MXPA03006581A

MXPA03006581A - Vacunas subunitarias con superporciones a2.

Info

Publication number: MXPA03006581A
Application number: MXPA03006581A
Authority: MX
Inventors: M Grey Howard
Original assignee: Epimmune Inc
Priority date: 2001-01-29
Filing date: 2002-01-29
Publication date: 2004-06-25
Also published as: SK9512003A3; WO2002061435A3; US20040096445A1; AU2002243730B2; WO2002061435A2; RU2003126447A; EP1368659A2; JP2005512016A; IL156660A0; KR20040052475A; CZ20032054A3; CA2432995C; NZ526860A; CA2432995A1; CN1653337A

Abstract

Se describen metodos para disenar vacunas que son efectivas en individuos que llevan alelos del supertipo A2. Analogos de sustitucion de aminoacido individual de peptidos de enlace del supertipo A2 conocidos, y bibliotecas de peptido grandes se utilizaron para definir rigurosamente las especificidades de enlace del peptido de las moleculas del supertipo A2. Mientras que cada molecula se noto que tiene preferencias unicas, se encontraron grandes sobreposiciones en la especificidad. La presencia de los residuos hidrofobicos y alifaticos L, I,V,M,A,T y Q en la posicion dos de los ligandos de peptido fue comunmente tolerada por las moleculas del supertipo A2. L, I,V,M,A y T fueron tolerados en el C-terminal. Mientras que el examen de influencias secundarias en el enlace del peptido revelo preferencias especificas de alelo, tambien se podrian identificar caracteristicas compartidas, y se utilizaron para definir una superposicion A2. Caracteristicas compartidas tambien se correlacionan con la reactividad cruzada; arriba de 70% de los peptidos que enlazan A*0201 con alta afinidad se encontraron que enlazan por lo menos 2 de otras moleculas del supertipo A2. Finalmente, se proporcionan los coeficientes para el uso en el desarrollo de algoritmos para la prediccion de enlace de peptido a las moleculas del supertipo A2.

Description

VACUNAS SÜBÜNITARIAS CON SUPERPORCIONES A2 Campo Técnico El tema descrito en la presente se refiere al diseño de vacunas que serán efectivas en grandes porciones de la población, en particular, aquellos miembros de la población que son caracterizados por tener un alelo del supertipo A2. Las vacunas subunitarias que comprenden la superporción A2 pueden ser diseñadas para efectuar tal cobertura de la población. Antecedentes La constitución genética de ,un mamífero dado codifica las estructuras asociadas con el sistema inmune de esa especie. Aunque existe una gran cantidad de diversidad genética en la población humana, aun más si se comparan humanos y otras especies, existen también características y efectos comunes. En mamíferos, ciertas moléculas asociadas con la función inmune son llamadas el complejo de histocompatibilidad mayor . Las moléculas MHC son clasificadas ya sea como moléculas de Clase I o Clase II. Las moléculas MHC Clase II son expresadas principalmente en células involucradas en iniciar y sostener respuestas inmunes, tales como linfocitos T, linfocitos B, macrófagos, etc. Las moléculas MHC Clase II son reconocidas por los linfocitos T ayudantes e inducen la proliferación de linfocitos T ayudantes y la amplificación de la respuesta inmune al péptido inmunogénico particular que es expuesto. Las moléculas MHC Clase I son expresadas en casi todas las células nucleadas y son reconocidas por los linfocitos T citotóxicos (CTLs), que luego destruyen las células que llevan antigeno - CTLs son particularmente importantes en el rechazo del tumor y en combatir infecciones virales . CTLs reconocen el antigeno en la forma de un fragmento de péptido enlazado a las moléculas MHC clase I antes que el antigeno extraño intacto mismo. El antigeno normalmente debe ser endógenamente sintetizado por la célula y una porción del antigeno de proteina es degradada en fragmentos de péptido pequeños en el citoplasma. Algunos de estos péptidos pequeños se translocalizan en un compartimiento pre-Golgi e interactúan con las cadenas pesadas clase I para facilitar el plegamiento apropiado y la asociación con la microglobulina ß2 subunitaria. El complejo de péptido-MHC clase I luego es dirigido a la superficie celular para la expresión y el reconocimiento potencial por CTLs específicos. Investigaciones de la estructura de cristal de la molécula MHC clase I humana, HLA-A2.1, indican que una acanaladura de enlace de péptido es creada por el plegamiento de los dominios al y ot2 de la cadena pesada clase I (Bjorkman y colaboradores, Nature 329:506 (1987)). Sin embargo, en estas investigaciones la identidad de los péptidos enlazados a- la acanaladura no fue determinada. Buus, y colaboradores, Science 242:1065 (1988) primero describen un método para la elución con ácido de péptidos enlazados de MHC. Subsecuentemente, Rammensee y sus colaboradores (Falk, y colaboradores, Nature 351:290 (1991)) han desarrollado un procedimiento para caracterizar péptidos naturalmente procesados enlazados a las moléculas clase I. Otros investigadores han obtenido exitosamente la secuenciación de aminoácidos directa de los péptidos más abundantes en varias fracciones de HPLC mediante la secuenciación automatizada convencional de péptidos eluidos de las moléculas clase I del tipo B (Jardetzky, y colaboradores, Nature 353:326 (1991)) y del tipo A2.1 por espectrometría de masas (Hunt, y colaboradores, Science 225:1261(1992)). Una revisión de la caracterización de los péptidos naturalmente procesados · en MHC clase I se ha presentado por Rótzschle & Falk (Rótzschle & Falk, I unol. Today 12:447(1991)). La publicación de PCT, WO 97/34621, incorporada en la presente por referencia, describe péptidos que tienen una porción de enlace para los alelos A2.1. Sette, y colaboradores, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:3296(1989) mostraron que las porciones especificas del alelo MHC podrian ser utilizadas para predecir la capacidad de enlace de MHC. Schaeffer, y colaboradores, Proc. Nat'l.

Acad. Sci. USA 86:4649 (1989) mostraron que el enlace de MHC fue relacionado con la inmunogenicidad. Otros (De Bruijn, y colaboradores, Eur. J. Imunoll., 21:2963-2970 (1991); Pamer, y colaboradores, 991 Nature 353852-955 (1991)) han proporcionado evidencia preliminar de que las porciones de enlace de clase I pueden ser aplicadas a la identificación de péptidos inmunogénicos potenciales en modelos de animales. Las porciones de clase I especificas para un número de alelos humanos de un isotipo de clase I dado todavía tienen que ser descritos. Es deseable que las frecuencias combinadas de estos diferentes alelos deben ser bastante altas para cubrir una gran fracción o quizás la mayoría de la población humana por mezcla de razas. A pesar de los desarrollos en la técnica, la técnica previa no ha proporcionado una vacuna basada en péptido humano útil o agente terapéutico basado en este trabajo. Descripción La invención proporciona los parámetros para el diseño de vacunas que se esperan que se dirijan efectivamente a grandes porciones de la población. Siguiendo la guía expuesta en la presente, para preparar vacunas con respecto a un organismo infeccioso particular o virus o tumor, se estima el antígeno relevante para determinar la localización de epítopes que son más probables que efectúen una respuesta T citotóxica a vina infección o tumor. Al analizar la secuencia de aminoácidos del antigeno de acuerdo con los métodos expuestos en la presente, se puede identificar un conjunto apropiado de epitopes. Péptidos que consisten de estos epitopes pueden ser fácilmente probados por su capacidad para enlazar uno o más alelos HLA característicos del supertipo A2. En general, los péptidos que enlazan con una afinidad representada por una IC50 de 500 nM o menor tienen una alta probabilidad de producir una respuesta de linfocito T citotóxica (CTL) . La habilidad de estos péptidos para desempeñarse de tal manera también puede ser fácilmente verificada. Vacunas luego pueden ser diseñadas basadas en los péptidos inmunogénicos así identificados . Las vacunas por si mismas pueden consistir de los péptidos per se, precursores que serán, esperados que generen los péptidos in vivo, o ácidos nucleicos que codifican estos péptidos para la producción in vivo. Así, en un aspecto, la invención se dirige a un método para identificar un epítope en un antígeno característico de un patógeno o tumor. El epítope identificado por este método es más probable que mejore una respuesta inmune en un individuo que lleva un alelo del supertipo A2 que un péptido arbitrariamente seleccionado. El método comprende analizar la secuencia de aminoácidos del antígeno para los segmentos de 8-11 aminoácidos, donde el aminoácido en la posición 2 es un residuo hidrofóbico alifático o pequeño (L, I, V, M, A/ T o Q) y el aminoácido en el C-terminal del segmento también es un residuo hidrofóbico alifático o pequeño (L, I, V, M, A o T) . En modalidades preferidas, el residuo en la posición 2 es L o M. En otras modalidades preferidas, el segmento contiene 9-10 de aminoácidos. En otra modalidad preferida, el segmento contiene Q o N en la posición 1 y/o R, H o K en la posición 8, y carece de un D, E y G en la posición 3 cuando el segmento es un 10-mer. También se prefiere un V en la posición 2 y en el C-terminal. También se describen en la presente, composiciones que comprenden péptidos inmunogénicos que tienen subsecuencias de porción de enlace para las moléculas HLA-A2.1. Los epitopes inmunogénicos en los péptidos, que enlazan al alelo MHC apropiado, son de preferencia de 8-11 residuos en longitud y más de preferencia, de 9 a 10 residuos en longitud y comprenden residuos conservados en ciertas posiciones tales como las posiciones 2 y el C-terminal. Además, los péptidos no comprenden residuos de enlace negativos como son definidos en la presente, en otras posiciones, tales como las posiciones 1, 3, 6 y/o 7 en el caso de péptidos de 9 aminoácidos en longitud y las posiciones 1, 3, 4, 5, 7, 8 y/o 9 en el caso de péptidos de 10 aminoácidos en longitud, la presente invención define posiciones . o una porción que hacen posible la selección de péptidos que enlazarán eficientemente a HLA A2.1. Epitopes en un número de proteínas objetivo inmunogénicas pueden ser identificados utilizando las porciones de secuencia descritas en la presente. Ejemplos de antígenos adecuados incluyen el antígeno específico de cáncer de próstata (PSA), antígeno de núcleo y superficie de hepatitis B (HBVc, HBVs) , antígenos de hepatitis C, antígenos del virus de Epstein-Barr, virus del tipo 1 de inmunodeficiencia humana (HIV1) , virus herpes de sarcoma de Kaposi (KSHV) , antígenos de virus de papiloma humano (HPV) , virus Lassa, tuberculosis micobactérica (MT) , p53, CEA, antígeno de superficie de tripanosoma (TSA) y Her2/neu. Los péptidos y ácidos nucleicos que codifican a estos, son útiles en composiciones farmacéuticas para aplicaciones tanto terapéuticas como de diagnóstico in vivo y ex vivo. Definiciones El término "péptido" se utiliza intercambiablemente con "oligopéptido" en la presente especificación para designar una serie de residuos, típicamente L-aminoácidos, conectados entre sí típicamente por enlaces de péptido entre los grupos alfa-amino y carbonilo de aminoácidos adyacentes. Los oligopéptidos son generalmente menores que 250 aminoácidos en longitud, y pueden ser menores que 150, 100, 75, 50, 25, o 15 aminoácidos en longitud. Además, un oligopéptido de la invención puede ser tal, que éste no comprende más de 15 aminoácidos contiguos de un antigeno nativo . La nomenclatura utilizada para describir compuestos de péptido sigue la práctica convencional, donde el grupo amino es presentado a la izquierda (el N-terminal) y el grupo carboxilo a la derecha (el C-terminal) de cada residuo de aminoácido. En las fórmulas que representan modalidades especificas seleccionadas de la presente invención, los grupos amino- y carboxilo-terminales, aunque no específicamente mostrados están en la forma que ellos asumirían a valores de pH fisiológicos, a menos que se especifique de otra manera. En las fórmulas de la estructura de aminoácido, cada residuo es generalmente representado por designaciones estándares de tres letras o una sola letra. La forma L de un residuo de aminoácido es representada por una sola letra mayúscula o una primera letra mayúscula de un símbolo de tres letras, y la fórmula D de aquellos aminoácidos que tienen forma D es representado por una sola letra minúscula o un simbolo de tres letras minúsculas. Glicina no tiene átomo de carbono asimétrico y es simplemente referida como "Gly" o G. Un "péptido inmunogénico" o "epitope" es un péptido o secuencia de aminoácidos que comprende una porción especifica de alelo, de tal manera que la secuencia de péptido enlazará una molécula MHC e inducirá una respuesta a CTL. Péptidos inmunogénicos de la invención son capaces de enlazar a una molécula HLA-A2 apropiada e inducir una respuesta de células T citotóxicas contra el antigeno de la cual se deriva el péptido inmunogénico . Los péptidos inmunogénicos de la invención son de m nos de aproximadamente 15 residuos en longitud, frecuentemente menos de 12 residuos en longitud y usualmente consisten de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 11 residuos, de preferencia de 9 o 10 residuos . Los péptidos inmunogénicos son convenientemente identificados utilizando los algoritmos de la invención. Los algoritmos son procedimientos matemáticos que producen un registro o marca que hace posible la selección de péptidos inmunogénicos. Típicamente se utiliza el registro algorítmico por un "umbral de enlace" para hacer posible la selección de péptidos que tienen una alta probabilidad de enlazar a una cierta afinidad y a su vez serán inmunogénicos. El algoritmo está basado en ya sea los efectos en el enlace de MHC de un aminoácido particular en una posición particular de un péptido o los efectos en el enlace de una sustitución particular en un péptido que contiene porción. Los resultados del enlace frecuentemente son expresados en términos de "IC5o's". IC50 es la concentración de péptido en un ensayo de enlace en el cual se observa 50% de inhibición de enlace de un péptido de referencia. Dadas las condiciones en las cuales los ensayos como son descritos en la presente, son corridos (es decir, proteínas HLA limitantes y concentraciones de péptido marcado), estos valores se aproximan a los valores KD. Los ensayos para determinar el enlace son descritos en detalle en las publicaciones de PCT, WO 94/20127 y O 94/03205. Se debe observar que los valores IC50 pueden cambiar, f ecuentemente en forma notable, si las condiciones del ensayo son variadas, y dependiendo de los reactivos particulares utilizados (por ejemplo, preparación de HLA, etc.). Por ejemplo, concentraciones excesivas de moléculas HLA incrementarán la IC50 medida aparente de un ligando dado y por lo tanto no reflejan el valor KD real. El enlace frecuentemente es expresado como una relación relativa a un péptido de referencia. Conforme un ensayo particular llega a ser más o.menos sensible, las IC50's de los péptidos probados pueden cambiar un poco. Sin embargo, el enlace con relación al péptido de referencia no cambiará significativamente. Por ejemplo, en un ensayo corrido bajo condiciones de- tal manera que la ICso del péptido de referencia se incrementa 10 veces, los valores de IC50 de los péptidos de prueba también se desplazarán aproximadamente 10 veces. Por lo tanto, para evitar ambigüedades, la estimación de sí un péptido es un enlazador bueno, intermedio, débil, o negativo está generalmente basada en su IC50, con relación a la IC50 de un péptido estándar. El enlace puede ser reportado como una relación o la relación puede ser utilizada para normalizar el valor de IC50 como es descrito en el Ejemplo 1. Como se utiliza en la presente, alta afinidad con respecto a las moléculas HLA clase I es definida como el enlace con una IC50 o valor KD de menos de 50 nM. La afinidad intermedia es el enlace con una IC50 (o KD) de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 500 nM. Un "residuo conservado" es un aminoácido que surge en una frecuencia significativamente más alta que seria esperada por la distribución aleatoria en una posición particular en un péptido. Típicamente, un residuo conservado es uno donde la estructura de MHC puede proporcionar un punto de contacto con el péptido inmunogénico . Uno a tres, de preferencia dos, residuos conservados dentro de un péptido de longitud definida define una porción para un péptido inmunogénico. Estos residuos están típicamente en estrecho contacto con la acanaladura de enlace de péptido, con sus cadenas laterales encajadas en cavidades específicas de la acanaladura misma. Típicamente, un péptido inmunogénico comprenderá hasta tres residuos conservados, más usualmente dos residuos conservados. Como se utiliza en la presente, "residuos de enlace negativos" son aminoácidos que si están presentes en ciertas posiciones (por ejemplo, las posiciones, 1, 3 y/o 7 de un 9-mer) dan por resultado un péptido- que es un no enlazador o pobre enlazador y a su vez fracasará para ser inmunogénico, es decir, inducir una respuesta de CTL. El término "porción"' se refiere al patrón de residucs en un péptido de longitud definida, usualmente aproximadamente 8 a aproximadamente 11 aminoácidos, que es reconocida por un alelo MHC particular. Las porciones de péptido son típicamente diferentes de cada alelo MHC humano y difieren en el patrón de los residuos altamente conservados y residuos negativos . La porción de enlace para un alelo puede ser definida con grados incrementados de precisión. En un caso, todos los residuos conservados están . presentes en las posiciones correctas en un péptido y no hay residuos negativos en las posiciones 1, 3 y/o 7. Una "superporción" es una especificidad de enlace al péptido compartida por las moléculas HLA codificadas por dos o más alelos HLA. Un epitope que lleva superporción de preferencia es reconocido con alta o intermedia afinidad (como se define en la presente) por dos o más antigenos HLA. Un "supertipo o familia de HLA", como se utiliza en la presente, describe conjuntos de moléculas HLA agrupadas en la base de las especificidades de enlace al péptido compartidas. Las moléculas HLA clase I que comparten un poco de afinidad de enlace similar para los péptidos que llevan ciertas porciones de aminoácidos son agrupadas en supertipos HLA. Los términos superfamilia HLA, familia de supertipo HLA y moléculas del supertipo similares a HLA xx (donde xx denota un tipo de HLA particular) son sinónimos. Las frases "aislado" o "biológicamente puro" se refieren al material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan como es encontrado en su estado nativo. Asi, los péptidos de esta invención no contienen material normalmente asociado con su medio ambiente ín situ, por ejemplo, moléculas MHC I en células que presentan antigeno. Aun donde una proteina se ha aislado a una banda homogénea o dominante, existen contaminantes menores en el rango de 5-10% de proteina nativa que copurifican con la proteina deseada. Péptidos aislados de esta invención no contienen tal proteina copurificada endógena. El término "residuo" se refiere a un aminoácido o aminoácido mimético incorporado en un oligopéptido por un enlace de amida o enlace de amida mimético. Breve Descripción de los Dibujos Figura 1. Especificidad fina en la posición 2 y extermina1 del HLA-A*0201. La preferencia para residuos específicos en la posición 2(a) o en el C-terminal (b) es mostrada en una función de por ciento de péptidos que llevan un residuo especifico que enlaza A*0201 con IC50 de 500 nM o mejor. Valores ARB de péptidos que llevan residuos específicos en la posición 2(a) o en el C-terminal (b) se calcularon como es descrito en la presente, y se indexaron con relación al residuo con la capacidad de enlace más alta. La capacidad de enlace promedio (geométrica) de los péptidos con L en la posición 2 fue de 1991 nM. La capacidad de enlace promedio (geométrica) de los péptidos con V en el C-terminal fue de 2133 nM. Los péptidos incluidos en el análisis tuvieron por lo menos un residuo fijo o anclado tolerado, como es descrito en el texto, ya sea en la posición 2 o en el C-terminal . Figura 2. Mapa de la porción A*0201. Mapa de resumen de la porción A*0201 para los péptidos 8-mer (b) , 10-mer (c) y 11-mer (d) . En posiciones fijas secundarias, los residuos mostrados como preferidos (o nocivos) están asociados con una capacidad de enlace promedio de por lo menos 3 veces más grande que (o 3 veces menor que) péptidos del mismo tamaño que llevan otros residuos en la misma posición. En las posiciones fijas primarias, los residuos preferidos son aquellos asociados con una capacidad de enlace promedio dentro de 10 veces del residuo óptimo en la misma posición. Los residuos fijos primarios tolerados son aquellos asociados con una capacidad de enlace promedio de entre 10 y 100 veces del residuo óptimo en la misma posición.

Figura 3. Especificidad fina en la posición 2 de las moléculas HLA.-supertipo A2. Valores ARB de péptidos que llevan residuos especificos en la posición 2 se calcularon para cada molécula del supertipo A2 como es descrito con el texto, y se indexaron con relación al residuo con el ARB más alto para cada molécula especifica. La capacidad de enlace promedio (geométrica) de los péptidos que llevan el residuo con el ARB más alto fue de 55, 59, 89 y 41 nM para A*0202, A*0206, y A*6802, respectivamente. Figura 4. Especificidad fina en el C-terminal de las moléculas HLA-supertipo A2. Valores ARB de péptidos que llevan residuos especificos en el C-terminal se calcularon para cada molécula del supertipo A2 como es descrito en el texto, y se indexaron con relación al residuo con el ARB más alto para cada molécula especifica. La capacidad de enlace promedio (geométrica) de los péptidos que llevan el residuo con el ARB más alto fue de 291, . 48, 250, y 553 nM para A*0202, A*0203, A*0206, y A*6802, respectivamente. Figura 5. Mapa de la porción A*0202. Mapa de resumen de la porción A*0202 para los péptidos 9-mer(a) y 10-mer(b). En posiciones fijas secundarias, los residuos mostrados, preferidos (o nocivos) están asociados con una capacidad de enlace promedio de por lo menos 3 veces más grande que (o 3 veces menor que) péptidos del mismo tamaño que llevan otros residuos en la misma posición. En las posiciones fijas primarias, los residuos preferidos son aquellos asociados con una capacidad de enlace promedio dentro de 10 veces del residuo óptimo en la misma posición. Los residuos fijos primarios tolerados son aquellos asociados con una capacidad- de enlace promedio de entre 10 y 100 veces del residuo óptimo en la misma posición. Figura 6. Mapa de la porción A*0203. Mapas de resumen de la porción A*0203 para los péptidos 9-mer(a) y 10-mer(b). En posiciones fijas secundarias, los residuos mostrados como preferidos (o nocivos) están asociados con una capacidad de enlace promedio de por lo menos 3 veces más grande que (o 3 veces menor que) los péptidos del mismo tamaño que llevan otros residuos en la misma posición. En las posiciones fijas primarias, los residuos preferidos son aquellos asociados con una capacidad de enlace promedio dentro de 10 veces del residuo óptimo en la misma posición. Los residuos fijos primarios tolerados son aquellos asociados con una capacidad de enlace promedio de entre 10 y 100 veces del residuo óptimo en la misma posición. Figura 7. Mapa de la porción A*0206. Mapas de resumen de la porción A*0206 para los péptidos 9-mer(a) y 10 mer(b). En posiciones fijas secundarias, los residuos mostrados como preferidos (o nocivos) están asociados con una capacidad de enlace promedio de por lo menos 3 veces más grande (o 3 veces menor que) los péptidos del mismo tamaño que llevan otros residuos en la misma posición. En las posiciones fijas primarias, los residuos preferidos son aquellos asociados con una capacidad de enlace promedio dentro de 10 veces del residuo óptimo en la misma posición. Los residuos fijos primarios tolerados son aquellos asociados con un.:,, capacidad de enlace promedio de entre 10 y 100 veces del residuo óptimo en la misma posición. Figura 8. Mapa de la porción A*6802. Mapas de resumen de la porción A*6802 para los péptidos 9-mer(a) y 10 mer(b). En posiciones fijas secundarias, los residuos mostrados como preferidos (o nocivos) están asociados con una capacidad de enlace promedio de por lo menos 3 veces más grande que (o 3 veces menor que) los péptidos del mismo tamaño que llevan otros residuos en la misma posición. En las posiciones fijas primarias, los residuos preferidos son aquellos asociados por una capacidad de enlace promedio dentro de 10 veces del residuo óptimo en la misma posición. Los residuos fijos primarios tolerados son aquellos asociados con una capacidad de enlace promedio de entre 10 y 100 veces el residuo óptimo en la misma posición. Figura 9. Resumen consensual de la superporción A2 de las influencias fijas secundarias y primarias en la capacidad de enlace del supertipo A2 de los péptidos 9- (a) y 10-mer(b) . Los residuos mostrados significativamente influencian el enlace a 3 o más moléculas del supertipo A2.

El número de moléculas influenciadas son indicadas entre paréntesis. En posiciones fijas secundarias, los residuos son considerados preferidos solamente si ellos no tienen una influencia nociva en más de una molécula. Residuos preferidos que fueron nocivos en el contexto de una molécula son indicados por fuente reducida y en cursiva. La estimación- en las posiciones fijas primarias están basadas en la sustitución individual y el análisis de biblioteca de péptido, como es discutido en el texto. Descripción de las Modalidades Preferidas La presente invención se refiere en parte a un procedimiento basado en epitope para el diseño de vacuna. Tal procedimiento está basado en el descubrimiento bien establecido de que el mecanismo para inducir la respuesta inmune de CTL comprende la etapa de presentar un epitope de CTL como un péptido de aproximadamente 8-11 aminoácidos enlazado a una molécula HLA expuesta en una célula que presenta antigeno. La molécula HLA es el producto de una MHC clase I en donde el producto es expresado en la mayoria de células nucleadas. Los productos de los alelos MHC clase I son genéricamente caracterizados como moléculas HLA A, B y C. Dentro de cada una de estas categorías, existe una multiplicidad de variantes alélicas en la población; en realidad, se cree que están bien por arriba de 500 alelos de clase I y clase II. Puesto que una respuesta de célula T citotóxica no puede ser - producida a menos que el epitope sea presentado por la HLA. clase I contenida en la superficie de las células del individuo inmunizado,, es importante que el epitope sea uno que es capaz de enlazar la HLA. exhibida por ese individuo. El punto de partida, por lo tanto, para el diseño de vacunas efectivas es asegurar que la vacuna generará un gran número de epitopes que pueden ser exitosamente presentados. Esto puede ser posible para administrar los péptidos que presentan los epitopes per se. Tal administración es dependiente de la presentación de las moléculas HLA "vacias" expuestas en las células del sujeto. En un procedimiento para usar los péptidos inmunogénicos per se, estos péptidos pueden ser incubados con células que presentan antigeno del sujeto a ser tratado ex vivo y las células luego regresadas al sujeto. · Alternativamente, el péptido de 8-11 aminoácidos puede ser generado in situ al administrar un ácido nucleico que contiene una secuencia de nucíeótidos que lo codifican. Medios para proporcionar tales moléculas de ácido nucleico son descritos en O 99/58658, la descripción de la cual es incorporada en la presente por referencia. Además los péptidos inmunogénicos pueden ser administrados como porciones de una molécula de péptido más grande y segmentadas para liberar el péptido deseado. El péptido más grande puede contener aminoácidos extraños, en general entre menos sean es mejor. Asi, los péptidos que contienen tales aminoácidos son típicamente de 25 aminoácidos o menos, más típicamente 20 aminoácidos o menos, y más típicamente 15 aminoácidos o menos. - El precursor- también puede ser un heteropo.1 ímero u homopolímero que contiene una multiplicidad de diferentes o mismos epitopes CTL. Por supuesto, también se pueden emplear mezclas de péptidos y ácidos nucleicos que generan una variedad de péptidos inmunogénicos . El diseño de las vacunas de péptido, las moléculas de ácido nucleico, o los hetero- u homo-polímeros es dependiente de la inclusión del epítope deseado. La presente invención proporciona un paradigma para identificar el epítope relevante que es efectivo a través del amplio rango de población de individuos que son caracterizados por el supertipo A2. Las siguientes páginas describen los métodos y resultados de experimentos para la identificación de la superporción A2. Se prefiere que los péptidos incluyan un epítope que enlaza a un alelo HLA-supertipo A2. Estas porciones pueden ser utilizadas para definir epitopes de células T de cualquier antígeno deseado, particularmente aquellos asociados con enfermedades virales humanas, cánceres o enfermedades autoinmunes, para las cuales la secuencia de aminoácidos de los objetivos potenciales de antígeno o autoantigeno es conocida. Epitopes en un número de proteínas objetivo potenciales pueden ser identificados basados en las porciones de enlace HLA. Ejemplos de antígenos adecuados incluyen el antigeno especifico de próstata (PSA) , antigenos de núcleo y superficie de hepatitis B (HBVc, HBVs), ., antigenos de hepatitis C, antigenos de virus Epstein-Barr, antigenos de melanoma (por ejemplo, MAGE-1), antigenos de virus de inmunodeficiencia humana (HIV) , antigenos de virus de papiloma humana (HPV) , p53, CEA, antigenos de superficie de tripanosoma (TSA), y Her2/neu. Péptidos que comprenden los epitopes de estos antigenos pueden ser sintetizados y luego probados por su capacidad para enlazar a las moléculas HC apropiadas en ensayos utilizando, por ejemplo, moléculas clase I purificadas y péptidos radioyodados y/o células que expresan moléculas ' clase I vacias, por. ejemplo, por manchado inmunofluorescente y microfluorometria de flujo, ensayos de ensamble de clase I dependientes del péptido e inhibición del reconocimiento de CTL por la competición de péptidos. Aquellos péptidos que enlazan a la molécula clase I además pueden ser evaluados por su habilidad para servir como objetivos para CTLs derivados de individuos infectados o inmunizados, asi como por su capacidad para inducir respuestas CTL primarias in vitro o in vivo que pueden dar origen a poblaciones CTL capaces de reaccionar con células objetivo viralmente infectadas o células de tumor como agentes terapéuticos potenciales. Los antigenos MHC clase I son codificados por los sitios HLA-A, B y C. Los antigenos HLA-A y B son expresados en le¦ superficie celular a densidades aproximadamente iguales, mientras que la expresión de HLA-C es significativamente menor (quizás tanto como 10 veces menor) . Cada uno de estos sitios tiene un número de alelos. Las porciones de enlace al péptido de la invención son relativamente especificas para cada subtipo alélico. Para vacunas basadas en péptido, los péptidos de preferencia comprenden una porción reconocida por una molécula MHC I que tiene una amplia distribución en la población humana, o comprenden una porción reconocida por una población genéticamente diversa. Puesto que los alelos MHC surgen en diferentes frecuencias dentro de diferentes grupos étnicos y razas, la selección del alelo MHC objetivo puede depender -de la población objetivo. La Tabla 1 muestra la frecuencia de varios alelos en los productos del sitio HLA-A entre diferentes razas. Por ejemplo, la mayoría de la población Caucasoide puede ser cubierta por péptidos que enlazan a cuatro subtipos de alelos HLA-A, específicamente HLA-A2.1, Ál, A3.2, y A24.1. De manera similar, la mayoría de la población Asiática está comprendida con adición de péptidos que enlazan el quinto alelo HLA-Al'1.2.

TABLA 1 Alelo A/Subtipo N(69)* A(54) C(502) Al 10.1(7) 1-8(1) 27.4(138) A2.1 11.5(8) 37.0(20) 39.8-(199) A2.2 10.1(7) 0 3.3(17) A2.3 1.4(1) 5.5(3) 0.8(4) A2.4 - - - A2.5 - - - A3.1 1.4(1) 0 0.2(0) A3.2 5.7(4) 5.5(3) 21.5(108) All.l 0 5.5 (3) 0 A11.2 5.7(4) 31.4(17) 8.7 (44) A11.3 0 3.7(2) 0 A23 4.3(3) - 3.9(20) A24 2.9 (2) 27.7 (15) 15.3 (77) A24.2 - - - A24.3 - - A25 1.4(1) - 6.9 (35) A26.1 4.3(3) 9.2 (5) 5.9(30) A26.2 7.2(5) - 1.0(5) A26V - 3.7 (2) - A28.1 10.1(7) - 1.6(8) A28.2 1-4(1) - 7.5 (38) A29.1 1.4(1) - 1.4(7) A29.2 10.1(7) 1.8(1) 5.3(27) A30.1 8.6(6) - 4.9(25) A30.2 1.4(1) - 0.2 (1) A30.3 7.2(5) - 3.9(20) A31 4.3(3) - 7.4-( 4) 6.9(35) A32 2.8 (2) - 7.1(36) Aw33.1 8.6(6) - 2.5(13) Aw33.2 2.8 (2) 16.6(9) 1.2(6) Aw34.1 1. (1) - - Aw34.2 14.5(10) - 0.8(4) Aw36 5.9(4) — — Tabla compilada de B. DuPont, Inmiunobiology of HLA, Vol. I, Histocompatibility Testing 1987, Springer-Verlag, New York 1989. *N = Negroide; A = Asiático; C = Caucasoide. Los números entre paréntesis representan el número de individuos incluidos en el análisis. El enlace reactivo cruzado de péptidos que llevan la porción HLA-A2.1 con otras moléculas especificas del alelo HLA-A2 puede surgir. Aquellas moléculas especificas de alelo que comparten especificidades de enlace con HLA-A2.1 se considera que comprenden el supertipo HLA-A2.1. La cavidad B de las moléculas HLA del supertipo A2 está caracterizada por una porción consensual que incluye los residuos (esta nomenclatura utiliza códigos de arainoácido de una sola letra, donde el subindice indica la posición del péptido) F/Y9, A24, 45 E/N63, /N66, V67, H/Q70 y Y/C99. De manera similar, la cavidad F del supertipo A2 esta caracterizada por una porción consensual que incluye los residuos D77, T8o, Leí y ???e(155) . Aproximadamente—66% de los péptidos que enlazan -A*02-01 serán reactivos cruzados entre tres o más alelos de un supertipo A2. El supertipo A2 como se define en la presente es consistente con los datos de reactividad cruzada (Fruci, D. y colaboradores, Hum. Immunol. 38:187, 1993), de ensayos de enlace de célula viva (del Guercio, M.F. y colaboradores, J. Immunol. 154:685, 1995) y datos obtenidos al secuenciar péptidos naturalmente procesados (Sudo, T . , y colaboradores, J. Immunol. 155:4749, 1995) enlazados a moléculas especificas de alelo HLA-A2. Por consiguiente, la familia de moléculas HLA (es decir, HLA-supertipo A2 que enlaza estos péptidos) está comprendida de por lo menos nueve proteínas HLA-A A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*0207, A*6802 y A*6901. Como es descrito en la presente, la superposición HLA-A2 comprende ligandos de péptido con L, I, V, M, A, T, o Q como residuos fijos primarios en la posición 2 y I, I, V, M, A, o T como un residuo fijo primario en la posición C-terminal del epitope. Las porciones HLA-A2 que son más particularmente relevantes con la invención reivindicada en la presente, comprenden V, A, T, o Q en la posición 2 y L, I, V, M, A, o T en la posición fija C-terminal. Un epitope de péptido que comprende una superporción HLA-A2 puede enlazar más de una molécula HLA-supertipo A2. -Un procedimiento que puede ser utilizado para identificar péptidos de la presente invención es descrito en Falk, y colaboradoresr Nature 351:290(1991), incorporada en la presente por referencia. Brevemente, los métodos involucran el aislamiento a gran escala de las moléculas MHC ciase I, típicamente por inmunoprecipitación o cromatografía de afinidad de la célula o lineas de células apropiadas. Ejemplos de otros métodos para el aislamiento de la molécula MHC deseada igualmente bien conocidos para la persona experta incluyen la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de lectina, exclusión de tamaño, cromatografía de ligando de alto desempeño y una- combinación de todas las técnicas anteriores. En un caso típico, se puede utilizar inmunoprecipitación para aislar el alelo deseado. Se puede utilizar un número de protocolos, dependiendo de la especificidad de los anticuerpos utilizados. Por ejemplo, los reactivos Ab específicos del alelo se pueden utilizar para la purificación de afinidad de las moléculas HLA-A, HIA-B y HLA-C. Varios reactivos mAb para el aislamiento de moléculas HLA-A están disponibles. El BB7.2 monoclonal es adecuado para aislar moléculas HLA-A2. Columnas de afinidad preparadas con estos mAbs utilizando técnicas estándares son exitosamente utilizadas para purificar los productos de alelo HLA-A respectivos . Además, de los mAbs especificos de alelo, anti-HLA- . A, B,C mAbs ampliamente reactivos, tales como "W6/32 B9.12.1 y Bl.23.2 podrían ser utilizados en protocolos de purificación de afinidad alternativos como es descrito en la sección de ejemplos después. Los péptidos enlazados a la acanaladura de enlace de péptido de las moléculas MHC aisladas son eluídos típicamente utilizando el tratamiento con ácido. Los péptidos también pueden ser disociados de las moléculas de la clase I mediante una variedad de medios de desnaturalización estándares, tales como calor, pH, detergentes, sales, agentes caotrópicos, o una combinación de los mismos. Fracciones de péptido son separadas adicionalmente de las moléculas MHC mediante la cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) de fase inversa y secuenciadas . Los péptidos pueden estar separados por una variedad de otros medios estándares bien conocidos para la persona experta, incluyéndose la filtración, ultrafiltración, electroforesis, cromatografía de tamaño, precipitación por anticuerpos específicos, cromatografía de intercambio iónico, isoelectroenfoque, y similares. La secuenciación de los péptidos aislados se puede realizar de acuerdo con técnicas estándares tal como la degradación de Edman (Hunkapiller, M.W, y colaboradores, Methods Enzymol. -91, 399 [11983] ) . Otros métodos adecuados para la - secuenciación -inc] uye la secuenciación de espectrometría de masas de péptidos individuales como es descrito brevemente (Hunt, y colaboradores, Science 225:1261(1992), que es incorporada en la presente por referencia) . La secuenciación de aminoácidos de péptidos heterogéneos en volumen (por ejemplo, fracciones de HPLC acumuladas) de diferentes moléculas clase I típicamente revela una porción de secuencia característica para cada alelo de clase I. La definición de porciones específicas para diferentes alelos de clase I permite la identificación de epitopes de péptido potenciales de una proteína antigénica cuya secuencia de aminoácidos es conocida. Típicamente, la identificación de los epitopes de péptido potenciales es inicialmente llevada a cabo utilizando una computadora para explorar la secuencia de aminoácidos de un antígeno deseado para la presencia de porciones . Después de la identificación de epitopes que llevan porción, las secuencias epxtópicas luego son sintetizadas. La capacidad para enlazar a las moléculas de la clase MHC es medida en una variedad de maneras diferentes. Un medio es un ensayo de enlace de molécula clase I como en descrito en las solicitudes relacionadas, mencionadas después. Otras alternativas descritas en la literatura incluyen la inhibición de la presentación de antigeno (Sette, y colaboradores, J. Immunol. 141:3P93 (1991) , ensayos de ensamble in vitro (Townsend, y colaboradores, Cell 62:285(1990), y ensayos basados en FACS utilizando células mutadas, tal como RMA.S (Melief, y colaboradores, Eur. J. Immunol. 21:2963(1991)). Como es descrito en la presente, la afinidad de enlace de HLA más alta está correlacionada con más grande inmunogenicidad. La inmunogenicidad más grande puede ser manifestada en varias maneras diferentes. La inmunogenicidad puede corresponder a si una respuesta inmune es producida en todo y al vigor de alguna respuesta particular, asi como al grado de una población diversa en la cual una respuesta es producida. Por ejemplo, un péptido podría producir una respuesta inmune en un arreglo diverso de la población, pero en ningún caso produce una respuesta vigorosa. De acuerdo con los principios descritos en la presente, cerca del 90% de péptidos de alto enlace se ha encontrado que son inmunogénicos, en contraste con aproximadamente 50% de los péptidos que enlazan con afinidad intermedia. Además, los péptidos de afinidad de enlace más alta conducen a respuestas inmunogénicas más vigorosas. Como resultado se requiere menos péptido para producir un efecto ¦ biológico similar si se utiliza péptido de enlace de alta afinidad. Asi, en modalidades preferidas de la invención, los epitopes de enlace de alta afinidad son particularmente útiles. No obstante, mejoras sustanciales sobre la técnica anterior se obtiene con péptidos de enlace intermedio o alto. La relación entre la afinidad de enlace para las moléculas de HLA clase I y la inmunogenicidad de epitopes de péptido discretos se ha determinado por primera vez en la técnica por los presentes inventores. En estos experimentos, en los cuales los péptidos discretos fueron referidos, se va a notar que el procesamiento celular de los péptidos in vivo conducirá a tales péptidos aun si se utilizan fragmentos más largos. Por consiguiente, péptidos más largos que comprenden uno o más epitopes están dentro del alcance de la invención. La correlación entre la afinidad de enlace y la inmunogenicidad se analizó en dos procedimientos experimentales diferentes (Sette, y colaboradores, J. Immunol. 153:5586:5592, 1994). En el primer procedimiento, la inmunogenicidad de epitopes potenciales que varian la afinidad de enlace de HLA sobre un rango de 10,000 veces se analizó en ratones transgénicos HLA-A*0201. En el segundo procedimiento, la antigenicidad de aproximadamente 100 diferentes epitopes potenciales derivados del virus de hepatitis B (HBV) todos que llevan porciones de enlace A*0201 se estimó al utilizar PBL (linfocitos de sangre periféricos) de pacientes con hepatitis aguda. Conforme estos procedimientos, se determinó que un valor de umbral de afinidad de aproximadamente 500 nM (de preferencia 50 nM o menor) está correlacionado con la capacidad de un epitope de péptido para producir una respuesta a CTL. Estos datos son verdaderos para las mediciones de afinidad de enlace de clase I para péptidos naturalmente procesados y para epitopes de células T sintetizados. Estos datos también indican la función importante de la selección determinante en la conformación de las respuestas de las células T (ver, por ejemplo, Schaeffer, y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:4649-4653,1989). Por consiguiente, los péptidos inductores de CTL de preferencia incluyen aquellos que tienen una IC50 para las moléculas HLA clase I de 500 nM · o menor. En el caso de epitopes de péptido que llevan porción de antigenos asociados con tumor, un umbral de afinidad de enlace de 200 nM se ha mostrado que está asociado con la exterminación de la célula del tumor por las poblaciones CTL resultantes. En una modalidad preferida, después de la estimación de enlace para una molécula especifica de alelo HLA-A2, los péptidos que exhiben alta o intermedia afinidad en todo son considerados para el análisis adicional. Péptidos seleccionados pueden ser probados en otros miembros de la familia del supertipo. En modalidades preferidas, los péptidos que exhiben enlace reactivo cruzado luego son utilizados en vacunas o análisis de clasificación celular. Por ejemplo, los péptidos que se prueban positivos en el ensayo de enlace HLA-2, es decir, que tienen valor de actividad de enlace de 500 nM o menor, se analizan para la habilidad de los péptidos para inducir respuestas CTL especificas in vitro. Por ejemplo, las células que presentan antigeno, que se han incubado con un péptido, pueden ser analizadas para la habilidad para inducir respuestas CTL en poblaciones de células respondedoras. Las células que presentan antigeno pueden ser células normales tales como células mononucleares de sangre periférica o células dendriticas (Inaba, y colaboradores, J. Exp. Med. 166:182 (1987); Boog. Eur. J. Immunol. 18 :219

[1988] ) . Alternativamente, las lineas de células de mamífero mutantes que están deficientes en su habilidad para cargar las moléculas clase I con péptidos internamente procesados, tales como las lineas de células de ratón RMA-S (Karre, y colaboradores, Nat re, 319:675(1986); Ljunggren, y colaboradores, Eur. J. Immunol: 21:2963-2970(1991)), y el híbrido de células T somático humano, T-2 (Cerundolo, y colaboradores, Nature 345:449-452(1990)) y que se han transfectado con los genes apropiados que codifican moléculas humanas de la clase I son convenientemente utilizados, cuando el péptido es hexógenamente adicionado a éstas, para probar la capacidad del péptido para inducir respuestas CTL primarias in vitro. Otras lineas de células eucarióticas que pueden ser utilizadas incluyen varias lineas de células de insectos tales como las lineas de células de larva de mosquitos (lineas de células ATCC CCL 125, 126, 1660, 1591, 6585, 6586), gusano de seda (ATTC CRL 8851), gusano desvastador (ATCC CRL 1711), polilla (ATCC CCL 80) y Drosofila tal como la linea de células Schneider (ver Schneider J. Embryol. Exp. Morphol. 27:353-365

[1927] ) . Linfocitos de sangre periférica son convenientemente aislados después de la venipuntura simple o leucaferesis de donadores o pacientes normales y utilizados como las fuentes de células respondedoras de precursores CTL. En una modalidad, las células que presentan antigeno apropiadas son incubadas con 10-100 µ? de péptido en medio libre de suero durante 4 horas bajo condiciones de cultivo apropiadas . Las células que presentan antigeno cargado de péptido luego son incubadas con las poblaciones de células respondedoras in vitro durante 7 a 10 dias bajo condiciones de cultivo utilizadas. La activación CTL positiva puede ser determinada al analizar los cultivos para la presencia de CTL que exterminan células objetivo radiomarcadas , tanto objetivos pulsados de péptido específicos así como células objetivo que expresan la forma endógenamente procesada del virus o antígeno de tumor relevante del cual se derivó la secuencia de péptido. La especificidad y restricción MHC del CTL es determinada por la prueba contra diferentes células objetivo de péptido que expresan MHC clase I humanó apropiado o inapropiado. Los péptidos que se prueban positivos en los ensayos de enlace MHC y dan origen a las respuestas CTL especificas son referidos en la presente como péptidos inmunogénicos . Kast, y colaboradores (J. Immunol. 152:3904-3912, 1994) han mostrado que los péptidos que llevan porción responden por 90% de los epítopes que enlazan a moléculas HLA clase I específicas de alelo. En este estudio todos los posibles péptidos de 9 aminoácidos en longitud y sobrepuestos por 8 aminoácidos (240 péptidos) que cubren la secuencia entera de las proteínas E6 y E7 del papilomavirus humano del tipo 16, se evaluaron para el enlace a 5 moléculas HLA específicas de alelo que son expresadas a alta frecuencia entre diferentes grupos étnicos. Este conjunto imparcial de péptidos permitió una evaluación del valor predictivo de porciones de HLA clase I. Del conjunto de 240 péptidos, 22 péptidos se identificaron que enlazan a moléculas HLA específicas de alelo con alta o intermedia afinidad. De estos 22 péptidos, 20, (es decir 91%) fueron portadores de porción.

Asi, este estudio demostró el valor de las porciones para la identificación de epitopes de péptido para la inclusión en una vacuna: la aplicación de las técnicas de identificación basada en porción eliminan la clasificación de 90% de los epitopes potenciales. La cantidad de péptidos disponibles sin la complejidad del proceso de clasificación h=ría una evaluación completa de un antigeno altamente difícil, si no es que imposible sin el uso de porciones . Un epitope de péptido inmunogénico de la invención puede ser incluido en una composición de vacuna poliepitópica que comprende epitopes de péptido adicionales del mismo antigeno, antigeno de la misma fuente y/o antigeno de una fuente diferente. Además los epitopes de la clase II pueden ser incluidos junto con los epitopes de la clase I. Los epitopes de péptido del mismo antigeno pueden ser epitopes adyacentes que están contiguos en la secuencia o pueden ser obtenidos de diferentes regiones de. la proteina. Como se menciona en mayor detalle después, los péptidos inmunogénicos pueden ser preparados sintéticamente, tal como mediante la síntesis química o mediante la tecnología de DNA recombinante, o aislados de fuentes naturales tales como virus o tumores completos . Aunque el péptido de preferencia estará sustancialmente libre de otras proteínas de la célula huésped que surge de manera natural y fragmentos de las mismas, en algunas modalidades los péptidos pueden ser sintéticamente conjugados con fragmentos o partículas nativas. Los polipéptidos o péptidos pueden ser de una variedad de longitudes, ya sea en sus formas neutras (sin carga) o en formas que son sales y ya sea libres de modificaciones tal como la glicocilación o como oxidación de cadena lateral o fosforilación o que contiene estas modificaciones, sujetos a la condición de que la modificación no destruye la actividad biológica de los péptidos como es descrito en la presente. Deseablemente, el péptido será tan pequeño como sea posible mientras que aun se mantenga sustancialmente toda la actividad biológica del péptido grande. Cuando es posible, puede ser deseable optimizar epítopes del péptido de la invención a una longitud de 9 o 10 residuos de aminoácido, en proporción con el tamaño con los péptidos virales endógenamente procesados o péptidos de célula de tumor que están enlazados a las moléculas MHC clase I en la superficie celular. Péptidos que tienen la actividad deseada pueden ser modificados como sea necesario para proporcionar ciertos atributos deseados, por ejemplo, características farmacológicas mejoradas, mientras que se incrementan o al menos se retienen sustancialmente toda la actividad biológica del péptido no modificado para enlazar la molécula MHC deseada y activar la célula T apropiada. Por ejemplo, los péptidos se pueden someter a varios cambios, tales como sustituciones, ya sea conservativas o no conservativas, donde tales cambios podrían proporcionar ciertas ventajas en su uso, tal como el enlace de MHC mejorado. Por sustituciones conservativas se da a entender el reemplazo de un residuo de aminoácido con otro que es biológicamente y/o quimicamente similar, por ejemplo, un residuo hidrofóbico por otro, o un residuo polar por otro, las sustituciones incluyen combinaciones tales como Gly, Ala; Val, lie, Leu, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. El efecto de sustituciones de un solo aminoácido también puede ser sondeado utilizando D-aminoácidos . Tales modificaciones se pueden hacer utilizando procedimientos de síntesis de péptido bien conocidos, como es descrito en, por ejemplo, Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany y Merrifield, The Peptides, Gross y Meienhofer, edsk (N.Y., Academic Press), pp. 1-284(1979); y Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, III, Pierce), 2d Ed. (1984). Los péptidos también pueden ser modificados al extender o decrecer la secuencia de aminoácidos del compuesto, por ejemplo, mediante la adición o supresión de aminoácidos . Los péptidos o análogos de la invención también pueden ser modificados al alterar el orden o composición de ciertos residuos, siendo fácilmente apreciado que ciertos residuos de aminoácidos esenciales para la actividad biológica, por ejemplo, aquellos en sitios de contacto críticos o residuos conservados, generalmente no pueden ser alterados sin un efecto adverso en la actividad biológica. Los aminoácidos no críticos no necesitan ser limitados a aquellos que surgen de manera natural en proteínas, tales como L-a-aminoácidos, pero pueden incluir aminoácidos no naturales también, tales como ß-?-d-áminoácidos, así como muchos derivados de L-a-aminoácidos tales como D-isómeros de aminoácidos naturales . Típicamente, una serie de péptidos con sustituciones de aminoácido individual son empleados para determinar el efecto de la carga electrostática, hidrofobicidad, etc. en el enlace. Por ejemplo, una serie de sustituciones de aminoácido positivamente cargados (por ejemplo, Lys o Arg) o negativamente cargados (por ejemplo, Glu) se hacen a lo largo de la longitud de péptido revelando diversos patrones de sensibilidad hacia varias moléculas MHC y receptores de células T. Además, se pueden emplear múltiples sustituciones utilizando porciones pequeñas, relativamente neutras tales como Ala, Gly, Pro, o residuos similares. Las sustituciones pueden producir péptidos muítiepitópicos que son homo-oligómeros o hetero-oligómeros . El número y tipos de residuos que son sustituidos o adicionados depende del espaciamiento necesario entre los puntos de contacto esenciales y ciertos atributos funcionales que son buscados (por ejemplo, hidrofobicidad contra hid ofilicidad) . La afinidad de enlace incrementada para una molécula MHC o receptor de célula T también se puede obtener por tales sustituciones, comparada con la afinidad del péptido de origen. En cualquier caso, tales sustituciones generalmente emplean residuos de aminoácido u otros fragmentos moleculares seleccionados para evitar, por ejemplo, la interferencia estérica y de carga que podria interrumpir el enlace. Las sustituciones de aminoácido son típicamente de residuos individuales. Las sustituciones, supresiones, inserciones o cualquier combinación de los mismos se pueden combinar para llegar a un péptido final. Las variantes sustitucionales son aquellas en las cuales por lo menos un residuo de un péptido se ha removido y un residuo diferente insertado en su lugar. Tales sustituciones, generalmente son hechas de acuerdo con la siguiente Tabla 2 cuando se desea modular finamente las características del péptido.

TABLA 2 Residuo Original Sustitución Ejemplar Ala Ser Arg Lys, His Asn Gln Asp Glu cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Lys; Arg Ile Leu; Val Leu lie; Val Lys Arg; His Met ¦ Leu; He Phe Tyr; Trp Ser Thr Thr Ser Trp Tyr; Phe Tyr Trp; Phe Val lie; Leu Cambios sustanciales en la función (por ejemplo, afinidad para moléculas MHC o receptores de células T) se hacen al seleccionar sustituciones que son menos conservativas que aquellas en la Tabla 2, es decir, seleccionar residuos que difieren más significativamente en su efecto al mantener (a) la estructura de la cadena principal del péptido en el área de la sustitución, por ejemplo como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se esperan que produzcan los cambios más grandes en las propiedades del péptido serán aquellas en las cuales (a) el residuo hidrofílico, por ejemplo serilo, es sustituido por (o mediante) un residuo hidrofóbico, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o ^alanilo; (b) un residuo que tiene un cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo, o histidilo, es sustituido por (o mediante) o residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (c) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo fenilalanina es sustituido por (o mediante) uno que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina - Los péptidos también pueden comprender isósteres de dos o más residuos en el péptido inmunogénico . Un isóster como se define en la presente, es una secuencia de dos o más residuos que pueden ser sustituidos -por una segunda secuencia debido a que la conformación estérica de la primera secuencia se ajusta a un sitio de enlace especifico para la segunda secuencia. El término específicamente incluye modificaciones de la cadena principal de péptido bien conocidas para aquellos expertos en la técnica. Tales modificaciones incluyen las modificaciones del nitrógeno de amida, el a-carbono, amida, carbonilo, reemplazo completo del enlace de amida, extensiones, supresiones o reticulaciones de la cadena principal. Ver, generalmente, Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Prroteins, Vol. VII (Weinstein ed. 1983). Modificaciones de peptidos con varios miméticos de amino ácido o aminoácidos no naturales son particularmente útilss en incrementar la_ estabilidad del péptido in vivo. La estabilidad puede ser analizada en un número de maneras. Por ejemplo, las peptidasas y varios medios biológicos, tal como plasma y suero humano, son utilizados para probar la estabilidad. Ver, por ejemplo, Verhoef, y colaboradores, Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin. 11:291-302(1986). El periodo de vida media de los péptidos de la presente invención es convenientemente determinado utilizando un ensayo de suero humano al 25% (v/v) . El protocolo es generalmente como sigue. Suero humano acumulado (tipo AB, inactivado sin calor) es deslipidado mediante la centrifugación antes del uso. El suero luego es diluido a 25% con medio de cultivo de tejido RPMI y utilizado para probar la estabilidad del péptido. En intervalos de tiempo predeterminados, una pequeña cantidad de solución de reacción es retirada y adicionada a ya sea ácido tricloroacético acuoso al 6% o etanol. La muestra de reacción turbia es enfriada (4°C) durante 15 minutos y luego girada para formar en pelotilla las proteínas de suero precipitadas. La presencia de los péptidos luego es determinada mediante la HPLC de fase inversa utilizando las condiciones cromatográficas especificas de estabilidad. Los péptidos de la presente invención o análogos de los mismos que tienen actividad estimulante CTL pueden ser modificados para proporcionar atributos deseados diferentes al periodo de vida media del suero mejorado. Por ejemplo, la habilidad de los péptidos para inducir actividad CTL puede ser mejorada por el enlace a una secuencia que contiene por lo menos un epitope que es capaz de inducir una respuesta de la célula ayudante T. En algunas modalidades, el péptido ayudante T es uno que es reconocido por las células ayudantes T en la mayoría de la población. Esto se puede realizar al seleccionar secuencias de aminoácidos que enlazan a muchas, la mayor parte, o todas las moléculas MHC clase II. Estas son conocidas como secuencias ayudantes T "libremente restringidas en MHC". Ejemplos de secuencias de aminoácidos que son libremente restringidas, en MHC incluyen las secuencias de antígenos tal como la toxina de tétano en las posiciones . .830-843 (QYIKANSKFIGITE) , proteina circunsporozoita de Plasmodium falcíparum (CS) en las posiciones 378-398 (DIEKKIAMEK7SSVF VVNS) , y proteína 18kD de Streptococus en las posiciones 1-16 (YGAVDSILGGVATYGAA) . Alternativamente, es posible preparar péptidos sintéticos capaces de estimular linfocitos ayudantes T en una manera libremente restringida en MHC, utilizando secuencias de aminoácidos no encontrados en la naturaleza. Estos compuestos sintéticos, llamados epitopes de enlace Pan-DR o moléculas PADRE™ (Epimmune, San Diego, CA) , son diseñados en la base de su capacidad de enlace a la mayoría de moléculas HLA-DR (MHC clase II humana) (ver, por ejemplo, la patente norteamericana número 5,736,142). Conjugados de péptidos/ayudante T inmunogénicos particularmente preferidos son enlazados por una molécula espaciadora. El espaciador está típicamente comprendido de moléculas neutras relativamente pequeñas, tales como aminoácidos o miméticos de aminoácido, que están sustancialmente no cargados bajo condiciones fisiológicas. Los espaciadores son típicamente seleccionados de, por ejemplo, Ala, Gly, u otros espaciadores neutros de aminoácidos no polares o aminoácidos polares neutros. Será entendido que el espaciador opcionalmente presente no necesita estar comprendido de los mismos residuos y así puede ser un hetero- u homo-oligómero . Cuando está presente, el espaciador usualmente será por lo menos uno o dos residuos, más usualmente tres a seis residuos. Alternativamente, el péptido CTL puede ser enlazado al péptido ayudante T sin un espaciador. El péptido inmunogénico puede ser enlazado al péptido ayudante T, ya sea directamente o vía un espaciador, en el amino o carboxi terminal del péptido CTL. El amino terminal de ya sea el péptido inmunogénico o el péptido ayudante T puede ser acilado. Péptidos ayudantes T ejemplares incluyen el toxoide de tétano 830-843, influenza 307-319, circunsporozoita de malaria 382-398 y 378-389. En algunas modalidades puede ser deseable incluir en las composiciones farmacéuticas de la invención por lo menos un componente que ceba CTL. Lipidos se han identificado como agentes capaces de cebar CTL in vivo contra antigenos virales. Por ejemplo, residuos de ácido palmitico pueden ser unidos a los grupos amino, alfa y epsilon de un residuo Lys y luego enlazados, por ejemplo, via uno o más residuos de enlace tales como Gly, Gly-Gly, Ser, Ser-Ser, o similares, a un péptido inmunogénico. El péptido lipxdado luego puede ser inyectado directamente en una forma micelar, incorporado en un liposoma o emulsificado en un adyuvante, por ejemplo, adyuvante de Freund incompleto. En una modalidad preferida, un inmunógeno particularmente efectivo comprende ácido palmitico unido a los grupos amino, alfa y epsilon de Lys, que es unido via el enlace, por ejemplo, Ser-Ser, al amino términal del péptido inmunogénico. Como otro ejemplo de cebado por lipido de la respuesta CTL, lipoproteinas de E. coli, tal como tripalmitol-S-glicerilcisteinliseril-serina (P3CSS) se puede utilizar para cebar CTL especifico del virus cuando se une covalentemente a un péptido apropiado. Ver, Deres, y colaboradores, Nature 342:561-564(1989). Péptidos de la invención se pueden acoplar a P3CSS, por ejemplo, y el lipopéptido administrado a un individuo para cebar específicamente una respuesta a CTL al antigeno objetivo. Además, como la inducción de los anticuerpos neutralizantes también puede ser cebada con P3CSS conjugada con un péptido que muestra un epitope apropiado, las dos composiciones se pueden combinar para producir más efectivamente respuestas tanto humorales como mediadas por la célula para la infección. Además, se pueden adicionar aminoácidos adicionales a las terminales de un péptido para proporcionar facilidad de enlace de los péptidos entre si, para el acoplamiento a un soporte portador, o péptido más grande, para la modificación de las propiedades físicas o químicas del péptido u oligopéptido, o similares. Aminoácidos tales como tirosina, cisteína, lisina, ácido glutámico -o aspártico o similares, pueden ser introducidos en el C- o N-terminal del péptido u oligopéptido. La modificación en el C-terminal en algunos casos puede alterar las características de enlace del péptido. Además, las secuencias de péptido u oligopéptido pueden diferir de la secuencia natural al ser modificadas por la acilación ¾ terminal, por ejemplo, por alcanoílo (Cl-C20) o acetilación de tioglicolilo, amidación de carboxilo terminal, por ejemplo, amoníaco, metilamina, etc. En algunos casos, estas modificaciones pueden proporcionar sitios para el enlace para soporte u otras moléculas. Los péptidos de la invención se pueden preparar en una amplia variedad de maneras . Debido a su tamaño relativamente corto, los péptidos (epítopes discretos o péptidos poliepitópicos) pueden ser sintetizados en solución o en un soporte sólido de acuerdo con las técnicas convencionales. Varios sintetizadores automáticos son comercialmente disponibles y se pueden utilizar de acuerdo con protocolos conocidos. Ver, por ejemplo, Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co. (1984), supra. Alternativamente, la preparación de péptidos de la invención puede comprender el uso de tecnología de DA recombinante, en donde una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido inmunogénico de interés es insertada en un vector de expresión, transformada o transfectada en una célula huésped apropiada y cultivada bajo condiciones adecuadas para la expresión. Estos procedimientos son generalmente conocidos en la técnica. Como es descrito generalmente en Sambrook, y colaboradores, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982), que es incorporada a la presente por referencia. Así, las proteínas de fusión que comprenden una o más secuencias de péptidos de la invención se pueden utilizar para presentar el epítope de células T apropiado. Como la secuencia de codificación para péptidos de la longitud contemplada en la presente, se puede sintetizar por técnicas químicas, por ejemplo, el método de fosfotriéster de Matteucci, y colaboradores, J. Am. Chem. — Soc. 103:3185(1981), la modificación _ se .puede hacer simplemente al sustituir la(s) base(s) apropiada (s) para aquellos que codifican la secuencia de péptido nativa. La secuencia de codificación luego puede ser proporcionada con enlazadores apropiados y ligada en vectores de expresión comúnmente disponibles en la técnica, y los vectores utilizados para transformar huéspedes adecuados para producir la proteína de fusión deseada. Un número de tales vectores y sistemas huéspedes adecuados están ahora disponibles. Para la expresión de las proteínas de fusión, la secuencia de codificación será proporcionada con codones de inicio de tensión operablemente enlazados, . regiones promotoras y terminadoras y usualmente un sistema de replicación para proporcionar un vector de expresión para la expresión en el huésped celular deseado. Por ejemplo las secuencias promotoras compatibles con huéspedes bacterianos se proporcionan en plásmidos que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción de la secuencia con codificación deseada. Los vectores de expresión resultantes son transformados en huéspedes bacterianos adecuados. Por supuesto, también se pueden utilizar huéspedes -celulares de levadura o de mamífero, empleando vectores y secuencias de control adecuadas . Los péptidos de la presente invención y composiciones farmacéuticas de vacuna- de los mismos, son útiles para la administración a mamíferos, particularmente humanos, para tratar terapéuticamente y/o prevenir infecciones y cáncer. Ejemplos de enfermedades que se pueden tratar utilizando los péptidos inmunogénicos de la invención incluyen el cáncer de próstata, hepatitis B, hepatitis C, AIDS, carcinoma renal, carcinoma cervical, linfoma, infección CMV y condlyloma acuminatum. . Para composiciones farmacéuticas, los péptidos inmunogénicos de la invención frecuentemente son administrados a un individuo que ya sufre cáncer o infectado con el virus de interés. Aquellos en la fase de incubación o la fase aguda de infección pueden ser tratados con los péptidos inmunogénicos por separado en conjunción con otros tratamientos, como sea apropiado. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones son administradas a un paciente en una cantidad suficiente para producir una respuesta a CTL efectiva al agente de enfermedad infeccioso o el antígeno de tumor y para curar o por lo menos parcialmente detener los síntomas y/o complicaciones. Una cantidad adecuada para realizar esto es definida como una "dosis terapéuticamente efectiva" o "dosis unitaria". Cantidades efectivas para este uso dependerán, por ejemplo de la composición del peptido, la manera de administración, la etapa y la gravedad de la enfermedad que es tratada, el peso y el estado general de salud del paciente y el juicio del médico que prescribe. Generalmente para humanos, el rango de dosis para la inmunización inicial (esto es para la administración terapéutica o profiláctica) es de aproximadamente 1.0 µg a aproximadamente 20,000 µg de péptido para un paciente de 70 kg, de preferencia, 100 µg-, 150 µg-, 200 g-, 250 ]ig- , 250 pg-, 300 ^g-, 400 µg-, o 500 µg-20,000 µg, seguido por dosificaciones reforzadoras en el mismo rango de dosis conforme a un régimen de refuerzos a través de semanas a meses dependiendo de la respuesta del paciente y la condición al medir la actividad CTL especifica en la sangre del paciente. En modalidades donde .se utiliza administración de ácido nucleico recombinante, el material administrado es titulado para obtener la respuesta terapéutica apropiada . Se debe mantener en mente que los péptidos y composiciones de la presente invención generalmente pueden ser empleados en estados de enfermedad graves, esto es, situaciones amenazantes de la vida o potencialmente amenazantes de la vida. En tales casos, en vista de la minimización de sustancias extrañas en las composiciones de la invención y, por ejeinpJo, la naturaleza no toxica relativa de los péptidos, es posible y se puede percibir deseable por el médico tratante administrar excesos sustanciales de estas composiciones . Para uso terapéutico, la administración debe - comenzar en el primer signo de infección o la detección o remoción quirúrgica de tumores o poco después de la diagnosis, en el caso de infección aguda. Esto es seguido por dosis reforzadoras hasta que por lo menos los síntomas son sustancialmente abatidos y por un período después . En la infección crónica, se pueden requerir dosis de carga seguidas por dosis reforzadoras. El tratamiento de un individuo infectado con las composiciones de la invención puede apresurar la resolución de la infección de individuos agudamente infectados. Para aquellos individuos susceptibles (o predispuestos) a desarrollar infección crónica, ¦ las composiciones son particularmente útiles en métodos para prevenir la evolución de infección aguda crónica. Donde los individuos susceptibles son identificados antes o durante la infección, por' ejemplo, como es descrito en la presente, la composición puede ser dirigida a éstos, minimizando la necesidad para la administración a una población más grande. Las composiciones de péptido también se pueden utilizar para el tratamiento de la infección crónica y para estimular el sistema inmune para eliminar, por ejemplo, las células infectadas por virus en portadores. Es importante proporcionar una cantidad de péptido inmunoaumentador de potencia en una formulación y modo de administración suficiente para estimular efectivamente una respuesta de las células T citotóxica. Asi, para el tratamiento de la infección crónica, las dosis de inmunización seguidas por las dosis reforzadoras en intervalos establecidos, por ejemplo, de una a cuatro semanas, pueden ser requeridas, posiblemente por un periodo prolongado de tiempo para inmunizar efectivamente un individuo. En el caso de infección crónica, la administración debe continuar hasta que por lo menos los síntomas clínicos o pruebas de laboratorio indican que la infección se ha eliminado o sustancialmente abatido y por un período después . Las composiciones farmacéuticas para tratamiento terapéutico se proponen para administración parenteral, tópica, oral o local. Los péptidos de la invención se pueden administrar en una forma de ácido nucleico que codifica los péptidos. De preferencia, las composiciones farmacéuticas son administradas parenteralmente, por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, intradérmicamente o intramuscularmente . Así, la invención proporciona composiciones para la administración parenteral que comprenden una solución de los péptidos inmunogénicos disueltos y suspendidos en un portador aceptable, de preferencia un portador acuoso. Una variedad de portadores acuosos pueden ser utilizados, por ejemplo, agua,, agua de solución regulada, solución salina al 0.8%, glicina al 0.3%, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden ser esterilizadas por técnicas de esterilización bien conocidas, convenci nales, o pueden ser filtradas de manera estéril. Las soluciones acuosas resultantes pueden ser envasadas para el uso como se encuentran, o liofilizadas, la preparación liofilizada que es combinada con una solución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como sea requerido para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tal como los agentes de ajuste y regulación del pH, agentes de ajuste de tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactado de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina, etc. La concentración de los péptidos estimuladores de CTL de la invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente 0.1%, usualmente a o por lo menos aproximadamente 2% a tanto como 20% a 50% o mayor en peso, y será seleccionada principalmente por los volúmenes de fluido, viscosidades, etc . , de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Una forma de dosis unitaria humana de la composición de péptido es típicamente incluida en una composición farmacéutica que comprende una dosis unitaria humana de un portador aceptable, de preferencia un portador acuoso, y es administrado en un volumen de fluido que es conocido para aquellos expertos en la técnica para ser utilizado para la - administración de tales composiciones a humanos . Los péptidos de la invención también se pueden administrar vía liposomas, que sirven para dirigir los péptidos a un tejido particular, tal como tejido linfoide, o dirigido selectivamente a células infectadas, así como incrementar el período de vida media de la composición de péptido. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípido, capas laminares y similares. En estas preparaciones, el péptido a ser suministrado es incorporado como parte de un liposoma, solo .o en conjunción por una molécula que enlaza a, por ejemplo, un receptor prevalente entre las células linfoides, tales como anticuerpos monoclonales que enlazan al antígeno CD45 antígeno, o con otras composiciones terapéuticas o inmunogénicas . Así, los liposomas ya sea rellenados o ataviados con un péptido deseado de la invención pueden ser dirigidos al sitio de la célula linfoides donde los liposomas luego suministran las composiciones de péptido terapéuticas/inmunogénicas seleccionadas. Liposomas para el uso de la invención son formadas de lipidos que forman vesículas estándares, que generalmente incluyen fosfolipidos neutros y negativamente cargados y un esterol, tal como colesterol. La selección de lipidos es generalmente guiada por consideración de, por ejemplo, el tamaño de liposoma, inestabilidad y estabilidad en ácido de los liposomas en la corriente sanguínea. Una variedad de métodos están disponibles para preparar liposomas, como es descrito en, por ejemplo, Szoka, y colaboradoresr Ann. J?ev. Biophysf Bioeng. 9:467(1980), patentes norteamericanas Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, y 5,019,369. Para la dirección a las células inmunes, un ligando a ser incorporado en el liposoma puede incluir, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos del mismo específicos para los determinantes de la superficie celular de las células del sistema inmune deseadas . Una suspensión de liposoma que contiene un péptido puede ser administrado intravenosamente, localmente, tópicamente, etc., en una dosis que varía de acuerdo con, ínter alia, la manera de administración, el péptido que es suministrado y la etapa de la enfermedad que es tratada. Para composiciones sólidas, se pueden utilizar portadores sólidos no tóxicos convencionales que incluyen, por ' ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sucrosa, carbonato de magnesio y similares. Para la administración oral, una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable es formada al incorporar cualquiera de los excipientes normalmente empleados, tales como aquellos portadores brevemente listados y generalmente 10-95% del ingrediente activo, esto es, uno o más péptidos de la invención, y más de preferencia a una concentración del 25%—75% - Para la administración en aerosol, los péptidos inmunogénicos son de preferencia suministrados en forma finamente dividida junto con uri surfactante e impelente. Los porcentajes típicos de péptido son de 0.1%-20% en peso, de preferencia 1%-10%. El surfactante, por supuesto, debe ser no tóxico, y de preferencia soluble en el impelente. Representativos de tales agentes son los ésteres o ésteres parciales de ácidos grados que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como ácido caproico, octanoico, laúrico, palmitico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico con un alcohol polihidrico alifático o su anhídrido cíclico. Se pueden emplear ésteres mezclados, tales como glicéridos mezclados o naturales. El surfactante puede constituir de 0.1%-20% en peso de la composición, de preferencia de 0.25-5%. El resto de la composición es ordinariamente propelente. También se puede incluir un portador, como es deseado, como con, por ejemplo, lecitina para el suministro intranasal. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se dirige a vacunas que contienen como un ingrediente activo una cantidad inmunogénicamente efectiva de un péptido inmunogénico como es descrito en la presente. Los péptidos también pueden ser administrados en la forma de ácidos nucleicos que codifican péptidos de la invención en la expresión en el recibidor. El (los) péptido (s) puede ser introducido en un huésped, incluyéndose humanos, enlazado a su propio portador o como un homopolimero o heteropolimero de unidades de péptido activas. Tal polimero tiene la ventaja de reacción inmunológica incrementada y, donde se utilizan diferentes péptidos para constituir el polimero, la habilidad adicional para inducir anticuerpos y/o CTL que reaccionan con diferentes determinantes antigénicos de las células del virus o tumor. Portadores útiles son bien, conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tal como albúmina de suero humano, toxoide.de tétano, poliaminoácidos tal como poli(lisina: ácido glutámico), influenza, proteina del núcleo de virus de hepatitis B, vacuna recombinante del virus de hepatitis B y similares. Las vacunas también pueden contener un diluyente fisiológicamente tolerable (aceptable) tal como agua, solución salina regulada con fosfato, o solución salina, y además típicamente incluyen un adyuvante.

Materiales tales como el adyuvante de Freund incompleto, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, o alum son materiales bien conocidos en la técnica como adyuvantes, y, como se mencionó anteriormente, las respuestas CTL pueden ser cebadas al conjugar péptidos de la invención a lipidos, tal como P3CSS. En la inmunización con una composición de péptido como es descrito en la presente, via la ruta de inyección, aerosol, oral, transdérmica u otra ruta, el sistema inmune del huésped responde a la vacuna al producir grandes cantidades de CTLs específicos para el antígeno deseado, y el huésped llegar a ser por lo menos parcialmente inmune a la infección posterior, o resistente a desarrollar infección crónica . En algunos casos, puede ser deseable combinar las vacunas de péptido de la invención con vacunas que inducen respuesta de anticuerpos neutralizantes al virus de interés, particularmente a antígenos de envoltura viral. Para propósitos terapéuticos o de inmunización, los péptidos de la invención se pueden administrar en la forma de ácidos nucleicos que codifican uno o más de los péptidos de la invención. Los ácidos nucleicos pueden codificar un péptido de la invención y opcionalmente una o más moléculas adicionales . Un número de métodos son convenientemente utilizados para suministrar ácidos nucleicos a un paciente. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser suministrado directamente como "DNA desnudo". Este procedimiento es descrito, por ejemplo, en Wolff, y colaboradores, Science 247:1465-1468(1990) asi como las patentes norteamericanas Nos. 5,580,859 y 5,589,466. Acidos nucleicos también se pueden administrar utilizando el suministro balístico como es descrito, por ejemplo, en- _J.a patente norteamericana No. 5,204,253. Se pueden administrar partículas comprendidas solamente de DNA. Alternativamente, se puede adherir DNA a las partículas, tales como partículas de oro. Los ácidos nucleicos también pueden ser suministrados en forma compleja con compuestos catiónicos, tales como lípidos catiónicos. Los métodos de suministro de gen mediado por lípido son descritos, por ejemplo, en WO 96/18372; WO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6 (7 ): 682-691 (1988) ; Rose patente norteamericana No, 5,279,833; WO 91/06309; y Gelgner, y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413-7414(1987). Los péptidos de la invención también se pueden expresar mediante huéspedes virales atenuados tales como vaccinia o sífilis de ave. Este procedimiento involucra el uso del virus de vaccinia como un vector para expresar secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la invención. En la introducción a un huésped agudamente o crónicamente infectado o a un huésped no infectado, el virus de vaccinia recombinante expresa el péptido inmunogénico y de esta manera produce una respuesta a CTL del huésped. Los vectores de vaccinia y métodos ¦ útiles en protocolos de inmunización son descritos en, por ejemplo, la patente norteamericana No, 4,722,848. Otro vector es BCG (Bacille Calmette Guerin) . Los vectores BCG son descritos, por ejemplo, en Stover, y colaboradores (Nature 351:456-460(1991)). Una amplia variedad de otros vectores útiles para administración terapéutica o inmunización de los péptidos de la invención, por ejemplo vectores de Salmonella tiphi y similares, serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción en la presente. Un medio preferido para administrar ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la invención utiliza construcciones de minigen que codifican epitopes múltiples de la invención opcionalmente junto con otras moléculas. Para crear una secuencia de DNA que codifica los epitopes CTL seleccionados (minigen) para la expresión en células humanas, las secuencias de aminoácidos de los epitopes son, por ejemplo, traducidas a la inversa. Una tabla de uso de codón humano es utiliza para guiar la selección del codón para cada aminoácido. Estas secuencias de DNA que codifican epitope son directamente unidas, creando una molécula que codifica una secuencia de polipéptido continuo. Opcionalmente, para optimizar la expresión y/o inmunogenicidad, se pueden incorporar elementos adicionales en el diseño del minigen.

Ejemplos de la secuencia de aminoácidos que podría ser traducida a la inversa e incluida en la secuencia de minigen incluyen: epitopes de linfocito T adyuvante, una secuencia líder (señal) y una señal de retención de retículo endoplásmico . Además, la presentación de MHC de los epitopes CTL puede ser mejorada al incluir secuencias flanqueantes sintéticas (por ejemplo, poli-alanina) o que surgen de manera natural adyacentes a los epitopes CTL. La secuencia de minigen es convertida a DNA al ensamblar oligonucleótidos que codifican las hebras más y menos del minigen. Oligonucleótidos sobrepuestos (30-100 bases de largo) son sintetizados, fosforilados, purificados y recocidos bajo condiciones apropiadas utilizando técnicas bien conocidas. Los extremos de los oligonucleótidos son unidos utilizando ligaza de DNA T . Este minigen sintético, que codifica el polipéptido de epitopes CTL luego puede ser clonado en un vector de expresión deseado. Secuencias reguladoras estándares bien conocidas para aquellos expertos en la técnica son generalmente incluidas en el vector para asegurar la expresión en las células objetivo. Varios elementos de vector son requeridos: un promotor con un sitio de clonación corriente abajo para la infección de minigen; una señal de poliadenilación para la terminación de la transcripción eficiente/ un origen de E. coli de replicación; y un marcador seleccionable de E. coli (por ejemplo, de resistencia a ampicilina o canamicina) . Numerosos promotores pueden ser utilizados para este propósito, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus humano (HCMV) . Ver, las patentes norteamericanas Nos. 5,580,859 y 5,589,466 para otras secuencias promotoras adecuadas. Modificaciones del vector adicionales pueden ser deseadas para utilizar la expresión del minigen y la inmunogenicidad. En algunos, se requieren intrones para la expresión del gen eficiente, y uno o más intrones sintéticos o que surgen de manera natural podrían ser incorporados en la región transcrita del minigen. La inclusión de secuencias de estabilización de mRNA también puede ser considerada para incrementar la expresión del minigen. Recientemente se ha propuesto que las secuencias inmunoestimuladoras (ISSs o CpGs) desempeñan una función en la inmunogenicidad de las vacunas de DNA. Éstas secuencias podrian ser incluidas en el vector, fuera de la secuencia de codificación del minigen, si se encuentran que mejoran la inmunogenicidad. En algunas modalidades, se puede utilizar un vector de expresión bicistrónico para permitir la producción de los epitopes codificados del minigen y una segunda proteina incluida para mejorar o disminuir la homogenicidad. Ejemplos de proteínas o polipéptidos que podrían mejorar beneficiosamente la respuesta inmune si se coexpresan, incluyen las citocinas (por ejemplo, IL2, IL12, GM-CSF) , moléculas inductoras de citocinas (por ejemplo, LelF) o moléculas coestimuladoras . Además, si se emplean epitopes de linfocito de T ayudante (HTL) los epitopes HTL pueden ser unidos a señales objetivo intracelulares y expresados por separado de los epitopes CTL. Esto permite la dirección de los epitopes HTL a un compartimiento celular diferente de los epitopes CTL« Esto puede facilitar la entrada más eficiente de los epitopes HTL en la ruta MHC clase II, facilitando de esta manera y mejorando la inducción del CTL. En contraste a la inducción del CTL, específicamente la disminución de la respuesta inmune mediante la coexpresión de moléculas inmunosupresoras (por ejemplo, TGF-ß) puede ser beneficioso en ciertas enfermedades . Una vez que selecciona un vector de expresión, el minigen es clonado en la región polienlazadora con el promotor. Este plásmido es transformado en una cepa de E. coli apropiada, y el DNA es preparado utilizando técnicas estándares. La orientación y la secuencia del DNA del minigen, asi como otros elementos incluido en el vector, son confirmados utilizando el mapeo de restricción y el análisis de secuencia de DNA. Las células bacterianas que hospedan el plásmido correcto puede ser almacenadas como un banco de células maestro y un banco de células de trabajo. Cantidades terapéuticas de DNA de plásmido son producidas, por ejemplo, mediante la fermentación de E. coli seguido por purificación. Las alícuotas del banco de células de trabajo son utilizadas para inocular el medio de fermentación (tal como Terrific Broth) , y cultivadas a saturación en matraces agitadores o un biorreactor de acuerdo con técnicas bien conocidas. El DNA de plásmido puede ser purificado utilizando tecnologías de bioseparación estándares tal como las resinas de intercambio iónico en fase sólida, suministradas por Quiagen. Si es requerido, DNA superenrollado puede ser aislado de las formas circulares y lineares abiertas utilizando la electrofóresis de gel u otros métodos . El DNA de plásmido puede ser preparado para la inducción utilizando una variedad de formulaciones. El más simple de estos es la reconstitución de DNA liofilizado en solución salina regulada con fosfato estéril (PBS) . Una variedad de métodos se han descrito y nuevas técnicas pueden llegar a estar disponibles. Como se mencionó anteriormente, los ácidos nucleicos son convenientemente formulados con lípidos catiónicos. Además, glicolípidos, liposomas fusogénicos, péptidos y compuestos referidos colectivamente como protectores, interactivos, de no condensación (PINC) también podrían ser formados en complejo con DNA de plásmido purificado para influenciar variables tales como estabilidad, dispersión intramuscular, o tráfico a órganos específicos o tipos de células.

La sensibilización de la célula objetivo, se puede utilizar como un ensayo funcional para la expresión en la presentación de MHC clase I de los epitopes CTL codificados del minigen. El DNA de plásmido puede ser introducido a una linea de células -de mamífero que es adecuada como un objetivo para los ensayos de liberación de cromo CTL estándares. El método de transfección utilizado será dependiente de la formulación final. La electroporación puede ser utilizada para el DNA "desnudo", mientras que los lípidos catiónicos permiten la transfección in vitxo directa. Un plásmido que expresa proteina fluorescente verde (GFP) puede ser cotransfectado para permitir el enriquecimiento de células transfectadas utilizando la clasificación de células activadas con fluorescencia (FACS) . Estas células luego son marcadas con cromo-51 y utilizadas como células objetivos para la linea de CTL específicas del epitope. La citólisis, detectada por la liberación de 51 Cr, indica la producción de la presentación MHC de epitope CTL codificado del minigen. La inmunogenicidad in vivo es un segundo procedimiento para la prueba funcional de las formulaciones de DNA de minigen. Ratones transgénicos que expresan moléculas MHC humanas apropiadas pueden ser inmunizadas con el producto de DNA. La dosis y ruta de administración son dependientes de la formulación {por ejemplo, IM para DNA en PBS, IP para DNA formado en complejo con lípido. Veintiún días después de la inmunización, esplenocitos son cosechados y- reestimulados durante 1 semana en la presencia de péptidos que codifican cada epitope que es probado. Estas células efectoras (CTLs) son analizadas para la citólisis de las células objetivo marcadas con cromo-51, cargadas de péptido utilizando técnicas estándares. La lisis de células objetivo sensibilizadas por la carga de MHC de péptidos correspondiente a epitopes codificados del minigen demuestra la función de la vacuna del DNA. para la inducción in vivo de CTLs . Animales transgénicos de haplotipos apropiados adicionalmente pueden proporcionar herramientas útiles en optimizar la homogenicidad in vivo del DNA del minigen. Además, animales tales como monos que tienen moléculas ÜLA conservadas con reactividad cruzada a los epitopes CTL reconocidas por las moléculas MHC humanas pueden ser utilizados para determinar la inmunogenicidad humana de los epitopes CTL (Bertoni, y colaboradores, J. Immunol. 161:4447-4455 (1998) ) . Tales estudios in vivo son requeridos para dirigir las variables cruciales para el desarrollo de la vacuna, que no son fácilmente evaluadas por los ensayos in vitro, tal como la ruta de administración, acumulación de vacuna, biodistribución en el tejido, e involucramiento de los órganos linfoides primarios y secundarios. Debido a su simplicidad y flexibilidad, los ratones transgénicos HLA representan una alternativa atractiva, por lo menos para los estudio de desarrollo de la vacuna iniciales, comparados con los estudios más difíciles de manejar y costosos en especies de animales superiores, tales como primates no humanos. Se pueden utilizar péptidos antigénicos para producir CT1 ex vivo, también. El CTL resultante puede ser utilizado para tratar infecciones crónicas (por ejemplo, viral o bacteriana) o tumores en pacientes que no responden a otras formas convencionales de la terapia, o no responderán a un procedimiento de vacuna de péptido de la terapia. La respuesta CTL ex vivo a un patógeno particular (agente infeccioso o antígeno tumoral) son inducidas al incubar en cultivo de tejido las células precursoras CTL del paciente (CTLp) junto con una fuente de células que presentan antigenos (APC) y el péptido inmunogénico apropiado. Después de un tiempo de incubación apropiado (típicamente 1-4 semanas), en el cual la CTLp son activadas y maduran y se expanden en la CTL efectora, las células son infusionadas nuevamente en el paciente, donde destruirán su célula objetivo específica (una célula infectada o una célula de tumor) . Los péptidos también pueden encontrar uso como reactivo de diagnóstico. Por ejemplo, un péptido de la invención se puede utilizar para determinar la susceptibilidad de un individuo particular a un régimen de tratamiento que emplea el péptido o péptidos relacionados, y así puede ser útil en modificar un protocolo de tratamiento existente puede determinar una prognosis para un individuo afectado. Por ejempJo, un péptido de la invención se puede utilizar en al ensayo de manchado de tetrámero para estimar las células mononucleares de la sangre periférica para la presencia de CTLs específicos de antígeno después de la exposición de un patógeno o inmunógeno. El complejo HLA-tetramérico es utilizado para visualizar directamente CTLs específicos de antígeno (ver, por ejemplo, OGG, y colaboradores, Science 279:2103-2106, 1998; y Altman, y colaboradores, Science 174:94-96, 1996) y determinar la frecuencia de la población de CTL específico de antígeno en una muestra de células mononucleares de sangre periférica. Un reactivo tetramérico que utiliza un péptido de la invención puede ser generado como sigue: un péptido que enlaza a una molécula HLA específica de alelo o molécula de supertipo es replegada en la presencia de una cadena pesada HLA correspondiente y p2-microglobulina para generar un complejo trimolecular . El complejo es biotinilado en el extremo terminal de carboxilo de la cadena pesada en un sitio que fue previamente diseñado en la proteína. La formación tetramérica luego es inducida mediante la adición de estreptavidina. Por medio de estreptavidina fluorescentemente marcada, el tetrámero puede ser utilizado para manchar las células especificas de antigeno. Las células luego pueden ser identificadas, por ejemplo, mediante la citometria de flujo. Tal análisis puede ser utilizado para propósitos de diagnóstico o prognóstico. Además, los péptidos también pueden ser utilizados para predecir que individuos estarán en riesgo sustancial para desarrollar infección crónica. La presente solicitud está relacionada con la solicitud norteame icana No. de serie 08/589,108, presentada el 23 de enero de 1996, y ahora abandonada, y a la solicitud norteamericana No. de serie 08/205,713 presentada el 4 de marzo de 1994, que es una continuación en parte de la solicitud norteamericana No. de serie 08/159,184, presentada el 29 de noviembre de 1993 y ahora abandonada, que es una continuación en parte de la solicitud norteamericana No. deserie 08/073,205 presentada el 4 de junio de 1993 y ahora abandonada, que es una continuación en parte de la solicitud norteamericana No. de serie 08/027,146 presentada el 5 de marzo de 1993 y ahora abandonada. La solicitud también está relacionada con la solicitud norteamericana No. de serie 60/013,980 presentada el 21 de marzo de 1996 y ahora abandonada, la solicitud norteamericana No. de serie 08/454,033 presentada el 26 de mayo de 1995, la solicitud norteamericana No. de serie 08/349,177 presentada el 2 de diciembre de 1994, y la solicitud norteamericana No. de serie 08/753,622 presentada el 27 de enero de 1996 y ahora abandonada. Cada una de las solicitudes referenciadas anteriormente es incorporada en la presente por referencia.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Péptidos Los péptidos utilizados fueron sintetizados como es descrito previamente por Ruppert, J. y colaboradores, "Prominent Role of Secondary Anchor Residues in Peptide Binding to HLA-A2.1 Molecules", Cell 74:929-937(1993) o adquiridos como material crudo de Chiron Mimotopes (Chiron Corp., Australia). Los péptidos sintetizados fueron típicamente purificados a >95% de homogeneidad mediante la HPLC de fase inversa. La pureza de péptidos sintetizados se determinó utilizando la HPLC de fase inversa analítica y el análisis de aminoácido, secuenciación y/o espectrometría de masas. Los péptidos liofilizados fueron resuspendidos a 4-20 mg/ml en DMSO al 100%, luego diluidos a concentraciones requeridas en PBS +0.05% (v/v) NP40 (Fluka Biochemika, Buchs, Switzerland) . Ejemplo 2: Purificación de MHC Las líneas de células transformadas de EBV, JY (A*0201), M7B (A*0202), FUN (A*0203) , DAH (A*0205), CLA (A*0206), kNE (A*0207), AP (A*0207), y ???? (A*6802) se utilizaron como la fuente primaria de moléculas MHC. Lineas 721.221 transfectadas con el alelo MHC individual también se utilizaron como fuentes de A*0202 y A*0207. Las células se mantuvieron in vitro por cultivo en el medio RPMI 1640 (Flow Laboratories, McLean, VA), suplementado con L-glutamina 2 mM (GIBCO, Grand Island, NY) , 100 U (100 g/ml) de solución de penicilina-estreptomicina (GIBCO) , y FCS inactivado con calor al 10% (Hazelton Biologics) . Cultivos a gran escala se mantuvieron en botellas rodantes . Las moléculas HLA se purificaron de lisados de células (Sidney, J., y colaboradores, "The Measurement of MHC/Peptide Interactions by Gel Infiltration", Curr Prot Immunol 18.3.1-18.3.19(1998)). Brevemente, las células se lisaron en una concentración de 108 células/ml en Tris-HCL 50 mM, pH8.5, que contiene NP-40 al 1% (v/v) , NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, y OMSF 2 mM. Los lisados luego se pasaron a través de filtros de 0.45 µ?, se limpiaron de núcleos y desechos por centrifugación a 10, 000 x g por 20 minutos y las moléculas MHC se purificaron mediante la cromatografía de afinidad basada en anticuerpo monoclonal . Para la purificación de afinidad, las columnas de Sepharose CL4B inactivada y Proteina A Sepharose se utilizaron como precolumnas. Las moléculas clase I se capturaron mediante el paso repetido a través de cuentas de proteina Sepharose conjugadas con el anticuerpo W6/32 de anti-HLA (A, B, C) (Sidney, J. , y colaboradores, supra) . Las moléculas HLA-A se purificaron adicionalmente de las moléculas HLA-B y -C mediante el paso sobre una columna Bl.23.2. Después de 2 a 4 pasos, la columna 6/32 se lavó con 10 volúmenes de columna de Tris-HCL 10 mM, pH8.0 con NP-40 al 1% (v/v) , 2 volúmenes de columna de PBS, y 2 volúmenes de columna PBS que contiene n-octilglucósido 0.4% (p/v) . Las moléculas clase I se eluyeron con dimetilamina a 50 mM en NaCl 0.15 M que contiene n-octilglucósido al 0.4% (p/v), pH 11.5 un 1/26 volumen de Tris 2.0M, pH 6.8, se adicionó al eluato para reducir al pH a -8.0. El eluato luego se concentró mediante centrifugación en concentradores Centriprep 30 a 2000 rpm (Amicon, Beverly, MA) . La pureza de la proteina, concentración y efectividad de las etapas de reducción se inspeccionaron por SDS-PAGE y ensayo BCA. Ejemplo 3: Ensayos de Enlace de MHC-Péptido Ensayos cuantitativos para medir el enlace de péptidos a las moléculas Clase I solubles están basados en la inhibición del enlace de un péptido estándar radiomarcado. Estos ensayos se realizaron como es descrito previamente (Sidney, J., y colaboradores, supra). Brevemente, 1-10 nM de péptido radiomarcado se incubó a temperatura ambiente con 1 uM a 1 nM de MHC purificado en la presencia de ß2-microglobulina humana 1 µ? (Scripps Laboratories, San Diego, CA) y un cóctel de inhibidores de- proteasa. Después de una incubación de dos días, se determinó el por ciento de radioactividad enlazada de MHC mediante la cromatografía en filtración de gel de exclusión de tamaño utilizando una columna TSK 2000. Alternativamente, el por ciento de radioactividad enlazada de MHC se determinó al capturar los complejos MHC/péptido en placas recubiertas de anticuerpos 6/32, y al determinar el cpm enlazado utilizando el contador de microcentelleo TopCount (Packard Instrument Co., Meriden, CT) (Southwood, y colaboradores, Epimmune Technical Report Epi 063-99) . El péptido estándar radiomarcado utilizado para los ensayos A*0201, A*0202, A*0203, A*0205, A*0206, y A*0207 fue un análogo F6>Y del epitope 18-27 del núcleo de HBV (secuencia FLPSDYFPSV) . La IC50 promedio de este péptido para cada molécula fue 5.0, 4.3, 10·, 4.3, 3.7, y 23 nM, respectivamente. Un análogo C4>A de HBV pol 646 (secuencia FTQAGYPAL) , o MAGE 1 282 (secuencia (YVIKVSARV) se utilizó como la marca para el ensayo A*6802. Sus IC50s para A*6802 fueron 40 y 8 nM, respectivamente. En el caso de ensayos competitivos, se calculó la concentración del péptido que produce 50% de inhibición del enlace del péptido radiomarcado. Los péptidos fueron inicialmente probados en una o dos dosis altas . La IC50 de los péptidos que producen inhibición positiva luego se determinaron en experimentos subsecuentes, en los cuales se probaron de dos a seis diluciones adicionales. Bajo las condiciones utilizadas, donde [marca] < [MHC] y IC50> [MHC], los valores IC50 medidos son aproximaciones razonables de los valores Kd verdaderos. Cada péptido competidor se probó en dos a cuatro experimentos independientes. Como un control positivo la versión no marcada de la sonda radiornarcada también se probó en cada experimento. Ejemplo 4: Ensayo de Enlace Alternativo Lineas de células homocigotas transformadas con el virus Epstein-Barr (EBV) , fibroblastos, CIR, o transfectantes 721.22 se utilizaron como fuentes para las moléculas HLA clase I. Estas células se mantuvieron in vitro mediante el cultivo en medio RPMI 1640 complementado con L-glutamina 2mM (GIBCO, Grand Island, NY) , 2-Me. 50 µ?, 100 µg/ l de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina (Irvine Scientific) y FCS inactivado con calor al 10% (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) . Las células se cultivaron en matraces de cultivo de tejido de 225-cm2, o para cultivos a gran escala, en aparatos de botellas rodantes . Las células se cosecharon por centrifugación a 1500 RPM utilizando una centrifuga IEC-CRU5000 con un rotor 259 y se lavaron tres veces con solución salina regulada con fosfato (PBS) (PO40.01 M, NaCl 0.154 M, pH 7.2 ) . Las células se formaron en pelotillas y se almacenaron a -70°C o se trataron con solución de lisado de detergente para preparar lisados de detergente. Lisados de células se prepararon mediante la adición de la solución de detergente de extracto (NP-40 al 1% (Sigma) o Renex 30 (Accurate Chem, Sci. Corp., Westbury, NY 11590), -NaCl 150 mM, Tris 50 mM, pH 8.0) a las pelotillas de células (previamente contadas) a una relación de 50-100 x 106 células por mililitro de solución de detergente. Un coctel de inhibidores de proteasa se adicionó al volumen premedido de solución de detergente de extracto inmediatamente antes de la adición de la pelotilla de células . La adición del coctel inhibidor de proteasa produjo concentraciones finales de lo siguiente: fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 2 mM; aprotinina, 5 g/ml/ leupeptina, 10 µg/ml; pepstatina, 10 µg/ml yodoacetamida, 100 pM, y EDTA, 3 ng/ml. La lisis celular se dejó proceder a 4°C durante 1 hora con mezclado periódico. Rutinariamente, 5-10 x 109 células se lisaron en 50-100 mi de solución de detergente. El lisado se clarificó mediante la centrifugación de 15,999 x g durante 30 minutos a 4°C y el paso subsecuente a la fracción sobrenadante a través de una unidad de filtro de 0.2 µ (Nalgene) . La purificación del antigeno HLA-A se obtuvo utilizando columnas de afinidad preparadas con cuentas Sepharose conjugadas con mAb. Para la producción de anticuerpo, las células se cultivaron en RPMI con FBS al 10% en matraces de cultivo de tejido grandes (Corning 25160-225) . Los anticuerpos se purificaron del medio de cultivo de tejido clarificado mediante el fraccionamiento con sulfato de amonio seguido por la cromatografía de afinidad en protein-A-Sepharose (Sigma) . Brevemente, sulfato de amonio saturado se adicionó lentamente con agitación al sobrenadante de cultivo de tejido a 45% (volumen a volumen) durante la noche a 4°C para precipitar las in unoglubulinas . Las proteínas precipitadas se cosecharon por centrifugación a 10,000 x g durante 30 minutos. El precipitado luego se disolvió en un volumen mínimo de PBS y se transfirió a la tubería de diálisis (Spectro/Por 2, Mol. t. Cutoff 12,000-14,000 Spectum Medical Ind) . La diálisis fue contra PBS (=20 veces el volumen de solución de proteina) con 4-6 cambios de solución reguladora de diálisis durante un periodo de 24-48 horas a CC. La solución de proteina dializada se clarificó por centrifugación (10,000 x g durante 30 minutos) y el pH de la solución de ajustó a pH 8.0 con NaOH 1N. Protein-A-Sepharose (Sigma) se hidrató de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se preparó una columna de protein-A-Sepharose. Una columna de 10 mi de volumen de lecho típicamente enlaza 50-100 mg de IgG de ratón. La muestra de proteina se cargó en la columna de protein-A-Sepharose utilizando una bomba peristáltica para grandes volúmenes de carga o por gravedad para volúmenes más pequeños (<100ml) , La columna se lavó con varios volúmenes de PBS y el eluato se inspeccionó a A280 en un espectrofotómetro hasta que se alcanzó la linea de base. El anticuerpo enlazado se eluyó utilizando ácido cítrico 0.1 M a un pH adecuado (ajustado al pH apropiado con agua NaOH 1N) . Para IgG-1 de ratón se utilizó el pH 6.5 para IgG2a se utilizó el pH 4.5 y para IgG2B e IgG3 se utilizó el pH 3.0. Se utilizó Tris base 2 M para neutralizar el eluato. Las fracciones que contienen el anticuerpo (inspeccionadas por A280) se acumularon, se dializaron como PBS y además se concentraron utilizando un sistema Amicon Stirred Cell (Amicon Model 8050 con membrana YM30) . El anti-A2 mAb, BB7.2, fue útil para la purificación de afinidad. El antigeno HLA-A se purificó utilizando columnas de afinidad preparadas con cuentas de Sepharose conjugadas con mAb. Las columnas de afinidad se prepararon al incubar cuentas de protein-A-Sepharose (Sigma) con mAb purificado con afinidad como es descrito anteriormente. Cinco a 10 mg de mAb por mi de cuentas es la relación preferida. Las cuentas enlazadas de mAb se lavaron con solución reguladora de borato (emulsión reguladora de borato: tetraborato de sodio 100 mM, NaCl 154 mM, pH 8.2) hasta que los lavados muestran A280 en la línea de base. Dimetil pimelimidato (20 mM) y trietanolamina 200 mM se adicionó para reticular covalentemente el mAb enlazado al protein-A-Sepharose (Schneider, y colaboradores, J. Biol. Che . 257:10766(1982). Después de la incubación durante 45 minutos a temperatura ambiente en un aparato rotativo, el reactivo de reticulación en exceso se retiró al lavar las cuentas dos veces con 10-20 mi de etanolamina 20 mM, pH 8.2. Entre cada uno, la suspensión espesa se colocó en un aparato rotativo por 5 minutos a temperatura ambiente. Las cuentas se lavaron con solución reguladora de borato y con PBS más azida de sodio al 0.02%. El lisado de células (5-10 x 109 equivalentes de células) luego se pasó lentamente sobre una columna de afinidad de 5-10 mi (tasa de flujo de 0.1-0.25 mi por minuto) para permitir el enlace del antigeno al anticuerpo inmovilizado. Después de que el lisado se dejó pasar a través de la columna, la columna se lavó secuencialmente con 20 volúmenes de columna de solución de extracto de detergente más dodecil sulfato de sodio al 0.1%, 20 volúmenes de columna de enlace de 0.5 M, Tris 20 mM, pH 8.0, y 10 volúmenes de columna de Tris 20 mM, pH 8.0. El antigeno HLA-A enlazado al mAb se eluyó con una solución reguladora básica (dimetilamina 50 mM en agua) . Como una alternativa, soluciones ácidas tales como ácido acético 0.15-0.25 M también se utilizaron para eluir el antigeno enlazado. Una alicuota del eluato (1/50) se retiró para la cuantificación de la proteina utilizando ya sea un ensayo colorimétrico (ensayo BCA, Pierce) o por SDS-PAGE, o ambos. En análisis de SDS-PAGE se realizó como es descrito por Laemmli (Laemmli, U.K, Nature 227:680(1970)) utilizando cantidades conocidas de albúmina de suero bovino (Sigma) como un estándar de proteina. Se utilizaron anticuerpos específicos de alelo para purificar la molécula MHC específica. En el caso de HLA-A2, se utilizó el mAb BB7.2. Una descripción detallada del protocolo utilizado para medir el enlace de péptidos a las moléculas HLA Clase I ha sido publicada (Sette, y colaboradores, Mol. Immunol. 31:813, 1994), Sidney, y colaboradores, en Current Protocols in Immunology, Margulies, Ed., Hohn Wiley & Sons, New York, Section 18.3, 1998). Brevemente, moléculas MHC purificadas (5 a 500 nM) se incubaron con varios inhibidores de péptido no marcados y péptidos de sonda 12?I-radiomarcados 1-10 nM durante 48 h en PBS que contiene Nonidet P-40 al 0.05% (NP40=(o digitonina al 20% w/v para ensayos H-2 IA) -en la presencia de un coctel de un inhibidor de proteasa. Las concentraciones finales de inhibidores de proteasa (cada uno de CalBioChem, La Jolla, CA) fueron PMSF 1 mM, 1.10 fenantrolina 1.3 nM, pept tina 73 µ?, EDTA 8 mM, N-etilmaleimida 6 mM, y alfa-p-tosil-L-lisina clorometil cetona 200 uM (TLCK) . Todos los ensayos se realizaron a pH 7.0.

Después de la incubación, los complejos de HC-péptido se separaron del- péptido libre mediante la filtración en gel en columnas TSK200 de 7.8 mm x 15 cm (TosoHaas 16215, Montgomeryville, PA) , eluidas a 1.2 mls/min con PBS pH 6.5 que contiene NP40 al 0.5% y NaN3 al 0.1%. El eluato de las columnas TSK se pasó a través de un detector de radioisótopo Beckman 170, y la radioactividad se graficó y se integró utilizando un integrador Hewlett-Packard 3396A, y la fracción de péptido enlazado se determinó. Los péptidos radiomarcados se yodaron utilizando el método de cloramina-T. Un péptido de sonda radiomarcado especifico se utilizó en cada ensayo. Tipicamente, en experimentos preliminares, cada preparación de HC se tituló en la presencia de cantidades fijas de péptidos radiomarcados para determinar la concentración de moléculas HLA necesarias para enlazar 10-20% de la radioactividad total. Todos los ensayos de enlace directo y de inhibición subsecuentes se realizaron utilizando estas concentraciones de HLA. Puesto que bajo estas condiciones [marca] < [HLA] e IC5o>[HLA], los valores IC50 medidos son aproximaciones razonables de los valores KD verdaderos. Los inhibidores de péptido son tipicamente probados a concentraciones que varian de 120 g ml a 1.2 ng/ml, y son probados en dos a cuatro experimentos completamente independientes. Para permitir la comparación de los datos obtenidos en diferentes experimentos, se calcula una figura de enlace relativa para cada péptido al dividir la IC50 de un control positivo para inhibición, es decir el péptido de referencia que es incluido en cada ensayo de enlace, entre la IC50 para cada péptido probado (típicamente versiones no marcadas del péptido de sonda radiomarcado) . Para propósitos de bases de datos, y comparaciones entre los experimentos, son compilados valores de enlace relativos. Estos valores subsecuentemente pueden ser convertidos en valores IC50 nM normalizados al dividir la IC50 histórica estándar del péptido de referencia entre el enlace relativo del péptido de interés . Este método de compilación de datos se ha probado que es el más preciso y consistente para comparar péptidos que se han probado en diferentes días, o con diferentes cantidades de MHC purificada. Por ejemplo, el péptido de referencia estándar (o control positivo) para los ensayos de enlace de HLA-A2.1 descritos en la presente, es el péptido que tiene una secuencia de FLPSDYFPSV, que tiene un valor de IC50 histórico promedio de 5 nM en múltiples ensayos de enlace repetidos. Este valor estándar es utilizado para normalizar los valores de IC50 reportados para el enlace de HLA-A2.1 como es descrito en la presente. Así, un valor de enlace relativo de un péptido que lleva la porción HLA-A2.1 de prueba puede ser convertido a una IC50 normalizada al dividir el valor de IC50 la referencia estándar, es decir 5 nM, entre el valor de enlace relativo del péptido que lleva porción de HLA-A2.1 de prueba . Ejemplo 5: Secuencia y Análisis de Enlace. Utili2ando el ensayo descrito en el Ejemplo 3, se calculó un valor de enlace relativo para cada péptido al dividir la IC50 del control positivo para la inhibición entre la IC50 para cada péptido probado. Estos valores subsecuentemente pueden ser convertidos nuevamente en valores IC50 nM al dividir la IC50 nM de los controles positivos para la inhibición entre el enlace relativo del péptido de interés. Este método de compilación de datos se ha probado que es preciso y consistente para comparar péptidos que se han probado en diferentes vías o con diferentes cantidades de MHC purificada. Los valores de enlace relativos estandarizados también permiten el cálculo de una media geométrica, o valor de enlace relativo promedio (ARB) , para todos los péptidos con una característica particular (Ruppert, J. , y colaboradores,. "Prominent Role of Secondary Anchor Residues in Peptide Binding to HLA-A2-1 Molecules", Cell 74:929-937 (1993); Sidney, J, y colaboradores, "Definition of an HLA-A3-Like Supermotif Demostrate the Overlapping Peptide Binding Repertoires of Common HLA Molecules", Hum Immunol . 45:79-93 (1996) ,Sidney, J, y colaboradores, "Specificity and Degeneracy in Peptide Binding to HLA-B7-Like Class I Molecules", J. Jmmunol. 157:3480- 3490 (1996) ;Kondo, A., y colaboradores, "Prominent Roles of Secondary Anchor Residues in Peptide Binding to HLA-A2 Human Class I Molecules", J. Immunol. 155:4307-4312 (1995); ondo, A., y colaboradores, "Two Distinct HLA.A*0101-Specific Submotids Illustrate Alternative Peptide Binding Modes, "ImmunogeneticsK 45:249-258 (1997); Gulu ota, K. , y colaboradores "Two Complementary Methods for Predicting Peptides Binding Major Histocompatibility Complex Molecules", J. Mol. Biol. 267:1258-1267 (1997); Southwood, S., y colaboradores, "Several Common HLA-DR Types Share Largely Overlapping Peptide Binding Repertoires", J. Immunol 160:3363-3373 (1998). Mapas de interacciones secundarias que influencian el enlace de péptido a las moléculas HLA-supertipo A2 basadas en ARB se derivaron como es descrito previamente (Ruppert, J. , y colaboradores, "Prominent Role of Secondary Anchor Residues in Peptide Binding to HLA-A2.1 Molecules", Cell 74:929-937 (1993); Sidney J., y colaboradores, "Definition of an HLA-A3 Like Supermotif Demonstrates the Overlapping Peptide Binding Repertoires of Common HLA Molecules", um Immunol. 45:79-93 (1996); Sidney, J., y colaboradores, "Specificity and Degeneracy in Peptide Binding to HLA-B7-Like Class I Molecules", J. Immunol. 157:3480-3490 (1996); Kondo, A., y colaboradores, "Prominent Roles of Secondary Anchor Residues in Peptide Binding to HLA-A24 Human Class I Molecules", J. Immunol. 155:4307-4312 (1995); Kondo, A. , y colaboradores, "Two Dintinct HLA-A*0101-Specific Sumotifs Ilústrate Alternative Peptide Binding Modes", Immunogenetics 45:249-258 (1997); Gulukota, K. , y colaboradores, "Two Complementary Methods for Predicting Peptides Binding Major Histocompatibility Complex Molecules", J. Mol. Biol. 267:1258-1267 (1997)). Esencialmente, todos los péptidos de un tamaño dado (8, 9, 10 u 11 aminoácidos) y con por lo menos un residuo fijo principal tolerado se seleccionaron para el análisis . La capacidad de enlace de los péptidos en cada grupo de tamaño fue analizada en determinados valores ARB para péptidos que contienen residuos de aminoácidos específicos en posiciones especificas. Para la determinación de la especificidad en las posiciones fijas principales, valores ARB se estandarizaron con relación al ARB de péptidos que llevan el residuo asociado con el mejor enlace. Para determinaciones fijas secundarias como valores ARB se estandarizaron con relación al ARB del conjunto de péptido total considerado. Esto es, por ejemplo, un valor ARB se determinó para todos los péptidos 9-mer que contienen A en la posición 1, o F en la posición 7, etc. Debido a la ocurrencia rara de ciertos aminoácidos, para algunos análisis, se agruparon residuos de acuerdo con similaridades químicas individuales, como es descrito previamente (Ruppert, J. y colaboradores, supra; Sidney, J., y colaboradores, supra; Sidney, J., y colaboradores, supra; Kondo, A., y colaboradores> supra; Kondo, A. , · y colaboradores, supra; Gulukota, K, y colaboradores, supra; Southwood, S., y colaboradoresr supra) . Frecuencias de Moléculas HLA-Supertipo A2 Para seleccionar un panel de moléculas del supertipo A2 representativo de las formas alélicas más frecuentes en los grupos étnicos mayores, se utilizaron datos mecanografiados de población publicados de D. Mann y M. Fernández Vina. Estos dados fueron consistentes con los datos publicados (Sudo, T . , y colaboradores, "DNA Typing for HLA Class I Alíeles: I. Subsets of HLA-A2 and of -A28", Hum. Immunol. 33:163-173 (1992); Ellis, J.M. y colaborado es, "Frequencies of HLA-A2 alíeles in Fice US Population Gropups", Hum. Immunol. 61:334-340(2000); Krausa, P., y colaboradores, "Genetic Polymorphism Within HLA-A*02: Significant Allelic Variation .Revealed in Different Populations", Tissue Antlgens 45:233-231 (1995) e Imanishi, T . , y colaboradores, "Alíele and Haplotype Freguencies for HLA and Complkement Loci in Various Ethnic Groups" Tsuji, K., y colaboradores, (eds) : HLA 1991, Proceeding of the Eleventh International Histo-Compatibility Workshop and Conference, Vol. 1., Oxford University Press, Oxford, pp.1065-1220 (1992) ) y son mostrados en la Tabla 3. Para los cuatro grupos étnicos mayores considerados, fue evidente que siete alelos HLA representan la vasta mayoría de alelos del supertipo A2. Incluidos en este grupo están A*0201, A*0202, A*0203, A*0205, A*0206, A*0207, y A*6802. Cada uno de estos alelos está presente en 2% o más de la población general, y también surgen con una frecuencia más grande que 5% en por lo menos una etnicidad mayor. Otros alelos son representados con solamente frecuencias mejores de 1.3%, o menor, en cualquier grupo étnico mayor. Además, ninguno de los alelos menores están presentes con una frecuencia mayor que 1% en la población general. Basados en estas observaciones, A*0201, A*0202, A*0203, A*0205, A*0206, A*0207, y A*6802 se seleccionaron para estudios que definen la especificidad de enlace del péptido y la reactividad cruzada en el supertipo A2. Posiciones Fijas Principales de las Moléculas del Supertipo A2 Estudios previos indicaron una especificidad de enlace del péptido grandemente sobrepuesta para un conjunto de moléculas Clase I designadas como el supertipo A2. Aquí, la especificidad de enlace del péptido principal de las moléculas del supertipo A2 se examinó en más detalle. Algunos de estos resultados se han publicado previamente, y son mostrados aquí solamente para propósitos de referencia (Ruppert, J., y colaboradores, supra y Sidney, J., y colaboradores, "The HLA-A*0207 Peptide Binding Repertoire is Limited to a Subset of the A*0201 Repertoire", Hum. Immunol, 5&:12-20(1997) ) . En una primera serie de estudios, se introdujeron sustituciones de lisina (K) no conservativas en cada posición de dos péptidos previamente notados para enlazar múltiples moléculas del supertipo A2: 1) el péptido 9-mer HCV NS3 590 (secuencia YLVAYQATV) , y 2) el péptido análogo 10-mer HBV núcleo 18 F6>Y (secuencia FLPSDYFPSV) . Estos péptidos se probaron para su capacidad para enlazar A*0201/ A*0202, A*0203, A*0205.A*0206, A*0207 y A*6802. En las Tablas 4a y 4b, las capacidades de enlace son expresadas como relaciones relativas al péptido de origen. Los péptidos cuyas capacidades de enlace están dentro de 10 veces del mejor enlazador se consideran preferidos/ aquellos cuyas capacidades de enlace relativas son 10-100 veces menor que el mejor enlazador se consideran toleradas. Un guión ("-") indica un enlace relativo de menos . que 0.01. En el caso del péptido HCV NS3 590 (Tabla 4a) la sustitución es K en posición 2 y el C-terminal dieron por resultado una reducción mayor que 100 veces en el enlace a cada molécula HLA. Disminuciones mayores que 100 veces en el enlace también se notaron en el contexto de A*6802 cuando K fue sustituido en las posiciones 1 y 5. Las reducciones en la capacidad de enlace en el rango de 10-100 veces se anotaron cuando las sustituciones se hicieron en otras diversas posiciones, notablemente las posiciones 3 y 7., Cuando se investigó el ligando 10-mer HBV núcleo 18 F6>Y (Tabla 4b) , reducciones mayores que 100 veces en la capacidad de enlace se notaron nuevamente cuando el péptido fue sustituido en la posición 2 y el C-terminal. Reducciones significantes en el enlace también se observaron después de la sustitución en la posición 7. Conj ntamente, estos datos sugieren que las moléculas del supertipo A2 enlazan ambos ligandos de péptido 9- y 10-mer vía los residuos fijos en la posición 2 y en el C-terminal. La presencia de un residuo fijo primario o secundario adicional hacia la parte media del péptido es demostrada por el hecho de que el enlace de ambos de los péptidos 9-mer y 10-mer fue usualmente reducida por las sustituciones en la posición 7.

TABLA 3 Frecuencias fenotipicas de los alelos del supertipo cuatro grupos étnicos mayores. Frecuencia fenotípica Alelo Negros Caucasianos Orientales Hispanos Promedio A*0201 22.3 45.6 18.1 37.1 30.8 A*6802 12.7 1.8 ?.0 4.2 4.7 A*0206 0.0 0.4 9.3 6.3 4.0 A*0207 0.0 0.0 11.0 0.0 2.7 A*0205 5.2 1.8 0.3 3.0 2.5 A*0203 0.0 0.0 8.8 0.0 2.2 A*0202 6. 0.0 0.5 1.3 2.0 A*6901 0.0 0.7 0.3 1.3 0.6 A*0211 0.0 0.0 0.0 1.3 0.3 A*0212 0.0 0.0 0.3 0.8 0.3 A*0213 0.0 0.0 0.0 0.4 0.1 A*0214 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Total 43.1 48.2 45.0 51.9 TABLA 4a HCV NS3 590 Secuencia Capacidad de enlace relativa 1 2 3 4 5 6'1 8 9 A*201 A*0202 A*0203 A*0205 A*0206 A*6802 ' Y L V A Y Q A T V 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 K 0.40 0.050 0.31 0.19 0.29 - _ _ _ K 0.53 0.093 0.60 0.63 0.064 0.022 K 0.36 0.19 0.44 1.0 0.41 0.17 K 0.17 0.026 0.30 0.23 0.16 - K 0.54 0.033 0.27 0.24 0.10 0.060 K 0.054 0.016 0.32 0.14 0.065 0.043 K 0.24 0.13 0.37 0.79 0.14 0.13 K _ — Tabla 4b HBV núcleo 18 F6>Y Secuencia Capacidad de enlace relativa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A* 0201 A* 0202 A* 0203 A* 0205 A* 0206 A* 0207 A* 6802 F L P S D Y F P- S V 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 K 0.43 0.75 0.72 0.36 1.7 0.24 K 0.44 0.39 13 0.27 0.17 - 0.22 0.95 0.82 3.4 0.61 1.3 1.3 0.43 0.60 0.75 12 0.60 0.76 0.85 0.77 K 0.58 0.70 6.8 0.40 0.39 1.8 1.6 K - - 0.079 - - 0.027 K 0.25 0.22 6.1 0.076 0.29 0.25 0.092 K 0.14 0.18 0.21 0.18 0.25 0.14 0.42 K - _ _ _ _ Especificidad de los Residuos Fijos en la Posición 2 y C-Terminal Basados en estos resultados, la especificidad de ligando de las moléculas del supertipo A2 en la posición 2 y el C-terminal se analizó utilizando análogos de sustitución individuales HCV NS3 590 y HBV núcleo 18 F6>Y adicionales, y también análogos de sustitución individuales de un péptido de poli-alanina (péptido 953.01; secuencia ALAKAAAAV) . Para estos análisis, aminoácidos preferidos para residuos fijos se definieron como aquellos asociados con una capacidad de enlace dentro de 10 veces del residuo óptimo. Aminoácidos cuya capacidad de enlace relativa fue de entre 0.01 y 0.1 se definieron como tolerados, y aquellos asociados con una capacidad de enlace de menos de 0.01 se consideraron como no tolerados. En las tablas acompañantes, un guión ("-") indica un enlace relativo de menos de 0.01. Las capacidades de enlace son expresadas como relaciones relativas al análogo relacionado con la afinidad de enlace más alta para cada molécula individual. En la posición 2, residuos alifáticos e idrofóbicos pequeños se encontraron que son generalmente tolerados, mientras que otros residuos, incluyéndose residuos grandes polares, aromáticos y cargados no fueron típicamente bien tolerados (Tablas 5a, 5b y 5c). L, I, V y M fueron preferidos como residuos fijos en la mayoría (>80%) de los contextos (Tabla 5d) . Las combinaciones de alelo/péptido en la Tabla 5d se refieren al número de casos en los cuales un residuo dado estuvo asociado con un enlace relativo en el rango de 1-0.1 (preferido) o rango de 0.1-0.01 (tolerado). A, T, Q y S fueron menos frecuentemente preferidos como residuos fijos, pero fueron ya sea preferidos o tolerados en >80% de los contextos examinados. Ninguno de los otros aminoácidos examinados fueron preferidos en cualquier contexto y solo raramente tolerados.

Capacidad de enlace relativa TABLA 5b HBV núcleo 18 F6>Y Capacidad de enlace' relativa Residuo A*0201 A*0202 A*0203 A*0205 A*0206 A*0207 A*6802 I 0.18 0.66 0.41 0.82 1.0 0.31 0.53 L 1.0 0.46 1.0 0.79 0.36 1.0 0.088 V 0.065 1.0 0.10 1.0 0.60 0.10 0.91 T 0.013 0.35 0.025 0.25 0.11 — 1.0 Q 0.26 0.049 0.49 0.074 0.15 0.053 — F - - 0.015 — — — 0.046 D - - - - - - TABLA. 5c Péptido de poli-alanina ALAKAAAAV Capacidad de enlace relativa Combinaciones de Alelo/Péptido Residuo Probado Preferido Tolerado % Preferido % Tolerado o Preferido V 19 17 2 89.5 100.0 L 19 16 3 84.2 100.0 I 19 16 3 84.2 100.0 M 6 5 1 83.3 100.0 19 14 4 73.7 94.7 A 6 2 4 33.3 100.0 Q 13 8 3 61.5 84.6 s 6 1 4 16.7 83.3 G 6 0 3 0.0 50.0 F 19 0 4 0.0 21.1 P 19 0 1 0.0 5.3 C 6 0 0 0.0 0.0 K 19 0 0 0.0 0.0 N 6 0 0 0.0 0.0 D 19 0 0 0.0 0.0 En el C-terminal, V se encontró que es el residuo óptimo en el contexto de todos los 3 péptidos de origen para A*0201, A*0206, y A*6802, y en 2 de cada 3 casos para A*0203 y A*0205 (Tablas 6a, 6b, y 6c). En conjunto, cualquier V o L fue el residuo C-terminal óptimo para cada molécula, sin considerar el péptido probado. Las combinaciones de alelo/péptido en la Tabla 6d se refieren al número de casos en los cuales un residuo dado estuvo asociado con un enlace relativo en el rango de 1-0.1 (preferido) o rango de 0.1-0.01 (tolerado) . Los aminoácidos alifáticos/ idrofóbicos V, L e I fueron preferidos como residuos fijos en mayor que 66.7% de los contextos de MHC-péptido. M, A y T fueron tolerados aproximadamente 50% de las veces. Otros residuos- examinados fueron ya sea no aceptados en modo alguno, o fueron tolerados solo raramente. Una Reevaluación de la Especificidad de Enlace de Péptido del A*0201 La especificidad fina del enlace de A*0201 se investigó en más detalle utilizando una base de datos de arriba de 4000 péptidos entre 8 y 11 residuos en longitud. Se encontró que arriba del 30% de los péptidos que llevan L o M en la posición 2 enlazaron A*0201 con afinidades de 500 nM, o mejores (Figura la). Entre 5 y 15 % de los péptidos que llevan los residuos alifáticos I, V, A, T y Q enlazaron con IC50s de 500 nm, o mejores. Ningún otro residuo, incluyéndose los residuos aromáticos (F, e Y) , cargados (R, H, K, D y E), polares (S y N) y pequeños (C, G, y P) , estuvo asociado con IC50s de 500 nm, o mejor. Consistente con el análisis de sustitución individual, V se encontró que es el residuo fijo C-terminal de A*0201 óptimo (Figura Ib). En conjunto, 31.9% de los péptidos con V en el C-terminal fueron enlazadores de A*0201.

I, L, S, C, M, T y A también se toleraron, con 7.1 a 28.6% de los péptidos que enlazan con una IC50 de 500 nm, o mejor. La correlación entre la longitud del péptido (entre 8 y 11 residuos) y la capacidad de enlace se analizó enseguida. Se encontró que 27.6% de los péptidos 9-mer enlazaron con IC50 de 500 nm, o menor, en buen acuerdo con estimados previos (Ruppert, J. y colaboradores, supxa) (Tabla 7a) . Los valores ARB se estandarizaron al conjunto de péptidos de tamaño óptimo y se mostraron para propósitos de referencia. Péptidos más largos también fueron capaces del enlace, aunque un poco menor; 17.8% de 10-mer, y 14.5% de los péptidos 11-mer tuvieron afinidades de 500 nM o mejor. Finalmente, se notó que los péptidos 8-mer enlazaron A*0201 solo raramente, con 3.5% de los péptidos que tienen capacidades de enlace mejores que 500 nM.

TABLA 6a HCV NS3 590 Capacidad de enlace relativa Residuo A*0201 A*0202 A*0203 A*0205 A*0206 A*6802 V 1.0 0.83 1.0 0.51 1.0 1.0 I 0.22 0.14 0.60 0.30 0.17 0.075 L 0.95 1.0 0.72 1.0 0.38 0.062 T 0.16 0.012 0.11 0.017 0.034 - F 0.066 — 0.044 — - - - D — - - - - - — - — - - - P _ — — — - - Q - - - - - - Capacidad de enlace relativa TABLA 6c Péptido de poli-alanina ALAKAAAAV Capacidad de enlace relativa Residuo A*0201 A*0202 A*0203 A*0205 A*0206 A*6802 I 0.18 0.29 0.37 0.11 0.10 0.38 V 1.0 0.73 0.20 1.0 1.0 1.0 ¦ L 0.040 1.0 1.0 0.36 0.085 0.26 M 0.025 0.18 0.031 0.049 0.034 - A 0.072 — 0.077 - - 0.025 S — — 0.011 - - - T — — 0.043 - - - c — — — - - - F — — — — — G - — — - - - N — — — — — — P — — — — — — R — — — — - — Y - - - - - - Combinaciones de Alelo/Péptido Residuo Probado Preferido Tolerado % Preferido % Tolerado o Preferido V 19 19 0 100.0 100.0 I 19 18 1 93.3 100.0 L 19 14 5 66.7 100.0 M 6 1 4 20.0 83.3 T 19 3 9 20.0 63.2 A 6 0 3 0.0 50.0 s 6 0 1 0.0 16.7 - P 19 0 3 0.0 15.8 F 19 0 2 0.0 10.5 c 6 0 0 0.0 0.0 G 6 0 0 0.0 0.0 N 6 0 0 0.0 0.0 R 6 0 0 0.0 0.0 K 13 0 . 0 0.0 0.0 y 6 0 0 0.0 0.0 D 13 0 0 0.0 0.0 Q 13 0 0 0.0 0.0 TABLA 7a Enlace como una función del tamaño del péptido Longitud del Péptido (n) % de Enlace de Péptidos ARB 8 171 3.5 0.072 9 2066 27.6 1.0 10 1451 17.8 0.27 11 179 14.5 0.20 Total 3867 22.2 Tabla 7b Enlace como una función de las porciones fijas principales Porción % de Enlace de Posición 2 C-terminal (n) péptidos ARB Preferido Preferido 526 48.7 1.0 Preferido Tolerado 1446 28.4 0.31 Tolerado Preferido 558 17.6 0.098 No tolerado Preferido 27 0.0 0.031 Preferido No tolerado 66 6.1 0.026 Tolerado Tolerado 1337 7.1 0.026 No tolerado Tolerado 46 0.0 0.015 No tolerado No tolerado 71 0.0 0.014 Tolerado No tolerado 105 0.0 0.013 Total 4182 20.7 La base de datos de enlace del péptido A*0201 se analizó adicionalmente para estimar la severidad, de. la porción A*0201. Como es esperado, los péptidos con residuos preferidos en cada posición fija enlazaron más frecuentemente (48.7%), y con capacidad de enlace relativa promedio más alta que' otros péptidos en la biblioteca (Tabla 7b) . Los péptidos con un residuo preferido y un residuo tolerado también enlazaron relativamente de manera frecuente, en el rango de 17.6 a 28.4%. Finalmente, los péptidos con por lo menos un residuo no tolerado, o con residuos tolerados en ambas posiciones fijas principales, enlazaron solo raramente, si lo es, con frecuencias de enlace en el rango de 0-7.1%. No se detectó diferencia significante en términos de las preferencias fijas primarias como uña fusión del tamaño del ligando . Para identificar efectos fijos secundarios, la capacidad de enlace de A*0201 de los péptidos en cada grupo de tamaño se analizó adiciónalmente al determinar los valores ARB para los péptidos que contienen un residuo aminoácido particular en una posición especifica, pero dependiente del tamaño. Los valores ARB resultantes, por pares de residuo/posición correspondientes, para las secuencias 8-11-mer son mostrados en las Tablas 8a-8d. Todos los péptidos en las Tablas 8a-8d tuvieron por lo menos 1 residuo preferido y 1 residuo tolerado en las posiciones fijas principales. En las posiciones fijas secundarias, los valores correspondientes a un incremento de 3 veces o más grande en la capacidad de enlace son indicados por la fuente incrementada y en negritas. Efectos negativos, asociados con una disminución de tres veces en la afinidad de enlace son identificados por la fuente subrayada y en cursiva. También, los residuos determinados que son fijos preferidos o tolerados son indicados por fuente en negritas. Los valores ARB en las posiciones fijas se derivaron de los análisis descritos en la Figura 1. Para permitir el uso de los valores mostrados en esta tabla como coeficientes para algoritmos predictivos, los valores para residuos fijos no tolerados se han ajustado a 0.001, equivalente a una reducción de 1000 veces en la capacidad de enlace, para translucir los péptidos sin porción. En las Tablas 8a, 8b, 8c y 8d, los resultados del análisis de un panel de 93 péptidos 8-mer, 1389 péptidos 9-mer, 953 péptidos 10-mer y 95 péptidos 11-mer, respectivamente, están basados en las secuencias que surgen de manera natural de diversos orígenes virales, bacterianos o patógenos. Los valores ARB mostrados se calcularon, por ejemplo, como es descrito en Sidney y colaboradores, Human Immunology 62: 1200 (2001) y Sidney y colaboradores J. Immunology 157:3480 (1996). Para los péptidos 9-mer y 10-mer, los valores ARB se derivaron de cada residuo considerado individualmente. Para estudios de los péptidos 8-mer y 11-mer (Tablas 8a y 8d, respectivamente), los valores ARB estuvieron basados en el agrupamiento de residuo químicamente similares, como es descrito en Ruppert y colaboradores, CeJl 74; 929 (1993). La capacidad de enlace geométrica promedio de los paneles 8-mer, 9-mer, 10-mer y 11-mer fue 14420 M, 1581 ??, 3155 ?? y 3793 ??, respectivamente. Mapas de resumen son mostrados en las Figuras 2a-2d. En la mayoría de las posiciones, algo de influencia secundaria podría ser detectada. La mayoría (55%) de las influencias negativas involucraron la presencia de residuos acídicos (D y E) o básicos (R, H y K) . Prolina (P) y residuos polares grandes (Q y N) , también fueron frecuentemente disruptivos. Mientras que cada tamaño en particular estuvo asociado con preferencias únicas, en la mayoría de los casos (79%) , los residuos preferidos fueron aromáticos (F, o Y) o hidrofóbicos (L, I, V o M) . Las longitudes de las mayorías de los péptidos exhibieron una preferencia para F, Y y M en la posición 3. De manera similar, todos los tamaños de péptidos compartieron una preferencia para residuos aromáticos o hidrofóbicos en la posición C-2.

Posición (ARB) Residuo 1 2 3 4 5 6 7 8 A 0.47 0.052 2.0 0.57 1.8 8.9 0.83 038 C 1.3 0.0010 0.70 13 0.59 23 1.1 0.0010 D Ó.23 0.0010 0.42 0.43 034 0.43 0.50 0.0010 £ 0.23 0.0010 0.42 0.43 0.34 0.43 0.50 0.0010 F 2.5 0.0010 1.4 13 0.27 3.4 12 0.0010 G 1.5 0.0010 17 1.8 2.7 0.38 4.8 0.0010 H 0.95 0.0010 OJO 0.54 0.61 0.40 0.55 0.0010 I 2.4 0.17 1.4 2.0 9.9 1.5 1.0 035 K 0.95 0.0010 0.30 0.54 0.61 0.40 0.55 0.0010 L 2.4 1.0 1.4 2.0 9.9 1.5 1.0 034 M 2.4 0.73 1.4 2.0 9.9 1.5 1.0 0.13 N 0.90 0.0010 1.0 0.51 0.38 038 0.66 0.0010 P Q 0.0010 038 0.40 0.75 0.50 3.4 0.0010 Q 0.90 0.076 1.0 0.51 038 038 0.66 0.0010 R 0.95 0.0010 0.30 0.54 0.61 0.40 0.55 0.0010 S 13 0.0010 0.70 1.3 0.59 2.3 1.1 0.0010 T 1.3 0.075 0.70 1 0.59 23 0.11 V 2.4 0.084 1.4 2.0 9.9 1.5 1.0 1.0 w 2.5 0.0010 1.4 13 Q 1 3.4 1.2 0.0010 Y 2.5 0.0010 1.4 1.3 Q.27 3.4 \ . 0.0010 Posición (ARB) Residuo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A 1.8 0-052 1.2 23 L9 0.45 23 0.80 0.28 C 0.70 0.0010 0.57 2.7 1.4 2.1 0.86 12 0.0010 D 0.065 0.0010 1.2 1.7 0.84 0 2 0.21 0.34 0.0010 E 0.065 0.0010 0.14 1.5 0.31 0.58 0.32 1.4 0.0010 F 9.1 0.0010 4.4 1.1 2.4 2.6 6.8 4.1 0.0010 G 0.84 0.0010 0.58 1.6 0.69 0.43 0.28 0.79 0.0010 H 0.68 0.0010 0.79 0.83 3.8 0.26 1.7 13 0.0010 I 13 0.17 1.8 0.56 2.1 2.0 13 0.45 0.35 K 1.5 0.0010 0.14 0.56 0.57 0.17 0.19 0.46 0.0010 L 1.9 1.0 2.2 0.70 1.3 2.6 2.9 2.1 0.34 M 1.4 0.73 4.6 0.20 0.97 1.5 1.0 0.30 0.13 N 1.1 0.0010 0.78 0.52 QJ2 0.90 0.47 0.47 0.0010 P 0.074 0.0010 0.64 0.62 0.47 0.89 1.6 . 1.6 0.0010 Q Q 1 0.076 1.2 0.74 1.0 0.83 0.62 0.78 0.0010 R 1.6 0.0010 Q 1 0.47 0.47 0.17 0.17 0.49 0.0010 S 0.99 0.0010 0.65 1J2 0.45 0,97 0.51 2.0 O.00I0 T 0.60 0.075 0.53 2.1 0.59 1.9 0.98 1.3 0.11 V T.93 0.084 1.2 0.56 1.7 2.7 0.75 0.30 1.0 w 0.58 0.0010 25 5.1 2.7 1.3 7.6 1.9 0.0010 Y 10 0.0010 4.3 0.52 32 1.0 7.4 1.7 0.0010 Tabla 8c Péptidos 10-mer Posición (ARB) Residuo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A 1.3 0.052 1.7 1.6 1.4 1.1 0.62 12 1.0 0.28 C 0.63 0.0010 13 1.3 1.8 0.51 13 2.6 ?2 O.OOIO D 0 2 0.0010 0.85 1.4 1.1 l.l 0.39 0.22 038 0.0010 £ 0.11 0.0010 0.17 2.8 QJ8. 0.75 0.43 0.40 0.92 0.0010 F 4-4 0.0010 4.1 1.4 3.2 23 3.0 5.0 53 0.0010 G US 0.0010 0.44 2.1 0.91 0.91 0.81 0.67 1.1 0.0010 H 0.54 0.0010 0.90 0.76 12 0.42 0.74 1.6 032 0.0010 I 1.4 0.17 3.1 0.67 2.4 1.6 2.7 13 037 035 K 1.8 0.0010 Q I 0.44 0.26 0.39 0.48 0.22 0.47 0.0010 L 1.9 1.0 3.6 12 13 1 4.5 2.5 1.2 034 M 1.4 0.73 9.8 1.1 0.58 1.7 2.2 4.6 038 0.13 N 038 0.0010 0.56 1.4 039 1.1 0.43 0.33 0.79 0.0010 P 0.77 a???? 0.53 0.66 0.40 0.92 0.86 1.7 0.85 0.0010 Q 030 0.076 0.97 0.30 1.7 0.48 0.41 0.32 0.70 0.0010 R 1.1 0.0010 0.19 035 0.33 0.77 0.27 0.17 038 0.0010 S 1.7 0.0010 0.38 0.60 0.43 0.58 0.49 0.87 1.1 o.ooto T 0.83 0.075 0.44 1.1 1.6 0.89 1.0 0.49 12 0.11 V 1 0.084 0.96 0.54 2.0 22 1.1 1.8 1.4 1.0 w 0.71 0.0010 1.8 4.2 3.5 1.1 2.6 4.8 1.5 0.0010 y 9.0 0.0010 7.4 0.74 0.67 0.52 2.0 2.7 2.0 0.0010 Posición (ARB) Residuo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 A 0.34 0.052 1.8 2.7 2.4 22 1.0 0.23 0.074 13 0.28 C 22 0.0010 0.17 0.21 0.98 1.4 1.9 0.63 0.79 1.4 O.0O1O D 0.21 0.0010 0.40 12 0.94 0.30 0.21 Q 0.28 1.5 0.0010 £ 0.21 0.0010 0.40 12 0.94 o o 0.21 0.25 0.28 1.5 0.0010 F 12 0.0010 6.1 0.40 2.6 0 I 1.4 9 H 6.1 0.17 0.0010 G 3.3 0.0010 0.13 1.0 0.30 14 21 5.3 0.76 9.0 0.0010 H 12 0.0010 0.42 0.58 0.12 0.088 1.4 0.51 0.16 SJI 0.COI0 I 4.4 0.17 92 1.4 2.4 3.7 0.87 . 2.1 ss 0.83 0J5 K 12 00010 0.42 0.58 0.12 0.088 1.4 0.51 QJ6 QJi. 0.0010 L 4.4 1.0 9? 1.4 2.4 3.7 0.87 2.1 5J 0.83 0 M 4.4 0.73 92 1.4 2.4 3.7 0.87 2.1 S S 0.83 0.13 N 0.12 0.0010 0.092 1.7 0.57 1.3 0.19 1.6 1.1 0.21 0.0010 P 0.056 0.0O1O 1.7 0.38 1.4 0.13 0.35 1.1 0.088 12 0.0010 Q 0.12 0.076 0.092 1.7 0.57 1.3 0.19 1.6 l.l QJl 0.0010 R 12 0.0010 0.42 0.58 0.12 0.088 1.4 0.51 Jé 0.33 0.0010 s 22 0.0010 0.17 0.21 0.98 1.4 1.9 0.63 0.79 1.4 0.0010 T 22 0.07S QJ1 0.21 0.98 1.4 1.9 0.63 0.79 1.4 0.11 V 4.4 0.084 92 1.4 2.4 3.7 0.87 2.1 SS 0.83 1.0 w 12 0.0010 6.1 0.40 2.6 QJ1 1.4 8.8 6.1 0.17 0.0010 Y 12 0.0010 6.1 0.40 2.6 Q 1 1.4 8.8 6.1 0.17 0.0010 Varios patrones de preferencia distintos también se observaron para los péptidos de un tamaño dado. Por ejemplo, los péptidos 8-mer no tuvieron alguna preferencia en ya sea la posición 1 o la posición 3 para los residuos hidrofóbicos o aromáticos preferidos por los péptidos 9-, 10- y 11-mer.

Los péptidos 11-mer fueron únicos en la preferencia para G en posiciones múltiples por toda la parte media del péptido. Especificidades Fijas Principales de Otras Moléculas del Supertipo A2 En el siguiente conjunto de análisis, se estimaron las especificidades fijas principales de A*0202, A*0203, A*0206, y A*6802, cuatro de los alelos del supertipo A2 más prevalentes después de A*0201. Los péptidos en la base de datos de enlace del supertipo A2 frecuentemente reflejan la selección utilizando una inclinación basada en A*0201, tal como la selección de solamente los péptidos de enlace A*0201, o la selección de péptidos de alto registro en algoritmos de A*0201. Como resultado, en la mayoría de los casos, los datos de enlace de péptido para las moléculas no de A*0201 están disponibles para solamente péptidos con residuos preferidos y tolerados del supertipo. A pesar de esta limitación, una base de datos de aproximadamente 400 péptidos estuvo disponible para el estudio. Una base de datos de tamaño suficiente no fue disponible para permitir en análisis de A*0205 y A*0207, aunque un análisis de la especificidad de A*0207 se ha publicado previamente (Sidney, J. y colaboradores, supra) . Los análisis de las especificidades en la posición 2 son resumidos en las Figuras 3a-d. En general, V. T, A, I y M fueron tolerados en el contexto de cada molécula. Las preferencias especificas del alelo también fueron notadas. En el caso de A*0202, Q fue el residuo más preferido. Otros residuos (L, I, V, A, T y M) fueron tolerados, y fueron aproximadamente equivalentes, con ARB en el rango de 0.08-0.30. En contraste, A*0203 tuvo una preferencia para L, M y Q. Los residuos V, A, I y T fueron asociados con afinidades de enlace en conjunto inferiores. Un tercer patrón se notó para A*0206, donde Q, V, I, A y T fueron todos bien tolerados con valores ARB entre 0.47 y 1.0, mientras que L y M fueron menos bien tolerados. Finalmente, para A*6802, V y T fueron los residuos óptimos, con ARB > 0.45. A también fue preferido, pero con un ARB menor (0.13). Disminuciones significantes del enlace se observaron con I y M, que tuvieron ARB entre 0.050 y 0.020. L y Q no fueron tolerados, con ARB < 0.010. En el C-terminal, I, V, L, A, M y T fueron tolerados por todas las moléculas del supertipo A2 probadas, con ARB > 0.060 (Figuras 4a-d) . I y V fueron los dos residuos más preferidos por cada alelo; V fue el residuo óptimo para A*0203, A*0206 y A*6802. L fue típicamente el siguiente residuo más preferido. T, A, y M fueron usualmente asociados con valores ARB menores. En conclusión, los residuos fijos en la posición 2 y C-terminal preferidos o tolerados por A*0201 también fueron bien tolerados por las otras moléculas del supertipo A2. Mientras que cada alelo tuvo patrón algo único de preferencias en la posición 2, los patrones de preferencias exhibidos por cada alelo en el C-terminal fueron muy similares . Influencias Secundarias en el Enlace de Péptido a las Moléculas del Supertipo A2 La misma biblioteca de ligandos de péptidos se analizó para determinar las preferencias de3 tamaño del ligando de A*0202, A*0203, A*0206, y A*68Q2. Para cada alelo, los valores ARB se estandarizaron al conjunto de péptidos del tamaño óptimo. Los solicitantes encontraron que para cada molécula los péptidos 9-11 mer fueron bien tolerados, con ARB > 0.36 (Tabla 9 a-d) . Para A*0203, A*0206, y A*6802, los péptidos 9-mer fueron óptimos, pero 10-mers fueron óptimos en el caso de A*0202. Para todos los alelos, los péptidos 8-mer fueron menos bien tolerados, con ARB en cada caso < 0.11.

Tabla 9a A*0202 Longitud del péptido (n) ARB 8 6 0.050 9 268 ' 0.79 10 120 1.0 11 16 0.90 Total 410 Tabla 9b A*0203 Longitud del péptido (n) ARB 8 6 0.11 9 272 1.0 10 122 0.75 11 16 0.36 Total 416 Tabla 9c A*0206 Longitud del péptido (n) A B 8 6 0.066 9 268 1.0 10 120 0.38 11 16 0.66 Total 410 Tabla 9d A*6802 Longitud del péptido (n) ARB 8 6 0.071 9 268 1.0 10 120 0.60 11 16 0.47 Total 410 La influencia de los residuos fijos secundarios en la capacidad de los péptidos para enlazar A*0202, A*0203, A*0206 y A*6802 se examinó enseguida. El número de péptidos disponibles solo permitió el análisis de los ligandos 9- y 10-mer. Los valores ARB para los péptidos 9-mer y 10-mer como una función de la presencia de un residuo particular en una posición especifica son mostrados en la Tablas 10-13, y los mapas de resumen en las Figuras 5-8. Como se mencionó anteriormente, los efectos positivos y negativos son definidos como asociados con incrementos o disminuciones tres veces o más grandes en la afinidad de enlace, respectivamente . En las Tablas 10a y 10b, un panel de 268 péptidos 9-mer y un panel de 120 péptidos 10-mer, respectivamente, se probaron para el enlace al alelo A*0202. En las Tablas lia y 11b, un panel de 272 péptidos 9-mer y un panel de 122 péptidos 10-mer, respectivamente, se probaron para el enlace al alelo A*0203. En las tablas 12a y 12b, un panel de 268 péptidos 9-mer y un panel de 120 péptidos 10-mer, respectivamente, se probaron para el enlace al alelo A*0206. En las Tablas 13a y 13b, un panel de 268 péptidos 9-mer y un panel de 120 péptidos 10-mer, respectivamente, se probaron para el enlace al alelo A*6802. Todos los péptidos fueron basados en secuencias que surgen de manera natural de varios orígenes virales, bacterianos o patógenos y tuvieron por lo menos 1 residuo preferido y 1 residuo tolerado en las posiciones fijas principales. Los valores ARB están basados en el agrupamiento de residuos químicamente similares, generalmente como es descrito en Ruppert y colaboradores, Cell 74: 929 (1993), por ejemplo. En las posiciones fijas secundarias, lor* valores correspondientes a un incremento de 3 veces o más grande en la capacidad de enlace son indicados por una fuente en negritas e incrementada. Efectos negativos, asociados con una disminución de tres veces en la afinidad de enlace, son indicados por una fuente subrayada y en cursiva. También, los residuos determinados que son residuos preferidos o tolerados son indicados por una fuente en negritas . Para permitir él uso de los valores mostrados en esta tabla como coeficientes para algoritmos predictivos, los valores para residuos fijos no tolerados se ajustaron a 0.001, equivalente a una reducción de 1000 veces en la capacidad de enlace para translucir péptidos sin porción. La capacidad de enlace geométrica promedio de cada panel en las Tablas 10a, 10b, lia, 11b, 12a, 12b, 13a y 13b fue de 401 nM, 342 nM, 85 nM, 95 nM, 387 nM, 643 nM, 838 nM y 1055 nM, respectivamente . En general, efectos nocivos fueron frecuentemente (35%) asociados con residuos cargados (D, E, R, H o ) . Un 35% adicional de las influencias nocivas se podrían atribuir a G o P. Las influencias positivas fueron atribuidas relativamente de manera uniforme a residuos básicos (R, H, K) , ácidos (D, E) , hidrofóbicos (F, W, Y, L, I, V, M) o pequeños (A, P) . Mientras que cada molécula tuvo un patrón distintivo de preferencias y aversiones, algunas tendencias comunes podrían ser notadas en el caso de los péptidos 10-mer. Por ejemplo, para todas las moléculas, Q y N fueron preferidos en la posición 1, y R, H y fueron preferidos en la posición 8. D, E y G fueron uniformemente nocivos para los péptidos 10-mer en la posición 3. Las preferencias o aversiones consens ales no se notaron para los péptidos 9-mer .

TABLA. 10a Péptidos 9-mer Posición (ARB) Residuo 1 2 3 4 s 6 7 s 9 A 1.1 0.16 43. 1.5 0.86 Q 3 2.4 1.1 0.43 C OJO 0.0010 0.71 12 2.1 2.1 0.95 0.95 0.0010 D 0.083 0.0010 0.097 12 0.78 0.71 0.23 0.95 0.0010 E 0.083 0.0010 Q.097 12 0.78 0.71 0.23 0.95 0.0010 F 2.0 0.0010 2.1 0.59 1.9 0.51 0.77 3.0 0.0010 G 0.46 0.0010 0.66 1.9 QJ¿ 036 0.71 0.64 0.0010 H 1.6 0.00)0 0.34 0.74 0.58 0.43 1.8 1.1 0.0010 I 1.1 0.17 1.1 1.4 0.79 2.2 0.75 0.41 1.0 K 1.6 0.0010 0.34 0.74 0.58 0.43 1.8 1.1 0.0010 L 1.1 0.081 1.1 1.4 0.79 2.2 0.75 0.41 0.76 M 1.1 0.14 1.1 1.4 0.79 2.2 0.75 0.41 0.17 N 0.37 fcOOtO 0.35 0.24 1.8 0.87 1.5 13 0.0010 P 0.42 0.0010 2.8 0.43 0.55 0.26 0.75 1.9 0.0010 Q 0.37 1.0 0.35 0.24 1.8 0.87 1.5 13 0.0010 R 1.6 0.0010 0.34 0.74 0.58 0.43 1.8 1.1 0.0010 S JO 0.0010 0.71 1.2 2.1 2.1 0.95 0.95 0.0010 T 0.30 0.18 0.71 1.2 2.1 2.1 0.95 0.95 0.15 V 1.1 0.29 1.1 1.4 0.79 2.2 0.75 0.41 0.92 w 2.0 0.0010 2.1 0.59 1.9 0.51 0.77 3.0 0.0010 Y 2,0 0.0010 2.1 0.59 1.9 0.51 0.77 3.0 0.0010 Posición (AKB) Residuo 1 2 3 4 5 6 7 s 9 10 A 12 0.16 1.1 0.81 1.4 3.1 0.56 1.4 2.4 0.43 C 0.27 0.0010 0.44 3.0 12 0.95 0.43 1.6 1.5 0.0010 D 0.16 0.0010 SJ& 2.2 9? 3.6 22 0.0077 1.8 0.0010 £ 0.16 0.0010 Q 2.2 9? 3.6 22 0,0077 1.8 0.0010 F 3J» 0.0010 5.8 13 0.83 2.8 1.3 1.5 1.1 0.0010 G 0.32 0.0010 0.098 0.88 1.0 0.44 Q ¿ 1.0 039 0.0010 H 2.1 0.0010 2.0 0.52 0.89 0.21 0.74 9.9 0.22 0.0010 I 0.76 0.17 0.85 0.65 0.67 0.60 6.7 0.40 0.60 1.0 K 2.1 0.0010 2.0 0.52 0.89 0.21 0.74 93 Q Z 0.0010 L 0.76 0.081 0.85 0.65 0.67 0.60 6.7 0.40 0.60 0.76 M 0.76 0.14 0.85 0.65 0.67 0.60 6.7 0.40 0.60 0.17 N 4.2 0.0010 038 1.4 0.66 0.36 0.26 0.79 0.91 0.0010 P 0.46 0.0010 1.1 0.091 23 2.5 0.14 12 3.8 0.0010 Q 4.2 1.0 038 1.4 0.66 036 QJ 0.79 0.91 0.0010 R 2.1 0.0010 2.0 0.52 0.89 Q 0.74 9.9 0.22 0.0010 S 0.27 0.0010 0.44 3.0 1.2 0.95 0.43 1.6 1.5 0.0010 T 0.27 0.18 0.44 3? 1.2 0.95 0.43 1.6 1.5 0.15 V 0.76 0.29 0.85 0.65 0.67 0.60 6.7 0.40 0.60 0.92 w 33 0.0010 5.8 13 0.83 2.8 13 1.5 1.1 0.0010 Y 3.9 0.0010 5.8 13 0.83 2.8 13 1 1.1 0.0010 TABLA lia Péptidos 9-mer Posición (ARB) Residuo 1 1 3 4 5 6 7 8 9 A 0.95 0.077 4.4 23 1.2 0.36 43 1.4 0.17 C 0.41 0.0010 0.83 1.4 0.91 0.86 1.8 1.7 0.0010 D 0.42 0.0010 0.059 0.73 0.28 0.36 0.56 0.64 0.0010 E 0.42 0.0010 0.059 0.73 QJ8 0.36 0.56 0.64 0.0010 F 33 0.0010 0.71 0.55 1.5 0.28 0.075 1.3 0.0010 -10 G 1.1 0.0010 1.8 1.5 0.86 1.3 3.2 1.2 0.0010 H 0.63 0.0010 4.2 0.91 1.9 0.71 0.95 0.30 0.0010 I 1.1 0.070 0.77 0.85 0.63 1.9 1.2 0.56 0.56 0.63 0.0010 4.2 0.91 1.9 0.71 0.95 Q 0.0010 L 1.1 1.0 0.77 0.85 0.63 1.9 1.2 036 0.14 M 1.1 0.63 0.77 0.85 0.63 1.9 1.2 0.56 0.17 N 0.36 o.ooto 1.3 0.59 2.1 1.3 0.97 1.3 0.0010 P 0.015 0.0010 1.0 0.55 12 1.8 1.0 4.4 0.0010 Q 0.36 0.51 1.3 0.59 2.1 1.3 0.97 1.3 0.0010 R 0.63 0.0010 4.2 0.91 1.9 0.71 0.95 0.30 0.0010 S 0.41 0.001O 0.83 1.4 0.91 0.86 1.8 1.7 0.0010 T 0.41 0.045 0.83 1.4 0.91 0.86 1.8 1.7 0.26 V 1.1 0.10 0.77 0.85 0.63 1.9 12 0.56 1.0 w 33 0.0010 0.71 0.55 1.5 0.28 0.075 13 0.0010 Y 33 0.0010 0.71 0.55 1.5 0.28 0.075 13 0.0010 5 TABLA 11b Péptidos 10-mer Posición(A B) Residuo 1 1 3 4 5 6 7 8 9 10 A 2.1 0.077 1.5 1.1 3.8 13 0.56 1.7 3.0 0.17 C 0.68 0.0010 0.33 1.0 0.82 0.69 0.69 2.2 1.1 0.0010 D 0.32 0.0010 0.074 3.7 1.1 2.4 0.60 16 2.8 0.0010 £ 0.32 0.0010 0.074 3.7 1.1 2.4 0.60 16 2.8 0.0010 F 83 0.0010 6.4 0.66 1.0 1.3 1.7 0.23 13 0.0010 G 1.0 0.0010 0.32 0.59 0.63 1.0 QM 3.8 2.6 a???? H 0.75 0.0010 33 1.4 0.62 0.55 0.77 4.7 0.095 0.0010 I 0.29 04)70 0.83 0.60 1.1 037 33 0.65 0.52 0.56 K 0.75 0.0020 3.9 1.4 0.62 0.55 0.77 4.7 0.0?5 0.0O1O L 0.29 1.0 0.83 0.60 1.1 0.57 33 0.65 0.52 0.14 M 0.29 0.63 0.83 0.60 Ll 0.57 33 0.65 0.52 0.17 N 6.0 0.0010 0.43 2.8 0.75 13 0.17 0.89 0.91 0.0010 P 0.019 0.0010 0.90 0,091 1.1 43 3.6 1.4 2.5 0.0010 Q 6.0 0.51 0.43 2.8 0.75 13 0.17 0.89 0.91 0.0010 R 0.75 0.0010 3.9 1.4 0.62 0.55 0.77 4.7 O.Otf 0.0010 S 0.68 0.0010 0:33 1.0 0.82 o:69 0.69 2.2 1.1 0.0010 T 0.68 0.045 0.33 1.0 0.82 0.69 0.69 2.2 1.1 0.26 V 0.29 0.10 0.83 0.60 1.1 0.57 33 0.65 0.52 1.0 w 83 0.0010 6.4 0.66 1.0 1.3 1.7 0.23 1.3 0.0010 Y 83 0.0010 €.4 0.66 1.0 1.3 1.7 0.23 13 0.0010 Posición (ARB) Residuo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A 0.95 0.52 0.91 1.6 0.74 0.21 13 0.53 0.16 C 035 0.0010 0.47 1.1 1.4 0.75 0.72 1.6 0.0010 D 031 0.0010 031 1.4 22 12 0.21 0.64 0.0010 E 0.81 0.0010 031 1.4 2.2 1.2 021 0.64 aooio F 23 0.0010 1.4 0.85 1,9 1.6 20 33 0.O010 G 0.67 0.0010 0.33 2.4 0.24 034 031 032 OJOOIO H 1.7 0.0010 0.13 0,47 0.62 0.61 0.85 033 0.0010 I 0.77 0.49 4.1 032 0.86 2.4 0.74 0.46 0.54 1.7 OJOOIO 0.13 0.47 0.62 0.61 0.85 0.83 0.0010 L 0.77 0.061 4.1 0,82 036 2.4 0.74 0.46 0.23 M 0.77 0.18 4.1 032 036 2.4 0.74 0.46 0.071 N 0.48 «X0010 039 0.29 2.0 0.94 13 1.0 aooio P 0.11 OJOOIO 0.47 0.32 0.27 0.19 2.1 1.4 0.0O1O Q 0.48 1.0 039 0.29 2.0 0.94 13 1.0 0.0010 R 1.7 a???? 0.13 0.47 0.62 0.61 0.85 0.83 0.0010 S 035 0.0010 0.47 1.1 1.4 0.75 0.72 1.6 0.0010 T 035 0.47 0.47 1.1 1.4 0.75 0.72 1.6 0.11 V 0.77 0.53 4.1 032 036 2.4 0.74 0.46 1.0 w 23 aooio 1.4 0.85 1.9 1.6 20 33 0.0010 Y 23 0.0010 1.4 035 1.9 1.6 20 33 0.0010 TABLA. 12b Péptidos 10-mer Posición (ARB) Residuo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A 2-4 032 0.62 12 2.1 0.55 0.17 053 5.3 0.16 C 0.61 0.0010 023 0.71 1.4 0.80 056 12 0.78 OJOOIO D 0.068 0.0010 0.099 2.7 11 3-2 12 0.38 4.0 O.0010 E 0r068 0.?010 0.099 2.7 11 3.2 12 038 40 0.0010 F 3.0 0.0010 4-1 0.80 1.2 2.6 1.8 21 0.45 0.0010 G 0.71 0.0010 0.072 0.81 0.61 0.48 0.71 0.73 0.41 0.0010 H 1.4 O0010 0.17 0.56 0.66 0.86 0.96 5.0 0.25 0.0010 I 0.42 0.49 3.8 0.67 0.76 0.90 4.9 0.79 1.0 0.54 K 1.4 0.0010 0.17 0.56 0.66 0.8 0.96 5.0 0.25 O.0010 L 0.42 0.061 3.8 0.67 0.76 0.90 4.9 0.79 1.0 0.23 M 0.42 0.18 3.8 0.67 0.76 0.90 4.9 0.79 1.0 0.071 N &1 a???? 028 1.8 0.47 0.82 0.14 0.20 0.34 0X010 P 0.27 0.0010 0.84 12 037 0.83 026 13 3.6 0X010 Q 6.1 1.0 028 1.8 0.47 0.82 0.14 020 034 0.0010 R 1.4 0.0010 0.17 036 0.66 0.86 0.96 5.0 0.25 0.0010 S 0.61 0.0O1 023 0.71 1.4 0.80 056 12 0.78 0.0010 T 0.61 0.47 023 0.71 1.4 0.80 0.56 12 0.78 0.11 V 0.42 033 3.8 0.67 0.76 0.90 49 0.79 1.0 1.0 W 3.0 0X010 4.1 0.80 1.2 26 1£ 21 0.45 0.O910 Y 3.0 0X010 41 0.80 1.2 26 1.8 21 0.45 0.0010 TABLA 13a Péptidos 9-mer Posición (AKB) Residuo 2 3 4 5 6 7 8 9 A 0.36 0.13 6.8 0.98 0.71 0.14 3.4 0.71 0.15 C 1.0 0.0010 0.42 0.92 0.95 1.7 0.60 0.75 0.0010 D 352 O.OOtO 0.30 0.70 0.28 0.70 0.36 0.45 0.0010 E 352 0.0010 0.30 0.70 0.28 0.70 0.36 0.45 0.0010 F 7.6 0.0010 2.7 1,4 1.8 23 1.5 2.1 0.0010 G 0.054 0.0010 QJ 2.5 0.48 0.53 0.85 1.9 0.0010 H QJá 0.0010 0.27 0.55 0.68 3.2 3.2 1.5 0.0010 I 2.2 0.052 0.88 13 1.1 0.80 0.65 0.57 0.80 0.16 0.0010 0.27 0.55 0.68 3.2 3.2 1.5 0.0010 L 2.2 0.0078 0.8S 13 1.1 0.80 0.65 0.57 032 M 2.2 0.023 0.88 1.3 1.1 0.80 0.65 0.57 0.093 N 0.83 0.0010 1.6 0.45 0.36 0.71 0.46 1.8 0.0010 P 0.49 0.0010 2.8 0.43 24 2.3 0.71 1.7 0.0010 Q 0.83 0.0010 1.6 0.45 0.36 0.71 0.46 1.8 0.0010 R 0.16 0.0010 0.27 0.55 0.68 3.2 3.2 1.5 0.0010 S 1.0 0.0010 0.42 0.92 0.95 1.7 0.60 0.75 0.0010 T 1.0 0.45 0.42 0.92 0.95 1.7 0.60 0.75 0.062 V 2.2 1.0 0.88 1.3 1.1 0.80 0.65 0.57 1.0 w 7.6 0.0010 2.7 1.4 1.8 23 1.5 2.1 0.0010 Y 7.6 0.0010 2.7 1.4 1.8 2.3 1.5 2.1 0.0010 TABLA. 13b Péptidos 10-mer Posición (ARB) Residuo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A 0.50 0.13 5.6 33 2.7 0.69 0.71 \3 1.4 0.15 C 2.1 0.0010 1.4 1.4 0.20 0.72 QJá 1.1 0.55 0.0010 D 3.2 0.0010 0.042 4.8 43 0.68 0.28 0.10 1.2 0.0010 E 3.2 0.0010 0.042 4.8 43 0.68 0.28 0.10 12 0.0010 G 1.1 0.0010 2.7 1.4 1.3 1.5 4.9 058 22 0.0010 G 0.086 0.0010 0.16 038 2.1 0.54 1.5 \S 0.66 0.0010 H 0.73 0.0010 0.16 0.15 0.70 0.18 3.8 3.1 0.88 0.0010 I 12 0.052 12 12 2.8 1.8 1.7 0.96 0.74 0.80 K 0.73 0.0010 0.16 QJS 0.70 QJ£ 3.8 3.1 0.88 0.0010 L 1.2 0.0078 1.2 1.2 2.8 1.8 1.7 0.96 0.74 032 M \2 0.023 12 12 2.8 1.8 1.7 0S6 0.74 0.093 N 16 0.0010 1.5 0.20 8.4 32 0.31 1.6 0.0010 P 115 0.0010 0.17 0.045 0,0 0 0.60 0.12 0.96 1.8 0.0010 Q 16 0.0010 0.22 1.5 0.20 8.4 Z2 031 1.6 0.0010 R 0.73 0.0010 0.16 QJ1 0.70 0.18 3.8 3.1 0.88 0.0010 S 2.1 0.0010 1.4 1.4 Q 0.72 0.26 1.1 0.55 0.0010 T 2.1 0.45 1.4 1.4 0.20 0.72 0.26 1.1 0.55 0.062 V 1.2 1.0 1 12 2.8 1.8 1.7 0.96 0.74 1.0 w 1.1 0.0010 27 1.4 13 1.5 4.9 0.98 22 0.0010 Y 1.1 0.0010 2.7 1.4 1:3 1.5 49 0.98 22 0.0010 En resumen, los datos en esta sección describen porciones detalladas de los péptidos 9- y 10-mer que enlazan a A*0202, A*0203, A*0206 y A*6802. Cada porción es caracterizada por aspectos especificos asociados con buenos o pobres péptidos de enlace. Una Superporción A2 Consensual Las porciones descritas anteriormente para las moléculas del supertipo A2 son muy similares y grandemente sobrepuestas. A este respecto, puede ser identificada una porción consensual que incorpora caracteristicas comúnmente compartidas por las porciones especificas de las molécula (Figura 9) . La porción consensual especifica la presencia de residuos hidrofóbicos y alifáticos en la posición 2 de los ligandos de péptido . En esta posición, V, L y son preferidos, mientras que T, Q, A e I todos son tolerados. En la base del rango de preferencia de cada residuo en el contexto de cada molécula de supertipo A2, V es el residuo más preferido. En el C-terminal, la porción consensual especifica la presencia de residuos hidrofóbicos y alifáticos L, I, V, M, A y T. V es el residuo óptimo más frecuentemente, mientras que L e í también se consideran preferidos, típicamente que son los residuos más óptimos siguientes. M, A y T son considerados como residuos tolerados . Los mapas de residuos fijos secundarios para A*0201, A*0202, A*0203, A*0206 y A*6802 fueron utilizados para derivar una porción fija secundaria consensual del supertipo para los péptidos 9- y 10-mer (Figura 9). Los residuos considerados como preferidos para 3 o más moléculas del supertipo A2, sin ser nocivos para cualquier molécula, se consideraron como preferidos para la porción consensual del supertipo. A la inversa, los residuos identificados como nocivos para 3 o más moléculas fueron designados como nocivos en la porción consensual. La porción consensual se sobrepone significativamente con la porción A*0201 detallada, e incluye una preferencia para residuos aromáticos en la posición 1 y/o 3, y una aversión compartida para residuos cargados en la posición 3. Correlación entre la Afinidad de Enlace de A*0201 y Reactividad Cruzada del Supertipo A2 Debido al predominio en cuatro etnicidades mayores de A*0202 comparado con otros alelos del supertipo A2 (ver, por ejemplo, Tabla 3), fue de interés determinar como los enlazadores A*0201 también enlazan a otras moléculas del supertipo A2. Se encontró que los péptidos que enlazan A*0201 con buena afinidad (IC5o < 500 nM) frecuentemente enlazan otras moléculas del supertipo A2 (Tabla 14a) . Entre 36.1 y 73.6% de péptidos de enlace de A*0201 enlazaron otras moléculas del supertipo A2. El análisis de la degeneración del supertipo A2 como una función de la afinidad de A*0201 también produjo resultados interesantes. 72.8% de los péptidos que enlazan A*0201 con IC50 < 500 nM, enlazaron 3 o más moléculas del supertipo A2 (Tabla 14b) . Como regla general, entre más alta es la afinidad de enlace de un péptido para A*0201, más alta es la probabilidad de que el péptido también enlazará 3 o más moléculas del supertipo. Arriba del 96% de los péptidos que enlazan A*0201 con afinidades de 20 nM o mejor también enlazaron 3 o más moléculas del supertipo A2. En contraste, los péptidos de la superporción A2 que no enlazan a A*0201 con afinidades mejores que 500 nM solo raramente (10%) enlazaron 3 o más moléculas de la superporción A2, y nunca enlazaron 4 o más moléculas . En resumen, este análisis del enlace reactivo cruzado de los péptidos a A*0201 y otras moléculas del supertipo A2, confirma el hecho de que esta familia de moléculas HLA reconoce características estructurales similares en sus ligandos de péptido. También se ha mostrado que la afinidad de enlace de A*0201 se correlaciona con la propensión para enlazar múltiples alelos del supertipo A2. TABLA 14a Reactividad cruzada entre las moléculas del supertipo A2 % de enlazadores que reaccionan cruzadamente con; Alelo A*0201 A*0202 A*0203 A*0206 A*6802 Promedio A*0201 54.9 73.6 50.2 36.1 53.7 A*0202 54.9 50.2 38.7 26.2 . 42.5 A*0203 73.6 50.2 42.7 30.0 49.1 A*0206 50.2 38.7 42.7 24.3 39.0 A*6802 36.1 26.2 30.0 24.3 29.2 TABLA 14b Degeneración de los enlazadores de A*0201 Afinidad Alelos del supertipo A2 enlazados (% de péptidos) de A*0201 C ) 1 2 3 4 5 >=3 <=20 0. .0 0. .0 3. ,5 17, .5 36, .8 42, .1 96. .5 «LOO 0. ,0 3. .6 11. ,2 21. .4 34. .7 29. .1 85. .2 <=500 0. ,0 7. ,1 20. ,1 25. .1 28. .3 19. .3 72. ,8 >500 40. 0 33. .3 16. 7 10. .0 0. .0 0. .0 10. ,0 Análisis los resultados de este análisis permiten la definición detallada de las propiedades de los péptidos que enlazan a HLA-A*0201 y otras moléculas del supertipo A2. Las moléculas del supertipo A2 no comparten solo especificidad de enlace de péptido grandemente sobrepuesta, sino también repertorios de enlace de péptidos significativamente sobrepuestos. Se identificaron características especificas de ligandos especificos asociados con la degeneración de la capacidad de enlace del supertipo A2, que proporcionan una explicación lógica para la relación del supertipo. En un estudio previo, se analizó la especificidad de enlace del péptido de A*0201, y se construyó una porción detallada, incluyéndose la identificación de características físicas secundarias. En los presentes análisis, realizados con una base de datos 10 veces más grande, los solicitantes confirmaron esos datos y extendieron el análisis para incluir los péptidos 8- y 11-mer. En conjunto, la especificidad de A*0201 para los péptidos 8- y 11-mer fue grandemente similar a aquella para los péptidos 9- y 10-mer. Por ejemplo, sin considerar el tamaño del péptido, la mayoría de influencias negativas en la capacidad de enlace estuvieron asociadas con la presencia de residuos cargados en posiciones fijas secundarias, mientras que la mayoria de influencias positivas estuvieron asociadas con la presencia de residuos hidrofóbicos . La definición de porciones detalladas para los péptidos 8- y 11-mer debe permitir una identificación más completa de los epítopes. La identificación de los enlazadores A*0201 ha sido grandemente facilitada por el uso de algoritmos basados en valores ARB. En los presentes análisis, se utilizó una base de datos sustancialmente más grande que la previamente disponible, permitiendo una refinación de coeficientes del algoritmo. Debido a que los coeficientes más recientes están basados en un conjunto de datos significativamente más grande, ellos son estadísticamente más precisos y deben dar la predicción más eficiente y precisa de los epítopes. En realidad, el análisis reciente ha mostrado que un algoritmo polinomial de A*0201 9-mer revisado, basado en un conjunto de datos más grande, es más preciso que tanto un algoritmo más antiguo basado en un conjunto de datos pequeños, y las metodologías de predicción de red neural. Además del incremento de la precisión de la predicción del epitope {Ruppert, J., y colaboradores, supra; Sydney, J., colaboradores, supra; Kondo, A., y colaboradores supra; Gulukota, K,, y colaboradores supra; Parker, K.C., y colaboradores, "Seqúense Motifs Important for Peptide Binding to the Human MHC Class I Molecule, HLA-A2", J. Immunol. 149:3580-3587 (1992) y Milik, M. , y colaboradores, "Application of an Artificial Neural Network to Predict Specific Class I MHC Binding Peptide Sequences", Nature (Biotech) 16:753-756 (1998)), las porciones de enlace de péptido detalladas que definen posiciones fijas primarias y secundarias permiten el diseño racional dé ligandos optimizados. Por ejemplo, se pueden identificar secuencias naturales que llevan residuos óptimos en posiciones primarias y/o secundarias. Los residuos óptimos pueden ser reemplazados con residuos óptimos, generando epitopes con afinidad de enlace incrementada (Sydney J., .y colaboradores, supra; Pogue, R.R., y colaboradores "Amino-Terminal Alteration of the HLA-A*0201-Restricted Human Immunodeficiency Virus Pol Peptide Increases Complex Stability and in Vitro Inmmunogenicity", Proc Nat'l. Acad. Sci., USA, 92:8166-8170 (1995) and Bakker, A.B., y colaboradores "Analogues of CTL epitopes With Improved MHC Class-I Binding Capacity Elicit Anti-Melanoma CTL Recognizing the Wide-Tipe Epitope," Int. J. Cáncer, 70:302-309 (1997)). Siguiendo este tipo de modificación, péptidos de tipo silvestre que fueron incapaces de producir respuestas, o fueron pobres inmunógenos, pueden llegar a ser altamente inmunogénieos Pogue, R.R., y colaboradores, supra; Bakker, A.B., y colaboradores supra; Parkhurst, M.R., "Improved Induction of melanoma-Reactive CTL ith Peptides From the Mela.ioma Antigen gplOO Modified at HLA-A*0201-Binding Peptides", J. Immonol. 157:2539-2548 (1996); Rosenberg, S.A. , y colaboradores, "Imunologic and Therapeutic Evaluation of a Synthetic Peptide Vaccine for the Treatment of Patients With Metastatic Melanoma", Nature (Med) 4:321-327 (1998); Sarobe, P., y colaboradores., "Enhanced in vitro Potency and in vivo Immunogenicity of a CTL Epitope From Hepatitis C Virus Core Pro ein Following Amino Acid replacement at Secondary HLA-A21.1 binding positions, "J. Clin. Invest. 102:1239-1248 (1998) y Ahler, J.D., y colaboradores "Enhanced Immunogenicity of HIV-1 Vaccine Construct by Modification of the Native Peptide Sequence", Proc. Nat'l Acad. Sci., USA, 94:10856-10861 (1997). El CTL inducido por tales péptidos análogos se ha. mostrado que es capaz, en la mayoría de los casos, de reconocer células objetivo que expresan secuencias de antigeno de tipo silvestre. Este fenómeno es probable que refleje requerimientos de enlace de epitope menos severos para el reconocimiento de células objetivo comparados con aquellos necesarios para la estimulación de células T nativas para inducir la diferenciación en efectores (Cho, B.K. y colaboradores, "Funtional Differences Between Memory and Naive CD8 T Cells", Proc. Nat'l Acad. Sci.f USA, 96:2976-2981 (1999); Sykulev, Y., y colaboradores, " Evidence That A Single Peptide - HC Complex On A Target Cell Can Elicit Acytolytic T Cell Response", Immunity 4:565-571 (1996). Asi, las porciones detalladas descritas en la presente, facilitarán no solamente la identificación de epitopes de CTL, que surgen de manera natural, sino también el diseño de epitopes diseñados con capacidad de enlace incrementada y/o características inmunogénicas . La especificidad de enlace del péptido para otras moléculas del supertipo A2 también se investigó utilizando péptidos análogos de sustitución individual y bibliotecas de péptido. De acuerdo con reportes previos (del Guercio, M-F y colaboradores, "Binding of a Peptide Antigen to Múltiple HLA Alíeles Allows Definition of an- A2-Like Supertype", J. Immunol. 154:685-693 (1995) and (Sydney, J., y colaboradores, "Practical, Biochemical and Evolutionary Implications of the Discovery of HLA Class I Supermotifs", Immunol Today 17:261-266 (1996) ; ver también los reportes presentados para NIH-NIAID CONTRATO NOI-AI-45241) , los solicitantes encontraron que las porciones fijas primarias de las moléculas del supertipo A2 fueron remarcablemente similares. El uso de bibliotecas de péptido permitió la caracterización detallada de las preferencias fijas secundarias y las aversiones de cada molécula. Se mostró que, mientras que cada molécula del supertipo A2 tiene una especificidad única, una superporción basada en patrones consensúales podria ser identificada. Debido a que la superporción describe características del ligando de péptido que son compartidas entré las moléculas del supertipo A2, se espera que permitan la identificación eficiente de péptidos altamente reactivos cruzadamente, e indique estrategias apropiadas para la fijación de residuo fijo, permitiendo la modulación de la degeneración del supertipo de ligandos de péptido. Un resultado adicional del presente análisis fue la derivación de coeficientes que podrían ser utilizados en algoritmos para predecir el enlace de péptido a A*0202, A*0203, A*0206 y A*6802. Como A*0201 de HLA es con gran diferencia el alelo del supertipo A2 más prevalente, tanto en la población general como dentro de los grupos étnicos mayores, la estrategia de clasificación de péptido que se utilizó se enfocó primero en la identificación de enlazadores de A*0201. Se determinó que arriba de 70% de los péptidos que enlazan a A*0201 también enlazan a por lo menos 2 moléculas del supertipo A2 adicionales, y que la propensión a enlazar otros alelos del supertipo A2 se correlacionó con la afinidad de enlace de A*0201. En conclusión, los datos descritos en la presente proporcionan una demostración formal de la especificidad de enlace del péptido compartido de un grupo de moléculas HLA-A designadas como el supertipo A2. No solamente estas moléculas reconocen características similares en posiciones fijas primarias y secundarias de sus ligandos de péptido, ellas también comparten repertorios de enlace de péptido grandemente sobrepuestos. La demostración de que estas moléculas comparten repertorios grandemente sobrepuestos tiene una implicación significante para el diseño de construcciones de vacuna potenciales. En realidad, el concepto de que la reactividad cruzada del supertipo A2 en el nivel de enlace del péptido puede ser de relevancia inmunológica se ha demostrado en un número de estudios, en tanto la enfermedad infecciosa (Khanna R. , y colaboradores, "Identification of Cytotoxic T-Cell Epitopes Within Epstein- Bar Virus (EBV) Oncogene Latent Me brane Protein 1 (LMP1) : Evidence for HLA A2 Supertype-Restricted Immune ecognition of EBV-Infected Cells by LMPl-Specific Citotoxic T lymphocytes", Éur J Immunol, 28:451-458 (1998); Bertoletti, A. y colaboradores "Molecular Features of the Hepatitis B Virus Nucleocapsid T-Cell Epitope 18-27: Interaction ith HLA An T-Cell Receptor", Hepatology 26:1027-1034 (1997); Livingston, B.D., y colaboradores "Immunization With the HBV ¦ Core 18-27 Epitope Elicits CTL Responses in Humans Expressing Different HLA-A2 Supertype Molecules", Hum Immunol 60:1013- 1017, (1999); Bertoni, R., y colaboradores "Human Histocompatibility Leukocyte A tigen-Binding Supermotifs Predict Broadly Cross-Reactive Cytotoxic T Lymphocyte Responses in Patients With Acute Hepatitis", J Clin Invest 100:503-513 (1997); y Doolan, D.L., y colaboradores "Degene ate Cytotoxic T-Cell Epitopes from P. falciparum Restricted by Múltiple HLA-A and HLA-B Supertype Alíeles", Imunity 7:97-112 (1997) y cáncer (Fleischhauer, K, y colaboradores, "Mltiple HLA-A Allétes Can Present an Immunodominant Peptide of the Human Melanoma Antigen Melan-A/MART-1 To A Peptide-Specific HLA-A*0201 + Cytotoxic Cell Line", J Immunol, 157:787-797 (1996); Rivoltini, L. y colaboradores "Binding and Presentation of Peptides Derived From Melanoma Antigens MART-1 and Glycoprotein-100 by HLA-A2 Subtypes: Implications for Peptide-Based Immunotherapy", J Immunol 156:3882-3891 (1996); Kawashima, I., "The Multi-Epitepe Approach for Immunotherapy for Cáncer: identification of Several CTL Epitopes from Various Tumor-Associated Antigens Expressed on Solid Epithelial Tumors", Hum Immunol 59:1-14 (1998)). Ejemplo 6: Composición de Péptido para Usos Profilácticos Las composiciones de vacuna de la presente invención son utilizadas para prevenir la infección o tratar cáncer en personas. Por ejemplo, una composición de epitope de péptido poliepitópico que contiene múltiples epitopes CTL y HTL es administrada a individuos en riesgo para la infección de HCV". La composición se proporciona como un solo polipéptido lipidado que comprende múltiples epitopes. La vacuna es administrada en un portador acuoso comprendido de Adyuvante Incompleto de Freund. La dosis de péptido para la inmunización inicial es de aproximadamente 1 a aproximadamente 50,000 g para un paciente de 70 kg administrado en un volumen de dosis para humano. La administración inicial de vacuna es seguida por dosificaciones reforzadoras en 4 semanas seguido por la evaluación de la magnitud de la respuesta inmune en el paciente, por técnicas que determinan la presencia de poblaciones de CTL especificas de epitope en una muestra de PBMC. Se administran dosis reforzadoras adicionales como sea requerido. La composición se encuentra que es tanto segura como eficaz, como una profilaxis contra la infección de HCV. Alternativamente, la composición de péptido poliepitópica puede ser administrada como un ácido nucleico de acuerdo con metodologías conocidas en la técnica y descritas en la presente. La discusión anterior se proporciona para ilustrar la invención pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención serán fácilmente evidentes para un experto ordinario en la técnica y están comprendidas por las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patentes citadas en la presente, incorporadas en la presente por referencia.

LISTA DE SECUENCIA <11Q> EPIMMUNE, INC. <120> VACUNAS SUBUNITARIAS CON SUPERPORCIONES Á2 <130> 399632003540 <140> PCT/US02/02708 <141> 2002-01-29 <150> 09/935, 476 <151 2001-08-22 <150> 60/264, 969 <151> 2001-01-29 <160> 69 <170> FastSEQ for Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213 Homo Sapiens <400> 1 ' Gln Tyr He Lys Ala Asn Ser Lys Phe He Gly He Thr Glu 1 5 10 210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Asp He Glu Lys Lys He Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val Val Asn Ser 20 <210> 3 211> 17 <212> PRT . . <213> Homo Sapiens <400> 3 Tyr Gly Ala Val Asp Ser He Leu Gly Gly Vál Ala Thr Tyr Gly Ala 1 5 . 10 15 Ala <210> 4 <211> 10 212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 4 Phe Leu Pro Ser Asp Tyr Phe Pro Ser Val l 5 io <210> 5 <211> 9 <212>.PRT <213> Homo Sapiens <400> 5 Phe Thr Gln Ala Gly Tyr Pro Ala Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212>' PRT <213> Homo Sapiens . <400> 6 . Tyr Val lie Lys Val Ser Ala Arg Val 1 5 <210> 7 •í211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 7 Phe Leu Pro Ser Asp Tyr Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210> .8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> B Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 9 Phe Leu Pro Ser Asp Tyr Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 10 Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> X <223> Xaa = Y or K <400> 11 Xaa Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val ' 1 5 . <210> 12 <211> 9 <212> PRT < 13> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = L or K <400> 12 Tyr Xaa Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 3 . <223> Xaa = V or K <400> 13 Tyr Leu Xaa Ala Tyr Gln Ala Thr Val 1 5 <21 > 14 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = A or K <400> 14 Tyr Leu Val Xaa Tyr Gln Ala Thr Val 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = Y or <400> 15 Tyr Leu Val Ala Xaa Gln Ala Thr Val 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Q or K <400> 1.6 Tyr Leu Val Ala Tyr Xaa Ala Thr Val 1 5 <210> 17 <211> .9 <212 PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 7. <223> Xaa =A or K <400> 17 Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Xaa Thr Val 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT < 13> Homo Sapiens <220> <221> VARIAN <222> 8 <223> Xaa = T or K <400> 18 Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Xaa Val 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = V or K <400> 19 Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Xaa 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <;213> Homo Sapiens <400> 20 Phe Leu Pro Ser Asp Tyr Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = F or K <400> 21 Xaa Leu Pro Ser Asp Tyr Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = L or K <400> 22 Phe Xaa Pro "Ser Asp Tyr Phe Pro Ser Val 1 . 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = P or K <400> 23 Phe Leu Xaa Ser Asp Tyr Phe Pro Ser Val 1 S 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = S or <400> 24 Phe Leu Pro Xaa Asp Tyr Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210> 25 <211> 10 212> PRT < 13> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = D or K <400> 25 Phe Leu Pro Ser Xaa Tyr Phe Pro Ser Val l 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Y ór K <400> 26 Phe Leu Pro Ser Asp Xaa Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens ¾220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = F or <400> 27 Phe Leu Pro Ser Asp Tyr Xaa Pro Ser Val 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = P or <400> 28 Phe Leu Pro Ser Asp Tyr Phe Xaa Ser Val 1 . 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = S or K <400> 29 Phe Leu Pro Ser Asp Tyr Phe Pro Xaa Val 1 5 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = V or K <400> 30 Phe Leu Pro Ser Asp Tyr Phe Pro Ser Xaa 1 5 10 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 31 Ala Leu Ala Lys Ala Ala Ala Ala Val 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = L, I, V, M, A, T, or <221> VARIANT <222> (3)... (7) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = L, I, V, M# A, or T <400> 32 Xa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens. <22Ó> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = L, I, V, M, A, T, or Q <221> VARIANT <222> (3) ... (8) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = L, I, V, M, A, or T <400> 33 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 34 <2I1> 10 <212> PRT < <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = L, · I, V, M, A, T, or Q <221> VARIANT <222> (3)... (9) <223> xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = L, I, V, M, A, or T <400> 34 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 35 <211> 11 < 12> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Any atnino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = L, I, V, M, A, T, or Q <221> VARIAH <222> (3) ... (10) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIA T <222> 11 <223> Xaa = L, I, V, M, A, or T <400> 35 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 . 10 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIAN <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = V, A, T, or Q <221> VARIANT <222> (3) ... (7) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = L, I, V, M, A, or T <400> 36 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = V, A, T, or Q <221 VARIANT <222> (3)... (8) <223> Xaa = Any aminó acid <221 VARIANT <222> 9 <223> Xaa = Ii, I, V, M, A, or T <400> 37 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223 Xaa = Any amino acid <221> VARIA T <222> 2 <223> Xaa = V, A, T, or Q <221? VARIANT <222> (3)... (9) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = h, I, V, H, A, or T <400> 38 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = V, A, T, or Q <221> VARIANT <222> (3) ... (10) <223 Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = L, I, V, M, A, or T <40O> 39 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220? <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIÁNT <222> 2 <223> Xaa = h, I, M, or Q <221> VARIANT <222> (3) ... (7) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIAN <222> 8 <223> Xaa = L, I, V, , A, or T <400> 40 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = , 1, M, or Q <221> VARIANT <222> (3)... (8) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = L, I, V, M, A, or T <400> 41 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220 <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = 'L, I, M, or Q <221> VARIANT <222> (3)... (9) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = L, I, V, M, A, or T <40O> 42 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = , I, M, or Q <221> VARIANT <222> (3) (10) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = L, I, V, M, A, or T <400> 43 Xaa Xaa aa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = I or Q <221> VARIANT <222> (3) ... (7) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222? 8 <223> Xaa = L, I, V, M, A, or T <400> 44 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210? 45 <211> 9 <212> PRT <213? Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223? Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = I or Q <221> VARIANT <222> (3)..- (8) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = L, I, V, , A, or T <400> 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = ¾ny amino acid <221> VARIA T <222> 2 <223> Xaa = I or Q <221> VARIA T <222 (3) ... (9) <223> Xaa = ftny amino acid <221>.?.¾1¾??? <222> 10 <223> Xaa = L, I, V, M, A, or T <400 46 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIA T <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = I or Q <221> VARIANT <222> (3)... (10) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = L, I, V, M, A, pr T <400> 47 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa 1 5 10 <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = L, I, V, M, A, T, or <221> VARIANT <222> (3)... (7) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = L, I, V, M, A, or T <400> 48 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIA T <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIAN <222> 2 <223> Xaa. = L, I, V, M, A, T, or Q <221> VARIA T <222> (3) ... (8) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = L, I, V, M, A, or T <400> 49 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = L, I, V, M, A, T, or Q <221> VARIANT . <222 (3) ... (9) <223> Xaa = Any amino acid . <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = L, X, V, M, A, or T <400> 50 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 . 5 10 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220 <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = L, I, V, M, A, T, or Q <221> VARIANT <222> (3) ... (10) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARI¾NT <222> 11 <223> Xaa = L, I, V, M, A, or T <400> 51 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIAWT <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIA T <222> 2 <223> Xaa = L, I, V, M, A, T, or <221> VA IANT ¦ <222> (3)..- (7) :223> Xaa = Any amino acid <221> VA IANT <222> 8 <223> Xaa = T < 00> 52 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 53 - <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARXAN <222> 2 <223> Xaa = h, 1, V, M, A, T, or Q <221> VARIA T <222> (3) (8) <223> Xaa = Any amino acid <221> VA IAT <222> ,9 <223> Xaa = T <400> 53 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VA IANT <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = L, I, V, ?,?, T, or Q <221> VA IAT <222> (3) ... (9) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIAN <222> 10 <223> Xaa = T <400> 5 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIA T <222> 2 <223> Xaa = L, I, V, M, A, T, or Q <221> VARIANT <222> (3)... (10) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIAN <222> 11 <223> Xaa = T <400> 55 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIA T <222> 1 <223> Xaa = D, E, or P <221> VARIA T <222> 2 <223> Xaa = L, M, I, V, A, T, or Q <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = G, E, H, or <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa => L, I, V, M, Y, F, or W <221> VARIANT <222> S <223> Xaa = A, Y, F, or W <221> VARIANT 1 <222> (7) ... (7) <223> Xaa = G or P <221> VA IAHT <222> (8) ... (8) <223> Xaa = V, L, I, V, A, T <400> 56 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIftHT <222> 1 <223> Xaa = P, Y, D, E, P, or Q <221> VARIAT <222> 2 <223> L, M, I, V, A, T, or Q <221> VARIANT <222> 3 <223> M, F, W, Y, E, R, or K <221> VARIAWT <222> 4 <223> W or M <221> VARIANT <222> 5 <223> H, Y, E, or N <221> VARIANT <222> 6 <223> R, H, or K <221> VARIANT <222> (7) ... (7) <223> Xaa = F, W, Y, D, E, R, K, or G <221> VARIANT <222> (8)... (8) <223> Xaa = F, M or V <221> VA IANT <222> (9) -.-(9) <223> Xaa = V, Ii, I, V, A, ?G T <400> 57 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa X a 1 5 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = F, Y, D, E, P, or Q <221> VA IANT <222> 2 <223> Xaa = L, M, I, V, A, T, or Q <221> VARIAN <222> 3 <223> Xaa = L, I, M, F, Y, R, K, or E <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = W or Q <221> VARIAN <222> 5 <223 Xaa = F, W, R, K, or E <221> VARIAN <222> 6 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIAN <222> (7)... (7) <223> Xaa = L or E <221> VARIANT <222> (8) ... (8) <223> Xaa = M, F, W, D, N,. Q, R, or K <221> VARIANT <222> {9) ... (9) <223> Xaa = F <221> VARIAHT <222> (10) ... (10) <223> Xaa = V, L, I, V, A, or T <400> 58 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 59 c211> 11 <212> P T <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = L, I, V, M, R, H, K, G, D, E, Q, N, P <221> VARIAH <222> 2 <223> Xaa = L, M, I, V, T, or Q <221> VARXANT <222> 3 <223> Xaa = L, I V, M, Y, F, W, G, Q, N, S, T, or C <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = D, E, S, T, or C <22'1> VARXANT <222> 5 <223> Xaa = G, R, H, or K <221> VARIAHT <222> 6 <223 Xaa = L, I, V, M, G, D, E, R, H, K, Y, F, W, or P. <221> VARIANT «c222> (7) ... (7) <223> Xaa = G, D, E, Q, or N <:221> VARIANT <222> (8) ... (8) <223> Xaa = Y, P, W, G, D, E, or A <221> VARIANT <222> (9) ... (9) <223> Xaa = Y, F, W, L, I, V, M, D, E, R, H, , or P <221> VARIAN <222> (10) ... (10) <223> Xaa = P, G, Y, F, W, R, H, , Q, or N <221> VARIANT <222> (11) ... (11) <223> Xaa = V, L, I, V, A, or T <400> 59 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VA IA T <222> 1 <223> Xaa = D, E, S, T, or C <221> VA IANT <222> 2 <223> Xaa = Q, V, T, I, A, M, or L <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = A, D, or E <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Q or N <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = G <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = A or P <221> VARIA T <222> (7) ... (7) <223> Xaa = D or E <221> VARIANT <222> (8)... (8) <223> Xaa = Aay amano acid <221> VARIANT <222> (9)... (9) <223> Xaa = X, V, L, A, M, or T <400> 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIAHT <222> 1 <223> Xaa = Q, N# Y, F, W, D, E, G, S, T, or C <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = Q, V, T, I, A, M, or L <221> VARIA <222> 3 <223> Xaa = Y, F, W, D, E, or G <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = D or E <221> VARIANT <222> 6 223> Xaa = A, D, E, R, H, or K <221> VARIANT <222> (7) ... (7) <223> Xaa = L, I, V, M, P, G, Q, or N <221> VARIANT <222> (8) ... (8) <223> Xaa = R, H, K, D, or E <221> VARIANT <222> (9) ... (9) <223> Xaa = P, R, H, or K <221> VARIANT <222> (10) ... (10) <223> Xaa = I, V, L, A, M, or T <400> 61 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa :aa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220¾ <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Y, F, W, or P <221> V¾RIANT <222> 2 <223> Xaa = L, M, Q, V, A, I, or T <221> VARIMTT <222> 3 <223> Xaa = A, R, H, K, D, or E <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIAN <222 5 <223> Xaa = D or E <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Y, F, or W <221> VARIANT <222> (7) ... (7) <223> Xaa = G, A <221> VARIAN <222> (8) ... (8) <223> Xaa = P, R, H, or <221> VARIANT <222> (9) .. - (9) <223> Xaa = V, I, T, A, M, or L <400> 62 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa .1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIA T <222> 1 <223> Xaa = Y, F, W, Q, N, D, E, L, I, V, M, or P <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = h, M, Q, V, A, T, or I <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Y, F, W, R, H, , S, T, C, D, E, or G <221 VARIANT <222> 4 <223> Xaa = D, E, or P <221> VARIANT <222> 5. <223> Xaa = A <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = P <221> VARIA T <222> (7) ... (7) <223> Xaa = L, I, V, M, P, G, Q, or N <221> VARIA T <222> (8) ... (8) <223> Xaa = G, D, E, R, H, K, ?, F, or W <221> VARIANT <222> (9) ... (9) <223> Xaa = A, R, H, or K <221> VARIAN <222> (10) ... (10) <223> Xaa = V, I, T, ?, ?, or L <400> 63 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = P <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = Q, V, A, I, T, M, or L <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = L, I, V, M, G, R, H, or <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Q, N; or P <221? VARIANT <222> 5 <223> Xaa = G or P <221? VARIANT <222> 6 <223> Xaa = A or P <221> VARIANT <222? (7) ... (7) <223> Xaa = D or E <221> VARIANT <222> (8) ... (8) <223> Xaa = Y, P, or W <221> VARIANT <222> (9) ... (9) <223> Xaa = V, I, L, A, T, or M <400> 64 Xaa Xaa Xaa Xaa Xáa Xaa Xaa. Xaa 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Q, N, D, E, or P <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = Q, V, A, I, T, M, or L <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Y, F, W, L, I, V, M, G, D, E, , R, H, K, Q, N, s, T, or c <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = D or E <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = D or E <221> VARIANT <222> (7)... (7) <223> Xaa = L, I, V, M, P, A, Q, or N <221> VARIANT <222> (8) ... (8) <223> Xaa = R, H, K, Q, or N <221> VARIANT <222> (9)... (9) <223> Xaa = A, D, E, P, R, H, or <221> VARIANT <222> (X0)...(10) <223> Xaa = V, I, L, A, T, or M. <400> 65 -Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 ' 5 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Y, F, W, D, E, G, R, H, or <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = V, T, A, I, or M <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa <221 VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = P, D, or E <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = R, H, K, or A <221> VARIANT <222> (7)... (7) <223> Xaa « A, R, H, or K <221> VARIANT <222> (8) ... (8) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIAT <222> (9)... (9) <223> Xaa = V, I, L, A, M, or T <400> 66 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIAHT <222> 1 <223> Xaa = P, Q, N, D, E, or G <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = V, T, A, I, or M . <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = A, R, H, K, P, Q, N, G, D, or E. <221> VARIA T <222> 4 <223> Xaa = A, D, E, R, H, K, or P <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = D, E, Q, N, P, S, T, or C <221> VARIA T <222> 6 <223> Xaa = Q, N, R, H, or <221> VARIANT <222> (7)... (7) <223> Xaa = Q, N, Y, F, W, R, H, K, D, E, P, S, T, or C <221> VARIANT <222> (8) ... (8) <223> Xaa = Ri K, D, E, Q, or N <221> VARIANT <222> (9)... (9) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> (10) - . - (10) <223> Xaa = V, I, L, A, M, or T <400> 67 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Y, P, or P <221> VARIANT <222> 2 <223> aa = L, M, V, T, Q, A, or I 221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Á, R, K, D, or E <221> VARIANT <222> <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = E <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = A <221> VARIANT <222> (7) ... (7) <223> Xaa = D or E <221> VARIANT <222> (8) ... (8) <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIANT <222> (9) ... (9) <223> Xaa = I, V, L, M, T, or A <400> S8 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARXAN <222> X <223> Xaa = P, Y, D, E, or P <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = I-, M, V, T, Q, A, or I <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = F, Y, W, R, K, D <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = P <221> VARIAN <222> 5 <223> Xaa = D or E <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Any amino acid <221> VARIAHT <222> (7) ... (7) <223> Xaa = L, I, V, M. Q, N <221> VARIAT <222> (8) ... (8) <223> Xaa = H, R, K, D,. Q, or N <221> VARIANT <222> (9) ... (9) <223> Xaa = R, H, or K <221> VARIANT <222> (10) .. - (10) <223> Xaa = V, I, L, M, T, or A <400> 69 Xaa Xaa Xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10

Claims

136 REIVINDICACIONES 1. Un método para identificar un péptido restringido de HLA-superporción ?2, caracterizado porque comprende : poner en contacto un péptido que consiste de 8-11 aminoácidos, en donde el aminoácido en la posición dos del N-terminal del péptido es L, I, V, M, A, T o Q y el aminoácido C-terminal es L, I, V, M, A o T, con tres o más de las moléculas HLA codificadas por los alelos A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*?207, A*6802 y A*6901; medir valores de IC50; e identificar un péptido que enlaza por lo menos tres moléculas HLA con un valor de IC50 menor que 500 nM como un péptido restringido de HLA-superporción A2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el aminoácido en la posición dos del péptido es V, A, T o Q. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el aminoácido en la posición dos del péptido es L, I, M o Q. . El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el aminoácido en la posición dos del péptido es I o Q. 5. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el aminoácido C-terminal es L, I, V, 137 M, A O T. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el aminoácido C-terminal es T. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido es derivado de un antigeno HIV, antigeno HBV, antigeno HCV, antigeno HPV, antigeno PSA, antigeno de virus de Epstein Barr, antigeno KSHV, antigeno de virus Lassa, antigeno MT, antigeno p53, antigeno CEA, antigeno TSA, antigeno MAGE o antigeno Her2/neu. 8. Un método para identificar un péptido restringido de HLA-superporción A2 inmunogénico, caracterizado porque comprende: poner en contacto un péptido que consiste de 8-11 aminoácidos, en donde el aminoácido en la posición dos del N-terminal del péptido es L, I, V, M, A, T o Q y el aminoácido C-terminal es L, I, V, M, A o T, para formar complejos de péptido/HLA-A2, con tres o más de las moléculas HLA codificadas por los alelos A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*0207, A*6802 y A*6901; determinar si los complejos de péptido/HLA-A2 inducen una respuesta de CTL, e identificar un péptido que induce una respuesta de CTL en complejo con por lo menos tres de las HLAs como un péptido restringido de HLA-superporción A2. 9. El método de conformidad con la reivindicación 138 8, caracterizado porque el aminoácido en la posición dos del péptido es V, A, T o Q. 10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el aminoácido en la posición dos del péptido es L, I, M o Q. 11. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el aminoácido en la posición dos del péptido es I o Q. 12. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el aminoácido C-terminal es L, I, V, M, A o T. 13. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el aminoácido C-terminal es T. .1 . El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el péptido es derivado de un antigeno HIV, antigeno HBV, antigeno HCV, antigeno HPV, antigeno PSA, antigeno de virus de Epstein Barr, antigeno KSHV, antigeno de virus Lassa, antigeno MT, antigeno p53, antigeno CEA, antigeno TSA, antigeno MAGE o antlgeno Her2/neu. 15. Un método para elaborar un péptido restringido de HLA-superporción A2, caracterizado porque comprende: proporcionar una secuencia de aminoácidos de un antigeno de interés; identificar dentro de la secuencia un epitope de células T putativo, en donde el epitope putativo consiste de 139 8-11 aminoácidos, en donde el aminoácido en la posición dos del N-terminal del epitope es L I, V, M, A, T o Q y el aminoácido C-terminal es L, I, V, M, A o T; preparar uno o más fragmentos de péptido del antigeno de interés que comprende el epitope; poner en contacto el péptido con tres o más de las moléculas HLA codificadas por los alelos A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*0207, A*6802 y A*6901; medir valores de IC50; y seleccionar un péptido que enlaza por lo menos tres moléculas HLA con un valor de IC50 menor que 500 nM como un péptido restringido de HLA-superporción A2. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el aminoácido en la posición dos del péptido es V, A, T o Q. 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el aminoácido en la posición dos del péptido es L, I, M o Q. 18. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el aminoácido en la posición dos del péptido es I o Q. 19. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el aminoácido C-terminal es L, I, V, M, A o T. 20. El método de conformidad con la reivindicación 140 15, caracterizado porque el aminoácido C-terminal es T. 21. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el antigeno es HIV, HBV, HCV, HPV, PSA, virus de Epstein Barr, KSHV, virus Lassa, MT, p53, CEA, TSA, MAGE o Her2/neu. 22. Un método para elaborar un péptido restringido de HLA-superporción A2 inmunogénico, caracterizado porque comprende : proporcionar una secuencia de aminoácidos de un antigeno de interés; identificar dentro de la secuencia un epitope de células T putativo, en donde el epitope putativo consiste de 8-11 aminoácidos, en donde el aminoácido en la posición dos del N-terminal del epitope es L, I, V, M, A, T o Q y el aminoácido C-terminal es L, I, V, M, A o T; preparar uno o más fragmentos de péptido del antigeno de interés que comprende el epitope; determinar si los complejos de péptido/HLA-A2 inducen una respuesta CTL; y seleccionar un péptido que induce una respuesta de CTL en complejo con por lo menos tres de los HLAs como un péptido restringido de HLA-superporción A2. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el aminoácido en la posición dos del péptido es V, A, T o Q. 141 24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el aminoácido en la posición dos del péptido es I, I, M o Q. 25. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el aminoácido en la posición dos del péptido es I o Q. 26. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el aminoácido C-terminal es I, I, V, , A o T. 27. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el aminoácido C-terminal es T. 28. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el antigeno es HIV, HBV, HCV, HPV, PSA, virus de Epstein Barr, SHV, virus Lassa, MT, p53, CEA, TSA, MAGE o Her2/neu.