
に置換することにより作製され得る。典型的な核酸置換例は、本明細書中のモチ
ーフ／スーパーモチーフにより規定されるアミノ酸をコードするものである。次
にコード配列は、適切なリンカーを提供され、当該技術で一般的に利用可能な発
現ベクター、ならびに適切な宿主を形質転換するために用いられるベクターに連
結されて、所望の融合タンパク質を産生し得る。多数のこのようなベクターおよ
び適切な宿主系が目下利用可能である。融合タンパク質の発現に関しては、コー
ド配列は、作動可能に連結される開始および停止コドン、プロモーターおよびタ
ーミネーター領域、ならびに通常は複製系を提供されて、所望の細胞宿主中での
発現のための発現ベクターを提供する。例えば、細菌宿主と適合性のプロモータ
ー配列は、所望のコード配列の挿入に便利な制限部位を含有するプラスミド中に
提供される。その結果生じる発現ベクターは、適切な細菌宿主中に形質転換され
る。当然ながら、酵母、昆虫または哺乳類細胞宿主も、適切なベクターおよび制
御配列を用いて使用され得る。
【０１５８】 （ＩＶ．Ｉ．Ｔ細胞応答を検出するためのアッセイ） いったんＨＬＡ結合ペプチドが同定されれば、それらはＴ細胞応答を引き出す
能力に関して試験され得る。モチーフ保有ペプチドの調製および評価は、ＰＣＴ
国際公開公報第９４／２０１２７号および同第第９４／０３２０５号に記載され
ている。要するに、特定の抗原からのエピトープを含むペプチドが合成され、適
切なＨＬＡタンパク質に結合するそれらの能力に関して試験される。これらのア
ッセイは、精製ＨＬＡクラスＩ分子への本発明のペプチドの結合を、放射性ヨウ
素標識参照ペプチドの結合に関して評価することを包含する。あるいは、免疫蛍
光染色および流動微小蛍光測定により、空のクラスＩ分子を発現する細胞（すな
わちその中にペプチドを欠く）が、ペプチド結合に関して評価され得る。ペプチ
ド結合を評価するために用いられ得るその他のアッセイとしては、ペプチド依存
性クラスＩアセンブリーアッセイおよび／またはペプチド競合によるＣＴＬ認識
の抑制が挙げられる。典型的には５００ｎＭまたはそれ未満の親和性で、クラス
Ｉ分子に結合するペプチドは、感染または免疫化固体由来のＣＴＬに対する標的
として役立つそれらの能力に関して、ならびに疾患と関連した選定標的細胞と反
応し得るＣＴＬ集団を生じ得る一次インビトロでのまたはインビボでのＣＴＬ応
答を誘導するそれらの能力に関して、さらに評価される。対応するアッセイは、
ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの評価のために用いられる。典型的には１０００
ｎＭまたはそれ未満の親和性にて結合することが示されているＨＬＡクラスＩＩ
モチーフ保有ペプチドはさらに、ＨＴＬ応答を刺激する能力に関して評価される
。
【０１５９】 アナログアッセイは、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの評価のために使用され
る。代表的に１０００ｎＭ以下の親和性で結合が示されるＨＬＡクラスＩＩモチ
ーフ保有ペプチドは、さらに、ＨＴＬ応答を刺激する能力について評価される。
【０１６０】 Ｔ細胞応答を検出するために利用される慣用的アッセイとしては、増殖アッセ
イ、リンホカイン分泌アッセイ、直接的細胞傷害性アッセイおよび限界希釈アッ
セイが挙げられる。例えばペプチドとともにインキュベートされた抗原提示細胞
は、応答体細胞集団中でＣＴＬ応答を誘導する能力に関してアッセイされ得る。
抗原提示細胞は、末梢血単核細胞または樹状細胞のような正常細胞、であり得る
。あるいは内部処理ペプチドとともにクラスＩ分子を負荷する能力を欠き、適切
なヒトクラスＩ遺伝子でトランスフェクトされた突然変異体非ヒト哺乳類細胞系
は、インビトロでの一次ＣＴＬ応答を誘導するペプチドの能力に関して試験する
ために用いられ得る。
【０１６１】 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＣＴＬ前駆体の応答体細胞供給源として用い
られ得る。適切な抗原提示細胞は、ペプチドとともにインキュベートされ、その
後、ペプチド負荷抗原提示細胞が、最適化培養条件下にて応答体細胞集団ととも
にインキュベートされる。陽性ＣＴＬ活性化は、放射能標識標的細胞、両特異的
ペプチドパルス化標的、ならびにペプチド配列が由来する内因的処理形態の抗原
を発現する標的細胞を死滅するＣＴＬの存在に関して培養物をアッセイすること
により確定され得る。
【０１６２】 さらに、フルオレセイン標識ＨＬＡテトラマー複合体で染色することにより抗
原特異的Ｔ細胞の直接定量を可能にする方法が案出された（Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．
Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１
０３３０，１９９３；Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７４：９４，１９９６）。他の比較的最近の技術的開発としては、細胞内リン
ホカインに対する染色およびインターフェロン放出アッセイまたはＥＬＩＳＰＯ
Ｔアッセイが挙げられる。テトラマー染色、細胞内リンホカイン染色およびＥＬ
ＩＳＰＯＴアッセイは全て、より慣用的アッセイより感度が少なくとも１０倍高
いと思われる（Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８
６：８５９，１９９７；Ｄｕｎｂａｒ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉ
ｏｌ．８：４１３，１９９８；Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ
．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：１７７，１９９８）。
【０１６３】 ＨＴＬ活性化も、Ｔ細胞増殖およびリンホカイン、例えばＩＬ−２の分泌のよ
うな当業者に既知の技法を用いて評価され得る（例えば、Ａｌｅｘａｎｄａｒら
，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１−７６１，１９９４参照）。
【０１６４】 あるいは、ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫化を用いて、ペプチドエピ
トープの免疫原性を確定し得る。ヒトＡ２．１、Ａ１１（ＨＬＡ−Ａ３エピトー
プを分析するために付加的に用いられ得る）およびＢ７対立遺伝子を有するマウ
スを含むいくつかのトランスジェニックマウスモデルが特性化され、そして他の
もの（例えばＨＬＡ−Ａ１およびＡ２４に関するトランスジェニックマウス）が
開発されつつある。ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ３マウスモデルも開発さ
れている。他のＨＬＡ対立遺伝子を有するさらに別のトランスジェニックマウス
モデルが、必要な場合には生成され得る。マウスは不完全フロイントアジュバン
ト中に乳化されたペプチドで免疫化され、その結果生じるＴ細胞が、ペプチドパ
ルス化標的細胞および適切な遺伝子でトランスフェクトされた標的細胞を認識す
るそれらの能力に関して試験される。ＣＴＬ応答は、上記の細胞傷害性アッセイ
を用いて分析され得る。同様に、ＨＴＬ応答は、Ｔ細胞増殖またはリンホカイン
の分泌のようなアッセイを用いて分析され得る。
【０１６５】 （ＩＶ．Ｊ．診断剤としてのならびに免疫応答を評価するためのペプチドエピ
トープの使用） 本発明の一実施形態では、本明細書中に記載するようなＨＬＡクラスＩおよび
クラスＩＩ結合ペプチドが、免疫応答を評価するための試薬として用いられる。
評価されるべき免疫応答は、試薬として用いられるべきペプチドエピトープ（単
数または複数）を認識し、それに結合する抗原特異的ＣＴＬまたはＨＴＬの産生
を結果として生じ得る任意の作用物質を免疫原として用いることにより誘導され
る。ペプチド試薬は、免疫原として用いられる必要はない。このような分析のた
めに用いられるアッセイ系としては、テトラマー、細胞内リンホカインに対する
染色およびインターフェロン放出アッセイまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイのよう
な比較的最近の技術的開発が挙げられる。
【０１６６】 例えば、本発明のペプチドは、腫瘍細胞抗原または免疫原への曝露後に抗原特
異的ＣＴＬの存在に関して末梢血単核細胞を評価するためのテトラマー染色アッ
セイに用いられる。ＨＬＡ−テトラマー複合体は、抗原特異的ＣＴＬを直接可視
化するために（例えば、Ｏｇｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：２１０３−２１０
６，１９９８、およびＡｌｔｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １７４：９４−９６，
１９９６参照）、および末梢血単核細胞サンプル中の抗原特異的ＣＴＬ集団の頻
度を確定するために用いられる。本発明のペプチドを用いるテトラマー試薬は、
以下のように生成される：ＨＬＡ分子に結合するペプチドが、対応するＨＬＡ重
鎖およびβ２−ミクログロブリンの存在下でリフォールディングされて、三分子
複合体を生成する。複合体は、タンパク質に予め操作された部位で重鎖のカルボ
キシル末端でビオチン化される。次にストレプトアビジンの添加により、テトラ
マー形成が誘導される。蛍光的標識ストレプトアビジンにより、テトラマーは抗
原特異的細胞を染色するために用いられる。次に細胞は、例えばフローサイトメ
トリーにより同定され得る。このような分析は、診断または予後用途に用いられ
得る。当該手法により同定される細胞は、治療用途にも用いられ得る。
【０１６７】 本発明のペプチドは、免疫リコール応答を評価するための試薬としても用いら
れる（例えば、Ｂｅｒｔｏｎｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０
３−５１３，１９９７およびＰｅｎｎａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１５
６５−１５７０，１９９１参照）。例えば、癌を有する個体からの患者ＰＢＭＣ
サンプルは、特異的ペプチドを用いて抗原特異的ＣＴＬまたはＨＴＬの存在に関
して分析される。単核細胞を含有する血液サンプルは、ＰＢＭＣを培養し、本発
明のペプチドで細胞を刺激することにより評価され得る。適切な培養時間後、増
殖した細胞集団が、例えばＣＴＬに関してまたはＨＴＬ活性に関して分析され得
る。
【０１６８】 ペプチドは、ワクチンの効力を評価するための試薬としても用いられる。免疫
原でワクチン接種された患者から得られるＰＢＭＣは、例えば上記方法のいずれ
かを用いて分析される。患者はＨＬＡ型分類され、その患者に存在する対立遺伝
子特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬が分析のために選定される。ワ
クチンの免疫原性は、ＰＢＭＣサンプル中のエピトープ特異的ＣＴＬおよび／ま
たはＨＴＬの存在により示される。
【０１６９】 本発明のペプチドは、当該技術で周知の技法を用いて抗体を作製するためにも
用いられ（例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯ
ＬＯＧＹ，Ｗｉｌｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ、およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
１９８９参照）、これは癌を診断またはモニターするための試薬として有用であ
り得る。このような抗体としては、ＨＬＡ分子の情況でペプチドを認識するもの
、すなわちペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体が挙げられる。
【０１７０】 （ＩＶ．Ｋ．ワクチン組成物） 本明細書中に記載されるような免疫原的有効量の１つまたはそれ以上のペプチ
ドを含有するワクチンおよびワクチンの調製方法は、本発明のさらなる実施形態
である。いったん適切免疫原性エピトープが定義されれば、それらは種々の手段
により分類および送達されて、本明細書中では「ワクチン」組成物と呼ばれる。
このようなワクチン組成物としては、例えばリポペプチド（例えば、Ｖｉｔｉｅ
ｌｌｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３４１，１９
９５）、ポリ（ＤＬ−ラクチドコグリコド）（「ＰＬＧ」）微小球中に封入され
るペプチド組成物（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．２８：２８７−２９４，１９９１；Ａｌｏｎｓｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ １２：
２９９−３０６，１９９４；Ｊｏｎｅｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：６７５−６
８１，１９９５参照）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）中に含入されるペプチ
ド組成物（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：８７３−８
７５，１９９０；Ｈｕら，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：２３５
−２４３，１９９８参照）、多抗原ペプチド系（ＭＡＰｓ）（例えば、Ｔａｍ，
Ｊ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：５４０９−
５４１３，１９８８；Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
１９６：１７−３２，１９９６参照）、多価ペプチドとして処方されるペプチ
ド；弾道送達系での使用のためのペプチド、典型的には結晶化ペプチド、ウイル
ス送達ベクター（Ｐｅｒｋｕｓ，Ｍ．Ｅ．ら：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃ
ｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．，編，ｐ
．３７９，１９９６；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３２０
：５３５，１９８６；Ｈｕ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５３７，１９
８６；Ｋｉｅｎｙ，Ｍ．Ｐ．ら，ＡＩＤＳ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４
：７９０，１９８６；Ｔｏｐ，Ｆ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２４
：１４８，１９７１；Ｃｈａｎｄａ，Ｐ．Ｋ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７５：
５３５，１９９０）、ウイルスまたは合成起源の粒子（例えば、Ｋｏｆｌｅｒ，
Ｎ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９２：２５，１９９６；Ｅｌ
ｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３；
Ｆａｌｏ，Ｌ．Ｄ．，Ｊｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．７：６４９，１９９５
）、アジュバント（Ｗａｒｒｅｎ，Ｈ．Ｓ．，Ｖｏｇｅｌ，Ｆ．Ｒ．，およびＣ
ｈｅｄｉｄ，Ｌ．Ａ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３６９，１９
８６；Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｖａｃｃｉｎｅ １１：２９３，１９９３）、
リポソーム（Ｒｅｄｄｙ，Ｒ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｍｏｌ．１４８：１５８５，１
９９２；Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：１３１，１
９９６）、あるいは裸または粒子吸収ｃＤＮＡ（Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５，１９９３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｈｕ
ｎｔ，Ｌ．Ａ．，およびＷｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １１：９
５７，１９９３；Ｓｈｉｖｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃ
ｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．，編，ｐ
．４２３，１９９６；Ｃｅａｓｅ，Ｋ．Ｂ．，およびＢｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ．
Ａ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：９２３，１９９４、およびＥ
ｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３
）が挙げられ得る。レセプター媒介性ターゲッティングとしても既知の毒素標的
化送達技術、例えばＡｖａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎ
ｃ．（Ｎｅｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のものも用いられ得る。
【０１７１】 本発明のワクチンとしては、核酸媒介性様相が挙げられる。本発明の１つまた
はそれ以上のペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡも、患者に投与され得る
。このアプローチは、例えばＷｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５
（１９９０）ならびに米国特許第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６
６号、同第５，８０４，５６６号、同第５，７３９，１１８号、同第５，７３６
，５２４号、同第５，６７９，６４７号、国際公開第９８／０４７２０号、およ
び以下にさらに詳細に記載される。ＤＮＡベースの送達技術の例としては、「裸
のＤＮＡ」促進（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、陽イオン性
脂質複合体、ならびに粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性送達が挙げ
られる（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号参照）。
【０１７２】 治療的または予防的免疫化用途のために、本発明のペプチドはまた、ウイルス
または細菌ベクターによって発現され得る。発現ベクターの例としては、ワクシ
ニアまたはファウルポックスのような弱毒ウイルス宿主が挙げられる。このアプ
ローチの一例として、ワクシニアウイルスは、本発明のペプチドをコードするヌ
クレオチド配列を発現するためのベクターとして用いられる。腫瘍を保有する宿
主中への導入時に、組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、
それにより宿主ＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を引き出す。免疫化プロトコー
ルに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４，７２２，８
４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍ
ｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒら，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３５１：４５６−４６０（１９９１）に記載されている。本発明のペプ
チドの治療的投与または免疫化に有用な多種多様の他のベクター、例えばアデノ
およびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ ｔｙｐｈｉベクター、解毒炭疽毒素ベクター等は、本明細書中の説明か
ら、当業者には明らかである。
【０１７３】 さらに、本発明によるワクチンは、１つ以上の特許請求するペプチドの組成物
を包含する。ペプチドは、ワクチン中に別々に存在し得る。あるいはペプチドは
、同一ペプチドの多数のコピーを含むホモポリマーとして、あるいは種々のペプ
チドのヘテロポリマーとして存在し得る。ポリマーは、免疫学的反応増大という
利点を有し、異なるペプチドエピトープがポリマーを製造するために用いられる
場合、免疫応答のために標的化された、病原性生物体または腫瘍関連ペプチドの
異なる抗原決定因子と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導するさらなる能
力を有する。この組成物は、抗原の天然に存在する領域であり得るか、あるいは
例えば組換え的にまたは化学合成により調製され得る。
【０１７４】 本発明のワクチンとともに用いられ得るキャリアは目的の分野で周知であり、
例えばチログロブリン、ヒト血清アルブミンのようなアルブミン、破傷風毒素、
ポリＬ−リシン、ポリＬ−グルタミン酸のようなポリアミノ酸、インフルエンザ
、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などが挙げられる。ワクチンは、生理学的に
耐容可能な（すなわち許容可能な）希釈剤（例えば水または生理食塩水、好まし
くはリン酸塩緩衝塩類溶液）を含有し得る。ワクチンはまた典型的には、アジュ
バントを含む。不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化ア
ルミニウムまたはミョウバンのようなアジュバントが、目的の分野で周知の物質
の例である。さらに、本明細書中に開示するように、ＣＴＬ応答は、例えばトリ
パルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）のよ
うな脂質に本発明のペプチドを結合することによりプライミングされ得る。
【０１７５】 注射、エアロゾル、経口、経皮、経粘膜、胸膜腔内、鞘内またはその他の適切
な経路を介しての本発明によるペプチド組成物での免疫化時に、宿主の免疫系は
、所望の抗原に特異的な大量のＣＴＬおよび／またはＨＴＬを産生することによ
り、ワクチンに応答する。その結果として、宿主はその後の感染に対して少なく
とも部分的に免疫を持つようになるか、または進行中の慢性感染の発症に対して
少なくとも部分的に耐性となるか、あるいは抗原が腫瘍関連性である場合には、
少なくともいくつかの治療的有益性を引き出す。
【０１７６】 いくつかの実施形態では、クラスＩペプチド構成成分を、目的の標的抗原に対
して中和抗体および／またはヘルパーＴ細胞応答を誘導または容易にする構成成
分と組み合わせることが望ましい。このような組成物の好ましい実施形態は、本
発明によるクラスＩおよびクラスＩＩエピトープを含む。このような組成物の代
替的実施形態は、本発明によるクラスＩおよび／またはクラスＩＩエピトープを
、ＨＬＡクラスＩＩ交差反応性結合分子、例えばＰＡＤＲＥＴＭ（Ｅｐｉｍｍｕ
ｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）分子とともに含む（例えば米国特許第５，７
３６，１４２号に記載されている）。
【０１７７】 本発明のワクチンはまた、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば樹状細胞（ＤＣ）
）を本発明のペプチドを提示するためのビヒクルとして含み得る。ワクチン組成
物は、樹状細胞動員および収集（それにより樹状細胞の充填がインビトロで起こ
る）後にインビトロで作製され得る。例えば樹状細胞は、例えば本発明によるミ
ニジーンによりトランスフェクトされ、あるいはペプチドによりパルス刺激され
る。次に樹状細胞は、インビボで免疫応答を引き出すために患者に投与され得る
。
【０１７８】 ＤＮＡまたはペプチドベースのいずれかのワクチン組成物もまた、樹状細胞動
員（それにより樹状細胞の充填がインビボで起こる）と組合せて、インビボで投
与され得る。
【０１７９】 抗原性ペプチドは、同様にＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答をエキソビボで引
き出すために用いられる。その結果生じるＣＴＬまたはＨＴＬ細胞は、他の慣用
的形態の治療に応答しないか、または本発明による治療用ワクチンペプチドまた
は核酸に応答しない患者において、腫瘍を治療するために用いられ得る。特定の
腫瘍関連抗原に対するエキソビボＣＴＬまたはＨＴＬ応答は、患者のまたは遺伝
子的に適合性のＣＴＬまたはＨＴＬ前駆細胞を、樹状細胞のような抗原提示細胞
の供給源、および適切な免疫原性ペプチドと一緒に組織培養物中でインキュベー
トすることにより誘導される。前駆細胞が活性化され、エフェクター細胞に膨張
される適切なインキュベーション時間（典型的には約７〜２８日）後、細胞は患
者に注入し戻され、そこでそれらはそれらの特異的標的細胞（感染細胞または腫
瘍細胞）を破壊し（ＣＴＬ）、または破壊を促す（ＨＴＬ）。トランスフェクト
された樹状細胞も、抗原提示細胞として用いられ得る。
【０１８０】 本発明のワクチン組成物はまた、癌のために用いられるその他の治療と併用し
て、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ等のような免疫アジュバントと
組合せても用いられ得る。
【０１８１】 好ましくは、ワクチン中に用いるためにポリエピトープ組成物中に含入するた
めにエピトープのアレイを選定する場合、あるいはワクチン中に含入される、お
よび／またはミニジーンのような核酸によりコードされる別々のエピトープを選
定するために、以下の原理が利用される。選定を行なうためには、以下の原理の
各々が釣り合っているのが好ましい。所定のワクチン組成物中に組み込まれる多
数のエピトープは、エピトープが得られる天然抗原中の配列にて連続的であり得
るが、そうである必要はない。
【０１８２】 １．）投与時に、腫瘍クリアランスと相関することが観察された免疫応答を模
倣するエピトープが選択される。ＨＬＡクラスＩに関しては、これは少なくとも
１つのＴＡＡからのものである３〜４個のエピトープを含む。ＨＬＡクラスＩＩ
に関しては、同様の論理的根拠が用いられ、これも３〜４個のエピトープが少な
くとも１つのＴＡＡから選定される（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ
．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１４４７−１４５０参照）。１つのＴＡＡからの
エピトープは、１つ以上のさらなるＴＡＡからのエピトープと組合せて用いられ
て、例えば実施例１５に記載されているように、高頻度発現ＴＡＡの種々の発現
パターンで腫瘍を標的にするワクチンを生産し得る。
【０１８３】 ２．）免疫原性と相関することが確立された必要な結合親和性を有するエピト
ープが選定される。ＨＬＡクラスＩに関してはＩＣ５０は５００ｎＭまたはそれ
未満、しばしば２００ｎＭまたはそれ未満、クラスＩＩに関してはＩＣ５０は１
０００ｎＭまたはそれ未満である。
【０１８４】 ３．）広範な集団適用範囲を与えるのに十分なスーパーモチーフ保有ペプチド
、または対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイが選定される。
例えば、少なくとも８０％の集団適用範囲を有するのが好ましい。目的の分野で
既知の統計学的評価であるモンテカルロ分析が、集団適用範囲の広さまたは重剰
性を評価するために用いられ得る。
【０１８５】 ４．）癌関連抗原からエピトープを選定する場合、患者は天然エピトープに対
する寛容を発生し得るため、類縁体を選定するのがしばしば有用である。感染性
疾患関連抗原に関するエピトープを選定する場合は、天然または類似させたエピ
トープを選定するのが好ましい。
【０１８６】 ５．）特に関連があるのは、「入れ子構造（ｎｅｓｔｅｄ）エピトープ」と呼
ばれるエピトープである。入れ子構造エピトープは、所定のペプチド配列中に少
なくとも２つのエピトープが重複する場合に起こる。入れ子構造ペプチド配列は
、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩエピトープの両方を含み得る。入れ子
構造エピトープを提供する場合、一般的目的は、１配列当たり最大数のエピトー
プを提供することである。したがって一つの局面は、ペプチド中のアミノ末端エ
ピトープのアミノ末端およびカルボキシル末端エピトープのカルボキシル末端よ
り任意に長いペプチドを提供するのを避けることである。入れ子構造エピトープ
のような多エピトープ配列、配列を提供する場合、病理学的またはその他の有害
な生物学的特性を有さないことを保証するために、配列をスクリーニングするこ
とが一般的に重要である。
【０１８７】 ６．）ポリエピトープタンパク質が作製されるか、またはミニジーンを作製す
る場合、目的のエピトープを包含する最小ペプチドを生成することが一目的であ
る。この原理は、入れ子構造ペプチドを含むペプチドを選択する場合に用いられ
るのと同様でない場合には、類似する。しかしながら人工ポリエピトープペプチ
ドを用いる場合、サイズ最小化の目的物は、ポリエピトープタンパク質中のエピ
トープ間に任意のスペーサー配列を組み込む必要性に対して釣り合いをとられる
。スペーサーアミノ酸残基は、例えば結合（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ）エピトープ
（免疫系により認識され、標的抗原中に存在せず、エピトープの人工並置によっ
てのみ作製されるエピトープ）を回避するために、あるいはエピトープ間の切断
を促し、それによりエピトープ提示を高めるために導入され得る。結合エピトー
プは一般に、回避される。なぜなら、レシピエントが非天然ペプチドに対して免
疫応答を生じ得るからである。特に重要なのは、「ドミナント（ｄｏｍｉｎａｎ
ｔ）エピトープ」である結合エピトープである。ドミナント（ｄｏｍｉｎａｎｔ
）エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が縮小されるかまたは抑制さ
れるような熱狂的な応答を引き起こし得る。
【０１８８】 （ＩＶ．Ｋ．１．ミニジーンワクチン） 多数のエピトープの同時送達を可能にする多数の異なるアプローチが利用可能
である。本発明のペプチドをコードする核酸は、本発明の特に有用な実施形態で
ある。ミニジーンに含入するためのエピトープは、好ましくは前節に記載した指
針にしたがって選択される。本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ま
しい手段は、本発明の１つまたは多数のエピトープを含むペプチドをコードする
ミニジーン構築物を使用する。
【０１８９】 多エピトープミニジーンの使用は、以下に、ならびに例えば米国同時係属出願
第０９／３１１，７８４号、Ｉｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１６２：３９１５−３９２５，１９９９、Ａｎ，Ｌ．ａｎｄ Ｗｈｉｔｔｏ
ｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２２９２，１９９７、Ｔｈｏｍｓｏｎ，
Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：８２２，１９９６、Ｗｈ
ｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３４８，１９９３
、Ｈａｎｋｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １６：４２６，１９９８に
記載されている。例えば、１つ以上の前立腺癌関連抗原の複数の領域由来のスー
パーモチーフおよび／またはモチーフ保有ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＡＰ、およびｈＫ
２エピトープ、普遍的（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ヘルパーＴ細胞エピトープ、ＰＡ
ＤＲＥＴＭ（またはＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＡＰ、およびｈＫ２由来の多ＨＴＬエピ
トープ）、および小胞体翻訳シグナル配列をコードする多エピトープＤＮＡプラ
スミドが、操作され得る。ワクチンは、他のＴＡＡ由来のエピトープもまた含む
。
【０１９０】 多エピトープミニジーンの免疫原性は、試験されるエピトープに対するＣＴＬ
誘導応答の規模を評価するためにトランスジェニックマウスで試験され得る。さ
らにＤＮＡコードエピトープのインビボでの免疫原性は、ＤＮＡプラスミドでト
ランスフェクトされた標的細胞に対する特異的ＣＴＬ系のインビトロ応答と相関
し得る。したがってこれらの実験は、ミニジーンが、１）ＣＴＬ応答を生じるこ
と、および２）誘導ＣＴＬが、コードされるエピトープを発現する細胞を認識す
るのに役立つことの両方を示し得る。
【０１９１】 例えば、ヒト細胞中での発現のための選定エピトープをコードするＤＮＡ配列
（ミニジーン）を作製するために、エピトープのアミノ酸配列は逆翻訳されても
よい。ヒトコドン使用法表は、各アミノ酸に対するコドン選択をガイドするため
に用いられ得る。これらのエピトープコードＤＮＡ配列は、翻訳される場合、連
続ポリペプチド配列が作られるように、直接隣接され得る。発現および／または
免疫原性を最適化するために、ミニジーン設計にさらなる要素が組み込まれ得る
。逆翻訳され、ミニジーン配列中に含入され得るアミノ酸配列の例としては、以
下のものが挙げられる：ＨＬＡクラスＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩＩエピトー
プ、ユビキチン結合シグナル配列および／または小胞体ターゲッティングシグナ
ル。さらに、ＣＴＬおよびＨＴＬエピトープのＨＬＡ提示は、ＣＴＬまたはＨＴ
Ｌエピトープに隣接する合成（例えばポリアラニン）または天然に存在するフラ
ンキング配列を含入することにより改善され得る。エピトープ（単数または複数
）を含むこれらの大型ペプチドは、本発明の範囲内である。
【０１９２】 ミニジーン配列は、ミニジーンのプラスおよびマイナス鎖をコードするオリゴ
ヌクレオチドを集合することによりＤＮＡに変換され得る。周知の技法を用いて
適切な条件下で、重複オリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）が合成され、
リン酸化され、精製され、アニーリングされ得る。オリゴヌクレオチドの末端は
、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結される。次に、エピトープポリペプチ
ドをコードするこの合成ミニジーンは所望の発現ベクター中にクローン化され得
る。
【０１９３】 当業者に周知の標準調節配列は、好ましくは標的細胞中での発現を保証するた
めにベクター中に含入される。以下のようないくつかのベクター要素が望ましい
：ミニジーン挿入のための下流クローニング部位を有するプロモーター、効率的
転写終結のためのポリアデニル化シグナル、大腸菌複製起点、および大腸菌選択
可能マーカー（例えばアンピシリンまたはカナマイシン耐性）。この目的のため
に、例えばヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターのような多数の
プロモーターが用いられ得る。他の適切なプロモーター配列に関しては、例えば
米国特許第５，５８０，８５９号および第５，５８９，４６６号を参照されたい
。
【０１９４】 ミニジーン発現および免疫原性を最適化するためには、さらなるベクター改変
が望ましくあり得る。いくつかの場合、効率的遺伝子発現のためにイントロンが
必要であり、１つ以上の合成または天然に存在するイントロンが、ミニジーンの
転写領域に組み込まれ得る。哺乳類細胞におけるｍＲＮＡ安定化配列および複製
用配列の含入もまた、ミニジーン発現増大のために考慮され得る。
【０１９５】 いったん発現ベクターが選定されれば、ミニジーンはプロモーターの下流のポ
リリンカー領域にクローン化される。このプラスミドは、適切な大腸菌株中で形
質転換され、標準技法を用いてＤＮＡが調製される。ミニジーンの配向およびＤ
ＮＡ配列、ならびにベクター中に含入されるすべてのその他の要素が、制限マッ
ピングおよびＤＮＡ配列分析を用いて確認される。正しいプラスミドを保有する
細菌細胞は、マスター細胞バンクおよび作業用細胞バンクとして貯蔵され得る。
【０１９６】 さらに、免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）は、ＤＮＡワクチンの免疫原性
にて役割を果たすようである。これらの配列は、免疫原性を強化するのが望まし
い場合には、ミニジーンコード配列の外側の、ベクター中に含入され得る。
【０１９７】 いくつかの実施形態では、ミニジーンにコードされるエピトープおよび第二の
タンパク質（免疫原性を強化または低減するために含入される）の両方の産生を
可能にする２シストロン発現ベクターが用いられ得る。同時発現された場合に有
益に免疫応答を高め得るタンパク質またはポリペプチドの例としては、サイトカ
イン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導性分
子（例えばＬｅＩＦ）、同時刺激分子、あるいはＨＴＬ応答に関しては、汎ＤＲ
（ｐａｎ−ＤＲ）結合タンパク質（ＰＡＤＲＥＴＭ、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内
ターゲッティングシグナルに連結され、発現ＣＴＬとは別個に発現される。これ
は、ＣＴＬエピトープの場合と異なる細胞区画へのＨＴＬエピトープの誘導を可
能にする。必要な場合、これはＨＬＡクラスＩＩ経路へのＨＴＬエピトープのよ
り効率的侵入を促し、それによりＨＴＬ誘導を改良し得る。ＨＴＬまたはＣＴＬ
誘導に対比して、免疫抑制分子（例えばＴＧＦ−β）の同時発現による免疫応答
の特異的低減は、ある種の疾患においては有益であり得る。
【０１９８】 治療的量のプラスミドＤＮＡは、例えばＥ．ｃｏｌｉにおける発酵、続く精製
により生産され得る。作業用細胞バンクからのアリコートを用いて、増殖培地に
接種し、周知の技法にしたがって振盪フラスコまたはバイオリアクター中で飽和
するまで増殖させる。プラスミドＤＮＡは、標準生物分離技法（例えばＱＩＡＧ
ＥＮ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により供給される
固相陰イオン交換樹脂）を用いて精製され得る。必要な場合、ゲル電気泳動また
はその他の方法を用いて、スーパーコイルＤＮＡが開環および線状形態から単離
され得る。
【０１９９】 精製プラスミドＤＮＡは、種々の処方物を用いた注射用に調製され得る。これ
らのうち最も簡単なのは、滅菌リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中での凍結
乾燥されたＤＮＡの再構成である。「裸のＤＮＡ」として既知のこのアプローチ
は、一般に臨床試験における筋肉内（ＩＭ）投与用に用いられている。ミニジー
ンＤＮＡワクチンの免疫治療効果を最大にするためには、精製プラスミドＤＮＡ
を処方するための代替的方法が望ましくあり得る。種々の方法が記載されており
、新規の技法が利用可能になってい得る。陽イオン性脂質、糖脂質およびフソゲ
ン性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソームも処方物中に用いられ得る（例えば、国
際公開９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ
，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２ （１９８８）、米国特許
第５，２７９，８３３号、国際公開９１／０６３０９およびＦｅｌｇｎｅｒ，ｅ
ｔ ａｌ．Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３ （
１９８７）参照）。さらに、総称して保護的、相互作用的、非縮合化合物（ＰＩ
ＮＣ）と呼ばれるペプチドおよび化合物もまた、精製プラスミドＤＮＡと複合体
化されて、安定性、筋肉内分散または特定の器官または細胞型への輸送のような
変数（変量）に影響を及ぼし得る。
【０２００】 標的細胞感作は、ミニジーンコードＣＴＬエピトープの発現およびＨＬＡクラ
スＩ提示に関する機能性アッセイとして用いられ得る。例えばプラスミドＤＮＡ
は、標準ＣＴＬクロム放出アッセイのための標的として適した哺乳類細胞系中に
導入される。用いられるトランスフェクション方法は、最終処方物に依存するで
あろう。エレクトロポレーションは、「裸の」ＤＮＡのために用いられ、一方、
陽イオン性脂質は、直接インビトロトランスフェクションを可能にする。グリー
ン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドは、同時トランスフェクトさ
れて、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いたトランスフェクト化された細胞
の富化を可能にする。これらの細胞は次に、クロム−５１（５１Ｃｒ）標識され
て、エピトープ特異的ＣＴＬ系に対する標的細胞として用いられる。５１Ｃｒ放
出により検出される細胞溶解は、ミニジーンコードＣＴＬエピトープの産生およ
びＨＬＡ提示の両方を示す。ＨＴＬエピトープの発現は、ＨＴＬ活性を評価する
ためにアッセイを用いて同様の方法で評価され得る。
【０２０１】 インビボ免疫原性は、ミニジーンＤＮＡ処方物の機能性試験のための第２のア
プローチである。適切なヒトＨＬＡタンパク質を発現するトランスジェニックマ
ウスは、ＤＮＡ産物で免疫化される。投与の用量および経路は、処方物依存性で
ある（例えばＰＢＳ中のＤＮＡに関してはＩＭ、脂質複合化ＤＮＡに関しては腹
腔内（ＩＰ））。免疫化後２１日目に、脾臓細胞を収集し、試験される各エピト
ープをコードするペプチドの存在下で１週間再刺激した。その後、ＣＴＬエフェ
クター細胞に関しては、アッセイは、標準技法を用いて、ペプチド充填５１Ｃｒ
標識標的細胞の細胞溶解に関して実行される。ミニジーンコードエピトープに対
応するペプチドエピトープを負荷されたＨＬＡにより感作された標的細胞の溶解
は、ＣＴＬのインビボ誘導に関するＤＮＡワクチン機能を立証する。ＨＴＬエピ
トープの免疫原性は、同様の方法で、トランスジェニックマウスで評価される。
【０２０２】 あるいは、核酸は、例えば米国特許第５，２０４，２５３号に記載されるよう
に弾道送達を用いて投与され得る。この技法を用いて、ＤＮＡ単独で構成される
粒子が投与される。さらなる代替的実施形態では、ＤＮＡは粒子、例えば金粒子
に付着される。
【０２０３】 ミニジーンは、目的の分野で周知のその他の細菌またはウイルス送達系を用い
ても送達され得る。例えば本発明のエピトープをコードする発現構築物は、ワク
シニアのようなウイルスベクター中に組み込まれ得る。
【０２０４】 （ＩＶ．Ｋ．２．ＣＴＬペプチドのヘルパーペプチドとの組合せ） 本発明のペプチドを含むワクチン組成物は、所望の属性（例えば血清半減期の
改良）を提供するために、または免疫原性を高めるために改変され得る。
【０２０５】 例えば、ペプチドがＣＴＬ活性を誘導する能力は、Ｔヘルパー細胞応答を誘導
し得る少なくとも１つのエピトープを含有する配列にペプチドを連結することに
より高められ得る。免疫原性を高めるためのＣＴＬエピトープを伴うＴヘルパー
エピトープの使用は、例えば米国同時係属出願第０８／８２０，３６０号、第０
８／１９７，４８４号および第０８／４６４，２３４号に説明されている。
【０２０６】 ＣＴＬペプチドは、Ｔヘルパーペプチドに直接連結され得るが、しかし多くの
場合ＣＴＬエピトープ／ＨＴＬエピトープ結合体はスペーサー分子により連結さ
れる。スペーサーは典型的には、生理学的条件下で実質的に荷電されない、比較
的小型の中性分子、例えばアミノ酸またはアミノ酸擬似体で構成される。スペー
サーは、典型的には、例えばＡｌａ、Ｇｌｙ、または非極性アミノ酸または中性
極性アミノ酸のその他の中性スペーサーから選択される。任意に存在するスペー
サーは同一残基で構成される必要はなく、したがってヘテロまたはホモオリゴマ
ーであってもよいと理解される。存在する場合、スペーサーは通常、少なくとも
１つまたは２つの残基、さらに通常は３〜６つの残基、場合によっては１０また
はそれを超える残基であろう。ＣＴＬペプチドエピトープは、直接またはスペー
サーを介して、ＣＴＬペプチドのアミノまたはカルボキシ末端でＴヘルパーペプ
チドエピトープに連結され得る。免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドの
いずれかのアミノ末端は、アシル化されてもよい。
【０２０７】 ある種の実施形態では、Ｔヘルパーペプチドは、大多数の集団中に存在するＴ
ヘルパー細胞により認識されるものである。これは多数の、ほとんどの、または
全てのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するアミノ酸配列を選定することにより成し
遂げられ得る。これらは「ゆるくＨＬＡ拘束された」または「混然とした」Ｔヘ
ルパー配列として既知である。混然としたペプチドの例としては、位置８３０〜
８４３（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ）での破傷風毒素、位置３７８〜３９８
（ＤＩＥＫＫＬＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ）でのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（熱帯熱マラリア原虫）スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパ
ク質、および位置１１６（ＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡ）でのＳｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ（連鎖球菌）１８ｋＤタンパク質のような抗原からの配列が挙
げられる。その他の例としては、ＤＲ１−４−７スーパーモチーフ、またはＤＲ
３モチーフのいずれかを保有するペプチドが挙げられる。
【０２０８】 あるいは、天然には見出されないアミノ酸配列を用いて、ゆるくＨＬＡ拘束さ
れた様式で、Ｔヘルパーリンパ球を刺激し得る合成ペプチドを調製することがで
きる（例えば、国際公開公報第９５／０７７０７号参照）。汎ＤＲ結合エピトー
プ（例えばＰＡＤＲＥ（商標）、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，ＣＡ）と呼ばれるこれらの合成化合物は、最も好ましくはほとんどのＨＬ
Ａ−ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子を結合するよう設計される。例えば、次
式：ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（式中、「Ｘ」はシクロヘキシルアラニン、フ
ェニルアラニンまたはチロシンであり、「ａ」はＤ−アラニンまたはＬ−アラニ
ンである）を有する汎ＤＲ結合エピトープペプチドは、ほとんどのＨＬＡ−ＤＲ
対立遺伝子に結合し、それらのＨＬＡ型とは関係なく、ほとんどの個体からのＴ
ヘルパーリンパ球の応答を刺激することが判明した。汎ＤＲ結合エピトープの代
替物は、全ての「Ｌ」型天然アミノ酸を含み、エピトープをコードする核酸の形
態で提供され得る。
【０２０９】 ＨＴＬペプチドエピトープも、それらの生物特性を改変するよう修飾され得る
。例えばそれらは、プロテアーゼに対するそれらの耐性を増大させ、したがって
それらの血清半減期を延長するためにそれらのＤ−アミノ酸を含入するよう修飾
され得るか、あるいはそれらはその生物活性を増大するために脂質、タンパク質
、炭水化物等のようなその他の分子と結合され得る。例えばＴヘルパーペプチド
は、アミノまたはカルボキシル末端で、１つまたはそれ以上のパルミチン酸鎖と
結合され得る。
【０２１０】 （ＩＶ．Ｋ．３．Ｔ細胞プライミング剤とのＣＴＬペプチドの組合せ） いくつかの実施形態では、細胞傷害性Ｔリンパ球をプライミングする少なくと
も１つの構成成分を本発明の薬学的組成物中に含むのが望ましい。脂質はウイル
ス抗原に対してインビボでＣＴＬをプライミングし得る作用物質であると同定さ
れている。例えば、パルミチン酸残基は、リシン残基のεおよびα−アミノ基に
結合され、次に１つまたはそれ以上の連結残基、例えばＧｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ等を介して免疫原性ペプチドに連結される。次に脂
質化ペプチドは、ミセルまたは粒子中に直接投与され、リポソーム中に組み込ま
れるか、あるいはアジュバント、例えば不完全フロイントアジュバント中で乳化
され得る。好ましい免疫原性組成物は、Ｌｙｓのε−およびα−アミノ基に結合
されるパルミチン酸を含み、これは、結合（例えばＳｅｒ−Ｓｅｒ）を介して免
疫原性ペプチドのアミノ末端に結合される。
【０２１１】 ＣＴＬ応答の脂質プライミングの別の例として、Ｅ．ｃｏｌｉリポタンパク質
（例えばトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ ＣＳＳ））は、適切なペプチドと共有結合される場合、ウイルス特異的ＣＴＬを
プライミングするために用いられ得る（例えば、Ｄｅｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ
３４２：５６１，１９８９参照）。本発明のペプチドは、例えば標的抗原に対す
るＣＴＬ応答を特異的にプライミングするために個体に投与されるリポペプチド
であるＰ３ＣＳＳに結合され得る。さらに中性抗体の誘導も、Ｐ３ＣＳＳ結合エ
ピトープでプライミングされ得る。２つのこのような組成物は、より効率的に体
液および細胞媒介性応答を引き出すために併合され得る。
【０２１２】 ＣＴＬおよび／またはＨＴＬペプチドは、互いにペプチドを連結するのを容易
にする、キャリア支持体またはより大きなペプチドにカップリングする、ペプチ
ドまたはオリゴペプチドの物理的または化学的特性を修飾する、などのためにペ
プチドの末端にアミノ酸を付加することによっても修飾され得る。アミノ酸、例
えばチロシン、システイン、リシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸などは
、ペプチドまたはオリゴペプチド、特にクラスＩペプチドのＣまたはＮ−末端に
導入され得る。しかしながら、ＣＴＬエピトープのカルボキシル末端の修飾は、
いくつかの場合には、ペプチドの結合特性を変え得るということに留意すべきで
ある。さらにペプチドまたはオリゴペプチド配列は、末端ＮＨ２アシル化により
、例えばアルカノイル（Ｃ１〜Ｃ２０）またはチオグリコリルアセチル化、末端
カルボキシルアミド化、例えばアンモニア、メチルアミン等により修飾されるこ
とにより天然配列と異なり得る。いくつかの場合には、これらの修飾は、支持体
またはその他の分子に結合するための部位を提供し得る。
【０２１３】 （ＩＶ．Ｋ．４．ＣＴＬおよび／またはＨＴＬペプチドでパルス化されたＤＣ
を含むワクチン組成物） 本発明のワクチン組成物の実施形態は、エピトープ保有ペプチドのカクテルを
患者血液からＰＢＭＣまたはそこからの単離ＤＣへエキソビボで投与することを
包含する。ＤＣの収集を促すための薬剤、例えばＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ
（商標）（Ｍｏｎｓａｎｔｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／
ＩＬ−４が用いられ得る。ペプチドを用いて、ＤＣをパルス化後、かつ患者への
再注入前にＤＣを洗浄して非結合ペプチドを除去する。この実施形態では、ワク
チンは、それらの表面にＨＬＡ分子と複合体を形成するパルス化ペプチドエピト
ープを提示するペプチドパルス化ＤＣを含む。
【０２１４】 ＤＣは、ペプチドのカクテルを用いてエキソビボでパルス化され得、そのうち
のいくつかは、１つ以上の目的の抗原（例えば前立腺関連抗原（例えばＰＳＡ、
ＰＳＭ、ＰＡＰ、カリクレインなど）、）に対するＣＴＬ応答を刺激する。必要
に応じて、ヘルパーＴ細胞ペプチド、例えばＰＡＤＲＥ（登録商標）ファミリー
分子は、ＣＴＬ応答を促進するために含入され得る。
【０２１５】 （ＩＶ．Ｌ．治療または予防用途のためのワクチンの投与） 本発明のペプチドならびに製剤および本発明のワクチン組成物は、代表的には
癌（特に、前立腺癌）を治療するために治療的に用いられる。本発明のペプチド
を含有するワクチン組成物は、代表的には１つ以上の前立腺関連抗原の発現に関
連した悪性疾患を有する前立腺癌患者に投与される。あるいはワクチン組成物は
、特定の種類の癌、例えば乳癌に罹り易いか、またはそうでなければ前立腺癌を
発症する危険がある個体に投与され得る。
【０２１６】 治療的用途においては、ペプチドおよび／または核酸組成物は、腫瘍抗原に対
する有効なＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を引き出すのに、そして症状および
／または合併症を治癒するかあるいは少なくとも部分的に休止させるかまたは遅
延させるのに十分な量で患者に投与される。これを成し遂げるのに適した量は、
「治療的有効用量」と定義される。この使用に有効な量は、例えば投与される特
定の組成物、投与の方法、治療される疾患の病期および重症度、患者の体重およ
び全身健康状態、ならびに処方医の判断によっている。
【０２１７】 上記のように、本発明のＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープを含むペプチ
ドは、ＨＬＡ分子により提示され、ペプチドにより構成されるエピトープに特異
的なＣＴＬまたはＨＴＬと接触されると、免疫応答を誘導する。このペプチド（
またはそれらをコードするＤＮＡ）は、個々にまたは１つ以上のペプチド配列の
融合物として投与され得る。ペプチドがＣＴＬまたはＨＴＬと接触される方法は
、本発明にとっては重要でない。例えばペプチドはインビボまたはインビトロで
ＣＴＬまたはＨＴＬと接触され得る。接触がインビボで起こる場合、ペプチドそ
れ自体が患者に投与されるか、あるいはその他のビヒクル、例えば１つまたはそ
れ以上のペプチドをコードするＤＮＡベクター、ペプチド（単数または複数）を
コードするウイルスベクター、リポソーム等が、本明細書中に記載されているよ
うに用いられ得る。
【０２１８】 ペプチドがインビトロで接触される場合、ワクチン剤は、細胞、例えばインビ
トロでペプチドを用いて抗原提示細胞をパルス処理することによって、または本
発明のミニジーンを用いて抗原提示細胞をトランスフェクトすることによって誘
導された、ペプチドパルス化樹状細胞またはＴＡＡ特異的ＣＴＬの集団を含み得
る。その後、このような細胞集団は治療的有効量で患者に投与される。
【０２１９】 治療的使用に関しては、投与は一般に、癌の初回診断時に開始すべきである。
この後、少なくとも症状が実質的に軽減されるまで、そしてその後一定期間、用
量をブーストさせる。患者に送達されるワクチン組成物の実施形態（即ち、その
例としては例えば、ペプチドカクテル、ポリエピトープポリペプチド、ミニジー
ンまたはＴＡＡ特異的ＣＴＬまたはパルス化された樹状細胞が挙げられるが、こ
れらに限定されない）は、疾患または患者の健康状態の段階によって変わり得る
。例えばＴＡＡ特異的ＣＴＬを含むワクチンは、代替的実施形態よりも進行性疾
患患者における腫瘍細胞を死滅させることにおいてより有効であり得る。
【０２２０】 本発明のワクチン組成物は、手術のような治療と組合せて治療的にも用いられ
得る。一例は、患者が原発性腫瘍を除去するために手術を受け、その後ワクチン
を用いて、再発および／または転移を遅延させたりまたは防止する状況である。
【０２２１】 感受性個体、例えば前立腺腫瘍の発症に対して遺伝的素因を受け継いでいると
診断され得る個体が、癌の診断前に同定された場合、組成物はそれらを標的にし
、したがってより大きな集団への投与の必要性を最小限にし得る。
【０２２２】 初回治療的免疫化のための投与量は一般に、低いほうの値が約１、５、５０、
５００または１，０００μｇであり、高い方の値が約１０，０００、２０，００
０、３０，０００、または５０，０００μｇである単位投与量範囲である。ヒト
のための投与量値は、代表的には体重７０ｋｇの患者につき約５００μｇ〜約５
０，０００μｇ範囲である。初回用量に引き続いて確立された間隔（例えば、４
週間〜６ヶ月）での免疫追加は、患者を有効に処置するための時間の可能な限り
延長した期間を必要とされ得る。数週間〜数ヶ月間にわたる追加免疫レジメンに
したがって約１．０μｇ〜約５０，０００μｇのペプチドの追加免疫投与量が、
患者の応答、ならびに患者の血液から得られるＣＴＬおよびＨＴＬの特異的活性
を測定することにより確定されるような条件に依存して投与され得る。
【０２２３】 投与は、少なくとも臨床症状または実験室試験が、腫瘍が排除されたことを、
または腫瘍細胞負荷が実質的に軽減されたことを示唆するまで、そしてその後一
定期間、継続されるべきである。投与の投与量、経路および用量計画は、当該分
野で公知の方法論にしたがって調整される。
【０２２４】 特定の実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、重篤な疾患状態に、
即ち致命的または致命的な恐れのある状況で用いられる。このような場合、本発
明の好ましい組成物中の最小量の外来物質および比較的に無毒性のペプチドの結
果、これらの規定投与量と比較して実質的に過剰量のこれらのペプチド組成物を
投与することができるし、治療医には望ましいと感じられ得る。
【０２２５】 本発明のワクチン組成物は、また予防薬として使用され得る。例えば、組成物
は、前立腺癌を発症する危険のある個体に投与され得る。初回治療的免疫化のた
めの投与量は一般に、低いほうの値が約１、５、５０、５００または１，０００
μｇであり、高い方の値が約１０，０００、２０，０００、３０，０００、また
は５０，０００μｇである単位投与量範囲である。ヒトのための投与量値は、代
表的には体重７０ｋｇの患者につき約５００μｇ〜約５０，０００μｇ範囲であ
る。数週間〜数ヶ月間にわたる追加免疫レジメンにしたがって約１．０μｇ〜約
５０，０００μｇのペプチドの追加免疫投与量が、患者の応答、ならびに患者の
血液から得られるＣＴＬおよびＨＴＬの特異的活性を測定することにより確定さ
れるような条件に依存して投与され得る。
【０２２６】 治療的処置のための薬学的組成物は、非経口的、局所的、経口的、鞘内または
限局投与を意図される。好ましくは薬学的組成物は、非経口的に、例えば静脈内
、皮下、皮内または筋肉内に投与される。したがって本発明は、受容可能なキャ
リア、好ましくは水性キャリア中に溶解または懸濁される免疫原性ペプチドの溶
液を含む非経口投与用の組成物を提供する。種々の水性キャリア，例えば水、緩
衝化水、０．８％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等が用いられ得る。
これらの組成物は、慣用的周知の滅菌技法により滅菌され得るし、あるいは滅菌
濾過され得る。その結果生じる水溶液は、そのままで用いるために包装されるか
、あるいは凍結乾燥され、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌溶液と併合される。組
成物は、生理学的に近似していることが要求される薬学的に受容可能な補助物質
、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤、防腐剤等、例えば酢酸
ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム
、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート等を含有し得る
。
【０２２７】 薬学的処方物中の本発明のペプチドの濃度は広範に、即ち約０．１％未満、通
常少なくとも約２重量％から、２０重量％〜５０重量％またはそれ以上の範囲で
変わり得、選定された特定の投与形態にしたがって、主として流体容積、粘度な
どにより選定される。
【０２２８】 ペプチド組成物のヒト単位用量形態は、代表的には、ヒト単位用量の受容可能
なキャリア、好ましくは水性キャリアを含む薬学的組成物中に含入され、そして
ヒトへのこのような組成物の投与のために用いられることが当業者に既知である
流体の容積中に投与される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）Ｍａ
ｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉ
ａ，１９８５参照）。
【０２２９】 本発明のペプチドは、特定の組織、例えばリンパ系組織に対してペプチドを標
的にするのに、あるいは感染細胞に対して選択的に標的にするのに、ならびにペ
プチド組成物の半減期を増大するのに役立つリポソームを介しても投与され得る
。リポソームは、エマルジョン、発泡体、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質
分散液、ラメラ層等を含む。これらの調製物中では、送達されるペプチドはリポ
ソームの一部として、単独で、またはリンパ系細胞、例えばＣＤ４５抗原に結合
するモノクローナル抗体間に広く存在している受容体に結合する分子と一緒に、
あるいはその他の治療用または免疫原性組成物と一緒に、組入れられ得る。した
がって、本発明の所望のペプチドを充填されるかまたはそれで修飾されるリポソ
ームはリンパ系細胞の部位に向けられて、そこでリポソームは次に、ペプチド組
成物を送達する。本発明にしたがって用いるためのリポソームは、標準小胞形成
脂質から形成され、これは一般に中性および負荷電リン脂質、ならびにステロー
ル、例えばコレステロールを含む。脂質の選定は一般に、例えばリポソームサイ
ズ、酸の不安定性および血流中のリポソームの安定性を考察することにより導き
出される。リポソームを調製するためには、例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７ （１９８０）および米国特
許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号
および第５，０１９，３６９号に記載されているような種々の方法が利用可能で
ある。
【０２３０】 免疫系の細胞をターゲッティングするために、リポソーム中に組入れられるリ
ガンドとしては、例えば所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体また
はそれらの断片が挙げられる。ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、静脈内
、限局的、局所的等で、とりわけ、投与の様式、送達されるペプチドおよび処置
される疾患の病期によって変わる用量で、投与され得る。
【０２３１】 固体組成物に関しては、従来の無毒性固体キャリアが用いられ、その例として
は、例えば製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグ
ネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロ
ース、炭酸マグネシウム等が挙げられる。経口投与に関しては、薬学的に受容可
能な無毒性組成物が、通常で用いられる賦形剤、例えば上記キャリアのいずれか
、一般的に１０〜９５％の活性成分、即ち本発明の１つまたはそれ以上のペプチ
ドを、ならびにさらに好ましくは２５％〜７５％の濃度で組み込むことにより形
成される。
【０２３２】 エアロゾル投与に関しては、免疫原性ペプチドは好ましくは界面活性剤および
噴射剤と一緒に、微粉砕形態で供給され得る。ペプチドの代表的パーセンテージ
は、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％である。界
面活性剤は、もちろん無毒性であり、好ましくは噴射剤中に可溶である。このよ
うな物質の代表例は、６〜２２個の炭素原子を含有する脂肪酸、例えばカプロン
酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノ
レン酸、オレステリック酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、オレイン酸の、
脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物とのエステルまたは部分エステルで
ある。混合エステル、例えば混合または天然グリセリドが用いられ得る。界面活
性剤は、組成物の０．１重量％〜２０重量％、好ましくは０．２５重量％〜５重
量％を構成し得る。組成物の残余物は、普通は噴射剤である。所望により、例え
ば鼻腔内送達のためのレシチンのような、キャリアも含まれ得る。
【０２３３】 （ＩＶ．Ｍ．ＨＬＡ発現：Ｔ細胞ベースの免疫療法に対する関連） （癌および感染性疾患における疾患進行） 動的相互作用が、癌および感染性疾患の設定において宿主および疾患間に存在
することは十分認識されている。感染性疾患の設定では、病原体が疾患中に進化
するいうことは十分確定されている。ＨＩＶ感染において初期に優勢である菌株
は、ＡＩＤＳおよび後期疾患段階に関連するものとは異なる（ＮＳ対Ｓ菌株）。
感染の確立において有効である病原体形態は、複製および慢性に関して最も有効
であるものとは異なり得ることが長い間仮定されてきた。
【０２３４】 同様に、個体が新生物性疾患に屈する病理プロセスは複雑であることが広範に
認識されている。疾患の経過中、多数の変化が癌細胞中で起こる。腫瘍は、増殖
および分化の機能不全調節に部分的に関連するが、その増殖能力を最大にするこ
とにも関連し、薬剤治療および／または身体の免疫監視から逃れる変異を蓄積す
る。新生物性疾患は、疾患進行の関数としての癌細胞のいくつかの異なる生化学
的変化の蓄積を生じる。それは、特に後期転移期において、有意レベルの癌内お
よび癌間異質性も生じる。
【０２３５】 治療結果に影響を及ぼす細胞変化のよく知られた例としては、治療経過中の放
射線または化学療法耐性腫瘍の進展が挙げられる。これらの例は、攻撃的化学療
法の結果としての薬剤耐性ウイルス株の出現、例えば慢性ＨＢＶおよびＨＩＶ感
染の出現、ならびに結核およびマラリアを引き起こす薬剤耐性生物の現行の復活
と並行している。応答の有意の異質性は、癌療法に対するその他のアプローチ、
例えば抗血管新生剤、受動抗体免疫療法、および活性Ｔ細胞ベースの免疫療法に
も関連する。したがって、このような現象の点から見て、多疾患関連抗原からの
エピトープはワクチンおよび治療薬に用いられることができ、それにより、突然
変異を生じ治療を逃れる疾患細胞の能力を妨害する。
【０２３６】 （疾患と免疫系の間の相互作用） 宿主と疾患の間の動的相互作用に関与する主な因子のうちの１つが、病原体，
感染細胞または悪性疾患細胞に対して立ち上げられる免疫応答である。多数の症
状において、このような免疫応答は疾患を制御する。いくつかの動物モデル系お
よびヒトにおける自然感染の期待される研究は、病原体に対する免疫応答が病原
体を制御し、重症疾患への進行を防止し、および／または病原体を排除し得るこ
とを示唆する。共通の主題は、多特異的Ｔ細胞応答に関する要件であり、狭い範
囲に集中する応答は有効性が低いと思われる。これらの観察は、広範な免疫応答
を提供する本発明の方法および組成物の実施形態に関して当業者に指針を示す。
【０２３７】 癌の場合、免疫応答が新生物増殖に影響を及ぼし得ることを示す以下のような
いくつかの知見が認められる： 第一に、多数の異なる動物モデルにおける、ＭＨＣクラスＩにより拘束される
抗腫瘍Ｔ細胞が腫瘍を防止し、または治療することが可能であるという証拠。
【０２３８】 第二に、有望な結果が免疫療法試験から得られた。
【０２３９】 第三に、自然疾患の経過中に成された観察が腫瘍内のＴ細胞浸潤の型および組
成を陽性臨床結果と相関させた（Ｃｏｕｌｉｅ ＰＧら、Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ
ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｔ ｗｏｒｋ ｉｎ ａ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅ
ｎｔ Ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１
３−２４２，１９９９）。
【０２４０】 最後に、腫瘍は一般的に、突然変異を引き起こし、それによりそれらの免疫学
的認識を変える能力を有する。例えば、単一特異的ＣＴＬの存在は、抗原損失が
発生するまで、腫瘍増殖の制御にも相関した（Ｒｉｋｅｒ Ａら、Ｉｍｍｕｎｅ
ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍ
ｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ａｕｇ；
１２６（２）：１１２−２０，１９９９；Ｍａｒｃｈａｎｄ Ｍら、Ｔｕｍｏｒ
ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉ
ｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ
ａｎ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ
ＭＡＧＥ−３ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｂｙ ＨＬＡ−Ａ１ Ｉｎｔ
．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８０（２）：２１９−３０，Ｊａｎ．１８，１９９９）。
同様に、β２ミクログロブリンの損失が、ＮＣＩで免疫療法を受けた後の黒色腫
患者から確立された５／１３株で検出された（Ｒｅｓｔｉｆｏ ＮＰら、Ｌｏｓ
ｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｂｅｔａ２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａｓ ｆｒｏｍ ｆｉｖｅ ｐａ
ｔｉｅｎｔｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，
Ｖｏｌ．８８（２），１００−１０８，Ｊａｎ．１９９６）。ＨＬＡクラスＩは
種々の腫瘍型で高頻度に変更される、ということが長い間認識されてきた。これ
は、クラスＩ拘束ＣＴＬにより腫瘍に加えられる免疫圧力をこの現象が反映し得
る、という仮説をもたらした。ＨＬＡクラスＩ発現の変更の範囲および程度は、
過去の免疫圧力を反映するものであると思われ、予後値も有し得る（ｖａｎ Ｄ
ｕｉｎｅｎ ＳＧら、Ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＨＬＡ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｌ
ｏｃｏｒｅｇｉｏｎａｌ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ
ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉ
ｔｈ ｍｅｌａｎｏｍａ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８，１０１９−
１０２５，Ｆｅｂ．１９８８；Ｍｏｌｌｅｒ Ｐら、Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ
ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌ
ａｓｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ
ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ ５１，７２９−７３６，Ｊａｎ．１９９１）。合わせて考えると、これらの
観察は癌および感染性疾患の免疫療法の根拠を提供し、そして有効な戦略は、疾
患に関連した一連の複雑な病理学的変化を説明する必要があることを示唆する。
【０２４１】 （腫瘍におけるＨＬＡ発現の３つの主な型の変化ならびにそれらの機能的意味
） 腫瘍におけるＨＬＡクラスＩ抗原の発現のレベルおよびパターンは、多数の異
なる腫瘍型で研究されており、研究された腫瘍の全ての型において変化が報告さ
れている。ＨＬＡクラスＩ変化の基礎を成す分子メカニズムは、全く異質である
ことを立証した。それらは、ＴＡＰ／プロセシング経路の変化、β２−ミクログ
ロブリンおよび特異的ＨＬＡ重鎖の突然変異、クラスＩ発現を制御する調節エレ
メントの変化、ならびに全染色体区分の損失を包含する。この題目に関するいく
つかの総説がある（例えば、Ｇａｒｒｉｄｏ Ｆら、Ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔ
ｏｒｙ ｏｆ ＨＬＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｕｍｏｕｒ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １４（１０）：４９１
−４９９，１９９３；Ｋａｋｌａｍａｎｉｓ Ｌら、Ｌｏｓｓ ｏｆ ＨＬＡ
ｃｌａｓｓ−Ｉ ａｌｌｅｌｅｓ，ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎｓ ａｎｄ β２−
ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５１（３）：３７９−８５，Ｍａｙ ２８，１９９２
参照）。ＨＬＡクラスＩ変化には３つの主な型が存在する（完全損失、対立遺伝
子特異的損失および発現低減）。各変化の機能的意味は別個に考察される。
【０２４２】 （ＨＬＡ発現の完全損失） ＨＬＡ発現の完全損失は、種々の異なる分子メカニズムに起因し得る。それら
については以下の文献で概説されている（Ａｌｇａｒｒａ Ｉら、Ｔｈｅ ＨＬ
Ａ ｃｒｏｓｓｒｏａｄ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｈｕｍａ
ｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６１，６５−７３，２０００；Ｂｒｏｗｎｉｎｇ
Ｍら、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｌｏｓｓ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ
ｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４７：３６４−３７１，１９９６；Ｆｅ
ｒｒｏｎｅ Ｓら、Ｌｏｓｓ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｇｅｎ
ｓ ｂｙ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｍｓ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎｄ ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，１６（
１０）：４８７−４９４，１９９５；Ｇａｒｒｉｄｏ Ｆら、Ｎａｔｕｒａｌ
ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ＨＬＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｕｍ
ｏｕｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １４（
１０）：４９１−４９９，１９９３；Ｔａｉｔ，ＢＤ，ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ：Ｉｍ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａ
ｐｙ Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６１，１５８−１６５，２０００）。機能に関
して、この型の変化はいくつかの重要な意味を有する。
【０２４３】 クラスＩ発現の完全非存在はそれらの腫瘍細胞のＣＴＬ認識を排除するが、一
方、ＨＬＡクラスＩの損失も、ＮＫ細胞からの溶解に対して腫瘍細胞を異常に感
受性にさせる（Ｏｈｎｍａｃｈｔ，ＧＡら、Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇ
ｅｎｓ ａｎｄ ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ
ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ Ｊ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙ
ｓ １８２：３３２−３３８，２０００；Ｌｉｕｎｇｇｒｅｎ ＨＧら、Ｈｏｓ
ｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｇ
ａｉｎｓｔ Ｈ−２ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｖａｒｉａｎｔ
ｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．，Ｄｅｃ １：１６２（６）：１７４５−５９，１９８５；Ｍａｉｏ Ｍら
、Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｎａｔｕ
ｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕ
ｍａｎ ＦＯ−１ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂ２ｍ ｇｅｎｅ Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８（１）：２８２−９，Ｊｕｌｙ １９９１：Ｓｃｈｒ
ｉｅｒ ＰＩら、Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｙｃ ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０：１８１−２４６，１
９９３）。
【０２４４】 ＨＬＡ発現の損失とＮＫ感受性の獲得との間の相補的相互作用は、Ｃｏｕｌｉ
ｅと共同研究者（Ｃｏｕｌｉｅ，ＰＧら、Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔ
ｙ ａｔ ｗｏｒｋ ｉｎ ａ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔ．Ｉｎ Ａ
ｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１３−２４２，１
９９９）の、数年に亘る経過中の患者の免疫応答の進展を記載した古典的研究に
より例示されている。ＮＫ溶解に対する感受性増大のために、概して生得免疫の
、特にＮＫ活性の刺激をもたらすアプローチは特別の意義を有することが予測さ
れる。このようなアプローチの一例は、種々の造血性増殖因子、例えばＦｌｔ３
リガンドまたはＰｒｏＧＰによる大量の樹状細胞（ＤＣ）の誘導である。このア
プローチに関する根拠は、樹状細胞が、生得免疫および特にＮＫ活性に対する最
も強力な刺激剤の１つである大量のＩＬ−１２を産生するという周知の事実にあ
る。あるいはＩＬ−１２は直接投与されるか、またはそれをコードする核酸とし
て投与される。この点から見て、Ｆｌｔ３リガンド治療がクラスＩ陰性前立腺ネ
ズミ癌モデルの一過性腫瘍退行を生じるということに留意するのは興味深い（Ｃ
ｉａｖａｒｒａ ＲＰら、Ｆｌｔ３−Ｌｉｇａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｒａｎ
ｓｉｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｎ ｅｃｔｏｐｉｃ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａ
ｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃ
ａｎｃｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：２０８１−８４，２０００）。この
情況では、本発明の特異的抗腫瘍ワクチンはこれらの型の造血増殖因子と相乗作
用して、ＣＴＬおよびＮＫ細胞応答の両方を促進し、それにより突然変異を生じ
、それにより有効な治療を逃れる細胞の能力を明らかに減損する。したがって本
発明の実施形態は、本発明の組成物を、ＮＫ細胞の機能的活性または数を増大す
る方法または組成物と一緒に包含する。このような実施形態は、ＮＫ誘導性の様
式で引き続き、あるいはＮＫ誘導性の様式で同時期に、本発明の組成物を提供す
るプロトコールを包含し得る。
【０２４５】 第二に、ＨＬＡの完全損失はしばしば腫瘍細胞の画分においてのみ起こるが、
一方、腫瘍細胞の残り部分は正常発現を示し続ける。機能に関して、腫瘍は部分
的に依然としてＣＴＬ応答からの直接攻撃を受け、細胞のＨＬＡを欠く部分はＮ
Ｋ応答を受ける。ＣＴＬ応答のみが用いられる場合でも、腫瘍のＨＬＡ発現画分
の破壊は生存時間およびクオリティーオブライフに劇的影響を及ぼす。
【０２４６】 異種ＨＬＡ発現の場合には、正常ＨＬＡ発現ならびに欠陥細胞はともに、「傍
観者効果」に基づいた免疫破壊を受け易いと予測される、ということにも留意す
べきである。このような効果は、例えば抗体標的化スーパー抗原の作用のインビ
ボメカニズムを調べたＲｏｓｅｎｄａｈｌと共同研究者の研究において立証され
た（Ｒｏｓｅｎｄａｈｌ Ａら、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ ａｎｄ ＩＦＮ−ｇａｍｍ
ａ ａｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅ
ｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅ
ｎｓ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（１１）：５３０９−１３，Ｊｕｎｅ １，
１９９８）。傍観者効果は、例えばＨＬＡ保有標的細胞に作用するＣＴＬから引
き出されるサイトカインにより媒介され、それによりサイトカインは付随して殺
害される他の罹患細胞の環境中に存在すると理解される。
【０２４７】 （対立遺伝子特異的損失） クラスＩ分子の変化の最も一般的な種類の１つは、ＨＬＡに対してヘテロ接合
性の個体中のある種の対立遺伝子の選択的損失である。対立遺伝子特異的変化は
、単一ＨＬＡ拘束エレメントにより拘束されるイムノドミナント（ｉｍｍｕｎｏ
ｄｏｍｉｎａｎｔ）応答により加えられる免疫圧力に対する腫瘍適合を反映し得
る。この種類の変化は、腫瘍にクラスＩ発現を保持させ、したがってＮＫ細胞認
識を逃れさせるが、なお依然として残りのＨＬＡ型に対応するエピトープを含む
本発明のＣＴＬベースのワクチンに感受性である。したがって対立遺伝子特異的
損失の考え得るハードルを克服するための実際的な解決策は、多数の特異的応答
の誘導に頼っている。本発明のワクチン中の多数の疾患関連抗原の含入は特定の
疾患抗原の損失を生じる突然変異を防ぐのとちょうど同じように、多数のＨＬＡ
特異性および多数の疾患関連抗原を同時にターゲッティングすることは、対立遺
伝子特異的損失による疾患逃避を阻止する。
【０２４８】 （発現の低減（対立遺伝子特異的または非特異的）） エフェクターＣＴＬの感受性は、長年立証されてきた（Ｂｒｏｗｅｒ，ＲＣら
、Ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｅ
ｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８＋ＣＴＬ Ｍｏｌ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．，３１：１２８５−９３，１９９４；Ｃｈｒｉｕｓｔｎｉｃｋ，ＥＴ
ら、Ｌｏｗ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ
ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｔｒｉｇｇｅｒ ａ Ｔ ｃ
ｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６７−７０，１９９１；Ｓ
ｙｋｕｌｅｖ，Ｙら、Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｐｅｐ
ｔｉｄｅ−ＭＨＣ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｎ ａ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｃａ
ｎ ｅｌｉｃｉｔ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｉ
ｍｍｕｎｉｔｙ，４（６）：５６５−７１，Ｊｕｎｅ １９９６）。単一ペプチ
ド／ＭＨＣ複合体でさえ、腫瘍細胞溶解を生じ、抗腫瘍リンホカインを放出し得
る．ＨＬＡ発現低減および免疫認識からの考え得る腫瘍逃避の生物学的意義は、
完全にはわかっていない。それにもかかわらず、１つという少ないＭＨＣ／ペプ
チド複合体のＣＴＬ認識で、腫瘍細胞溶解を導くのに十分である、ということが
立証されている。
【０２４９】 さらに、ＨＬＡの発現は、エフェクターＣＴＬにより一般的に分泌されるγＩ
ＦＮにより上方制御され得る、ということが一般的に観察される。さらにＨＬＡ
クラスＩ発現は、αおよびβＩＦＮの両方によりインビボで誘導され得る（Ｈａ
ｌｌｏｒａｎら、Ｌｏｃａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎｄｕｃ
ｅ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ＭＨＣ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ １４８：３８３７，１９９２；Ｐｅｓｔｋａ，Ｓら、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ
ｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｏｎｓ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．５６：７２７−７７，１９８７）。逆に、ＨＬＡクラスＩ発現のレベル低減も
細胞をＮＫ溶解に対してより感受性にさせる。
【０２５０】 γＩＦＮに関しては、Ｔｏｒｒｅｓ等（Ｔｏｒｒｅｓ，ＭＪら、Ｌｏｓｓ ｏ
ｆ ａｎ ＨＬＡ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｓ ｃａｎｃｅ
ｒ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｕｍｏｒ
ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４
７：３７２−８１，１９９６）は、ハロタイプの全体的損失が起こらない限り、
ＨＬＡ発現が膵臓癌におけるγＩＦＮにより上方制御される、ということに注目
している。同様にＲｅｅｓとＭｉａｎは、対立遺伝子欠失および損失は、サイト
カイン（例えばＩＦＮ−γ）により少なくとも部分的に回復され得る、というこ
とに注目した（Ｒｅｅｓ，Ｒら、Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＭＨＣ ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｕｒｓ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ａｄａｐｔｉｖｅ ａｎ
ｄ ｉｎｎａｔｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ４８：３７４−８１，１９９９）。
ＩＦＮ−γ治療は、研究された症例の大多数におけるクラスＩ分子の上方制御を
もたらす、ということも注目された（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ Ｍら、Ｍｅｃｈａｎｉ
ｓｍｓ ｏｆ ｌｏｓｓ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ ｏｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ，Ｔｉｓｓｕｅ Ａ
ｎｔｉｇｅｎｓ ４７：３６４−３７１，１９９６）。Ｋａｋｌａｍａｋｉｓ等
も、ＩＦＮ−γを用いるアジュバント免疫療法がＨＬＡクラスＩ陰性腫瘍の場合
に有益であり得る、ということを示唆した（Ｋａｋｌａｍａｎｉｓ Ｌ，Ｌｏｓ
ｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉ
ｎｇ １ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍａｊｏｒ ｈｉｓ
ｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅ
ｃｕｌｅｓ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｖｅｒｓｕｓ ｐｒｉｍａｒｙ ｂ
ｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５：５１９１
−９４，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９５）。局所炎症／免疫化によりＩＦＮ−γ産
生が誘導され、自己増幅されて（Ｈａｌｌｏｒａｎら、Ｌｏｃａｌ Ｔ ｃｅｌ
ｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ＭＨＣ ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：３８３７，１９９２）、炎症
部位から離れた部位でもＭＨＣ発現の大増加をもたらす、と強調することは重要
である。
【０２５１】 最後に、研究により、ＨＬＡ発現の低減が腫瘍細胞をＮＫ溶解に対してより感
受性にさせ得るということが立証された（Ｏｈｎｍａｃｈｔ，ＧＡら、Ｈｅｔｅ
ｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｕ
ｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ Ｊ
Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓ １８２：３３２−３３８，２０００；Ｌｉｕｎｇ
ｇｒｅｎ ＨＧら、Ｈｏｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｅ
ｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｈ−２ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｌｙｍｐ
ｈｏｍａ ｖａｒｉａｎｔｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｍ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６２（６）：１７４５−５９，Ｄｅｃｅｍｂ
ｅｒ １，１９８５；Ｍａｌｏ Ｍら、Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｓｃｅ
ｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ−ｍｅｄ
ｉａｔｅｄ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＦＯ−１ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃ
ｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ
ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｗ
ｉｔｈ β２ｍ ｇｅｎｅ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８（１）：２８２
−９，Ｊｕｌｙ １９９１：Ｓｃｈｒｉｅｒ ＰＩら、Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉ
ｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｙｃ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎ
ｄ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．，６０：１８１−２４６，１９９３）。もしＨＬＡ発現の低減が、ＣＴ
Ｌ逃避を促すために腫瘍に対して利益を与えるが、腫瘍をＮＫ溶解に対して感受
性にさせるならば、ＮＫ活性に対する耐性を可能にするＨＬＡ発現の最小レベル
が選定される（Ｇａｒｒｉｄｏ Ｆら、Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉ
ｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ａｌｔｅｒｅｄ ＨＬＡ ｃｌａ
ｓｓ Ｉ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｕｒｓ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １８（２）：８９−９６，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９９７
）。したがって本発明の治療用組成物または方法は、ＨＬＡ発現を上方制御する
ための治療および／または高親和性Ｔ細胞による治療と一緒に、腫瘍をＣＴＬ破
壊に対して感受性にさせる。
【０２５２】 （ＨＬＡ発現における変化の頻度） クラスＩ発現における変化の頻度は、多数の研究の対象である（Ａｌｇａｒｒ
ａ Ｉら、Ｔｈｅ ＨＬＡ ｃｒｏｓｓｒｏａｄ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６１，６５−７３，２００
０）。ＲｅｅｓとＭｉａｎは、対立遺伝子損失は全体で３〜２０％の腫瘍に起こ
り、対立遺伝子欠失は１５〜５０％の腫瘍で起こると概算している。各細胞は２
つの別々の組のクラスＩ遺伝子を有し、その各遺伝子が１つのＨＬＡ−Ａおよび
１つのＨＬＡ−Ｂ遺伝子座を保有する、ということに留意すべきである。したが
って完全へテロ接合型個体は、２つの異なるＨＬＡ−Ａ分子と２つの異なるＨＬ
Ａ−Ｂ分子を保有する。したがって、任意の特異的対立遺伝子に関する損失の実
際の頻度は、全頻度の４分の１という少なさであり得る。概して、発現の勾配は
正常細胞、原発性腫瘍および腫瘍転移間に存在する、ということにも彼等は留意
した。Ｎａｔａｌｉと共同研究者（Ｎａｔａｌｉ ＰＧら、Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ
ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ
Ｉ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ
ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：６７１９−６７２３，Ｓ
ｅｐｔｅｍｂｅｒ １９８９）からの研究では、固形腫瘍は、Ｗ６／３２抗体を
用いて、全体的ＨＬＡ発現に関して、およびＢＢ７．２抗体の使用により評価し
た場合のＡ２抗原の対立遺伝子特異的発現に関して検査された。腫瘍試料は、１
３の異なる腫瘍型に関して原発性癌または転移から得られ、２０％未満である場
合は陰性、３０〜８０％の範囲である場合には低減、そして８０％を超える場合
には正常と採点された。腫瘍は全て、原発性も転移も、Ｗ６／３２を用いてＨＬ
Ａ陽性であった。Ａ２発現に関しては、低減は１６．１％の症例で認められ、Ａ
２は３９．４％の症例で検出されないと採点された。Ｇａｒｒｉｄｏと共同研究
者（Ｇａｒｒｉｄｏ Ｆら、Ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ＨＬＡ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｕｍｏｕｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １４（１０）：４９１−９９，１９９３）は、
ＨＬＡ変化は良性から最も攻撃的までの進行中の特定の段階で起こると思われる
ことを強調した。Ｊｉｍｉｎｅｚ等（Ｊｉｍｉｎｅｚ Ｐら、Ｍｉｃｒｏｓａｔ
ｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ
ｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｏｔａ
ｌ ｌｏｓｓ ｏｆ ＨＬＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕ
ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ４８：６８４−９０，２０００）は、１１８の
異なる腫瘍を分析した（結腸直腸癌６８例、喉頭癌３４例および黒色腫１６例）
。ＨＬＡ発現の全体的損失に関して報告された頻度は、結腸癌１１％、黒色腫１
８％および喉頭癌１３％であった。したがってＨＬＡクラスＩ発現は、恐らくは
免疫圧力の反映として、または病理学的変化および罹患細胞の変化の蓄積の単な
る反映として、腫瘍型の有意の画分中で変更される。
【０２５３】 （ＨＬＡ損失情況での免疫療法） 大多数の腫瘍はＨＬＡクラスＩを発現し、後期段階で、かつ低分化腫瘍におい
て、より重篤な変化が見出される傾向がある。このパターンは、免疫療法の情況
において有望であり、特に以下のようであると考える：１）免疫組織化学的技法
の相対的低感度は、腫瘍におけるＨＬＡ発現を低く評価し得る；２）クラスＩ発
現は、局所的炎症およびリンホカイン放出の結果として腫瘍細胞中で誘導され得
る；および３）クラスＩ陰性細胞は、ＮＫ細胞による溶解に感受性である。
【０２５４】 したがって本発明の種々の実施形態は、特に腫瘍性疾患の情況において、ＨＬ
Ａ分子のある程度の損失が存在し得るという事実を考慮して選択され得る。例え
ば治療医は、ＨＬＡが発現されているか否かを確証するために患者の腫瘍をアッ
セイし得る。あるパーセンテージの腫瘍細胞がクラスＩＨＬＡを発現しないなら
ば、ＮＫ細胞応答を引き出す方法または組成物を含む本発明の実施形態が用いら
れ得る。本明細書中に記載されているように、このようなＮＫ誘導法または組成
物は、樹状細胞の動員を促進するＦＩｔ３リガンドまたはＰｒｏＧＰを含み得る
。理論的根拠は、樹状細胞が大量のＩＬ−１２を産生するということにある。Ｉ
Ｌ−１２はアミノ酸形態または核酸形態のいずれかで直接投与され得る。本発明
の組成物はＮＫ細胞誘導性組成物と同時に投与され得るし、あるいはこれらの組
成物は引き続いて投与され得る、ということに留意すべきである。
【０２５５】 対立遺伝子特異的ＨＬＡ損失の情況では、腫瘍はクラスＩ発現を保持し、した
がってＮＫ細胞認識を逃れ、さらに残りのＨＬＡ型に対応するエピトープを含む
本発明のＣＴＬベースのワクチンに依然として感受性であり得る。この概念はこ
こでは、特異的抗原の損失をもたらす突然変異に対して防護するために多数の疾
患抗原を含む本発明の実施形態に類似する。したがって、対立遺伝子特異的損失
、ならびに疾患関連抗原損失による腫瘍逃避を防止するために、多数の疾患関連
抗原からの多数のＨＬＡ特異性および多数のエピトープを同時に標的にし得る。
さらに本発明の実施形態は、代替的治療組成物および方法と併合され得る。この
ような代替的組成物および方法は、放射線、細胞傷害性薬剤および／または体液
性抗体応答を誘導する組成物／方法を包含するが、これらに限定されない。
【０２５６】 さらに、ＨＬＡの発現は、エフェクターＣＴＬにより一般的に分泌されるγＩ
ＦＮにより上方制御され得ること、およびＨＬＡクラスＩ発現は、αおよびβＩ
ＦＮの両方によりインビボで誘導され得ることが観察された。したがって本発明
の実施形態は、ＨＬＡの上方制御を促進するために、α、βおよび／またはγＩ
ＦＮも含み得る。
【０２５７】 （ＩＶ．Ｎ．副作用を誘導する療法からの猶予期間：「計画治療中断または薬
剤休日（ｄｒｕｇ ｈｏｌｉｄａｙ）」） 病原体に感染し、初期に病原体負荷を低減する治療レジメンで処置されたある
患者は、治療レジメンから外れた場合でも、即ち「薬剤休日」中も、病原体負荷
低減を維持し得た、ということを近年の証拠は示している（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ
，Ｅ．ら、Ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＨＩＶ−１ ａｆｔｅｒ ｅ
ａｒｌｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｎａ
ｔｕｒｅ ４０７：５２３−２６，Ｓｅｐｔ．２８，２０００）。当業者に理解
されるように、病原体および癌の両方に対する多数の治療レジメンは、多数の、
しばしば重篤な副作用を有する。薬剤休日中に、患者の免疫系は疾患を抑制して
いる。本発明の組成物を用いるための方法は、癌および病原性感染に対して薬剤
休日の情況で用いられる。
【０２５８】 感染の治療に関しては、療法が特に免疫抑制性であるわけでない場合、本発明
の組成物が標準療法と同時に投与される．この期間中は、患者の免疫系は、本発
明の組成物により含まれるエピトープに対する応答を誘導することに向けられる
。副作用を有する治療から外れた時点で、患者は、病原体負荷が増大し始める場
合に感染性病原体に対して応答するようプライミングされる。本発明の組成物は
、薬剤休日中も同様に提供され得る。
【０２５９】 癌患者に関しては、多数の療法が免疫抑制性である。したがって、寛解が達成
されるかまたは、患者が標準治療に対して難治性であると同定され、次に免疫抑
制療法から外れた場合、本発明の組成物が投与される。したがって患者の免疫系
が再構成するにつれ、貴重な免疫源が同時に癌に向けられる。本発明の組成物は
、所望により免疫抑制レジメンと同時にも投与され得る。
【０２６０】 （ＩＶ．Ｏ．キット） 本発明のペプチドおよび核酸組成物は、ワクチン投与のための指示書とともに
キットの形態で提供され得る。代表的に、キットは、容器中の所望のペプチド組
成物（好ましくは、単位用量形態にある）および投与のための指示書を含む。代
替的なキットは、投与のための指示書とともに、容器中の本発明の所望の核酸を
含むミニジーン構築物（好ましくは、単位用量形態にある）を含む。ＩＬ−２ま
たはＩＬ−１２のようなリンホカインもまた、キットに含まれ得る。所望であり
得る他のキット構成要素には、例えば、滅菌シリンジ、ブースター投薬、および
他の所望の賦形剤が挙げられる。
【０２６１】 （ＩＶ．Ｐ．概要） 本発明に従うエピトープは、免疫応答を誘導するために首尾良く使用された。
これらのエピトープを用いた免疫応答は、これらのエピトープを種々の形態で投
与することによって誘導された。これらのエピトープは、ペプチドとして、核酸
として、そして本発明のエピトープをコードする核酸を含むウイルスベクターと
して投与された。ペプチドベースのエピトープ形態の投与において、免疫応答は
、細胞で発現される空のＨＬＡ分子上にエピトープを直接負荷することによって
、そしてこのエピトープのインターナリゼーションおよびＨＬＡ Ｉ型経路を介
するプロセシングを介して誘導された；いずれの場合においても、次いで、この
エピトープを発現するＨＬＡ分子は、相互作用し得、そしてＣＴＬ応答を誘導し
得た。ペプチドは、直接的に、またはリポソームのような薬剤を使用して送達さ
れ得る。これらは、さらに、銃式送達（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ
）を使用して送達され得、ここで、ペプチドは、代表的には、結晶形態である。
ＤＮＡを使用して免疫応答を誘導する場合、ＤＮＡは、裸のＤＮＡとして（一般
的に、約１〜５μｇの投薬範囲）または銃式の「遺伝子銃」送達を介して（代表
的に、約１０〜１００μｇの投薬範囲）のいずれかで投与される。ＤＮＡは、種
々のコンホメーション（例えば、線状、環状など）で送達され得る。本発明に従
うエピトープをコードする核酸を含む、種々のウイルスベクターもまた、首尾良
く使用された。
【０２６２】 従って、本発明に従う組成物は、いくつかの形態で存在する。本発明に従うこ
れらの組成物形態の各々の実施形態は、免疫応答を誘導するために首尾良く使用
された。
【０２６３】 本発明に従う１つの組成物は、複数のペプチドを含む。この複数のペプチドま
たはペプチドのカクテルは、一般的に、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤と
混合される。ペプチドカクテルは、同じペプチドの複数のコピーを含み得るか、
またはペプチドの混合物を含み得る。ペプチドは、天然に存在するエピトープの
アナログであり得る。ペプチドは、人工アミノ酸および／または化学的改変（例
えば、脂質化；アセチル化、グリコシル化、ビオチン化、リン酸化のような表面
活性分子の付加）を含み得る。ペプチドは、ＣＴＬエピトープまたはＨＴＬエピ
トープであり得る。好ましい実施形態において、ペプチドカクテルは、複数の異
なるＣＴＬエピトープおよび少なくとも１つのＨＴＬエピトープを含む。ＨＴＬ
エピトープは、天然または非天然（例えば、ＰＡＤＲＥ（登録商標）、Ｅｐｉｍ
ｍｕｎｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）であり得る。本発明の実施形
態における異なるエピトープの数は、一般的に、１〜１３０の整数（ｗｈｏｌｅ
ｕｎｉｔ ｉｎｔｅｇｅｒ）である（例えば、１、２、３、４、５、６、７、
８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０
、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２
、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４
、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６
、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８
、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０
、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２
、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００）。
【０２６４】 本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、ポリペプチド多エピトープ構築物
（すなわち、ポリエピトープペプチド）を含む。本発明に従うポリエピトープペ
プチドは、当該分野において周知の技術の使用によって調製される。これらの公
知の技術の使用によって、本発明に従うエピトープは、互いに連結される。ポリ
エピトープペプチドは、線状または非線状（例えば、多価）であり得る。これら
のポリエピトープ構築物は、人工アミノ酸、スペーシングまたはスペーサーアミ
ノ酸、隣接アミノ酸、または隣接エピトープ単位間の化学的改変を含み得る。ポ
リエピトープ構築物は、ヘテロポリマーまたはホモポリマーであり得る。ポリエ
ピトープ構築物は、一般的に、２〜１５０の間の任意の整数の量（例えば、２、
３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１
７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２
９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４
１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５
３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６
５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７
７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８
９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１
００）のエピトープを含む。ポリエピトープ構築物は、ＣＴＬエピトープおよび
／またはＨＴＬエピトープを含み得る。構築物中の１以上のエピトープは、例え
ば、表面活性物質（例えば、脂質）の付加によって改変され得るか、または化学
的に改変され得る（例えば、アセチル化など）。さらに、多エピトープ構築物に
おける結合は、ペプチド結合以外（例えば、共有結合、エステルまたはエーテル
結合、ジスルフィド結合、水素結合、イオン結合など）であり得る。
【０２６５】 あるいは、本発明に従う組成物は、ネイティブ配列に対して相同性を有する（
すなわち、対応するかまたは近接する）アミノ酸の系列、配列、ストレッチ（ｓ
ｔｒｅｔｃｈ）を含む構築物を含む。このアミノ酸のストレッチは、より長い系
列のアミノ酸から切断されるかまたは単離された場合に、本発明に従って、ＨＬ
Ａ Ｉ型エピトープまたはＨＬＡ ＩＩ型エピトープとして機能する、アミノ酸
の少なくとも１つのサブ配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。この実施形態
において、ペプチド配列は、当該分野で公知であるかまたは提供される多数の技
術を使用することによって、本明細書中に規定されるような構築物になるように
改変される。ポリエピトープ構築物は、７０〜１００％（例えば、７０、７１、
７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、
８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、
９６、９７、９８、９９、または１００％）の任意の整数の増分でネイティブ配
列に対して相同性を含み得る。
【０２６６】 本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、本発明に従う１以上のエピトープ
を含む、抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、「プロフェッショナル」抗原提
示細胞（例えば、樹状細胞）であり得る。抗原提示細胞は、当該分野において公
知の任意の手段または当該分野において決定された任意の手段によって、本発明
のエピトープを含み得る。このような手段には、銃式核酸送達のような核酸投与
によって、または核酸の投与のための当該分野の他の技術（ベクターベースの（
例えば、ウイルスベクター）核酸の送達を含む）によって、樹状細胞を１以上の
個々のエピトープまたは複数のエピトープを含む１以上のペプチドでパルスする
ことを含む。
【０２６７】 本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、本発明の１以上のペプチドをコー
ドする核酸、または本発明に従うポリエピトープペプチドをコードする核酸を含
む。当業者によって理解されるように、種々の核酸組成物は、遺伝コードの縮重
に起因して同じペプチドをコードする。これらの核酸組成物の各々は、本発明の
範囲内に含まれる。本発明のこの実施形態は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み、特定
の実施形態において、ＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせを含む。本発明に従うペ
プチドをコードする核酸を含む任意の組成物または本発明に従う任意の他のペプ
チドベースの組成物が、本発明の範囲内にあることが理解される。
【０２６８】 本発明のペプチドベースの形態（ならびに、これらをコードする核酸）が、当
該分野で既に公知であるかまたは公知になる原理を使用して作製される、本発明
のエピトープのアナログを含み得ることが理解される。アナログ化に関する原理
は、現在、当該分野において公知であり、本明細書中に開示される；さらに、ア
ナログ化原理（ヘテロクリティックアナログ化）は、１９９９年１月６日に出願
された同時係属出願シリアル番号Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第０９／２２６，７７５号に
開示される。一般的に、本発明の組成物は、単離されているかまたは精製されて
いる。
【０２６９】 本発明を、特定の実施例によってより詳細に記載する。以下の実施例は、例示
の目的のために提供され、そしていかなる様式においても本発明を制限すること
を意図しない。当業者は、本発明に従って代替の実施形態を得るために変化また
は改変され得る重要でない種々のパラメータを容易に認識する。
【０２７０】 （Ｖ．実施例） 以下の実施例は、ワクチン組成物に含ませるための免疫原性クラスＩおよびク
ラスＩＩペプチドエピトープの同定、選択、および使用を例示する。
【０２７１】 （実施例１．ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ結合アッセイ） ＨＬＡ分子に結合するペプチドの以下の例は、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩ
Ｉペプチドの結合親和性の定量化を示す。結合アッセイは、モチーフを保有する
かまたはモチーフを保有しないペプチドを用いて実施され得る。
【０２７２】 精製ＨＬＡ分子を使用するＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ結合アッセイを、
開示のプロトコールに従って行った（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２０１２７
；Ｓｉｄｎｅｙら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ １８．３．１（１９９８）；Ｓｉｄｎｅｙ，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１５４：２４７（１９９５）；Ｓｅｔｔｅ，ら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３
１：８１３（１９９４））。手短には、精製ＭＨＣ分子（５〜５００ｎＭ）を、
種々の未標識ペプチドインヒビターおよび上記の１〜１０ｎＭの１２５Ｉ放射標
識プローブペプチドと共にインキュベートした。インキュベーション後、ＭＨＣ
ペプチド複合体を、ゲル濾過によって遊離ペプチドから分離し、そして結合した
ペプチドの画分を決定した。代表的には、予備実験において、各ＭＨＣ調製物を
、固定量の放射標識ペプチドの存在下で滴定し、全放射活性の１０〜２０％を結
合するのに必要とされるＨＬＡの濃度を決定した。全てのその後の阻害アッセイ
および直接結合アッセイを、これらのＨＬＡ濃度を用いて実施した。
【０２７３】 ［標識］＜［ＨＬＡ］およびＩＣ５０≧［ＨＬＡ］のこれらの条件下で、測定
されたＩＣ５０値は、真のＫＤ値の適切な近似である。ペプチドインヒビターは
、代表的に、１２０μｇ／ｍｌ〜１．２ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で試験され、そ
して２〜４回の完全に独立した実験において試験される。異なる実験から得られ
たデータの比較を可能にするために、阻害についてのポジティブコントロールの
ＩＣ５０を各々の試験したペプチド（代表的には、その放射標識されたプローブ
ペプチドの標識されていないバージョン）のＩＣ５０で除算することによって、
相対的な結合の数値を、各ペプチドについて計算した。データベース目的および
実験間比較のために、相対的な結合値を編集する。続いて、これらの値を、阻害
についてのポジティブコントロールのＩＣ５０ ｎＭを目的のペプチドの相対的
な結合で除算することによって、ＩＣ５０ ｎＭ値に変換し得る。このデータの
編集方法は、異なる日、または異なるロットの精製ＭＨＣで試験したペプチドを
比較するために、最も正確でかつ一貫していることが証明された。
【０２７４】 上に概説された結合アッセイは、例えば、実施例２に記載されるようなスーパ
ーモチーフおよび／またはモチーフを保有するエピトープを分析するために使用
され得る。
【０２７５】 （実施例２．ＨＬＡスーパーモチーフおよびモチーフを保有するＣＴＬ候補エ
ピトープの同定） 本発明のワクチン組成物は、広範な集団適用範囲を達成するために、複数のＨ
ＬＡスーパーモチーフまたはＨＬＡモチーフを含む、複数のエピトープを含み得
る。この実施例は、このようなワクチン組成物に含ませるためのスーパーモチー
フおよびモチーフ保有エピトープの同定を例示する。集団適用範囲の計算を、以
下に記述されるストラテジーを用いて実施した。
【０２７６】 （スーパーモチーフおよび／またはモチーフを保有するエピトープの同定のた
めのコンピュータ検索およびアルゴリズム） 実施例２および５においてモチーフ保有ペプチド配列を同定するために実施さ
れる検索は、前立腺癌関連抗原についてのタンパク質配列データを使用した。
【０２７７】 ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩのスーパーモチーフまたはモチーフを保有す
るエピトープについてのコンピュータ検索を、以下のように実施した。全ての翻
訳されたタンパク質配列を、テキスト記号列検索（ｔｅｘｔ ｓｔｒｉｎｇ ｓ
ｅａｒｃｈ）ソフトウェアプログラム（例えば、ＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈ １．
４（Ｄ．Ｂｒｏｗｎ，Ｓｎａ Ｄｉｅｇｏ））を使用して分析して、適切なＨＬ
Ａ結合モチーフを含む潜在的なペプチド配列を同定した；代替のプログラムは、
本明細書中に開示されたモチーフ／スーパーモチーフを考慮して、当該分野の情
報に従って容易に作成される。さらに、このような計算は、頭の中で行われ得る
。
【０２７８】 同定したＡ２スーパーモチーフ配列、Ａ３スーパーモチーフ配列およびＤＲス
ーパーモチーフ配列を、特定のＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する
それらの能力を予測するための、多項式アルゴリズムを使用してスコア付けした
。これらの多項式アルゴリズムは、伸長モチーフおよび洗練モチーフの両方を考
慮し（すなわち、異なる位置での異なるアミノ酸の影響を考慮すること）、そし
てペプチド−ＨＬＡ分子相互作用の全体の親和性（つまり、ΔＧ）が、以下の型
の線形多項式関数として近似され得るという事実に本質的に基づく： “ΔＧ”＝ａ１ｉ×ａ２ｉ×ａ３ｉ．．．．．．×ａｎｉ ここで、ａｊｉは、ｎ個のアミノ酸のペプチドの配列に沿った所定の位置（ｉ）
での所定のアミノ酸（ｊ）の存在の効果を表す係数である。この方法の重要な仮
定は、各位置での効果が、本質的に互いに独立である（すなわち、個々の側鎖の
独立した結合）ことである。残基ｊが、ペプチドの位置ｉに生じる場合、一定の
量のｊｉがペプチドの残りの配列に関わらず、このペプチドの結合の自由エネル
ギーに寄与することを仮定する。この仮定は、ペプチドが、実質的に伸びたコン
ホメーションで、ＭＨＣに結合しそしてＴ細胞によって認識されるということを
立証した本発明者らの研究室からの研究によって証明される（本明細書において
データは省略した）。
【０２７９】 特定のアルゴリズム係数の導出方法は、Ｇｕｌｕｋｏｔａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．２６７：１２５８−１２６，１９９７に記載されている；（Ｓｉｄｎｅ
ｙら，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１９９６；およびＳｏ
ｕｔｈｗｏｏｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３，１９９
８をまた、参照のこと）。簡潔には、全てのｉ位について、アンカーおよび非ア
ンカーと同様に、ｊを保有する全てのペプチドの平均相対結合（ＡＲＢ）の幾何
平均を、この群の残りに対して計算し、そしてｊｉの推定値として使用する。ク
ラスＩＩペプチドについて、複数の整列が可能である場合、最も高いスコアの配
列のみが使用され、反復手順に続く。試験セットにおける所定のペプチドのアル
ゴリズムスコアを計算するために、そのペプチドの配列に対応するＡＲＢ値を、
乗算する。この積が、選択された閾値を超えた場合、このペプチドは、結合する
と予測される。適切な閾値は、所望の予測の厳密さの程度の関数として選択され
る。
【０２８０】 （ＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ交差反応性ペプチドの選択） 前立腺癌関連抗原ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、およびｈＫ２の完全なタンパク質
配列は、ＧｅｎＢａｎｋから得、そして、モチーフ同定ソフトウェアを使用して
走査し、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ主要アンカー特異性を含む８マー、９マ
ー、１０マーおよび１１マーの配列を同定した。
【０２８１】 ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有配列を、表ＶＶＩＩに示す。次いでこれら
の配列を、Ａ２アルゴリズムを使用してスコア付けし、この陽性とスコア付けし
た配列に対応するペプチドを合成し、そしてインビトロで精製ＨＬＡ−Ａ＊０２
０１分子（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１は、原型のＡ２スーパータイプ分子であると考
えられる）を結合するそれらの能力について試験する。
【０２８２】 ＩＣ５０値≦５００ｎＭでＨＬＡ−Ａ＊０２０１に結合する、同定したペプチ
ドの例を、表ＸＸＩＩおよびＸＸＩＩＩに示す。次いで、これらのペプチドを、
さらなるＡ２スーパータイプ分子（Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０６
、およびＡ＊６８０２）に結合する能力について試験した。試験した５つのＡ２
スーパータイプ対立遺伝子のうち少なくとも３つに結合するペプチドを、Ａ２ス
ーパータイプ交叉反応性結合剤と考える。好ましいペプチドは５００ｎＭ以下の
親和性で３つ以上のＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ分子に結合する。これらのペプ
チドの例を、表ＸＸＩＩＩに示す（上記の相同性に起因して、多くのＣＴＬおよ
びＨＴＬエピトープは、ＰＳＡおよびｈＫ２抗原両方において示される。このこ
とを、上部の供給源および対立遺伝子供給源として表ＸＸＩＩＩおよびＸＸＩＶ
に示す。）。
【０２８３】 （ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープの選択） 上記で走査したタンパク質配列をまた、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有エ
ピトープを同定するために行った方法に類似する方法を使用して、ＨＬＡ−Ａ３
スーパーモチーフ一次アンカーを有するペプチドの存在について試験した。
【０２８４】 次いで、これらのスーパーモチーフ保有配列に対応するペプチドを合成し、Ｈ
ＬＡ−Ａ＊０３０１およびＨＬＡ−Ａ＊１１０１分子（２つの最も一般的なＡ３
スーパータイプ対立遺伝子）への結合について試験する。次いで、５００ｎＭ以
下、好ましくは２００ｎＭ以下の結合親和性でこの２つの対立遺伝子のうちの一
方に結合することが見出されるペプチドを、他の一般的なＡ３スーパータイプ対
立遺伝子（Ａ＊３１０１、Ａ＊３３０１、およびＡ＊６８０１）への結合交差反
応性について試験し、これらの試験した５つのＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ分子
のうちの少なくとも３つに結合し得るペプチドを同定する。
【０２８５】 （ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有エピトープの選択） 同じ標的抗原タンパク質配列をまた分析して、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ
保有配列を同定した。次いで、これらの対応するペプチドを合成し、そしてＨＬ
Ａ−Ｂ＊０７０２（最も一般的なＢ７スーパータイプ対立遺伝子（すなわち、原
型のＢ７スーパータイプ対立遺伝子））への結合について試験する。次いで、５
００ｎＭ以下、好ましくは２００ｎＭ以下のＩＣ５０でＢ＊０７０２に結合する
これらのペプチドを、他の一般的なＢ７スーパータイプ分子（Ｂ＊３５０１、Ｂ ＊ ５１０１、Ｂ＊５３０１およびＢ＊５４０１）への結合について試験し、これ
らの試験した５つのＢ７スーパータイプ対立遺伝子のうちの３つ以上に結合し得
るペプチドを同定する。
【０２８６】 （Ａ１およびＡ２４モチーフ保有エピトープの選択） 集団適用範囲をさらに増加させるために、ＨＬＡ−Ａ１エピトープおよびＨＬ
Ａ−Ａ２４エピトープをまた、ワクチン構築物に組み込み得る。上記で利用した
標的抗原からのタンパク質配列データの分析もまた行って、ＨＬＡ−Ａ１−モチ
ーフ含有保存配列およびＨＬＡ−Ａ２４−モチーフ含有保存配列を同定した。次
いで、ペプチド配列を合成し、そして結合について試験した。
【０２８７】 他のスーパーモチーフおよび／またはモチーフを保有するペプチドを、類似の
様式において結合または交差反応性結合について評価し得る。
【０２８８】 （実施例３：免疫原性の確認） 実施例２において記載したように同定した交差反応性候補のＣＴＬ Ａ２スー
パーモチーフ保有ペプチドを、インビトロの免疫原性試験のために選択した。少
なくとも３／５のＨＬＡ−Ａ２スーパーファミリーメンバーに２００ｎＭ以下の
ＩＣ５０で結合する免疫原性ＨＬＡ−Ａ２交差反応性結合ペプチドの例を、表Ｘ
ＸＩＶに示す。試験を以下の方法論を使用して実施した。
【０２８９】 （細胞性スクリーニングのための標的細胞系） ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子を、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃを有さない
変異体ヒトＢリンパ芽球状細胞株７２１．２２１に移入することによって産生さ
れた．２２１Ａ２．１細胞株を、ペプチドをロードされた標的として用いて、Ｈ
ＬＡ−Ａ２．１拘束ＣＴＬの活性を測定する。この細胞株を、抗生物質、ピルビ
ン酸ナトリウム、非必須アミノ酸および１０％（ｖ／ｖ）熱非働化ＦＣＳを補充
したＲＰＭＩ−１６４０培地で増殖させる。目的の抗原を発現する細胞、または
目的の抗原をコードする遺伝子を含む被形質導入体を、標的細胞として使用して
、内因性の抗原を認識するペプチド特異的ＣＴＬの能力を試験する。
【０２９０】 （一次ＣＴＬ誘導培養物） 樹状細胞（ＤＣ）の作製：ＰＢＭＣを、３０μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅを含むＲ
ＰＭＩに融解し、２回洗浄し、そして完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０ならびに５
％ＡＢヒト血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンおよ
びペニシリン／ストレプトマイシン）に再懸濁する。単球を、６ウェルプレート
に、１ウェル当たり１０×１０６ＰＢＭＣをプレーティングすることによって精
製した。３７℃で２時間後、非付着細胞を、プレートを穏やかに振盪し、そして
上清を吸引することによって除去した。ウェルを、３ｍｌのＲＰＭＩで合計３回
洗浄して、大半の非付着細胞およびゆるい付着細胞を除去した。次いで、５０ｎ
ｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび１，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を含む３ｍｌの完
全培地を、各々のウェルに添加した。ＴＮＦαを、７５ｎｇ／ｍｌで６日後にＤ
Ｃに添加し、そして細胞を、培養の７日後にＣＴＬ誘導培養物について使用した
。
【０２９１】 ＤＣおよびペプチドを用いたＣＴＬの誘導：ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｄｙｎａｌ免
疫磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−４５０）およびｄｅｔａｃ
ｈａ−ｂｅａｄ（登録商標）試薬を用いたポジティブ選択によって単離する。代
表的には、約２００〜２５０×１０６個のＰＢＭＣをプロセスして、２４×１０ ６ 個のＣＤ８＋Ｔ細胞（４８ウェルプレート培養に十分である）を得る。手短に
言えば、ＰＢＭＣを、３０μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅを含むＲＰＭＩに融解し、１
％ヒトＡＢ血清を含むＰＢＳで１回洗浄し、そして２０×１０６細胞／ｍｌの濃
度で、ＰＢＳ／１％ＡＢ血清に再懸濁する。磁気ビーズを、ＰＢＳ／ＡＢ血清で
３回洗浄し、細胞に添加し（２０×１０６細胞当たり１４０μｌのビーズ）、そ
して連続的に混合しながら、４℃で１時間インキュベートする。このビーズおよ
び細胞を、ＰＢＳ／ＡＢ血清で４回洗浄して非付着細胞を除去し、そして１００
μｌ／ｍｌのｄｅｔａｃｈａ−ｂｅａｄ（登録商標）試薬および３０μｇ／ｍｌ
のＤＮＡｓｅを含むＰＢＳ／ＡＢ血清に、１００×１０６細胞／ｍｌで（最初の
細胞数に基づく）再懸濁する。この混合物を、連続的に混合しながら、室温で１
時間インキュベートする。このビーズを、ＰＢＳ／ＡＢ／ＤＮＡｓｅで再び洗浄
して、ＣＤ８＋Ｔ細胞を収集する。ＤＣを収集し、そして１３００ｒｐｍで５〜
７分間遠心分離し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１回洗浄し、計数し、そして２０
℃で４時間、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で、１〜２×１０ ６ ／ｍｌの細胞濃度で、４０μｇ／ｍｌのペプチドを用いてパルス（ｐｕｌｓｅ
）した。次いで、このＤＣを、照射し（４，２００ｒａｄ）、培地で１回洗浄し
、そして再び計数する。
【０２９２】 誘導培養物のセットアップ：０．２５ｍｌのサイトカイン生成ＤＣ（＠１×１
０５細胞／ｍｌ）を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下で、４８ウェルプレー
トの各々のウェルにおいて、０．２５ｍｌのＣＤ８＋Ｔ細胞（＠２×１０６細胞
／ｍｌ）とともに共存培養する。組換えヒトＩＬ１０を、最終濃度１０ｎｇ／ｍ
ｌで翌日添加し、そして組換えヒトＩＬ２を、１０ＩＵ／ｍｌで４８時間後に添
加する。
【０２９３】 ペプチドでパルスした付着細胞での誘導培養物の再度刺激：一次誘導の７日お
よび１４日後、細胞を、ペプチドでパルスした付着細胞で再度刺激する。ＰＢＭ
Ｃを融解し、そしてＲＰＭＩおよびＤＮＡｓｅで２回洗浄する。この細胞を、５
×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、そして約４２００ｒａｄで照射する。ＰＢＭＣ
を、１ウェル当たり０．５ｍｌの完全培地中に２×１０６でプレーティングし、
そして３７℃で２時間インキュベートする。このプレートを、穏やかにプレート
をトラップ（ｔｒａｐ）することによってＲＰＭＩで２回洗浄して、非付着細胞
を除去し、そして付着細胞を、１ウェル当たり０．２５ｍｌのＲＰＭＩ／５％Ａ
Ｂにおいて３μｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリンの存在下で、３７℃で２時間、
１０μｇ／ｍｌのペプチドでパルスする。各ウェルからのペプチド溶液を吸引し
、そしてこのウェルを、ＲＰＭＩで１回洗浄した。大半の培地を、誘導培養物（
ＣＤ８＋細胞）から吸引し、そして新鮮な培地で０．５ｍｌにする。次いで、こ
れらの細胞を、ペプチドでパルスした付着細胞を含むウェルに移した。２４時間
後、組換えヒトＩＬ１０を、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、そして組換えヒ
トＩＬ２を翌日添加し、そして再び５０ＩＵ／ｍｌで２〜３日後に添加する（Ｔ
ｓａｉら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
１８（１−２）：６５−７５、１９９８）。７日後、この培養物を、５１Ｃｒ放
出アッセイにおいてＣＴＬ活性についてアッセイする。いくつかの実験において
、この培養物を、第二の再度刺激時に、インサイチュＩＦＮγ ＥＬＩＳＡにお
いて、ペプチド特異的認識についてアッセイし、その後、７日後に内因性認識の
アッセイを行う。拡張（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）後、活性を、平衡して比較するた
めに両方のアッセイにおいて測定する。
【０２９４】 （５１Ｃｒ放出によるＣＴＬ溶解活性の測定） 第二の再度刺激の７日後、細胞傷害性を、一つのＥ：Ｔで個々のウェルをアッ
セイすることによって、標準的な（５時間）５１Ｃｒ放出アッセイにおいて決定
する。ペプチドでパルスした標的物を、細胞を３７℃で一晩１０μｇ／ｍｌのペ
プチドとともにインキュベートすることによって調製する。
【０２９５】 付着標的細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて培養フラスコから除去する。
標的細胞を、３７℃で１時間、２００μＣｉの５１Ｃｒクロム酸ナトリウム（Ｄ
ｕｐｏｎｔ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）で標識する。標識した標的細胞を、
１０６／ｍｌで再懸濁し、そして３．３×１０６／ｍｌの濃度でＫ５６２細胞を
用いて１：１０に希釈する（ＮＫ感受性赤芽細胞腫（ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ
ｏｍａ）細胞株を使用して、非特異的溶解を減少させる）。標的細胞（１００μ
ｌ）および１００μｌのエフェクターを、９６ウェル丸底プレートにプレーティ
ングし、そして３７℃で５時間インキュベートした。この時、１００μｌの上清
を、各々のウェルから収集し、そしてパーセント溶解を、以下の式に従って決定
する：［（試験サンプルのｃｐｍ−自発的な５１Ｃｒ放出サンプルのｃｐｍ）／
（最大の５１Ｃｒ放出サンプルのｃｐｍ−自発的な５１Ｃｒ放出サンプルのｃｐ
ｍ）］×１００。最大の放出および自発的な放出は、それぞれ、１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００および培地単独とともに、標識された標的物をインキュベートす
ることによって決定する。陽性培地を、個々のウェルの場合に、特異的溶解（サ
ンプル−バックグラウンド）が１０％以上であり、そして拡張された培養物をア
ッセイした場合に、２つの最も高いＥ：Ｔの比で、１５％以上であると規定する
。
【０２９６】 （ペプチド特異的認識および内因性認識の指標としてのヒトγＩＦＮ産生のイ
ンサイチュ測定） Ｉｍｍｕｌｏｎ２プレートを、４℃で一晩、マウス抗ヒトＩＦＮγモノクロー
ナル抗体（４μｇ／ｍｌ ０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．２）でコーティン
グする。このプレートを、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳ／０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、そしてＰＢＳ／１０％ＦＣＳで２時間ブロックし、こ
の後、ＣＴＬ（１ウェル当たり１００μｌ）および標的物（１ウェル当たり１０
０μｌ）を、各々のウェルに添加し、空のウェルを、標準およびブランクのため
に残す（これらには、培地のみ入れる）。標的細胞（ペプチドでパルスした標的
物または内因性の標的物のいずれか）を、１×１０６細胞／ｍｌの濃度で使用す
る。このプレートを、５％ＣＯ２とともに３７℃で４８時間インキュベートする
。
【０２９７】 組換えヒトＩＦＮγを、４００ｐｇ／１００μｌ／ウェルまたは１２００ｐｇ
／１００μｌ／ウェルで開始する標準ウェルに添加し、そしてこのプレートを、
３７℃で２時間インキュベートする。このプレートを洗浄し、そして１００μｌ
のビオチン化マウス抗ヒトＩＦＮγモノクローナル抗体（ＰＢＳ／３％ＦＣＳ／
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０において４μｇ／ｍｌ）を添加し、そして室温で２時
間インキュベートする。再び洗浄した後、１００μｌのＨＲＰ−ストレプトアビ
ジンを添加し、そして室温で１時間インキュベートする。次いで、このプレート
を、洗浄緩衝液で６回洗浄し、１ウェル当たり１００μｌの展開溶液（ＴＭＢ１
：１）を添加し、そしてこのプレートを、５〜１５分間展開する。反応を、１ウ
ェル当たり５０μｌの１Ｍ Ｈ３ＰＯ４で停止させ、そしてＯＤ４５０にて読み
取る。バックグラウンドを超えて１ウェル当たり少なくとも５０ｐｇのＩＦＮγ
を測定し、そして発現がバックグラウンドレベルの２倍である場合に、培養物を
ポジティブとみなす。
【０２９８】 ＣＴＬ拡張。ペプチドでパルスした標的物および／または腫瘍標的物に対して
特異的な溶解活性を示す培養物を、抗ＣＤ３を用いて２週間を超えて拡張する。
手短に言えば、５×１０４個のＣＤ８＋細胞を、以下を含むＴ２５フラスコに添
加する：１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウ
ム、２５μＭ ２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／
ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−６４０における、１ｍｌ当たり１×１０６ 個の照射（４，２００ｒａｄ）ＰＢＭＣ（自家組織または同種の）、１ｍｌ当た
り２×１０５個の照射（８，０００ｒａｄ）ＥＢＶ−形質転換細胞、および１ｍ
ｌ当たり３０ｎｇでのＯＫＴ３（抗ＣＤ３）。ＲｈｕｍａｎＩＬ２を、２００Ｉ
Ｕ／ｍｌの最終濃度で２４時間後に添加し、その後、５０ＩＵ／ｍｌで新鮮な培
地を３日ごとに添加する。細胞濃度が、１×１０６／ｍｌを超えた場合に、細胞
をはがし、そして培養物を、拡張の前と同じ標的物を用いて、５１Ｃｒ放出アッ
セイにおいて３０：１、１０：１、３：１および１：１のＥ：Ｔ比で、またはイ
ンサイチュＩＦＮγアッセイにおいて１×１０６／ｍｌで、１３日目と１５日目
の間にアッセイする。
【０２９９】 培養物を、続いて抗ＣＤ３＋の非存在で拡張する。ペプチドおよび内因性標的
に対する特異的な溶解活性を示すこれらの培養物を選択し、そして５×１０４Ｃ
Ｄ８＋細胞を、以下を含むＴ２５フラスコに添加する、以下：１ｍｌあたり２時
間３７℃で１０μｇ／ｍｌのペプチドを用いてパルス化し、そして照射（４，２
００ｒａｄ）したペプチドである１×１０６自己ＰＢＭＣ；１０％（ｖ／ｖ）ヒ
トＡＢ血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ ２−ＭＥ、Ｌ
−グルタミンおよびゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０ １ｍｌ当た
り２×１０５個の照射（８，０００ｒａｄ）ＥＢＶ−形質転換細胞。
【０３００】 （Ａ２−スーパーモチーフ保有ペプチドの免疫原性） Ａ２−スーパーモチーフ交差反応性結合ペプチドを、正常な個体においてペプ
チド特異的ＣＴＬを誘導する能力について、細胞性アッセイにおいて試験した。
この分析において、少なくとも２のドナーにおいて（別段の通知のない限り）、
ペプチド特異的ＣＴＬを誘導し、そして好ましくは内因性に発現したペプチドを
また認識する場合に、ペプチドを、エピトープとみなす。免疫原性ペプチドの例
を表ＸＸＩＶに示す。
【０３０１】 さらに、免疫原性を、癌患者から単離されたＰＢＭＣを使用して確認する。簡
単には、ＰＢＭＣを、前立腺癌を有する患者から単離し、ペプチドパルス化され
た単球を用いて再刺激し、そしてペプチドパルス化した標的細胞および抗原を内
因性に発現するトランスフェクトされた細胞を認識する能力についてアッセイす
る。
【０３０２】 （Ａ＊０３／Ａ１１免疫原性の評価） ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフを保有する交差反応性結合ペプチドをまた、Ｈ
ＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドの免疫原性を評価するために使用したもの
と類似の方法論を用いて、免疫原性について評価する。
【０３０３】 （Ｂ７免疫原性の評価） 実施例２において同定されたＢ７スーパータイプ交差反応性結合ペプチドの免
疫原性スクリーニングを、Ａ２およびＡ３スーパーモチーフ保有ペプチドの評価
と類似の様式で評価する。
【０３０４】 他のスーパーモチーフおよび／またはモチーフを保有するペプチド（例えば、
ＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−ａ２４など）をまた、同様の方法論を使用して評価する。
【０３０５】 （実施例４．アナログの作製によってネイティブのエピトープの結合能を改善
するための拡張されたスーパーモチーフのインプリメンテーション） ＨＬＡモチーフおよびスーパーモチーフ（一次残基および／または二次残基を
含む）は、本明細書中に説明されるように、高度に交差反応性のネイティブペプ
チドの同定および調製に有用である。さらに、ＨＬＡモチーフおよびスーパーモ
チーフの定義もまた、ネイティブのペプチド配列内部の残基を同定することによ
って、高度に交差反応性のエピトープの設計を可能にする。このネイティブのペ
プチド配列は、アナログ化されるか（ａｎａｌｏｇｕｅｄ）、または「固定」さ
れて、ペプチドに、特定の特性（例えば、スーパータイプを含むＨＬＡ分子集団
内のより大きな交差反応性、および／またはこれらのＨＬＡ分子のうちのいくつ
かもしくはすべてに対するより大きな結合親和性）を与え得る。調節された結合
親和性を示すアナログペプチドの例を、本実施例に示す。
【０３０６】 （一次アンカー残基でのアナログ化） ペプチド操作ストラテジーを実行して、上記で同定されたエピトープの交差反
応性をさらに増大した（例えば、表ＸＸＩＩＩを参照のこと）。例えば、関連し
、そして同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ ０９／２２６，７７５に開示されるデー
タに基づいて、Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドの主要なアンカーを変更して
、例えば、２位に好ましいＬ、Ｉ、ＶまたはＭを導入し、そしてＣ末端にＩまた
はＶを導入する。
【０３０７】 少なくとも弱いＡ＊０２０１結合（５０００ｎＭ以下のＩＣ５０）を示し、そ
して２位、Ｃ末端位置、またはその両方のいずれかに、最適未満のアンカー残基
を保有するペプチドが、規範的な置換を導入することによって（代表的に２位に
Ｌ、そしてＣ末端にＶ）固定され得る。次いで、Ａ＊０２０１結合において少な
くとも３倍の増大を示し、そして５００ｎＭ、または好ましくは２００ｎＭ以下
のＩＣ５０で結合するこれらのアナログ化ペプチドを、これらの野生型（ＷＴ）
相対物に加えて、Ａ２交差反応性結合について試験する。次いで、５つのＡ２ス
ーパータイプ対立遺伝子のうちの少なくとも３つを結合するアナログ化ペプチド
を、細胞性スクリーニング分析について選択する。
【０３０８】 さらに、細胞性スクリーニング分析についてのアナログの選択を、ＷＴ親ペプ
チドが、３つ以上のＡ２スーパータイプ対立遺伝子に少なくとも弱く結合する（
すなわち、５０００ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する）能力によりさらに限定する
。この要求についての原理は、ＷＴペプチドが、生物学的に適切であるに十分な
量で内因性に存在しなければならない、ということである。アナログ化ペプチド
は、ＷＴエピトープに対して特異的なＴ細胞によって増大した免疫原性および交
差反応性を有することが示されている（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１５７：２５３９、１９９６；およびＰｏｇｕｅら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：８１６６、１９９５を参照のこと
）。
【０３０９】 これらのペプチドアナログの細胞性スクリーニングにおいて、アナログ特異的
ＣＴＬはまた、野生型ペプチド、そして可能であれば、このエピトープを内因性
に発現する腫瘍標的物を認識し得ることを実証することが重要である。
【０３１０】 一次アンカー残基でアナログ化した（一般的に、一次アンカー位置に好ましい
残基を付加することによって）ペプチドを、合成し、増強されたＡ＊０２０１へ
の結合および増強された交差反応性結合について評価した。増加された結合およ
び／または交差反応性を示すアナログ化されたペプチドの例を、表ＸＸＩＩＩに
示す。
【０３１１】 次いで、変化した結合特性を示すアナログを、細胞性スクリーニング研究のた
めに選択する。例を表ＸＩＶに示す。
【０３１２】 ＨＬＡ−Ａ２アナログを開発するために使用されたものと類似の方法論を用い
て、ＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有エピトープのアナロ
グをまた作製する。類似のストラテジーを、他のスーパーモチーフ／モチーフを
保有するペプチドのためになお使用し得る。例えば、Ａ３スーパータイプ分子の
うちの５分の３に少なくとも弱く結合するペプチドは、一次アンカー残基で操作
されて、２位に好ましい残基（Ｖ、Ｓ、ＭまたはＡ）を有し得る。次いで、この
アナログペプチドを、Ａ＊０３およびＡ＊１１（プロトタイプのＡ３スーパータ
イプの対立遺伝子）を結合する能力について試験する。次いで、５００ｎＭ以下
、しばしば２００ｎＭ以下の結合値を示すこれらのペプチドを、Ａ３スーパータ
イプの交差反応性について試験する。例えば、Ｓｉｄｎｅｙらによって明らかに
された（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０，１９９６）ように
、Ｂ７スーパーモチーフ保有ペプチドを操作して、好ましい残基（Ｖ、Ｉ、Ｌま
たはＦ）をＣ末端一次アンカー位置で所有し得、そしてＢ７スーパータイプ対立
遺伝子への結合について試験する。
【０３１３】 （二次アンカー残基でのアナログ化） さらに、ＨＬＡスーパーモチーフは、高度に交差反応性のペプチド、および／
またはこのような性質に関連する二次アンカー位置で特定の残基を同定すること
によって、増大した親和性でＨＬＡ分子を結合するペプチドを設計する際に価値
がある。例えば、１位での目立たない（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）１アミノ酸置換の典
型であるＢ７スーパーモチーフ保有ペプチドの結合能を分析し得る。例えば、ペ
プチドをアナログ化して、１位でＬをＦで置換し得、そして引き続いて、増大し
た結合親和性および／または増大した交差反応性について評価し得る。
【０３１４】 結合能力または交差反応性を十分に改善した操作されたアナログを、上のよう
に免疫原性について試験する。
【０３１５】 （他のアナログ化ストラテジー） アンカー位置に関連しない別の形態のペプチドのアナログ化は、αアミノ酪酸
でのシステインの置換に関与する。その化学的性質に起因して、システインは、
ジスルフィド架橋を形成し、そして結合能を減少するように、構造的にペプチド
を十分に変更する性質を有する。システインのαアミノ酪酸での置換は、この問
題を解消するだけではなく、いくつかの例において、結合能および交差結合能を
改善することが示されている（例えば、Ｓｅｔｔｅらによる総説、Ｐｅｒｓｉｓ
ｔｅｎｔ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、Ｒ．ＡｈｍｅｄおよびＩ．Ｃｈ
ｅｎ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９９９を参
照のこと）。
【０３１６】 結論として、これらのデータは、１つのアミノ酸置換でさえ使用することによ
って、ＨＬＡスーパータイプ分子に対するペプチドリガンドの結合親和性および
／または交差反応性を増加し得ることを明らかにする。
【０３１７】 （実施例５．ＨＬＡ−ＤＲ結合モチーフを有するペプチドエピトープ配列の同
定） ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフまたはモチーフを保有するペプチドエピト
ープをまた、実施例１〜３に記載されるものと類似の方法論を用いて、以下に概
説されるように同定し得る。
【０３１８】 （ＨＬＡ−ＤＲスーパーモチーフ保有エピトープの選択） ＨＬＡクラスＩＩ ＨＴＬエピトープを同定するために、前立腺癌関連抗原タ
ンパク質配列を、ＨＬＡ−ＤＲモチーフまたはスーパーモチーフを保有する配列
の存在について分析した。具体的には、９マーのコアをさらに含むＤＲスーパー
モチーフ、ならびに３残基のＮ末端隣接領域およびＣ末端隣接領域を含む（合計
１５アミノ酸）、１５マーの配列を選択する。
【０３１９】 ＤＲ分子に結合するペプチドの推定についてのプロトコールが開発されている
（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３、
１９９８）。個々のＤＲ分子に特異的なこれらのプロトコールは、９マーのコア
領域のスコア付けおよびランク付けを可能にする。各々のプロトコールは、９マ
ーのコアの内部のＤＲスーパーモチーフの一次アンカーの存在（すなわち、１位
および６位）について、ペプチド配列をスコア付けするだけではなく、さらに、
二次アンカーの存在についても配列を評価する。対立遺伝子に特異的な選択表（
例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、同書を参照のこと）を用いて、これらのプロト
コールが、特定のＤＲ分子を結合する高い確率で、ペプチド配列を効果的に選択
することが見出されている。さらに、これらのプロトコール（具体的には、ＤＲ
１、ＤＲ４ｗ４およびＤＲ７についてのプロトコール）を連繋して実行すること
により、ＤＲの交差反応性ペプチドを効果的に選択し得ることが見出されている
。
【０３２０】 上記で同定された前立腺抗原由来のペプチドを、種々の一般的なＨＬＡ−ＤＲ
分子に対する結合能について試験する。すべてのペプチドを、最初に、一次パネ
ル：ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４およびＤＲ７において、ＤＲ分子への結合について試験
する。次いで、１０００ｎＭ以下のＩＣ５０値でこれらの３つのＤＲ分子のうち
の少なくとも２つを結合するペプチドを、ＤＲ５＊０１０１、ＤＲＢ１＊１５０
１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊０８０２およびＤＲＢ１＊１３０２への結
合について試験した。試験した８つの対立遺伝子のうちの少なくとも５つに、１
０００ｎＭ以下のＩＣ５０値で結合した場合、ペプチドを、交差反応性のＤＲス
ーパータイプバインダー（ｂｉｎｄｅｒ）とみなした。
【０３２１】 上記に概説したストラテジーの後、ＤＲスーパーモチーフ保有配列を、前立腺
抗原タンパク質配列内で同定した。一般的に、次いでこれらの配列を、複合（ｃ
ｏｍｂｉｎｅｄ）ＤＲ１−４−７アルゴリズムにおいて、スコア付けした。この
陽性とスコア付けされたペプチドを合成し、そしてＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１
、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１への結合について試験した。次いで
、３つの対立遺伝子の内少なくとも２つを、二次ＤＲスーパータイプ対立遺伝子
：ＤＲＢ５＊０１０１、ＤＲＢ１＊１５０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊ ０８０２およびＤＲＢ１＊１３０２への結合について試験した。
【０３２２】 （ＤＲ３モチーフペプチドの選択） ＨＬＡ−ＤＲ３は、カフカス人集団、黒人集団およびスペイン系人集団におい
て優勢な対立遺伝子であるので、ＤＲ３結合能は、ＨＴＬエピトープの選択にお
ける重要な基準である。しかし、以前に生成されたデータは、ＤＲ３のみが、他
のＤＲ対立遺伝子とめったに交差反応しないことを示した（Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２６３４−２６４０、１９９２；Ｇｅｌｕｋら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５７４２−５７４８、１９９４；Ｓｏｕｔｈｗｏｏ
ｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３、１９９８）。これは
、ＤＲ３ペプチド結合モチーフが、大半の他のＤＲ対立遺伝子の特異性とは異な
るようである点において、まったく驚くべきことではない。ワクチン候補物の開
発における最大の効率について、ＤＲ３モチーフが、ＤＲスーパーモチーフ領域
に近接して密集することが望ましい。従って、候補物であると示されたペプチド
もまた、そのＤＲ３結合能についてアッセイされ得る。しかし、ＤＲ３モチーフ
の異なる結合特異性を考慮して、ＤＲ３のみに結合するペプチドをまた、ワクチ
ン処方物への包含についての候補物とみなし得る。
【０３２３】 ＤＲ３を結合するペプチドを効果的に同定するために、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＡ
Ｐ、およびｈＫ２タンパク質配列を、Ｇｅｌｕｋら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５
２：５７４２−５７４８、１９９４）によって報告される２つのＤＲ３特異的結
合モチーフ（表ＩＩＩ）のうちの１つを保有する配列について分析した。次いで
、対応するペプチドを合成し、そして１０００ｎＭまたはよりよい（すなわち、
１０００ｎＭ未満の）親和性でＤＲ３を結合する能力について試験する。
【０３２４】 さらに、ＤＲ３結合剤をまた、ＤＲスーパータイプ対立遺伝子への結合につい
て試験する。逆に、ＤＲスーパータイプ交差反応性結合ペプチドをまた、ＤＲ３
結合能について試験する。
【０３２５】 この様式で同定されたＤＲ３結合エピトープをまた、ＤＲ３スーパーモチーフ
保有ペプチドエピトープを有するワクチン組成物中に含む。
【０３２６】 ＨＬＡクラスＩモチーフ保有ペプチドの場合と同様に、クラスＩＩモチーフ保
有ペプチドをアナログ化して、親和性または交差反応性を改善する。例えば、９
マーコア配列の位置４でのアスパラギン酸は、ＤＲ３結合について最適な残基で
あり、そしてこの残基についての置換は、しばしばＤＲ３結合を改善する。
【０３２７】 例えば、多くのＨＬＡ−ＤＲスーパーモチーフおよびＤＲ−３モチーフ保有前
立腺抗原関連配列を、同定している。各部門における数を、表ＸＸＶにまとめる
。
【０３２８】 （実施例６．ＨＴＬエピトープの免疫原性） 本実施例は、実施例５における方法論を用いて同定されたエピトープ間の、免
疫原性ＤＲスーパーモチーフ保有エピトープおよびＤＲ３モチーフ保有エピトー
プを決定する。
【０３２９】 ＨＴＬエピトープの免疫原性を、ＨＴＬ応答を刺激する能力の評価および／ま
たは適切なトランスジェニックマウスモデルの使用によって、ＣＴＬエピトープ
の免疫原性の決定に類似の様式で評価する。免疫原性を、以下についてのスクリ
ーニングによって決定する：１．）正常なＰＢＭＣを用いたインビトロ一次誘導
、または２．）癌患者のＰＢＭＣ由来のリコール（ｒｅｃａｌｌ）応答。
【０３３０】 （実施例７．集団範囲の広さを決定するための、種々の人種背景におけるＨＬ
Ａスーパータイプの表現型頻度の計算） 本実施例は、複数のスーパーモチーフおよび／またはモチーフを含む複数のエ
ピトープから構成されるワクチン組成物の集団範囲の広さの評価を例示する。
【０３３１】 集団範囲を分析するために、ＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子頻度を決定した。各々
のＨＬＡ対立遺伝子についての遺伝子頻度を、二項分布式ｇｆ＝１−（ＳＱＲＴ
（１−ａｆ））を利用して、抗原頻度または対立遺伝子頻度から計算した（例え
ば、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３、１９９
６を参照のこと）。全体の表現型頻度を得るために、累積遺伝子頻度を計算し、
そして累積抗原頻度は、逆関数式［ａｆ＝１−（１−Ｃｇｆ）２］の使用によっ
て導かれた。
【０３３２】 頻度のデータが、ＤＮＡ分類のレベルで入手不可能であった場合、血清学的に
規定された抗原頻度の対応を仮定した。合計の潜在的なスーパータイプの集団範
囲を得るために、連鎖不均衡を仮定せず、そして各々のスーパータイプに属する
ことが確認される対立遺伝子のみを含めた（最小限の見積もり）。位置間（ｉｎ
ｔｅｒ−ｌｏｃｉ）の組み合わせによって達成される合計の潜在的な範囲の見積
もりを、考慮されるＢ対立遺伝子によって覆われることが期待され得る、Ａで覆
われない集団の割合を、Ａ範囲に付加することによって作製した（例えば、合計
＝Ａ＋Ｂ＊（１−Ａ））。Ａ３様スーパータイプの確認されたメンバーは、Ａ３
、Ａ１１、Ａ３１、Ａ＊３３０１およびＡ＊６８０１である。Ａ３様スーパータ
イプはまた、Ａ３４、Ａ６６およびＡ＊７４０１を含み得るが、これらの対立遺
伝子は、合計の頻度計算に含めなかった。同様に、Ａ２様スーパータイプファミ
リーの確認されたメンバーは、Ａ＊０２０１、Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ ＊ ０２０４、Ａ＊０２０５、Ａ＊０２０６、Ａ＊０２０７、Ａ＊６８０２および
Ａ＊６９０１である。最終的に、Ｂ７様スーパータイプの確認された対立遺伝子
は、以下である：Ｂ７、Ｂ＊３５０１〜０３、Ｂ５１、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊５４
０１、Ｂ＊５５０１〜２、Ｂ＊５６０１、Ｂ＊６７０１およびＢ＊７８０１（潜
在的には、またＢ＊１４０１、Ｂ＊３５０４〜０６、Ｂ＊４２０１およびＢ＊５
６０２）。
【０３３３】 Ａ２スーパータイプ、Ａ３スーパータイプおよびＢ７スーパータイプを結合す
ることによって達成される集団範囲は、５つの主要な人種群において、約８６％
である（表ＸＸＩを参照のこと）。範囲は、Ａ１モチーフおよびＡ２４モチーフ
を保有するペプチドを含めることによって拡張され得る。平均して、Ａ１は、５
つの異なる主要な人種群（カフカス人、北米黒人、中国人、日本人およびスペイ
ン系人）に渡る集団の１２％に存在し、そしてＡ２４は、この５つの異なる主要
な人種群に渡る集団の２９％に存在する。合わせて、これらの対立遺伝子を、こ
れらの同じ人種集団において３９％の平均頻度で表す。Ａ１およびＡ２４を、Ａ
２スーパータイプ対立遺伝子、Ａ３スーパータイプ対立遺伝子およびＢ７スーパ
ータイプ対立遺伝子の範囲と組み合わせる場合、主要な民族的背景に渡る合計の
範囲は、９５％を超える。類似のアプローチを使用して、クラスＩＩモチーフ保
有エピトープの組み合わせを用いて達成される集団範囲を概算し得る。
【０３３４】 （実施例８．プライム後の内因性にプロセスされた抗原の認識） 本実施例は、実施例１〜６に記載されるように同定されかつ選択される、ネイ
ティブのペプチドエピトープまたはアナログ化ペプチドエピトープによって誘導
されるＣＴＬが、トランスジェニックマウスモデルを使用して、内因性に合成さ
れた（すなわち、ネイティブの）抗原を認識することを決定する。
【０３３５】 ペプチドエピトープ（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．３２：６０３、１９９５に記載されるような）で免疫したトランスジェニッ
クマウスから単離したエフェクター細胞（例えば、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチー
フ保有エピトープ）を、ペプチドでコーティングした刺激（ｓｔｉｍｕｌａｔｏ
ｒ）細胞を用いて、インビトロで再度刺激する。６日後、エフェクター細胞を、
細胞傷害性についてアッセイし、そしてペプチド特異的細胞傷害性活性を含む細
胞系を、さらに再度刺激する。さらに６日後、これらの細胞系を、ペプチドの非
存在または存在下で、５１Ｃｒで標識したＪｕｒｋａｔ−Ａ２．１／Ｋｂ標的細
胞に対する細胞傷害性活性について試験し、そしてまた、内因性に合成された抗
原を保有する５１Ｃｒで標識した標的細胞（すなわち、前立腺腫瘍細胞またはＴ
ＡＡ発現ベクターを用いて安定にトランスフェクトされる細胞）について試験す
る。
【０３３６】 結果は、ペプチドエピトープを用いてプライムした動物から得られたＣＴＬ系
が、内因性に合成された抗原を認識することを実証する。このような分析につい
て使用されるべきトランスジェニックマウスモデルの選択は、評価されているエ
ピトープに依存する。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ｋｂトランスジェニックマウスに
加えて、ヒトＡ１１を有するマウスを含むいくつかの他のトランスジェニックマ
ウスモデル（これはまた、Ａ３エピトープを評価するために使用され得る）およ
びＢ７対立遺伝子を有するマウスを含むいくつかの他のトランスジェニックマウ
スモデルが特徴付けられ、そして他のもの（例えば、ＨＬＡ−Ａ１およびＡ２４
についてのトランスジェニックマウス）が開発されている。ＨＬＡ−ＤＲ１マウ
スモデルおよびＨＬＡ−ＤＲ３マウスモデルもまた開発され、これは、ＨＴＬエ
ピトープを評価するために使用され得る。
【０３３７】 （実施例９．トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ−ＨＴＬ結合体化エピ
トープの活性） 本実施例は、腫瘍関連抗原ＣＴＬ／ＨＴＬペプチド結合体の使用によるトラン
スジェニックマウスにおけるＣＴＬおよびＨＴＬの誘導を実証し、それによって
、ワクチン組成物が、癌患者に投与されるべきペプチドを含む。ペプチド組成物
は、複数のＣＴＬエピトープおよび／またはＨＴＬエピトープを含み得、そして
さらに、複数の腫瘍関連抗原から選択されるエピトープを含み得る。このエピト
ープを、実施例１〜６に記載されるような方法論を用いて同定する。この分析は
、ワクチン組成物における１つ以上のＨＴＬエピトープの包含によって達成され
得る免疫原性の増大を実証する。このようなペプチド組成物は、好ましいＣＴＬ
エピトープに結合体化したＨＴＬエピトープを含み得、このＣＴＬエピトープは
、例えば、表ＸＸＩＩＩから選択される少なくとも１つのＣＴＬエピトープまた
はこのエピトープの他のアナログを含む。所望であれば、このペプチドは脂質化
（ｌｉｐｉｄａｔｅ）され得る。
【０３３８】 免疫化手順：トランスジェニックマウスの免疫化を、記載されるように行う（
Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３−４７６１、１
９９７）。例えば、Ａ２／Ｋｂマウス（これは、ヒトＨＬＡ Ａ２．１対立遺伝
子についてトランスジェニックであり、そしてＨＬＡ−Ａ＊０２０１モチーフ保
有エピトープまたはＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有エピトープの免疫原性の
評価に有用である）を、完全フロイントアジュバント、またはペプチド組成物が
脂質化ＣＴＬ／ＨＴＬ結合体である場合、ＤＭＳＯ／生理食塩水またはペプチド
組成物がポリペプチドである場合、ＰＢＳもしくは完全フロイントアジュバント
中の０．１ｍｌのペプチド結合体で、皮下的に（尾の基部）プライムする。プラ
イムの７日後、これらの動物から得られた脾細胞を、ペプチドでコーティングさ
れた、同系の（ｓｙｎｇｅｎｉｃ）照射されたＬＰＳ活性化リンパ芽球で再度刺
激する。
【０３３９】 ペプチド特異的細胞傷害性アッセイについての標的細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１
／Ｋｂキメラ遺伝子でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞である（例えば
、Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７、１９９１）。
【０３４０】 インビトロＣＴＬ活性化：プライムの１週間後、脾臓細胞（３０×１０６細胞
／フラスコ）を、１０ｍｌの培養培地／Ｔ２５フラスコにおいて、同系の照射さ
れた（３０００ｒａｄ）、ペプチドでコーティングされたリンパ芽球（１０×１
０６細胞／フラスコ）とともに、３７℃で共存培養する。６日後、エフェクター
細胞を収集し、そして細胞傷害性活性についてアッセイする。
【０３４１】 細胞傷害性活性についてのアッセイ：標的細胞（１．０〜１．５×１０６）を
、２００μｌの５１Ｃｒの存在下で３７℃でインキュベートする。６０分後、細
胞を３回洗浄し、そして培地中に再懸濁する。ペプチドを添加し、この場合、１
μｇ／ｍｌの濃度で必要とされる。アッセイについて、１０４個の５１Ｃｒで標
識された標的細胞を、Ｕ底の９６ウェルプレートに、異なる濃度のエフェクター
細胞（最終容量は２００μｌ）を添加する。３７℃で６時間のインキュベーショ
ン後、上清の０．１ｍｌのアリコートを、各々のウェルから除去し、そして放射
能を、Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ自動ガンマカウンターにおいて決定する。パーセン
ト特異的溶解を、以下の式によって決定する：パーセント特異的放出＝１００×
（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）。同じ条件下で行われ
る別々のＣＴＬアッセイ間の比較を容易にするために、％５１Ｃｒ放出データを
、溶解単位／１０６細胞として表す。１溶解単位を、６時間の５１Ｃｒ放出アッ
セイにおいて、１０，０００個の標的細胞の３０％の溶解を達成するために必要
とされるエフェクター細胞の数として任意に規定する。特定の溶解単位／１０６ を得るために、ペプチドの非存在下において得られる溶解単位／１０６を、ペプ
チドの存在下において得られる溶解単位／１０６から差し引く。例えば、３０％
の５１Ｃｒ放出が、ペプチドの非存在下で、５０：１のエフェクター（Ｅ）：標
的（Ｔ）比（すなわち、１０，０００個の標的に対して５×１０５個のエフェク
ター細胞）で得られ、そしてペプチドの存在下で、５：１の比（すなわち、１０
，０００個の標的に対して５×１０４個のエフェクター細胞）で得られる場合、
この特定の溶解単位は、以下である：［（１／５０，０００）−（１／５００，
０００）］×１０６＝１８ＬＵ。
【０３４２】 結果を分析して、免疫原性のＣＴＬ／ＨＴＬ結合体ワクチン調製物を用いて注
射された動物のＣＴＬ応答の大きさを評価する。応答の程度および頻度をまた、
ＣＴＬエピトープ自体を使用して達成されるＣＴＬ応答と比較し得る。これに類
似の分析を行って、複数のＣＴＬエピトープおよび／または複数のＨＴＬエピト
ープを含むペプチド結合体の免疫原性を評価し得る。これらの手順に従って、Ｃ
ＴＬ応答が誘導され、そして付随して、ＨＴＬ応答が、このような組成物の投与
の際に誘導されることが見出される。
【０３４３】 （実施例１０：癌ワクチンに含有させるためのＣＴＬエピトープおよびＨＴＬ
エピトープの選択） 本実施例は、本発明ワクチン組成物のためのペプチドエピトープを選択する手
順を説明する。本組成物中のペプチドは、ペプチドをコードする単独または一つ
以上の配列（つまり、ミニジーン）のいずれかの核酸配列という形態であっても
よいし、単独および／またはポリエピトープ性のペプチドであってもよい。
【０３４４】 ワクチン組成物中に含有させるためのエピトープのアレイを選択する際、次の
原理を利用する。選択を行うために、次のそれぞれの原理を比較考慮する。
【０３４５】 投与の際に、腫瘍排除と相関することが認められた免疫応答を模倣するエピト
ープを選択する。例えば、ワクチンには、少なくとも１つの前立腺癌関連抗原由
来の３〜４個のエピトープが含まれ得る。例えば、実施例１５にて記述するよう
な、頻繁に発現されるＴＡＡの発現パターンが変化する腫瘍を標的とするワクチ
ンを調製するために、１つの前立腺癌関連抗原由来のエピトープを、一つ以上の
さらなるＴＡＡ由来のエピトープと組み合わせて使用し得る。
【０３４６】 好ましくは、ＨＬＡクラスＩ分子に対する結合アフィニティー（ＩＣ５０）が
５００ｎＭ以下、多くの場合、２００ｎＭ以下、またはクラスＩＩ分子に対する
結合アフィニティーが１０００ｎＭ以下であるエピトープを選択する。
【０３４７】 幅広い集団の適用範囲を与えるように、十分なスーパーモチーフを持つペプチ
ド、または十分な、対立遺伝子特異的モチーフを持つペプチドの十分なアレイを
選択する。例えば、最低８０％の集団の適用範囲を提供するように、エピトープ
を選択する。集団の適用範囲の広さまたは重複性を評価するために、当該分野で
既知の統計的評価であるモンテカルロ分析を使用し得る。
【０３４８】 癌関連抗原からエピトープを選択する際、患者はネイティブのエピトープに対
して耐性を持つようになるので、多くの場合、アナログを選択することが好まし
い。
【０３４９】 例えばミニジーンなどのポリエピトープ性組成物を調製する際、スペーサーま
たは他の隣接配列もまた組み込まれ得るが、目的のエピトープを含有することが
可能な最小のペプチドを調製することが典型的には望ましい。用いる原理は、多
くの場合、入れ子構造になった（ｎｅｓｔｅｄ）エピトープを含むペプチドを選
択する際に用いる原理と同様である。しかしながら、さらに、ミニジーンとして
提供される核酸配列を決定する際に、結合エピトープが生じているか否かを調べ
るために、その核酸配列がコードするペプチド配列を解析する。例えばモチーフ
解析により予想されるように、結合エピトープは、潜在的なＨＬＡ結合エピトー
プである。レシピエントがＨＬＡ分子に結合し、ネイティブのタンパク質配列に
は存在しないそのエピトープに対して免疫応答を生じ得るので、結合エピトープ
は一般的に避けられるべきである。
【０３５０】 投与する場合、選択したペプチドを含むワクチン組成物は、安全であり、効果
があり、そして免疫応答を誘導し、その結果、腫瘍細胞殺傷および腫瘍サイズま
たは質量の減少を生じる。
【０３５１】 （実施例１１：ミニジーンマルチエピトープＤＮＡプラスミドの構築） 本実施例は、ミニジーン発現プラスミド構築に対する一般的な説明を提供する
。構築物の例および発現プラスミドの評価は、例えば１９９９年５月１３日に提
出された同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３１１，７８４において記述され
ている。
【０３５２】 ミニジーン発現プラスミドには、複数のＣＴＬおよびＨＴＬペプチドエピトー
プが含まれ得る。本実施例において、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ
７スーパーモチーフを持つペプチドエピトープおよび、ＨＬＡ−Ａ１およびＨＬ
Ａ−Ａ２４モチーフを持つペプチドエピトープを、ＤＲスーパーモチーフを持つ
エピトープおよび／またはＤＲ３エピトープとともに使用する。幅広い集団の適
用範囲を確実にするために複数のスーパーモチーフ／モチーフが示されるように
、複数の前立腺癌関連抗原由来のＨＬＡクラスＩスーパーモチーフまたはモチー
フ保有ペプチドエピトープを、選択する。同様に、幅広い集団の適用範囲を提供
するように複数の前立腺癌関連抗原からＨＬＡクラスＩＩエピトープを選択する
、つまり、ＨＬＡ ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフを持つエピトープおよび
ＨＬＡ ＤＲ−３モチーフを持つエピトープの両方をミニジーン構築物に含める
ために選択する。次に、選択したＣＴＬおよびＨＴＬエピトープを、発現ベクタ
ーで発現するようにミニジーンに組み込む。
【０３５３】 この実施例は、そのようなミニジーンを持つ発現プラスミドの構築に使用する
方法を説明する。ミニジーン組成物に使用し得る他の発現ベクターが利用可能で
あり、当業者により既知である。
【０３５４】 ミニジーンＤＮＡプラスミドには、コンセンサスコザック配列およびコンセン
サスマウスカッパＩｇ−軽鎖シグナル配列が含まれる。このコンセンサスマウス
カッパＩｇ−軽鎖シグナル配列の後に、本明細書中で開示した原理に従い選択し
たＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープが続く。本配列は、ｐｃＤＮＡ３．１
Ｍｙｃ−ＨｉｓベクターによりコードされたＭｙｃおよびＨｉｓ抗体エピトープ
タグと融合したオープンリーディングフレームをコードする。
【０３５５】 重複するオリゴヌクレオチド（例えば、長さが平均しておよそ７０ヌクレオチ
ドで、１５個のヌクレオチド重複を持つ）を合成し、ＨＰＬＣ精製する。オリゴ
ヌクレオチドは、適切なリンカーヌクレオチドであるコザック配列およびシグナ
ル配列、ならびに選択したペプチドエピトープをコードする。ＰＣＲを用いた３
セットの反応で重複オリゴヌクレオチドを伸長させて、最終的なマルチエピトー
プミニジーンを組み立てる。Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ ９６００ ＰＣＲ装置
を使用し、次の条件を用いて全部で３０サイクル行う。その条件とは、９５℃で
１５秒、アニーリング温度（それぞれのプライマーペアの計算上の最低Ｔｍ値よ
りも５℃低い温度）で３０秒、および７２℃で１分である。
【０３５６】 例えば、ミニジーンを以下のように調製し得る。第一のＰＣＲ反応に対して、
５μｇの二つのそれぞれのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、伸長させる
：８つのオリゴヌクレオチドを使用する例（すなわち、４つのプライマー対）に
おいて、オリゴヌクレオチド１＋２、３＋４、５＋６および７＋８を、Ｐｆｕポ
リメラーゼ緩衝液（１×＝１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸、ｐＨ８．７５、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００，１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ
、および２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含む１００μｌの反応系に添加する。
全長のダイマー産物をゲルにより精製し、１＋２および３＋４の産物、ならびに
５＋６および７＋８の産物を含む２つの反応物を混合し、アニーリング、伸長反
応を１０サイクル行う。次に二つの反応系の半分を混合し、５サイクルのアニー
リングおよび伸長を行った後、隣接プライマーを添加して、２５サイクルの反応
を行って全長産物を増幅させる。全長産物をゲルにより精製し、ｐＣＲ−ｂｌｕ
ｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、個々のクローンを配列決定に
よりスクリーニングする。
【０３５７】 （実施例１２：プラスミド構築物およびそれが免疫原性を誘導する程度） プラスミド構築物（例えば、実施例１１に従って構築したプラスミド）が免疫
原性を誘導し得る程度を、エピトープ発現核酸構築物を用いたＡＰＣの形質導入
またはトランスフェクションに続くＡＰＣによるエピトープ提示について試験す
ることでインビトロで評価し得る。そのような試験により、「抗原性」が決定さ
れ、ヒトＡＰＣの使用が可能になる。細胞表面上のエピトープ−ＨＬＡクラスＩ
複合体密度を定量することにより、Ｔ細胞により認識される状況において、エピ
トープのＡＰＣにより提示される能力がそのアッセイから決定される。直接、Ａ
ＰＣから溶出したペプチド量を測定することにより（例えば、Ｓｉｊｔｓら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：６８３−６９２，１９９６；Ｄｅｍｏｔｚら、Ｎａ
ｔｕｒｅ３４２：６８２−６８４，１９８９を参照すること）定量を行い得る；
または、感染した標的細胞またはトランスフェクトした細胞により誘導される溶
解またはリンホカイン放出量を測定し、次いで同等レベルの溶解またはリンホカ
イン放出を得るために必要なペプチド濃度を決定することによりペプチド−ＨＬ
ＡクラスＩ複合体数を推定し得る（例えば、Ｋａｇｅｙａｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１５４：５６７−５７６、１９９５を参照すること）。
【０３５８】 あるいは、免疫原性を、マウスへのインビボ注射およびそれに続くインビトロ
でのＣＴＬおよびＨＴＬ活性の評価により評価し得る。ＣＴＬおよびＨＴＬ活性
を、例えば、１９９９年５月１３日に提出されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ ０９／３１１
，７８４、およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１−７６
１、１９９４にて詳述されているような、細胞傷害性および増殖アッセイをそれ
ぞれ用いて解析する。
【０３５９】 例えば、インビボにてＣＴＬを誘導するために少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２
スーパーモチーフペプチドを含むＤＮＡミニジーン構築物（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｓ
．Ｎ．０９／３１１，７８４にて記述されているように調製したｐＭｉｎミニジ
ーン構築物）の能力を評価するために、例えば、ＨＬＡ−Ａ１１／Ｋｂトランス
ジェニックマウスに、１００μｇの裸のｃＤＮＡを筋肉内免疫する。ｃＤＮＡの
免疫によって誘導されるＣＴＬレベルを比較する方法として、複数のエピトープ
がミニジーンによりコードされている場合、単一のポリペプチドとして合成した
複数のエピトープを含む実際のペプチド組成物を用いて、コントロール群の動物
もまた免疫する。
【０３６０】 免疫した動物由来の脾臓細胞を、それぞれの別個の組成物（ミニジーンでコー
ドされているペプチドエピトープ、またはポリエピトープ性ペプチド）で二回刺
激し、５１Ｃｒ放出アッセイにおいてペプチド特異的細胞傷害性活性についてア
ッセイする。その結果から、Ａ２拘束性エピトープに対して向けられるＣＴＬ応
答の程度、従って、ミニジーンワクチンおよびポリエピトープ性ワクチンのイン
ビボでの免疫原性が示される。従って、ポリエピトープ性ペプチドワクチンが免
疫応答を惹起するように、ミニジーンが、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチ
ドエピトープに対して向けられた免疫応答を惹起するということが明らかになる
。ＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７モチーフ、またはスーパーモチーフエピトー
プによるＣＴＬ誘導を評価するために、他のＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７ト
ランスジェニックマウスモデルを使用して同様の解析をまた行う。
【０３６１】 クラスＩＩエピトープをコードするミニジーンがインビボでＨＴＬ、ＤＲトラ
ンスジェニックマウス、または適切なマウスＭＨＣ分子を用いて交差反応するエ
ピトープを誘導する能力を評価するために、例えば、Ｉ−Ａｂ拘束性マウスに、
筋肉内に１００μｇのプラスミドＤＮＡを免疫する。ＤＮＡ免疫により誘導され
るＨＴＬレベルを比較する方法として、コントロール群の動物もまた、完全フロ
イントアジュバントで乳化した実際のペプチド組成物を用いて免疫する。ＣＤ４
＋Ｔ細胞、つまりＨＴＬを、免疫した動物の脾臓細胞から精製しそれぞれの別個
の組成物（ミニジーンでコードされているペプチド）で刺激する。３Ｈ−チミジ
ン取り込み増殖解析（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：
７５１−７６１，１９９４を参照すること）を用いてＨＴＬ応答を測定する。そ
の結果から、ＨＴＬ応答の大きさ、従って、インビボでのミニジーンの免疫原性
が示される。
【０３６２】 実施例１１にて記述するように構築したＤＮＡミニジーンをまた、プライムブ
ーストプロトコールを用いてブースト剤（ｂｏｏｓｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）と組
み合わせたワクチンとして評価し得る。ブースト剤は、組換えタンパク質（例え
ば、Ｂａｒｎｅｔｔら、Ａｉｄｓ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖ
ｉｒｕｓｅｓ １４、補遺３：Ｓ２９９−Ｓ３０９，１９９８）または、組換え
ワクシニア（例えば、ミニジーンまたは目的の完全なタンパク質をコードするＤ
ＮＡを発現する）からなり得る（例えば、Ｈａｎｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６
：４３９−４４５，１９９８；Ｓｅｄｅｇａｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：７６４８−５３、１９９８；Ｈａｎｋｅおよび Ｍ
ｃＭｉｃｈａｅｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ６６：１７７−１８１，
１９９９；およびＲｏｂｉｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：５２６−３
４，１９９９を参照すること）。
【０３６３】 例えば、プライムブーストプロトコールにおいて使用するＤＮＡミニジーンの
有効性を、トランスジェニックマウスにおいて評価し得る。この実施例において
、Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスに対して、少なくとも１つのＨＬＡ
−Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドを含む免疫原性ペプチドをコードする１０
０μｇのＤＮＡミニジーンを用いて筋肉内注射により免疫する。インキュベーシ
ョン期間（３−９週間の範囲）後、ＤＮＡミニジーンにコードされている同じ配
列を発現している組換えワクシニアウイルス１０７ｐｆｕ／マウスを用いて、マ
ウスに追加免疫を行う。コントロールマウスに、ミニジーン配列無しで、または
ミニジーンをコードするＤＮＡとともに、１００μｇのＤＮＡまたは組換えワク
シニアで免疫するが、ワクシニア追加免疫は行わない。さらなる２週間のインキ
ュベーション期間後、マウスから採取した脾臓細胞を、直ちにＥＬＩＳＰＯＴア
ッセイによってペプチド特異的活性についてアッセイする。さらに、ミニジーン
中にコードされているＡ２拘束性ペプチドエピトープおよび組換えワクシニアで
脾臓細胞をインビボで刺激し、次いで、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡにおいてペプチド
特異的活性をアッセイする。
【０３６４】 プライムブーストプロトコールで利用したミニジーンが、ＨＬＡ−Ａ２スーパ
ーモチーフペプチドに対して、ＤＮＡ単独の場合よりも大きな免疫応答を惹起す
るということがわかる。ＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７モチーフまたはスーパ
ーモチーフエピトープによるＣＴＬ誘導を評価するために、他のＨＬＡ−Ａ１１
およびＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いてそのような解析も
また行い得る。
【０３６５】 ヒトにおけるプライムブーストプロトコールの使用を、実施例２０に記載する
。
【０３６６】 （実施例１３：予防的使用のためのペプチド組成物） 腫瘍を発症する高い危険性のある人において、癌を予防するために、本発明ワ
クチン組成物を使用する。例えば、集団の８０％以上を標的とするようにも選択
した実施例９および／または１０で選択したような複数のＣＴＬおよびＨＴＬエ
ピトープを含むポリエピトープ性ペプチドエピトープ組成物（または同じものを
含む核酸）を、前立腺癌の高い危険性を持つ個体に投与する。本組成物を、複数
のエピトープを含む単一ポリペプチドとして与える。フロイント不完全アジュバ
ントを含む水性担体とともに本ワクチンを投与する。初回免疫のペプチド用量は
、体重７０ｋｇの患者に対しておよそ１からおよそ５０，０００μｇ、一般的に
は１００−５，０００μｇである。ワクチンの初回投与後、４週間目に追加免疫
投与を行い、その後、ＰＢＭＣ試料中のエピトープ特異的ＣＴＬ集団の存在を測
定する技術により、患者の免疫応答の大きさを評価する。必要に応じてさらなる
追加免疫用量を投与する。本組成物は、安全であること、および癌に対する予防
剤として有効であるということのいずれもが認められる。
【０３６７】 あるいは、当該分野で公知であり本明細書中で開示している方法論に従って核
酸としてポリエピトープ性ペプチド組成物を投与し得る。
【０３６８】 （実施例１４：ネイティブＴＡＡ配列由来のポリエピトープ性ワクチン組成物
） 複数のエピトープを含み、好ましくは、完全なネイティブ抗原より長さが短い
、「比較的短い」ポリタンパク質領域を同定するために、好ましくは、それぞれ
のクラスＩおよび／またはクラスＩＩスーパーモチーフもしくはモチーフに関し
て定義されたコンピューターアルゴリズムを用いて、ネイティブＴＡＡポリタン
パク質配列をスクリーニングする。複数の別個のものでさらに重複しているエピ
トープを含むこの比較的短い配列を選択し、ミニジーン構築物を調製するために
使用する。ネイティブタンパク質配列に相当するペプチドを発現するように構築
物を構築する。「比較的短い」ペプチドは、一般的に長さが１００、５００、ま
たは２５０アミノ酸未満、多くの場合、長さが１００アミノ酸未満、好ましくは
７５アミノ酸未満、より好ましくは５０アミノ酸未満である。ワクチン組成物の
タンパク質配列は、そのタンパク質配列に含まれるエピトープが最大数である、
つまり、エピトープが高濃度に存在するので、そのタンパク質配列が選択される
。本明細書中で述べているように、エピトープモチーフを入れ子構造にしてもい
よいし、重複させてもよい（つまり、互いに対してフレームシフトが起こってい
る）。例えば、フレームシフトが起こっている重複エピトープがある場合、二つ
の９マーのエピトープおよび一つの１０マーのエピトープが、１０アミノ酸ペプ
チド中に存在し得る。治療または予防を目的として、そのようなワクチン組成物
を投与する。
【０３６９】 ワクチン組成物には、好ましくは、例えば、複数の前立腺癌関連抗原由来の３
つのＣＴＬエピトープおよび少なくとも一つのＨＴＬエピトープが含まれる。こ
のポリエピトープ性ネイティブ配列を、ペプチドとして、またはそのペプチドを
コードする核酸配列としてのいずれかで投与する。あるいは、このネイティブ配
列から、アナログを作製し、それにより一つ以上のエピトープがそのポリエピト
ープ性ペプチドの交差反応性および／または結合アフィニティー特性を変化させ
る置換を含む。
【０３７０】 この実施例の実施形態により、今までのところ発見されていない免疫系プロセ
シングの局面がネイティブ入れ子構造配列に対して適用され、それによって治療
または予防を目的とした免疫応答誘導ワクチン組成物の調製を促進する可能性が
与えられる。さらに、そのような実施形態は、現在のところ未知のＨＬＡ構造に
対する、モチーフを持つエピトープの可能性を提供する。さらに、この実施形態
（アナログがない）は、実際にネイティブＴＡＡに存在し、従っていかなる結合
エピトープを評価する必要も回避する、複数のペプチド配列に対する免疫応答を
指向する。最後に、本実施形態は、核酸ワクチン組成物を調製する場合、規模の
経済性を提供する。
【０３７１】 この実施形態に関連して、当該分野における、標的配列において配列長あたり
のエピトープの最大数を同定する原理に従い、コンピュータープログラムを導出
し得る。
【０３７２】 （実施例１５：複数の腫瘍関連抗原由来のエピトープを含むポリエピトープ性
のワクチン組成物） 本発明の前立腺癌関連抗原ペプチドエピトープを、互いにまたは他の標的腫瘍
関連抗原由来のペプチドエピトープと組み合わせて使用し、複数の患者由来の前
立腺腫瘍の処置に有用なワクチン組成物を作製する。さらに、複数の腫瘍抗原由
来のエピトープを含むワクチン組成物はまた、個体の腫瘍抗原の発現の損失に起
因する逸脱変異に対する潜在能力を減少する。
【０３７３】 様々なＴＡＡ由来の複数のエピトープを組み入れた単一ポリペプチドとして本
組成物を提供し得るか、または一つ以上の別個のエピトープを含む組成物として
本組成物を投与し得る。あるいは、ミニジーン構築物として、またはインビボで
ペプチドエピトープで負荷をかけた樹状細胞として本ワクチンを投与し得る。
【０３７４】 （実施例１６：免疫応答を評価するためのペプチドの使用） 前立腺癌関連抗原に向けられた特異的なＣＴＬまたはＨＴＬ集団の存在に対す
る免疫応答を解析するために本発明ペプチドを使用し得る。例えば、Ｏｇｇら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：２１０３−２１０６，１９９８およびＧｒｅｔｅｎら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：７５６８−７５７３
，１９９８によって記述されているような多量体複合体を用いてそのような解析
を行い得る。次の例において、免疫原としてではなく、診断目的または予測目的
の試薬として本発明に従ったペプチドを使用する。
【０３７５】 この例において、例えば、異なる疾患段階またはその後のＡ＊０２０１モチー
フを含むＴＡＡペプチドを用いた免疫後の腫瘍関連抗原ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽
性患者からのＨＬＡ−Ａ＊０２０１特異的ＣＴＬ頻度の断面的分析について、高
感度のヒト白血球抗原テトラマー複合体（「テトラマー」）を使用する。記述さ
れているように（Ｍｕｒｓｅｙら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：１２６
７，１９９７）、テトラマー複合体を合成する。簡潔に述べると、原核生物発現
システムにより、精製したＨＬＡ重鎖（この実施例でのＡ＊０２０１）およびβ
２−ミクログロブリンを合成する。膜貫通−細胞質テールの欠失およびＣＯＯＨ
−末端へのＢｉｒＡ酵素のビオチン化部位を含む配列付加により重鎖を改変する
。重鎖、β２−ミクログロブリン、およびペプチドを希釈により再折りたたみす
る。４５−ｋＤの再折りたたみ産物を、高速タンパク質液体クロマトグラフィー
で単離し、次に、ビオチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ
）、アデノシン５’三リン酸およびマグネシウム存在下でＢｉｒＡによりビオチ
ン化を行う。ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体をモル比１：４で添
加し、テトラマー産物を１ｍｇ／ｍｌになるように濃縮する。得られた産物をテ
トラマー−フィコエリトリンと呼ぶ。
【０３７６】 患者血液試料の分析に対して、およそ百万のＰＢＭＣを、３００ｇで５分間遠
心分離し、５０μｌの冷リン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁する。抗−ＣＤ８−Ｔ
ｒｉｃｏｌｏｒ、および抗−ＣＤ３８とともに、テトラマー−フィコエリトリン
を用いてＴｒｉ−ｃｏｌｏｒ分析を行う。ＰＢＭＣを、テトラマーおよび抗体と
ともに、氷上で３０分から６０分インキュベーションし、ホルムアルデヒドで固
定する前に二回洗浄する。ゲートに９９．９８％を超えるコントロール試料を含
むようにアプライする。テトラマーのコントロールは、Ａ＊０２０１−陰性の個
体およびＡ＊０２０１−陽性の非感染ドナー両方を含む。次に、テトラマーによ
り染色された細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより測定する。そ
の結果から、エピトープ拘束性ＣＴＬを含むＰＢＭＣ試料における細胞数が示さ
れ、それにより、ＴＡＡエピトープに対する免疫応答の程度、従って腫瘍の進行
段階、または防御的または治療的応答を惹起するワクチンへの曝露が容易に示さ
れる。
【０３７７】 （実施例１７：再帰性応答を評価するためのペプチドエピトープの使用） 本発明ペプチドエピトープを、患者の急性または再帰性の応答などのＴ細胞応
答を評価するための試薬として使用する。寛解状態にある患者、腫瘍がある患者
、または前立腺癌関連抗原ワクチンでワクチン接種されている患者に対してその
ような解析を行い得る。
【０３７８】 例えば、ワクチン接種されている人のクラスＩ拘束性ＣＴＬ応答を解析し得る
。ワクチンは、任意のＴＡＡワクチンであり得る。ＰＢＭＣをワクチン接種され
た個体から回収し、ＨＬＡ型を検出する。次に、複数のＨＬＡスーパータイプフ
ァミリーメンバーとの交差反応性を与えるスーパーモチーフを随意で持つ本発明
の適切なペプチドエピトープを、そのＨＬＡ型を持つ個体由来の試料の解析に使
用する。
【０３７９】 ワクチン接種を行った個体由来のＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｉｓｔｏｐａ
ｑｕｅ密度勾配（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
ＭＯ）で分離し、ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で３回洗
浄し、１０％熱非働化ヒトＡＢ血清を含む、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシ
リン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびＨｅｐｅ
ｓ（１０ｍＭ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）（完全ＲＰＭＩ）で再懸濁し、マイクロ培養形式でプレートする。本
発明エピトープを含む合成ペプチドを、１０μｇ／ｍｌになるようにそれぞれの
ウェルに添加し、刺激の第一週目の間の補助的なＴ細胞源としてＨＢＶコア１２
８−１４０エピトープを１μｇ／ｍｌになるように各ウェルに添加する。
【０３８０】 マイクロ培養形式において、１００μｌ／ウェルの完全ＲＰＭＩを添加した９
６ウェル丸底プレート中の８個の同型培養において４Ｘ１０５ＰＢＭＣをペプチ
ドで刺激する。３日目と１０日目に、それぞれのウェルに１００ ｌの完全ＲＰ
ＭＩおよび最終濃度２０Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２を添加する。７日目に、培養物を
９６ウェル平底プレートへ移し、ペプチド、ｒＩＬ−２および放射線照射（３，
０００ｒａｄ）した１０５個の自系支持細胞で再び刺激する。その培養物を、１
４日目に細胞傷害性活性に関して試験を行う。以前に記述されているように（Ｒ
ｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：１１０４−１１０８，１９９
６；Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１６５５−１
６６５，１９９６；およびＲｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ
．９８：１４３２−１４４０，１９９６）、非感染コントロール被験者との比較
に基づいて、陽性ＣＴＬ応答として、８個の同型培養物のうちの２以上において
１０％を越える特異的５１Ｃｒ放出を示すことが必要である。
【０３８１】 標的細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏ
ｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＡＳＨＩ，
Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から購入するか、または記述されているように（Ｇｕｉｌ
ｈｏｔら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．６６：２６７０−２６７８，１９９２）、患者のプー
ルから確立するか、いずれかの自系および同種異系ＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬで
ある。
【０３８２】 次の様式で細胞傷害性アッセイを行う。標的細胞は、１０μＭの本発明合成ペ
プチドエピトープと共に一晩インキュベーションを行い、１００μＣｉの５１Ｃ
ｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉ
Ｌ）で１時間標識し、その後ＨＢＳＳで４回洗浄を行った同種異系ＨＬＡ適合ま
たは自系ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球細胞株のどちらかからなる。
【０３８３】 ３，０００標的細胞／ウェルが入っているＵ底９６ウェルプレートを用いて標
準的な４時間のスプリット−ウェル（ｓｐｌｉｔ−ｗｅｌｌ）５１Ｃｒ放出アッ
セイで細胞溶解活性を調べる。１４日目に、２０〜５０：１のエフェクター／標
的（Ｅ／Ｔ）比で、刺激したＰＢＭＣを試験する。式：１００Ｘ［（実験による
放出−自発的放出）／最大放出−自発的放出）］からパーセント細胞傷害性を算
出する。界面活性剤（２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いた標的細胞溶解により最大放
出を調べる。自発的放出は、全ての実験について、最大放出の２５％未満である
。
【０３８４】 そのような解析の結果から、ＨＬＡ−拘束性ＣＴＬ集団がＴＡＡまたはＴＡＡ
ワクチンに対する以前の曝露により刺激されている程度が示される。
【０３８５】 クラスＩＩ拘束性ＨＴＬ応答もまた解析し得る。精製したＰＢＭＣを、９６ウ
ェル平底プレートで、１．５×１０５細胞／ウェルの密度で培養し、１０μｇ／
ｍｌの合成ペプチド、完全抗原、またはＰＨＡで刺激する。細胞を通常通り、そ
れぞれの条件に対して４−６ウェルの同型培養としてプレートする。培養７日後
、培養液を除去し、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮な培養液に交換する。２
日後、１μＣｉの３Ｈ−チミジンをそれぞれのウェルに添加し、さらに１８時間
インキュベーションを続ける。次に細胞内のＤＮＡをグラスファイバーマット上
に取り出し、３Ｈ−チミジン取り込みについて解析する。抗原非存在下での３Ｈ
−チミジン取り込み量で割った抗原存在下での３Ｈ−チミジン取り込み量の比と
して抗原特異的Ｔ細胞増殖を計算する。
【０３８６】 （実施例１８：ヒトでの特異的ＣＴＬ応答の誘導） 本発明ＣＴＬおよびＨＴＬエピトープを含む免疫原性組成物に対するヒトの治
験をＩＮＤフェーズＩ、投与量漸増試験として開始する。そのような治験を、例
えば次のように設計する。
【０３８７】 全体でおよそ２７人の男性被験者を登録し、３つの群に分ける： 第一群：３人の被験者にプラセボを注射し、６人の被験者に５μｇのペプチド
組成物を注射する。
【０３８８】 第二群：３人の被験者にプラセボを注射し、６人の被験者に５０μｇのペプチ
ド組成物を注射する。
【０３８９】 第三群：３人の被験者にプラセボを注射し、６人の被験者に５００μｇのペプ
チド組成物を注射する。
【０３９０】 最初の注射から４週間後に、全ての被験者に対して同じ投与量で追加免疫接種
を行う。同じスケジュールで更なる追加免疫接種を行い得る。
【０３９１】 この試験で測定する項目は、ペプチド組成物の免疫原性と同時にその安全性お
よび認容性に関連する。本ペプチド組成物に対する細胞性免疫応答は、ペプチド
組成物の本質的な活性の指標であり、従って、生物学的有効性の目安として見な
され得る。次に、安全性および有効性の項目に関連する臨床および実験データを
要約する。
【０３９２】 安全性：プラセボおよび薬物処置群で有害事象の発生率を監視し、程度およ
び可逆性に関して評価する。
【０３９３】 ワクチン有効性の評価：ワクチンの有効性を評価するために、被験者から注
射の前後に採血する。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により末
梢血単核細胞を新鮮なヘパリン処理血液から単離し、凍結保存用培地中にアリコ
ートに分け、冷凍保存する。試料をＣＴＬおよびＨＴＬ活性に関して分析する。
【０３９４】 本ワクチンが安全であり有効であることが認められる。
【０３９５】 （実施例１９：癌患者における治療的使用） 前立腺癌患者におけるＣＴＬ−ＨＴＬペプチド組成物の有効性を確認するため
に、ワクチン組成物の評価を行う。本治験の主要な目的は、癌患者においてＣＴ
Ｌを誘導するために有効な用量およびレジメンを決定すること、これらの患者に
おけるＣＴＬおよびＨＴＬ応答誘導の安全性を確立すること、およびどの程度の
ＣＴＬ活性化が、腫瘍細胞数の減少により明らかとなるように、癌患者の臨床状
態を向上させるのかを調べることである。例えば次のように、そのような治験を
設計する。
【０３９６】 複数の施設で本試験を行う。本治験設計は、単回用量としてペプチド組成物を
投与し、６週間後に同じ用量で単回追加免疫を行う、非盲検の非対照用量漸増プ
ロトコール（ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ，ｕｎｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｄｏｓｅ ｅ
ｓｃａｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）である。投与量は、一回の注射あたり
５０、５００および５０００マイクログラムである。薬物関連副作用（重症度お
よび可逆性）を記録する。
【０３９７】 患者を３群に分ける。第一群に、５０μｇのペプチド組成物を注射し、第二群
、第三群に、それぞれ、５００および５０００μｇのペプチド組成物を注射する
。それぞれの群の患者は、男性であり、典型的に５０歳より上であり、そして人
種背景を示す。
【０３９８】 （実施例２０：プライムブーストプロトコールを用いたＣＴＬ応答の誘導） その基礎をなす原理において、実施例１２で記述したようなトランスジェニッ
クマウスでのＤＮＡワクチン有効性を評価するために使用するプロトコールと同
様のプライムブーストプロトコールを、ヒトへのワクチン投与に対しても使用し
得る。このようなワクチンレジメンには、例えば裸のＤＮＡを用いた初回投与と
、それに続く本ワクチンをコードする組換えウイルス、またはアジュバント中で
投与される組換えタンパク質／ポリペプチドもしくはペプチド混合物を用いた追
加免疫が含まれ得る。
【０３９９】 例えば、裸の核酸を複数部位に０．５〜５ｍｇの量をＩＭ（またはＳＣもしく
はＩＤ）投与する形態で、実施例１１に従って構築されるような発現ベクターを
用いて初回免疫を行い得る。その核酸（０．１から１０００μｇ）はまた、遺伝
子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）を用いて投与することも可能である。３−４週間のイ
ンキュベーション期間後、追加免疫投与を行う。追加免疫は、組換え鶏痘ウイル
スを５×１０７から５×１０９ｐｆｕの用量で投与するものであり得る。ＭＶＡ
、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスなどの、他
の組換えウイルスもまた、追加免疫に使用してもよいし、ポリエピトープ性のタ
ンパク質またはペプチド混合物を投与してもよい。ワクチンの有効性を評価する
ために、患者血液試料を、免疫前ならびに初回ワクチン投与後および追加免疫用
量のワクチン投与後に一定間隔で採取する。新鮮なヘパリン処理血液から、Ｆｉ
ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により末梢血単核細胞を単離し、凍
結保存用培地中にアリコートに分け、凍結保存する。試料をＣＴＬおよびＨＴＬ
活性に関してアッセイする。
【０４００】 その結果の解析から、癌に対する防御免疫を達成するに十分な応答の大きさが
生じることが示される。
【０４０１】 （実施例２１：樹状細胞を用いたワクチン組成物の投与） 抗原提示細胞（ＡＰＣ）または樹状細胞（ＤＣ）などの「専門の（ｐｒｏｆｅ
ｓｓｉｏｎａｌ）」ＡＰＣを用いて本発明のペプチドエピトープを含むワクチン
を投与し得る。この実施例において、インビボでのＣＴＬ応答を刺激するために
ペプチドでパルスしたＤＣを患者に投与する。この方法において、樹状細胞を単
離し、増大させ、本発明のペプチドＣＴＬおよびＨＴＬエピトープを含むワクチ
ンでパルスする。インビボでＣＴＬおよびＨＴＬ応答を誘発するように、樹状細
胞を、患者に注入して戻す。そして、誘導したＣＴＬおよびＨＴＬは、ワクチン
中のエピトープが由来するタンパク質を持つ特異的標的腫瘍細胞を破壊（ＣＴＬ
）、または破壊を促進（ＨＴＬ）する。
【０４０２】 例えば、エピトープを持つペプチドのカクテルを、エキソビボで患者血液由来
のＰＢＭＣに投与するか、または患者から単離したＤＣに投与する。ＤＣの回収
を促進する薬剤、例えばＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ
，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４のような薬剤を使用
し得る。ＤＣをペプチドでパルスした後、および患者に再注入する前に、非結合
ペプチドを除去するためにＤＣを洗浄する。
【０４０３】 臨床的に認識されるように、および臨床成果を基礎にした技術の一つにより容
易に決定されるように、患者に再注入する樹状細胞数は様々であり得る（例えば
、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４：３２８，１９９８；Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：
５２，１９９６およびＰｒｏｓｔａｔｅ ３２：２７２，１９９７を参照するこ
と）。典型的には、患者一人当たり２〜５０×１０６の樹状細胞を投与するが、
１０７または１０８のようなさらに多くの樹状細胞をも与えられ得る。そのよう
な細胞集団は、典型的に、５０〜９０％の樹状細胞を含む。
【０４０４】 いくつかの実施形態において、ペプチドを負荷したＰＢＭＣを、ＤＣを精製せ
ずに患者に注入する。例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｅｔｉｎＴＭのような薬剤で
処理した後に生じたＤＣを含むＰＢＭＣを、ＤＣを精製せずに患者に注射する。
投与するＰＢＭＣの総数は、多くの場合、１０８から１０１０の範囲である。一
般的に、患者に注射する細胞用量は、例えば特異的抗ＤＣ抗体を用いた免疫蛍光
解析により測定されるような、それぞれの患者の血液中のＤＣのパーセンテージ
に基づく。従って、例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭによって所定の
患者の末梢血液中で２％のＤＣが動員され、その患者が５Ｘ１０６個の細胞を受
容する場合、その患者はペプチドを負荷した２．５×１０８個のＰＢＭＣを注射
される。ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭなどの薬剤により動員されたＤＣの
パーセントは、典型的に、２−１０％の間と見積もられるが、当業者によって認
識されるように様々であり得る。
【０４０５】 免疫応答を刺激するＤＣの能力をインビトロおよびインビボの両方で免疫機能
アッセイを評価した。これらのアッセイは、ＣＴＬハイブリドーマおよびＣＴＬ
細胞株の刺激、ならびにＣＴＬのインビボ活性化を含む。
【０４０６】 （ＤＣ精製） ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで固定化された細胞を、Ｐｒｏｇｅｎｉｐ
ｏｉｅｔｉｎＴＭで処置されたＣ５７Ｂ１／６マウスの末梢血（ＰＢ）および脾
臓から精製し、抗原を提示し、そして細胞性免疫応答を導き出す能力を評価した
。簡単には、ＤＣを総ＷＢＣおよび脾臓から陽性選択ストラテジー（ＣＤ１１ｃ
特異的抗体でコーティングされた磁気性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅ
ｃ、Ａｕｂｕｒｎ ＣＡ）を使用する）を使用して精製した。比較として、エキ
ソビボで拡張されたＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の標準的カクテル（Ｒ
＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて未処置のＣ５
７Ｂ１／６マウス由来の骨髄細胞を７〜８日の期間、培養することによって生成
した（Ｍａｙｏｒｄｏｍｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：１２９７−１３０２
（１９９５））。最近の研究は、このエキソビボで拡張されたＤＣ集団が、有効
な抗原提示細胞を含み、抗腫瘍免疫応答を刺激する能力を有することが明らかに
されている（Ｃｅｌｌｕｚｚｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．８３：２８３−２８７
（１９９６））。
【０４０７】 ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで誘導されたＤＣ（１００μｇ/日、１０
日、ＳＣ）およびＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４エキソビボ拡張された細胞の精製
を、フローサイトメトリーによって決定した。ＤＣ集団を、ＣＤ１１ｃおよびＭ
ＨＣクラスＩＩ分子の両方を発現する細胞として定義した。磁気性ＣＤ１１ｃマ
クロビーズからのＤＣの精製に続いて、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで処
置されたマウスから単離した２重陽性のＰＢで誘導されたＤＣのパーセンテージ
を、約４％から４８〜５７％の範囲に高めた（平均収量＝４．５×１０６ＤＣ／
動物）。ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで処置されたマウスから単離した精
製された脾性ＤＣのパーセンテージを、１２〜１７％の範囲から６７〜７７％の
範囲に高めた。ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４エキソビボ拡張された細胞の精製は、３
１〜４１％の範囲であった（Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１：
３２０４０（１９９８））。
【０４０８】 （ＣＴＬハイブリドーマおよびＣＴＬ細胞のインビトロ刺激：特異的ＣＴｌエ
ピロープの提示） ＣＴＬ細胞株をＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで生成されたＤＣの能力を
、ウイルス由来エピトープおよび対応するエピトープ応答性ＣＴｌ細胞株を使用
してインビトロで明らかにした。ヒトＨＬＡ−Ａ２．１を発現するトランスジェ
ニックマウスを、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで処置した。これらのマウ
スから単離された脾性ＤＣを、ペプチドエピトープ（Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ
Ｐｏｌ ４５５）由来）でパルス化し、そして次いでＩＦＮγを産生すること
によってＨＢＶ Ｐｏｌ ４５５エピトープ／ＨＬＡ−Ａ２．１複合体に応答す
るＣＴＬ細胞株を用いてインキュベートした。ＨＢＶ Ｐｏｌ ４５５エピトー
プを提示するＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで誘導された脾性ＤＣの能力は
、２つの陽性コントロール集団（ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４拡張ＤＣ培養物、
または精製脾性Ｂ細胞）の能力よりも大きかった。Ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉ
ｎＴＭで誘導された脾性細胞対他の抗原提示細胞についての応答曲線における左
のシフトは、これらのＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで誘導された細胞が、
応答細胞株によって放出される最大ＩＦＮγを刺激するためにより少ないエピト
ープ必要とすることを示した。
【０４０９】 インビボにおけるＣＴＬ応答を刺激するエキソビボでペプチドパルス化された
ＤＣの能力をまた、ＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスモデルを使用し
て評価した。ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで処置された動物由来のＤＣま
たはＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で拡張した後の骨髄細胞由来のコントロールＤ
Ｃを、エキソビボでＨＢＶ Ｐｏｌ ４５５を用いてパルス化し、洗浄し、そし
てこのようなマウスへ注射した（ＩＶ）。免疫化の７日経過後、脾臓を除去し、
ＤＣおよびＣＴＬを含む脾臓細胞を、ＨＢＶ Ｐｏｌ ４５５ペプチドの存在下
でインビトロで２回再刺激した。再刺激された脾臓細胞培養物３つの独立した培
養物のＣＴＬ活性を、ペプチドで、または、なしにパルス化した５１Ｃｒ標識し
た標的細胞を溶解するＣＴＬの能力を測定することによって評価した。強力なＣ
ＴＬ応答を、エピトープパルス化されたＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで誘
導されたＤＣならびにエピトープパルス化されたＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４ ＤＣ
で免疫化した動物において生成した。対照的に、擬パルス化したＰｒｏｇｅｎｉ
ｐｏｉｅｔｉｎＴＭで産生されたＤＣ（ペプチドなし）で免疫化された動物は、
ＣＴＬ誘導の証拠を示さなかった。
【０４１０】 これらのデータは、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで処置されたマウス由
来のＤＣを、エキソビボでエピトープを用いてパルス化し、そしてインビボにお
ける特異的ＣＴＬ応答を誘導するために使用し得ることを確認する。
【０４１１】 マウスにおけるインビボ薬理学的研究は、動物へのパルス化された自己ＤＣの
再注入の明らかな毒性はないことを明らかにしている。
【０４１２】 （エキソビボでのＣＴＬ／ＨＴＬ応答活性化） あるいは、組織培養中で、患者の、または遺伝学的に適合性のＣＴＬまたはＨ
ＴＬ前駆細胞を、樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）源および適切な免疫原
性ペプチドとともにインキュベーションすることによって、特定の腫瘍関連抗原
に対するｅｘ ｖｉｖｏでのＣＴＬまたはＨＴＬ応答を誘導し得る。前駆細胞が
活性化されエフェクター細胞へと発達するような適切なインキュベーション時間
後（典型的には７−２８日）、その細胞を患者に注入して戻す。そこで、戻され
た細胞はそれらの特異的標的細胞、つまり腫瘍細胞を破壊（ＣＴＬ）または破壊
を促進（ＨＴＬ）する。
【０４１３】 （実施例２２：モチーフを持つペプチドの代替的同定法） モチーフを持つペプチドを同定する別の方法は、規定されたＭＨＣ分子を持つ
細胞からそれらを抽出することである。例えば、組織型決定に使用するＥＢＶ形
質転換Ｂ細胞株は、それがどのＨＬＡ分子を発現しているのかを決定するために
徹底的に特徴付けられた。ある場合では、これらの細胞はただ一つのタイプのＨ
ＬＡ分子のみを発現する。これらの細胞を病原性生物に感染させてもよいし、こ
れらの細胞に目的の腫瘍抗原を発現する核酸をトランスフェクトしてもよい。そ
の後、感染の結果として（またはトランスフェクションの結果として）産生され
たペプチドの内因性抗原プロセシングにより生じたペプチドが、細胞中でＨＬＡ
分子と結合し、細胞表面上に運ばれ提示される。
【０４１４】 次に、温和な酸性条件に曝露することにより、ペプチドをＨＬＡ分子から抽出
し、例えば、質量分析によって（例えば、Ｋｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
５２：３９１３，１９９４）そのアミノ酸配列を決定する。本明細書中で開示し
ているように特定のＨＬＡ分子を結合する大部分のペプチドがモチーフを持つも
のなので、これは、細胞上で発現されている特定のＨＬＡ分子と相関したモチー
フを持つペプチドを獲得するための代わりの様相である。
【０４１５】 あるいは、内因性ＨＬＡ分子を全く発現していない細胞株に、１つのＨＬＡ対
立遺伝子をコードする発現構築物をトランスフェクションし得る。そこでこれら
の細胞を記述するように使用し得る、つまり、細胞表面上に提示されている病原
体または目的の抗原に相当するペプチドを単離するために、これらの細胞に病原
性生物を感染させてもよいし、目的の抗原をコードする核酸をトランスフェクシ
ョンしてもよい。そのような分析から得たペプチドは、細胞で発現される一つの
ＨＬＡ対立遺伝子との結合に対応するモチーフを持つ。
【０４１６】 当業者により認識されるように、１を超えるＨＬＡ対立遺伝子を持つ細胞にお
いて同様の分析を行い、続いて、発現しているそれぞれのＨＬＡ対立遺伝子に特
異的なペプチドを決定し得る。さらに、当業者はまた、細胞に対して抗原源を与
えるために、タンパク質抗原での負荷のような、感染またはトランスフェクショ
ン以外の手段を使用し得るということも認識する。
【０４１７】 本発明を説明するために上記の実施例を提供するが、これはその範囲を限定す
るものではない。例えば、主要組織適合遺伝子複合体についてのヒトの用語、す
なわちＨＬＡを、この書類全体を通して使用する。これらの原理を他の種に同じ
ように拡大し得ることが認識される。従って、本発明の他の改変が、当業者に対
して容易に明らかであり、添付の特許請求の範囲により包含される。本明細書で
引用する全ての刊行物、特許および特許出願は全ての目的に対して参考として本
明細書により援用される。
【０４１８】
【表１】
【０４１９】
【表２】
【０４２０】
【表３】
【０４２１】
【表４】
【０４２２】
【表５】
【０４２３】
【表６】
【０４２４】
【表７】
【０４２５】
【表８】
【０４２６】
【表９】
【０４２７】
【表１０】
【０４２８】
【表１１】
【０４２９】
【表１２】
【０４３０】
【表１３】
【０４３１】
【表１４】
【０４３２】
【表１５】
【０４３３】
【表１６】
【０４３４】
【表１７】
【０４３５】
【表１８】
【０４３６】
【表１９】
【０４３７】
【表２０】
【０４３８】
【表２１】
【０４３９】
【表２２】
【０４４０】
【表２３】
【０４４１】
【表２４】
【０４４２】
【表２５】
【手続補正書】
【提出日】平成１４年７月３１日（２００２．７．３１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 （Ｉ．発明の背景） 増加中の証拠群が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が腫瘍細胞に対する免疫
応答において重要であることを示唆する。ＣＴＬは、ほとんどすべての有核細胞
の表面上で発現されるＨＬＡクラスＩ分子の状況でペプチドエピトープを認識す
る。内因的に合成された腫瘍抗原の細胞内プロセシング後、抗原由来ペプチドエ
ピトープが、小胞体においてクラスＩ ＨＬＡ分子に結合し、次いで、生じた複
合体が、細胞表面に輸送される。ＣＴＬは、このペプチド−ＨＬＡクラスＩ複合
体を認識し、次いでこのことは、このＨＬＡ−ペプチド複合体を保有する細胞の
、直接的なこのＣＴＬによる破壊、および／または非破壊的機構の活性化（例え
ば、免疫応答を増強しそして腫瘍細胞の破壊を促進するリンホカイン（例えば、
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）またはインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の活
性化）を介する破壊を生じる。
【０００２】 腫瘍特異的ヘルパーＴリンパ球ＨＴＬもまた、有効な抗腫瘍免疫を維持するた
めに重要であることが公知である。抗腫瘍免疫におけるその役割が、これらの細
胞がＣＴＬおよび抗体応答の誘導の補助を提供するだけでなく、エフェクター機
能も提供するように作用する動物モデルにおいて示されており、これは、直接の
細胞接触により媒介され、そしてリンホカイン（例えば、ＩＦＮγおよびＴＮＦ
−α）の選択によっても媒介される。
【０００３】 有効な腫瘍ワクチンの開発における基本的難題は、生じ得る免疫抑制または免
疫寛容である。従って、進行を妨げそして／または腫瘍を除去するに十分な範囲
および強さの免疫応答を惹起するワクチン実施形態を確立する必要が存在する。
【０００４】 本発明者らが記載しているようなエピトープアプローチは、それが、１つ以上
の標的腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の別個の領域からの種々のＣＴＬエピトープ、Ｈ
ＴＬエピトープ、および抗体（必要な場合）エピトープを単一のワクチン組成物
に組み込み可能にするという点で、この難題に対する解決を示す。このような組
成物は、複数のドミナント（ｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープおよびサブドミナン
トエピトープを同時に標的とし得、それにより種々の集団における有効な免疫を
達成するために使用され得る。
【０００５】 前立腺癌は、男性において最も一般的な悪性疾患である。今の治療（すなわち
、男性ホルモン遮断、抗男性ホルモン撤退、および他の二次的なホルモン治療と
組み合わせられる化学療法）は、限定的な成功を受けている。従って、より効能
のある治療を開発することが必要である。本発明の多エピトープの免疫治療ワク
チン組成物は、この必要性を満たす。
【０００６】 前立腺癌に関連する抗原として、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的
膜抗原（ＰＳＭ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、およびヒトカリクレ
イン２（ｈＫ２またはＨｕＫ２）が挙げられるが、これに限定されない。これら
の抗原は、本発明のポリエピトープワクチン組成物に対して重要な抗原標的を示
す。
【０００７】 ＰＳＭはまた、前立腺癌治療に対して重要な候補である。これは、前立腺腺癌
において高レベルで発現される２型膜タンパク質である。発現のレベルは、転移
およびホルモン治療に対して難治性である癌において増加する。ＰＳＭは、一般
的に正常な組織上で存在しないが、結腸陰窩および十二指腸において低いレベル
が検出されており、そしてＰＳＭは、正常な雄性血清および精液において検出さ
れ得る（例えば、Ｓｉｌｖｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３：８１
−８５，１９９７を参照のこと）。ＰＳＭに対するＣＴＬ応答はまた、文書で説
明されている（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ２９：３７１−３８
０，１９９６；およびＳａｌｇａｌｌｅｒら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３５：１４４
−１５１，１９９８を参照のこと）。
【０００８】 ＰＡＰは、前立腺における細胞によって専ら分泌される組織特異的な分化抗原
である（例えば、Ｌａｍら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ １５：１３−２１，１９８９を
参照のこと）。ＰＡＰは、血清において検出され得、レベルは、前立腺癌を有す
る患者において増加する（例えば、Ｊａｃｏｂｓら、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂｌ．Ｃ
ａｎｃｅｒ １５：２９９−３６０，１９９１を参照のこと）。ＰＡＰタンパク
質配列は、タンパク質中の至る所に分布される相同性領域を有する他の酸性ホス
ファターゼと最高で４９％の配列相同性を有する。従って、ＰＡＰ特異的エピト
ープは、同定され得、そしていくつかの異なるＣＴＬエピトープが記載されてい
る（例えば、Ｐｅｓｈｗａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３６：１２９−１３８，１９
９８を参照のこと）。
【０００９】 ｈＫ２タンパク質は、ポリペプチドの翻訳後プロセシングに関与する機能的な
セリンプロテアーゼである。ｈＫ２タンパク質は、前立腺上皮の側で専ら発現さ
れ、そして良性前立腺癌組織および悪性前立腺癌組織の両方において見出される
。正常な前立腺細胞の５０％において発現されるが、ｈＫ２を発現する細胞のパ
ーセンテージは、腺癌および前立腺上皮内の新形成（ＰＩＮ）において増加する
（例えば、Ｄａｒｓｏｎら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ４９：８５７−８６２，１９９７
を参照のこと）。前立腺ガン細胞上のこの抗原の好ましい発現に基づいて、ｈＫ
２はまた、免疫治療について重要な標的である。
【００１０】 前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）（ｈＫ３ともいわれる）は、分泌されるセリンプ
ロテアーゼおよびタンパク質のカリクレインファミリーのメンバーである。ＰＳ
Ａ遺伝子は、ｈＫ２遺伝子と８０％の相同性であるが、ｈＫ２の組織発現は、Ｐ
ＳＡと独立して調節される（例えば、Ｄａｒｓｏｎら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ４９：
８５７−８６２，１９９７を参照のこと）。ＰＳＡの発現は、前立腺上皮細胞（
良性および悪性の両方）に対して制限される。この抗原は、ほとんどの前立腺癌
患者の血清および精液血漿において検出され得る。ＰＳＡ由来のいくつかのＴ細
胞エピトープは、同定されており、そして免疫原性であることが見出されており
、そして抗体応答は、患者において報告されている（例えば、Ｃｏｒｒｅａｌｅ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３１８６，１９９８；およびＡｌｅｘａｎｄ
ｅｒら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ５１：１５０−１５７，１９９８を参照のこと）。従
って、この前立腺制限発現および免疫応答を刺激する能力に基づいて、ＰＳＡは
、前立腺癌の免疫治療に対する誘引標的である。
【００１１】 この節において提供される情報は、本出願の出願日時点で現在理解されている
技術水準を開示することが意図される。本出願の優先日後に得られた情報は、こ
の節に含まれる。従って、この節の情報は、いかようにも、本発明の優先日で線
引きすることが意図されない。
【００１２】 （ＩＩ．発明の要旨） 本発明は、例えば、ＴＡＡに対するエピトープベースワクチンを開発するため
に、抗原がＴ細胞によって認識される機構についての本発明者らの知識を適用す
る。より詳細には、本願は、診断的および／または薬学的組成物における含有物
のためのエピトープならびに、免疫応答の評価および癌の処置および／または予
防に対するエピトープの使用方法を同定する。
【００１３】 このエピトープベースワクチンの使用は、特に、ワクチン組成物における抗原
全体の使用と比較した場合に、現在のワクチンを超えるいくつかの利点を有する
。例えば、抗原全体中に存在し得る免疫抑制エピトープが、エピトープベースワ
クチンの使用により回避され得る。このような免疫抑制エピトープは、例えば、
抗原全体におけるイムノドミナントエピトープに対応し得、これは、非ドミナン
ト領域からペプチドエピトープを選択することによって回避され得る（例えば、
Ｄｉｓｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３１５１〜３１５８、１９９６を
参照のこと）。
【００１４】 エピトープベースワクチンのアプローチのさらなる利点は、選択されたエピト
ープ（ＣＴＬおよびＨＴＬ）を組み合わせる能力であり、さらに（例えば、増強
された免疫原性を達成する）これらのエピトープの組成を改変する能力である。
従って、免疫応答は、標的疾患について適切なように調節され得る。この応答の
類似の操作は、従来のアプローチでは可能でない。
【００１５】 エピトープベース免疫刺激ワクチンの別の主な利点は、その安全性である。そ
れ自体の固有の生物学的活性を有し得る病原菌（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｇｅ
ｎｔ）またはタンパク質抗原全体によって引き起こされる、可能性のある病理学
的副作用は、排除される。
【００１６】 エピトープベースワクチンはまた、同じ病原体（「病原体」とは、病原菌また
は腫瘍関連分子であり得る）由来の複数の選択された抗原に対して免疫応答を指
向し焦点を合わせる能力を提供する。従って、特定の病原体に対する免疫応答に
おける患者間の変動性は、ワクチン組成物に、この病原体由来の複数の抗原由来
のエピトープを含めることによって軽減され得る。
【００１７】 さらに、エピトープベース抗腫瘍ワクチンはまた、複数の腫瘍関連分子に由来
するエピトープを組み合わせる機会を提供する。従って、この能力は、所定の腫
瘍型について広く標的とする抗腫瘍ワクチンを開発する場合に生じる腫瘍間の変
動性という問題に取り組み得、そしてまた、抗原損失に起因する腫瘍の逸脱の可
能性を減少し得る。例えば、ある患者中の前立腺癌細胞は、別の患者中の前立腺 癌細胞 と異なる標的ＴＡＡを発現し得る。複数のＴＡＡに由来するエピトープが
、両方の前立腺癌を標的とするポリエピトープワクチンに含まれ得る。
【００１８】 しかし、広く効果的なエピトープベース免疫療法剤の開発に対する最も困難な
障壁の１つは、ＨＬＡ分子の極度な多型性であった。今日まで、非遺伝学的偏向
がない有効な集団適用範囲は、かなり複雑な課題であり；このような適用範囲は
、各々個々のＨＬＡ対立遺伝子に対応するＨＬＡ分子に特異的なエピトープを使
用することを必要とした。従って、民族的に多様な集団をカバーするためには、
実行不可能に多くの数のエピトープを使用しなければならなかった。従って、エ
ピトープベースワクチンにおける使用のための、複数のＨＬＡ抗原分子が結合し
たペプチドエピトープの必要性が存在していた。結合するＨＬＡ抗原分子数が多
いほど、ワクチンによる集団の適用範囲の広さは大きくなる。
【００１９】 さらに、より詳細に本明細書中に記載されるように、ペプチド結合特性を（例
えば、複数のＨＬＡ抗原に結合し得るペプチドが、免疫応答を刺激する親和性で
複数のＨＬＡ抗原に結合するように）調節する必要性が存在していた。免疫原性
に相関する親和性で１つより多くＨＬＡ対立遺伝子によって拘束されるエピトー
プの同定が、十分な集団適用範囲を提供するため、そしてその集団の多様な部分
において感染を予防または排除するに十分に強力な応答の誘発を可能にするため
に、重要である。このような応答はまた、広範な多くのエピトープを標的し得る
。本明細書中に開示される技術は、このような好ましい免疫応答を提供する。
【００２０】 好ましい実施形態において、本発明のワクチン組成物に含むためのエピトープ
は、既知の抗原のタンパク質配列を、モチーフ保有エピトープまたはスーパーモ
チーフ保有エピトープの存在について評価するプロセスによって、選択される。
次いで、モチーフ保有エピトープまたはスーパーモチーフ保有エピトープに対応
するペプチドを合成し、そしてそれらのペプチドを、その選択されたモチーフを
認識するＨＬＡ分子に結合する能力について試験する。中程度の親和性または高
い親和性（すなわち、ＨＬＡクラスＩ分子ついては、ＩＣ５０（またはＫＤ値） 約 ５００ｎＭ以下、またはＨＬＡクラスＩＩ分子については、ＩＣ５０ 約１００
０ｎＭ以下で結合するこれらのペプチドを、ＣＴＬ応答またはＨＴＬ応答を誘導
するそれらの能力についてさらに評価する。免疫原性ペプチドエピトープを、ワ
クチン組成物に含むために選択する。
【００２１】 スーパーモチーフ保有ペプチドを、ＨＬＡスーパータイプファミリー内の複数
の対立遺伝子に結合する能力について、さらに試験し得る。さらに、ペプチドエ
ピトープを、ＨＬＡスーパータイプ内の複数の対立遺伝子に対する結合親和性お
よび／またはこれら複数の対立遺伝子に結合する能力を改変するために、アナロ
グ化し得る。
【００２２】 本発明はまた、既知のＨＬＡ型を有する患者において、ＴＡＡに対する免疫応
答をモニターまたは評価するための方法を含む、実施形態を包含する。このよう
な方法は、患者由来のＴリンパ球サンプルを、ＴＡＡエピトープを含むペプチド
組成物と共にインキュベートする工程、および、このペプチドに結合するＴリン
パ球の存在について検出する工程を包含し、このＴＡＡエピトープは、スーパー
モチーフまたはモチーフを含み、そしてその患者に存在する少なくとも１つのＨ
ＬＡ対立遺伝子の産物を結合するアミノ酸配列を有する。ＣＴＬペプチドエピト
ープは、例えば、この型の分析のためのテトラマー複合体の成分として使用され
得る。
【００２３】 本発明に従うペプチドエピトープを規定するための代替的様式は、特定の対立
遺伝子特異的ＨＬＡ分子または対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子のグループへの結合
に相関される、物理的特性（例えば、長さ；一次構造；または電荷）を記載する
ことである。ペプチドエピトープを規定するためのさらなる様式は、ＨＬＡ結合
ポケットの物理的特性またはいくつかの対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合ポケットに
共有される特性（例えば、ポケットの形状および電荷分布）を記載すること、お
よびこのペプチドエピトープがポケット（単数または複数）に適合しそして結合
することを記載することである。
【００２４】 以下の議論から明らかなように、他の方法および実施形態もまた意図される。
さらに、本明細書中の方法のいずれかによって生成された新規合成ペプチドもま
た、本発明の一部である。
【００２５】 （ＩＩＩ．図面の簡単な説明） 適用されず。
【００２６】 （ＩＶ．発明の詳細な説明） 本発明のペプチドエピトープおよび対応する核酸組成物は、ＣＴＬ応答または
ＨＴＬ応答の生成を刺激することによって、ＴＡＡに対する免疫応答を刺激する
ために有用である。これらのペプチドエピトープは、ネイティブＴＡＡタンパク
質アミノ酸配列に直接的または間接的に由来し、ＨＬＡ分子に結合し得そしてＴ
ＡＡに対する免疫応答を刺激し得る。分析されるＴＡＡタンパク質の完全配列は
、Ｇｅｎｂａｎｋより入手され得る。以下に提供する開示から明らかなように、
ペプチドエピトープおよびそのアナログはまた、配列情報から容易に決定され得
、配列情報は、今後、以前に未知であった特定のＴＡＡの改変体について発見さ
れるかもしれない。
【００２７】 標的ＴＡＡの一覧としては、以下の抗原が挙げられるが、これらに限定されな
い：ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ−１１、ＭＡＧＥ−Ａ１０
、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＬＡＧＥ−１、ＣＡＧ−３
、ＤＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ１８、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＵＭ−１、
ＣＤＫ４、ＢＲＣＡ２、ＮＹ−ＬＵ−１、ＮＹ−ＬＵ−７、ＮＹ−ＬＵ−１２、
ＣＡＳＰ８、ＲＡＳ、ＫＩＡＡ−２−５、ＳＣＣ、ｐ５３、ｐ７３、ＣＥＡ、Ｈ
ｅｒ２／ｎｅｕ、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ２、ｇｐ
７５／ＴＲＰ１、カリクレイン、ＰＳＭ、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＴ１−１、Ｂ−カ
テニン、ＰＲＡＭＥ、テロメラーゼ、ＦＡＫ、サイクリンＤ１タンパク質、ＮＯ
ＥＹ２、ＥＧＦ−Ｒ、ＳＡＲＴ−１、ＣＡＰＢ、ＨＰＶＥ７、ｐ１５、葉酸レセ
プターＣＤＣ２７、ＰＡＧＥ−１およびＰＡＧＥ−４。これらの抗原由来のエピ
トープは、特異的な腫瘍型（例えば、前立腺腫瘍）を標的とする、または腫瘍の
複数の型を標的とする１つの別のものと組み合わせて使用され得る、 本発明のペプチドエピトープは、以下で議論されるように、多くの方法で同定
された。特定のアミノ酸残基を改変して、変化した免疫原性を示すペプチドアナ
ログを作製することによって、アナログペプチドを誘導し、そしてＨＬＡ分子の
結合活性が調節されることもまた、より詳細に議論する。さらに、本発明は、種
々の対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子と相互作用し得るエピトープベ
ースワクチンに、先行技術のワクチンよりも広い集団適用範囲を提供させ得る、
組成物および組成物の組み合わせを提供する。
【００２８】 （ＩＶ．Ａ．定義） 本発明は、アルファベット順に列挙した、以下の定義を参照してより良好に理
解され得る。
【００２９】 本明細書中で使用される場合、「構築物」は、一般に、天然に存在しない組成
物を示す。構築物は、核酸またはアミノ酸についての合成技術（例えば、組換え
ＤＮＡの調製および発現または化学合成技術）によって、生成され得る。構築物
はまた、結果としてその形態が天然において見い出されないように、ある材料へ
の別の材料の付加または添加（ａｆｆｉｌｉａｔｉｏｎ）によって生成され得る
。
【００３０】 「コンピューター」または「コンピューターシステム」は、一般に、以下を備
える：プロセッサー；少なくとも１つの情報記憶／検索装置（例えば、ハードド
ライブ、ディスクドライブまたはテープドライブなど）；少なくとも１つの入力
装置（例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーン、またはマイクロホンな
ど）；およびディスプレイ構造。さらに、コンピューターは、ネットワークと連
絡する通信チャネルを備え得る。このようなコンピューターは、多かれ少なかれ
、上記に列挙したものを備え得る。
【００３１】 「交差反応性結合」とは、１より多いＨＬＡ分子がペプチドに結合することを
示し；同義語は、縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）結合である。
【００３２】 「潜在（ｃｒｉｐｔｉｃ）エピトープ」は、単離されたペプチドでの免疫によ
って応答を誘導するが、そのエピトープを含むインタクトなタンパク質全体が抗
原として使用される場合に、その応答は、インビトロで交差反応性でない。
【００３３】 「ドミナント（ｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープ」は、ネイティブ抗原全体での
免疫に際して免疫応答を誘導するエピトープである（例えば、Ｓｅｒｃａｒｚら
、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：７２９−７６６，１９９３を参照
のこと）。このような応答は、単離されたペプチドエピトープとは、インビトロ
で交差反応性である。
【００３４】 特定のアミノ酸配列に関して、「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによ
る認識に関与するアミノ酸残基のセットであるか、またはＴ細胞の状況下では、
Ｔ細胞レセプタータンパク質および／または主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ
）レセプターによる認識に必要な残基である。インビボまたはインビトロでの免
疫系の設定において、エピトープは、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたは
ＨＬＡ分子によって認識される部位を共に形成する、分子の集団的特徴（例えば
、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造および三次ペプチド構造および電荷のよ
うな）である。本開示全体を通して、エピトープおよびペプチドは、しばしば、
交換可能に使用される。
【００３５】 本発明のエピトープおよびさらなるアミノ酸を含むタンパク質またはペプチド
分子が、本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。特定の実施形態に
おいて、さもなければ本明細書で規定されるような構築物ではないとする、本発
明のペプチドの長さに関する制限が存在する。長さが制限される実施形態は、本
発明のエピトープを含むタンパク質／ペプチドがネイティブ配列と１００％同一
性を有する領域（すなわち、一連の連続するアミノ酸）を含む場合に、生じる。
例えば、天然分子全体に対する読み取り枠由来の具陳したエピトープの定義を回
避するために、ネイティブペプチド配列との１００％同一性を有する任意の領域
の長さが制限される。従って、本発明のエピトープおよびネイティブペプチド配
列との１００％同一性を有する領域を含む（そして、さもなければ構築物ではな
い）ペプチド配列について、ネイティブ配列に対する１００％同一性を有するそ
の領域は、一般に、６００アミノ酸以下、しばしば、５００アミノ酸以下、しば
しば、４００アミノ酸以下、しばしば、２５０アミノ酸以下、しばしば、１００
アミノ酸以下、しばしば、８５アミノ酸以下、しばしば、７５アミノ酸以下、し
ばしば、６５アミノ酸以下、そしてしばしば、５０アミノ酸以下の長さを有する
。特定の実施形態において、構築物ではない本発明の「エピトープ」は、ネイテ
ィブペプチド配列に対して１００％同一性を有する５１個未満のアミノ酸を、５ 個のアミノ酸までの 任意の変化量（５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４
、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２
、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０
、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７
、６、５）で含む領域を有するペプチドに含まれる。
【００３６】 ６００アミノ酸より長い特定のペプチドまたはタンパク質配列は、本発明の範
囲内である。このような長い配列は、それらが、ネイティブペプチド配列との１
００％同一性を有する６００アミノ酸よりも大きい任意の連続配列を含まない限
り、または、６００アミノ酸より長い場合には、それらが構築物である限り、本
発明の範囲内にある。ネイティブ配列に対応する５以下連続する残基を有する任
意のペプチドについては、本発明の範囲内にあるための、そのペプチドの最大長
さに対する制限は存在しない。本発明のＣＴＬエピトープは、８アミノ酸残基ま での任意の変化量の ６００未満の残基長であることが、現在では好ましい。
【００３７】 「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」は、ヒトクラスＩまたはクラスＩＩの主
要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質（例えば、Ｓｔｉｔｅｓら、Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８版、Ｌａｎｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｓ Ａｌ
ｔｏｓ，ＣＡ（１９９４）を参照のこと）である。
【００３８】 本明細書中で使用される場合、「ＨＬＡスーパータイプまたはファミリー」と
は、共有するペプチド結合特異性に基づいてグループ化したＨＬＡ分子のセット
を記載する。特定のアミノ酸モチーフを保有するペプチドに対して幾分類似した
結合親和性を共有するＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡスーパータイプにグループ
化される。用語ＨＬＡスーパーファミリー、ＨＬＡスーパータイプファミリー、
ＨＬＡファミリーおよびＨＬＡ ｘｘ様分子（ここで、ｘｘは、特定のＨＬＡ型
を示す）は、同義である。
【００３９】 本開示全体を通して、結果を、「ＩＣ５０」で表す。ＩＣ５０は、参照ペプチ
ドの結合の５０％阻害が観察される、結合アッセイにおけるペプチドの濃度であ
る。アッセイを行う条件（すなわち、律速のＨＬＡタンパク質濃度および標識ペ
プチド濃度）を考慮すると、これらの値は、ＫＤ値と近似する。結合を測定する
ためのアッセイは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２０１２７およびＷＯ９４／
０３２０５に、詳細に記載される。ＩＣ５０値が、アッセイ条件が変化する場合
に、そして使用する特定の試薬（例えば、ＨＬＡ調製物など）に依存して、（し
ばしば、劇的に）変化し得ることに留意するべきである。例えば、過剰濃度のＨ
ＬＡ分子は、所定のリガンドの見かけ上測定されるＩＣ５０を増加させる。
【００４０】 あるいは、結合は、参照ペプチドと関連して表される。特定のアッセイが、よ
り高感度またはより低感度になるにつれて、試験するペプチドのＩＣ５０は、幾
分変化し得るが、参照ペプチドに対する結合は、有意には変化しない。例えば、
参照ペプチドのＩＣ５０が１０倍増加するような条件下で行うアッセイにおいて
、試験ペプチドのＩＣ５０値もまた、約１０倍シフトする。従って、あいまい性
を回避するために、ペプチドが良好な結合因子であるか、中程度の結合因子であ
るか、弱い結合因子であるかまたはネガティブな結合因子であるかの評価は、一
般に、標準ペプチドのＩＣ５０ に対する、そのＩＣ５０に基づく。
【００４１】 結合はまた、以下を使用するアッセイ系を含む、他のアッセイ系を使用して測
定され得る：生細胞（例えば、Ｃｅｐｐｅｌｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９
：３９２，１９８９；Ｃｈｒｉｓｔｎｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６７、
１９９１；Ｂｕｓｃｈら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４３、１９９９０；
Ｈｉｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１８９、１９９１；ｄｅｌ Ｇｕｅ
ｒｃｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５，１９９５）、界面活性剤溶
解物を使用する無細胞系（例えば、Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．２１：２０６９，１９９１）、固定した精製ＭＨＣ（例えば、Ｈｉｌｌら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２８９０，１９９４；Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１５２：４９４６，１９９４）、ＥＬＩＳＡ系（例えば、Ｒｅａ
ｙら、ＥＭＢＯ Ｊ．１１：２８２９，１９９２）、表面プラズモン共鳴（例え
ば、Ｋｈｉｌｋｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５４２５，１９９３
）；高フラックス可溶相アッセイ（ｈｉｇｈ ｆｌｕｘ ｓｏｌｕｂｌｅｐｈａ
ｓｅ ａｓｓａｙ）（Ｈａｍｍｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３５３
，１９９４）、およびクラスＩ ＭＨＣの安定化またはアセンブリの測定（例え
ば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４７６、１９９０；Ｓｃｈ
ｕｍａｃｈｅｒら、Ｃｅｌｌ ６２：５６３、１９９０；Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、
Ｃｅｌｌ ６２：２８５、１９９０；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
４９；１８９６，１９９２）。
【００４２】 本明細書中で使用される場合、ＨＬＡクラスＩ分子に関する「高親和性」とは
、５０ｎＭ以下のＩＣ５０またはＫＤ値での結合として定義され；「中程度の親
和性」とは、約５０ｎＭと約５００ｎＭとの間のＩＣ５０またはＫＤ値での結合
である。ＨＬＡクラスＩＩ分子への結合に関する「高親和性」とは、１００ｎＭ
以下のＩＣ５０またはＫＤ値での結合として定義され；「中程度の親和性」とは
、約１００ｎＭと約１０００ｎＭとの間のＩＣ５０またはＫＤ値での結合である
。
【００４３】 ２以上のペプチド配列の状況下で、用語「同一」またはパーセント「同一性」
とは、配列比較アルゴリズムを使用してかまたは手動の整列化および目視検査に
よって測定されるように、比較ウインドウにわたる最大一致について比較および
整列化した場合に、同じであるかまたは特定のパーセンテージの同一アミノ酸残
基を有する、２以上の配列または部分配列をいう。
【００４４】 「免疫原性ペプチド」または「ペプチドエピトープ」とは、そのペプチドがＨ
ＬＡ分子を結合しそしてＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答を誘導するような
、対立遺伝子特異的モチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドである。従
って、本発明の免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ分子に結合し得、そしてその
後、免疫原性ペプチドが由来する抗原に対する、ＨＬＡ拘束細胞傷害性Ｔ細胞応
答またはヘルパーＴ細胞応答を誘導し得る。
【００４５】 句「単離された」または「生物学的に純粋」とは、そのネイティブ状態におい
て見い出される場合に通常その物質に付随する成分を、実質的または本質的に含
まない物質をいう。従って、本発明に従う単離されたペプチドは、好ましくは、
そのインサイチュ環境下でそのペプチドに通常会合する物質を含まない。
【００４６】 「連結」または「結合」とは、ペプチドを機能的に接続するための当該分野で
公知の任意の方法をいい、これらには、組換え融合、共有結合、ジスルフィド結
合、イオン結合、水素結合、および静電結合が挙げられるが、これらに限定され
ない。
【００４７】 「主要組織適合遺伝子複合体」または「ＭＨＣ」は、生理的免疫応答を担う細
胞性相互作用の制御において役割を担う遺伝子のクラスターである。ヒトにおい
て、ＭＨＣ複合体はまた、ＨＬＡ複合体として公知である。ＭＨＣ複合体および
ＨＬＡ複合体の詳細な説明については、Ｐａｕｌ、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ Ｉ
ＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第３版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１
９９３を参照のこと。
【００４８】 用語「モチーフ」は、規定された長さのペプチドにおける残基のパターンをい
う。クラスＩ ＨＬＡモチーフについて通常、約８〜約１３アミノ酸のペプチド およびしばしば８〜１０アミノ酸のペプチド、そしてクラスＩＩ ＨＬＡモチー
フについて約６〜約２５アミノ酸のペプチドであり、これは、特定のＨＬＡ分子
によって認識される。ペプチドモチーフは、代表的には、各々のヒトＨＬＡ対立
遺伝子によってコードされる各々のタンパク質について異なり、そして一次アン
カー残基および二次アンカー残基のパターンにおいて異なる。
【００４９】 「陰性な（ｎｅｇａｔｉｖｅ）結合残基」または「有害な（ｄｅｌｅｔｅｒｉ
ｏｕｓ）残基」は、ペプチドエピトープにおける特定の位置（代表的には一次ア
ンカー位置ではない）に存在する場合に、ペプチドの対応するＨＬＡ分子に対す
るペプチドの結合親和性の減少を生じさせるアミノ酸である。
【００５０】 「非ネイティブ」な配列または「構築物」は、天然には見出されない（すなわ
ち、「天然には存在しない」）配列をいう。このような配列としては、例えば、
脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅ）されるかさもなくば改変されたペプチド、およびネ
イティブなタンパク質配列中では連続しないエピトープを含むポリエピトープ性
（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）組成物が挙げられる。
【００５１】 用語「ペプチド」は、本明細書中において「オリゴペプチド」と相互変換可能
に使用され、（代表的には、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基
との間のペプチド結合によって）互いに連結される一連の残基（代表的にはＬ−
アミノ酸）を示す。本発明のＣＴＬ誘導ペプチドは、しばしば１３以下の残基長
であり、そして通常、約８残基と約１１残基との間（好ましくは９または１０残
基）からなる。ＨＴＬ誘導オリゴペプチドは、しばしば約５０残基長未満であり
、そして通常、約６残基と約３０残基との間からなり、より通常には、約１２残
基と２５残基との間、そしてしばしば約１５残基と２０残基との間からなる。
【００５２】 「薬学的に受容可能な」は、一般に、非毒性の、不活性な、および／または薬
理学的に適合性の組成物をいう。
【００５３】 「薬学的賦形剤」は、アジュバント、キャリア、ｐＨ調整剤、および緩衝剤の
ような物質、張度調整剤、湿潤剤、防腐剤などを含む。
【００５４】 「一次アンカー残基」は、免疫原性ペプチドとＨＬＡ分子との間の接触点を提
供することが理解されるペプチド配列に沿った特定位置におけるアミノ酸である
。規定された長さのペプチド内の１〜３個（通常は２個）の一次アンカー残基は
、一般に、免疫原性ペプチドについての「モチーフ」を規定する。これらの残基
は、結合溝（ｇｒｏｏｖｅ）自身の特定のポケットにおいて埋没するこれらの側
鎖を有する、ＨＬＡ分子のペプチド結合溝（ｇｒｏｏｖｅ）と密接に接触して適
合することが理解される。１つの実施形態において、例えば、一次アンカー残基
は、本発明に従って９残基ペプチドエピトープの位置２（アミノ末端位から）お
よびカルボキシル末端位に配置される。各々のモチーフおよびスーパーモチーフ
についての一次アンカー位置は、表１に示される。例えば、アナログペプチドは
、これらの一次アンカー位置における特定の残基の存在または非存在を変更する
ことによって作製され得る。このようなアナログを使用して、特定のモチーフま
たはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を調節する。
【００５５】 「乱雑な認識」は、種々のＨＬＡ分子の状況下において、別々のペプチドが同
一のＴ細胞クローンによって認識されることである。乱雑な認識または結合は、
交差反応性結合と同義である。
【００５６】 「防御免疫応答」または「治療的免疫応答」は、感染性因子または腫瘍抗原由
来の抗原に対するＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答をいい、これは、疾患の
症状または進行を予防するかまたは少なくとも部分的に抑制する。免疫応答はま
た、ヘルパーＴ細胞の刺激によって促進された抗体応答を含み得る。
【００５７】 用語「残基」は、アミド結合またはアミド結合模倣物によってオリゴペプチド
に組み込まれるアミノ酸またはアミノ酸模倣物をいう。
【００５８】 「二次アンカー残基」は、ペプチドにおける一次アンカー位置以外の位置での
、ペプチド結合に影響し得るアミノ酸である。二次アンカー残基は、結合したペ
プチドの中である位置でのアミノ酸の無秩序な分布によって期待されるより有意
に高い頻度で存在する。二次アンカー残基は、「二次アンカー位置」に存在する といわれる。二次アンカー残基は、高い親和性もしくは中程度の親和性で結合す
るペプチドの中でより高頻度で存在する残基、またはさもなくば高い親和性もし
くは中程度の親和性の結合と関連する残基として同定され得る。例えば、アナロ
グペプチドは、これらの二次アンカー位置における特定の残基の存在または非存
在を変更することによって作製され得る。このようなアナログを使用して、特定
のモチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を良好に調節す
る。
【００５９】 「サブドミナント（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープ」は、エピトープを
含む抗原全体での免疫に際して応答をほとんど引き起こさないかまたは全く引き
起こさないが、単離されたペプチドでの免疫によって応答が得られ得るエピトー
プであり、そして（潜在エピトープの場合とは異なり）この応答は、タンパク質
全体を使用してインビトロまたはインビボでの応答をリコール（ｒｅｃａｌｌ）
する場合に、検出される。
【００６０】 「スーパーモチーフ」は、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる
ＨＬＡ分子によって共有されるペプチド結合特異性である。好ましくは、スーパ
ーモチーフ保有ペプチドは、２つ以上のＨＬＡ分子によって高い親和性または中
程度の親和性（本明細書中に規定される）で認識される。
【００６１】 「合成ペプチド」は、化学合成または組換えＤＮＡ技術のような方法を使用し
て人工的に作製したペプチドをいう。
【００６２】 本明細書中で使用される場合、「ワクチン」は、本発明の１つ以上のペプチド
を含む組成物である。本発明に従うワクチンの実施形態（例えば、１つ以上のペ
プチドのカクテルによって；ポリエピトープ性のペプチドによって含まれる本発
明の１以上のエピトープ；または、このようなペプチドもしくはポリペプチドを
コードする核酸（例えば、ポリエピトープ性のペプチドをコードするミニジーン
（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）））が数多く存在する。「１つ以上のペプチド」は、１〜
１５０の単位整数全体のいずれか（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７
、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２
０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３
２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６
０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１
１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５もしくは１５０または
それより多く）の本発明のペプチドを含み得る。これらのペプチドまたはポリペ
プチドは、必要ならば、例えば、脂質化、標的化配列もしくは他の配列の付加に
よって改変され得る。本発明のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは、細胞傷害性Ｔリ
ンパ球およびヘルパーＴリンパ球の両方の活性化を促進するために、ＨＬＡクラ
スＩＩ結合ペプチドと混合され得るかまたは連結され得る。ワクチンはまた、ペ
プチドでパルス（ｐｕｌｓｅ）された抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含み
得る。
【００６３】 ペプチド化合物を記載するために使用される命名法は、慣用的な実践に従い、
ここで、アミノ基は各々のアミノ酸残基の左（Ｎ末端）そしてカルボキシル基は
右（Ｃ末端）に示される。アミノ酸残基位置がペプチドエピトープにおいて言及
される場合、これらは、アミノからカルボキシルの方向に番号付けられ、位置１ は、エピトープ、またはその一部分であり得るペプチドもしくはタンパク質のア ミノ末端に最も近い位置である。 本発明の選択された特定の実施形態を示す形式
において、特には示されないが、アミノ末端基およびカルボキシル末端基は、他 に 特定されない場合には、生理学的ｐＨ値でとる形態である。アミノ酸構造の形
式において、各残基は、一般に、標準的な３文字表記または１文字表記によって
示される。Ｌ−型のアミノ酸残基は、大文字の１文字または３文字記号の最初の
文字の大文字によって示され、そしてＤ−型を有するこれらのアミノ酸について
のＤ−型は、小文字の１文字または小文字の３文字記号によって示される。グリ
シンは、不斉炭素原子を有さず、そして単に「Ｇｌｙ」またはＧとしていわれる
。本明細書中で示されるペプチドのアミノ酸配列は、一般的に、標準的な１文字
記号を使用して示される（Ａ，アラニン；Ｃ，システイン；Ｄ，アスパラギン酸
；Ｅ，グルタミン酸；Ｆ，フェニルアラニン；Ｇ，グリシン；Ｈ，ヒスチジン；
Ｉ，イソロイシン；Ｋ，リジン；Ｌ，ロイシン；Ｍ，メチオニン；Ｎ，アスパラ
ギン；Ｐ，プロリン；Ｑ，グルタミン；Ｒ，アルギニン；Ｓ，セリン；Ｔ，トレ
オニン；Ｖ，バリン；Ｗ，トリプトファン；およびＹ，チロシン）。これらの記
号に加えて、本明細書中で使用される１文字略語「Ｂ」は、α−アミノ酪酸を示
す。
【００６４】 （ＩＶ．Ｂ．ＣＴＬ応答およびＨＴＬ応答の刺激） Ｔ細胞が抗原を認識するメカニズムは、過去１０年間に記述されている。免疫
系についての本発明者等の理解に基づいて、広範な集団におけるＴＡＡに対する
治療的または予防的な免疫応答を誘発し得る有効なペプチドエピトープワクチン
組成物を本発明者等は開発してきた。特許請求した組成物の価値および効力を理
解するために、免疫学関連技術についての簡単な概説を提供する。
【００６５】 ＨＬＡ分子とペプチド抗原との複合体は、ＨＬＡ拘束Ｔ細胞により認識される
リガンドとして作用する（Ｂｕｕｓ，Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ ４７：１０７１，１９
８６；Ｂａｂｂｉｔｔ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７：３５９，１９８５
；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ａ．ａｎｄ Ｂｏｄｍｅｒ，Ｈ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．７：６０１，１９８９；Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．，Ａｎｎｕ．
Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：４０３，１９９３）。単一アミノ酸置換抗原ア
ナログの研究、ならびに内因的結合した天然でプロセシングされたペプチドの配
列決定により、ＨＬＡ抗原分子に特異的に結合するために必要とされるモチーフ
に対応する重要な残基が同定されており、本明細書中に記載され、表Ｉ、表ＩＩ
および表ＩＩＩに示されている（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１６０：３３６３，１９９８；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１７８，１９９５；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、ＳＹＦＰＥ
ＩＴＨＩ、ｈｔｔｐ：／／１３４．２．９６．２２１／ｓｃｒｉｐｔｓ．ｈｌａ
ｓｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍにてウェブを介するアクセス；Ｓｅｔ
ｔｅ，Ａ．ａｎｄ Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１０：４７８，１９９８；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｖ．Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１３，１９９４；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．ａｎｄ Ｇｒｅｙ，
Ｈ．Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：７９，１９９２；Ｓｉｎ
ｉｇａｇｌｉａ，Ｆ．ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：５
２，１９９４；Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７，１９９３
；Ｋｏｎｄｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７−４３１２，１９９５
；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０，１９９
６；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１９９
６；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．ａｎｄ Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ １９９９ Ｎｏｖ；５０（３−４）：２０１−１２，Ｒｅｖｉｅｗ９も参照
のこと）。
【００６６】 さらにＨＬＡペプチド複合体のＸ線結晶解析は、ペプチドリガンドにより運ば れる 残基を対立遺伝子特異的様式で収容するＨＬＡ分子のペプチド結合裂溝（ｃ
ｌｅｆｔ）内のポケットを明示した。これらの残基は次に、それらが存在するペ
プチドのＨＬＡ結合能力を決定する（例えば、Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｒ．、Ａｎｎ
ｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５８７，１９９５；Ｓｍｉｔｈら、Ｉｍｍ
ｕｎｉｔｙ ４：２０３，１９９６；Ｆｒｅｍｏｎｔら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８
：３０５，１９９８；Ｓｔｅｒｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：２４５，１９９
４；Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７５，
１９９７；Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６４：３３，１９９３；
Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：
８０５３，１９９３；Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：３６４，１
９９２；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：３６７，１９９２
；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９２７，１９９２；
Ｍａｄｄｅｎら、Ｃｅｌｌ ７０：１０３５，１９９２；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｄ．
Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９１９，１９９２；Ｓａｐｅｒ，Ｍ．Ａ．，
Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．２１９：２７７，１９９１を参照のこと）。
【００６７】 したがって、クラスＩ対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合モチーフおよびクラスＩＩ
対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合モチーフの規定、あるいはクラスＩスーパーモチー
フまたはクラスＩＩスーパーモチーフの規定は、特定のＨＬＡ分子を結合する可
能性を有するタンパク質内の領域の同定を可能にする。
【００６８】 本明細書中に開示する結合親和性と免疫原性との相関は、候補ペプチドを評価
する場合に考えられるべき重要な因子であるということを本発明者等は見出した
。したがって、モチーフ検索とＨＬＡ−ペプチド結合アッセイとの組合せにより
、エピトープベースのワクチンのための候補物が同定された。それらの結合親和
性を決定後、さらなる確認作業を実行して、これらのワクチン候補物の中で、集
団適用範囲、抗原性および免疫原性に関して好ましい特徴を有するエピトープを
選択し得る。
【００６９】 免疫原性を評価するために種々の戦略が利用され得る。それらの例を以下に挙
げる： １）正常個体由来の初代Ｔ細胞培養物の評価（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，
Ｐ．Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６０３，１９９５；Ｃｅｌｉｓ，
Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２１０５，１
９９４；Ｔｓａｉ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１７９６，１９９７
；Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：１，１９
９８を参照のこと）。これらの手順は、数週間の期間に亘るインビトロでの抗原
提示細胞の存在下での、正常被験者由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の試験ペプ
チドによる刺激を包含する。このペプチドに特異的なＴ細胞は、この時間中に活
性化され、例えばペプチド感作標的細胞を包む５１Ｃｒ放出アッセイを用いて検
出される。
【００７０】 ２）ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，
Ｐ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７，１９９６；Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ
，Ｐ．Ａ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５１，１９９６；Ａｌｅｘａｎ
ｄｅｒ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３，１９９７を参照のこ
と）。この方法では、不完全フロイントアジュバント中のペプチドが、ＨＬＡト
ランスジェニックマウスに皮下投与される。免疫後数週間目に、脾臓細胞が取り
出され、試験ペプチドの存在下で約１週間、インビトロで培養される。例えばペ
プチド感作標的細胞と内因的に生成された抗原を発現する標的細胞とを包む、５ １ Ｃｒ放出アッセイを用いて、ペプチド特異的Ｔ細胞が検出される。
【００７１】 ３）効果的にワクチン接種された患者または腫瘍を有する患者からのリコール
（ｒｅｃａｌｌ）Ｔ細胞応答の立証（例えば、Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ，Ｂ．ら、Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１０４７，１９９５；Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．ら、
Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：９７，１９９７；Ｂｅｒｔｏｎｉ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３，１９９７；Ｔｈｒｅｌｋｅｌｄ，Ｓ．Ｃ．
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１６４８，１９９７；Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒ，
Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６０１１，１９９７；Ｔｓａｎｇら、Ｊ．
Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８７：９８２−９９０，１９９５；Ｄｉｓ
ｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３１５１−３１５８，１９９６を参照の
こと）。この戦略の適用に際しては、リコール応答は、「自然に」免疫応答を生
じていた癌患者由来のＰＢＬ、あるいは腫瘍抗原ワクチンでワクチン接種された
患者由来のＰＢＬを培養することにより検出される。被験者由来のＰＢＬは、試
験ペプチドおよび抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で１〜２週間インビトロで培
養されて、「ナイーブ」Ｔ細胞と比較した場合、「記憶」Ｔ細胞の活性化を可能
にする。培養期間終了時に、ペプチド感作標的、Ｔ細胞増殖またはリンホカイン
放出を包含する５１Ｃｒ放出を含めたＴ細胞活性に関するアッセイを用いて、Ｔ
細胞活性が検出される。
【００７２】 本発明のペプチドエピトープおよび対応する核酸を以下で説明する。
【００７３】 （ＩＶ．Ｃ．ＨＬＡ分子に関するペプチドエピトープの結合親和性） 本明細書中で示されているように、ＨＬＡ多型の大きな程度は、ワクチン開発
に対するエピトープベースのアプローチに関して考慮されるべき重要な因子であ
る。この因子に対処するために、複数のＨＬＡ分子に高親和性または中親和性で
結合し得るペプチドの同定を包含するエピトープ選択が好ましくは利用され、最
も好ましくはこれらのエピトープは、高親和性または中親和性で２つ以上の対立
遺伝子特異的ＨＬＡ分子に結合する。
【００７４】 ワクチン組成物のための目的のＣＴＬ誘導性ペプチドとしては、クラスＩ Ｈ
ＬＡ分子についてのＩＣ５０または結合親和性値、好ましくは５００ｎＭまたは
それより優れた値（すなわち、その値は５００ｎＭ以下である）を有するものが
挙げられる。ＨＴＬ誘導性ペプチドとしては、クラスＩＩ ＨＬＡ分子について
のＩＣ５０または結合親和性、、好ましくは１０００ｎＭまたはそれより優れた
値（すなわち、その値は１０００ｎＭ以下である）を有するものが挙げられる。
例えばペプチド結合は、インビトロで精製ＨＬＡ分子に結合する候補ペプチドの
能力を試験することにより評価される。次に、高親和性または中親和性を示すペ
プチドが、さらなる分析のために考慮される。選択されたペプチドは、スーパー
タイプファミリーの他のメンバーに対して試験される。好ましい実施形態では、
交差反応結合を示すペプチドは次に、細胞スクリーニング分析またはワクチンに
て用いられる。
【００７５】 高いＨＬＡ結合親和性は、高い免疫原性と相関する（例えば、Ｓｅｔｔｅら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：５５８６−５５９２，１９９４；Ｃｈｅｎら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２８７４−２８８１，１９９４；およびＲｅｓｓｉ
ｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９３４−５９４３，１９９５）。より
高い免疫原性は、いくつかの異なる方法で表示され得る。免疫原性は、免疫応答
が少しでも惹起されるのか否か、および任意の特定の応答の強さ、ならびに応答
が惹起される集団の程度に対応している。例えばペプチドは、多様な群の集団に
て免疫応答を惹起し得るが、しかし強力な応答を生じることはない。さらに高結
合親和性ペプチドほど、より強力な免疫原性応答を引き起こす。その結果、高親
和性結合ペプチドまたは中親和性結合ペプチドが用いられる場合には、同様の生
物学的作用を惹起するために、より少ないペプチドしか必要とされない。したが
って本発明の好ましい実施形態では、高親和性結合エピトープまたは中親和性結
合エピトープが、特に有用である。
【００７６】 ＨＬＡクラスＩ分子に対する結合親和性と結合した抗原上の別々のペプチドエ
ピトープの免疫原性との関係は、本発明人等により当該分野で初めて決定された
。結合親和性と免疫原性との相関は、２つの異なる実験アプローチで分析された
（例えば、Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：５５８６−５５９２，
１９９４を参照のこと）。最初のアプローチでは、ＨＬＡ結合親和性における１
０，０００倍の範囲を超える潜在エピトープの免疫原性が、ＨＬＡ−Ａ＊０２０
１トランスジェニックマウスで分析された。第二のアプローチでは、全てＡ＊０
２０１結合モチーフを保有している約１００個の異なるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢ
Ｖ）由来潜在エピトープの抗原性が、急性肝炎患者由来のＰＢＬを用いて評価さ
れた。これらのアプローチにしたがって、親和性閾値約５００ｎＭ（好ましくは
５０ｎＭ以下）がＣＴＬ応答を惹起するペプチドエピトープの能力を決定すると
いうことを決定した。これらのデータは、天然でプロセシングされたペプチドに
ついてのクラスＩ結合親和性測定値、ならびに合成Ｔ細胞エピトープについての
クラスＩ結合親和性測定値に関しては、正しい。これらのデータは、Ｔ細胞応答
の決定に際しての決定基選択の重要な役割も示す（例えば、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４６４９−４６５
３，１９８９を参照のこと）。
【００７７】 ＨＬＡクラスＩＩ ＤＲ分子の状況での免疫原性に関連した親和性閾値も記述
されている（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６
０：３３６３−３３７３，１９９８および同時係属中の米国特許出願第０９／０
０９，９５３号（１９９８年１月２１日出願）を参照のこと）。ＤＲ結合親和性
の生物学的に有意の閾値を規定するために、それらの拘束エレメント（すなわち
モチーフを結合するＨＬＡ分子）に対する３２ＤＲ拘束エピトープの結合親和性
のデータベースが編集された。約半数の例（３２個のうちの１５個のエピトープ
）において、ＤＲ拘束は高結合親和性（すなわち、１００ｎＭ以下の結合親和性
値）に関連した。他の半数の例（３２個のうち１６個）では、ＤＲ拘束は中親和
性（１００〜１０００ｎＭ範囲の結合親和性値）に関連した。３２例のうちの１
例のみにおいて、ＤＲ拘束は１０００ｎＭ以上のＩＣ５０に関連した。したがっ
て１０００ｎＭは、ＤＲ分子の状況での免疫原性に関連した親和性閾値と規定さ
れ得る。
【００７８】 腫瘍関連抗原の場合、ペプチドパルスされた標的細胞およびそのエピトープを
内因的に発現する腫瘍細胞標的を溶解するＣＴＬを誘導することが示されている
多数のＣＴＬペプチドエピトープが、２００ｎＭ以下の結合親和性またはＩＣ５ ０ 値を示す。このようなＴＡＡエピトープの小さな組の結合親和性および免疫原
性の関連を評価した研究では、高結合剤（すなわち５０ｎＭ以下の親和性で結合
するペプチドエピトープ）の１００％（１０／１０）が免疫原性であり、それら
の８０％（８／１０）が、腫瘍細胞を特異的に認識するＣＴＬを惹起した。５１
〜２００ｎＭ範囲で、非常によく似た数値が得られた。アナログペプチドのつい
ては、野生型ペプチドおよび腫瘍細胞に対して陽性であるＣＴＬ誘導は、それぞ
れペプチドの８６％（６／７）および７１％（５／７）認められた。２０１〜５
００ｎＭ範囲では、ほとんどのペプチド（４／５野生型）が、野生型ペプチドを
認識するＣＴＬの誘導に関して陽性であったが、腫瘍認識は検出されなかった。
【００７９】 ＨＬＡ分子に対するペプチドの結合親和性は、以下の実施例１に記載されてい
るように決定され得る。
【００８０】 （ＩＶ．Ｄ．ペプチドエピトープ結合モチーフおよびスーパーモチーフ） 単一アミノ酸置換抗原アナログの研究、ならびに内因的に結合された天然でプ
ロセシングされたペプチドの配列決定により、ＨＬＡ分子との対立遺伝子特異的
結合に必要とされる重要残基が同定されている。これらの残基の存在は、ＨＬＡ
分子に対する結合親和性と相関する。高親和性結合および中親和性結合と相関す
るモチーフおよび／またはスーパーモチーフの同定は、ワクチン中の含入物のた
めの免疫原性ペプチドエピトープの同定に関して重要な問題である。Ｋａｓｔ等
（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９０４−３９１２，１９９４）は、モチーフ
保有ペプチドが対立遺伝子特異的ＨＬＡクラスＩ分子に結合するエピトープの９
０％を占めることを示した。この研究では、ヒトパピローマウイルス１６型のＥ
６タンパク質およびＥ７タンパク質の全体配列を網羅する、９アミノ酸長の、か
つ、８個のアミノ酸を重複する考え得る全てのペプチド（２４０ペプチド）が、
異なる民族群間で高頻度で発現される５つの対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子との結
合に関して評価された。このペプチドの偏りのない組が、ＨＬＡクラスＩモチー
フの予測値の評価を可能にした。２４０ペプチドの組から、２２ペプチドが、高
親和性または中親和性で対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子に結合すると同定された。
これら２２ペプチドのうち、２０ペプチド（すなわち９１％）がモチーフ保有性
であった。したがって、この研究は、ワクチン中に含めるためのペプチドエピト
ープの同定に関するモチーフの値を立証する。モチーフベースの同定技法の適用
は、標的抗原タンパク質配列中の潜在エピトープの約９０％を同定する。
【００８１】 このようなペプチドエピトープは、下記の表中で確認される。
【００８２】 本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩＤＲ分子に結合するエピトープも含み
得る。そのペプチドのＮ末端およびＣ末端と比較して、モチーフのサイズおよび
結合フレーム位置の両方における、より度合いの高い不均一性が、クラスＩＩペ
プチドリガンドに存在する。ＨＬＡクラスＩＩペプチドリガンドのこの不均一性
の増大は、そのクラスＩ対応部分と違って両端で開いている、ＨＬＡクラスＩＩ
分子の結合溝（ｇｒｏｏｖｅ）の構造によるものである。ＨＬＡクラスＩＩＤＲ
Ｂ＊０１０１ペプチド複合体の結晶解析は、結合の主エネルギーが、ＤＲＢ＊０
１０１分子上の相補的ポケットと複合体化されたペプチド残基によるものである
ことを示した。重要なアンカー残基は、最も深い疎水性ポケットにかみ合い（例
えば、Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｒ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５８７
，１９９５を参照のこと）、位置１（Ｐ１）と呼ばれる。Ｐ１はクラスＩＩ結合
ペプチドエピトープのＮ末端残基を表し得るが、さらに典型的には、１つ以上の
残基によりＮ末端方向に隣接される。他の研究は、種々のＤＲ分子との結合に関
して、Ｐ１に対して、Ｃ末端方向への６番目の位置のペプチド残基に関する重要
な役割もまた指摘している。
【００８３】 過去数年間、ほぼ重複するペプチド結合レパートリーならびに主ペプチド結合
ポケットのコンセンサス構造により各々特徴づけされる、多くのＨＬＡクラスＩ
分子およびＨＬＡクラスＩＩ分子が、比較的少数のスーパータイプに分類され得
ることを立証する証拠が蓄積されてきた。したがって本発明のペプチドは、いく
つかのＨＬＡ特異的アミノ酸モチーフ（例えば表Ｉ〜ＩＩＩを参照のこと）のい
ずれか１つによってか、またはそのモチーフの存在がいくつかの対立遺伝子特異
的ＨＬＡ分子を結合する能力に対応する場合には、スーパーモチーフにより、同
定される。特定のアミノ酸スーパーモチーフを保有するペプチドに結合するＨＬ
Ａ分子は、集合的にＨＬＡ「スーパータイプ」と呼ばれる。
【００８４】 下記の、ならびに表Ｉ〜ＩＩＩに要約されたペプチドモチーフおよびスーパー
モチーフは、本発明に従ったペプチドエピトープの同定および使用に関する指針
を提供する。
【００８５】 スーパーモチーフおよび/またはモチーフ保有ペプチドエピトープの例は、表
ＶＩＩ〜ＸＸに示されている。ペプチドエピトープ配列を得るために、前立腺癌
抗原ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、およびｈＫ２に対するタンパク質配列データ（表
ＶＩＩ〜ＸＸにおいてカリクレインとして示される）は、示されたスーパーモチ
ーフまたはモチーフの存在について評価された。「位置」欄は、推定の第１のア
ミノ酸残基に対応するタンパク質配列における位置を示す。「アミノ酸の数」は
、エピトープ配列における残基の数を示す。表はまた、上部の欄に示される対立
遺伝子特異的ＨＬＡ分子に対するいくつかのペプチドエピトープについて列挙さ
れる結合親和性比を含む。その比は、以下の式を用いてＩＣ５０に変換され得る
：標準ペプチドのＩＣ５０／比＝試験ペプチド（すなわちペプチドエピトープ）
のＩＣ５０。クラスＩペプチドに関する結合親和性を決定するために用いられる
標準ペプチドのＩＣ５０値は、表ＩＶに示されている。クラスＩＩペプチドに関
する結合親和性を決定するために用いられる標準ペプチドのＩＣ５０値は、表Ｖ
に示されている。本明細書中に記載した結合アッセイのための標準として用いら
れるペプチドは、標準の例である。代替的標準ペプチドも、結合試験を実施する
場合に用いられ得る。
【００８６】 表ＶＩＩ〜ＸＸの各々に列挙したペプチドエピトープ配列を得るために、ＰＳ
Ａ、ＰＳＭ、ＰＡＰ、およびＨｕＫのアミノ酸配列は、示されるスーパーモチー
フまたはモチーフについて評価された。すなわち、それぞれのモチーフまたはス
ーパーモチーフの各々に関して表Ｉ（クラスＩモチーフに関して）または表ＩＩ
Ｉ（クラスＩＩモチーフに関して）に記述されたような一次アンカー残基の存在
に関して、アミノ酸配列が検索された。
【００８７】 表中、モチーフおよび／またはスーパーモチーフ保有アミノ酸配列は、前立腺
抗原アミノ酸配列、および下に提供される番号付けに関して位置の数およびエピ
トープの長さによって同定される。「ｐｏｓ」（位置）欄は、エピトープの最初
のアミノ酸残基に対応する下の前立腺抗原配列タンパク質配列中のアミノ酸位置
を示す。「アミノ酸の数」は、エピトープ配列中の残基の数を、ひいてはエピト
ープの長さを示す。例えば表ＶＩＩに列挙した最初のペプチド配列は、ＰＡＰの
位置１２２で始まる１１残基長の配列である。したがって、このエピトープのア
ミノ酸配列は、ＡＬＦＰＰＥＧＶＳＩＷである。同様に、表ＶＩＩにおける第１
のカリクレインは、位置１４７で始まり、そして１１残基長である。従って、ア
ミノ酸配列は、ＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷである。
【００８８】 表ＶＩＩ〜ＸＸに示される結合データは、対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子と標識
された欄において相対結合比（上記）として表される。
【００８９】 ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）
【００９０】
【化１】 ＰＡＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）
【００９１】
【化２】 ＰＳＭ（前立腺特異的膜抗原）
【００９２】
【化３】 カリクレイン（ヒトカリクレイン２、受託ＮＭ００５５５１）
【００９３】
【化４】 （ＣＴＬ誘導ペプチドエピトープを示すＨＬＡクラスＩモチーフ） 下記のＨＬＡクラスＩペプチドエピトープスーパーモチーフおよびＨＬＡクラ
スＩペプチドエピトープモチーフの一次アンカー残基は、表Ｉに概説されている
。表Ｉ（ａ）に記述されたＨＬＡクラスＩモチーフは、本明細書中で特許請求さ
れる本発明に最も特に関連があるものである。一次アンカー位置および二次アン
カー位置は、表ＩＩに概説されている。ＨＬＡクラスＩスーパータイプファミリ
ーを含む対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表ＶＩに列挙されている。いくつかの
場合、ペプチドエピトープは、重複一次アンカー特異性が原因で、モチーフおよ
びスーパーモチーフの表の両方に列挙される。特定のモチーフおよびそれぞれの
スーパーモチーフの関係は、個々のモチーフの説明中に示されている。
【００９４】 （ＩＶ．Ｄ．１．ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフは、このエピトープの第２位における小さい（
ＴまたはＳ）または疎水性の（Ｌ、Ｉ、ＶまたはＭ）一次アンカー残基、ならび
にＣ末端位置での芳香族（Ｙ、ＦまたはＷ）一次アンカー残基の、ペプチドリガ
ンド中の存在によって特徴付けられる。Ａ１スーパーモチーフに結合するＨＬＡ
分子のこの対応するファミリー（すなわち、ＨＬＡ−Ａ１スーパータイプ）は、
少なくとも：Ａ＊０１０１、Ａ＊２６０１、Ａ＊２６０２、Ａ＊２５０１および
Ａ＊３２０１からなる（例えば、ＤｉＢｒｉｎｏ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１５１：５９３０，１９９３；ＤｉＢｒｉｎｏ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１５２：６２０，１９９４；Ｋｏｎｄｏ，Ａ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ４５：２４９，１９９７を参照のこと）。このＡ１スーパーファミリーの
メンバーであると予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す
。これらの個々のＨＬＡタンパク質の各々に結合するペプチドは、一次および／
または二次アンカー位置での置換（好ましくは、このスーパーモチーフに特定化
された各々の残基を選択して）によって調節され得る。
【００９５】 Ａ１スーパーモチーフを含む代表的ペプチドエピトープを、添付の表ＶＩＩに
示す。
【００９６】 （ＩＶ．Ｄ．２．ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ） 対立遺伝子特異的ＨＬＡ−Ａ２．１分子に対する一次アンカー特異性（例えば
、Ｆａｌｋら，Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６，１９９１；Ｈｕｎｔら
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−１２６３，１９９２；Ｐａｒｋｅｒら，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−３５８７，１９９２；Ｒｕｐｐｅｒｔ
ら，Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７，１９９３参照）、ならびにＨＬＡ−Ａ２
およびＨＬＡ−Ａ２８分子間の交差反応結合は、記載されている（関連データの
総説については、例えば、Ｆｒｕｃｉら，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：
１８７−１９２，１９９３；Ｔａｎｉｇａｋｉら，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｎｏｌ．
３９：１５５−１６２，１９９４；Ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１５４：６８５−６９３，１９９５；Ｋａｓｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５２：３９０４−３９１２，１９９４を参照のこと）。これらの一次アンカー
残基は、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフを規定し；ペプチドリガンド中のその存
在は、いくつかの異なるＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２８分子を結合する能力
に対応する。このＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフは、このエピトープの第２位の
一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＱおよびこのエピトープ
のＣ末端位置の一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＴを有する、
ペプチドリガンドを含む。
【００９７】 ＨＬＡ分子のこの対応するファミリー（すなわち、これらのペプチドを結合す
るＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ）は、少なくとも：Ａ＊０２０１、Ａ＊０２０２
、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０４、Ａ＊０２０５、Ａ＊０２０６、Ａ＊０２０７、
Ａ＊０２０９、Ａ＊０２１４、Ａ＊６８０２およびＡ＊６９０１からなる。この
Ａ２スーパーファミリーのメンバーであると予測される他の対立遺伝子特異的Ｈ
ＬＡ分子を、表ＶＩに示す。以下で詳細に説明するように、これらの個々の対立
遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々への結合は、一次アンカー位置および／または二
次アンカー位置での置換（好ましくは、このスーパーモチーフに特定化された各
々の残基を選択して）によって調節され得る。
【００９８】 Ａ２スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表ＶＩＩ
Ｉに示す。第２位に一次アンカー残基Ｖ、Ａ、ＴまたはＱおよびＣ末端位置に一
次アンカー残基Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＡまたはＴを含むこれらのモチーフは、本明細書中
の特許請求された本発明に最も特に関連があるモチーフである。
【００９９】 （ＩＶ．Ｄ．３．ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフは、このエピトープの第２位の一次アンカーと
してのＡ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳまたはＴおよびこのエピトープのＣ末端位置（例
えば、９マーの第９位）の正荷電残基ＲまたはＫの、ペプチドリガンド中の存在
により特徴付けられる（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４
５：７９，１９９６を参照のこと）。このＡ３スーパーモチーフに結合するＨＬ
Ａ分子のこの対応するファミリー（すなわち、ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ）の
メンバーの例としては、少なくとも：Ａ＊０３０１、Ａ＊１１０１、Ａ＊３１０
１、Ａ＊３３０１およびＡ＊６８０１が挙げられる。このＡ３スーパータイプの
メンバーであると予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す
。以下で詳細に説明されるように、これらの個々の対立遺伝子特異的ＨＬＡタン
パク質の各々に結合するペプチドは、そのペプチドの一次および／または二次ア
ンカー位置でのアミノ酸の置換（好ましくは、このスーパーモチーフに特定化さ
れた各々の残基を選択して）によって調節され得る。
【０１００】 このＡ３スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表Ｉ
Ｘに示す。
【０１０１】 （ＩＶ．Ｄ．４．ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフは、このエピトープの第２位の一次アンカー
としての芳香族残基（Ｆ、ＷまたはＹ）または疎水性脂肪族残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、
ＭまたはＴ）およびこのエピトープのＣ末端位置の一次アンカーとしてのＹ、Ｆ
、Ｗ、Ｌ、ＩまたはＭの、ペプチドリガンド中の存在により特徴付けられる（例
えば、ＳｅｔｔｅおよびＳｉｄｎｅｙ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９
９ Ｎｏｖ；５０（３−４）：２０１−１２，Ｒｅｖｉｅｗを参照のこと）。こ
のＡ２４スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子のこの対応するファミリー（す
なわち、Ａ２４スーパータイプ）としては、少なくとも：Ａ＊２４０２、Ａ＊３
００１およびＡ＊２３０１が挙げられる。このＡ２４スーパータイプのメンバー
であると予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。これら
の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々に結合するペプチドは、一次および／また
は二次アンカー位置での置換（好ましくは、このスーパーモチーフに特定化され
た各々の残基を選択して）によって調節され得る。
【０１０２】 このＡ２４スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表
Ｘに示す。
【０１０３】 （ＩＶ．Ｄ．５．ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフは、このエピトープの一次アンカーとして第２
位におけるプロリンならびにこのエピトープのＣ末端位置での一次アンカーとし
て疎水性または脂肪族アミノ酸（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｆ、ＷまたはＹ）を保有
するペプチドによって、特徴付けられる。このＢ７スーパーモチーフに結合する
ＨＬＡ分子のこの対応するファミリー（すなわち、ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプ
）は、少なくとも：Ｂ＊０７０２、Ｂ＊０７０３、Ｂ＊０７０４、Ｂ＊０７０５
、Ｂ＊１５０８、Ｂ＊３５０１、Ｂ＊３５０２、Ｂ＊３５０３、Ｂ＊３５０４、
Ｂ＊３５０５、Ｂ＊３５０６、Ｂ＊３５０７、Ｂ＊３５０８、Ｂ＊５１０１、Ｂ ＊ ５１０２、Ｂ＊５１０３、Ｂ＊５１０４、Ｂ＊５１０５、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊ ５４０１、Ｂ＊５５０１、Ｂ＊５５０２、Ｂ＊５６０１、Ｂ＊５６０２、Ｂ＊６
７０１およびＢ＊７８０１を含む、少なくとも２６個のＨＬＡ−Ｂタンパク質か
らなる（関連データの総説については、例えば、Ｓｉｄｎｅｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１５４：２４７，１９９５；Ｂａｒｂｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５
：１７９，１９９５；Ｈｉｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ ３６０：４３４，１９９２；
Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１７８，１９９
５を参照のこと）。このＢ７スーパータイプのメンバーであると予測される他の
対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。以下で詳細に説明されるように
、これらの個々の対立遺伝子特異的ＨＬＡタンパク質の各々に結合するペプチド
は、このペプチドの一次および／または二次アンカー位置での置換（好ましくは
、スーパーモチーフに特定化された各々の残基を選択して）によって調節され得
る。
【０１０４】 このＢ７スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表Ｘ
Ｉに示す。
【０１０５】 （ＩＶ．Ｄ．６．ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフは、このエピトープの第２位での一次アンカ
ーとしての正荷電（Ｒ、ＨまたはＫ）残基およびこのエピトープのＣ末端位置で
の一次アンカーとしての疎水性（Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ｉ、ＡまたはＶ）残基の
、ペプチドリガンド中の存在により特徴付けられる（例えば、Ｓｉｄｎｅｙおよ
びＳｅｔｔｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９９ Ｎｏｖ；５０（
３−４）：２０１−１２，Ｒｅｖｉｅｗを参照のこと）。このＢ２７スーパーモ
チーフに結合するＨＬＡ分子のこの対応するファミリー（すなわち、Ｂ２７スー
パータイプ）の例示的メンバーとしては、少なくとも：Ｂ＊１４０１、Ｂ＊１４
０２、Ｂ＊１５０９、Ｂ＊２７０２、Ｂ＊２７０３、Ｂ＊２７０４、Ｂ＊２７０
５、Ｂ＊２７０６、Ｂ＊３８０１、Ｂ＊３９０１、Ｂ＊３９０２およびＢ＊７３
０１が挙げられる。このＢ２７スーパータイプのメンバーであると予測される他
の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。この対立遺伝子特異的ＨＬＡ
分子の各々に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位置での置
換（好ましくは、スーパーモチーフに特定化された各々の残基を選択して）によ
って調節され得る。
【０１０６】 このＢ２７スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表
ＸＩＩに示す。
【０１０７】 （ＩＶ．Ｄ．７．ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフは、このエピトープの第２位での一次アンカ
ーとしての負荷電（ＤまたはＥ）残基およびこのエピトープのＣ末端位置での一
次アンカーとしての疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、ＶまたはＡ）の、ペ
プチドリガンド中の存在によって特徴付けられる（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら，Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：２６１，１９９６を参照のこと）。このＢ４
４スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子のこの対応するファミリー（すなわち
、Ｂ４４スーパータイプ）の例示的なメンバーとしては、少なくとも：Ｂ＊１８
０１、Ｂ＊１８０２、Ｂ＊３７０１、Ｂ＊４００１、Ｂ＊４００２、Ｂ＊４００
６、Ｂ＊４４０２、Ｂ＊４４０３およびＢ＊４４０４が挙げられる。これらの対
立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々に結合するペプチドは、一次および／または二
次アンカー位置での置換（好ましくは、このスーパーモチーフに特定化された各
々の残基を選択して）によって調節され得る。
【０１０８】 （ＩＶ．Ｄ．８．ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフは、このエピトープの第２位での一次アンカ
ー残基としての小さい脂肪族残基（Ａ、ＳまたはＴ）およびこのエピトープのＣ
末端位置での一次アンカー残基としての芳香族または疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＡ）の、ペプチドリガンド中の存在によって特徴付けられ
る（例えば、ＳｉｄｎｅｙおよびＳｅｔｔｅ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ
１９９９ Ｎｏｖ； ５０（３−４）：２０１−１２，Ｒｅｖｉｅｗを参照のこ
と）。このＢ５８スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子のこの対応するファミ
リー（すなわちＢ５８スーパータイプ）の例示的なメンバーとしては、少なくと
も：Ｂ＊１５１６、Ｂ＊１５１７、Ｂ＊５７０１、Ｂ＊５７０２およびＢ＊５８
０１が挙げられる。このＢ２７スーパータイプのメンバーであると予測される他
の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。これらの対立遺伝子特異的Ｈ
ＬＡ分子の各々に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位置で
の置換（好ましくは、このスーパーモチーフに特定化された各々の残基を選択し
て）によって調節され得る。
【０１０９】 このＢ５８スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表
ＸＩＩに示す。
【０１１０】 （ＩＶ．Ｄ．９．ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフは、このエピトープの第２位での一次アンカ
ーとしての極性脂肪族残基Ｑまたは疎水性脂肪族残基（Ｌ、Ｖ、Ｍ、ＩまたはＰ
）およびこのエピトープのＣ末端位置での一次アンカーとしての疎水性残基（Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、ＬまたはＡ）の、ペプチドリガンド中の存在によって特
徴付けられる（例えば、ＳｉｄｎｅｙおよびＳｅｔｔｅ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ １９９９ Ｎｏｖ；５０（３−４）：２０１−１２，Ｒｅｖｉｅｗを
参照のこと）。このＢ６２スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子のこの対応す
るファミリー（すなわち、Ｂ６２スーパータイプ）の例示的なメンバーとしては
、少なくとも：Ｂ＊１５０１、Ｂ＊１５０２、Ｂ＊１５１３およびＢ＊５２０１
が挙げられる。このＢ６２スーパータイプのメンバーであると予測される他の対
立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。これらの対立遺伝子特異的ＨＬＡ
分子の各々に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位置での置
換（好ましくは、このスーパーモチーフに特定化された各々の残基を選択して）
によって調節され得る。
【０１１１】 このＢ６２スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表
ＸＩＶに示す。
【０１１２】 （ＩＶ．Ｄ．１０．ＨＬＡ−Ａ１モチーフ） ＨＬＡ−Ａ１モチーフは、このエピトープの第２位での一次アンカー残基とし
てのＴ、ＳまたはＭおよびこのエピトープのＣ末端位置での一次アンカー残基と
してのＹの、このペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。代替
的な対立遺伝子特異的Ａ１モチーフは、第２位ではなくむしろ第３位での一次ア
ンカー残基によって特徴付けられる。このモチーフは、このエピトープの第３位
での一次アンカー残基としてのＤ、Ｅ、ＡまたはＳおよびこのエピトープのＣ末
端位置での一次アンカー残基としてのＹの存在によって特徴付けられる（関連デ
ータの総説については、例えば、ＤｉＢｒｉｎｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１
５２：６２０，１９９４；Ｋｏｎｄｏら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５
：２４９，１９９７；およびＫｕｂｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１
３，１９９４を参照のこと）。ＨＬＡ−Ａ１に結合するペプチドは、一次および
／または二次アンカー位置での置換（好ましくは、このモチーフに特定化された
各々の残基を選択して）によって調節され得る。
【０１１３】 いずれかのＡ１モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表ＸＶ
に示す。第２位にＴ、ＳまたはＭそしてＣ末端位置にＹを含むエピトープはまた
、これらの残基が、Ａ１スーパーモチーフのサブセットであるので、表ＶＩＩに
列挙されるＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープのリストに含
まれる。
【０１１４】 （ＩＶ．Ｄ．１１．ＨＬＡ−Ａ＊０２０１モチーフ） ＨＬＡ−Ａ２＊０２０１モチーフは、９残基ペプチドの第２位での一次アンカ
ー残基としてのＬまたはＭおよび９残基ペプチドのＣ末端位置での一次アンカー
残基としてのＬまたはＶの、ペプチドリガンド中の存在によって特徴付けられる
ことが決定され（例えば、Ｆａｌｋら，Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６
，１９９１を参照のこと）、そしてさらに、９アミノ酸ペプチドの第２位でＩお
よびＣ末端位置でＩまたはＡを含むことが見出された（例えば、Ｈｕｎｔら，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−１２６３，Ｍａｒｃｈ ６，１９９２；Ｐａ
ｒｋｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−３５８７，１９９２を参
照のこと）。このＡ＊０２０１対立遺伝子特異的モチーフは、このエピトープの
第２位に一次アンカー残基としてＶ、Ａ、ＴまたはＱおよびこのエピトープのＣ
末端位置に一次アンカー残基としてＭまたはＴをさらに含むことが、本発明者ら
によって規定された（例えば、Ｋａｓｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９
０４−３９１２，１９９４を参照のこと）。従って、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１モチ
ーフは、このエピトープの第２位に一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ
、ＴまたはＱおよびこのエピトープのＣ末端位置に一次アンカー残基としてＬ、
Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＴを有する、ペプチドリガンドを含む。このＨＬＡ−Ａ＊ ０２０１モチーフの一次アンカー位置を特徴付ける、これらの好ましくかつ許容
される残基は、Ａ２スーパーモチーフを説明する残基と同一である（関連データ
の総説については、例えば、ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５４：６８５−６９３，１９９５；Ｒｕｐｐｅｒｔら，Ｃｅｌｌ ７４：９２
９−９３７，１９９３；Ｓｉｄｎｅｙら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：
２６１−２６６，１９９６；ＳｅｔｔｅおよびＳｉｄｎｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ
ｎ．ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４７８−４８２，１９９８を参照のこと）。
このＡ＊０２０１モチーフを特徴付ける二次アンカー残基が、さらに規定されて
いる（例えば、Ｒｕｐｐｅｒｔら，Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７，１９９３
を参照のこと）。これらは、表ＩＩに示されている。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子
に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位置での置換（好まし
くは、このモチーフに特定化された各々の残基を選択して）によって調節され得
る。
【０１１５】 Ａ＊０２０１モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表ＶＩＩ
Ｉに示す。第２位に一次アンカー残基Ｖ、Ａ、ＴまたはＱおよびＣ末端位置に一
次アンカー残基Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＡまたはＴを含むＡ＊０２０１モチーフは、本明細
書における特許請求された本発明に最も特に関連があるモチーフである。
【０１１６】 （ＩＶ．Ｄ．１２．ＨＬＡ−Ａ３モチーフ） ＨＬＡ−Ａ３モチーフは、このエピトープの第２位での一次アンカー残基とし
てのＬ、Ｍ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｃ、ＧまたはＤおよびこのエピトープの
Ｃ末端位置での一次アンカー残基としてのＫ、Ｙ、Ｒ、Ｈ、ＦまたはＡの、ペプ
チドリガンド中の存在によって特徴付けられる（例えば、ＤｉＢｒｉｎｏら，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１５０８，１９９３；お
よびＫｕｂｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３−３９２４，１９９４
を参照のこと）。ＨＬＡ−Ａ３に結合するペプチドは、一次および／または二次
アンカー位置での置換（好ましくは、このモチーフに特定化された各々の残基を
選択して）によって調節され得る。
【０１１７】 このＡ３モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表ＸＶＩに示
す。このＡ３スーパーモチーフも含むペプチドエピトープはまた、表ＩＸに列挙
される。このＡ３スーパーモチーフ一次アンカー残基は、Ａ３−およびＡ１１−
対立遺伝子特異的モチーフのサブセットを含む。
【０１１８】 （ＩＶ．Ｄ．１３．ＨＬＡ−Ａ１１モチーフ） ＨＬＡ−Ａ１１モチーフは、このエピトープの第２位での一次アンカー残基と
してのＶ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｃ、ＤまたはＦおよびこのエピト
ープのＣ末端位置での一次アンカー残基としてのＫ、Ｒ、ＹまたはＨの、ペプチ
ドリガンドにおける存在によって特徴付けられる（例えば、Ｚｈａｎｇら，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２２１７−２２２１，１
９９３；およびＫｕｂｏら， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３−３９２
４，１９９４を参照のこと）。ＨＬＡ−Ａ１１に結合するペプチドは、一次およ
び／または二次アンカー位置での置換（好ましくは、このモチーフに特定化され
た各々の残基を選択して）によって調節され得る。
【０１１９】 このＡ１１モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表ＸＶＩＩ
に示す。Ａ３対立遺伝子特異的モチーフを含むペプチドエピトープもまた、Ａ３
モチーフ一次アンカー特異性とＡ１１モチーフ一次アンカー特異性との間の広範
な重複に起因してこの表に示される。さらにＡ３スーパーモチーフを含むペプチ
ドエピトープもまた、表ＩＸに列挙される。
【０１２０】 （ＩＶ．Ｄ．１４．ＨＬＡ−Ａ２４モチーフ） ＨＬＡ−Ａ２４モチーフは、このエピトープの第２位での一次アンカー残基と
してのＹ、Ｆ、ＷまたはＭおよびこのエピトープのＣ末端位置での一次アンカー
残基としてのＦ、Ｌ、ＩまたはＷの、ペプチドリガンドにおける存在によって特
徴付けられる（例えば、Ｋｏｎｄｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７
−４３１２，１９９５；およびＫｕｂｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９
１３−３９２４，１９９４を参照のこと）。ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプ
チドは、一次および／または二次アンカー位置での置換（好ましくは、このモチ
ーフに特定化された各々の残基を選択して）によって調節され得る。
【０１２１】 このＡ２４モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、添付の表ＸＶＩＩ
Ｉに示す。これらのエピトープは、このＡ２４対立遺伝子特異的モチーフを特徴
付ける一次アンカー残基が、Ａ２４スーパーモチーフ一次アンカー残基のサブセ
ットを含むので、表Ｘ（ＨＬＡ−Ａ２４−スーパーモチーフ保有ペプチドエピト
ープを示す）にも列挙される。
【０１２２】 （クラスＩＩ ＨＴＬ誘導ペプチドエピトープを示すモチーフ） 以下で記載されるＨＬＡクラスＩＩペプチドエピトープスーパーモチーフおよ
びＨＬＡクラスＩＩペプチドエピトープモチーフの一次および二次アンカー残基
を、表ＩＩＩに要約する。
【０１２３】 （ＩＶ．Ｄ．１５．ＨＬＡ ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフ） ３つの共通ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子：ＨＬＡ ＤＲＢ１ ＊ ０４０１、ＤＲＢ１＊０１０１およびＤＲＢ１＊０７０１に結合するペプチド
に関しても、モチーフは同定されている（例えばＳｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：３３６３−３３７３，１９９８による概説を参照
）。集合的に、これらのモチーフからの共通の残基は、ＨＬＡ ＤＲ−１−４−
７スーパーモチーフを記述する。これらのＤＲ分子に結合するペプチドは、位置
１における一次アンカー残基としての大型芳香族または疎水性残基（Ｙ、Ｆ、Ｗ
、Ｌ、Ｉ、ＶまたはＭ）、ならびに９マーコア領域の位置６における一次アンカ
ー残基としての小非荷電残基（Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ａ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、ＬまたはＭ）によ
り特徴付けられるスーパーモチーフを保有する。対立遺伝子特異的二次作用およ
びこれらのＨＬＡ型の各々に関する二次アンカーも同定されている（Ｓｏｕｔｈ
ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．、上記）。これらは、表ＩＩＩに記載されている。ＨＬ
Ａ−ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０１０１および／またはＤＲＢ１＊０７０
１に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位置での置換により
調整されることができ、好ましくはスーパーモチーフに特異化されるそれぞれの
残基を選択する。
【０１２４】 ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフを含む代表的な９マーペプチド配列（スー
パーモチーフの位置１が９残基コアの位置１にある）は、表ＸＩＸに示す。各配
列について、「タンパク質」欄は、前立腺関連抗原（すなわち、ＰＳＡ、ＰＳＭ
、ＰＡＰ、またはＨｕＫ２（カリクレイン））を示す。「位置」欄は、コア配列
の第１のアミノ酸残基に対応する前立腺抗原タンパク質配列におけるアミノ酸位
置を示す。コア配列は、全て９残基長である。例えば、表ＸＩＸに列挙される第
１のＰＳＭ配列は、９残基長のコア配列であり、本明細書中に提供されるＰＳＭ
アミノ酸配列の位置６１１で開始する。従って、コア配列のアミノ酸配列は、Ｉ
ＹＳＩＳＭＫＨＰである。９残基コアを含む１５アミノ酸長の例示的なエピトー
プは、、９残基コアの側面にある各側で３残基を含む。例えば、ＰＳＭの位置６
１１でコアエピトープを含む、１５アミノ酸残基長の例示的エピトープは、ＡＤ
ＫＩＹＳＩＳＭＫＨＰＱＥＭである。
【０１２５】 コア配列を含むＨＴＬエピトープはまた、１５アミノ酸以外の長さであり得る
（上記）。例えば、本発明のエピトープは、各側で９残基のすぐ近くに隣接する
９残基コアおよび１，２，３（例示的な１５マーにおいて）、４、または５個の
フランキング残基を含む配列を含む。
【０１２６】 （ＩＶ．Ｄ．１６．ＨＬＡ ＤＲ３モチーフ） ２つの代替的モチーフ（すなわちサブモチーフ）は、ＨＬＡ−ＤＲ３分子に結
合するペプチドエピトープを特徴付ける（例えば、Ｇｅｌｕｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１５２：５７４２，１９９４参照）。第一のモチーフ（サブモチーフＤ
Ｒ３ａ）では、大型疎水性残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＦまたはＹ）が９マーコアの
アンカー位置１に存在し、そしてＤがエピトープのカルボキシル末端に向けて、
位置４にアンカーとして存在する。その他のクラスＩＩモチーフの場合と同様に
、コア位置１がペプチドＮ末端位置を占めることもあるし、そうでないこともあ
る。
【０１２７】 代替的ＤＲ３サブモチーフは、エピトープのカルボキシル末端に向かう位置６
での正電荷の存在により、アンカー位置１での大型疎水性残基の欠如に、および
／または位置４での負荷電またはアミド様アンカー残基の欠如に備える。従って
代替的対立遺伝子特異的ＤＲ３モチーフ（サブモチーフＤＲ３ｂ）に関しては：
Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、ＡまたはＹがアンカー位置１に存在し；Ｄ、Ｎ、Ｑ、
Ｅ、ＳまたはＴがアンカー位置４に存在し；そしてＫ、ＲまたはＨがアンカー位
置６に存在する。ＨＬＡ−ＤＲ３に結合するペプチドは、一次および／または二
次アンカー位置での置換により調整されることができ、好ましくはそのモチーフ
に特異化されるそれぞれの残基を選択する。
【０１２８】 ＤＲ３ａまたはＤＲ３ｂサブモチーフ（モチーフの位置１が９残基コアの位置
１である）を含む９残基配列に対応する、ペプチドエピトープ９マーコア領域は
、表ＸＸａおよびｂに記載されている。各配列に関して、「タンパク質」欄は、
前立腺関連抗原（すなわち、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＡＰ、またはＨｕＫ２（カリク
レイン））を示す。「位置」欄は、コア配列の第１のアミノ酸残基に対応する前
立腺抗原タンパク質配列におけるアミノ酸位置を示す。コア配列は、全て９残基
長である。例えば、表ＸＸａに列挙される第１の配列は、９残基長のコア配列で
あり、本明細書中に提供されるＰＡＰアミノ酸配列の位置１２４で開始する。従
って、コア配列のアミノ酸配列は、ＦＰＰＥＧＶＳＩＷである。９残基コアを含
む１５アミノ酸長の例示的なエピトープは、９残基コアの側面にあるいずれかの 側で３残基を含む。例えば、ＰＡＰの位置１２４でコアエピトープを含む、１５
アミノ酸長の例示的エピトープは、ＡＡＬＦＰＰＥＧＶＳＩＷＮＰＩである。
【０１２９】 コア配列を含むＨＴＬエピトープはまた、１５アミノ酸以外の長さであり得る
（上記）。例えば、本発明のエピトープは、各側で９残基のすぐ近くに隣接する
９残基コアおよび１，２，３（例示的な１５マーにおいて）、４、または５個の
フランキング残基を含む配列を含む。
【０１３０】 本明細書中に記載されているように同定されたＨＬＡクラスＩまたはクラスＩ
Ｉペプチドエピトープの各々は、単にこの出願の本発明の一態様であるとみなさ
れる。さらに各ペプチドエピトープが任意のその他のペプチドエピトープと組合
せて用いられ得るということも、本出願の発明の一態様である。
【０１３１】 （ＩＶ．Ｅ．ワクチンの強化集団適用範囲） 商業的により発展可能であり、そして一般的にほとんどの人々に適用可能であ
るために、広範な集団適用範囲を有するワクチンが好ましい。広範な集団適用範
囲は、全体的に考えた場合に、ほとんどの集団に存在するＨＬＡ対立遺伝子に結
合するペプチドエピトープを選択することにより、本発明のペプチド（ならびに
／またはこのようなペプチドをコードする核酸組成物）を用いて得られ得る。表
ＸＸＩは、種々の民族におけるＨＬＡクラスＩスーパータイプの全体的頻度（表
ＸＸＩａ）ならびに、Ａ２−、Ａ３−およびＢ７−スーパータイプ（表ＸＸＩｂ
）により達成された併合集団適用範囲を示す。Ａ２−、Ａ３−およびＢ７スーパ
ータイプは、これら５つの主要民族群の各々において平均で４０％を超えて各々
存在する。８０％という過剰の適用範囲は、これらのスーパーモチーフの組合せ
により達成される。これらの結果は、有効かつ民族的偏りのない集団適用範囲が
、限定数の交差反応性ペプチドの使用時に達成されることを示唆する。これら３
つの主要ペプチド特異性により達成された集団適用範囲は高いが、付加的スーパ
ーモチーフまたは対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの使用時には、９５％
およびそれ以上の集団適用範囲に達するよう、そして真の多特異的応答をさらに
容易に達成するよう、適用範囲は拡張され得る。
【０１３２】 Ｂ４４−スーパータイプ、Ａ１−スーパータイプおよびＡ２４−スーパータイ
プは、これらの主要民族集団中に平均で２５％〜４０％の範囲で各々存在する（
表ＸＸＩａ）。全体的に低流布性であるが、しかしＢ２７−、Ｂ５８−およびＢ
６２スーパータイプは各々、少なくとも１つの主要民族群中に２５％より大きい
頻度で存在する（表ＸＸＩａ）。表ＸＸＩｂは、５つの主要民族群で同定された
ＨＬＡスーパータイプの組合せの流布概算値を概説する。Ａ２、Ａ３およびＢ７
適用範囲へのＡ１スーパータイプ、Ａ２４スーパータイプおよびＢ４４スーパー
タイプの含入により得られた適用範囲増分、ならびに本明細書中に記載された全
てのスーパータイプを用いて得られた適用範囲が示されている。
【０１３３】 Ａ２−、Ａ３−およびＢ７スーパータイプの従来の定義と一緒に本明細書中に
提示されたデータは、全ての抗原（Ａ２９、Ｂ８およびＢ４６は考え得る例外と
して）が全部で９つのＨＬＡスーパータイプに分類され得ることを示す。６つの
最も高頻度のスーパータイプからのエピトープを含入することにより、９９％と
いう平均集団適用範囲が５つの主要民族群に関して得られる。
【０１３４】 （ＩＶ．Ｆ．免疫応答刺激ペプチドアナログ（類似体、類縁体）） 概して、全体の抗原に対するＣＴＬおよびＨＴＬ応答は、全ての考え得るエピ
トープに対して向けられるというわけではない。むしろそれらは２〜３の「腫瘍
抗原」決定基（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）に拘
束される（Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，ら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５１
５９，１９７９；Ｂｅｎｎｉｋ，ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１９３５−
１９３９，１９８８；Ｒａｗｌｅ，ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３９７７
−３９８４，１９９１）。イムノドミナンス（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ ）（Ｂｅｎａｃｅｒｒａｆ，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １７５：２７３−２７９，１
９７２）は、特定のＨＬＡタンパク質を選択的に結合する（決定因子選択理論）
（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：１６３５，１９８３；
Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、Ｎａｔｕｒｅ ２６７：１５６〜１５８，１９７７）ま
たは既存のＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）特異性により選択的に認識される（レパート
リー理論）（Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣ
Ｅ ＯＦ ＳＥＬＦ／ＮＯＮＳＥＬＦ ＤＩＳＣＲＩＭＩＮＡＴＩＯＮ，Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２７０−３１０，１９
８２）所定のエピトープの能力のいずれかにより説明され得る。主としてプロセ
シング事象に結び付けられる付加的因子も、厳密な免疫原性を越えて、多数の考
え得る決定因子が主要抗原決定基として存在することを指令する場合に重要な役
割を演じ得る、ということが立証されている（Ｓｅｒｃａｒｚ，ら、Ａｎｎｕ．
Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：７２９−７６６，１９９３）。
【０１３５】 組織特異性および発生性ＴＡＡは、少なくともいくつかの時点で、または身体
内の少なくともいくつかの位置で正常組織上に発現されるため、それらに対する
Ｔ細胞、特にドミナント（ｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープは免疫監視中に排除さ
れ、そして寛容が誘導される、と予測され得る。しかしながら正常ドナーと癌患
者の両方において腫瘍エピトープに対するＣＴＬ応答が検出されており、これは
寛容が不完全であることを示し得る（例えば、Ｋａｗａｓｈｉｍａら、Ｈｕｍ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：１，１９９８；Ｔｓａｎｇ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｉｎｓｔ．８７：８２−９０，１９９５；Ｒｏｎｇｏｕｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１６３：１０３７，１９９９参照）。従って免疫寛容は、高親和性ＨＬ
ＡクラスＩ結合ペプチドを認識し得るＣＴＬ前駆体を完全には排除または不活性
化しない。
【０１３６】 寛容を克服するためのさらに別の戦略は、アナログ（類似体）ペプチドを用い
ることである。理論によって束縛されることを意図しないが、ドミナント（ｄｏ
ｍｉｎａｎｔ）エピトープに対するＴ細胞はクローン的に欠失され得るため、サ
ブドミナント（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープの選択が既存のＴ細胞を必
要にさせ得、これが次に治療的または予防的応答をもたらすことが考えられる。
しかしながらサブドミナント（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープとのＨＬＡ
分子の結合は、しばしばドミナント（ｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープとの結合よ
りも低強硬（ｖｉｇｏｒｏｕｓ）である。従って、１つまたはそれ以上のＨＬＡ
分子に対する特定の免疫原性エピトープの結合親和性を調整し、それにより、例
えばより強力な（ｖｉｇｏｒｏｕｓ）応答を引き出すアナログ（類似体）ペプチ
ドを調製するよう、ペプチドにより引き出される免疫応答を調整し得る必要があ
る。
【０１３７】 上記のスクリーニング手法により、スーパーファミリーの全ての対立遺伝子間
の適した交差反応性を有するペプチドが同定されているが、しかし交差反応性は
いつもできるだけ完全であるというわけではなく、ある場合には、ペプチドの交
差反応性を増大するための手法が有用であり得る；さらにこのような手法は、結
合親和性またはペプチド安定性のようなペプチドの他の特性を改質するためにも
用いられ得る。所定のモチーフまたはスーパーモチーフ内のＨＬＡ対立遺伝子に
対するペプチドの交差反応性を支配する一般原則が確立されれば、より広範な（
あるいはそうでなければ修飾された）ＨＬＡ結合能力を達成するために、当該特
定の目的のペプチドの構造の修飾（すなわちアナログ（類似体）化）が実施され
得る。より詳細には、最も広範な交差反応性パターンを示すペプチドが、本明細
書中の教示に従って生成され得る。アナログ（類似体）生成に関連した本発明の
概念は、米国同時係属出願の第０９／２２６，７７５号（１９９９年１月６日出 願 ）により詳細に記載されている。
【０１３８】 要するに、用いられる戦略は、ある種のＨＬＡ分子との結合と相関するモチー
フまたはスーパーモチーフを利用する。モチーフまたはスーパーモチーフは、一
次アンカーを、多くの場合には、二次アンカーを有することにより規定される。
アナログ（類似体）ペプチドは、一次アンカー、二次アンカーでのまたは一次お
よび二次アンカー位置のアミノ酸残基を置換することにより作製され得る。一般
にアナログ（類似体）は、モチーフまたはスーパーモチーフをすでに保有するペ
プチドに対して作製される。ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ結合ペプチドに関
して規定されていたスーパーモチーフおよびモチーフの好ましい二次アンカー残
基は、それぞれ表ＩＩおよびＩＩＩに示される。
【０１３９】 本発明に従う多数のモチーフまたはスーパーモチーフに関して、対立遺伝子特
異的ＨＬＡ分子、あるいはそれぞれのモチーフまたはスーパーモチーフを結合す
るＨＬＡスーパータイプのメンバーに結合することが有害である残基が規定され
る（表ＩＩおよびＩＩＩ）。従って結合に有害であるこのような残基の除去が、
本発明に従って実施され得る。例えばＡ３スーパータイプの場合には、このよう
な有害残基を有する全てのペプチドが、分析に用いられるペプチドの集団から除
去されると、交差反応性の発生率は、２２％から３７％に増大した（例えば、Ｓ
ｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、Ｈｕ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９，１９９６参照）。従
って、所定のスーパーモチーフ内のペプチドの交差反応性を改善するための一戦
略は、単に、ペプチド内に存在する１つ以上の有害残基を欠失させ、そして小「
中性」残基、例えばＡｌａ（ペプチドのＴ細胞認識に影響を及ぼし得ない）を置
換することである。ペプチド内の有害残基の排除とともに、対立遺伝子特異的Ｈ
ＬＡ分子とのまたはスーパーファミリー内の複数のＨＬＡ分子との高親和性結合
に関連した「好ましい」残基が挿入される場合に、交差反応性強化の可能性が、
予期される。
【０１４０】 アナログ（類似体）ペプチドが、ワクチンとして用いられる場合、インビボで
ネイティブな（ｎａｔｉｖｅ）エピトープに対するＣＴＬ応答を実際に惹起する
（またはクラスＩＩエピトープの場合は、野生型ペプチドと交差反応するヘルパ
ーＴ細胞を惹起する）ことを保証するために、アナログ（類似体）ペプチドが、
適切なＨＬＡ対立遺伝子の個体からインビトロでＴ細胞を免疫化するために用い
られ得る。その後、野生型ペプチド感作標的細胞の溶解を誘導する免疫化細胞の
能力が評価される。それは、内因的に産生された抗原が関連Ｔ細胞によっても認
識されるか否かを確定するために、適切な遺伝子で感染されたかまたはトランス
フェクトされた細胞であるか、あるいはクラスＩＩエピトープの場合には、全タ
ンパク質抗原でパルスされた細胞のいずれかである抗原提示細胞として用いるの
が望ましい。
【０１４１】 本発明の別の実施形態は、弱結合ペプチドのアナログ（類似体）を作製し、そ
れにより適正数の交差反応性細胞結合剤を保証することである。５００〜５００
０ｎＭの結合親和性を示し、かつ許容可能であるが、一方または両方の位置に最
適下限の一次アンカー残基を保有するクラスＩ結合ペプチドは、それぞれのスー
パータイプに従って好ましいアンカー残基を置換することにより「固定」され得
る。次に、アナログ（類似体）ペプチドは交差結合活性に関して試験され得る。
【０１４２】 有効なペプチドアナログ（類似体）を生成するための別の実施形態は、例えば
液体環境中でのペプチド安定性または溶解性に悪影響を及ぼす残基の置換を包含
する。この置換は、ペプチドエピトープの任意の位置で起こり得る。例えばシス
テインはαアミノ酪酸（本明細書中に列挙したペプチド配列に関する一文字略語
で「Ｂ」）を選択して置換され得る。その化学的性質のために、システインはジ
スルフィド架橋を形成する傾向を有し、そして結合能力を低減するのに十分なだ
けペプチドを構造的に変える。システインの代わりにα−アミノ酪酸を置換する
と、この問題が改善されるだけでなく、ある場合には結合および交差結合能力が
実際に改良される（例えば、Ｓｅｔｔｅら：Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ Ｖｉｒａｌ
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，編．Ｒ．Ａｈｍｅｄ ａｎｄ Ｉ．Ｃｈｅｎ，Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９９による概説を参照）
。
【０１４３】 （ＩＶ．Ｇ．スーパーモチーフ保有エピトープまたはモチーフ保有エピトープ に関する疾患関連抗原からのタンパク質配列のコンピュータースクリーニング） 標的抗原中のスーパーモチーフ保有ペプチドまたはモチーフ保有ペプチドを同
定するために、ネイティブなタンパク質配列、例えば腫瘍関連抗原、あるいは感
染生物体、または移植用ドナー組織由来の配列は、配列内のスーパーモチーフま
たはモチーフの存在を確定するために、知的計算またはコンピューターのような
演算のための手段を用いて、スクリーニングされる。ネイティブなペプチドの分
析から得られる情報は、ネイティブなペプチドの状態を評価するために直接用い
られ得るか、またはその後ペプチドエピトープを生成するために利用され得る。
【０１４４】 対象スーパーモチーフまたはモチーフの発生に関するタンパク質配列の迅速ス
クリーニングを可能にするコンピュータープログラムが、アナログ（類似体）ペ
プチドの生成を可能にするプログラムと同様に、本発明に包含される。これらの
プログラムは、任意の同定されたアミノ酸配列を分析するか、あるいは未知の配
列に関して作動し、同時に配列を確定して、そのモチーフ保有エピトープを同定
するために実行される。アナログ（類似体）も同様に同時に確定され得る。一般
に同定された配列は、病原性生物体または腫瘍関連ペプチド由来である。本発明
において、標的ＴＡＡ分子としては、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＡＰ、およびｈＫ２が
挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】 ペプチド結合の予測のために利用される選択判定基準は、実際の結合と最も効
率的に相関するためにできるだけ正確であることが重要である。適切な一次アン
カーの存在に基づいた、例えばＨＬＡ−Ａ＊０２０１に結合するペプチドの予測
は、約３０％の割合で有望である（例えば、Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ
７４：９２９，１９９３参照）。しかしながら、本明細書中に開示されるペプ
チド−ＨＬＡ結合データ、関連特許出願中のデータおよび当該技術のデータを広
範に分析することにより、本発明者らは、一次アンカー残基の単独での存在を基
礎にした同定を上回って予測値を劇的に増大する多数の対立遺伝子特異的多項式
アルゴリズムを開発した。これらのアルゴリズムは、一次アンカーの存在または
非存在だけでなく、二次アンカー残基（異なる位置での異なるアミノ酸の影響を
説明するため）の肯定的または有害な存在も考慮に入れる。アルゴリズムは本質
的には、ペプチド−ＨＬＡ相互作用の全親和性（または△Ｇ）が以下の型の一次
多項式関数として概算され得るという仮定に基づく： △Ｇ＝ａ１ｉｘａ２ｉｘａ３ｉ・・・・ｘａｎｉ （式中、ａ１ｉは、ｎ個のアミノ酸のペプチドの配列に沿って所定位置（ｉ）で
の所定アミノ酸（ｊ）の存在の影響を表す係数である）。この方法の重要な仮定
は、各位置での影響が本質的に互いに無関係であるということである。この仮定
は、ペプチドがＨＬＡ分子に結合され、かつ本質的に拡張配座におけるＴ細胞に
より認識されることを立証する研究により正当化される。特定のアルゴリズム係
数の誘導は、例えば、Ｇｕｌｕｋｏｔａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６
７：１２５８，１９９７に記載されている。
【０１４６】 また特異的モチーフを使用する好ましいペプチド配列を同定するためのさらに
別の方法としては、ニューラルネットワークおよび分子モデリングプログラムの
使用が挙げられる（例えば、Ｍｉｌｉｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ １６：７５３，１９９８；Ａｌｔｕｖｉａら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．５８：１，１９９７；Ａｌｔｕｖｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：
２４４，１９９５；Ｂｕｕｓ，Ｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１
：２０９−２１３，１９９９；Ｂｒｕｓｉｃ，Ｖ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔ
ｉｃｓ １４：１２１−１３０，１９９８；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１５２：１６３，１９９３；Ｍｅｉｓｔｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ １３：５
８１，１９９５；Ｈａｍｍｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３５３，１
９９４；Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：
５５５，１９９９参照）。
【０１４７】 例えば、少なくとも１つの好ましい二次アンカー残基を含有するＡ＊０２０１
モチーフ保有ペプチドのセット中では、任意の有害な二次アンカー残基の存在を
回避する一方で、ペプチドの６９％がＡ＊０２０１を結合し、ＩＣ５０は５００
ｎＭ未満である、ということが示されている（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ら、Ｃｅｌ
ｌ ７４：９２９，１９９３）。これらのアルゴリズムはまた、カットオフスコ
アが所望により、より大きいまたはより低い予測結合特性を有するペプチド組を
選定するよう調整され得るという点で、融通性がある。
【０１４８】 ペプチドエピトープを同定するためにコンピュータースクリーニングを利用す
る際、タンパク質配列または翻訳配列は、モチーフを検索するために開発された
ソフトウェア、例えば「ＦＩＮＤＰＡＴＴＥＲＮＳ」プログラム（Ｄｅｖｅｒｅ
ｕｘ，ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５，１９８４）
、あるいは適切なＨＬＡ結合モチーフを含有する潜在性ペプチド配列を同定する
ためのＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈ１．４ソフトウェアプログラム（Ｄ．Ｂｒｏｗｎ
，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて分析され得る。同定ペプチドは、特異的
ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ対立遺伝子を結合するそれらの能力を予測する
ために、カスタマイズド多項式アルゴリズムを用いてスコア付けされ得る。当業
者に理解されるように、既知または未知のペプチド配列を評価するために（例え
ばエピトープを同定するために、ペプチド長当たりのエピトープ濃度を同定する
ために、またはアナログ（類似体）を生成するために、ただし、これらに限定さ
れない）、コンピュータープログラミングソフトウェアおよびハードウェアオプ
ションの大型アレイが、本発明のモチーフを実行するために用いられ得る関連分 野 で利用可能である。
【０１４９】 上記の手法に従って、ＨＬＡスーパータイプ群または対立遺伝子特異的ＨＬＡ
分子を結合することが可能である前立腺癌関連抗原ペプチドエピトープおよびそ
のアナログが同定されている。
【０１５０】 （ＩＶ．Ｈ．ペプチドエピトープの調製） 本発明によるペプチドは、組換えＤＮＡ技術または化学合成により合成的に、
あるいはネイティブの腫瘍または病原性生物体のような天然供給源から調製され
得る。ペプチドエピトープは、別々に、またはポリエピトープペプチドとして合
成されてもよい。ペプチドは好ましくは他の天然に存在する宿主細胞タンパク質
およびそれらのフラグメントを実質的に含まないが、いくつかの実施形態では、
ペプチドはネイティブのフラグメントまたは粒子と合成的に結合され得る。
【０１５１】 本発明によるペプチドは、種々の長さであり得、そしてそれらの中性（非荷電
）形態または塩である形態のいずれかであり得る。本発明によるペプチドは、グ
リコシル化、側鎖の酸化またはリン酸化のような修飾を含まない；あるいはそれ
らは、修飾が本明細書中に記載されるようなペプチドの生物活性を破壊しないと
いう条件で、これらの修飾を含むかのいずれかである。
【０１５２】 可能な場合は、約８〜約１３、しばしば８〜１１、好ましくは９〜１０のアミ
ノ酸残基の長さに、ポリエピトープ構築物中で用いられ得るように、本発明のＨ
ＬＡクラスＩ結合エピトープを最適化するのが望ましくあり得る。本発明のＨＬ
ＡクラスＩＩ結合ペプチドエピトープは、約６〜約３０のアミノ酸長の長さ、好
ましくは約１３〜約２０の残基に最適化され得る。好ましくは、ペプチドエピト
ープは、関連ＨＬＡ分子に結合される内因的処理病原体由来ペプチドまたは腫瘍
細胞ペプチドとサイズが同等であるが、本発明のエピトープを含むペプチドの同
定および調製はまた、本明細書中に記載される技法を用いて実行され得る。
【０１５３】 代替的実施形態では、本発明のエピトープは、ポリエピトープペプチド、また
はポリエピトープペプチドをコードするミニジーンとして連結され得る。
【０１５４】 別の実施形態では、高濃度のクラスＩおよび／またはクラスＩＩエピトープを
含有するネイティブのペプチド領域を同定するのが好ましい。このような配列は
一般に、それがアミノ酸長当たり最大数のエピトープを含有することを基礎にし
て選択される。エピトープは入れ子式または重複様式で存在し得、例えば１０ア
ミノ酸長ペプチドは２つの９アミノ酸長エピトープおよび１つの１０アミノ酸長
エピトープを含有し得、細胞内プロセシング時には各エピトープは露出され得、 そして このようなペプチドの投与時にはＨＬＡ分子により結合され得ると理解さ
れるべきである。このより大きい、好ましくは多エピトープのペプチドは、合成
的に、組換え的に、またはネイティブの供給源からの切断により生成され得る。
【０１５５】 本発明のペプチドは、多種多様の方法で調製され得る。好ましい比較的短いサ
イズに関しては、ペプチドは慣用的技法にしたがって溶液中でまたは固体支持体
上で合成され得る。種々の自動合成機が市販されており、かつ既知のプロトコー
ルにしたがって用いられ得る（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ，ＳＯ
ＬＩＤ ＰＨＡＳＥ ＰＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，第２版，Ｐｉｅｒ
ｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，１９８４参照）。さらに個々のペプチドエピ
トープは、化学的連結を用いて連結されて、やはり本発明の範囲内であるより大 型な ペプチドを生成し得る。
【０１５６】 あるいは、目的の免疫原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が、発現ベ
クターに挿入され、適切な宿主細胞中に形質転換されるかまたはトランスフェク
トされ、そして発現に適した条件下で培養される組換えＤＮＡ技術が用いられ得
る。これらの手法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮ
Ｇ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ（１９８９）に一般に記載されているように、一般に当該技術で既知である
。したがって、本発明の１つまたはそれ以上のペプチド配列を含む組換えポリペ
プチドは、適切なＴ細胞エピトープを提示するために用いられ得る。
【０１５７】 本明細書中で意図される好ましい長さのペプチドエピトープに関する配列をコ
ードするヌクレオチドは、化学的技法により、例えばＭａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ
．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５ （１９８１）のホスホトリエス
テル法により合成され得る。ペプチドアナログは、ネイティブのペプチド配列を
コードするものの代わりに、適切なかつ所望の核酸塩基（単数または複数）を単
に置換することにより作製され得る；典型的な核酸置換例は、本明細書中のモチ
ーフ／スーパーモチーフにより規定されるアミノ酸をコードするものである。次
にコード配列は、適切なリンカーを提供され、そして当該分野で一般的に利用可
能な発現ベクター、ならびに適した宿主を形質転換するために用いられるベクタ
ーに連結されて、所望の融合タンパク質を産生し得る。多数のこのようなベクタ
ーおよび適した宿主系が目下利用可能である。融合タンパク質の発現に関しては
、コード配列は、作動可能に連結される開始および停止コドン、プロモーターお
よびターミネーター領域、ならびに通常は複製系を提供されて、所望の細胞宿主
中での発現のための発現ベクターを提供する。例えば、細菌宿主と適合性のプロ
モーター配列は、所望のコード配列の挿入に便利な制限部位を含有するプラスミ
ド中に提供される。その結果生じる発現ベクターは、適した細菌宿主中に形質転
換される。当然ながら、酵母、昆虫または哺乳類細胞宿主も、適したベクターお
よび制御配列を用いて使用され得る。
【０１５８】 （ＩＶ．Ｉ．Ｔ細胞応答を検出するためのアッセイ） いったんＨＬＡ結合ペプチドが同定されれば、それらはＴ細胞応答を引き出す
能力に関して試験され得る。モチーフ保有ペプチドの調製および評価は、ＰＣＴ
国際公開公報第９４／２０１２７号および同第９４／０３２０５号に記載されて
いる。要するに、特定の抗原からのエピトープを含むペプチドが合成され、そし て 適切なＨＬＡタンパク質に結合するそれらの能力に関して試験される。これら
のアッセイは、精製ＨＬＡクラスＩ分子への本発明のペプチドの結合を、放射性
ヨウ素標識参照ペプチドの結合に関して評価することを包含し得る。あるいは、
免疫蛍光染色および流動微小蛍光測定により、空のクラスＩ分子を発現する細胞
（すなわちその中にペプチドを欠く）が、ペプチド結合に関して評価され得る。
ペプチド結合を評価するために用いられ得るその他のアッセイとしては、ペプチ
ド依存性クラスＩアセンブリーアッセイおよび／またはペプチド競合によるＣＴ
Ｌ認識の抑制が挙げられる。典型的には５００ｎＭまたはそれ未満の親和性で、
クラスＩ分子に結合するこれらのペプチドは、感染または免疫化固体由来のＣＴ
Ｌに対する標的として役立つそれらの能力に関して、ならびに疾患と関連した選
定標的細胞と反応し得るＣＴＬ集団を生じ得る一次インビトロでのまたはインビ
ボでのＣＴＬ応答を誘導するそれらの能力に関して、さらに評価される。対応す
るアッセイは、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの評価のために用いられる。典型
的には１０００ｎＭまたはそれ未満の親和性にて結合することが示されているＨ
ＬＡクラスＩＩモチーフ保有ペプチドはさらに、ＨＴＬ応答を刺激する能力に関
して評価される。
【０１５９】 アナログアッセイは、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの評価のために使用され
る。代表的に１０００ｎＭ以下の親和性で結合が示されるＨＬＡクラスＩＩモチ
ーフ保有ペプチドは、さらに、ＨＴＬ応答を刺激する能力について評価される。
【０１６０】 Ｔ細胞応答を検出するために利用される慣用的アッセイとしては、増殖アッセ
イ、リンホカイン分泌アッセイ、直接的細胞傷害性アッセイおよび限界希釈アッ
セイが挙げられる。例えばペプチドとともにインキュベートされた抗原提示細胞
は、応答体細胞集団中でＣＴＬ応答を誘導する能力に関してアッセイされ得る。
抗原提示細胞は、末梢血単核細胞または樹状細胞のような正常細胞、であり得る
。あるいは内部処理ペプチドとともにクラスＩ分子を負荷する能力を欠き、かつ 適切なヒトクラスＩ遺伝子でトランスフェクトされた突然変異体非ヒト哺乳類細
胞系は、インビトロでの一次ＣＴＬ応答を誘導するペプチドの能力に関して試験
するために用いられ得る。
【０１６１】 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＣＴＬ前駆体の応答体細胞供給源として用い
られ得る。適切な抗原提示細胞は、ペプチドとともにインキュベートされ、その
後、ペプチド負荷抗原提示細胞が、最適化培養条件下にて応答体細胞集団ととも
にインキュベートされる。陽性ＣＴＬ活性化は、放射能標識標的細胞、両特異的
ペプチドパルス化標的、ならびにペプチド配列が由来する内因的処理形態の抗原
を発現する標的細胞を死滅するＣＴＬの存在に関して培養物をアッセイすること
により確定され得る。
【０１６２】 さらに、フルオレセイン標識ＨＬＡテトラマー複合体で染色することにより抗
原特異的Ｔ細胞の直接定量を可能にする方法が案出された（Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．
Ｄ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０３３０，
１９９３；Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４，１９９
６）。他の比較的最近の技術的開発としては、細胞内リンホカインに対する染色
およびインターフェロンγ放出アッセイまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイが挙げら
れる。テトラマー染色、細胞内リンホカイン染色およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
は全て、より慣用的アッセイより感度が少なくとも１０倍高いと思われる（Ｌａ
ｌｖａｎｉ，Ａ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９，１９９７；Ｄｕｎ
ｂａｒ，Ｐ．Ｒ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：４１３，１９９８；Ｍｕｒａｌ
ｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｋ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：１７７，１９９８）。
【０１６３】 ＨＴＬ活性化も、Ｔ細胞増殖およびリンホカイン、例えばＩＬ−２の分泌のよ
うな当業者に既知の技法を用いて評価され得る（例えば、Ａｌｅｘａｎｄａｒら
，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１−７６１，１９９４参照）。
【０１６４】 あるいは、ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫化を用いて、ペプチドエピ
トープの免疫原性を確定し得る。ヒトＡ２．１、Ａ１１（ＨＬＡ−Ａ３エピトー
プを分析するために付加的に用いられ得る）およびＢ７対立遺伝子を有するマウ
スを含むいくつかのトランスジェニックマウスモデルが特性化され、そして他の
もの（例えばＨＬＡ−Ａ１およびＡ２４に関するトランスジェニックマウス）が
開発されている。ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ３マウスモデルも開発され
ている。他のＨＬＡ対立遺伝子を有するさらに別のトランスジェニックマウスモ
デルが、必要な場合には生成され得る。マウスは不完全フロイントアジュバント
中に乳化されたペプチドで免疫化され得、そしてその結果生じるＴ細胞が、ペプ
チドパルス化標的細胞および適切な遺伝子でトランスフェクトされた標的細胞を
認識するそれらの能力に関して試験される。ＣＴＬ応答は、上記の細胞傷害性ア
ッセイを用いて分析され得る。同様に、ＨＴＬ応答は、Ｔ細胞増殖またはリンホ
カインの分泌のようなアッセイを用いて分析され得る。
【０１６５】 （ＩＶ．Ｊ．診断剤としてのおよび免疫応答を評価するためのペプチドエピト
ープの使用） 本発明の一実施形態では、本明細書中に記載されるようなＨＬＡクラスＩおよ
びクラスＩＩ結合ペプチドが、免疫応答を評価するための試薬として用いられる
。評価されるべき免疫応答は、試薬として用いられるべきペプチドエピトープ（
単数または複数）を認識し、かつそれに結合する抗原特異的ＣＴＬまたはＨＴＬ
の産生を結果として生じ得る任意の作用物質を免疫原として用いることにより誘
導される。ペプチド試薬は、免疫原として用いられる必要はない。このような分
析のために用いられるアッセイ系としては、テトラマー、細胞内リンホカインに
対する染色およびインターフェロン放出アッセイまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
のような比較的最近の技術的開発が挙げられる。
【０１６６】 例えば、本発明のペプチドは、腫瘍細胞抗原または免疫原への曝露後に抗原特
異的ＣＴＬの存在に関して末梢血単核細胞を評価するためのテトラマー染色アッ
セイに用いられる。ＨＬＡ−テトラマー複合体は、抗原特異的ＣＴＬを直接可視
化するために（例えば、Ｏｇｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：２１０３−２１０
６，１９９８、およびＡｌｔｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １７４：９４−９６，
１９９６参照）、および末梢血単核細胞サンプル中の抗原特異的ＣＴＬ集団の頻
度を確定するために用いられる。本発明のペプチドを用いるテトラマー試薬は、
以下のように生成される：ＨＬＡ分子に結合するペプチドが、対応するＨＬＡ重
鎖およびβ２−ミクログロブリンの存在下でリフォールディングされて、三分子
複合体を生成する。複合体は、タンパク質に予め操作された部位で重鎖のカルボ
キシル末端でビオチン化される。次にストレプトアビジンの添加により、テトラ
マー形成が誘導される。蛍光的標識ストレプトアビジンにより、テトラマーは抗
原特異的細胞を染色するために用いられ得る。次に細胞は、例えばフローサイト
メトリーにより同定され得る。このような分析は、診断または予後用途に用いら
れ得る。当該手法により同定される細胞は、治療用途にも用いられ得る。
【０１６７】 本発明のペプチドは、免疫リコール応答を評価するための試薬としても用いら
れる（例えば、Ｂｅｒｔｏｎｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０
３−５１３，１９９７およびＰｅｎｎａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１５
６５−１５７０，１９９１参照）。例えば、癌を有する個体からの患者ＰＢＭＣ
サンプルは、特異的ペプチドを用いて抗原特異的ＣＴＬまたはＨＴＬの存在に関
して分析される。単核細胞を含有する血液サンプルは、ＰＢＭＣを培養し、かつ 本発明のペプチドで細胞を刺激することにより評価され得る。適切な培養時間後
、増殖した細胞集団が、例えばＣＴＬに関してまたはＨＴＬ活性に関して分析さ
れ得る。
【０１６８】 ペプチドは、ワクチンの効力を評価するための試薬としても用いられる。免疫
原でワクチン接種された患者から得られるＰＢＭＣは、例えば上記方法のいずれ
かを用いて分析される。患者はＨＬＡ型分類され、そしてその患者に存在する対
立遺伝子特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬が分析のために選定され
る。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣサンプル中のエピトープ特異的ＣＴＬおよ
び／またはＨＴＬの存在により示される。
【０１６９】 本発明のペプチドは、当該分野で周知の技法を用いて抗体を作製するためにも
用いられ（例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯ
ＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１
９８９参照）、これは癌を診断またはモニターするための試薬として有用であり
得る。このような抗体としては、ＨＬＡ分子の情況でペプチドを認識するもの、
すなわちペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体が挙げられる。
【０１７０】 （ＩＶ．Ｋ．ワクチン組成物） 本明細書中に記載されるような免疫原的有効量の１つまたはそれ以上のペプチ
ドを含有するワクチンおよびワクチンの調製方法は、本発明のさらなる実施形態
である。いったん適切免疫原性エピトープが定義されれば、それらは種々の手段
により分類および送達され得、本明細書中では「ワクチン」組成物と呼ばれる。
このようなワクチン組成物としては、例えばリポペプチド（例えば、Ｖｉｔｉｅ
ｌｌｏ，Ａ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３４１，１９９５）、ポ
リ（ＤＬ−ラクチドコグリコド）（「ＰＬＧ」）微小球中に封入されるペプチド
組成物（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２
８７−２９４，１９９１；Ａｌｏｎｓｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ １２：２９９−３
０６，１９９４；Ｊｏｎｅｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：６７５−６８１，１９
９５参照）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）中に含入されるペプチド組成物（
例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：８７３−８７５，１９
９０；Ｈｕら，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：２３５−２４３，
１９９８参照）、多抗原ペプチド系（ＭＡＰｓ）（例えば、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５４０９−５４１
３，１９８８；Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９６：１７−３２，１９９６参照）、多価ペプチドとして処方されるペプチ
ド；弾道送達系での使用のためのペプチド、典型的には結晶化ペプチド、ウイル
ス送達ベクター（Ｐｅｒｋｕｓ，Ｍ．Ｅ．ら：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃ
ｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．，編，ｐ
．３７９，１９９６；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３２０
：５３５，１９８６；Ｈｕ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５３７，１９
８６；Ｋｉｅｎｙ，Ｍ．Ｐ．ら，ＡＩＤＳ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４
：７９０，１９８６；Ｔｏｐ，Ｆ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２４
：１４８，１９７１；Ｃｈａｎｄａ，Ｐ．Ｋ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７５：
５３５，１９９０）、ウイルスまたは合成起源の粒子（例えば、Ｋｏｆｌｅｒ，
Ｎ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９２：２５，１９９６；Ｅｌ
ｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３；
Ｆａｌｏ，Ｌ．Ｄ．，Ｊｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．７：６４９，１９９５
）、アジュバント（Ｗａｒｒｅｎ，Ｈ．Ｓ．，Ｖｏｇｅｌ，Ｆ．Ｒ．，およびＣ
ｈｅｄｉｄ，Ｌ．Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３６９，１９８
６；Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｖａｃｃｉｎｅ １１：２９３，１９９３）、リ
ポソーム（Ｒｅｄｄｙ，Ｒ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｍｏｌ．１４８：１５８５，１９
９２；Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：１３１，１９
９６）、あるいは裸または粒子吸収ｃＤＮＡ（Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２５９：１７４５，１９９３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｈｕｎ
ｔ，Ｌ．Ａ．，およびＷｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １１：９５
７，１９９３；Ｓｈｉｖｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃｃ
ｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．，編，ｐ．
４２３，１９９６；Ｃｅａｓｅ，Ｋ．Ｂ．，およびＢｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ａ
．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：９２３，１９９４、およびＥｌ
ｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３）
が挙げられ得る。レセプター媒介性ターゲッティングとしても既知の毒素標的化
送達技術、例えばＡｖａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ
．（Ｎｅｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のものも用いられ得る。
【０１７１】 本発明のワクチンとしては、核酸媒介性様相が挙げられる。本発明の１つまた
はそれ以上のペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡも、患者に投与され得る
。このアプローチは、例えばＷｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５
（１９９０）ならびに米国特許第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６
６号、同第５，８０４，５６６号、同第５，７３９，１１８号、同第５，７３６
，５２４号、同第５，６７９，６４７号、国際公開第９８／０４７２０号、およ
び以下にさらに詳細に記載される。ＤＮＡベースの送達技術の例としては、「裸
のＤＮＡ」促進（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、陽イオン性
脂質複合体、ならびに粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性送達が挙げ
られる（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号参照）。
【０１７２】 治療的または予防的免疫化用途のために、本発明のペプチドはまた、ウイルス
または細菌ベクターによって発現され得る。発現ベクターの例としては、ワクシ
ニアまたはファウルポックスのような弱毒ウイルス宿主が挙げられる。このアプ
ローチの一例として、ワクシニアウイルスは、本発明のペプチドをコードするヌ
クレオチド配列を発現するためのベクターとして用いられる。腫瘍を保有する宿
主中への導入時に、組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、
それにより宿主ＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を引き出す。免疫化プロトコー
ルに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４，７２２，８
４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍ
ｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒら，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３５１：４５６−４６０（１９９１）に記載されている。本発明のペプ
チドの治療的投与または免疫化に有用な多種多様の他のベクター、例えばアデノ
およびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ ｔｙｐｈｉベクター、解毒炭疽毒素ベクター等は、本明細書中の説明か
ら、当業者には明らかである。
【０１７３】 さらに、本発明によるワクチンは、１つ以上の特許請求するペプチドの組成物
を包含する。ペプチドは、ワクチン中に別々に存在し得る。あるいはペプチドは
、同一ペプチドの多数のコピーを含むホモポリマーとして、または種々のペプチ
ドのヘテロポリマーとして存在し得る。ポリマーは、免疫学的反応増大という利
点を有し、そして異なるペプチドエピトープがポリマーを製造するために用いら
れる場合、免疫応答のために標的化された、病原性生物体または腫瘍関連ペプチ
ドの異なる抗原決定因子と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導するさらな
る能力を有する。この組成物は、抗原の天然に存在する領域であり得るか、ある
いは例えば組換え的にまたは化学合成により調製され得る。
【０１７４】 本発明のワクチンとともに用いられ得るキャリアは当該分野で周知であり、例
えばチログロブリン、ヒト血清アルブミンのようなアルブミン、破傷風毒素、ポ
リＬ−リシン、ポリＬ−グルタミン酸のようなポリアミノ酸、インフルエンザ、
Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などが挙げられる。ワクチンは、生理学的に耐
容可能な（すなわち許容可能な）希釈剤（例えば水または生理食塩水、好ましく
はリン酸塩緩衝塩類溶液）を含有し得る。ワクチンはまた典型的には、アジュバ
ントを含む。不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アル
ミニウムまたはミョウバンのようなアジュバントが、当該分野で周知の物質の例
である。さらに、本明細書中に開示されるように、ＣＴＬ応答は、例えばトリパ
ルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）のよう
な脂質に本発明のペプチドを結合することによりプライミングされ得る。
【０１７５】 注射、エアロゾル、経口、経皮、経粘膜、胸膜腔内、鞘内またはその他の適し た 経路を介しての本発明によるペプチド組成物での免疫化時に、宿主の免疫系は
、所望の抗原に特異的な大量のＣＴＬおよび／またはＨＴＬを産生することによ
り、ワクチンに応答する。その結果として、宿主はその後の感染に対して少なく
とも部分的に免疫を持つようになるか、または進行中の慢性感染の発症に対して
少なくとも部分的に耐性となるか、あるいは抗原が腫瘍関連性である場合には、
少なくともいくつかの治療的有益性を引き出す。
【０１７６】 いくつかの実施形態では、クラスＩペプチド構成成分を、目的の標的抗原に対
して中和抗体および／またはヘルパーＴ細胞応答を誘導または容易にする構成成
分と組み合わせることが望ましくあり得る。このような組成物の好ましい実施形
態は、本発明によるクラスＩおよびクラスＩＩエピトープを含む。このような組
成物の代替的実施形態は、本発明によるクラスＩおよび／またはクラスＩＩエピ
トープを、ＨＬＡクラスＩＩ交差反応性結合分子、例えばＰＡＤＲＥＴＭ（Ｅｐ
ｉｍｍｕｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）分子とともに含む（例えば米国特許
第５，７３６，１４２号に記載されている）。
【０１７７】 本発明のワクチンはまた、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば樹状細胞（ＤＣ）
）を本発明のペプチドを提示するためのビヒクルとして含み得る。ワクチン組成
物は、樹状細胞動員および収集（それにより樹状細胞の充填がインビトロで起こ
る）後にインビトロで作製され得る。例えば樹状細胞は、例えば本発明によるミ
ニジーンによりトランスフェクトされ、またはペプチドによりパルス刺激される
。次に樹状細胞は、インビボで免疫応答を引き出すために患者に投与され得る。
【０１７８】 ＤＮＡまたはペプチドベースのいずれかのワクチン組成物もまた、樹状細胞動
員（それにより樹状細胞の充填がインビボで起こる）と組合せて、インビボで投
与され得る。
【０１７９】 抗原性ペプチドは、同様にＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答をエキソビボで誘 発するために使用される 。その結果生じるＣＴＬまたはＨＴＬ細胞は、他の慣用
的形態の治療に応答しないか、または本発明による治療用ワクチンペプチドまた
は核酸に応答しない患者において、腫瘍を治療するために使用され得る。特定の
腫瘍関連抗原に対するエキソビボＣＴＬまたはＨＴＬ応答は、患者のまたは遺伝
子的に適合性のＣＴＬまたはＨＴＬ前駆細胞を、樹状細胞のような抗原提示細胞
の供給源、および適切な免疫原性ペプチドと一緒に組織培養物中でインキュベー
トすることにより誘導される。前駆細胞が活性化され、エフェクター細胞に膨張
される適切なインキュベーション時間（典型的には約７〜２８日）後、細胞は患
者に注入し戻され、そこでそれらはそれらの特異的標的細胞（感染細胞または腫
瘍細胞）を破壊し（ＣＴＬ）、または破壊を促す（ＨＴＬ）。トランスフェクト
された樹状細胞も、抗原提示細胞として用いられ得る。
【０１８０】 本発明のワクチン組成物はまた、癌のために用いられるその他の治療と併用し
て、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ等のような免疫アジュバントと
組合せても使用され得る。
【０１８１】 好ましくは、ワクチン中に用いるためにポリエピトープ組成物中に含入するた
めにエピトープのアレイを選定する場合、あるいはワクチン中に含入される、お
よび／またはミニジーンのような核酸によりコードされる別々のエピトープを選
定するために、以下の原理が利用される。選定を行なうためには、以下の原理の
各々が釣り合っているのが好ましい。所定のワクチン組成物中に組み込まれる多
数のエピトープは、エピトープが得られる天然抗原中の配列にて連続的であり得
るが、そうである必要はない。
【０１８２】 １．）投与時に、腫瘍クリアランスと相関することが観察された免疫応答を模
倣するエピトープが選択される。ＨＬＡクラスＩに関しては、これは少なくとも
１つのＴＡＡからのものである３〜４個のエピトープを含む。ＨＬＡクラスＩＩ
に関しては、同様の論理的根拠が用いられ、これも３〜４個のエピトープが少な
くとも１つのＴＡＡから選定される（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２７８：１４４７−１４５０参照のこと）。１つのＴＡＡ由来のエピト
ープは、１つ以上のさらなるＴＡＡからのエピトープと組合せて用いられて、例
えば実施例１５に記載されているように、高頻度発現ＴＡＡの変化する発現パタ
ーンで腫瘍を標的にするワクチンを生産し得る。
【０１８３】 ２．）免疫原性と相関することが確立された必要な結合親和性を有するエピト
ープが選定される。ＨＬＡクラスＩに関してはＩＣ５０は５００ｎＭまたはそれ
未満、しばしば２００ｎＭまたはそれ未満、クラスＩＩに関してはＩＣ５０は１
０００ｎＭまたはそれ未満である。
【０１８４】 ３．）広範な集団適用範囲を与えるのに十分なスーパーモチーフ保有ペプチド
、または対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイが選定される。
例えば、少なくとも８０％の集団適用範囲を有するのが好ましい。目的の分野で
既知の統計学的評価であるモンテカルロ分析が、集団適用範囲の広さまたは重剰
性を評価するために用いられ得る。
【０１８５】 ４．）癌関連抗原からエピトープを選定する場合、患者は天然エピトープに対
する寛容を発生し得るため、アナログを選定するのがしばしば有用である。感染
性疾患関連抗原に関するエピトープを選定する場合は、天然または類似させたエ
ピトープを選定するのが好ましい。
【０１８６】 ５．）特に関連があるのは、「入れ子構造（ｎｅｓｔｅｄ）エピトープ」と呼
ばれるエピトープである。入れ子構造エピトープは、所定のペプチド配列中に少
なくとも２つのエピトープが重複する場合に起こる。入れ子構造ペプチド配列は
、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩエピトープの両方を含み得る。入れ子
構造エピトープを提供する場合、一般的目的は、１配列当たり最大数のエピトー
プを提供することである。したがって一つの局面は、ペプチド中のアミノ末端エ
ピトープのアミノ末端およびカルボキシル末端エピトープのカルボキシル末端よ
り任意に長いペプチドを提供するのを避けることである。入れ子構造エピトープ を含む配列 のような多エピトープ配列を提供する場合、病理学的またはその他の
有害な生物学的特性を有さないことを保証するために、配列をスクリーニングす
ることが一般的に重要である。
【０１８７】 ６．）ポリエピトープタンパク質が作製されるか、またはミニジーンを作製す
る場合、目的のエピトープを包含する最小ペプチドを生成することが目的である
。この原理は、入れ子構造ペプチドを含むペプチドを選択する場合に用いられる
のと同様でない場合には、類似する。しかしながら人工ポリエピトープペプチド
を用いる場合、サイズ最小化の目的物は、ポリエピトープタンパク質中のエピト
ープ間に任意のスペーサー配列を組み込む必要性に対して平均化する。スペーサ
ーアミノ酸残基は、例えば結合（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ）エピトープ（免疫系に
より認識され、標的抗原中に存在せず、エピトープの人工並置によってのみ作製
されるエピトープ）を回避するために、あるいはエピトープ間の切断を促し、そ
れによりエピトープ提示を高めるために導入され得る。結合エピトープは一般に
、回避される。なぜなら、レシピエントが非天然ペプチドに対して免疫応答を生
じ得るからである。特に重要なのは、「ドミナント（ｄｏｍｉｎａｎｔ）エピト
ープ」である結合エピトープである。ドミナント（ｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトー
プは、他のエピトープに対する免疫応答が縮小されるかまたは抑制されるような 激しい 応答を引き起こし得る。
【０１８８】 （ＩＶ．Ｋ．１．ミニジーンワクチン） 多数のエピトープの同時送達を可能にする多数の異なるアプローチが利用可能
である。本発明のペプチドをコードする核酸は、本発明の特に有用な実施形態で
ある。ミニジーンに含入するためのエピトープは、好ましくは前節に記載した指
針にしたがって選択される。本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ま
しい手段は、本発明の１つまたは多数のエピトープを含むペプチドをコードする
ミニジーン構築物を使用する。
【０１８９】 多エピトープミニジーンの使用は、以下に、ならびに例えば米国同時係属出願
第０９／３１１，７８４号、Ｉｓｈｉｏｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：
３９１５−３９２５，１９９９；Ａｎ，Ｌ．およびＷｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．，
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２２９２，１９９７；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：８２２，１９９６；Ｗｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．ら、 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３４８，１９９３、Ｈａｎｋｅ，Ｒ．ら、Ｖａｃｃｉｎ
ｅ １６：４２６，１９９８に記載されている。例えば、１つ以上の前立腺癌関
連抗原の複数の領域由来のスーパーモチーフおよび／またはモチーフ保有ＰＳＡ
、ＰＳＭ、ＰＡＰ、およびｈＫ２エピトープ、普遍的（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ヘ
ルパーＴ細胞エピトープ、ＰＡＤＲＥＴＭ（またはＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＡＰ、お
よびｈＫ２由来の多ＨＴＬエピトープ）、および小胞体翻訳シグナル配列をコー
ドする多エピトープＤＮＡプラスミドが、操作され得る。ワクチンは、他のＴＡ
Ａ由来のエピトープもまた含む。
【０１９０】 多エピトープミニジーンの免疫原性は、試験されるエピトープに対するＣＴＬ
誘導応答の規模を評価するためにトランスジェニックマウスで試験され得る。さ
らにＤＮＡコードエピトープのインビボでの免疫原性は、ＤＮＡプラスミドでト
ランスフェクトされた標的細胞に対する特異的ＣＴＬ系のインビトロ応答と相関
し得る。したがってこれらの実験は、ミニジーンが、１）ＣＴＬ応答を生じるこ
と、および２）誘導ＣＴＬが、コードされるエピトープを発現する細胞を認識す
るのに役立つことの両方を示し得る。
【０１９１】 例えば、ヒト細胞中での発現のための選定エピトープをコードするＤＮＡ配列
（ミニジーン）を作製するために、エピトープのアミノ酸配列は逆翻訳されても
よい。ヒトコドン使用法表は、各アミノ酸に対するコドン選択を指示するために 使用さ れ得る。これらのエピトープコードＤＮＡ配列は、翻訳される場合、連続
ポリペプチド配列が作られるように、直接隣接され得る。発現および／または免
疫原性を最適化するために、ミニジーン設計にさらなる要素が組み込まれ得る。
逆翻訳され、ミニジーン配列中に含入され得るアミノ酸配列の例としては、以下
のものが挙げられる：ＨＬＡクラスＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ
、ユビキチン結合シグナル配列および／または小胞体標的化シグナル。さらに、
ＣＴＬおよびＨＴＬエピトープのＨＬＡ提示は、ＣＴＬまたはＨＴＬエピトープ
に隣接する合成（例えばポリアラニン）または天然に存在する隣接配列を含入す
ることにより改善され得る。エピトープ（単数または複数）を含むこれらの大型
ペプチドは、本発明の範囲内である。
【０１９２】 ミニジーン配列は、ミニジーンのプラスおよびマイナス鎖をコードするオリゴ
ヌクレオチドを集合することによりＤＮＡに変換され得る。周知の技法を用いて
適切な条件下で、重複オリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）が合成され、
リン酸化され、精製され、アニーリングされ得る。オリゴヌクレオチドの末端は
、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結される。次に、エピトープポリペプチ
ドをコードするこの合成ミニジーンは所望の発現ベクター中にクローン化され得
る。
【０１９３】 当業者に周知の標準調節配列は、好ましくは標的細胞中での発現を保証するた
めにベクター中に含入される。以下のようないくつかのベクター要素が望ましい
：ミニジーン挿入のための下流クローニング部位を有するプロモーター；効率的
転写終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点；およびＥ． ｃｏｌｉ 選択可能マーカー（例えばアンピシリンまたはカナマイシン耐性）。こ
の目的のために、例えばヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターの
ような多数のプロモーターが用いられ得る。他の適切なプロモーター配列に関し
ては、例えば米国特許第５，５８０，８５９号および第５，５８９，４６６号を
参照のこと。
【０１９４】 ミニジーン発現および免疫原性を最適化するためには、さらなるベクター改変
が望ましくあり得る。いくつかの場合、効率的遺伝子発現のためにイントロンが
必要であり、１つ以上の合成または天然に存在するイントロンが、ミニジーンの
転写領域に組み込まれ得る。哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡ安定化配列および複
製用配列の含入もまた、ミニジーン発現増大のために考慮され得る。
【０１９５】 一旦発現ベクターが選定されれば、ミニジーンはプロモーターの下流のポリリ
ンカー領域にクローン化される。このプラスミドは、適切なＥ．ｃｏｌｉ株中で
形質転換され、標準技法を用いてＤＮＡが調製される。ミニジーンの配向および
ＤＮＡ配列、ならびにベクター中に含入されるすべてのその他の要素が、制限マ
ッピングおよびＤＮＡ配列分析を用いて確認される。正しいプラスミドを保有す
る細菌細胞は、マスター細胞バンクおよび作業用細胞バンクとして貯蔵され得る
。
【０１９６】 さらに、免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）は、ＤＮＡワクチンの免疫原性
にて役割を果たすようである。これらの配列は、免疫原性を強化するのが望まし
い場合には、ミニジーンコード配列の外側の、ベクター中に含入され得る。
【０１９７】 いくつかの実施形態では、ミニジーンにコードされるエピトープおよび第二の
タンパク質（免疫原性を強化または低減するために含入される）の両方の産生を
可能にする２シストロン発現ベクターが用いられ得る。同時発現された場合に有
益に免疫応答を高め得るタンパク質またはポリペプチドの例としては、サイトカ
イン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導性分
子（例えばＬｅＩＦ）、同時刺激分子、あるいはＨＴＬ応答に関しては、汎ＤＲ
（ｐａｎ−ＤＲ）結合タンパク質（ＰＡＤＲＥＴＭ、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内 標的化 シグナルに連結され、発現ＣＴＬとは別個に発現される。これは、ＣＴＬ
エピトープの場合と異なる細胞区画へのＨＴＬエピトープの誘導を可能にする。
必要な場合、これはＨＬＡクラスＩＩ経路へのＨＴＬエピトープのより効率的侵
入を促し、それによりＨＴＬ誘導を改良し得る。ＨＴＬまたはＣＴＬ誘導に対比
して、免疫抑制分子（例えばＴＧＦ−β）の同時発現による免疫応答の特異的低
減は、ある種の疾患においては有益であり得る。
【０１９８】 治療的量のプラスミドＤＮＡは、例えばＥ．ｃｏｌｉにおける発酵、続く精製
により生産され得る。作業用細胞バンク由来のアリコートを用いて、増殖培地に
接種し、周知の技法にしたがって振盪フラスコまたはバイオリアクター中で飽和
するまで増殖させる。プラスミドＤＮＡは、標準生物分離技法（例えばＱＩＡＧ
ＥＮ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により供給される
固相陰イオン交換樹脂）を用いて精製され得る。必要な場合、ゲル電気泳動また
はその他の方法を用いて、スーパーコイルＤＮＡが開環および線状形態から単離
され得る。
【０１９９】 精製プラスミドＤＮＡは、種々の処方物を用いた注射用に調製され得る。これ
らのうち最も簡単なのは、滅菌リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中での凍結
乾燥されたＤＮＡの再構成である。「裸のＤＮＡ」として既知のこのアプローチ
は、一般に臨床試験における筋肉内（ＩＭ）投与用に用いられている。ミニジー
ンＤＮＡワクチンの免疫治療効果を最大にするためには、精製プラスミドＤＮＡ
を処方するための代替的方法が望ましくあり得る。種々の方法が記載されており
、新規の技法が利用可能になり得る。陽イオン性脂質、糖脂質およびフソゲン性
（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソームも処方物中に用いられ得る（例えば、国際公
開９３／２４６４０；ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｂ
ｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２ （１９８８）；米国特許第５
，２７９，８３３号；国際公開９１／０６３０９およびＦｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒ
ｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３ （１９８７）参照 のこと ）。さらに、総称して保護的、相互作用的、非縮合化合物（ＰＩＮＣ）と
呼ばれるペプチドおよび化合物もまた、精製プラスミドＤＮＡと複合体化されて
、安定性、筋肉内分散または特定の器官または細胞型への輸送のような変数（変
量）に影響を及ぼし得る。
【０２００】 標的細胞感作は、ミニジーンコードＣＴＬエピトープの発現およびＨＬＡクラ
スＩ提示に関する機能性アッセイとして用いられ得る。例えばプラスミドＤＮＡ
は、標準ＣＴＬクロム放出アッセイのための標的として適した哺乳動物細胞系中
に導入される。用いられるトランスフェクション方法は、最終処方物に依存する
。エレクトロポレーションは、「裸の」ＤＮＡのために用いられ、一方、陽イオ
ン性脂質は、直接インビトロトランスフェクションを可能にする。グリーン蛍光
タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドは、同時トランスフェクトされて、
蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いたトランスフェクト化された細胞の富化
を可能にする。これらの細胞は次に、クロム−５１（５１Ｃｒ）標識されて、エ
ピトープ特異的ＣＴＬ系に対する標的細胞として使用される。５１Ｃｒ放出によ
り検出される細胞溶解は、ミニジーンコードＣＴＬエピトープの産生およびＨＬ
Ａ提示の両方を示す。ＨＴＬエピトープの発現は、ＨＴＬ活性を評価するために
アッセイを用いて同様の方法で評価され得る。
【０２０１】 インビボ免疫原性は、ミニジーンＤＮＡ処方物の機能性試験のための第２のア
プローチである。適切なヒトＨＬＡタンパク質を発現するトランスジェニックマ
ウスは、ＤＮＡ産物で免疫化される。投与の用量および経路は、処方物依存性で
ある（例えばＰＢＳ中のＤＮＡに関してはＩＭ、脂質複合化ＤＮＡに関しては腹
腔内（ＩＰ））。免疫化後２１日目に、脾臓細胞を収集し、試験される各エピト
ープをコードするペプチドの存在下で１週間再刺激した。その後、ＣＴＬエフェ
クター細胞に関しては、アッセイは、標準技法を用いて、ペプチド充填５１Ｃｒ
標識標的細胞の細胞溶解に関して実行される。ミニジーンコードエピトープに対
応するペプチドエピトープを負荷されたＨＬＡにより感作された標的細胞の溶解
は、ＣＴＬのインビボ誘導に関するＤＮＡワクチン機能を立証する。ＨＴＬエピ
トープの免疫原性は、同様の方法で、トランスジェニックマウスで評価される。
【０２０２】 あるいは、核酸は、例えば米国特許第５，２０４，２５３号に記載されるよう
に弾道送達を用いて投与され得る。この技法を用いて、ＤＮＡ単独で構成される
粒子が投与される。さらなる代替的実施形態では、ＤＮＡは粒子、例えば金粒子
に付着される。
【０２０３】 ミニジーンはまた、当該分野で周知のその他の細菌またはウイルス送達系を用
いても送達され得る。例えば本発明のエピトープをコードする発現構築物は、ワ
クシニアのようなウイルスベクター中に組み込まれ得る。
【０２０４】 （ＩＶ．Ｋ．２．ＣＴＬペプチドのヘルパーペプチドとの組合せ） 本発明のペプチドを含むワクチン組成物は、所望の属性（例えば血清半減期の
改良）を提供するために、または免疫原性を高めるために改変され得る。
【０２０５】 例えば、ペプチドがＣＴＬ活性を誘導する能力は、Ｔヘルパー細胞応答を誘導
し得る少なくとも１つのエピトープを含有する配列にペプチドを連結することに
より高められ得る。免疫原性を高めるためのＣＴＬエピトープを伴うＴヘルパー
エピトープの使用は、例えば米国同時係属出願第０８／８２０，３６０号、第０
８／１９７，４８４号および第０８／４６４，２３４号に例示されている。
【０２０６】 ＣＴＬペプチドは、Ｔヘルパーペプチドに直接連結され得るが、しかし多くの
場合ＣＴＬエピトープ／ＨＴＬエピトープ結合体はスペーサー分子により連結さ
れる。スペーサーは典型的には、生理学的条件下で実質的に荷電されない、比較
的小型の中性分子、例えばアミノ酸またはアミノ酸模倣体で構成される。スペー
サーは、典型的には、例えばＡｌａ、Ｇｌｙ、または非極性アミノ酸または中性
極性アミノ酸のその他の中性スペーサーから選択される。任意に存在するスペー
サーは同一残基で構成される必要はなく、したがってヘテロまたはホモオリゴマ
ーであってもよいと理解される。存在する場合、スペーサーは通常、少なくとも
１つまたは２つの残基、さらに通常は３〜６つの残基、場合によっては１０また
はそれを超える残基である。ＣＴＬペプチドエピトープは、直接またはスペーサ
ーを介して、ＣＴＬペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端でＴヘルパーペ
プチドエピトープに連結され得る。免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチド
のいずれかのアミノ末端は、アシル化され得る。
【０２０７】 ある種の実施形態では、Ｔヘルパーペプチドは、大多数の集団中に存在するＴ
ヘルパー細胞により認識されるものである。これは多数の、ほとんどの、または
全てのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するアミノ酸配列を選定することにより達成 さ れ得る。これらは「ゆるくＨＬＡ拘束された」または「混然とした」Ｔヘルパ
ー配列として既知である。混然としたペプチドの例としては、位置８３０〜８４
３（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ）での破傷風毒素、位置３７８〜３９８（Ｄ
ＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ）でのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａ
ｌｃｉｐａｒｕｍ（熱帯熱マラリア原虫）スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質
、および位置１１６（ＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡ）でのＳｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ（連鎖球菌）１８ｋＤタンパク質のような抗原からの配列が挙げら
れる。その他の例としては、ＤＲ１−４−７スーパーモチーフ、またはＤＲ３モ
チーフのいずれかを保有するペプチドが挙げられる。
【０２０８】 あるいは、天然には見出されないアミノ酸配列を用いて、ゆるくＨＬＡ拘束さ
れた様式で、Ｔヘルパーリンパ球を刺激し得る合成ペプチドを調製することがで
きる（例えば、国際公開公報第９５／０７７０７号参照）。汎ＤＲ結合エピトー
プ（例えばＰＡＤＲＥ（商標）、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，ＣＡ）と呼ばれるこれらの合成化合物は、最も好ましくはほとんどのＨＬ
Ａ−ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子を結合するよう設計される。例えば、次
式：ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（式中、「Ｘ」はシクロヘキシルアラニン、フ
ェニルアラニンまたはチロシンであり、「ａ」はＤ−アラニンまたはＬ−アラニ
ンである）を有する汎ＤＲ結合エピトープペプチドは、ほとんどのＨＬＡ−ＤＲ
対立遺伝子に結合し、それらのＨＬＡ型とは関係なく、ほとんどの個体からのＴ
ヘルパーリンパ球の応答を刺激することが判明した。汎ＤＲ結合エピトープの代
替物は、全ての「Ｌ」型天然アミノ酸を含み、エピトープをコードする核酸の形
態で提供され得る。
【０２０９】 ＨＴＬペプチドエピトープも、それらの生物特性を改変するよう修飾され得る
。例えばそれらは、プロテアーゼに対するそれらの耐性を増大させ、したがって
それらの血清半減期を延長するためにそれらのＤ−アミノ酸を含入するよう修飾
され得るか、あるいはそれらはその生物活性を増大するために脂質、タンパク質
、炭水化物等のようなその他の分子と結合され得る。例えばＴヘルパーペプチド
は、アミノまたはカルボキシル末端で、１つまたはそれ以上のパルミチン酸鎖と
結合され得る。
【０２１０】 （ＩＶ．Ｋ．３．Ｔ細胞プライミング剤とのＣＴＬペプチドの組合せ） いくつかの実施形態では、細胞傷害性Ｔリンパ球をプライミングする少なくと
も１つの構成成分を本発明の薬学的組成物中に含むのが望ましくあり得る。脂質
はウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬをプライミングし得る作用物質である
と同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、リシン残基のε−アミノ基お
よびα−アミノ基に結合され、次に１つまたはそれ以上の連結残基、例えばＧｌ
ｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ等を介して免疫原性ペプチドに
連結される。次に脂質化ペプチドは、ミセルまたは粒子中に直接投与され、リポ
ソーム中に組み込まれるか、あるいはアジュバント、例えば不完全フロイントア
ジュバント中で乳化され得る。好ましい免疫原性組成物は、Ｌｙｓのε−アミノ 基 およびα−アミノ基に結合されるパルミチン酸を含み、これは、結合（例えば
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）を介して免疫原性ペプチドのアミノ末端に結合される。
【０２１１】 ＣＴＬ応答の脂質プライミングの別の例として、Ｅ．ｃｏｌｉリポタンパク質
（例えばトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ ＣＳＳ））は、適切なペプチドと共有結合される場合、ウイルス特異的ＣＴＬを
プライミングするために用いられ得る（例えば、Ｄｅｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ
３４２：５６１，１９８９参照）。本発明のペプチドは、例えば標的抗原に対す
るＣＴＬ応答を特異的にプライミングするために個体に投与されるリポペプチド
であるＰ３ＣＳＳに結合され得る。さらに中性抗体の誘導も、Ｐ３ＣＳＳ結合エ
ピトープでプライミングされ得るので、２つのこのような組成物は、より効率的
に体液および細胞媒介性応答を引き出すために併合され得る。
【０２１２】 ＣＴＬおよび／またはＨＴＬペプチドは、互いにペプチドを連結するのを容易
にする、キャリア支持体またはより大きなペプチドにカップリングする、ペプチ
ドまたはオリゴペプチドの物理的または化学的特性を修飾する、などのためにペ
プチドの末端にアミノ酸を付加することによっても修飾され得る。アミノ酸、例
えばチロシン、システイン、リシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸などは
、ペプチドまたはオリゴペプチド、特にクラスＩペプチドのＣまたはＮ−末端に
導入され得る。しかしながら、ＣＴＬエピトープのカルボキシル末端の修飾は、
いくつかの場合には、ペプチドの結合特性を変更し得るということに留意すべき
である。さらにペプチドまたはオリゴペプチド配列は、末端ＮＨ２アシル化（例
えばアルカノイル（Ｃ１〜Ｃ２０）またはチオグリコリルアセチル化）、末端カ
ルボキシルアミド化（例えばアンモニア、メチルアミン等）により修飾されるこ
とにより天然配列と異なり得る。いくつかの場合には、これらの修飾は、支持体
またはその他の分子に結合するための部位を提供し得る。
【０２１３】 （ＩＶ．Ｋ．４．ＣＴＬおよび／またはＨＴＬペプチドでパルス化されたＤＣ
を含むワクチン組成物） 本発明のワクチン組成物の実施形態は、エピトープ保有ペプチドのカクテルを
患者血液からＰＢＭＣまたはそこからの単離ＤＣへエキソビボで投与することを
包含する。ＤＣの収集を促すための薬剤、例えばＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ
（商標）（Ｍｏｎｓａｎｔｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／
ＩＬ−４が用いられ得る。ペプチドを用いて、ＤＣをパルス化後、かつ患者への
再注入前にＤＣを洗浄して非結合ペプチドを除去する。この実施形態では、ワク
チンは、それらの表面にＨＬＡ分子と複合体を形成するパルス化ペプチドエピト
ープを提示するペプチドパルス化ＤＣを含む。
【０２１４】 ＤＣは、ペプチドのカクテルを用いてエキソビボでパルス化され得、そのうち
のいくつかは、１つ以上の目的の抗原（例えば前立腺関連抗原（例えばＰＳＡ、
ＰＳＭ、ＰＡＰ、カリクレインなど））に対するＣＴＬ応答を刺激する。必要に
応じて、ヘルパーＴ細胞ペプチド、例えばＰＡＤＲＥ（登録商標）ファミリー分
子は、ＣＴＬ応答を促進するために含入され得る。
【０２１５】 （ＩＶ．Ｌ．治療または予防用途のためのワクチンの投与） 本発明のペプチドならびに製剤および本発明のワクチン組成物は、代表的には
癌（特に、前立腺癌）を治療するために治療的に用いられる。本発明のペプチド
を含有するワクチン組成物は、代表的には１つ以上の前立腺関連抗原の発現に関
連した悪性疾患を有する前立腺癌患者に投与される。あるいはワクチン組成物は
、特定の種類の癌、例えば乳癌に罹り易いか、またはそうでなければ前立腺癌を
発症する危険がある個体に投与され得る。
【０２１６】 治療的用途においては、ペプチドおよび／または核酸組成物は、腫瘍抗原に対
する有効なＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を誘発するのに、そして症状および
／または合併症を治癒するかあるいは少なくとも部分的に休止させるかまたは遅
延させるのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに適した量は、「
治療的有効用量」と定義される。この使用に有効な量は、例えば投与される特定
の組成物、投与の方法、治療される疾患の病期および重症度、患者の体重および
全身健康状態、ならびに処方医の判断に依存する。
【０２１７】 上記のように、本発明のＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープを含むペプチ
ドは、ＨＬＡ分子により提示され、ペプチドにより構成されるエピトープに特異
的なＣＴＬまたはＨＴＬと接触されると、免疫応答を誘導する。このペプチド（
またはそれらをコードするＤＮＡ）は、個々にまたは１つ以上のペプチド配列の
融合物として投与され得る。ペプチドがＣＴＬまたはＨＴＬと接触される方法は
、本発明にとっては重要でない。例えばペプチドはインビボまたはインビトロで
ＣＴＬまたはＨＴＬと接触され得る。接触がインビボで起こる場合、ペプチドそ
れ自体が患者に投与されるか、あるいはその他のビヒクル、例えば１つまたはそ
れ以上のペプチドをコードするＤＮＡベクター、ペプチド（単数または複数）を
コードするウイルスベクター、リポソーム等が、本明細書中に記載されているよ
うに使用され得る。
【０２１８】 ペプチドがインビトロで接触される場合、ワクチン剤は、細胞、例えばインビ
トロでペプチドを用いて抗原提示細胞をパルス処理することによって、または本
発明のミニジーンを用いて抗原提示細胞をトランスフェクトすることによって誘
導された、ペプチドパルス化樹状細胞またはＴＡＡ特異的ＣＴＬの集団を含み得
る。その後、このような細胞集団は治療的有効量で患者に投与される。
【０２１９】 治療的使用に関しては、投与は一般に、癌の初回診断時に開始すべきである。
この後、少なくとも症状が実質的に軽減されるまで、そしてその後一定期間、用
量をブーストさせる。患者に送達されるワクチン組成物の実施形態（即ち、その
例としては例えば、ペプチドカクテル、ポリエピトープポリペプチド、ミニジー
ンまたはＴＡＡ特異的ＣＴＬまたはパルス化された樹状細胞が挙げられるが、こ
れらに限定されない）は、疾患または患者の健康状態の段階によって変わり得る
。例えばＴＡＡ特異的ＣＴＬを含むワクチンは、代替的実施形態よりも進行性疾
患患者における腫瘍細胞を死滅させることにおいてより有効であり得る。
【０２２０】 本発明のワクチン組成物は、手術のような治療と組合せて治療的にも使用され
得る。一例は、患者が原発性腫瘍を除去するために手術を受け、その後ワクチン
を用いて、再発および／または転移を遅延させたりまたは防止する状況である。
【０２２１】 感受性個体、例えば前立腺腫瘍の発症に対して遺伝的素因を受け継いでいると
診断され得る個体が、癌の診断前に同定された場合、組成物はそれらを標的にし
、したがってより大きな集団への投与の必要性を最小限にし得る。
【０２２２】 初回治療的免疫化のための投与量は一般に、低いほうの値が約１、５、５０、
５００または１，０００μｇであり、高い方の値が約１０，０００、２０，００
０、３０，０００、または５０，０００μｇである単位投与量範囲である。ヒト
のための投与量値は、代表的には体重７０ｋｇの患者につき約５００μｇ〜約５
０，０００μｇ範囲である。初回用量に引き続いて確立された間隔（例えば、４
週間〜６ヶ月）での免疫追加は、患者を有効に処置するための時間の可能な限り
延長した期間を必要とされ得る。数週間〜数ヶ月間にわたる追加免疫レジメンに
したがって約１．０μｇ〜約５０，０００μｇのペプチドの追加免疫投与量が、
患者の応答、ならびに患者の血液から得られるＣＴＬおよびＨＴＬの特異的活性
を測定することにより確定されるような条件に依存して投与され得る。
【０２２３】 投与は、少なくとも臨床症状または実験室試験が、腫瘍が排除されたことを、
または腫瘍細胞負荷が実質的に軽減されたことを示唆するまで、そしてその後一
定期間、継続されるべきである。投与の投与量、経路および用量計画は、当該分
野で公知の方法論にしたがって調整される。
【０２２４】 特定の実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、重篤な疾患状態に、
即ち致命的または致命的な恐れのある状況で用いられる。このような場合、本発
明の好ましい組成物中の最小量の外来物質および比較的に無毒性のペプチドの結
果、これらの規定投与量と比較して実質的に過剰量のこれらのペプチド組成物を
投与することができるし、治療医には望ましいと感じられ得る。
【０２２５】 本発明のワクチン組成物は、また予防薬として使用され得る。例えば、組成物
は、前立腺癌を発症する危険のある個体に投与され得る。初回治療的免疫化のた
めの投与量は一般に、低いほうの値が約１、５、５０、５００または１，０００
μｇであり、高い方の値が約１０，０００、２０，０００、３０，０００、また
は５０，０００μｇである単位投与量範囲である。ヒトのための投与量値は、代
表的には体重７０ｋｇの患者につき約５００μｇ〜約５０，０００μｇ範囲であ
る。続いて、最初のワクチン投与後、約４週間〜６ヶ月間にわたって約１．０μ ｇ〜約５０，０００μｇのペプチドの追加量が投与される。ワクチンの免疫原性 は、患者の応答、ならびに患者の血液のサンプルから得られるＣＴＬおよびＨＴ
Ｌの特異的活性を測定することにより評価され得る。
【０２２６】 治療的処置のための薬学的組成物は、非経口的、局所的、経口的、鞘内または
限局投与を意図される。好ましくは薬学的組成物は、非経口的に、例えば静脈内
、皮下、皮内または筋肉内に投与される。したがって本発明は、受容可能なキャ
リア、好ましくは水性キャリア中に溶解または懸濁される免疫原性ペプチドの溶
液を含む非経口投与用の組成物を提供する。種々の水性キャリア，例えば水、緩
衝化水、０．８％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等が用いられ得る。
これらの組成物は、慣用的周知の滅菌技法により滅菌され得るし、あるいは滅菌
濾過され得る。その結果生じる水溶液は、そのままで用いるために包装されるか
、あるいは凍結乾燥され、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌溶液と併合される。組
成物は、生理学的に近似していることが要求される薬学的に受容可能な補助物質
、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤、防腐剤等、例えば酢酸
ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム
、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート等を含有し得る
。
【０２２７】 薬学的処方物中の本発明のペプチドの濃度は広範に、即ち約０．１％未満、通
常少なくとも約２重量％から、２０重量％〜５０重量％またはそれ以上の範囲で
変わり得、選定された特定の投与形態にしたがって、主として流体容積、粘度な
どにより選定される。
【０２２８】 ペプチド組成物のヒト単位用量形態は、代表的には、ヒト単位用量の受容可能
なキャリア、好ましくは水性キャリアを含む薬学的組成物中に含入され、そして
ヒトへのこのような組成物の投与のために用いられることが当業者に既知である
流体の容積中に投与される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）Ｍａ
ｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉ
ａ，１９８５参照）。
【０２２９】 本発明のペプチドは、特定の組織、例えばリンパ系組織に対してペプチドを標
的にするのに、あるいは感染細胞に対して選択的に標的にするのに、ならびにペ
プチド組成物の半減期を増大するのに役立つリポソームを介しても投与され得る
。リポソームは、エマルジョン、泡状物、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質
分散液、ラメラ層等を含む。これらの調製物中では、送達されるペプチドはリポ
ソームの一部として、単独で、またはリンパ系細胞、例えばＣＤ４５抗原に結合
するモノクローナル抗体間に広く存在している受容体に結合する分子と一緒に、
あるいはその他の治療用または免疫原性組成物と一緒に、組入れられ得る。した
がって、本発明の所望のペプチドを充填されるかまたはそれで修飾されるリポソ
ームはリンパ系細胞の部位に向けられて、そこでリポソームは次に、ペプチド組
成物を送達する。本発明にしたがって用いるためのリポソームは、標準小胞形成
脂質から形成され、これは一般に中性および負荷電リン脂質、ならびにステロー
ル、例えばコレステロールを含む。脂質の選定は一般に、例えばリポソームサイ
ズ、酸の不安定性および血流中のリポソームの安定性を考察することにより導き
出される。リポソームを調製するためには、例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７ （１９８０）および米国特
許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号
および第５，０１９，３６９号に記載されているような種々の方法が利用可能で
ある。
【０２３０】 免疫系の細胞を標的化するために、リポソーム中に組入れられるリガンドとし
ては、例えば所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはそれらの フラグメント が挙げられる。ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、静脈内、
限局的、局所的等で、とりわけ、投与の様式、送達されるペプチドおよび処置さ
れる疾患の病期によって変更される用量で、投与され得る。
【０２３１】 固体組成物に関しては、従来の無毒性固体キャリアが用いられ、その例として
は、例えば製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグ
ネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロ
ース、炭酸マグネシウム等が挙げられる。経口投与に関しては、薬学的に受容可
能な無毒性組成物が、通常で用いられる賦形剤、例えば上記キャリアのいずれか
、一般的に１０〜９５％の活性成分、即ち本発明の１つまたはそれ以上のペプチ
ドを、ならびにさらに好ましくは２５％〜７５％の濃度で組み込むことにより形
成される。
【０２３２】 エアロゾル投与に関しては、免疫原性ペプチドは好ましくは界面活性剤および
噴射剤と一緒に、微粉砕形態で供給され得る。ペプチドの代表的な割合は、０．
０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％である。界面活性剤
は、もちろん無毒性であり、好ましくは噴射剤中に可溶でなければならない。こ
のような物質の代表例は、６〜２２個の炭素原子を含有する脂肪酸（例えばカプ
ロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、
リノレン酸、オレステリック酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、オレイン酸 ） の、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物とのエステルまたは部分エス
テルである。混合エステル、例えば混合または天然グリセリドが用いられ得る。
界面活性剤は、組成物の０．１重量％〜２０重量％、好ましくは０．２５重量％
〜５重量％を構成し得る。組成物の平均は、普通は噴射剤である。所望により、
例えば鼻腔内送達のためのレシチンのような、キャリアも含まれ得る。
【０２３３】 （ＩＶ．Ｍ．ＨＬＡ発現：Ｔ細胞ベースの免疫療法に対する関連） （癌および感染性疾患における疾患進行） 動的相互作用が、癌および感染性疾患の設定において宿主および疾患間に存在
することは十分認識されている。感染性疾患の設定では、病原体が疾患中に進化
するいうことは十分確定されている。ＨＩＶ感染において初期に優勢である菌株
は、ＡＩＤＳおよび後期疾患段階に関連するものとは異なる（ＮＳ対Ｓ菌株）。
感染の確立において有効である病原体形態は、複製および慢性に関して最も有効
であるものとは異なり得ることが長い間仮定されてきた。
【０２３４】 同様に、個体が新生物性疾患に屈する病理プロセスは複雑であることが広範に
認識されている。疾患の経過中、多数の変化が癌細胞中で起こる。腫瘍は、増殖
および分化の機能不全調節に部分的に関連するが、その増殖能力を最大にするこ
とにも関連し、薬剤治療および／または身体の免疫監視から逃れる変異を蓄積す
る。新生物性疾患は、疾患進行の関数としての癌細胞のいくつかの異なる生化学
的変化の蓄積を生じる。それは、特に後期転移期において、有意レベルの癌内異 質性 および癌間異質性も生じる。
【０２３５】 治療結果に影響を及ぼす細胞変化のよく知られた例としては、治療経過中の放
射線または化学療法耐性腫瘍の進展が挙げられる。これらの例は、攻撃的化学療
法の結果としての薬剤耐性ウイルス株の出現、例えば慢性ＨＢＶおよびＨＩＶ感
染の出現、ならびに結核およびマラリアを引き起こす薬剤耐性生物の現行の復活
と並行している。応答の有意の異質性は、癌療法に対するその他のアプローチ、
例えば抗血管新生剤、受動抗体免疫療法、および活性Ｔ細胞ベースの免疫療法に
も関連する。したがって、このような現象の点から見て、多疾患関連抗原からの
エピトープはワクチンおよび治療薬に使用され得、それにより、突然変異を生じ 、 治療を逃れる疾患細胞の能力を妨害する。
【０２３６】 （疾患と免疫系の間の相互作用） 宿主と疾患の間の動的相互作用に関与する主な因子のうちの１つが、病原体，
感染細胞または悪性疾患細胞に対して立ち上げられる免疫応答である。多数の症
状において、このような免疫応答は疾患を制御する。いくつかの動物モデル系お
よびヒトにおける自然感染の期待される研究は、病原体に対する免疫応答が病原
体を制御し、重症疾患への進行を防止し、および／または病原体を排除し得るこ
とを示唆する。共通の主題は、多特異的Ｔ細胞応答に関する要件であり、狭い範
囲に集中する応答は有効性が低いと思われる。これらの観察は、広範な免疫応答
を提供する本発明の方法および組成物の実施形態に関して当業者に指針を示す。
【０２３７】 癌の場合、免疫応答が新生物増殖に影響を及ぼし得ることを示す以下のような
いくつかの知見が認められる： 第一に、多数の異なる動物モデルにおける、ＭＨＣクラスＩにより拘束される
抗腫瘍Ｔ細胞が腫瘍を防止し、または治療することが可能であるという証拠。
【０２３８】 第二に、有望な結果が免疫療法試験から得られた。
【０２３９】 第三に、自然疾患の経過中に成された観察が腫瘍内のＴ細胞浸潤の型および組
成を陽性臨床結果と相関させた（Ｃｏｕｌｉｅ ＰＧら、Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ
ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｔ ｗｏｒｋ ｉｎ ａ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅ
ｎｔ Ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１
３−２４２，１９９９）。
【０２４０】 最後に、腫瘍は一般的に、突然変異を引き起こし、それによりそれらの免疫学
的認識を変える能力を有する。例えば、単一特異的ＣＴＬの存在は、抗原損失が
発生するまで、腫瘍増殖の制御にも相関した（Ｒｉｋｅｒ Ａら、Ｉｍｍｕｎｅ
ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍ
ｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ａｕｇ；
１２６（２）：１１２−２０，１９９９；Ｍａｒｃｈａｎｄ Ｍら、Ｔｕｍｏｒ
ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉ
ｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ
ａｎ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ
ＭＡＧＥ−３ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｂｙ ＨＬＡ−Ａ１ Ｉｎｔ
．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８０（２）：２１９−３０，Ｊａｎ．１８，１９９９）。
同様に、β２ミクログロブリンの損失が、ＮＣＩで免疫療法を受けた後の黒色腫
患者から確立された５／１３株で検出された（Ｒｅｓｔｉｆｏ ＮＰら、Ｌｏｓ
ｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｂｅｔａ２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａｓ ｆｒｏｍ ｆｉｖｅ ｐａ
ｔｉｅｎｔｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，
Ｖｏｌ．８８（２），１００−１０８，Ｊａｎ．１９９６）。ＨＬＡクラスＩは
種々の腫瘍型で高頻度に変更される、ということが長い間認識されてきた。これ
は、クラスＩ拘束ＣＴＬにより腫瘍に加えられる免疫圧力をこの現象が反映し得
る、という仮説をもたらした。ＨＬＡクラスＩ発現の変更の範囲および程度は、
過去の免疫圧力を反映するものであると思われ、予後値も有し得る（ｖａｎ Ｄ
ｕｉｎｅｎ ＳＧら、Ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＨＬＡ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｌ
ｏｃｏｒｅｇｉｏｎａｌ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ
ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉ
ｔｈ ｍｅｌａｎｏｍａ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８，１０１９−
１０２５，Ｆｅｂ．１９８８；Ｍｏｌｌｅｒ Ｐら、Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ
ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌ
ａｓｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ
ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ ５１，７２９−７３６，Ｊａｎ．１９９１）。合わせて考えると、これらの
観察は癌および感染性疾患の免疫療法の根拠を提供し、そして有効な戦略は、疾
患に関連した一連の複雑な病理学的変化を説明する必要があることを示唆する。
【０２４１】 （腫瘍におけるＨＬＡ発現の３つの主な型の変化ならびにそれらの機能的意味
） 腫瘍におけるＨＬＡクラスＩ抗原の発現のレベルおよびパターンは、多数の異
なる腫瘍型で研究されており、研究された腫瘍の全ての型において変化が報告さ
れている。ＨＬＡクラスＩ変化の基礎を成す分子メカニズムは、全く異質である
ことを実証した。それらは、ＴＡＰ／プロセシング経路の変化、β２−ミクログ
ロブリンおよび特異的ＨＬＡ重鎖の突然変異、クラスＩ発現を制御する調節エレ
メントの変化、ならびに全染色体区分の損失を包含する。この題目に関するいく
つかの総説がある（例えば、Ｇａｒｒｉｄｏ Ｆら、Ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔ
ｏｒｙ ｏｆ ＨＬＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｕｍｏｕｒ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １４（１０）：４９１
−４９９，１９９３；Ｋａｋｌａｍａｎｉｓ Ｌら、Ｌｏｓｓ ｏｆ ＨＬＡ
ｃｌａｓｓ−Ｉ ａｌｌｅｌｅｓ，ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎｓ ａｎｄ β２−
ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５１（３）：３７９−８５，Ｍａｙ ２８，１９９２
参照）。ＨＬＡクラスＩ変化には３つの主な型が存在する（完全損失、対立遺伝
子特異的損失および発現低減）。各変化の機能的意味は別個に考察される。
【０２４２】 （ＨＬＡ発現の完全損失） ＨＬＡ発現の完全損失は、種々の異なる分子メカニズムに起因し得る。それら
については以下の文献で概説されている（Ａｌｇａｒｒａ Ｉら、Ｔｈｅ ＨＬ
Ａ ｃｒｏｓｓｒｏａｄ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｈｕｍａ
ｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６１，６５−７３，２０００；Ｂｒｏｗｎｉｎｇ
Ｍら、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｌｏｓｓ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ
ｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４７：３６４−３７１，１９９６；Ｆｅ
ｒｒｏｎｅ Ｓら、Ｌｏｓｓ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｇｅｎ
ｓ ｂｙ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｍｓ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎｄ ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，１６（
１０）：４８７−４９４，１９９５；Ｇａｒｒｉｄｏ Ｆら、Ｎａｔｕｒａｌ
ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ＨＬＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｕｍ
ｏｕｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １４（
１０）：４９１−４９９，１９９３；Ｔａｉｔ，ＢＤ，ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ：Ｉｍ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａ
ｐｙ Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６１，１５８−１６５，２０００）。機能に関
して、この型の変化はいくつかの重要な意味を有する。
【０２４３】 クラスＩ発現の完全非存在はそれらの腫瘍細胞のＣＴＬ認識を排除するが、一
方、ＨＬＡクラスＩの損失も、ＮＫ細胞からの溶解に対して腫瘍細胞を異常に感
受性にさせる（Ｏｈｎｍａｃｈｔ，ＧＡら、Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇ
ｅｎｓ ａｎｄ ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ
ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ Ｊ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙ
ｓ １８２：３３２−３３８，２０００；Ｌｉｕｎｇｇｒｅｎ ＨＧら、Ｈｏｓ
ｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｇ
ａｉｎｓｔ Ｈ−２ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｖａｒｉａｎｔ
ｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．，Ｄｅｃ １：１６２（６）：１７４５−５９，１９８５；Ｍａｉｏ Ｍら
、Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｎａｔｕ
ｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕ
ｍａｎ ＦＯ−１ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂ２ｍ ｇｅｎｅ Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８（１）：２８２−９，Ｊｕｌｙ １９９１：Ｓｃｈｒ
ｉｅｒ ＰＩら、Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｙｃ ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０：１８１−２４６，１
９９３）。
【０２４４】 ＨＬＡ発現の損失とＮＫ感受性の獲得との間の相補的相互作用は、Ｃｏｕｌｉ
ｅと共同研究者（Ｃｏｕｌｉｅ，ＰＧら、Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔ
ｙ ａｔ ｗｏｒｋ ｉｎ ａ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔ．Ｉｎ Ａ
ｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１３−２４２，１
９９９）の、数年に亘る経過中の患者の免疫応答の進展を記載した古典的研究に
より例示されている。ＮＫ溶解に対する感受性増大のために、概して生得免疫お よび 特にＮＫ活性の刺激をもたらすアプローチは特別の意義を有することが予測
される。このようなアプローチの一例は、種々の造血性増殖因子、例えばＦｌｔ
３リガンドまたはＰｒｏＧＰによる大量の樹状細胞（ＤＣ）の誘導である。この
アプローチに関する根拠は、樹状細胞が、生得免疫および特にＮＫ活性に対する
最も強力な刺激剤の１つである大量のＩＬ−１２を産生するという周知の事実に
ある。あるいはＩＬ−１２は直接投与されるか、またはそれをコードする核酸と
して投与される。この点から見て、Ｆｌｔ３リガンド処置がクラスＩ陰性前立腺 マウス 癌モデルの一過性腫瘍退行を生じるということに留意するのは興味深い（
Ｃｉａｖａｒｒａ ＲＰら、Ｆｌｔ３−Ｌｉｇａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｒａ
ｎｓｉｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｎ ｅｃｔｏｐｉ ｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐ
ａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ
ｃａｎｃｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：２０８１−８４，２０００）。こ
の情況では、本発明の特異的抗腫瘍ワクチンはこれらの型の造血増殖因子と相乗
作用して、ＣＴＬおよびＮＫ細胞応答の両方を促進し、それにより突然変異を生
じ、それにより有効な処置を逃れる細胞の能力を明らかに減損する。したがって
本発明の実施形態は、本発明の組成物を、ＮＫ細胞の機能的活性または数を増大
する方法または組成物と一緒に包含する。このような実施形態は、ＮＫ誘導性の
様式で引き続き、あるいはＮＫ誘導性の様式で同時期に、本発明の組成物を提供
するプロトコールを包含し得る。
【０２４５】 第二に、ＨＬＡの完全損失はしばしば腫瘍細胞の画分においてのみ起こるが、
一方、腫瘍細胞の残り部分は正常発現を示し続ける。機能に関して、腫瘍は部分
的に依然としてＣＴＬ応答からの直接攻撃を受け、細胞のＨＬＡを欠く部分はＮ
Ｋ応答を受ける。ＣＴＬ応答のみが用いられる場合でも、腫瘍のＨＬＡ発現画分
の破壊は生存時間およびクオリティーオブライフに劇的影響を及ぼす。
【０２４６】 異種ＨＬＡ発現の場合には、正常ＨＬＡ発現および欠陥細胞はともに、「傍観
者効果」に基づいた免疫破壊を受け易いと予測される、ということにも留意すべ
きである。このような効果は、例えば抗体標的化スーパー抗原の作用のインビボ
メカニズムを調べたＲｏｓｅｎｄａｈｌと共同研究者の研究において実証された
（Ｒｏｓｅｎｄａｈｌ Ａら、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ ａｎｄ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ
ａｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃ
ｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ
ｓ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（１１）：５３０９−１３，Ｊｕｎｅ １，１
９９８）。傍観者効果は、例えばＨＬＡ保有標的細胞に作用するＣＴＬから誘導 されるサイトカインにより媒介され、それによりサイトカインは付随して殺害さ
れる他の罹患細胞の環境中に存在すると理解される。
【０２４７】 （対立遺伝子特異的損失） クラスＩ分子の変化の最も一般的な型の１つは、ＨＬＡに対してヘテロ接合性
の個体中のある種の対立遺伝子の選択的損失である。対立遺伝子特異的変化は、
単一ＨＬＡ拘束エレメントにより拘束されるイムノドミナント（ｉｍｍｕｎｏｄ
ｏｍｉｎａｎｔ）応答により加えられる免疫圧力に対する腫瘍適合を反映し得る
。この型の変化は、腫瘍にクラスＩ発現を保持させ、したがってＮＫ細胞認識を
逃れさせるが、なお依然として残りのＨＬＡ型に対応するエピトープを含む本発
明のＣＴＬベースのワクチンに感受性である。したがって対立遺伝子特異的損失
の考え得るハードルを克服するための実際的な解決策は、多数の特異的応答の誘
導に依存する。本発明のワクチン中の多数の疾患関連抗原の含入は特定の疾患抗
原の損失を生じる突然変異を防ぐのとちょうど同じように、多数のＨＬＡ特異性
および多数の疾患関連抗原を同時にターゲッティングすることは、対立遺伝子特
異的損失による疾患逃避を阻止する。
【０２４８】 （発現の低減（対立遺伝子特異的または非特異的）） エフェクターＣＴＬの感受性は、長年実証されてきた（Ｂｒｏｗｅｒ，ＲＣら
、Ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｅ
ｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８＋ＣＴＬ Ｍｏｌ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．，３１：１２８５−９３，１９９４；Ｃｈｒｉｕｓｔｎｉｃｋ，ＥＴ
ら、Ｌｏｗ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ
ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｔｒｉｇｇｅｒ ａ Ｔ ｃ
ｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６７−７０，１９９１；Ｓ
ｙｋｕｌｅｖ，Ｙら、Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｐｅｐ
ｔｉｄｅ−ＭＨＣ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｎ ａ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｃａ
ｎ ｅｌｉｃｉｔ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｉ
ｍｍｕｎｉｔｙ，４（６）：５６５−７１，Ｊｕｎｅ １９９６）。単一ペプチ
ド／ＭＨＣ複合体でさえ、腫瘍細胞溶解を生じ、抗腫瘍リンホカインを放出し得
る．ＨＬＡ発現低減および免疫認識からの考え得る腫瘍逃避の生物学的意義は、
完全にはわかっていない。それにもかかわらず、１つという少ないＭＨＣ／ペプ
チド複合体のＣＴＬ認識で、腫瘍細胞溶解を導くのに十分である、ということが 実証 されている。
【０２４９】 さらに、ＨＬＡの発現は、エフェクターＣＴＬにより一般的に分泌されるγＩ
ＦＮにより上方制御され得る、ということが一般的に観察される。さらにＨＬＡ
クラスＩ発現は、αおよびβＩＦＮの両方によりインビボで誘導され得る（Ｈａ
ｌｌｏｒａｎら、Ｌｏｃａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎｄｕｃ
ｅ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ＭＨＣ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ １４８：３８３７，１９９２；Ｐｅｓｔｋａ，Ｓら、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ
ｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｏｎｓ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．５６：７２７−７７，１９８７）。逆に、ＨＬＡクラスＩ発現のレベル低減も
細胞をＮＫ溶解に対してより感受性にさせる。
【０２５０】 γＩＦＮに関しては、Ｔｏｒｒｅｓ等（Ｔｏｒｒｅｓ，ＭＪら、Ｌｏｓｓ ｏ
ｆ ａｎ ＨＬＡ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｓ ｃａｎｃｅ
ｒ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｕｍｏｒ
ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４
７：３７２−８１，１９９６）は、ハロタイプの全体的損失が起こらない限り、
ＨＬＡ発現が膵臓癌におけるγＩＦＮにより上方制御される、ということに注目
している。同様にＲｅｅｓおよびＭｉａｎは、対立遺伝子欠失および損失は、サ
イトカイン（例えばＩＦＮ−γ）により、少なくとも部分的に回復され得る、と
いうことに注目した（Ｒｅｅｓ，Ｒら、Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＭＨＣ ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｕｒｓ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ａｄａｐｔｉｖｅ
ａｎｄ ｉｎｎａｔｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ４８：３７４−８１，１９９
９）。ＩＦＮ−γ処置は、研究された症例の大多数におけるクラスＩ分子の上方
制御をもたらす、ということも注目された（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ Ｍら、Ｍｅｃｈ
ａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｌｏｓｓ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ ｏｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ，Ｔｉｓｓｕ
ｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４７：３６４−３７１，１９９６）。Ｋａｋｌａｍａｋ
ｉｓ等も、ＩＦＮ−γを用いるアジュバント免疫療法がＨＬＡクラスＩ陰性腫瘍
の場合に有益であり得る、ということを示唆した（Ｋａｋｌａｍａｎｉｓ Ｌ，
Ｌｏｓｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅ
ｓｓｉｎｇ １ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍａｊｏｒ
ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍ
ｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｖｅｒｓｕｓ ｐｒｉｍａｒ
ｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５：５
１９１−９４，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９５）。局所炎症／免疫化によりＩＦＮ
−γ産生が誘導され、自己増幅されて（Ｈａｌｌｏｒａｎら、Ｌｏｃａｌ Ｔ
ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ＭＨＣ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：３８３７，１９９２）
、炎症部位から離れた部位でもＭＨＣ発現の大増加をもたらす、と強調すること
は重要である。
【０２５１】 最後に、研究により、ＨＬＡ発現の低減が腫瘍細胞をＮＫ溶解に対してより感
受性にさせ得るということが実証された（Ｏｈｎｍａｃｈｔ，ＧＡら、Ｈｅｔｅ
ｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｕ
ｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ Ｊ
Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓ １８２：３３２−３３８，２０００；Ｌｉｕｎｇ
ｇｒｅｎ ＨＧら、Ｈｏｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｅ
ｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｈ−２ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｌｙｍｐ
ｈｏｍａ ｖａｒｉａｎｔｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｍ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６２（６）：１７４５−５９，Ｄｅｃｅｍｂ
ｅｒ １，１９８５；Ｍａｌｏ Ｍら、Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｓｃｅ
ｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ−ｍｅｄ
ｉａｔｅｄ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＦＯ−１ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃ
ｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ
ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｗ
ｉｔｈ β２ｍ ｇｅｎｅ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８（１）：２８２
−９，Ｊｕｌｙ １９９１：Ｓｃｈｒｉｅｒ ＰＩら、Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉ
ｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｙｃ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎ
ｄ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．，６０：１８１−２４６，１９９３）。もしＨＬＡ発現の低減が、ＣＴ
Ｌ逃避を促すために腫瘍に対して利益を与えるが、その腫瘍をＮＫ溶解に対して
感受性にさせるならば、ＮＫ活性に対する耐性を可能にするＨＬＡ発現の最小レ
ベルが選定される（Ｇａｒｒｉｄｏ Ｆら、Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ
ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ａｌｔｅｒｅｄ ＨＬＡ ｃ
ｌａｓｓ Ｉ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｕｒｓ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １８（２）：８９−９６，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９
９７）。したがって本発明の処置用組成物または方法は、ＨＬＡ発現を上方制御
するための処置および／または高親和性Ｔ細胞による処置と一緒に、腫瘍をＣＴ
Ｌ破壊に対して感受性にさせる。
【０２５２】 （ＨＬＡ発現における変化の頻度） クラスＩ発現における変化の頻度は、多数の研究の対象である（Ａｌｇａｒｒ
ａ Ｉら、Ｔｈｅ ＨＬＡ ｃｒｏｓｓｒｏａｄ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６１，６５−７３，２００
０）。ＲｅｅｓとＭｉａｎは、対立遺伝子損失は全体で３〜２０％の腫瘍に起こ
り、対立遺伝子欠失は１５〜５０％の腫瘍で起こると概算している。各細胞は２
つの別々の組のクラスＩ遺伝子を有し、その各遺伝子が１つのＨＬＡ−Ａおよび
１つのＨＬＡ−Ｂ遺伝子座を保有する、ということに留意すべきである。したが
って完全へテロ接合型個体は、２つの異なるＨＬＡ−Ａ分子と２つの異なるＨＬ
Ａ−Ｂ分子を保有する。したがって、任意の特異的対立遺伝子に関する損失の実
際の頻度は、全頻度の４分の１という少なさであり得る。概して、発現の勾配は
正常細胞、原発性腫瘍および腫瘍転移間に存在する、ということにも彼等は留意
した。Ｎａｔａｌｉと共同研究者（Ｎａｔａｌｉ ＰＧら、Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ
ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ
Ｉ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ
ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：６７１９−６７２３，Ｓ
ｅｐｔｅｍｂｅｒ １９８９）からの研究では、固形腫瘍は、Ｗ６／３２抗体を
用いて、全体的ＨＬＡ発現に関して、およびＢＢ７．２抗体の使用により評価し
た場合のＡ２抗原の対立遺伝子特異的発現に関して検査された。腫瘍試料は、１
３の異なる腫瘍型に関して原発性癌または転移から得られ、２０％未満である場
合は陰性、３０〜８０％の範囲である場合には低減、そして８０％を超える場合
には正常と採点された。腫瘍は全て、原発性も転移も、Ｗ６／３２を用いてＨＬ
Ａ陽性であった。Ａ２発現に関しては、低減は１６．１％の症例で認められ、Ａ
２は３９．４％の症例で検出されないと採点された。Ｇａｒｒｉｄｏと共同研究
者（Ｇａｒｒｉｄｏ Ｆら、Ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ＨＬＡ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｕｍｏｕｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １４（１０）：４９１−９９，１９９３）は、
ＨＬＡ変化は良性から最も攻撃的までの進行中の特定の段階で起こると思われる
ことを強調した。Ｊｉｍｉｎｅｚ等（Ｊｉｍｉｎｅｚ Ｐら、Ｍｉｃｒｏｓａｔ
ｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ
ｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｏｔａ
ｌ ｌｏｓｓ ｏｆ ＨＬＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕ
ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ４８：６８４−９０，２０００）は、１１８の
異なる腫瘍を分析した（結腸直腸癌６８例、喉頭癌３４例および黒色腫１６例）
。ＨＬＡ発現の全体的損失に関して報告された頻度は、結腸癌１１％、黒色腫１
８％および喉頭癌１３％であった。したがってＨＬＡクラスＩ発現は、恐らくは
免疫圧力の反映として、または病理学的変化および罹患細胞の変化の蓄積の単な
る反映として、腫瘍型の有意の画分中で変更される。
【０２５３】 （ＨＬＡ損失情況での免疫療法） 大多数の腫瘍はＨＬＡクラスＩを発現し、後期段階で、かつ低分化腫瘍におい
て、より重篤な変化が見出される一般的傾向がある。このパターンは、免疫療法 の情況において有望であり、特に以下のようであると考える：１）免疫組織化学
的技法の相対的低感度は、腫瘍におけるＨＬＡ発現を低く評価し得る；２）クラ
スＩ発現は、局所的炎症およびリンホカイン放出の結果として腫瘍細胞中で誘導
され得る；ならびに３）クラスＩ陰性細胞は、ＮＫ細胞による溶解に感受性であ
る。
【０２５４】 したがって本発明の種々の実施形態は、特に腫瘍性疾患の情況において、ＨＬ
Ａ分子のある程度の損失が存在し得るという事実を考慮して選択され得る。例え
ば処置医は、ＨＬＡが発現されているか否かを確証するために患者の腫瘍をアッ
セイし得る。あるパーセンテージの腫瘍細胞がクラスＩＨＬＡを発現しないなら
ば、ＮＫ細胞応答を惹起する方法または組成物を含む本発明の実施形態が用いら
れ得る。本明細書中に記載されているように、このようなＮＫ誘導法またはＮＫ 誘導 組成物は、樹状細胞の動員を促進するＦＩｔ３リガンドまたはＰｒｏＧＰを
含み得る。理論的根拠は、樹状細胞が大量のＩＬ−１２を産生するということに
ある。ＩＬ−１２はアミノ酸形態または核酸形態のいずれかで直接投与され得る
。本発明の組成物はＮＫ細胞誘導性組成物と同時に投与され得るし、あるいはこ
れらの組成物は引き続いて投与され得る、ということに留意すべきである。
【０２５５】 対立遺伝子特異的ＨＬＡ損失の情況では、腫瘍はクラスＩ発現を保持し、した
がってＮＫ細胞認識を逃れ、さらに残りのＨＬＡ型に対応するエピトープを含む
本発明のＣＴＬベースのワクチンに依然として感受性であり得る。この概念はこ
こでは、特異的抗原の損失をもたらす突然変異に対して防護するために多数の疾
患抗原を含む本発明の実施形態に類似する。したがって、対立遺伝子特異的損失
、ならびに疾患関連抗原損失による腫瘍逃避を阻止するために、多数の疾患関連
抗原由来の多数のＨＬＡ特異性および多数のエピトープを同時に標的にし得る。
さらに本発明の実施形態は、代替的な治療用組成物および治療方法と併合され得
る。このような代替的な組成物および方法は、放射線、細胞傷害性薬剤および／
または体液性抗体応答を誘導する組成物／方法を包含するが、これらに限定され
ない。
【０２５６】 さらに、ＨＬＡの発現は、エフェクターＣＴＬにより一般的に分泌されるγＩ
ＦＮにより上方制御され得ること、およびＨＬＡクラスＩ発現は、αおよびβＩ
ＦＮの両方によりインビボで誘導され得ることが観察された。したがって本発明
の実施形態は、ＨＬＡの上方制御を促進するために、α、βおよび／またはγＩ
ＦＮも含み得る。
【０２５７】 （ＩＶ．Ｎ．副作用を誘導する治療からの猶予期間：「計画的処置の中断また
は休薬日（ｄｒｕｇ ｈｏｌｉｄａｙ）」） 病原体に感染し、初期に病原体負荷を低減する処置レジメンで処置されたある
患者は、処置レジメンから外れた場合でも、即ち「休薬日」中も、病原体負荷低
減を維持し得た、ということを近年の証拠は示している（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，
Ｅ．ら、Ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＨＩＶ−１ ａｆｔｅｒ ｅａ
ｒｌｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔ
ｕｒｅ ４０７：５２３−２６，Ｓｅｐｔ．２８，２０００）。当業者に理解さ
れるように、病原体および癌の両方に対する多数の処置レジメンは、しばしば重 篤な多数の副作用を有する。休薬日中に、患者の免疫系は疾患を抑制している。
本発明の組成物を用いるための方法は、癌および病原性感染に対して休薬日の情
況で用いられる。
【０２５８】 感染の処置に関しては、治療が特に免疫抑制性であるわけでない場合、本発明
の組成物が標準的治療と同時に投与される．この期間の間、患者の免疫系は、本
発明の組成物により含まれるエピトープに対する応答を誘導するように指向され る 。副作用を有する処置から外れた時点で、患者は、病原体負荷が増大し始める
場合に感染性病原体に対して応答するようプライミングされる。本発明の組成物
は、休薬日中も同様に提供され得る。
【０２５９】 癌患者に関しては、多数の治療が免疫抑制性である。したがって、寛解が達成
されるかまたは、患者が標準的処置に対して耐性であると同定され、次に免疫抑
制治療から外れた場合、本発明の組成物が投与される。したがって患者の免疫系
が再構成するにつれ、貴重な免疫源が同時に癌に向けられる。本発明の組成物は
、所望の場合、免疫抑制レジメンと同時にも投与され得る。
【０２６０】 （ＩＶ．Ｏ．キット） 本発明のペプチドおよび核酸組成物は、ワクチン投与のための指示書とともに
キットの形態で提供され得る。代表的に、キットは、容器中の所望のペプチド組
成物（好ましくは、単位用量形態にある）および投与のための指示書を含む。代
替的なキットは、投与のための指示書とともに、容器中の本発明の所望の核酸で 構成される ミニジーン構築物（好ましくは、単位用量形態にある）を含む。ＩＬ
−２またはＩＬ−１２のようなリンホカインもまた、キットに含まれ得る。所望
であり得る他のキット構成要素には、例えば、滅菌シリンジ、ブースター投薬、
および他の所望の賦形剤が挙げられる。
【０２６１】 （ＩＶ．Ｐ．概要） 本発明に従うエピトープは、免疫応答を誘導するために首尾良く使用された。
これらのエピトープを用いた免疫応答は、これらのエピトープを種々の形態で投
与することによって誘導された。これらのエピトープは、ペプチドとして、核酸
として、そして本発明のエピトープをコードする核酸を含むウイルスベクターと
して投与された。ペプチドベースのエピトープ形態の投与において、免疫応答は
、細胞で発現される空のＨＬＡ分子上にエピトープを直接負荷することによって
、そしてこのエピトープのインターナリゼーションおよびＨＬＡクラスＩ型経路
を介するプロセシングを介して誘導された；いずれの場合においても、次いで、
このエピトープを発現するＨＬＡ分子は、相互作用し得、そしてＣＴＬ応答を誘
導し得た。ペプチドは、直接的に、またはリポソームのような薬剤を使用して送
達され得る。これらは、さらに、銃式送達（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｄｅｌｉｖｅ
ｒｙ）を使用して送達され得、ここで、これらのペプチドは、代表的には、結晶
形態である。ＤＮＡを使用して免疫応答を誘導する場合、ＤＮＡは、裸のＤＮＡ
として（一般的に、約１〜５ｍｇの投薬範囲）または銃式の「遺伝子銃」送達を
介して（代表的に、約１０〜１００μｇの投薬範囲）のいずれかで投与される。
ＤＮＡは、種々のコンホメーション（例えば、直鎖状、環状など）で送達され得
る。本発明に従うエピトープをコードする核酸を含む、種々のウイルスベクター
もまた、首尾良く使用された。
【０２６２】 従って、本発明に従う組成物は、いくつかの形態で存在する。本発明に従うこ
れらの組成物形態の各々の実施形態は、免疫応答を誘導するために首尾良く使用
された。
【０２６３】 本発明に従う１つの組成物は、複数のペプチドを含む。この複数のペプチドま
たはペプチドのカクテルは、一般的に、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤と
混合される。ペプチドカクテルは、同じペプチドの複数のコピーを含み得るか、
またはペプチドの混合物を含み得る。ペプチドは、天然に存在するエピトープの
アナログであり得る。ペプチドは、人工アミノ酸および／または化学的改変（例
えば、脂質化；アセチル化、グリコシル化、ビオチン化、リン酸化などの表面活
性分子の付加のような改変）を含み得る。ペプチドは、ＣＴＬエピトープまたは
ＨＴＬエピトープであり得る。好ましい実施形態において、ペプチドカクテルは
、複数の異なるＣＴＬエピトープおよび少なくとも１つのＨＴＬエピトープを含
む。ＨＴＬエピトープは、天然または非天然（例えば、ＰＡＤＲＥ（登録商標）
、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）であり得る。本発
明の実施形態における異なるエピトープの数は、一般的に、１〜１５０の整数（
ｗｈｏｌｅ ｕｎｉｔ ｉｎｔｅｇｅｒ）である（例えば、１、２、３、４、５
、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、
１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、
３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、
４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、
５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、
６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、
７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、
９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００）。
【０２６４】 本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、ポリペプチド多エピトープ構築物
（すなわち、ポリエピトープペプチド）を含む。本発明に従うポリエピトープペ
プチドは、当該分野において周知の技術の使用によって調製される。これらの公
知の技術の使用によって、本発明に従うエピトープは、互いに連結される。ポリ
エピトープペプチドは、直鎖状または非直鎖状（例えば、多価）であり得る。こ
れらのポリエピトープ構築物は、人工アミノ酸、スペーシングアミノ酸またはス
ペーサーアミノ酸、隣接アミノ酸、または隣接エピトープ単位間の化学的改変を
含み得る。ポリエピトープ構築物は、ヘテロポリマーまたはホモポリマーであり
得る。ポリエピトープ構築物は、一般的に、２〜１５０の間の任意の整数の量（
例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１
５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２
７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３
９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５
１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６
３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７
５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８
７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９
９、または１００）のエピトープを含む。ポリエピトープ構築物は、ＣＴＬエピ
トープおよび／またはＨＴＬエピトープを含み得る。構築物中の１以上のエピト
ープは、例えば、表面活性物質（例えば、脂質）の付加によって改変され得るか
、または化学的に改変され得る（例えば、アセチル化など）。さらに、多エピト
ープ構築物における結合は、ペプチド結合以外（例えば、共有結合、エステルま
たはエーテル結合、ジスルフィド結合、水素結合、イオン結合など）であり得る
。
【０２６５】 あるいは、本発明に従う組成物は、ネイティブ配列に対して相同性を有する（
すなわち、対応するかまたは近接する）アミノ酸の系列、配列、ストレッチ（ｓ
ｔｒｅｔｃｈ）を含む構築物を含む。このアミノ酸のストレッチは、より長い系
列のアミノ酸から切断されるかまたは単離された場合に、本発明に従って、ＨＬ
ＡクラスＩ型エピトープまたはＨＬＡクラスＩＩ型エピトープとして機能する、
アミノ酸の少なくとも１つのサブ配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。この
実施形態において、ペプチド配列は、当該分野で公知であるかまたは提供される
多数の技術を使用することによって、本明細書中に定義されるような構築物にな
るように改変される。ポリエピトープ構築物は、７０〜１００％（例えば、７０
、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２
、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４
、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）の任意の整数の増分でネイ
ティブ配列に対して相同性を含み得る。
【０２６６】 本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、本発明に従う１以上のエピトープ
を含む、抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、「プロフェッショナル」抗原提
示細胞（例えば、樹状細胞）であり得る。抗原提示細胞は、当該分野において公
知の任意の手段または当該分野において決定された任意の手段によって、本発明
のエピトープを含み得る。このような手段には、銃式核酸送達のような核酸投与
によって、または核酸の投与のための当該分野の他の技術（ベクターベース（例
えば、ウイルスベクター）の核酸の送達を含む）によって、樹状細胞を１以上の
個々のエピトープまたは複数のエピトープを含む１以上のペプチドとともにパル
スすることを含む。
【０２６７】 本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、本発明の１以上のペプチドをコー
ドする核酸、または本発明に従うポリエピトープペプチドをコードする核酸を含
む。当業者によって理解されるように、種々の核酸組成物は、遺伝コードの縮重
に起因して同じペプチドをコードする。これらの核酸組成物の各々は、本発明の
範囲内に含まれる。本発明のこの実施形態は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み、特定
の実施形態において、ＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせを含む。本発明に従うペ
プチドをコードする核酸を含む任意の組成物または本発明に従う任意の他のペプ
チドベースの組成物が、本発明の範囲内にあることが理解される。
【０２６８】 本発明のペプチドベースの形態（ならびに、これらをコードする核酸）が、当
該分野で既に公知であるかまたは公知になる原理を使用して作製される、本発明
のエピトープのアナログを含み得ることが理解される。アナログ化に関する原理
は、現在、当該分野において公知であり、本明細書中に開示される；さらに、ア
ナログ化原理（ヘテロクリティックアナログ化）は、１９９９年１月６日に出願
された同時係属出願シリアル番号Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第０９／２２６，７７５号に
開示される。一般的に、本発明の組成物は、単離されているかまたは精製されて
いる。
【０２６９】 本発明を、特定の実施例によってより詳細に記載する。以下の実施例は、例示
の目的のために提供され、そしていかなる様式においても本発明を制限すること
を意図しない。当業者は、本発明に従って代替の実施形態を得るために変化また
は改変され得る重要でない種々のパラメータを容易に認識する。
【０２７０】 （Ｖ．実施例） 以下の実施例は、ワクチン組成物に含ませるための免疫原性クラスＩおよびク
ラスＩＩペプチドエピトープの同定、選択、および使用を例示する。
【０２７１】 （実施例１．ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ結合アッセイ） ＨＬＡ分子に結合するペプチドの以下の例は、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩ
Ｉペプチドの結合親和性の定量化を示す。結合アッセイは、モチーフを保有する
かまたはモチーフを保有しないペプチドのいずれかを用いて実施され得る。
【０２７２】 精製ＨＬＡ分子を使用するＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ結合アッセイを、
開示のプロトコールに従って行った（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２０１２７ およびＷＯ９４／０３２０５ ；Ｓｉｄｎｅｙら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８．３．１（１９９８）；Ｓｉｄｎｅ
ｙ，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２４７（１９９５）；Ｓｅｔｔｅ，ら，
Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３（１９９４））。手短には、精製ＭＨＣ
分子（５〜５００ｎＭ）を、種々の未標識ペプチドインヒビターおよび上記の１
〜１０ｎＭの１２５Ｉ放射標識プローブペプチドと共にインキュベートした。イ
ンキュベーション後、ＭＨＣペプチド複合体を、ゲル濾過によって遊離ペプチド
から分離し、そして結合したペプチドの画分を決定した。代表的には、予備実験
において、各ＭＨＣ調製物を、固定量の放射標識ペプチドの存在下で滴定し、全
放射活性の１０〜２０％を結合するのに必要とされるＨＬＡ分子の濃度を決定し
た。全てのその後の阻害アッセイおよび直接結合アッセイを、これらのＨＬＡ濃
度を用いて実施した。
【０２７３】 ［標識］＜［ＨＬＡ］およびＩＣ５０≧［ＨＬＡ］のこれらの条件下で、測定
されたＩＣ５０値は、真のＫＤ値の適切な近似である。ペプチドインヒビターは
、代表的に、１２０μｇ／ｍｌ〜１．２ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で試験され、そ
して２〜４回の完全に独立した実験において試験される。異なる実験から得られ
たデータの比較を可能にするために、阻害についてのポジティブコントロールの
ＩＣ５０を各々の試験したペプチド（代表的には、その放射標識されたプローブ
ペプチドの標識されていないバージョン）のＩＣ５０で除算することによって、
相対的な結合の数値を、各ペプチドについて計算した。データベース目的および
実験間比較のために、相対的な結合値を編集する。続いて、これらの値を、阻害
についてのポジティブコントロールのＩＣ５０ ｎＭを目的のペプチドの相対的
な結合で除算することによって、ＩＣ５０ ｎＭ値に変換し得る。このデータの
編集方法は、異なる日、または異なるロットの精製ＭＨＣで試験したペプチドを
比較するために、最も正確でかつ一貫していることが証明された。
【０２７４】 上に概説された結合アッセイは、例えば、実施例２に記載されるようなスーパ
ーモチーフおよび／またはモチーフを保有するエピトープを分析するために使用
され得る。
【０２７５】 （実施例２．ＨＬＡスーパーモチーフおよびモチーフを保有するＣＴＬ候補エ
ピトープの同定） 本発明のワクチン組成物は、広範な集団適用範囲を達成するために、複数のＨ
ＬＡスーパーモチーフまたはＨＬＡモチーフを含む、複数のエピトープを含み得
る。この実施例は、このようなワクチン組成物に含ませるためのスーパーモチー
フおよびモチーフ保有エピトープの同定を例示する。集団適用範囲の計算を、以
下に記述されるストラテジーを用いて実施した。
【０２７６】 （スーパーモチーフおよび／またはモチーフを保有するエピトープの同定のた
めのコンピュータ検索およびアルゴリズム） 実施例２および５においてモチーフ保有ペプチド配列を同定するために実施さ
れる検索は、前立腺癌関連抗原についてのタンパク質配列データを使用した。
【０２７７】 ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩのスーパーモチーフまたはモチーフを保有す
るエピトープについてのコンピュータ検索を、以下のように実施した。全ての翻
訳されたタンパク質配列を、テキスト記号列検索（ｔｅｘｔ ｓｔｒｉｎｇ ｓ
ｅａｒｃｈ）ソフトウェアプログラム（例えば、ＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈ １．
４（Ｄ．Ｂｒｏｗｎ，Ｓｎａ Ｄｉｅｇｏ））を使用して分析して、適切なＨＬ
Ａ結合モチーフを含む潜在的なペプチド配列を同定した；代替のプログラムは、
本明細書中に開示されたモチーフ／スーパーモチーフを考慮して、当該分野の情
報に従って容易に作成される。さらに、このような計算は、頭の中で行われ得る
。
【０２７８】 同定したＡ２スーパーモチーフ配列、Ａ３スーパーモチーフ配列およびＤＲス
ーパーモチーフ配列を、特定のＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する
それらの能力を予測するための、多項式アルゴリズムを使用してスコア付けした
。これらの多項式アルゴリズムは、伸長モチーフおよび洗練モチーフの両方を考
慮し（すなわち、異なる位置での異なるアミノ酸の影響を考慮すること）、そし
てペプチド−ＨＬＡ分子相互作用の全体の親和性（つまり、ΔＧ）が、以下の型
の線形多項式関数として近似され得るという事実に本質的に基づく： “ΔＧ”＝ａ１ｉ×ａ２ｉ×ａ３ｉ．．．．．．×ａｎｉ ここで、ａｊｉは、ｎ個のアミノ酸のペプチドの配列に沿った所定の位置（ｉ）
での所定のアミノ酸（ｊ）の存在の効果を表す係数である。この方法の重要な仮
定は、各位置での効果が、本質的に互いに独立である（すなわち、個々の側鎖の
独立した結合）ことである。残基ｊが、ペプチドの位置ｉに生じる場合、一定の
量のｊｉがペプチドの残りの配列に関わらず、このペプチドの結合の自由エネル
ギーに寄与することを仮定する。この仮定は、ペプチドが、実質的に伸びたコン
ホメーションで、ＭＨＣに結合しそしてＴ細胞によって認識されるということを 実証 した本発明者らの研究室からの研究によって証明される（本明細書において
データは省略した）。
【０２７９】 特定のアルゴリズム係数の導出方法は、Ｇｕｌｕｋｏｔａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．２６７：１２５８−１２６，１９９７に記載されている；（Ｓｉｄｎｅ
ｙら，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１９９６；およびＳｏ
ｕｔｈｗｏｏｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３，１９９
８をまた、参照のこと）。簡潔には、全てのｉ位について、アンカーおよび非ア
ンカーと同様に、ｊを保有する全てのペプチドの平均相対結合（ＡＲＢ）の幾何
平均を、この群の残りに対して計算し、そしてｊｉの推定値として使用する。ク
ラスＩＩペプチドについて、複数の整列が可能である場合、最も高いスコアの配
列のみが使用され、反復手順に続く。試験セットにおける所定のペプチドのアル
ゴリズムスコアを計算するために、そのペプチドの配列に対応するＡＲＢ値を、
乗算する。この積が、選択された閾値を超えた場合、このペプチドは、結合する
と予測される。適切な閾値は、所望の予測の厳密さの程度の関数として選択され
る。
【０２８０】 （ＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ交差反応性ペプチドの選択） 前立腺癌関連抗原ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、およびｈＫ２の完全なタンパク質
配列は、ＧｅｎＢａｎｋから得、そして、モチーフ同定ソフトウェアを使用して
走査し、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ主要アンカー特異性を含む８マー、９マ
ー、１０マーおよび１１マーの配列を同定した。
【０２８１】 ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有配列を、表ＶＩＩに示す。次いでこれらの
配列を、Ａ２アルゴリズムを使用してスコア付けし、この陽性とスコア付けした
配列に対応するペプチドを合成し、そしてインビトロで精製ＨＬＡ−Ａ＊０２０
１分子（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１は、原型のＡ２スーパータイプ分子であると考え
られる）を結合するそれらの能力について試験する。
【０２８２】 ＩＣ５０値≦５００ｎＭでＨＬＡ−Ａ＊０２０１に結合する、同定したペプチ
ドの例を、表ＸＸＩＩおよびＸＸＩＩＩに示す。次いで、これらのペプチドを、
さらなるＡ２スーパータイプ分子（Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０６
、およびＡ＊６８０２）に結合する能力について試験した。試験した５つのＡ２
スーパータイプ対立遺伝子のうち少なくとも３つに結合するペプチドを、Ａ２ス
ーパータイプ交差反応性結合剤と考える。好ましいペプチドは５００ｎＭ以下の
親和性で３つ以上のＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ分子に結合する。これらのペプ
チドの例を、表ＸＸＩＩＩに示す（上記の相同性に起因して、多くのＣＴＬおよ
びＨＴＬエピトープは、ＰＳＡおよびｈＫ２抗原両方において示される。このこ
とを、上部の供給源および対立遺伝子供給源として表ＸＸＩＩＩおよびＸＸＩＶ
に示す。）。
【０２８３】 （ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープの選択） 上記で走査したタンパク質配列をまた、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有エ
ピトープを同定するために行った方法に類似する方法論を使用して、ＨＬＡ−Ａ
３スーパーモチーフ一次アンカーを有するペプチドの存在について試験した。
【０２８４】 次いで、これらのスーパーモチーフ保有配列に対応するペプチドを合成し、Ｈ
ＬＡ−Ａ＊０３０１およびＨＬＡ−Ａ＊１１０１分子（２つの最も一般的なＡ３
スーパータイプ対立遺伝子）への結合について試験する。次いで、５００ｎＭ以
下、好ましくは２００ｎＭ以下の結合親和性でこの２つの対立遺伝子のうちの一
方に結合することが見出されるペプチドを、他の一般的なＡ３スーパータイプ対
立遺伝子（Ａ＊３１０１、Ａ＊３３０１、およびＡ＊６８０１）への結合交差反
応性について試験し、これらの試験した５つのＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ分子
のうちの少なくとも３つに結合し得るペプチドを同定する。
【０２８５】 （ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有エピトープの選択） 同じ標的抗原タンパク質配列をまた分析して、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ
保有配列を同定した。次いで、これらの対応するペプチドを合成し、そしてＨＬ
Ａ−Ｂ＊０７０２（最も一般的なＢ７スーパータイプ対立遺伝子（すなわち、原
型のＢ７スーパータイプ対立遺伝子））への結合について試験する。次いで、５
００ｎＭ以下、好ましくは２００ｎＭ以下のＩＣ５０でＢ＊０７０２に結合する
これらのペプチドを、他の一般的なＢ７スーパータイプ分子（Ｂ＊３５０１、Ｂ ＊ ５１０１、Ｂ＊５３０１およびＢ＊５４０１）への結合について試験し、これ
らの試験した５つのＢ７スーパータイプ対立遺伝子のうちの３つ以上に結合し得
るペプチドを同定する。
【０２８６】 （Ａ１およびＡ２４モチーフ保有エピトープの選択） 集団適用範囲をさらに増加させるために、ＨＬＡ−Ａ１エピトープおよびＨＬ
Ａ−Ａ２４エピトープをまた、ワクチン構築物に組み込み得る。上記で利用した
標的抗原からのタンパク質配列データの分析もまた行って、ＨＬＡ−Ａ１−モチ
ーフ含有保存配列およびＨＬＡ−Ａ２４−モチーフ含有保存配列を同定した。次
いで、ペプチド配列を合成し、そして結合について試験した。
【０２８７】 他のスーパーモチーフおよび／またはモチーフを保有するペプチドを、類似の
様式において結合または交差反応性結合について評価し得る。
【０２８８】 （実施例３：免疫原性の確認） 実施例２において記載したように同定した交差反応性候補のＣＴＬ Ａ２スー
パーモチーフ保有ペプチドを、インビトロの免疫原性試験のために選択した。少
なくとも３／５のＨＬＡ−Ａ２スーパータイプファミリーメンバーに２００ｎＭ
以下のＩＣ５０で結合する免疫原性ＨＬＡ−Ａ２交差反応性結合ペプチドの例を
、表ＸＸＩＶに示す。試験を以下の方法論を使用して実施した。
【０２８９】 （細胞性スクリーニングのための標的細胞系） ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子を、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃを有さない
変異体ヒトＢリンパ芽球状細胞株７２１．２２１に移入することによって産生さ
れた、２２１Ａ２．１細胞株を、ペプチドをロードされた標的として用いて、Ｈ
ＬＡ−Ａ２．１拘束ＣＴＬの活性を測定する。この細胞株を、抗生物質、ピルビ
ン酸ナトリウム、非必須アミノ酸および１０％（ｖ／ｖ）熱非働化ＦＣＳを補充
したＲＰＭＩ−１６４０培地で増殖させる。目的の抗原を発現する細胞、または
目的の抗原をコードする遺伝子を含む被形質導入体を、標的細胞として使用して
、内因性の抗原を認識するペプチド特異的ＣＴＬの能力を試験する。
【０２９０】 （一次ＣＴＬ誘導培養物） 樹状細胞（ＤＣ）の作製：ＰＢＭＣを、３０μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅを含むＲ
ＰＭＩに融解し、２回洗浄し、そして完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０ならびに５
％ＡＢヒト血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンおよ
びペニシリン／ストレプトマイシン）に再懸濁する。単球を、６ウェルプレート
に、１ウェル当たり１０×１０６ＰＢＭＣをプレーティングすることによって精
製した。３７℃で２時間後、非付着細胞を、プレートを穏やかに振盪し、そして
上清を吸引することによって除去した。ウェルを、３ｍｌのＲＰＭＩで合計３回
洗浄して、大半の非付着細胞およびゆるい付着細胞を除去した。次いで、５０ｎ
ｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび１，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を含む３ｍｌの完
全培地を、各々のウェルに添加した。ＴＮＦαを、７５ｎｇ／ｍｌで６日後にＤ
Ｃに添加し、そして細胞を、培養の７日後にＣＴＬ誘導培養物について使用した
。
【０２９１】 ＤＣおよびペプチドを用いたＣＴＬの誘導：ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｄｙｎａｌ免
疫磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−４５０）およびｄｅｔａｃ
ｈａ−ｂｅａｄ（登録商標）試薬を用いたポジティブ選択によって単離する。代
表的には、約２００〜２５０×１０６個のＰＢＭＣをプロセスして、２４×１０ ６ 個のＣＤ８＋Ｔ細胞（４８ウェルプレート培養に十分である）を得る。手短に
言えば、ＰＢＭＣを、３０μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅを含むＲＰＭＩに融解し、１
％ヒトＡＢ血清を含むＰＢＳで１回洗浄し、そして２０×１０６細胞／ｍｌの濃
度で、ＰＢＳ／１％ＡＢ血清に再懸濁する。磁気ビーズを、ＰＢＳ／ＡＢ血清で
３回洗浄し、細胞に添加し（２０×１０６細胞当たり１４０μｌのビーズ）、そ
して連続的に混合しながら、４℃で１時間インキュベートする。このビーズおよ
び細胞を、ＰＢＳ／ＡＢ血清で４回洗浄して非付着細胞を除去し、そして１００
μｌ／ｍｌのｄｅｔａｃｈａ−ｂｅａｄ（登録商標）試薬および３０μｇ／ｍｌ
のＤＮＡｓｅを含むＰＢＳ／ＡＢ血清に、１００×１０６細胞／ｍｌで（最初の
細胞数に基づく）再懸濁する。この混合物を、連続的に混合しながら、室温で１
時間インキュベートする。このビーズを、ＰＢＳ／ＡＢ／ＤＮＡｓｅで再び洗浄
して、ＣＤ８＋Ｔ細胞を収集する。ＤＣを収集し、そして１３００ｒｐｍで５〜
７分間遠心分離し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１回洗浄し、計数し、そして２０
℃で４時間、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で、１〜２×１０ ６ ／ｍｌの細胞濃度で、４０μｇ／ｍｌのペプチドを用いてパルス（ｐｕｌｓｅ
）した。次いで、このＤＣを、照射し（４，２００ｒａｄ）、培地で１回洗浄し
、そして再び計数する。
【０２９２】 誘導培養物のセットアップ：０．２５ｍｌのサイトカイン生成ＤＣ（＠１×１
０５細胞／ｍｌ）を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下で、４８ウェルプレー
トの各々のウェルにおいて、０．２５ｍｌのＣＤ８＋Ｔ細胞（＠２×１０６細胞
／ｍｌ）とともに共存培養する。組換えヒトＩＬ１０を、最終濃度１０ｎｇ／ｍ
ｌで翌日添加し、そして組換えヒトＩＬ２を、１０ＩＵ／ｍｌで４８時間後に添
加する。
【０２９３】 ペプチドでパルスした付着細胞での誘導培養物の再度刺激：一次誘導の７日お
よび１４日後、細胞を、ペプチドでパルスした付着細胞で再度刺激する。ＰＢＭ
Ｃを融解し、そしてＲＰＭＩおよびＤＮＡｓｅで２回洗浄する。この細胞を、５
×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、そして約４２００ｒａｄで照射する。ＰＢＭＣ
を、１ウェル当たり０．５ｍｌの完全培地中に２×１０６でプレーティングし、
そして３７℃で２時間インキュベートする。このプレートを、穏やかにプレート
をトラップ（ｔｒａｐ）することによってＲＰＭＩで２回洗浄して、非付着細胞
を除去し、そして付着細胞を、１ウェル当たり０．２５ｍｌのＲＰＭＩ／５％Ａ
Ｂにおいて３μｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリンの存在下で、３７℃で２時間、
１０μｇ／ｍｌのペプチドでパルスする。各ウェルからのペプチド溶液を吸引し
、そしてこのウェルを、ＲＰＭＩで１回洗浄した。大半の培地を、誘導培養物（
ＣＤ８＋細胞）から吸引し、そして新鮮な培地で０．５ｍｌにする。次いで、こ
れらの細胞を、ペプチドでパルスした付着細胞を含むウェルに移した。２４時間
後、組換えヒトＩＬ１０を、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、そして組換えヒ
トＩＬ２を翌日添加し、そして再び５０ＩＵ／ｍｌで２〜３日後に添加する（Ｔ
ｓａｉら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
１８（１−２）：６５−７５、１９９８）。７日後、この培養物を、５１Ｃｒ放
出アッセイにおいてＣＴＬ活性についてアッセイする。いくつかの実験において
、この培養物を、第二の再度刺激時に、インサイチュＩＦＮγ ＥＬＩＳＡにお
いて、ペプチド特異的認識についてアッセイし、その後、７日後に内因性認識の
アッセイを行う。拡張（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）後、活性を、平衡して比較するた
めに両方のアッセイにおいて測定する。
【０２９４】 （５１Ｃｒ放出によるＣＴＬ溶解活性の測定） 第二の再度刺激の７日後、細胞傷害性を、一つのＥ：Ｔで個々のウェルをアッ
セイすることによって、標準的な（５時間）５１Ｃｒ放出アッセイにおいて決定
する。ペプチドでパルスした標的物を、細胞を３７℃で一晩１０μｇ／ｍｌのペ
プチドとともにインキュベートすることによって調製する。
【０２９５】 付着標的細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて培養フラスコから除去する。
標的細胞を、３７℃で１時間、２００μＣｉの５１Ｃｒクロム酸ナトリウム（Ｄ
ｕｐｏｎｔ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）で標識する。標識した標的細胞を、
１０６／ｍｌで再懸濁し、そして３．３×１０６／ｍｌの濃度でＫ５６２細胞を
用いて１：１０に希釈する（ＮＫ感受性赤芽細胞腫（ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ
ｏｍａ）細胞株を使用して、非特異的溶解を減少させる）。標的細胞（１００μ
ｌ）および１００μｌのエフェクターを、９６ウェル丸底プレートにプレーティ
ングし、そして３７℃で５時間インキュベートした。この時、１００μｌの上清
を、各々のウェルから収集し、そしてパーセント溶解を、以下の式に従って決定
する：［（試験サンプルのｃｐｍ−自発的な５１Ｃｒ放出サンプルのｃｐｍ）／
（最大の５１Ｃｒ放出サンプルのｃｐｍ−自発的な５１Ｃｒ放出サンプルのｃｐ
ｍ）］×１００。最大の放出および自発的な放出は、それぞれ、１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００および培地単独とともに、標識された標的物をインキュベートす
ることによって決定する。陽性培地を、個々のウェルの場合に、特異的溶解（サ
ンプル−バックグラウンド）が１０％以上であり、そして拡張された培養物をア
ッセイした場合に、２つの最も高いＥ：Ｔの比で、１５％以上であると規定する
。
【０２９６】 （ペプチド特異的認識および内因性認識の指標としてのヒトγＩＦＮ産生のイ
ンサイチュ測定） Ｉｍｍｕｌｏｎ２プレートを、４℃で一晩、マウス抗ヒトＩＦＮγモノクロー
ナル抗体（４μｇ／ｍｌ ０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．２）でコーティン
グする。このプレートを、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳ／０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、そしてＰＢＳ／１０％ＦＣＳで２時間ブロックし、こ
の後、ＣＴＬ（１ウェル当たり１００μｌ）および標的物（１ウェル当たり１０
０μｌ）を、各々のウェルに添加し、空のウェルを、標準およびブランクのため
に残す（これらには、培地のみ入れる）。標的細胞（ペプチドでパルスした標的
物または内因性の標的物のいずれか）を、１×１０６細胞／ｍｌの濃度で使用す
る。このプレートを、５％ＣＯ２とともに３７℃で４８時間インキュベートする
。
【０２９７】 組換えヒトＩＦＮγを、４００ｐｇ／１００μｌ／ウェルまたは１２００ｐｇ
／１００μｌ／ウェルで開始する標準ウェルに添加し、そしてこのプレートを、
３７℃で２時間インキュベートする。このプレートを洗浄し、そして１００μｌ
のビオチン化マウス抗ヒトＩＦＮγモノクローナル抗体（ＰＢＳ／３％ＦＣＳ／
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０において２μｇ／ｍｌ）を添加し、そして室温で２時
間インキュベートする。再び洗浄した後、１００μｌのＨＲＰ−ストレプトアビ
ジン（１：４０００）を添加し、そして室温で１時間インキュベートする。次い
で、このプレートを、洗浄緩衝液で６回洗浄し、１ウェル当たり１００μｌの展
開溶液（ＴＭＢ１：１）を添加し、そしてこのプレートを、５〜１５分間展開す
る。反応を、１ウェル当たり５０μｌの１Ｍ Ｈ３ＰＯ４で停止させ、そしてＯ
Ｄ４５０にて読み取る。バックグラウンドを超えて１ウェル当たり少なくとも５
０ｐｇのＩＦＮγを測定し、そして発現がバックグラウンドレベルの２倍である
場合に、培養物をポジティブとみなす。
【０２９８】 ＣＴＬ拡張。ペプチドでパルスした標的物および／または腫瘍標的物に対して
特異的な溶解活性を示す培養物を、抗ＣＤ３を用いて２週間を超えて拡張する。
手短に言えば、５×１０４個のＣＤ８＋細胞を、以下を含むＴ２５フラスコに添
加する：１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウ
ム、２５μＭ ２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／
ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−６４０における、１ｍｌ当たり１×１０６ 個の照射（４，２００ｒａｄ）ＰＢＭＣ（自家組織または同種の）、１ｍｌ当た
り２×１０５個の照射（８，０００ｒａｄ）ＥＢＶ−形質転換細胞、および１ｍ
ｌ当たり３０ｎｇでのＯＫＴ３（抗ＣＤ３）。ＲｈｕｍａｎＩＬ２を、２００Ｉ
Ｕ／ｍｌの最終濃度で２４時間後に添加し、その後、５０ＩＵ／ｍｌで新鮮な培
地を３日ごとに添加する。細胞濃度が、１×１０６／ｍｌを超えた場合に、細胞
をはがし、そして培養物を、拡張の前と同じ標的物を用いて、５１Ｃｒ放出アッ
セイにおいて３０：１、１０：１、３：１および１：１のＥ：Ｔ比で、またはイ
ンサイチュＩＦＮγアッセイにおいて１×１０６／ｍｌで、１３日目と１５日目
の間にアッセイする。
【０２９９】 培養物を、続いて抗ＣＤ３＋の非存在で拡張する。ペプチドおよび内因性標的
に対する特異的な溶解活性を示すこれらの培養物を選択し、そして５×１０４Ｃ
Ｄ８＋細胞を、以下を含むＴ２５フラスコに添加する、以下：１ｍｌあたり２時
間３７℃で１０μｇ／ｍｌのペプチドを用いてパルス化し、そして照射（４，２
００ｒａｄ）したペプチドである１×１０６自己ＰＢＭＣ；１０％（ｖ／ｖ）ヒ
トＡＢ血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ ２−ＭＥ、Ｌ
−グルタミンおよびゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０ １ｍｌ当た
り２×１０５個の照射（８，０００ｒａｄ）ＥＢＶ−形質転換細胞。
【０３００】 （Ａ２−スーパーモチーフ保有ペプチドの免疫原性） Ａ２−スーパーモチーフ交差反応性結合ペプチドを、正常な個体においてペプ
チド特異的ＣＴＬを誘導する能力について、細胞性アッセイにおいて試験した。
この分析において、少なくとも２のドナーにおいて（別段の通知のない限り）、
ペプチド特異的ＣＴＬを誘導し、そして好ましくは内因性に発現したペプチドを
また認識する場合に、ペプチドを、エピトープとみなす。免疫原性ペプチドの例
を表ＸＸＩＶに示す。
【０３０１】 さらに、免疫原性を、癌患者から単離されたＰＢＭＣを使用して確認する。簡
単には、ＰＢＭＣを、前立腺癌を有する患者から単離し、ペプチドパルス化され
た単球を用いて再刺激し、そしてペプチドパルス化した標的細胞および抗原を内
因性に発現するトランスフェクトされた細胞を認識する能力についてアッセイす
る。
【０３０２】 （Ａ＊０３／Ａ１１免疫原性の評価） ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフを保有する交差反応性結合ペプチドをまた、Ｈ
ＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドの免疫原性を評価するために使用したもの
と類似の方法論を用いて、免疫原性について評価する。
【０３０３】 （Ｂ７免疫原性の評価） 実施例２において同定されたＢ７スーパータイプ交差反応性結合ペプチドの免
疫原性スクリーニングを、Ａ２およびＡ３スーパーモチーフ保有ペプチドの評価
と類似の様式で評価する。
【０３０４】 他のスーパーモチーフおよび／またはモチーフを保有するペプチド（例えば、
ＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−ａ２４など）をまた、同様の方法論を使用して評価する。
【０３０５】 （実施例４．アナログの作製によってネイティブのエピトープの結合能を改善
するための拡張されたスーパーモチーフのインプリメンテーション） ＨＬＡモチーフおよびスーパーモチーフ（一次残基および／または二次残基を
含む）は、本明細書中に説明されるように、高度に交差反応性のネイティブペプ
チドの同定および調製に有用である。さらに、ＨＬＡモチーフおよびスーパーモ
チーフの定義もまた、ネイティブのペプチド配列内部の残基を同定することによ
って、高度に交差反応性のエピトープの設計を可能にする。このネイティブのペ
プチド配列は、アナログ化されるか（ａｎａｌｏｇｕｅｄ）、または「固定」さ
れて、ペプチドに、特定の特性（例えば、スーパータイプを含むＨＬＡ分子集団
内のより大きな交差反応性、および／またはこれらのＨＬＡ分子のうちのいくつ
かもしくはすべてに対するより大きな結合親和性）を与え得る。調節された結合
親和性を示すアナログペプチドの例を、本実施例に示す。
【０３０６】 （一次アンカー残基でのアナログ化） ペプチド操作ストラテジーを実行して、上記で同定されたエピトープの交差反
応性をさらに増大した（例えば、表ＸＸＩＩＩを参照のこと）。例えば、関連し
、そして同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ ０９／２２６，７７５に開示されるデー
タに基づいて、Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドの主要なアンカーを変更して
、例えば、２位に好ましいＬ、Ｉ、ＶまたはＭを導入し、そしてＣ末端にＩまた
はＶを導入する。
【０３０７】 少なくとも弱いＡ＊０２０１結合（５０００ｎＭ以下のＩＣ５０）を示し、そ
して２位、Ｃ末端位置、またはその両方のいずれかに、最適未満のアンカー残基
を保有するペプチドが、規範的な置換を導入することによって（代表的に２位に
Ｌ、そしてＣ末端にＶ）固定され得る。次いで、Ａ＊０２０１結合において少な
くとも３倍の増大を示し、そして５００ｎＭ、または好ましくは２００ｎＭ以下
のＩＣ５０で結合するこれらのアナログ化ペプチドを、これらの野生型（ＷＴ）
相対物に加えて、Ａ２交差反応性結合について試験する。次いで、５つのＡ２ス
ーパータイプ対立遺伝子のうちの少なくとも３つを結合するアナログ化ペプチド
を、細胞性スクリーニング分析について選択する。
【０３０８】 さらに、細胞性スクリーニング分析についてのアナログの選択を、ＷＴ親ペプ
チドが、３つ以上のＡ２スーパータイプ対立遺伝子に少なくとも弱く結合する（
すなわち、５０００ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する）能力によりさらに限定する
。この要求についての原理は、ＷＴペプチドが、生物学的に適切であるに十分な
量で内因性に存在しなければならない、ということである。アナログ化ペプチド
は、ＷＴエピトープに対して特異的なＴ細胞によって増大した免疫原性および交
差反応性を有することが示されている（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１５７：２５３９、１９９６；およびＰｏｇｕｅら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：８１６６、１９９５を参照のこと
）。
【０３０９】 これらのペプチドアナログの細胞性スクリーニングにおいて、アナログ特異的
ＣＴＬはまた、野生型ペプチド、そして可能であれば、このエピトープを内因性
に発現する腫瘍標的物を認識し得ることを実証することが重要である。
【０３１０】 一次アンカー残基でアナログ化した（一般的に、一次アンカー位置に好ましい
残基を付加することによって）ペプチドを、合成し、増強されたＡ＊０２０１へ
の結合および増強された交差反応性結合について評価した。増加された結合およ
び／または交差反応性を示すアナログ化されたペプチドの例を、表ＸＸＩＩＩに
示す。
【０３１１】 次いで、変化した結合特性を示すアナログを、細胞性スクリーニング研究のた
めに選択する。例を表ＸＩＶに示す。
【０３１２】 ＨＬＡ−Ａ２アナログを開発するために使用されたものと類似の方法論を用い
て、ＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有エピトープのアナロ
グをまた作製する。類似のストラテジーを、他のスーパーモチーフ／モチーフを
保有するペプチドのためになお使用し得る。例えば、Ａ３スーパータイプ分子の
うちの５分の３に少なくとも弱く結合するペプチドは、一次アンカー残基で操作
されて、２位に好ましい残基（Ｖ、Ｓ、ＭまたはＡ）を有し得る。次いで、この
アナログペプチドを、Ａ＊０３およびＡ＊１１（プロトタイプのＡ３スーパータ
イプの対立遺伝子）を結合する能力について試験する。次いで、５００ｎＭ以下
、しばしば２００ｎＭ以下の結合値を示すこれらのペプチドを、Ａ３スーパータ
イプの交差反応性について試験する。例えば、Ｓｉｄｎｅｙらによって明らかに
された（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０，１９９６）ように
、Ｂ７スーパーモチーフ保有ペプチドを操作して、好ましい残基（Ｖ、Ｉ、Ｌま
たはＦ）をＣ末端一次アンカー位置で保持し得、そしてＢ７スーパータイプ対立
遺伝子への結合について試験する。
【０３１３】 （二次アンカー残基でのアナログ化） さらに、ＨＬＡスーパーモチーフは、高度に交差反応性のペプチド、および／
または増大した親和性でＨＬＡ分子を結合するペプチドをこのような性質に関連
する二次アンカー位置で特定の残基を同定することによって、操作する際に有益 で ある。例えば、１位での目立たない（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）１アミノ酸置換の典
型であるＢ７スーパーモチーフ保有ペプチドの結合能を分析し得る。例えば、ペ
プチドをアナログ化して、１位でＬをＦで置換し得、そして引き続いて、増大し
た結合親和性および／または増大した交差反応性について評価し得る。このよう な手順は調節された結合親和性を有するアナログペプチドを同定する。
【０３１４】 結合能力または交差反応性を十分に改善した操作されたアナログを、上のよう
に免疫原性について試験する。
【０３１５】 （他のアナログ化ストラテジー） アンカー位置に関連しない別の形態のペプチドのアナログ化は、αアミノ酪酸
でのシステインの置換に関与する。その化学的性質に起因して、システインは、
ジスルフィド架橋を形成し、そして結合能を減少するように、構造的にペプチド
を十分に変更する性質を有する。システインのαアミノ酪酸での置換は、この問
題を解消するだけではなく、いくつかの例において、結合能および交差結合能を
改善することが示されている（例えば、Ｓｅｔｔｅらによる総説、Ｐｅｒｓｉｓ
ｔｅｎｔ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、Ｒ．ＡｈｍｅｄおよびＩ．Ｃｈ
ｅｎ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９９９を参
照のこと）。
【０３１６】 結論として、これらのデータは、１つのアミノ酸置換でさえ使用することによ
って、ＨＬＡスーパータイプ分子に対するペプチドリガンドの結合親和性および
／または交差反応性を増加し得ることを明らかにする。
【０３１７】 （実施例５．ＨＬＡ−ＤＲ結合モチーフを有するペプチドエピトープ配列の同
定） ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフまたはモチーフを保有するペプチドエピト
ープをまた、実施例１〜３に記載されるものと類似の方法論を用いて、以下に概
説されるように同定し得る。
【０３１８】 （ＨＬＡ−ＤＲスーパーモチーフ保有エピトープの選択） ＨＬＡクラスＩＩ ＨＴＬエピトープを同定するために、前立腺癌関連抗原タ
ンパク質配列を、ＨＬＡ−ＤＲモチーフまたはスーパーモチーフを保有する配列
の存在について分析した。具体的には、９マーのコアをさらに含むＤＲスーパー
モチーフ、ならびに３残基のＮ末端隣接領域およびＣ末端隣接領域を含む（合計
１５アミノ酸）、１５マーの配列を選択する。
【０３１９】 ＤＲ分子に結合するペプチドの推定についてのプロトコールが開発されている
（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３、
１９９８）。個々のＤＲ分子に特異的なこれらのプロトコールは、９マーのコア
領域のスコア付けおよびランク付けを可能にする。各々のプロトコールは、９マ
ーのコアの内部のＤＲスーパーモチーフの一次アンカーの存在（すなわち、１位
および６位）について、ペプチド配列をスコア付けするだけではなく、さらに、
二次アンカーの存在についても配列を評価する。対立遺伝子に特異的な選択表（
例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、同書を参照のこと）を用いて、これらのプロト
コールが、特定のＤＲ分子を結合する高い確率で、ペプチド配列を効果的に選択
することが見出されている。さらに、これらのプロトコール（具体的には、ＤＲ
１、ＤＲ４ｗ４およびＤＲ７についてのプロトコール）を連繋して実行すること
により、ＤＲの交差反応性ペプチドを効果的に選択し得ることが見出されている
。
【０３２０】 上記で同定された前立腺抗原由来のペプチドを、種々の一般的なＨＬＡ−ＤＲ
分子に対する結合能について試験する。すべてのペプチドを、最初に、一次パネ
ル：ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４およびＤＲ７において、ＤＲ分子への結合について試験
する。次いで、１０００ｎＭ以下のＩＣ５０値でこれらの３つのＤＲ分子のうち
の少なくとも２つを結合するペプチドを、ＤＲ５＊０１０１、ＤＲＢ１＊１５０
１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊０８０２およびＤＲＢ１＊１３０２への結
合について試験した。試験した８つの対立遺伝子のうちの少なくとも５つに、１
０００ｎＭ以下のＩＣ５０値で結合した場合、ペプチドを、交差反応性のＤＲス
ーパータイプバインダー（ｂｉｎｄｅｒ）とみなした。
【０３２１】 上記に概説したストラテジーの後、ＤＲスーパーモチーフ保有配列を、前立腺
抗原タンパク質配列内で同定した。一般的に、次いでこれらの配列を、複合（ｃ
ｏｍｂｉｎｅｄ）ＤＲ１−４−７アルゴリズムにおいて、スコア付けした。この
陽性とスコア付けされたペプチドを合成し、そしてＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１
、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１への結合について試験した。次いで
、３つの対立遺伝子の内少なくとも２つを、二次ＤＲスーパータイプ対立遺伝子
：ＤＲＢ５＊０１０１、ＤＲＢ１＊１５０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊ ０８０２およびＤＲＢ１＊１３０２への結合について試験した。
【０３２２】 （ＤＲ３モチーフペプチドの選択） ＨＬＡ−ＤＲ３は、カフカス人集団、黒人集団およびスペイン系人集団におい
て優勢な対立遺伝子であるので、ＤＲ３結合能は、ＨＴＬエピトープの選択にお
ける重要な基準である。しかし、以前に生成されたデータは、ＤＲ３のみが、他
のＤＲ対立遺伝子とめったに交差反応しないことを示した（Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２６３４−２６４０、１９９２；Ｇｅｌｕｋら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５７４２−５７４８、１９９４；Ｓｏｕｔｈｗｏｏ
ｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３、１９９８）。これは
、ＤＲ３ペプチド結合モチーフが、大半の他のＤＲ対立遺伝子の特異性とは異な
ると思われる点において、まったく驚くべきことではない。ワクチン候補物の開
発における最大の効率について、ＤＲ３モチーフが、ＤＲスーパーモチーフ領域
に近接してクラスター化ことが望ましい。従って、候補物であると示されたペプ
チドもまた、そのＤＲ３結合能についてアッセイされ得る。しかし、ＤＲ３モチ
ーフの異なる結合特異性を考慮して、ＤＲ３のみに結合するペプチドをまた、ワ
クチン処方物への包含についての候補物とみなし得る。
【０３２３】 ＤＲ３を結合するペプチドを効果的に同定するために、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＡ
Ｐ、およびｈＫ２タンパク質配列を、Ｇｅｌｕｋら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５
２：５７４２−５７４８、１９９４）によって報告される２つのＤＲ３特異的結
合モチーフ（表ＩＩＩ）のうちの１つを保有する配列について分析した。次いで
、対応するペプチドを合成し、そして１０００ｎＭまたはよりよい（すなわち、
１０００ｎＭ未満の）親和性でＤＲ３を結合する能力について試験する。
【０３２４】 さらに、ＤＲ３結合剤をまた、ＤＲスーパータイプ対立遺伝子への結合につい
て試験する。逆に、ＤＲスーパータイプ交差反応性結合ペプチドをまた、ＤＲ３
結合能について試験する。
【０３２５】 この様式で同定されたＤＲ３結合エピトープをまた、ＤＲ３スーパーモチーフ
保有ペプチドエピトープを有するワクチン組成物中に含む。
【０３２６】 ＨＬＡクラスＩモチーフ保有ペプチドの場合と同様に、クラスＩＩモチーフ保
有ペプチドをアナログ化して、親和性または交差反応性を改善する。例えば、９
マーコア配列の位置４でのアスパラギン酸は、ＤＲ３結合について最適な残基で
あり、そしてこの残基についての置換は、しばしばＤＲ３結合を改善する。
【０３２７】 例えば、多くのＨＬＡ−ＤＲスーパーモチーフおよびＤＲ−３モチーフ保有前
立腺抗原関連配列を、同定している。各部門における数を、表ＸＸＶにまとめる
。
【０３２８】 （実施例６．ＨＴＬエピトープの免疫原性） 本実施例は、実施例５における方法論を用いて同定されたエピトープ間の、免
疫原性ＤＲスーパーモチーフ保有エピトープおよびＤＲ３モチーフ保有エピトー
プを決定する。
【０３２９】 ＨＴＬエピトープの免疫原性を、ＨＴＬ応答を刺激する能力の評価および／ま
たは適切なトランスジェニックマウスモデルの使用によって、ＣＴＬエピトープ
の免疫原性の決定に類似の様式で評価する。免疫原性を、以下についてのスクリ
ーニングによって決定する：１．）正常なＰＢＭＣを用いたインビトロ一次誘導
、または２．）癌患者のＰＢＭＣ由来のリコール（ｒｅｃａｌｌ）応答。
【０３３０】 （実施例７．集団範囲の広さを決定するための、種々の人種背景におけるＨＬ
Ａスーパータイプの表現型頻度の計算） 本実施例は、複数のスーパーモチーフおよび／またはモチーフを含む複数のエ
ピトープから構成されるワクチン組成物の集団範囲の広さの評価を例示する。
【０３３１】 集団範囲を分析するために、ＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子頻度を決定した。各々
のＨＬＡ対立遺伝子についての遺伝子頻度を、二項分布式ｇｆ＝１−（ＳＱＲＴ
（１−ａｆ））を利用して、抗原頻度または対立遺伝子頻度から計算した（例え
ば、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３、１９９
６を参照のこと）。全体の表現型頻度を得るために、累積遺伝子頻度を計算し、
そして累積抗原頻度は、逆関数式［ａｆ＝１−（１−Ｃｇｆ）２］の使用によっ
て導かれた。
【０３３２】 頻度のデータが、ＤＮＡ分類のレベルで入手不可能であった場合、血清学的に
規定された抗原頻度の対応を仮定した。合計の潜在的なスーパータイプの集団範
囲を得るために、連鎖不平衡を仮定せず、そして各々のスーパータイプに属する
ことが確認される対立遺伝子のみを含めた（最小限の見積もり）。位置間（ｉｎ
ｔｅｒ−ｌｏｃｉ）の組み合わせによって達成される合計の潜在的な範囲の見積
もりを、考慮されるＢ対立遺伝子によって覆われることが期待され得る、Ａで覆
われない集団の割合を、Ａ範囲に付加することによって作製した（例えば、合計
＝Ａ＋Ｂ＊（１−Ａ））。Ａ３様スーパータイプの確認されたメンバーは、Ａ３
、Ａ１１、Ａ３１、Ａ＊３３０１およびＡ＊６８０１である。Ａ３様スーパータ
イプはまた、Ａ３４、Ａ６６およびＡ＊７４０１を含み得るが、これらの対立遺
伝子は、合計の頻度計算に含めなかった。同様に、Ａ２様スーパータイプファミ
リーの確認されたメンバーは、Ａ＊０２０１、Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ ＊ ０２０４、Ａ＊０２０５、Ａ＊０２０６、Ａ＊０２０７、Ａ＊６８０２および
Ａ＊６９０１である。最終的に、Ｂ７様スーパータイプの確認された対立遺伝子
は、以下である：Ｂ７、Ｂ＊３５０１〜０３、Ｂ５１、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊５４
０１、Ｂ＊５５０１〜２、Ｂ＊５６０１、Ｂ＊６７０１およびＢ＊７８０１（潜
在的には、またＢ＊１４０１、Ｂ＊３５０４〜０６、Ｂ＊４２０１およびＢ＊５
６０２）。
【０３３３】 Ａ２スーパータイプ、Ａ３スーパータイプおよびＢ７スーパータイプを結合す
ることによって達成される集団範囲は、５つの主要な人種群において、約８６％
である（表ＸＸＩを参照のこと）。範囲は、Ａ１モチーフおよびＡ２４モチーフ
を保有するペプチドを含めることによって拡張され得る。平均して、Ａ１は、５
つの異なる主要な人種群（カフカス人、北米黒人、中国人、日本人およびスペイ
ン系人）に渡る集団の１２％に存在し、そしてＡ２４は、この５つの異なる主要
な人種群に渡る集団の２９％に存在する。合わせて、これらの対立遺伝子を、こ
れらの同じ人種集団において３９％の平均頻度で表す。Ａ１およびＡ２４を、Ａ
２スーパータイプ対立遺伝子、Ａ３スーパータイプ対立遺伝子およびＢ７スーパ
ータイプ対立遺伝子の範囲と組み合わせる場合、主要な民族的背景に渡る合計の
範囲は、９５％を超える。類似のアプローチを使用して、クラスＩＩモチーフ保
有エピトープの組み合わせを用いて達成される集団範囲を概算し得る。
【０３３４】 （実施例８．プライム後の内因性にプロセスされた抗原の誘発の認識） 本実施例は、実施例１〜６に記載されるように同定されかつ選択される、ネイ
ティブのペプチドエピトープまたはアナログ化ペプチドエピトープによって誘導
されるＣＴＬが、トランスジェニックマウスモデルを使用して、内因性に合成さ
れた（すなわち、ネイティブの）抗原を認識することを決定する。
【０３３５】 ペプチドエピトープ（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．３２：６０３、１９９５に記載されるような）で免疫したトランスジェニッ
クマウスから単離したエフェクター細胞（例えば、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチー
フ保有エピトープ）を、ペプチドでコーティングした刺激（ｓｔｉｍｕｌａｔｏ
ｒ）細胞を用いて、インビトロで再度刺激する。６日後、エフェクター細胞を、
細胞傷害性についてアッセイし、そしてペプチド特異的細胞傷害性活性を含む細
胞系を、さらに再度刺激する。さらに６日後、これらの細胞系を、ペプチドの非
存在または存在下で、５１Ｃｒで標識したＪｕｒｋａｔ−Ａ２．１／Ｋｂ標的細
胞に対する細胞傷害性活性について試験し、そしてまた、内因性に合成された抗
原を保有する５１Ｃｒで標識した標的細胞（すなわち、前立腺腫瘍細胞またはＴ
ＡＡ発現ベクターを用いて安定にトランスフェクトされる細胞）について試験す
る。
【０３３６】 結果は、ペプチドエピトープを用いてプライムした動物から得られたＣＴＬ系
が、内因性に合成された抗原を認識することを実証する。このような分析につい
て使用されるべきトランスジェニックマウスモデルの選択は、評価されているエ
ピトープに依存する。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ｋｂトランスジェニックマウスに
加えて、ヒトＡ１１を有するマウスを含むいくつかの他のトランスジェニックマ
ウスモデル（これはまた、Ａ３エピトープを評価するために使用され得る）およ
びＢ７対立遺伝子を有するマウスを含むいくつかの他のトランスジェニックマウ
スモデルが特徴付けられ、そして他のもの（例えば、ＨＬＡ−Ａ１およびＡ２４
についてのトランスジェニックマウス）が開発されている。ＨＬＡ−ＤＲ１マウ
スモデルおよびＨＬＡ−ＤＲ３マウスモデルもまた開発され、これは、ＨＴＬエ
ピトープを評価するために使用され得る。
【０３３７】 （実施例９．トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ−ＨＴＬ結合体化エピ
トープの活性） 本実施例は、腫瘍関連抗原ＣＴＬ／ＨＴＬペプチド結合体の使用によるトラン
スジェニックマウスにおけるＣＴＬおよびＨＴＬの誘導を実証し、それによって
、ワクチン組成物が、癌患者に投与されるべきペプチドを含む。ペプチド組成物
は、複数のＣＴＬエピトープおよび／またはＨＴＬエピトープを含み得、そして
さらに、複数の腫瘍関連抗原から選択されるエピトープを含み得る。このエピト
ープを、実施例１〜６に記載されるような方法論を用いて同定する。この分析は
、ワクチン組成物における１つ以上のＨＴＬエピトープの包含によって達成され
得る免疫原性の増大を実証する。このようなペプチド組成物は、好ましいＣＴＬ
エピトープに結合体化したＨＴＬエピトープを含み得、このＣＴＬエピトープは
、例えば、表ＸＸＩＩＩから選択される少なくとも１つのＣＴＬエピトープまた
はこのエピトープの他のアナログを含む。所望であれば、このペプチドは脂質化
（ｌｉｐｉｄａｔｅ）され得る。
【０３３８】 免疫化手順：トランスジェニックマウスの免疫化を、記載されるように行う（
Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３−４７６１、１
９９７）。例えば、Ａ２／Ｋｂマウス（これは、ヒトＨＬＡ Ａ２．１対立遺伝
子についてトランスジェニックであり、そしてＨＬＡ−Ａ＊０２０１モチーフ保
有エピトープまたはＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有エピトープの免疫原性の
評価に有用である）を、完全フロイントアジュバント、またはペプチド組成物が
脂質化ＣＴＬ／ＨＴＬ結合体である場合、ＤＭＳＯ／生理食塩水またはペプチド
組成物がポリペプチドである場合、ＰＢＳもしくは完全フロイントアジュバント
中の０．１ｍｌのペプチド結合体で、皮下的に（尾の基部）プライムする。プラ
イムの７日後、これらの動物から得られた脾細胞を、ペプチドでコーティングさ
れた、同系の（ｓｙｎｇｅｎｉｃ）照射されたＬＰＳ活性化リンパ芽球で再度刺
激する。
【０３３９】 ペプチド特異的細胞傷害性アッセイについての標的細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１
／Ｋｂキメラ遺伝子でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞である（例えば
、Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７、１９９１）。
【０３４０】 インビトロＣＴＬ活性化：プライムの１週間後、脾臓細胞（３０×１０６細胞
／フラスコ）を、１０ｍｌの培養培地／Ｔ２５フラスコにおいて、同系の照射さ
れた（３０００ｒａｄ）、ペプチドでコーティングされたリンパ芽球（１０×１
０６細胞／フラスコ）とともに、３７℃で共存培養する。６日後、エフェクター
細胞を収集し、そして細胞傷害性活性についてアッセイする。
【０３４１】 細胞傷害性活性についてのアッセイ：標的細胞（１．０〜１．５×１０６）を
、２００μｌの５１Ｃｒの存在下で３７℃でインキュベートする。６０分後、細
胞を３回洗浄し、そして培地中に再懸濁する。ペプチドを添加し、この場合、１
μｇ／ｍｌの濃度で必要とされる。アッセイについて、１０４個の５１Ｃｒで標
識された標的細胞を、Ｕ底の９６ウェルプレートに、異なる濃度のエフェクター
細胞（最終容量は２００μｌ）を添加する。３７℃で６時間のインキュベーショ
ン後、上清の０．１ｍｌのアリコートを、各々のウェルから除去し、そして放射
能を、Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ自動ガンマカウンターにおいて決定する。パーセン
ト特異的溶解を、以下の式によって決定する：パーセント特異的放出＝１００×
（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）。同じ条件下で行われ
る別々のＣＴＬアッセイ間の比較を容易にするために、％５１Ｃｒ放出データを
、溶解単位／１０６細胞として表す。１溶解単位を、６時間の５１Ｃｒ放出アッ
セイにおいて、１０，０００個の標的細胞の３０％の溶解を達成するために必要
とされるエフェクター細胞の数として任意に規定する。特定の溶解単位／１０６ を得るために、ペプチドの非存在下において得られる溶解単位／１０６を、ペプ
チドの存在下において得られる溶解単位／１０６から差し引く。例えば、３０％
の５１Ｃｒ放出が、ペプチドの非存在下で、５０：１のエフェクター（Ｅ）：標
的（Ｔ）比（すなわち、１０，０００個の標的に対して５×１０５個のエフェク
ター細胞）で得られ、そしてペプチドの存在下で、５：１の比（すなわち、１０
，０００個の標的に対して５×１０４個のエフェクター細胞）で得られる場合、
この特定の溶解単位は、以下である：［（１／５０，０００）−（１／５００，
０００）］×１０６＝１８ＬＵ。
【０３４２】 結果を分析して、免疫原性のＣＴＬ／ＨＴＬ結合体ワクチン調製物を用いて注
射された動物のＣＴＬ応答の大きさを評価する。応答の程度および頻度をまた、
ＣＴＬエピトープ自体を使用して達成されるＣＴＬ応答と比較し得る。これに類
似の分析を行って、複数のＣＴＬエピトープおよび／または複数のＨＴＬエピト
ープを含むペプチド結合体の免疫原性を評価し得る。これらの手順に従って、Ｃ
ＴＬ応答が誘導され、そして付随して、ＨＴＬ応答が、このような組成物の投与
の際に誘導されることが見出される。
【０３４３】 （実施例１０：癌ワクチンに含有させるためのＣＴＬエピトープおよびＨＴＬ
エピトープの選択） 本実施例は、本発明ワクチン組成物のためのペプチドエピトープを選択する手
順を説明する。本組成物中のペプチドは、ペプチドをコードする単独または一つ
以上の配列（つまり、ミニジーン）のいずれかの核酸配列という形態であっても
よいし、単独および／またはポリエピトープ性のペプチドであってもよい。
【０３４４】 ワクチン組成物中に含有させるためのエピトープのアレイを選択する際、次の
原理を利用する。選択を行うために、次のそれぞれの原理を比較考慮する。
【０３４５】 投与の際に、腫瘍排除と相関することが認められた免疫応答を模倣するエピト
ープを選択する。例えば、ワクチンには、少なくとも１つの前立腺癌関連抗原由
来の３〜４個のエピトープが含まれ得る。例えば、実施例１５にて記述するよう
な、頻繁に発現されるＴＡＡの発現パターンが変化する腫瘍を標的とするワクチ
ンを調製するために、１つの前立腺癌関連抗原由来のエピトープを、一つ以上の
さらなるＴＡＡ由来のエピトープと組み合わせて使用し得る。
【０３４６】 好ましくは、ＨＬＡクラスＩ分子に対する結合アフィニティー（ＩＣ５０）が
５００ｎＭ以下、多くの場合、２００ｎＭ以下、またはクラスＩＩ分子に対する
結合アフィニティーが１０００ｎＭ以下であるエピトープを選択する。
【０３４７】 幅広い集団の適用範囲を与えるように、十分なスーパーモチーフを持つペプチ
ド、または十分な、対立遺伝子特異的モチーフを持つペプチドの十分なアレイを
選択する。例えば、最低８０％の集団の適用範囲を提供するように、エピトープ
を選択する。集団の適用範囲の広さまたは重複性を評価するために、当該分野で
既知の統計的評価であるモンテカルロ分析を使用し得る。
【０３４８】 癌関連抗原からエピトープを選択する際、患者はネイティブのエピトープに対
して耐性を持つようになるので、多くの場合、アナログを選択することが好まし
い。
【０３４９】 例えばミニジーンなどのポリエピトープ性組成物を調製する際、スペーサーま
たは他の隣接配列もまた組み込まれ得るが、目的のエピトープを含有することが
可能な最小のペプチドを調製することが典型的には望ましい。用いる原理は、多
くの場合、入れ子構造になった（ｎｅｓｔｅｄ）エピトープを含むペプチドを選
択する際に用いる原理と同様である。しかしながら、さらに、ミニジーンとして
提供される核酸配列を決定する際に、「結合エピトープ」が生じているか否かを
調べるために、その核酸配列がコードするペプチド配列を解析する。例えばモチ
ーフ解析により予想されるように、結合エピトープは、潜在的なＨＬＡ結合エピ
トープである。レシピエントがＨＬＡ分子に結合し、ネイティブのタンパク質配
列には存在しないそのエピトープに対して免疫応答を生じ得るので、結合エピト
ープは一般的に避けられるべきである。
【０３５０】 投与する場合、選択したペプチドを含むワクチン組成物は、安全であり、効果
があり、そして免疫応答を誘導し、その結果、腫瘍細胞殺傷および腫瘍サイズま
たは質量の減少を生じる。
【０３５１】 （実施例１１：ミニジーンマルチエピトープＤＮＡプラスミドの構築） 本実施例は、ミニジーン発現プラスミド構築に対する一般的な説明を提供する
。もちろん、ミニジーンプラスミドは、ＣＴＬエピトープおよび／またはＨＴＬ エピトープの種々の配列もしくは本明細書中に記載されるエピトープのアナログ を含み得る。 構築物の例および発現プラスミドの評価は、例えば１９９９年５月
１３日に出願された同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３１１，７８４におい
て記述されている。
【０３５２】 ミニジーン発現プラスミドには、複数のＣＴＬおよびＨＴＬペプチドエピトー
プが含まれ得る。本実施例において、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ
７スーパーモチーフを持つペプチドエピトープおよび、ＨＬＡ−Ａ１およびＨＬ
Ａ−Ａ２４モチーフを持つペプチドエピトープを、ＤＲスーパーモチーフを持つ
エピトープおよび／またはＤＲ３エピトープとともに使用する。幅広い集団の適
用範囲を確実にするために複数のスーパーモチーフ／モチーフが示されるように
、複数の前立腺癌関連抗原由来のＨＬＡクラスＩスーパーモチーフまたはモチー
フ保有ペプチドエピトープを、選択する。同様に、幅広い集団の適用範囲を提供
するように複数の前立腺癌関連抗原からＨＬＡクラスＩＩエピトープを選択する
、つまり、ＨＬＡ ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフを持つエピトープおよび
ＨＬＡ ＤＲ−３モチーフを持つエピトープの両方をミニジーン構築物に含める
ために選択する。次に、選択したＣＴＬおよびＨＴＬエピトープを、発現ベクタ
ーで発現するようにミニジーンに組み込む。
【０３５３】 本実施例は、そのようなミニジーンを持つ発現プラスミドの構築に使用する方
法を例示する。ミニジーン組成物に使用し得る他の発現ベクターが利用可能であ
り、当業者により既知である。
【０３５４】 ミニジーンＤＮＡプラスミドには、コンセンサスコザック配列およびコンセン
サスマウスカッパＩｇ−軽鎖シグナル配列が含まれる。このコンセンサスマウス
カッパＩｇ−軽鎖シグナル配列の後に、本明細書中で開示した原理に従い選択し
たＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープが続く。この配列は、ｐｃＤＮＡ３．
１Ｍｙｃ−ＨｉｓベクターによりコードされたＭｙｃおよびＨｉｓ抗体エピトー
プタグと融合したオープンリーディングフレームをコードする。
【０３５５】 重複するオリゴヌクレオチド（例えば、長さが平均しておよそ７０ヌクレオチ
ドで、１５個のヌクレオチド重複を持つ）を合成し、ＨＰＬＣ精製する。オリゴ
ヌクレオチドは、適切なリンカーヌクレオチドであるコザック配列およびシグナ
ル配列、ならびに選択したペプチドエピトープをコードする。ＰＣＲを用いた３
セットの反応で重複オリゴヌクレオチドを伸長させて、最終的なマルチエピトー
プミニジーンを組み立てる。Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ ９６００ ＰＣＲ装置
を使用し、次の条件を用いて全部で３０サイクル行う。その条件とは、９５℃で
１５秒、アニーリング温度（それぞれのプライマーペアの計算上の最低Ｔｍ値よ
りも５℃低い温度）で３０秒、および７２℃で１分である。
【０３５６】 例えば、ミニジーンを以下のように調製し得る。第一のＰＣＲ反応に対して、
５μｇの二つのそれぞれのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、伸長させる
：例えば、８つのオリゴヌクレオチドを使用する例（すなわち、４つのプライマ
ー対）において、オリゴヌクレオチド１＋２、３＋４、５＋６および７＋８を、
Ｐｆｕポリメラーゼ緩衝液（１×＝１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ
Ｏ４、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸、ｐＨ８．７５、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１
％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、０．２５ｍＭの各
ｄＮＴＰ、および２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含む１００μｌの反応系に添
加する。全長のダイマー産物をゲルにより精製し、１＋２および３＋４の産物、
ならびに５＋６および７＋８の産物を含む２つの反応物を混合し、アニーリング
、伸長反応を１０サイクル行う。次に二つの反応系の半分を混合し、５サイクル
のアニーリングおよび伸長を行った後、隣接プライマーを添加して、２５サイク
ルの反応を行って全長産物を増幅させる。全長産物をゲルにより精製し、ｐＣＲ
−ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、個々のクローンを配
列決定によりスクリーニングする。
【０３５７】 （実施例１２：プラスミド構築物およびそれが免疫原性を誘導する程度） プラスミド構築物（例えば、実施例１１に従って構築したプラスミド）が免疫
原性を誘導し得る程度を、エピトープ発現核酸構築物を用いたＡＰＣの形質導入
またはトランスフェクションに続くＡＰＣによるエピトープ提示について試験す
ることでインビトロで評価し得る。そのような試験により、「抗原性」が決定さ
れ、ヒトＡＰＣの使用が可能になる。細胞表面上のエピトープ−ＨＬＡクラスＩ
複合体密度を定量することにより、Ｔ細胞により認識される状況において、エピ
トープのＡＰＣにより提示される能力がそのアッセイから決定される。直接、Ａ
ＰＣから溶出したペプチド量を測定することにより（例えば、Ｓｉｊｔｓら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：６８３−６９２，１９９６；Ｄｅｍｏｔｚら、Ｎａ
ｔｕｒｅ３４２：６８２−６８４，１９８９を参照すること）定量を行い得る；
または、感染した標的細胞またはトランスフェクトした細胞により誘導される溶
解またはリンホカイン放出量を測定し、次いで同等レベルの溶解またはリンホカ
イン放出を得るために必要なペプチド濃度を決定することによりペプチド−ＨＬ
ＡクラスＩ複合体数を推定し得る（例えば、Ｋａｇｅｙａｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１５４：５６７−５７６、１９９５を参照すること）。
【０３５８】 あるいは、免疫原性を、マウスへのインビボ注射およびそれに続くインビトロ
でのＣＴＬおよびＨＴＬ活性の評価により評価し得る。ＣＴＬおよびＨＴＬ活性
を、例えば、１９９９年５月１３日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ ０９／３１１
，７８４、およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１−７６
１、１９９４にて詳述されているような、細胞傷害性および増殖アッセイをそれ
ぞれ用いて解析する。
【０３５９】 例えば、インビボにてＣＴＬを誘導するために少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２
スーパーモチーフペプチドを含むＤＮＡミニジーン構築物（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｓ
．Ｎ．０９／３１１，７８４にて記述されているように調製したｐＭｉｎミニジ
ーン構築物）の能力を評価するために、例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂトラン
スジェニックマウスに、１００μｇの裸のｃＤＮＡを筋肉内免疫する。ｃＤＮＡ
の免疫によって誘導されるＣＴＬレベルを比較する方法として、複数のエピトー
プがミニジーンによりコードされている場合、単一のポリペプチドとして合成し
た複数のエピトープを含む実際のペプチド組成物を用いて、コントロール群の動
物もまた免疫する。
【０３６０】 免疫した動物由来の脾臓細胞を、それぞれの別個の組成物（ミニジーンでコー
ドされているペプチドエピトープ、またはポリエピトープ性ペプチド）で二回刺
激し、５１Ｃｒ放出アッセイにおいてペプチド特異的細胞傷害性活性についてア
ッセイする。その結果から、Ａ２拘束性エピトープに対して向けられるＣＴＬ応
答の程度、従って、ミニジーンワクチンおよびポリエピトープ性ワクチンのイン
ビボでの免疫原性が示される。従って、ポリエピトープ性ペプチドワクチンが免
疫応答を惹起するように、ミニジーンが、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチ
ドエピトープに対して向けられた免疫応答を惹起するということが明らかになる
。ＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７モチーフ、またはスーパーモチーフエピトー
プによるＣＴＬ誘導を評価するために、他のＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７ト
ランスジェニックマウスモデルを使用して同様の解析をまた行う。
【０３６１】 クラスＩＩエピトープをコードするミニジーンがインビボでＨＴＬ、ＤＲトラ
ンスジェニックマウス、または適切なマウスＭＨＣ分子を用いて交差反応するエ
ピトープを誘導する能力を評価するために、例えば、Ｉ−Ａ ｂ 拘束性マウスに、
筋肉内に１００μｇのプラスミドＤＮＡを免疫する。ＤＮＡ免疫により誘導され
るＨＴＬレベルを比較する方法として、コントロール群の動物もまた、完全フロ
イントアジュバントで乳化した実際のペプチド組成物を用いて免疫する。ＣＤ４
＋Ｔ細胞、つまりＨＴＬを、免疫した動物の脾臓細胞から精製しそれぞれの別個
の組成物（ミニジーンでコードされているペプチド）で刺激する。３Ｈ−チミジ
ン取り込み増殖解析（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：
７５１−７６１，１９９４を参照すること）を用いてＨＴＬ応答を測定する。そ
の結果から、ＨＴＬ応答の大きさ、従って、インビボでのミニジーンの免疫原性
が示される。
【０３６２】 実施例１１にて記述するように構築したＤＮＡミニジーンをまた、プライムブ
ーストプロトコールを用いてブースト薬剤（ｂｏｏｓｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）と
組み合わせたワクチンとして評価し得る。ブースト薬剤は、組換えタンパク質（
例えば、Ｂａｒｎｅｔｔら、Ａｉｄｓ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒ
ｏｖｉｒｕｓｅｓ １４、補遺３：Ｓ２９９−Ｓ３０９，１９９８）または、組
換えワクシニア（例えば、ミニジーンまたは目的の完全なタンパク質をコードす
るＤＮＡを発現する）からなり得る（例えば、Ｈａｎｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ
１６：４３９−４４５，１９９８；Ｓｅｄｅｇａｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：７６４８−５３、１９９８；Ｈａｎｋｅおよび ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ６６：１７７−１８
１，１９９９；およびＲｏｂｉｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：５２６
−３４，１９９９を参照すること）。
【０３６３】 例えば、プライムブーストプロトコールにおいて使用するＤＮＡミニジーンの
有効性を、トランスジェニックマウスにおいて最初に評価し得る。この実施例に
おいて、Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスに対して、少なくとも１つの
ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドを含む免疫原性ペプチドをコードす
る１００μｇのＤＮＡミニジーンを用いて筋肉内注射により免疫する。インキュ
ベーション期間（３−９週間の範囲）後、ＤＮＡミニジーンにコードされている
同じ配列を発現する１０７ｐｆｕ／マウスの組換えワクシニアウイルスを用いて
、マウスに追加免疫を行う。コントロールマウスに、ミニジーン配列無しで、ま
たはミニジーンをコードするＤＮＡとともに、１００μｇのＤＮＡまたは組換え
ワクシニアで免疫するが、ワクシニア追加免疫は行わない。さらなる２週間のイ
ンキュベーション期間後、マウスから採取した脾臓細胞を、直ちにＥＬＩＳＰＯ
Ｔアッセイによってペプチド特異的活性についてアッセイする。さらに、ミニジ
ーン中にコードされているＡ２拘束性ペプチドエピトープおよび組換えワクシニ
アで脾臓細胞をインビボで刺激し、次いで、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡにおいてペプ
チド特異的活性をアッセイする。
【０３６４】 プライムブーストプロトコールで利用したミニジーンが、ＨＬＡ−Ａ２スーパ
ーモチーフペプチドに対して、ＤＮＡ単独の場合よりも大きな免疫応答を惹起す
るということがわかる。ＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７モチーフまたはスーパ
ーモチーフエピトープによるＣＴＬ誘導を評価するために、他のＨＬＡ−Ａ１１
およびＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いてそのような解析も
また行い得る。
【０３６５】 ヒトにおけるプライムブーストプロトコールの使用を、実施例２０に記載する
。
【０３６６】 （実施例１３：予防的使用のためのペプチド組成物） 腫瘍を発症する高い危険性のある人において、癌を予防するために、本発明ワ
クチン組成物を使用する。例えば、集団の８０％以上を標的とするようにも選択
した実施例９および／または１０で選択したような複数のＣＴＬおよびＨＴＬエ
ピトープを含むポリエピトープ性ペプチドエピトープ組成物（または同じものを
含む核酸）を、前立腺癌の高い危険性を持つ個体に投与する。本組成物を、複数
のエピトープを含む単一ポリペプチドとして与える。フロイント不完全アジュバ
ントを含む水性担体とともに本ワクチンを投与する。初回免疫のペプチド用量は
、体重７０ｋｇの患者に対しておよそ１からおよそ５０，０００μｇ、一般的に
は１００−５，０００μｇである。ワクチンの初回投与後、４週間目に追加免疫
投与を行い、その後、ＰＢＭＣ試料中のエピトープ特異的ＣＴＬ集団の存在を測
定する技術により、患者の免疫応答の大きさを評価する。必要に応じてさらなる
追加免疫用量を投与する。本組成物は、安全であること、および癌に対する予防
剤として有効であるということのいずれもが認められる。
【０３６７】 あるいは、当該分野で公知であり本明細書中で開示している方法論に従って核
酸としてポリエピトープ性ペプチド組成物を投与し得る。
【０３６８】 （実施例１４：ネイティブＴＡＡ配列由来のポリエピトープ性ワクチン組成物
） 複数のエピトープを含み、好ましくは、完全なネイティブ抗原より長さが短い
、「比較的短い」ポリタンパク質領域を同定するために、好ましくは、それぞれ
のクラスＩおよび／またはクラスＩＩスーパーモチーフもしくはモチーフに関し
て定義されたコンピューターアルゴリズムを用いて、ネイティブＴＡＡポリタン
パク質配列をスクリーニングする。複数の別個のものでさらに重複しているエピ
トープを含むこの比較的短い配列を選択し、ミニジーン構築物を調製するために
使用する。ネイティブタンパク質配列に相当するペプチドを発現するように構築
物を構築する。「比較的短い」ペプチドは、一般的に長さが１０００、５００、
または２５０アミノ酸未満、多くの場合、長さが１００アミノ酸未満、好ましく
は７５アミノ酸未満、より好ましくは５０アミノ酸未満である。ワクチン組成物
のタンパク質配列は、そのタンパク質配列に含まれるエピトープが最大数である
、つまり、エピトープが高濃度に存在するので、そのタンパク質配列が選択され
る。本明細書中で述べているように、エピトープモチーフを入れ子構造にしても
いよいし、重複させてもよい（つまり、互いに対してフレームシフトが起こって
いる）。例えば、フレームシフトが起こっている重複エピトープがある場合、二
つの９マーのエピトープおよび一つの１０マーのエピトープが、１０アミノ酸ペ
プチド中に存在し得る。治療または予防を目的として、そのようなワクチン組成
物を投与する。
【０３６９】 ワクチン組成物には、好ましくは、例えば、複数の前立腺癌関連抗原由来の３
つのＣＴＬエピトープおよび少なくとも一つのＨＴＬエピトープが含まれる。こ
のポリエピトープ性ネイティブ配列を、ペプチドとして、またはそのペプチドを
コードする核酸配列としてのいずれかで投与する。あるいは、このネイティブ配
列から、アナログを作製し、それにより一つ以上のエピトープがそのポリエピト
ープ性ペプチドの交差反応性および／または結合アフィニティー特性を変化させ
る置換を含む。
【０３７０】 この実施例の実施形態により、今までのところ発見されていない免疫系プロセ
シングの局面がネイティブ入れ子構造配列に対して適用され、それによって治療
または予防を目的とした免疫応答誘導ワクチン組成物の調製を容易にする可能性
が与えられる。さらに、そのような実施形態は、現在のところ未知のＨＬＡ構造
に対する、モチーフを持つエピトープの可能性を提供する。さらに、この実施形
態（アナログがない）は、実際にネイティブＴＡＡに存在し、従っていかなる結
合エピトープを評価する必要も回避する、複数のペプチド配列に対する免疫応答
を指向する。最後に、本実施形態は、核酸ワクチン組成物を調製する場合、規模
の経済性を提供する。
【０３７１】 この実施形態に関連して、当該分野における、標的配列において配列長あたり
のエピトープの最大数を同定する原理に従い、コンピュータープログラムを導出
し得る。
【０３７２】 （実施例１５：複数の腫瘍関連抗原由来のエピトープを含むポリエピトープ性
のワクチン組成物） 本発明の前立腺癌関連抗原ペプチドエピトープを、互いにまたは他の標的腫瘍
関連抗原由来のペプチドエピトープと組み合わせて使用し、複数の患者由来の前
立腺腫瘍の処置に有用なワクチン組成物を作製する。さらに、複数の腫瘍抗原由
来のエピトープを含むワクチン組成物はまた、個体の腫瘍抗原の発現の損失に起
因する逸脱変異に対する潜在能力を減少する。
【０３７３】 様々なＴＡＡ由来の複数のエピトープを組み入れた単一ポリペプチドとして本
組成物を提供し得るか、または一つ以上の別個のエピトープを含む組成物として
本組成物を投与し得る。あるいは、ミニジーン構築物として、またはインビボで
ペプチドエピトープで負荷をかけた樹状細胞として本ワクチンを投与し得る。
【０３７４】 （実施例１６：免疫応答を評価するためのペプチドの使用） 前立腺癌関連抗原に向けられた特異的なＣＴＬまたはＨＴＬ集団の存在に対す
る免疫応答を解析するために本発明ペプチドを使用し得る。例えば、Ｏｇｇら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：２１０３−２１０６，１９９８およびＧｒｅｔｅｎら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：７５６８−７５７３
，１９９８によって記述されているような多量体複合体を用いてそのような解析
を行い得る。次の例において、免疫原としてではなく、診断目的または予測目的
の試薬として本発明に従ったペプチドを使用する。
【０３７５】 この例において、例えば、異なる疾患段階またはその後のＡ＊０２０１モチー
フを含むＴＡＡペプチドを用いた免疫後の腫瘍関連抗原ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽
性患者からのＨＬＡ−Ａ＊０２０１特異的ＣＴＬ頻度の断面的分析について、高
感度のヒト白血球抗原テトラマー複合体（「テトラマー」）を使用する。記述さ
れているように（Ｍｕｒｓｅｙら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：１２６
７，１９９７）、テトラマー複合体を合成する。簡潔に述べると、原核生物発現
システムにより、精製したＨＬＡ重鎖（この実施例でのＡ＊０２０１）およびβ
２−ミクログロブリンを合成する。膜貫通−細胞質テールの欠失およびＣＯＯＨ
−末端へのＢｉｒＡ酵素のビオチン化部位を含む配列付加により重鎖を改変する
。重鎖、β２−ミクログロブリン、およびペプチドを希釈により再折りたたみす
る。４５−ｋＤの再折りたたみ産物を、高速タンパク質液体クロマトグラフィー
で単離し、次に、ビオチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ
）、アデノシン５’三リン酸およびマグネシウム存在下でＢｉｒＡによりビオチ
ン化を行う。ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体をモル比１：４で添
加し、テトラマー産物を１ｍｇ／ｍｌになるように濃縮する。得られた産物をテ
トラマー−フィコエリトリンと呼ぶ。
【０３７６】 患者血液試料の分析に対して、およそ百万のＰＢＭＣを、３００ｇで５分間遠
心分離し、５０μｌの冷リン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁する。抗−ＣＤ８−Ｔ
ｒｉｃｏｌｏｒ、および抗−ＣＤ３８とともに、テトラマー−フィコエリトリン
を用いてＴｒｉ−ｃｏｌｏｒ分析を行う。ＰＢＭＣを、テトラマーおよび抗体と
ともに、氷上で３０分から６０分インキュベーションし、ホルムアルデヒドで固
定する前に二回洗浄する。ゲートに９９．９８％を超えるコントロール試料を含
むようにアプライする。テトラマーのコントロールは、Ａ＊０２０１−陰性の個
体およびＡ＊０２０１−陽性の非感染ドナー両方を含む。次に、テトラマーによ
り染色された細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより測定する。そ
の結果から、エピトープ拘束性ＣＴＬを含むＰＢＭＣ試料における細胞数が示さ
れ、それにより、ＴＡＡエピトープに対する免疫応答の程度、従って腫瘍の進行
段階、または防御的または治療的応答を惹起するワクチンへの曝露が容易に示さ
れる。
【０３７７】 （実施例１７：再帰性応答を評価するためのペプチドエピトープの使用） 本発明ペプチドエピトープを、患者の急性または再帰性の応答などのＴ細胞応
答を評価するための試薬として使用する。寛解状態にある患者、腫瘍がある患者
、または前立腺癌関連抗原ワクチンでワクチン接種されている患者に対してその
ような解析を行い得る。
【０３７８】 例えば、ワクチン接種されている人のクラスＩ拘束性ＣＴＬ応答を解析し得る
。ワクチンは、任意のＴＡＡワクチンであり得る。ＰＢＭＣをワクチン接種され
た個体から回収し、ＨＬＡ型を検出する。次に、必要に応じて、複数のＨＬＡス
ーパータイプファミリーメンバーとの交差反応性を与えるスーパーモチーフを持 つ本発明の適切なペプチドエピトープを、そのＨＬＡ型を持つ個体由来の試料の
解析に使用する。
【０３７９】 ワクチン接種を行った個体由来のＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｉｓｔｏｐａ
ｑｕｅ密度勾配（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
ＭＯ）で分離し、ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で３回洗
浄し、１０％熱非働化ヒトＡＢ血清を含む、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシ
リン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびＨｅｐｅ
ｓ（１０ｍＭ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）（完全ＲＰＭＩ）で再懸濁し、マイクロ培養形式でプレートする。本
発明エピトープを含む合成ペプチドを、１０μｇ／ｍｌになるようにそれぞれの
ウェルに添加し、刺激の第一週目の間の補助的なＴ細胞源としてＨＢＶコア１２
８−１４０エピトープを１μｇ／ｍｌになるように各ウェルに添加する。
【０３８０】 マイクロ培養形式において、１００μｌ／ウェルの完全ＲＰＭＩを添加した９
６ウェル丸底プレート中の８個の同型培養において４×１０ ５ ＰＢＭＣをペプチ
ドで刺激する。３日目と１０日目に、それぞれのウェルに１００μｌの完全ＲＰ
ＭＩおよび最終濃度２０Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２を添加する。７日目に、培養物を
９６ウェル平底プレートへ移し、ペプチド、ｒＩＬ−２および放射線照射（３，
０００ｒａｄ）した１０５個の自系フィーダー細胞で再び刺激する。その培養物
を、１４日目に細胞傷害性活性に関して試験を行う。以前に記述されているよう
に（Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：１１０４−１１０８，
１９９６；Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１６５
５−１６６５，１９９６；およびＲｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．９８：１４３２−１４４０，１９９６）、非感染コントロール被験者と
の比較に基づいて、陽性ＣＴＬ応答として、８個の同型培養物のうちの２以上に
おいて１０％を越える特異的５１Ｃｒ放出を示すことが必要である。
【０３８１】 標的細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏ
ｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＡＳＨＩ，
Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から購入するか、または記述されているように（Ｇｕｉｌ
ｈｏｔら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．６６：２６７０−２６７８，１９９２）、患者のプー
ルから確立するか、いずれかの自系および同種異系ＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬで
ある。
【０３８２】 次の様式で細胞傷害性アッセイを行う。標的細胞は、１０μＭの本発明合成ペ
プチドエピトープと共に一晩インキュベーションを行い、１００μＣｉの５１Ｃ
ｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉ
Ｌ）で１時間標識し、その後ＨＢＳＳで４回洗浄を行った同種異系ＨＬＡ適合ま
たは自系ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球細胞株のどちらかからなる。
【０３８３】 ３，０００標的細胞／ウェルが入っているＵ底９６ウェルプレートを用いて標
準的な４時間のスプリット−ウェル（ｓｐｌｉｔ−ｗｅｌｌ）５１Ｃｒ放出アッ
セイで細胞溶解活性を調べる。１４日目に、２０〜５０：１のエフェクター／標
的（Ｅ／Ｔ）比で、刺激したＰＢＭＣを試験する。式：１００Ｘ［（実験による
放出−自発的放出）／最大放出−自発的放出）］からパーセント細胞傷害性を算
出する。界面活性剤（２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いた標的細胞溶解により最大放
出を調べる。自発的放出は、全ての実験について、最大放出の２５％未満である
。
【０３８４】 そのような解析の結果から、ＨＬＡ−拘束性ＣＴＬ集団がＴＡＡまたはＴＡＡ
ワクチンに対する以前の曝露により刺激されている程度が示される。
【０３８５】 クラスＩＩ拘束性ＨＴＬ応答もまた解析し得る。精製したＰＢＭＣを、９６ウ
ェル平底プレートで、１．５×１０５細胞／ウェルの密度で培養し、１０μｇ／
ｍｌの合成ペプチド、完全抗原、またはＰＨＡで刺激する。細胞を通常通り、そ
れぞれの条件に対して４−６ウェルの同型培養としてプレートする。培養７日後
、培養液を除去し、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮な培養液に交換する。２
日後、１μＣｉの３Ｈ−チミジンをそれぞれのウェルに添加し、さらに１８時間
インキュベーションを続ける。次に細胞内のＤＮＡをグラスファイバーマット上
に取り出し、３Ｈ−チミジン取り込みについて解析する。抗原非存在下での３Ｈ
−チミジン取り込み量で割った抗原存在下での３Ｈ−チミジン取り込み量の比と
して抗原特異的Ｔ細胞増殖を計算する。
【０３８６】 （実施例１８：ヒトでの特異的ＣＴＬ応答の誘導） 本発明ＣＴＬおよびＨＴＬエピトープを含む免疫原性組成物に対するヒトの治
験をＩＮＤフェーズＩ、投与量漸増試験として開始する。そのような治験を、例
えば次のように設計する。
【０３８７】 全体でおよそ２７人の男性被験者を登録し、３つの群に分ける： 第一群：３人の被験者にプラセボを注射し、６人の被験者に５μｇのペプチド
組成物を注射する。
【０３８８】 第二群：３人の被験者にプラセボを注射し、６人の被験者に５０μｇのペプチ
ド組成物を注射する。
【０３８９】 第三群：３人の被験者にプラセボを注射し、６人の被験者に５００μｇのペプ
チド組成物を注射する。
【０３９０】 最初の注射から４週間後に、全ての被験者に対して同じ投与量で追加免疫接種
を行う。同じスケジュールで更なる追加免疫接種を行い得る。
【０３９１】 この試験で測定する項目は、ペプチド組成物の免疫原性と同時にその安全性お
よび認容性に関連する。本ペプチド組成物に対する細胞性免疫応答は、ペプチド
組成物の本質的な活性の指標であり、従って、生物学的有効性の目安として見な
され得る。次に、安全性および有効性の項目に関連する臨床および実験データを
要約する。
【０３９２】 安全性：プラセボおよび薬物処置群で有害事象の発生率を監視し、程度およ
び可逆性に関して評価する。
【０３９３】 ワクチン有効性の評価：ワクチンの有効性を評価するために、被験者から注
射の前後に採血する。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により末
梢血単核細胞を新鮮なヘパリン処理血液から単離し、凍結保存用培地中にアリコ
ートに分け、冷凍保存する。試料をＣＴＬおよびＨＴＬ活性に関して分析する。
【０３９４】 本ワクチンが安全であり有効であることが認められる。
【０３９５】 （実施例１９：癌患者における治療的使用） 癌患者におけるＣＴＬ−ＨＴＬペプチド組成物の有効性を確認するために、ワ
クチン組成物の評価を行う。本治験の主要な目的は、癌患者においてＣＴＬを誘
導するために有効な用量およびレジメンを決定すること、これらの患者における
ＣＴＬおよびＨＴＬ応答誘導の安全性を確立すること、およびどの程度のＣＴＬ
活性化が、腫瘍細胞数の減少により明らかとなるように、癌患者の臨床状態を向
上させるのかを調べることである。例えば次のように、そのような治験を設計す
る。
【０３９６】 複数の施設で本試験を行う。本治験設計は、単回用量としてペプチド組成物を
投与し、６週間後に同じ用量で単回追加免疫を行う、非盲検の非対照用量漸増プ
ロトコール（ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ，ｕｎｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｄｏｓｅ ｅ
ｓｃａｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）である。投与量は、一回の注射あたり
５０、５００および５０００マイクログラムである。薬物関連副作用（重症度お
よび可逆性）を記録する。
【０３９７】 患者を３群に分ける。第一群に、５０μｇのペプチド組成物を注射し、第二群
、第三群に、それぞれ、５００および５０００μｇのペプチド組成物を注射する
。それぞれの群の患者は、男性であり、典型的に５０歳より上であり、そして人
種背景を示す。
【０３９８】 （実施例２０：プライムブーストプロトコールを用いたＣＴＬ応答の誘導） その基礎をなす原理において、実施例１２で記述したようなトランスジェニッ
クマウスでのＤＮＡワクチン有効性を評価するために使用するプロトコールと同
様のプライムブーストプロトコールを、ヒトへのワクチン投与に対しても使用し
得る。このようなワクチンレジメンには、例えば裸のＤＮＡを用いた初回投与と
、それに続く本ワクチンをコードする組換えウイルス、またはアジュバント中で
投与される組換えタンパク質／ポリペプチドもしくはペプチド混合物を用いた追
加免疫が含まれ得る。
【０３９９】 例えば、裸の核酸を複数部位に０．５〜５ｍｇの量をＩＭ（またはＳＣもしく
はＩＤ）投与する形態で、実施例１１に従って構築されるような発現ベクターを
用いて初回免疫を行い得る。その核酸（０．１から１０００μｇ）はまた、遺伝
子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）を用いて投与することも可能である。３−４週間のイ
ンキュベーション期間後、追加免疫投与を行う。追加免疫は、組換え鶏痘ウイル
スを５×１０７から５×１０９ｐｆｕの用量で投与するものであり得る。ＭＶＡ
、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスなどの、他
の組換えウイルスもまた、追加免疫に使用してもよいし、ポリエピトープ性のタ
ンパク質またはペプチド混合物を投与してもよい。ワクチンの有効性を評価する
ために、患者血液試料を、免疫前ならびに初回ワクチン投与後および追加免疫用
量のワクチン投与後に一定間隔で採取する。新鮮なヘパリン処理血液から、Ｆｉ
ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により末梢血単核細胞を単離し、凍
結保存用培地中にアリコートに分け、凍結保存する。試料をＣＴＬおよびＨＴＬ
活性に関してアッセイする。
【０４００】 その結果の解析から、前立腺癌に対する防御免疫を達成するに十分な応答の大
きさが生じることが示される。
【０４０１】 （実施例２１：樹状細胞を用いたワクチン組成物の投与） 抗原提示細胞（ＡＰＣ）または樹状細胞（ＤＣ）などの「専門の（ｐｒｏｆｅ
ｓｓｉｏｎａｌ）」ＡＰＣを用いて本発明のペプチドエピトープを含むワクチン
を投与し得る。この実施例において、インビボでのＣＴＬ応答を刺激するために
ペプチドでパルスしたＤＣを患者に投与する。この方法において、樹状細胞を単
離し、増大させ、本発明のペプチドＣＴＬおよびＨＴＬエピトープを含むワクチ
ンでパルスする。インビボでＣＴＬおよびＨＴＬ応答を誘発するように、樹状細
胞を、患者に注入して戻す。そして、誘導したＣＴＬおよびＨＴＬは、ワクチン
中のエピトープが由来するタンパク質を持つ特異的標的腫瘍細胞を破壊（ＣＴＬ
）、または破壊を促進（ＨＴＬ）する。
【０４０２】 例えば、エピトープを持つペプチドのカクテルを、エキソビボで患者血液由来
のＰＢＭＣに投与するか、または患者から単離したＤＣに投与する。ＤＣの回収
を促進する薬剤、例えばＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ
，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４のような薬剤を使用
し得る。ＤＣをペプチドでパルスした後、および患者に再注入する前に、非結合
ペプチドを除去するためにＤＣを浄化する。
【０４０３】 臨床的に認識されるように、および臨床成果を基礎にした技術の一つにより容
易に決定されるように、患者に再注入する樹状細胞数は様々であり得る（例えば
、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４：３２８，１９９８；Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：
５２，１９９６およびＰｒｏｓｔａｔｅ ３２：２７２，１９９７を参照するこ
と）。典型的には、患者一人当たり２〜５０×１０６の樹状細胞を投与するが、
１０７または１０８のようなさらに多くの樹状細胞をも与えられ得る。そのよう
な細胞集団は、典型的に、５０〜９０％の樹状細胞を含む。
【０４０４】 いくつかの実施形態において、ペプチドを負荷したＰＢＭＣを、ＤＣを精製せ
ずに患者に注入する。例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｅｔｉｎＴＭのような薬剤で
処理した後に生じたＤＣを含むＰＢＭＣを、ＤＣを精製せずに患者に注射する。
投与するＰＢＭＣの総数は、多くの場合、１０８から１０１０の範囲である。一
般的に、患者に注射する細胞用量は、例えば特異的抗ＤＣ抗体を用いた免疫蛍光
解析により測定されるような、それぞれの患者の血液中のＤＣのパーセンテージ
に基づく。従って、例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭによって所定の
患者の末梢血液中で２％のＤＣが動員され、その患者が５×１０ ６ 個の細胞を受
容する場合、その患者はペプチドを負荷した２．５×１０８個のＰＢＭＣを注射
される。ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭなどの薬剤により動員されたＤＣの
パーセントは、典型的に、２−１０％の間と見積もられるが、当業者によって認
識されるように様々であり得る。
【０４０５】 免疫応答を刺激するＤＣの能力をインビトロおよびインビボの両方で免疫機能
アッセイを評価した。これらのアッセイは、ＣＴＬハイブリドーマおよびＣＴＬ
細胞株の刺激、ならびにＣＴＬのインビボ活性化を含む。
【０４０６】 （ＤＣ精製） ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで固定化された細胞を、Ｐｒｏｇｅｎｉｐ
ｏｉｅｔｉｎＴＭで処置されたＣ５７Ｂ１／６マウスの末梢血（ＰＢ）および脾
臓から精製し、抗原を提示し、そして細胞性免疫応答を導き出す能力を評価した
。簡単には、ＤＣを総ＷＢＣおよび脾臓から陽性選択ストラテジー（ＣＤ１１ｃ
特異的抗体でコーティングされた磁気性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅ
ｃ、Ａｕｂｕｒｎ ＣＡ）を使用する）を使用して精製した。比較として、エキ
ソビボで拡張されたＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の標準的カクテル（Ｒ
＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて未処置のＣ５
７Ｂ１／６マウス由来の骨髄細胞を７〜８日の期間、培養することによって生成
した（Ｍａｙｏｒｄｏｍｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：１２９７−１３０２
（１９９５））。最近の研究は、このエキソビボで拡張されたＤＣ集団が、有効
な抗原提示細胞を含み、抗腫瘍免疫応答を刺激する能力を有することが明らかに
されている（Ｃｅｌｌｕｚｚｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．８３：２８３−２８７
（１９９６））。
【０４０７】 ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで誘導されたＤＣ（１００μｇ／日、１０
日、ＳＣ）およびＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４エキソビボ拡張された細胞の精製
を、フローサイトメトリーによって決定した。ＤＣ集団を、ＣＤ１１ｃおよびＭ
ＨＣクラスＩＩ分子の両方を発現する細胞として定義した。磁気性ＣＤ１１ｃマ
クロビーズからのＤＣの精製に続いて、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで処
置されたマウスから単離した２重陽性のＰＢで誘導されたＤＣのパーセンテージ
を、約４％から４８〜５７％の範囲に高めた（平均収量＝４．５×１０６ＤＣ／
動物）。ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで処置されたマウスから単離した精
製された脾性ＤＣのパーセンテージを、１２〜１７％の範囲から６７〜７７％の
範囲に高めた。ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４エキソビボ拡張された細胞の精製は、３
１〜４１％の範囲であった（Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１：
３２０４０（１９９８））。
【０４０８】 （ＣＴＬハイブリドーマおよびＣＴＬ細胞株のインビトロ刺激：特異的ＣＴｌ
エピロープの提示） ＣＴＬ細胞株をＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで生成されたＤＣの能力を
、ウイルス由来エピトープおよび対応するエピトープ応答性ＣＴＬ細胞株を使用
してインビトロで明らかにした。ヒトＨＬＡ−Ａ２．１を発現するトランスジェ
ニックマウスを、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで処置した。これらのマウ
スから単離された脾性ＤＣを、ペプチドエピトープ（Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ
Ｐｏｌ ４５５）由来）でパルス化し、そして次いでＩＦＮγを産生すること
によってＨＢＶ Ｐｏｌ ４５５エピトープ／ＨＬＡ−Ａ２．１複合体に応答す
るＣＴＬ細胞株を用いてインキュベートした。ＨＢＶ Ｐｏｌ ４５５エピトー
プを提示するＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで誘導された脾性ＤＣの能力は
、２つの陽性コントロール集団（ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４拡張ＤＣ培養物、
または精製脾性Ｂ細胞）の能力よりも大きかった。Ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉ
ｎＴＭで誘導された脾性細胞対他の抗原提示細胞についての応答曲線における左
のシフトは、これらのＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで誘導された細胞が、
応答細胞株によって放出される最大ＩＦＮγを刺激するためにより少ないエピト
ープ必要とすることを示した。
【０４０９】 インビボにおけるＣＴＬ応答を刺激するエキソビボでペプチドパルス化された
ＤＣの能力をまた、ＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスモデルを使用し
て評価した。ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで処置された動物由来のＤＣま
たはＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で拡張した後の骨髄細胞由来のコントロールＤ
Ｃを、エキソビボでＨＢＶ Ｐｏｌ ４５５を用いてパルス化し、浄化し、そし
てこのようなマウスへ注射した（ＩＶ）。免疫化の７日経過後、脾臓を除去し、
ＤＣおよびＣＴＬを含む脾臓細胞を、ＨＢＶ Ｐｏｌ ４５５ペプチドの存在下
でインビトロで２回再刺激した。再刺激された脾臓細胞培養物３つの独立した培
養物のＣＴＬ活性を、ペプチドを用いて、または用いずにパルス化した５１Ｃｒ
標識した標的細胞を溶解するＣＴＬの能力を測定することによって評価した。強
力なＣＴＬ応答を、エピトープパルス化されたＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴ Ｍ で誘導されたＤＣならびにエピトープパルス化されたＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４
ＤＣで免疫化した動物において生成した。対照的に、擬パルス化したＰｒｏｇ
ｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで産生されたＤＣ（ペプチドなし）で免疫化された動
物は、ＣＴＬ誘導の証拠を示さなかった。従って、これらのデータは、Ｐｒｏｇ ｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ誘導化ＤＣが、ヒトＭＨＣクラスＩを表すモデルにお いてＣＴＬ応答を促進するという原理を支持する。
【０４１０】 これらのデータは、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭで処置されたマウス由
来のＤＣを、エキソビボでエピトープを用いてパルス化し、そしてインビボにお
ける特異的ＣＴＬ応答を誘導するために使用し得ることを確認する。
【０４１１】 マウスにおけるインビボ薬理学的研究は、動物へのパルス化された自己ＤＣの
再注入の明らかな毒性はないことを明らかにしている。
【０４１２】 （エキソビボでのＣＴＬ／ＨＴＬ応答活性化） あるいは、組織培養中で、患者の、または遺伝学的に適合性のＣＴＬまたはＨ
ＴＬ前駆細胞を、樹状細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）源および適切な免疫
原性ペプチドとともにインキュベーションすることによって、特定の腫瘍関連抗
原に対するｅｘ ｖｉｖｏでのＣＴＬまたはＨＴＬ応答を誘導し得る。前駆細胞
が活性化されエフェクター細胞へと発達するような適切なインキュベーション時
間後（典型的には７−２８日）、その細胞を患者に注入して戻す。そこで、戻さ
れた細胞はそれらの特異的標的細胞、つまり腫瘍細胞を破壊（ＣＴＬ）または破
壊（ＨＴＬ）を容易にするする。
【０４１３】 （実施例２２：モチーフを持つペプチドの代替的同定法） モチーフを持つペプチドを同定する別の方法は、規定されたＭＨＣ分子を持つ
細胞からそれらを抽出することである。例えば、組織型決定に使用するＥＢＶ形
質転換Ｂ細胞株は、それがどのＨＬＡ分子を発現しているのかを決定するために
徹底的に特徴付けられた。ある場合では、これらの細胞はただ一つのタイプのＨ
ＬＡ分子のみを発現する。これらの細胞を病原性生物に感染させてもよいし、こ
れらの細胞に目的の腫瘍抗原を発現する核酸をトランスフェクトしてもよい。そ
の後、感染の結果として（またはトランスフェクションの結果として）産生され
たペプチドの内因性抗原プロセシングにより生じたペプチドが、細胞中でＨＬＡ
分子と結合し、細胞表面上に運ばれ提示される。
【０４１４】 次に、温和な酸性条件に曝露することにより、ペプチドをＨＬＡ分子から抽出
し、例えば、質量分析によって（例えば、Ｋｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
５２：３９１３，１９９４）そのアミノ酸配列を決定する。本明細書中で開示し
ているように特定のＨＬＡ分子を結合する大部分のペプチドがモチーフを持つも
のなので、これは、細胞上で発現されている特定のＨＬＡ分子と相関したモチー
フを持つペプチドを獲得するための代わりの様相である。
【０４１５】 あるいは、内因性ＨＬＡ分子を全く発現していない細胞株に、１つのＨＬＡ対
立遺伝子をコードする発現構築物をトランスフェクションし得る。そこでこれら
の細胞を記述するように使用し得る、つまり、細胞表面上に提示されている目的 の 病原体または目的の抗原に相当するペプチドを単離するために、これらの細胞
に病原性生物を感染させてもよいし、目的の抗原をコードする核酸をトランスフ
ェクションしてもよい。そのような分析から得たペプチドは、細胞で発現される
一つのＨＬＡ対立遺伝子との結合に対応するモチーフを持つ。
【０４１６】 当業者により認識されるように、１を超えるＨＬＡ対立遺伝子を持つ細胞にお
いて同様の分析を行い、続いて、発現しているそれぞれのＨＬＡ対立遺伝子に特
異的なペプチドを決定し得る。さらに、当業者はまた、細胞に対して抗原源を与
えるために、タンパク質抗原での負荷のような、感染またはトランスフェクショ
ン以外の手段を使用し得るということも認識する。
【０４１７】 本発明を説明するために上記の実施例を提供するが、これはその範囲を限定す
るものではない。例えば、主要組織適合遺伝子複合体についてのヒトの用語、す
なわちＨＬＡを、この書類全体を通して使用する。これらの原理を他の種に同じ
ように拡大し得ることが認識される。従って、本発明の他の改変が、当業者に対
して容易に明らかであり、添付の特許請求の範囲により包含される。本明細書で
引用する全ての刊行物、特許および特許出願は全ての目的に対して参考として本
明細書により援用される。
【０４１８】
【表１】
【０４１９】
【表２】
【０４２０】
【表３】
【０４２１】
【表４】
【０４２２】
【表５】
【０４２３】
【表６】
【０４２４】
【表７】
【０４２５】
【表８】
【０４２６】
【表９】
【０４２７】
【表１０】
【０４２８】
【表１１】
【０４２９】
【表１２】
【０４３０】
【表１３】
【０４３１】
【表１４】
【０４３２】
【表１５】
【０４３３】
【表１６】
【０４３４】
【表１７】
【０４３５】
【表１８】
【０４３６】
【表１９】
【０４３７】
【表２０】
【０４３８】
【表２１】
【０４３９】
【表２２】
【０４４０】
【表２３】
【０４４１】
【表２４】
【０４４２】
【表２５】 （訂正の理由１） 特許請求の範囲を上記のように補正します。 （訂正の理由２） 特許法第１８４条の４第１項の規定に基づいて平成１４年６月２１日に提出い
たしました翻訳文中の発明の詳細な説明の全体にわたって誤訳が存在するため、
それらの誤訳を訂正します。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年７月３１日（２００２．７．３１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】 表中、モチーフおよび／またはスーパーモチーフ保有アミノ酸配列は、前立腺
抗原アミノ酸配列、および下に提供される番号付けに関して位置の数およびエピ
トープの長さによって同定される。「ｐｏｓ」（位置）欄は、エピトープの最初
のアミノ酸残基に対応する下の前立腺抗原配列タンパク質配列中のアミノ酸位置
を示す。「アミノ酸の数」は、エピトープ配列中の残基の数を、ひいてはエピト
ープの長さを示す。例えば表ＶＩＩに列挙した最初のペプチド配列は、ＰＡＰの
位置１２２で始まる１１残基長の配列である。したがって、このエピトープのア
ミノ酸配列は、ＡＬＦＰＰＥＧＶＳＩＷ（配列番号１）である。同様に、表ＶＩ
Ｉにおける第１のカリクレインは、位置１４７で始まり、そして１１残基長であ
る。従って、アミノ酸配列は、ＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷ（配列番号２）である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】 ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）（配列番号３）
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
【化１】 ＰＡＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）（配列番号４）
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
【化２】 ＰＳＭ（前立腺特異的膜抗原）（配列番号５）
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
【化３】 カリクレイン（ヒトカリクレイン２、受託ＮＭ００５５５１）（配列番号６）
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】 ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフを含む代表的な９マーペプチド配列（スー
パーモチーフの位置１が９残基コアの位置１にある）は、表ＸＩＸに示す。各配
列について、「タンパク質」欄は、前立腺関連抗原（すなわち、ＰＳＡ、ＰＳＭ
、ＰＡＰ、またはＨｕＫ２（カリクレイン））を示す。「位置」欄は、コア配列
の第１のアミノ酸残基に対応する前立腺抗原タンパク質配列におけるアミノ酸位
置を示す。コア配列は、全て９残基長である。例えば、表ＸＩＸに列挙される第
１のＰＳＭ配列は、９残基長のコア配列であり、本明細書中に提供されるＰＳＭ
アミノ酸配列の位置６１１で開始する。従って、コア配列のアミノ酸配列は、Ｉ
ＹＳＩＳＭＫＨＰ（配列番号７）である。９残基コアを含む１５アミノ酸長の例
示的なエピトープは、、９残基コアの側面にある各側で３残基を含む。例えば、
ＰＳＭの位置６１１でコアエピトープを含む、１５アミノ酸残基長の例示的エピ
トープは、ＡＤＫＩＹＳＩＳＭＫＨＰＱＥＭ（配列番号８）である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】 ＤＲ３ａまたはＤＲ３ｂサブモチーフ（モチーフの位置１が９残基コアの位置
１である）を含む９残基配列に対応する、ペプチドエピトープ９マーコア領域は
、表ＸＸａおよびｂに記載されている。各配列に関して、「タンパク質」欄は、
前立腺関連抗原（すなわち、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＡＰ、またはＨｕＫ２（カリク
レイン））を示す。「位置」欄は、コア配列の第１のアミノ酸残基に対応する前
立腺抗原タンパク質配列におけるアミノ酸位置を示す。コア配列は、全て９残基
長である。例えば、表ＸＸａに列挙される第１の配列は、９残基長のコア配列で
あり、本明細書中に提供されるＰＡＰアミノ酸配列の位置１２４で開始する。従
って、コア配列のアミノ酸配列は、ＦＰＰＥＧＶＳＩＷ（配列番号９）である。
９残基コアを含む１５アミノ酸長の例示的なエピトープは、９残基コアの側面に
あるいずれかの側で３残基を含む。例えば、ＰＡＰの位置１２４でコアエピトー
プを含む、１５アミノ酸長の例示的エピトープは、ＡＡＬＦＰＰＥＧＶＳＩＷＮ
ＰＩ（配列番号１０）である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０７】 ある種の実施形態では、Ｔヘルパーペプチドは、大多数の集団中に存在するＴ
ヘルパー細胞により認識されるものである。これは多数の、ほとんどの、または
全てのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するアミノ酸配列を選定することにより成し
遂げられ得る。これらは「ゆるくＨＬＡ拘束された」または「混然とした」Ｔヘ
ルパー配列として既知である。混然としたペプチドの例としては、位置８３０〜
８４３（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（配列番号１１））での破傷風毒素、位
置３７８〜３９８（ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ（配列番号１ ２） ）でのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（熱帯熱マラリア原虫
）スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質、および位置１１６（ＧＡＶＤＳＩＬＧ
ＧＶＡＴＹＧＡＡ（配列番号１３））でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（連鎖球
菌）１８ｋＤタンパク質のような抗原からの配列が挙げられる。その他の例とし
ては、ＤＲ１−４−７スーパーモチーフ、またはＤＲ３モチーフのいずれかを保
有するペプチドが挙げられる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０８】 あるいは、天然には見出されないアミノ酸配列を用いて、ゆるくＨＬＡ拘束さ
れた様式で、Ｔヘルパーリンパ球を刺激し得る合成ペプチドを調製することがで
きる（例えば、国際公開公報第９５／０７７０７号参照）。汎ＤＲ結合エピトー
プ（例えばＰＡＤＲＥ（商標）、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，ＣＡ）と呼ばれるこれらの合成化合物は、最も好ましくはほとんどのＨＬ
Ａ−ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子を結合するよう設計される。例えば、次
式：ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（配列番号１４）（式中、「Ｘ」はシクロヘキ
シルアラニン、フェニルアラニンまたはチロシンであり、「ａ」はＤ−アラニン
またはＬ−アラニンである）を有する汎ＤＲ結合エピトープペプチドは、ほとん
どのＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に結合し、それらのＨＬＡ型とは関係なく、ほとん
どの個体からのＴヘルパーリンパ球の応答を刺激することが判明した。汎ＤＲ結
合エピトープの代替物は、全ての「Ｌ」型天然アミノ酸を含み、エピトープをコ
ードする核酸の形態で提供され得る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２１】
【表４】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２２】
【表５】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３９】
【表２２】
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４０】
【表２３】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４１】
【表２４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シドニー， ジョン アメリカ合衆国 カリフォルニア 92130， サン ディエゴ， コート デ ラ シ エナ 4218 (72)発明者 サウスウッド， スコット アメリカ合衆国 カリフォルニア 92071， サンティー， ストラスモア ドライブ 19679 (72)発明者 チェスナット， ロバート アメリカ合衆国 カリフォルニア 92007， カーディフ−バイ−ザ−シー， キング ス クロス ドライブ 1473 (72)発明者 セリス， エステバン アメリカ合衆国 ミネソタ 55902， ロ チェスター， ライト ロード エス．ダ ブリュー． 3683 (72)発明者 ケオグ， エリッサ アメリカ合衆国 カリフォルニア 92122， サン ディエゴ， カミニト ディア ナンバー２ 7999 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA36 CA04 DA02 EA02 EA04 GA11 GA18 HA03 4B065 AA91X AA93X CA44 4C085 AA03 AA04 BB01 CC21 DD62 EE06 FF24 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA41 DA86 EA28 EA31 FA74

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離された調製された前立腺癌関連抗原エピトープであって
    、該エピトープは、表ＸＸＩＶにて示される配列からなる群より選択される配列
    からなる、エピトープ。
  2. 【請求項２】 前記エピトープがＣＴＬエピトープと混合しているかまたは
    ＣＴＬエピトープに結合している、請求項１に記載の組成物。
  3. 【請求項３】 前記ＣＴＬエピトープが請求項１にて示される群より選択さ
    れる、請求項２に記載の組成物。
  4. 【請求項４】 前記エピトープがＨＴＬエピトープと混合しているかまたは
    ＨＴＬエピトープに結合している、請求項１に記載の組成物。
  5. 【請求項５】 前記ＨＴＬエピトープが請求項１にて示される群より選択さ
    れる、請求項４に記載の組成物。
  6. 【請求項６】 前記ＨＴＬエピトープが汎ＤＲ結合分子である、請求項４に
    記載の組成物。
  7. 【請求項７】 請求項１にて示される群より選択される少なくとも３つのエ
    ピトープを含む、請求項１に記載の組成物。
  8. 【請求項８】 リポソームをさらに含む請求項１に記載の組成物であって、
    前記エピトープが該リポソーム上にあるかまたは該リポソーム内にある、組成物
    。
  9. 【請求項９】 前記エピトープが脂質に結合している、請求項１に記載の組
    成物。
  10. 【請求項１０】 前記エピトープがリンカーに結合している、請求項１に記
    載の組成物。
  11. 【請求項１１】 前記エピトープが、ＨＬＡ重鎖と、β２−ミクログロブリ
    ンと、ストレプトアビジンとの複合体に結合しており、それによりテトラマーが
    形成されている、請求項１に記載の組成物。
  12. 【請求項１２】 抗原提示細胞をさらに含む請求項１に記載の組成物であっ
    て、前記エピトープが、該抗原提示細胞上にあるかまたは該抗原提示細胞内にあ
    る、組成物。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の組成物であって、前記エピトープが前
    記抗原提示細胞上のＨＬＡ分子に結合しており、それにより、該ＨＬＡ分子に拘
    束されている細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）が存在する場合には、該ＣＴＬのレ
    セプターが、該ＨＬＡ分子と該エピトープとの複合体に結合する、組成物。
  14. 【請求項１４】 クローン性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であって、該
    ＣＴＬは、インビトロで培養され、そして表ＸＸＩＶにて示される群より選択さ
    れるエピトープの複合体に結合し、該複合体はＨＬＡ分子に結合している、ＣＴ
    Ｌ。
  15. 【請求項１５】 第１のエピトープおよび第２のエピトープを少なくとも含
    むペプチドであって、該第１のエピトープが、表ＸＸＩＶにて示される配列から
    なる群より選択され； 該ペプチドは、ネイティブのペプチド配列と１００％同一性を有する５０個未
    満連続するアミノ酸を含む、ペプチド。
  16. 【請求項１６】 前記第１のエピトープおよび前記第２のエピトープが、請
    求項１４に記載の群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
  17. 【請求項１７】 請求項１５に記載の群より選択される第３のエピトープを
    さらに含む、請求項１６に記載の組成物。
  18. 【請求項１８】 前記ペプチドがヘテロポリマーである、請求項１５に記載
    の組成物。
  19. 【請求項１９】 前記ペプチドがホモポリマーである、請求項１５に記載の
    組成物。
  20. 【請求項２０】 前記第２のエピトープがＣＴＬエピトープである、請求項
    １５に記載の組成物。
  21. 【請求項２１】 前記ＣＴＬエピトープが、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、
    前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭ）、前立腺産生ホスファターゼ（ＰＡＰ）、または
    ヒトカリクレイン２（ＨｕＫ２）ではない腫瘍関連抗原に由来する、請求項２０
    に記載の組成物。
  22. 【請求項２２】 前記第２のエピトープが汎ＤＲ結合分子である、請求項１
    ５に記載の組成物。
  23. 【請求項２３】 前記第１のエピトープがリンカー配列に連結されている、
    請求項１に記載の組成物。
  24. 【請求項２４】 ワクチン組成物であって、前立腺癌関連抗原のネイティブ
    のペプチド配列と１００％同一性を有する５０個未満連続するアミノ酸を含むペ
    プチドの単位用量と； 薬学的賦形剤とを含み、 該ペプチドは、表ＸＸＩＶにて示される配列からなる群より選択される第１のエ
    ピトープを少なくとも含む、ワクチン組成物。
  25. 【請求項２５】 第２のエピトープをさらに含む、請求項２４に記載のワク
    チン組成物。
  26. 【請求項２６】 前記第２のエピトープがＰａｎＤＲ結合分子である、請求
    項２４に記載のワクチン組成物。
  27. 【請求項２７】 前記薬学的賦形剤がアジュバントを含む、請求項２４に記
    載のワクチン組成物。
  28. 【請求項２８】 ペプチドをコードする単離された核酸であって、該ペプチ
    ドが、表ＸＸＩＶにて示される配列からなる群より選択される配列からなるエピ
    トープを含む、単離された核酸。
  29. 【請求項２９】 ペプチドをコードする単離された核酸であって、該ペプチ
    ドは、第１のエピトープおよび第２のエピトープを少なくとも含み、該第１のエ
    ピトープが、表ＸＸＩＶにて示される配列からなる群より選択され；そしてここ
    で、該ペプチドが、ネイティブのペプチド配列と１００％同一性を有する５０個
    未満連続するアミノ酸を含む、単離された核酸。
  30. 【請求項３０】 前記ペプチドが、表ＸＸＩＶにて示される配列から選択さ
    れる少なくとも２つのエピトープを含む、請求項２９に記載の単離された核酸。
  31. 【請求項３１】 前記ペプチドが、表ＸＸＩＶにて示される配列から選択さ
    れる少なくとも３つのエピトープを含む、請求項３０に記載の単離された核酸。
  32. 【請求項３２】 前記第２のペプチドがＣＴＬエピトープである、請求項２
    ９に記載の単離された核酸。
  33. 【請求項３３】 前記ＣＴＬが、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異
    的膜抗原（ＰＳＭ）、前立腺産生ホスファターゼ（ＰＡＰ）、またはヒトカリク
    レイン２（ＨｕＫ２）ではない腫瘍関連抗原に由来する、請求項３２に記載の単
    離された核酸。
  34. 【請求項３４】 前記第２のペプチドがＨＴＬエピトープである、請求項２
    ０に記載の単離された核酸。
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