JP2005512016A - Ａ２スーパーモチーフを有するサブユニットワクチン - Google Patents

Abstract

Ａ２スーパータイプ対立遺伝子を有している個体において有効なワクチンを設計するための方法が、記載される。既知のＡ２−スーパータイプ結合ペプチドの単一アミノ酸置換アナログ、および巨大なペプチドライブラリーが、Ａ２−スーパータイプ分子のペプチド結合特異性を厳密に規定するために利用される。分子の各々は、特有の優先度を有することが指摘されるが、特異性における広範な重複が見出された。ペプチドの結合に与える２次的な影響について検査は、対立遺伝子特異的な優先度を明らかにし、共有される特徴がまた、同定され、そしてＡ２−スーパーモチーフを規定するために使用された。さらに、Ａ２−スーパータイプ分子に結合するペプチドの予測のためのアルゴリズムの発達において使用するための係数が、提供される。

Description

本明細書中に開示される主題は、集団（特に、Ａ２スーパータイプ対立遺伝子を有することで特徴づけられる集団のこれらメンバー）の大部分に有効なワクチンの設計に関する。Ａ２スーパーモチーフを含むサブユニットワクチンは、このような集団を網羅するよう設計され得る。

所定の哺乳動物の遺伝子構造は、その種の免疫系に関連する構造をコードする。ヒト集団において、多大な遺伝子の多様性が存在するが、よりヒトと他の種を比較すると、共通の機能および効果も存在する。哺乳動物において、免疫機能に関連する特定の分子は、主要組織適合性複合体と呼ばれる。

ＭＨＣ分子は、クラスＩ分子またはクラスＩＩ分子のいずれかに分類される。クラスＩＩ ＭＨＣ分子は、主に細胞上に発現され、免疫応答（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージなど）を開始し、そして持続することに関与する。クラスＩＩ ＭＨＣ分子がヘルパーＴリンパ球によって認識され、ヘルパーＴリンパ球の増殖および提示される特定の免疫原性ペプチドに対する免疫応答の増幅を誘発する。クラスＩ ＭＨＣ分子は、ほとんど全ての有核細胞で発現され、そして細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識される。次いで、ＣＴＬは抗原保有細胞を破壊する。ＣＴＬは、腫瘍拒絶およびウイルス感染と闘うことにおいて特に重要である。

ＣＴＬは、インタクトな外来抗原自体ではなく、ＭＨＣクラスＩ分子と結合したペプチドフラグメントの形成において抗原を認識する。抗原は、通常、内因的に細胞によって合成され得、そして一部のタンパク質抗原は、細胞質中で小さいペプチドフラグメントへと分解される。いくつかのこれらの小さいペプチドは、前ゴルジ区画へと転移し、適切な折りたたみおよびサブユニットβ２ミクログロブリンとの会合を促進するクラスＩ重鎖と相互作用する。ペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体は、次いで発現および特異的なＣＴＬによる潜在的な認識のために細胞表面に送られる。

ヒトＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ２．１）の結晶構造の研究は、ペプチド結合溝が、クラスＩ重鎖のα１ドメインおよびα２ドメインの折りたたみによって創造されことを示す（Ｂｊｏｒｋｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２９：５０６（１９８７））。しかし、これらの研究において、溝と結合するペプチドの同定は、決定されなかった。

Ｂｕｕｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０６５（１９８８）は、ＭＨＣからの結合ペプチドの酸溶離の方法について初めて記載した。引き続き、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅと彼の共同研究者（Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０（１９９１））は、クラスＩ分子と結合する天然のプロセッシングを受けたペプチドを特徴づけるためのアプローチを開発した。他の研究者は、質量分析によってクラスＩのＢ型（Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３５３：３２６（１９９１））およびＡ２．１型（Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：１２６１（１９９２））から溶離したペプチドの従来の自動化された配列決定により、様々なＨＰＬＣ画分において、より豊富なペプチドの直接的なアミノ酸配列決定に成功した。ＭＨＣクラスＩにおいて天然のプロセッシングを受けたペプチドの特徴付けの総説は、Ｒｏｔｚｓｃｈｋｅ＆Ｆａｌｋ（Ｒｏｔｚｓｃｈｋｅ ＆ Ｆａｌｋ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １２：４４７（１９９１））によって示されている。ＰＣＴ公開ＷＯ９７／３４６２１（本明細書中に参考として援用する）は、Ａ２．１対立遺伝子の結合モチーフを有するペプチドについて記載する。

Ｓｅｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３２９６（１９８９）は、ＭＨＣ対立遺伝子特異的モチーフが、ＭＨＣ結合能力を予測するために使用され得ることを示した。Ｓｃｈａｅｆｆｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４６４９（１９８９）は、ＭＨＣの結合が免疫原性に関係することを示した。他（Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２１：２９６３−２９７０（１９９１）；Ｐａｍｅｒら、９９１ Ｎａｔｕｒｅ ３５３：８５２−９５５（１９９１））は、クラスＩ結合モチーフが、動物モデル中の潜在的な免疫原性ペプチドの同定に適用され得るという予備的な証明を提供した。所定のクラスＩアイソタイプの多くのヒト対立遺伝子に対して特異的なクラスＩモチーフは、いまだ記載されない。これらの異なる対立遺伝子の組み合わせの頻度が、大きなフラクション（すなわち、おそらくヒトの異系交配集団の大部分）をカバーするように十分に高いことが望ましい。

当該分野の発達にもかかわらず、先行技術は、有用なヒトペプチドに基づくワクチンまたははこの研究に基づく治療的薬剤を、まだ提供していない。

（要旨）
本発明は、集団の大部分を効果的に標的化すると予想されるワクチン設計のためのパラメーターを提供する。本明細書中に示される手引きに従って、特定の感染性生物またはウイルスまたは腫瘍に対するワクチンを調製するために、関連する抗原は、感染症あるいは腫瘍に対する細胞毒素Ｔ応答をもたらす可能性が最も高いエピトープの位置を決定するために評価される。本明細書中に示される方法に従って抗原のアミノ酸配列を分析することによって、適切なエピトープのセットが、同定され得る。これらのエピトープから成るペプチドは、Ａ２スーパータイプに特徴的な１つ以上のＨＬＡ対立遺伝子と結合するそれらの能力を、容易に試験され得る。一般的に、５００ｎＭ未満のＩＣ_５０によって表される親和性で結合するペプチドは、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発する可能性が高い。これらのペプチドのこのような能力はまた、容易に確認され得る。ワクチンは、次いでこのように同定された免疫原性ペプチドに基づいて設計され得る。ワクチン自身は、ペプチド自体、インビボでペプチドを生成すると考えられる前駆体またはインビボでの生成のためのこれらのペプチドをコードしている核酸から成り得る。

従って、１つの局面において、本発明は、病原体あるいは腫瘍の抗原特徴においてエピトープを同定する方法に関する。この方法によって同定されたエピトープは、任意に選択されたペプチドよりも、Ａ２スーパータイプの対立遺伝子を有する個体において免疫応答を増強することが見込まれる。この方法は、２番目の位置のアミノ酸が小さいかまたは脂肪族の疎水性残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｔ、またはＱ）であり、そしてセグメントのＣ末端のアミノ酸が、小さいかまたは脂肪族の疎水性残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＴ）でもある、８〜１１のアミノ酸のセグメントに対する抗原のアミノ酸配列を分析する工程を包含する。好ましい実施形態において、２番目の位置の残基は、ＬまたはＭである。他の好ましい実施形態において、このセグメントは、９〜１０のアミノ酸を含む。別の好ましい実施形態において、このセグメントが１０マーである場合、セグメントは１番目の位置にＱまたはＮ、および／または８番目の位置にＲ、ＨまたはＫ、を含み、そして３番目の位置のＤ、Ｅ、およびＧを欠損する。また好ましくは、２番目の位置およびＣ末端はＶである。

ＨＬＡ−Ａ２．１分子の結合モチーフの部分配列を有する免疫原性ペプチドを含む組成物が、本明細書中に記載される。ペプチド中の適切なＭＨＣ対立遺伝子と結合する免疫原性エピトープは、好ましくは８〜１１残基長、より好ましくは９〜１０残基長であり、そして２番目の位置およびＣ末端のような特定の位置の保存された残基を含む。さらに、このペプチドは、他の位置（例えば、９アミノ酸長のペプチドの場合、１番目の位置、３番目の位置、６番目の位置および／または７番目の位置、そして１０アミノ酸長のペプチドの場合、１番目の位置、３番目の位置、４番目の位置、５番目の位置、７番目の位置、８番目の位置、およびまたは９番目の位置）に本明細書中に定義されるようなネガティブな結合残基を含まない。本発明は、ＨＬＡ Ａ２．１に効率よく結合するペプチドの選定を可能にするモチーフ内の位置を定義する。

本明細書中に記載された配列モチーフを使って、多くの免疫原性標的タンパク質上のエピトープが同定され得る。適当な抗原の例としては、以下が挙げられる：前立腺癌特異抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎コア抗原およびＢ型肝炎表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン・バー・ウイルス抗原、ヒト免疫不全１型ウイルス（ＨＩＶ１）、カポージ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原、ラッサウイルス、ヒト結核菌（ＭＴ）、ｐ５３、ＣＥＡ、トリパノソーマ表面抗原（ＴＳＡ）、およびＨｅｒ２／ｎｅｕ。これらをコードするペプチドおよび核酸は、インビボおよびエキソビボの両方での治療的用途および診断的用途のための薬学的組成物において有用である。

（定義）
用語「ペプチド」は、本発明中で「オリゴペプチド」と交換可能に使用され、隣接しているアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基の間のペプチド結合によって代表的に他と結合された一連の残基（代表的にＬアミノ酸）を意味する。オリゴペプチドは、一般的に、２５０アミノ酸長未満であり、そして１５０アミノ酸長、１００アミノ酸長、７５アミノ酸長、５０アミノ酸長、２５アミノ酸長または１５アミノ酸長未満であり得る。さらに、本発明のオリゴペプチドは、ネイティブ抗原の１５連続アミノ酸長以上を含まないようであり得る。

ペプチド化合物を記載するために使用される学術用語は、従来の習慣に従い、アミノ基をそれぞれのアミノ酸残基の左側（Ｎ末端）に示し、そしてカルボキシル基を右側（Ｃ末端）に示す。本発明の選択された特定の実施形態を示す式において、アミノ末端基およびカルボキシル末端基は、特に示されるわけではないが、他に特定されない限り、生理学的なｐＨ値で想定される形態中にある。アミノ酸構造式において、それぞれの残基は、一般的に標準の３文字または１文字の表記によって表される。アミノ酸残基のＬ型は、単一の大文字または３文字記号の大文字の頭文字によって表され、そしてＤ型を有するこれらのアミノ酸のＤ型は、単一の小文字または小文字の３文字記号によって表される。グリシンは、不斉炭素原子を有さず、単に「Ｇｌｙ」またはＧという。

「免疫原性ペプチド」または「エピトープ」は、ペプチド配列がＭＨＣ分子を結合し、そしてＣＴＬ応答を誘発するような対立遺伝子特有モチーフを含むペプチドまたはアミノ酸配列である。本発明の免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ−Ａ２分子に結合し得、そして免疫原性ペプチドを誘導する抗原に対する細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発し得る。本発明の免疫原性ペプチドは、約１５残基長未満、しばしば約１２残基長未満、そして通常、約８残基長と約１１残基長との間から成り、好ましくは、９残基または１０残基である。

発明のアルゴリズムを用いて、免疫原生ペプチドが、便利に同定される。アルゴリズムは、免疫原性ペプチドの選択を可能にするスコアを生成する数学的手順である。一般的に、特定の親和性での結合の高い見込みを有する、そして免疫原性でもあるペプチドの選択を可能にするために、「結合閾値」と共にアルゴリズムスコアを使用する。アルゴリズムは、ペプチドの特定の位置における特定のアミノ酸のＭＨＣ結合に対する効果、またはモチーフを含むペプチドの特定の置換基の結合に対する効果のいずれかに基づく。

結合結果は、しばしば、用語「ＩＣ_５０」で表される。ＩＣ_５０は、結合アッセイにおいて参照ペプチドの結合の５０％の阻害が観察されるペプチドの濃度である。本明細書中に記載されるようなアッセイを実施する条件が与えられれば（すなわち、限定的なＨＬＡタンパク質および標識されるペプチドの濃度）、これらの値は、Ｋ_Ｄ値に近い。結合を測定するためのアッセイは、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２０１２７およびＷＯ９４／０３２０５中に詳細に記載される。アッセイ条件が様々であり、そして使用される特定の試薬（例えば、ＨＬＡ調製など）に依存する場合、ＩＣ_５０値が、しばしば劇的に、変化し得ることに注意すべきである。例えば、ＨＬＡ分子の過剰な濃度は、所定のリガンドの見かけ上の測定されたＩＣ_５０を増加し、そして従って本当のＫ_Ｄ値を反映しない。

結合は、参照ペプチドに関連する割合としてしばしば表される。特定のアッセイの感度の多少によって、試験されるペプチドのＩＣ_５０は、いくらか変化し得る。しかし、参照ペプチドに対する結合は、有意に変化しない。例えば、参照ペプチドのＩＣ_５０が１０倍に上昇するような、アッセイ実行条件下において、試験ペプチドのＩＣ_５０値はまた、約１０倍にシフトする。従って、曖昧さを避けるために、標準ペプチドのＩＣ_５０に関連して、ペプチドが良い結合剤、中程度の結合剤、弱い結合剤、またはネガティブ結合剤なのかどうかの評価は、そのＩＣ_５０に一般的に基づく。結合は、割合として報告され得るか、または実施例１に記載されるようなＩＣ_５０値を規格化するために使用され得る。

本明細書中に使用される場合、ＨＬＡクラスＩ分子に対する高い親和性は、５０ｎＭ未満のＩＣ_５０値またはＫ_Ｄ値での結合として定義される。中程度の親和性は、約５０と約５００ｎＭとの間のＩＣ_５０（またはＫ_Ｄ）での結合である。

「保存された残基」は、ペプチドの特定の位置で、ランダムな分布によって予測されるよりも有意に高い頻度で生じるアミノ酸である。代表的に保存された残基は、ＭＨＣ構造が免疫原性ペプチドとの接触点を提供し得るものである。定義された長さのペプチド内の１〜３、好ましくは２の保存された残基は、免疫原性ペプチドのためのモチーフを定義する。それらの残基は、代表的にペプチド結合溝と密接に接触し、それらの側鎖は、その溝の特定のポケットの中に埋もれる。代表的に、免疫原性ペプチドは、３つまでの保存された残基、より通常は２つの保存された残基を含む。

本明細書中に使用される場合、「ネガティブな結合残基」は、特定の位置（例えば、９マーの１番目の位置、３番目の位置および／または７番目の位置）に存在する場合、非結合剤または弱い結合剤であるペプチドを生じ、そして免疫原生を有さない（すなわち、ＣＴＬ応答を誘発しない）アミノ酸である。

用語「モチーフ」は、特定のＭＨＣ対立遺伝子により認識される、定義された長さ（通常約８アミノ酸〜約１１アミノ酸）のペプチドにおける残基のパターンをいう。ペプチドモチーフは、それぞれのヒトＭＨＣ対立遺伝子について代表的に異なり、高度に保存された残基およびネガティブな残基のパターンに関して異なる。

対立遺伝に対する結合モチーフは、正確さの程度の増加により定義され得る。１つの場合において、全ての保存された残基が、ペプチド中の正確な位置に存在し、そして１番目の位置、３番目の位置、および／または７番目の位置にネガティブな残基が存在しない。

「スーパーモチーフ」は、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされたＨＬＡ分子によって共有されるペプチド結合特異性である。好ましいスーパーモチーフ保有エピトープは、２つ以上のＨＬＡ抗原によって、高度または中程度の親和性（本明細書中に定義されるように）で認識される。

「ＨＬＡスーパータイプまたはファミリー」は、本明細書中に使用される場合、共有されるペプチド結合特異性を基礎としてグループ化されたＨＬＡ分子のセットを表す。特定のアミノ酸モチーフを保有しているペプチドに対してある程度類似する結合親和性を共有するＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡスーパータイプに分類される。用語ＨＬＡスーパーファミリー、ＨＬＡスーパータイプファミリーおよびＨＬＡｘｘ様スーパータイプ分子（ｘｘが特定のＨＬＡタイプを意味する）は、同義語である。

句「単離された」または「生物学的に純粋」は、ネガティブの状態で見出される場合に通常それに伴う成分を実質的にあるいは本質的に含まない材料をいう。従って、本発明のペプチドは、インサイチュの環境でそれらに通常関連する材料を含まない（例えば、抗原提示細胞上のＭＨＣ Ｉ分子）。タンパク質が均一なバンドまたは優性のバンドになるまで単離された場合にさえ、所望のタンパク質と同時精製された、天然タンパク質の５％〜１０％の範囲内の微量の不純物が存在する。本発明の単離されたペプチドは、このような内因性の同時精製タンパク質を含まない。

用語「残基」は、アミド結合またはアミド結合模倣物によりオリゴペプチドに組み込まれたアミノ酸またはアミノ酸模倣物をいう。

（好ましい実施形態の説明）
本発明は、ワクチン設計のためのエピトープに基づくアプローチに一部、関する。こようなアプローチは、ＣＴＬ免疫応答を誘発するための機構が、抗原提示細胞上に提示されたＨＬＡ分子と結合する約８〜１１アミノ酸のペプチドとして、ＣＴＬエピトープを提示する工程を包含するという十分に確立した知見に基づく。ＨＬＡ分子は、クラスＩＭＨＣの産物であり、ここで、産物は、多くの有核細胞上で発現される。

ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の産物は、Ａ、ＢおよびＣ ＨＬＡ分子として一般的に特徴付けられる。これらの各カテゴリーにおいて、多数の対立遺伝子改変体が、その集団中に存在し；実に、５００を超えるほどのクラスＩ対立遺伝子およびクラスＩＩ対立遺伝子が存在すると思われる。細胞傷害性Ｔ細胞応答は、エピトープが、免疫される個体細胞の表面に含まれるクラスＩ ＨＬＡによって示されなければ、誘発され得ないので、このエピトープがその個体によって示されるＨＬＡに結合し得るものであることが重要である。

従って、有効なワクチンを設計するための出発点は、首尾良く存在し得る多数のエピトープを産生するワクチンを確保することである。このエピトープ自体を示すペプチドを投与することは可能であり得る。このような投与は、被験体の細胞に見られる「空の」ＨＬＡ分子の掲示に依存する。免疫原性ペプチド自体の使用のための１つのアプローチにおいて、これらのペプチドは、エキソビボで処置される被験体由来の抗原提示細胞とともにインキュベートされ得、次いで、その細胞を被験体に戻す。

あるいは、８〜１１のアミノ酸ペプチドは、それをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を投与することによってインサイチュで産生され得る。このような核酸分子を得る手段は、ＷＯ ９９／５８６５８に記載され、この開示は、本明細書中で参考文献として援用される。さらに、この免疫原性ペプチドは、大きいペプチド分子の一部分として投与され得、そして切断されて所望のペプチドを放出する。より大きなペプチドは、外来性のアミノ酸を含み得、通常、より少ない方がより良い、。従って、このようなアミノ酸を含むペプチドは、典型的には２５アミノ酸以下であり、より典型的には２０アミノ酸以下であり、そしてより典型的には１５アミノ酸以下である。この前駆体はまた、様々な、異なるかまたは同じＣＴＬエピトープを含むヘテロポリマーまたはホモポリマーであり得る。もちろん、種々の免疫原性ペプチドを産生するペプチドおよび核酸の混合物もまた、使用され得る。このペプチドワクチン、核酸分子、またはヘテロポリマーもしくはホモポリマーの設計は、所望のエピトープの封入に依存する。本発明は、Ａ２スーパータイプによって特徴付けられる個体の広範な集団範囲にわたって有効である、関連エピトープを同定するための実例を提供する。以下の頁に、Ａ２スーパーモチーフを同定するための実験方法および結果を記載する。

ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ対立遺伝子に結合するエピトープを含むことが好ましい。これらのモチーフは、任意の所望の抗原由来のＴ細胞エピトープを規定するのに使用され得、特に、これらはヒトウイルス疾患、癌または自己免疫疾患に関連し、これらに対して、潜在的な抗原または自己抗原標的のアミノ酸配列が公知である。

多くの潜在的な標的タンパク質のエピトープが、ＨＬＡ結合モチーフに基づいて同定され得る。適切な抗原の例としては、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢＶｃ）およびＢ型肝炎表面抗原（ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、黒色腫抗原（例えば、ＭＡＧＥ−１）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原、ｐ５３、ＣＥＡ、トリパノソーマ表面抗原（ＴＳＡ）、およびＨｅｒ２／ｎｅｕが挙げられる。

これらの抗原由来のエピトープを含むペプチドは、合成され得、次いで、例えば、精製されたクラスＩ分子および放射性ヨウ化ペプチドおよび／または空のクラスＩ分子を発現する細胞を使用するアッセイ（例えば、免疫蛍光染色および流動微蛍光測定によるアッセイ）、ペプチド依存性クラスＩアッセンブリアッセイ、ならびに、ペプチド競合によるＣＴＬ認識の阻害において、適切なＭＨＣ分子に結合するそれらの能力について試験され得る。クラスＩ分子に結合するこれらのペプチドは、感染されたかまたは免疫化された個体由来のＣＴＬに対する標的として役立つ能力、および潜在的な治療薬剤としてウイルス感染した標的細胞または腫瘍細胞と反応し得るＣＴＬ集団を生じ得る、インビトロまたはインビボの一次ＣＴＬ応答を誘導する能力について、さらに評価され得る。

このＭＨＣクラスＩ抗原は、ＨＬＡ−Ａ座、ＨＬＡ−Ｂ座およびＨＬＡ−Ｃ座によってコードされる。ＨＬＡ−Ａ抗原およびＨＬＡ−Ｂ抗原は、細胞表面において、ほとんど等しい密度で発現されるにもかかわらず、ＨＬＡ−Ｃの発現は、明らかに低い（おそらく１０分の１ほど）。これらの座のそれぞれに、多数の対立遺伝子が存在する。本発明のペプチド結合モチーフは、各対立遺伝子サブタイプに対して、比較的特異的である。

ペプチドベースのワクチンについて、ペプチドは、好ましくは、ヒトの集団に広く分布するＭＨＣＩ分子によって認識されるモチーフを含むか、または一般的に多様な集団によって認識されるモチーフを含む。ＭＨＣ対立遺伝子は、異なる民族および人種において異なる頻度で生じるので、標的ＭＨＣ対立遺伝子の選択は、標的集団に依存し得る。表１は、異なる人種間のＨＬＡ−Ａ座産物における種々の対立遺伝子の頻度を示す。例えば、白色人種集団の大多数は、４つのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子サブタイプ（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２．１、Ａ１、Ａ３．２、およびＡ２４．１）に結合するペプチドによってカバーされ得る。同様に、アジア人の集団の大多数は、５番目の対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ１１．２に結合するペプチドの付加で包囲される。

Ｂ．ＤｕＰｏｎｔ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＨＬＡ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ １９８７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ １９８９より編集した表。

^＊Ｎ＝黒色人種；Ａ＝アジア人；Ｃ＝白色人種。括弧内の数字は、分析した個体の数を示す。

ＨＬＡ−Ａ２．１モチーフ保有ペプチドと他のＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子特異性分子との交差反応結合が生じ得る。ＨＬＡ−Ａ２．１との結合特異性を共有するこれらの対立遺伝子特異的分子は、ＨＬＡ−Ａ２．１スーパータイプを含むとみなされる。Ａ２スーパータイプＨＬＡ分子のＢポケットは、残基（この命名は、１文字アミノ酸コードを使用し、下付文字は、ペプチド位置を示す）Ｆ／Ｙ_９、Ａ_２４、Ｍ_４５、Ｅ／Ｎ_６３、Ｋ／Ｎ_６６、Ｖ_６７、Ｈ／Ｑ_７０およびＹ／Ｃ_９９を含むコンセンサスモチーフによって特徴付けられる。同様に、このＡ２スーパータイプＦポケットは、残基Ｄ_７７、Ｔ_８０、Ｌ_８１およびＹ_１１６（１５５）を含むコンセンサスモチーフによって特徴付けられる。Ａ^＊０２０１に結合するペプチドの約６６％が、３以上のＡ２スーパータイプ対立遺伝子間で交差反応する。

本明細書中で規定されるＡ２スーパータイプは、生存細胞結合アッセイ（ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏ，Ｍ．−Ｆら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５，１９９５）からの交差反応データ（Ｆｒｕｃｉ，Ｄら，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１８７，１９９３）およびＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子特異的分子に結合する、天然にプロセスされるペプチドの配列決定によって得られるデータ（Ｓｕｄｏ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４７４９，１９９５）と一致する。従って、ＨＬＡ分子のファミリー（すなわち、これらのペプチドに結合するＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ）は、少なくとも９のＨＬＡ−Ａタンパク質：Ａ^＊０２０１、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０４、Ａ^＊０２０５、Ａ^＊０２０６、Ａ^＊０２０７、Ａ^＊６８０２、およびＡ^＊６９０１からなる。

本明細書中に記載されるように、このＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフは、２番目の位置に主要なアンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＱを、そしてエピトープのＣ末端位置に主要なアンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＴを有するペプチドリガンドを含む。ここで要求される本発明に最も特に関連するＨＬＡ−Ａ２モチーフは、２位にＶ、Ａ、ＴまたはＱを含み、そしてＣ末端アンカー位置にＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＴを含む。ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフを含むペプチドエピトープは、１より多いＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ分子を結合し得る。

本発明のペプチドを同定するのに使用され得る手順は、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０（１９９１）に開示され、本明細書中に参考文献として援用される。手短に言えば、ＭＨＣクラスＩ分子の大規模な単離を含む方法は、典型的には、適切な細胞または細胞株からの免疫沈降またはアフィニティークロマトグラフィーによる。所望のＭＨＣ分子を単離する他の方法の例は、当業者に同様に周知であり、これらとしては、イオン交換クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、サイズ排除、高速リガンドクロマトグラフィー、および上記の技術全ての組合せが挙げられる。

典型的な場合において、免疫沈降は、所望の対立遺伝子を単離するのに使用され得る。使用される抗体の特異性に基づいて、多くのプロトコルが使用され得る。例えば、対立遺伝子特異的ｍＡｂ試薬は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ分子の親和性精製に使用され得る。ＨＬＡ−Ａ分子を単離するためのいくつかのｍＡｂ試薬が入手可能である。モノクローナルＢＢ７．２は、ＨＬＡ−Ａ２分子の単離に適切である。標準的な技術を使用して、これらのｍＡｂで調製される親和性カラムは、各ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子産物の精製に首尾良く使用される。

対立遺伝子特異的ｍＡｂに加え、広範に反応性の抗ＨＬＡ−Ａ ｍＡｂ、抗ＨＬＡ−Ｂ ｍＡｂ、抗ＨＬＡ−Ｃ ｍＡｂ（例えば、Ｗ６／３２ Ｂ９．１２．１およびＢ１．２３．２）が、以下の実施例の節に記載されるように代替的な親和性精製プロトコルに使用され得る。

単離されるＭＨＣ分子の溝に結合するペプチドに結合されるペプチドは、典型的には、酸処理によって溶出される。ペプチドはまた、クラスＩ分子から、種々の標準的な変性手段（例えば、熱、ｐＨ、界面活性剤、塩、カオトロピズム試薬、またはこれらの組合せ）によって分離され得る。

ペプチド画分は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってＭＨＣ分子からさらに分離され、そして配列決定される。ペプチドは、当業者に周知の種々の他の標準的な手段（濾過、限外濾過、電気泳動、サイズクロマトグラフィー、特定の抗体を用いる沈降、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動など）によって分離され得る。

単離されるペプチドの配列決定は、Ｅｄｍａｎ分解（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１，３９９［１９８３］）のような標準的な技術に従って実施され得る。配列決定に適切な他の方法としては、前に記載したような個体ペプチドの質量分析配列決定（Ｈｕｎｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：１２６１（１９９２）（これは、本明細書中で参考文献として援用される））が挙げられる。異なるクラスＩ分子由来のバルク異種ペプチドのアミノ酸配列決定（例えば、プールされるＨＰＬＣ画分）は、典型的には、各クラスＩ対立遺伝子に対して特有の配列モチーフを明らかにする。

異なるクラスＩ対立遺伝子に特異的なモチーフ定義は、アミノ酸配列が公知である抗原タンパク質由来の潜在的なペプチドエピトープの同定を可能にする。典型的に、潜在的なペプチドエピトープの同定は、最初に、モチーフの存在に対する所望の抗原のアミノ酸配列をスキャンするためのコンピュータを使用して実行される。

モチーフ保有エピトープの同定の後、エピトープ配列が合成される。ＭＨＣクラス分子を結合する能力は、種々の異なる方法で測定される。ひとつの手段としては、以下に示す関連出願に記載されるようなクラスＩ分子結合アッセイがある。文献に記載される他の代替手段としては、抗原提示の阻害（Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３８９３（１９９１）、インビトロアッセンブリアッセイ（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｃｅｌｌ ６２：２８５）、およびＲＭＡ．Ｓ（Ｍｅｌｉｅｆら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２９６３（１９９１）のような変異された細胞を使用するＦＡＣＳベースのアッセイ）が挙げられる。

本明細書中に開示されるように、より高いＨＬＡ結合親和性は、より大きい免疫原性と関連する。より大きい免疫原性は、いくつかの異なる方法で明らかにされ得る。免疫原性は、免疫応答が全てにおいて誘発されるか否か、および任意の特定の応答の強さ、ならびに応答が誘発される多様な集団の限度に対応し得る。例えば、ペプチドは、集団の多様なアレイにおける免疫応答を誘発し得るが、強い応答を生じる実例はない。本明細書に開示される原理に従って、中間の親和性で結合する約５０％のペプチドとは対照的に、９０％に近い高度な結合ペプチドが、免疫原性であることが見出されている。さらに、より高度な結合親和性ペプチドは、より強い免疫原性応答を導く。結果的に、高い親和性の結合ペプチドが使用される場合、同様の生物学的効果を誘発するためにより少ないペプチドが必要とされる。従って、本発明の好ましい実施形態において、高い親和性結合エピトープが、特に有用である。それにもかかわらず、先行技術を超える実質的な改善は、中間体または高度な結合ペプチドを用いて達成された。

ＨＬＡクラスＩ分子に対する結合親和性と分散したペプチドエピトープの免疫原性との関係は、本発明者らによる技術で初めて決定される。これらの実験（ここで、分散したペプチドが参照される）において、インビボにおけるペプチドの細胞内プロセッシングは、より長いフラグメントが使用されたとしてもこのようなペプチドを導くことに留意のこと。従って、１以上のエピトープを含むより長いペプチドは、本発明の範囲内である。結合親和性と免疫原性との間の関係は、２つの異なる実験アプローチで分析される（Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：５５８６−５５９２，１９９４）。第１のアプローチにおいて、１０，０００倍の範囲にわたるＨＬＡ結合親和性における潜在的なエピトープの免疫原性範囲は、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１トランスジェニックマウスで分析される。第２のアプローチにおいて、約１００の異なるＢ型感染ウイルス（ＨＢＶ）を誘導する潜在的なエピトープの抗原性は、全てＡ^＊０２０１結合モチーフを保有し、急性肝炎患者由来のＰＢＬ（末梢血リンパ球）を使用することによって評価された。これらのアプローチに従って、約５００ｎＭ（好ましくは５０ｎＭ以下）の親和性閾値が、ＣＴＬ応答を誘発するペプチドエピトープの能力と関連することが決定された。これらのデータは、天然にプロセスされたペプチドおよび合成されたＴ細胞エピトープに対するクラスＩ結合親和性測定に対して当てはまる。これらのデータはまた、Ｔ細胞応答の形成における決定因子選択の重要な役割を示す（例えば、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４６４９−４６５３、１９８９を参照のこと）。

従って、ＣＴＬ誘導ペプチドは、好ましくは、５００ｎＭ以下のクラスＩ ＨＬＡ分子に対するＩＣ_５０を有するペプチドを含む。腫瘍に関連する抗原由来のモチーフ保有ペプチドエピトープの場合において、２００ｎＭの結合親和性閾値が、ＣＴＬ集団を得ることによる腫瘍細胞の死滅に関連して示される。

好ましい実施形態において、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子特異的分子に対する結合活性の評価に続いて、ペプチドが示す高い親和性または中間の親和性が、さらなる分析のために考慮される。選択されるペプチドは、スーパータイプファミリーの他のメンバーについて試験され得る。好ましい実施形態において、交差反応結合を示すペプチドは、次いで、ワクチン内または細胞内スクリーニングアッセイに使用される。

例えば、ＨＬＡ−Ａ２結合アッセイにおいて陽性を試験するペプチド（すなわち、５００ｎＭ以下の結合親和値を有するペプチド）は、インビトロで特定のＣＴＬ応答を誘導するペプチドの能力についてアッセイされる。例えば、ペプチドとともにインキュベートされる抗原提示細胞は、応答細胞集団においてＣＴＬ応答を誘導する能力についてアッセイされ得る。抗原提示細胞は、末梢血単核細胞または樹状細胞のような正常細胞であり得る（Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１８２（１９８７）；Ｂｏｏｇ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２１９［１９８８］）。

あるいは、内部でプロセスされるペプチドを有するクラスＩ分子を導く能力が欠失している変異哺乳動物細胞株（例えば、マウス細胞株ＲＭＡ−Ｓ（Ｋａｅｒｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３１９：６７５（１９８６）；Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２９６３−２９７０（１９９１））およびヒトＴ体細胞ハイブリッド、Ｔ−２（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３４５：４４９−４５２（１９９０）））およびヒトクラスＩ分子をコードする適切な遺伝子でトランスフェクトされる細胞株が、ペプチドが外因的にこれらに加えられる場合、１次のＣＴＬ応答をインビトロで誘導するペプチドの能力を試験するために、好都合に使用される。使用され得る他の真核生物細胞株としては、種々の昆虫細胞株（例えば、蚊の幼虫（ＡＴＣＣ細胞株ＣＣＬ １２５、１２６、１６６０、１５９１、６５８５、６５８６）、カイコ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８８５１）、アワヨトウの幼虫（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）、ガ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８０））、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞株（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞株（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．２７：３５３−３６５［１９２７］を参照のこと）が挙げられる。

末梢血リンパ球は、正常なドナーまたは患者の簡単な静脈穿刺または白血球搬出に続いて都合良く単離され、そしてＣＴＬ前駆体の応答細胞源として使用される。１つの実施形態において、適切な抗原提示細胞は、１０〜１００μＭのペプチドとともに血清を含まない培地において４時間、適切な培養条件でインキュベートされる。このペプチドをロードされた抗原提示細胞は、次いで、インビトロで７〜１０日間、最適な培養条件下で応答細胞集団とともにインキュベートされる。ポジティブなＣＴＬ活性化は、放射標識された標的細胞を殺すＣＴＬの存在について培養物をアッセイすることによって決定され得、特定のペプチドパルス標的物と、ペプチド配列由来の関連ウイルスまたは腫瘍抗原の内因的にプロセスされた形態を発現する標的細胞の両方を誘導した。

ＣＴＬの特異性およびＭＨＣ制限は、適切なヒトＭＨＣクラスＩまたは不適切なヒトＭＨＣクラスＩを発現する異なるペプチド標的細胞に対して試験することによって決定される。ＭＨＣ結合アッセイにおける陽性を試験し、特異的なＣＴＬ応答を生じるペプチドは、免疫原性ペプチドとして本明細書中で参照される。

Ｋａｓｔら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９０４−３９１２、１９９４）は対立遺伝子特異的ＨＬＡクラスＩ分子に結合するエピト−プの９０％を占めるモチーフ保有ペプチドを示す。この研究において、９アミノ酸長であり８つのアミノ酸によって重ね合わされるすべての可能性のあるペプチド（２４０ペプチド）（これは、ヒトパピローマウイルス１６型のＥ６タンパク質およびＥ７タンパク質の配列全体にわたる）は、異なる民族間において高い頻度で発現される５つの対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子への結合について評価された。この不偏性のペプチドのセットは、ＨＬＡクラスＩモチーフの予測値を評価し得る。２４０個のペプチドのセットから、高い親和性または中間の親和性を有する対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子に結合する２２個のペプチドが同定された。これらの２２個のペプチドのうち２０個（すなわち９１％）は、モチーフ保有であった。従って、この研究は、ワクチンに封入するためのペプチドエピトープの同定のためにモチーフの値を示した。モチーフベースの同定技術の適用は、潜在的なエピトープの９０％のスクリーニングを排除する。モチーフを使用しないことが不可能でなければ、利用可能なペプチドの質、およびスクリーニングプロセスの複雑性は、抗原の包括的な評価を極めて困難にする。

本発明の免疫原性ペプチドエピトープは、同じ抗原、同じ供給源由来の抗原、および／または異なる供給源由来の抗原のさらなるペプチドエピトープを含む、ポリエピトープワクチン組成物に含まれ得る。さらに、クラスＩＩエピトープは、クラスＩエピトープとともに含まれ得る。同じ抗原由来のペプチドエピトープは、配列中において連続する隣接エピトープであり得るかまたはタンパク質の異なる領域から得られ得る。

以下により詳細に記すように、この免疫原性ペプチドは、合成的に調製され得る（例えば、化学合成によって、または組換えＤＮＡ技術によって、またはウイルス全体もしくは腫瘍のような天然の供給源からの単離によって）。しかしながら、このペプチドは、好ましくは、他の天然に発生する宿主細胞タンパク質およびこのフラグメントを実質的に含まず、いくつかの実施形態において、このペプチドは、ネイティブのフラグメントまたは粒子に合成的に結合体化され得る。

このポリペプチドまたはペプチドは、多様な長さであり得、中性（電荷を帯びていない）形態かまたは塩形態のいずれか、および修飾（例えば、グリコシル化、側鎖酸化、もしくはリン酸化）なしかこれらの修飾を含むかのいずれか、であり得、この修飾が本明細書中に記載されるようなポリペプチドの生物学的活性を破壊しない条件に供される。

望ましくは、このペプチドは、大きいペプチドの全ての生物学的活性を実質的に維持しつつ、可能な限り小さい。可能な場合、本発明のペプチドエピトープを、内因的にプロセスされるウイルスペプチドもしくは腫瘍細胞ペプチド（これらは細胞表面においてＭＨＣクラスＩ分子に結合する）と釣り合ったサイズである、９または１０アミノ酸残基長に最適化するが望ましくあり得る。

望ましい活性を有するペプチドは、必要に応じて修飾され、特定の望ましい特性（例えば、改善された薬学的特性）を提供し得るが、その一方、所望のＭＨＣ分子に結合する未修飾ペプチドの全ての生物学的活性を実質的に増加させるか少なくとも保持し、適切なＴ細胞を活性化させる。例えば、このペプチドは、様々な変化（例えば、置換、保存か非保存のいずれか）に供され得、ここでこのような変化は、これらの使用において、特定の利点（例えば、改良されたＭＨＣ結合性）を提供し得る。保存的な置換とは、アミノ酸残基を別のものと置きかえることを意味し、これは、生物学的および／または化学的に類似している（例えば、ある疎水性残基が別のものに、またはある極性残基が別のものに）。この置換基としては、以下のような組合せが挙げられる：例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒ。単一のアミノ酸置換基の効果はまた、Ｄ−アミノ酸を使用してプローブされ得る。このような修飾物は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１−３４７（１９８６）、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ（編）（Ｎ．Ｙ，、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１−２８４頁（１９７９）；ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．、Ｐｉｅｒｃｅ）、第２版（１９８４）に記載されるような、周知のペプチド合成手段を使用して作製され得る。

このペプチドはまた、化合物のアミノ酸配列を伸長させるかまたは減少させることによって（例えば、アミノ酸の付加または欠失によって）修飾され得る。本発明のペプチドまたはアナログはまた、特定の残基の順番または組成を変化させることによって修飾され得、生物学的活性に対して必須である特定のアミノ酸残基（例えば、臨界（ｃｒｉｔｉｃａｌ）接触部位または保存された残基におけるもの）は、一般的には生物学的活性に対して有害な効果を有さずに変化されないことが容易に理解される。この非臨界アミノ酸は、Ｌ−α−アミノ酸のように、タンパク質中に天然に生じるアミノ酸に限定される必要はないが、β−γ−δ−アミノ酸のような非天然アミノ酸、ならびに天然アミノ酸のＤ−異性体のようなＬ−α−アミノ酸の多くの誘導体が含まれ得る。

典型的には、単一のアミノ酸置換基を有するペプチド系は、結合に対する電荷、疎水性などの効果を決定するのに使用される。例えば、一連の、正に帯電したアミノ酸置換基（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）または負に帯電したアミノ酸置換基（例えば、Ｇｌｕ）は、種々のＭＨＣ分子およびＴ細胞レセプターに対する感度の、異なるパターンを示すペプチドの長さに沿って作製される。さらにＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、または類似の残基のような小さく、比較的に中性の部分を使用して、複数の置換が実行され得る。この置換は、ホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーであるマルチエピトープペプチドを産生し得る。置換されるかまたは付与される残基の数および型は、本質的な接触点間に必要な空間、および見られる特定の機能特性（例えば、疎水性対親水性）に依存する。親ペプチドの親和性と比較して、ＭＨＣ分子レセプターまたはＴ細胞レセプターに対する結合親和性の増加はまた、このような置換によって達成され得る。いずれの事象においても、このような置換は、例えば、結合を破壊し得る立体障害および電荷障害を避けるために選択されるアミノ酸残基残基または他の分子フラグメントを使用する。

アミノ酸置換基は、典型的には単一の残基である。置換基、欠失物、挿入物またはこれらの任意の組合せが、最終的なペプチドに達するために組み合わされ得る。置換の改変体は、少なくとも１つのペプチド残基が取り除かれ、そして異なる残基がその場所に挿入されるものである。このような置換は、一般的には、ペプチドの特徴を最終的に変えることが望まれる場合、以下の表２に従ってなされる。

機能（例えば、ＭＨＣ分子またはＴ細胞レセプターに対する親和性）における実質的な変化は、表２における置換よりも保存性の低い置換を選択すること、すなわち、（ａ）置換の範囲におけるペプチド骨格の構造、例えば、シート構造もしくはヘリックス構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖の嵩高さの維持におけるそれらの効果においてより有意に異なる残基を選択することによって成される。一般に、ペプチド特性において最も大きな変化を生じると予想される置換は、（ａ）親水性残基（例えば、セリル）が、疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、もしくはアラニル）によって置換されるか；（ｂ）電気陽性側鎖を有する残基（たとえば、リジル、アルギニル、もしくはヒスチジル）が、電気陰性側鎖（例えば、グルタミルもしくはアスパルチル）によって置換されるか；または（ｃ）かさばった側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が、側鎖を有さない残基（例えば、グリシン）によって置換される置換である。

このペプチドはまた、免疫原性ペプチド中に２つ以上の残基のアイソスターを含み得る。本明細書中で定義されるようなアイソスターは、第１の配列の立体配座が、第２の配列に特異的な結合部位に適合するので、第２の配列と置換され得る、２つ以上の残基の配列である。この用語は、詳細には、当業者に周知のペプチド骨格修飾を含む。このような修飾としては、アミド窒素、α−炭素、アミドカルボニル、アミド結合の完全な置換、伸長、欠損もしくは骨格の架橋の修飾が挙げられる。一般に、Ｓｐａｔｏｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．ＶＩＩ（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編，１９８３）を参照のこと。

種々のアミノ酸模倣物または非天然アミノ酸を用いたペプチドの修飾は、特に、インビボでのペプチドの安定性の増加において有用である。安定性は、多数の方法においてアッセイされ得る。例えば、ペプチダーゼおよび種々の生物学的培地（例えば、ヒト血漿およびヒト血清）が、安定性を試験するために使用されている。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．１１：２９１〜３０２（１９８６）を参照のこと。本発明のペプチドの半減期は、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを用いて都合よく測定される。このプロトコルは、一般に以下のとおりである。プールされたヒト血清（ＡＢ型、非加熱不活性化）を、使用の前に遠心分離によって脱脂する。次いで、この血清を、ＲＰＭＩ組織培養培地を用いて２５％に希釈し、そしてペプチド安定性を試験するために使用する。所定時間の間隔で、少量の反応溶液を取り出し、そして６％トリクロロ酢酸水溶液またはエタノールのいずれかに添加する。混濁した反応サンプルを、１５分間冷却（４℃）し、次いでスピンして沈殿した血清タンパク質をペレット化する。次いで、ペプチドの存在を、安定性特異的クロマトグラフィー条件を用いて逆相ＨＰＬＣによって測定する。

本発明のペプチド、またはＣＴＬ刺激活性を有するそのアナログを修飾して、向上された血清の半減期以外の所望される特性を提供し得る。例えば、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力は、ヘルパーＴ細胞の応答を誘導し得る少なくとも１つのエピトープを含む配列への結合によって増強され得る。

いくつかの実施形態において、ヘルパーＴペプチドは、集団の大多数におけるヘルパーＴ細胞によって認識されるものである。これは、多くのＭＨＣクラスＩＩ分子、ほとんどのＭＨＣクラスＩＩ分子、または全てのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するアミノ酸配列を選択することによって成し遂げられ得る。これらは、「大まかにＭＨＣ制限された」ヘルパーＴ配列として公知である。大まかにＭＨＣ制限されたアミノ酸配列の例としては、抗原由来の配列（例えば、破傷風毒素の８３０〜８４３位（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の３７８〜３９８位（ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ）、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの１８ｋＤタンパク質の１〜１６位（ＹＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡ））が挙げられる。

あるいは、自然において見出されないアミノ酸配列を用いて、大まかにＭＨＣ制限された様式において、ヘルパーＴリンパ球を刺激し得る合成ペプチドを調製することが可能である。Ｐａｎ−ＤＲ−結合エピトープまたはＰＡＤＲＥ^ＴＭ分子（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と呼ばれるこれらの合成化合物は、ほとんどのＨＬＡ−ＤＲ（ヒトＭＨＣクラスＩＩ）分子に対するその結合活性に基づいて設計される（例えば、米国特許第５，７３６，１４２号を参照のこと）。

特に好ましい免疫原性ペプチド／ヘルパーＴ結合体は、スペーサー分子によって連結される。このスペーサーは、代表的に比較的小さい、中性の分子（例えば、アミノ酸またはアミノ酸模倣物）からなり、これらは、生理学的条件下で実質的に荷電していない。このスペーサーは、代表的に、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙまたは非極性アミノ酸または中性の極性アミノ酸の他の中性のスペーサーから選択される。必要に応じて存在するスペーサーは、同じ残基からなる必要がなく、従ってヘテロオリゴマー、もしくはホモオリゴマーであり得ることが理解される。存在する場合、このスペーサーは、通常少なくとも１個または２個の残基であり、より一般的には３〜６個の残基である。あるいは、ＣＴＬペプチドは、スペーサーなしでヘルパーＴペプチドに結合され得る。

この免疫原性ペプチドは、ＣＴＬペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端で直接か、またはスペーサーを介してのいずれかでヘルパーＴペプチドに結合され得る。免疫原性ペプチドまたはヘルパーＴペプチドのいずれかのアミノ末端が、アシル化され得る。例示的なヘルパーＴペプチドとしては、破傷風トキソイド８３０〜８４３、インフルエンザ３０７〜３１９、マラリアのスポロゾイト周囲３８２〜３９８および３７８〜３８９が挙げられる。

いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物中に、ＣＴＬをプライムする少なくとも１つの成分を含むことが所望され得る。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬをプライムし得る因子として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、Ｌｙｓ残基のαアミノ基およびεアミノ基に付着され得、次いで、例えば、１つ以上の連結残基（例えば、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなど）を介して、免疫原性ペプチドに連結され得る。次いで、脂質化ペプチドは、ミセル形態で直接注射され得るか、リポソームに組み込まれ得るか、またはアジュバント（例えば、フロイントの不完全アジュバント）において乳化され得る。好ましい実施形態において、特に有効な免疫原は、Ｌｙｓのαアミノ基およびεアミノ基に付着されたパルミチン酸を含み、これは連結（例えば、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）を介して、免疫原性ペプチドのアミノ末端に付着される。

ＣＴＬ応答の脂質プライムの別の例として、Ｅ．ｃｏｌｉリポタンパク質（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ_３ＣＳＳ）は、適切なペプチドに共有結合している場合、ウイルス特異的なＣＴＬをプライムするために使用され得る。Ｄｅｒｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：５６１〜５６４（１９８９）を参照のこと。例えば、本発明のペプチドは、Ｐ_３ＣＳＳと結合され得、そしてリポペプチドを、個体に投与して、標的抗原に対するＣＴＬ応答を特異的にプライムし得る。さらに、中和抗体の導入もまた、適切なエピトープを示すペプチドに結合体化したＰ_３ＣＳＳでプライムされ得るので、この２つの組成物を、結合して、感染に対する体液性応答および細胞媒介性応答の両方をより効果的に誘発し得る。

さらに、さらなるアミノ酸を、ペプチドの末端に付加して、互いにペプチドを結合し易くすること、キャリア支持体、もしくはより大きなペプチドに結合すること、ペプチドもしくはオリゴペプチドの物理学的特性もしくは化学的特性を修飾することなどを提供し得る。アミノ酸（例えば、チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸など）は、ペプチドもしくはオリゴペプチドのＣ末端もしくはＮ末端で導入され得る。いくつかの場合におけるＣ末端での修飾は、ペプチドの結合特性を変更し得る。さらに、ペプチド配列またはオリゴペプチド配列は、末端−ＮＨ_２のアシル化（例えば、アルカノイル（Ｃ_１〜Ｃ_２０）またはチオグリコリルアセチル化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニア、メチルアミンなど）によって修飾されることによって天然の配列から異なり得る。いくつかの例において、これらの修飾は、支持体もしくは他の分子に連結するための部位を提供し得る。

本発明のペプチドは、広く多様な方法において調製され得る。その比較的短いサイズのため、ペプチド（個別のエピトープまたはポリエピトープペプチド）は、従来技術に従って、溶液中もしくは固体支持体上で合成され得る。種々の自動合成機が、市販され、そして公知のプロトコルに従って使用され得る。例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（１９８４），前出を参照のこと。

あるいは、本発明のペプチドの調製は、組換えＤＮＡ技術の使用を含み得、ここで、目的の免疫原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が、発現ベクター中に挿入され、適切な宿主細胞に形質転換されるか、またはトランスフェクトされ、そして発現に適切な条件下で培養される。これらの手順は、本明細書中で参考として援用されるＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）に記載されるように、一般に、当該分野において公知である。従って、本発明の１つ以上のペプチド配列を含む融合タンパク質が、適切なＴ細胞エピトープを示すために使用され得る。

本明細書中で検討される長さのペプチドについてのコード配列が、化学技術（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１）のホスホトリエステル方法）によって合成され得る場合、修飾は、天然のペプチド配列をコードする配列について適切な塩基を置換することによって単純になされ得る。次いで、このコード配列に、適切なリンカーを提供し得、そして当該分野において一般に、利用可能な発現ベクター中にライゲーションし得、そしてベクターを使用して、適切な宿主を形質転換して、所望の融合タンパク質を生成し得る。多数のこのようなベクターおよび適切な宿主系が、現在利用可能である。融合タンパク質の発現のために、コード配列は、作動可能に連結された開始コドンおよび終止コドン、プロモーター領域およびターミネーター領域を有し、そして通常複製系を有して、所望の細胞宿主における発現のための発現ベクターを提供する。例えば、細菌宿主に適合するプロモーター配列は、所望のコード配列の挿入のための都合の良い制限部位を含むプラスミドに提供される。生じる発現ベクターは、適切な細菌宿主に形質転換される。当然、適切なベクター配列およびコントロール配列を用いて、酵母細胞宿主または哺乳動物細胞宿主もまた使用され得る。

本発明のペプチドおよびその薬学的組成物およびワクチン組成物は、感染症および癌の治療的処置および／または予防のために哺乳動物（特にヒト）への投与に有用である。本発明の免疫原性ペプチドを用いて処置され得る疾患の例としては、前立腺癌、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＡＩＤＳ、腎臓癌腫、頸部癌腫、リンパ腫、ＣＭＶ感染症および尖圭コンジローマ（ｃｏｎｄｌｙｌｏｍａ ａｃｕｍｉｎａｔｕｍ）が挙げられる。

薬学的組成物について、本発明の免疫原性ペプチドは、しばしば、すでに癌に羅患しているか、または目的のウイルスに感染された個体に投与される。感染症の潜伏期または急性期における個体は、免疫原性ペプチドを別個に用いて処置され得るか、または適切な他の処置と組み合わせて処置され得る。治療的適用において、組成物は、感染疾患因子または腫瘍の抗原への効果的なＣＴＬ応答を誘発および治療するのに十分な量、または少なくとも部分的に症状および／または合併症を抑止する量、患者に投与される。これを成し遂げるのに適切な量は、「治療的に有効な用量」または「単位用量」として定義される。この使用について有効な量は、例えば、ペプチド組成、投与の様式、処置される疾患の段階および重症度、患者の体重および健康の一般的な状態、ならびに指示する医師の判断に依存する。一般に、ヒトについての初回免疫（治療的投与または予防的投与のため）についての用量範囲は、７０ｋｇの患者について、約１．０μｇ〜約２０，０００μｇのペプチド、好ましくは１００μｇ−、１５０μｇ−、２００μｇ−、２５０μｇ−、３００μｇ−、４００μｇ−、または５００μｇ−２０，０００μｇであり、続いて患者の血液中の特異的ＣＴＬ活性を測定することによる患者の応答および状態に依存して、数週〜数ヶ月にわたるレジメンの追加免疫に従って同じ用量範囲の投薬量を追加免疫する。組換え核酸投与が使用される実施形態において、投与された物質を滴定して、適切な治療応答を成し遂げる。本発明のペプチドおよび組成物が、一般に深刻な疾患状態、すなわち生命にかかわる状況または潜在的に生命にかかわる状況において用いられ得ることが、留意されなければならない。このような場合に、本発明の組成物における外来性の物質の最小化の観点、および例えば、ペプチドの比較的無毒の性質の観点において、実質的に過剰のこれらの組成物を投与することは、可能であり、そして処置する医師によって所望され得る。

治療的使用について、投与は、感染症の初めの徴候の際、または腫瘍の検出もしくは外科的除去の際、または急性の感染症の場合において診断の直後に開始するべきである。これに続いて、少なくとも症状が実質的に寛解されるまで、およびその後の期間、用量を追加免疫する。慢性の感染症において、用量のローディングに続いて、用量の追加免疫が、必要とされ得る。

本発明の組成物を用いた感染した個体の処置は、急性的に感染した個体における感染症の回復を促進し得る。慢性の感染症の発生に感受性の（または素因化する）個体について、この組成物は、急性から慢性への感染症の進展を予防する方法において特に、有用である。感受性の個体が、例えば、本明細書中に記載されるように、感染の前または感染の間に同定される場合、この組成物はそれらを標的化し得、より大きな集団への投与の必要性を最小化する。

このペプチド組成物はまた、慢性の感染症を処置するために使用され得、そして免疫系を刺激して、例えば、キャリアにおけるウイルス感染細胞を除去する。細胞傷害性Ｔ細胞応答を効果的に刺激するのに十分な処方、および投与の様式において、ある量の免疫増強ペプチドを提供することが、重要である。従って、慢性の感染症の治療のために、免疫化用量に続く、確立された間隔（例えば、１〜４週間）での用量の追加免疫は、個体を効果的に免疫化する期間を延長するためにおそらく必要とされ得る。慢性の感染症の場合において、投与を、少なくとも臨床的症状または実験室検査が、感染が除去されたか、または実質的に抑止されたことを示すまで、およびその後の期間続けるべきである。

治療的処置のための薬学的組成物は、非経口投与、局所的投与、経口投与または局部投与について意図される。本発明のペプチドは、ペプチドをコードする核酸の形態で投与され得る。好ましくは、この薬学的組成物は、非経口的（例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内）に投与される。従って、本発明は、受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）中に溶解されるか、または懸濁される免疫原性ペプチドの溶液を含む、非経口投与のための組成物を提供する。種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝化された水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸など）が、使用され得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得るか、またはろ過滅菌され得る。生じる水溶液は、そのまま使用されるようにパッケージングされ得るか、または凍結乾燥され得、凍結乾燥された調製物は、投与の前に滅菌溶液と合せられる。この組成物は、近似の生理学的条件に必要とされる薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張性調整剤、湿潤剤など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、チオエタノールアミンオレアートなど）を含み得る。

薬学的処方物における本発明のＣＴＬ刺激ペプチドの濃度は、広く（すなわち、約０．１重量％未満から、通常は少なくとも約２重量％から２０重量％〜５０重量％以上と同じ程度）変化し得、そして選択された投与の特定の様式に従って、主として流体容量、粘性などによって選択される。ペプチド組成物のヒト単位用量形態は、代表的に、ヒト単位用量の受容可能なキャリア（好ましくは水性キャリア）を含む薬学的組成物に含まれ、そしてヒトに対するこのような組成物の投与について使用されると当業者によって公知の流体の容量で、投与される。

本発明のペプチドはまた、特定の組織（例えば、リンパ組織）に対してペプチドを標的化するリポソームを介して投与され得るか、または感染細胞に対して選択的に標的化され得、ならびにペプチド組成物の半減期を増加し得る。リポソームは、乳化物、泡沫体、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層などを含む。これらの調製物において、送達されるペプチドは、リポソームの一部として、単独あるいは例えば、リンパ系細胞間で優性なレセプターに結合する分子（例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体）または他の治療的組成物もしくは免疫原性組成物との組合せで組み込まれる。従って、本発明の所望のペプチドで充填または装飾のいずれかをされたリポソームは、リンパ系細胞の部位を対象にし得、ここでリポソームは、次いで、選択された治療的／免疫原性ペプチド組成物を送達する。本発明における使用のためのリポソームは、標準のビヒクル形成脂質から形成され、これは、一般に、中性および陰性に荷電したリン脂質およびステロール（例えば、コレステロール）を含む。脂質の選択は、一般に、例えば、血流におけるリポソームのサイズ、リポソームの酸不安定性および酸安定性の考察によって導かれる。種々の方法が、例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０），米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号および同第５，０１９，３６９号に記載されるように、リポソームを調製するために利用される。

免疫細胞を標的化するために、リポソームに組込まれるリガンドが、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定因子について特異的なその抗体またはフラグメントを含み得る。ペプチドを含むリポソーム懸濁物は、特に、投与の様式、送達されるペプチド、および処置される疾患の段階に従って変化する用量において、静脈内投与、局部投与、局所投与などをされ得る。

固体組成物について、従来の非毒性固体キャリアが使用され得、例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石粉、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。経口投与について、薬学的に受容可能な非毒性組成物が、任意の通常用いられる賦形剤（例えば、前記で列挙したキャリア）、および一般に１０〜９５％の活性成分、すなわち、本発明の１つ以上のペプチド、およびより好ましくは、２５〜７５％の濃度で組み込むことによって形成される。

エアロゾルの投与について、免疫原性ペプチドが、好ましくは、界面活性剤および噴霧剤とともに微細的に分割された形態で供給される。ペプチドの代表的なパーセンテージは、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１％〜１０％である。当然、この表面活性剤は、非毒性でなければならず、そして好ましくは噴霧剤に可溶性である。このような薬剤の代表は、６〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸（例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレイン酸、オレステリン酸およびオレイン酸）の脂肪族多価アルコールまたはその環式無水物とのエステルまたは部分エステルである。混合されたエステル（例えば、混合されたグリセリドまたは天然のグリセリド）が、用いられ得る。この界面活性剤は、組成物の０．１重量％〜２０重量％、好ましくは０．２５〜５％を構成し得る。組成物の残りは、通常噴霧剤である。キャリアもまた、所望される場合、例えば、鼻腔内送達のためにレクチンを用いるように含まれ得る。

従って、本発明の局面は、活性な成分として免疫原性的に有効な量の本明細書中に記載される免疫原性ペプチドを含むワクチンに関する。このペプチドはまた、レシピエントにおける発現において本発明のペプチドをコードする核酸の形態で投与され得る。このペプチドは、それ自体のキャリアと組み合わせて、または活性ペプチド単位のホモポリマーもしくはヘテロポリマーとして、ヒトを含む宿主に導入され得る。このようなポリマーは、増加した免疫学的反応の利点を有し、そして、異なるペプチドがポリマーを作製するために使用される場合、ウイルス細胞または腫瘍細胞の異なる抗原の決定因子と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導するさらなる能力の利点を有する。有用なキャリアが、当該分野において周知であり、そして例えば、サイログロブリン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸（例えば、ポリ（リジン：グルタミン酸））、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルス核タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス組換えワクチンなどが挙げられる。このワクチンはまた、生理学的に容認できる（受容可能な）希釈剤（例えば、水、リン酸緩衝化生理食塩水、または生理食塩水）を含み得、そしてさらに代表的にアジュバンドを含み得る。フロイントの不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、または明礬のような物質は、アジュバントとして当該分野において周知の物質である。そして、上記で示されるように、ＣＴＬ応答は、本発明のペプチドを脂質（例えば、Ｐ_３ＣＳＳ）に結合体化させることによってプライムされ得る。注射、エアロゾル、経口、経皮または他の経路を介する、本明細書中に記載されるようなペプチド組成物を用いる免疫化の際、宿主の免疫系は、所望される抗原に特異的な大量のＣＴＬを生成することによってワクチンに応答し、そしてこの宿主は少なくとも、後の感染に対する部分的な免疫となるか、または慢性の感染症の発生に抵抗する。

いくつかの例において、本発明のペプチドワクチンを目的のウイルス、特にウイルスのエンベロープ抗原に応答する中和抗体を誘導するワクチンと合わせることが、所望され得る。

治療または免疫化の目的のために、本発明のペプチドは、本発明の１つ以上のペプチドをコードする核酸の形態で投与され得る。この核酸は、本発明のペプチドおよび必要に応じて１つ以上のさらなる分子をコードし得る。多数の方法が、核酸を患者に送達するために一般に使用される。例えば、核酸は、「むきだし（ｎａｋｅｄ）のＤＮＡ」として直接送達され得る。このアプローチは、例えば、Ｗｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５〜１４６８（１９９０）および米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号に記載される。核酸はまた、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されるような弾道的送達を用いて投与され得る。ＤＮＡのみからなる粒子が、投与され得る。あるいは、ＤＮＡは、粒子（例えば金粒子）に接着され得る。

この核酸はまた、陽イオン性化合物（例えば、陽イオン性脂質）と複合体化して送達され得る。脂質媒介遺伝子の送達方法は、例えば、ＷＯ９６／１８３７２；ＷＯ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２〜６９１（１９８８）；Ｒｏｓｅの米国特許第５，２７９，８３３号；ＷＯ９１／０６３０９；およびＦｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３〜７４１４（１９８７）に記載される。

本発明のポリペプチドはまた、弱毒化されたウイルス宿主（例えば、ワクシニアまたは鶏痘）によって発現され得る。このアプローチは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしてのワクシニアウイルスの使用を含む。急性に感染された宿主もしくは慢性に感染された宿主、または感染されていない宿主への導入において、組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、そしてこれによって宿主のＣＴＬ応答を誘発する。免疫化プロトコルにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載される。別のベクターはＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）である。ＢＣＧベクターは、例えば、Ｓｔｏｖｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６〜４６０（１９９１））に記載される。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化に有用な広く多様な他のベクター（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉベクターなど）が、本明細書中の記載から当業者に明らかとなる。

本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段は、必要に応じて他の分子と共に、本発明の複数のエピトープをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。ヒト細胞中での発現のための、選択されたＣＴＬエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を作製するために、このエピトープのアミノ酸配列は、たとえば、逆翻訳される。ヒトコドン使用表は、各アミノ酸についてのコドン選択を案内するために使用される。これらのエピトープコードＤＮＡ配列は、直接的に隣接されており、連続するポリペプチド配列をコードする分子を作製する。必要に応じて、発現および／または免疫原性を最適化するために、さらなるエレメントがミニ遺伝子の設計に組み込まれ得る。逆翻訳され、そしてミニ遺伝子配列に含まれ得るアミノ酸配列の例としては、以下が挙げられる：ヘルパーＴ白血球エピトープ、リーダー（シグナル）配列、および小胞体保持シグナル。さらに、ＣＴＬエピトープのＭＨＣの提示は、ＣＴＬエピトープに隣接する合成的（例えば、ポリ−アラニン）または天然に存在する隣接領域配列を含むことによって、改善され得る。

ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子の＋鎖および−鎖をコードするオリゴヌクレオチドを構築することによって、ＤＮＡに変換される。重複するオリゴヌクレオチド（３０塩基長〜１００塩基長）は、周知の技術を使用して適切な条件下で、合成され、リン酸化され、精製され、そしてアニールされる。オリゴヌクレオチド末端は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結される。次いで、この合成ミニ遺伝子（ＣＴＬエピトープポリペプチドをコードする）は、所望の発現ベクターにクローニングされ得る。

当業者に周知の標準調節配列は、一般に、標的細胞中での発現を保証するために、ベクター中に含まれる。種々のベクターエレメントが必要とされる：ミニ遺伝子挿入のための下流クローニング部位を有するプロモーター；有効な転写終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉ由来の複製；およびＥ．ｃｏｌｉの選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性またはカナマイシン耐性）。多数のプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター）が、この目的のために使用され得る。他の適切なプロモーター配列について、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照のこと。

さらなるベクターの改変が、ミニ遺伝子発現および免疫原性の最適化のために所望され得る。時には、イントロンが効率的な遺伝子発現のために必要とされ、そして、１つ以上の合成イントロンまたは天然に存在するイントロンが、ミニ遺伝子の転写される領域に組み込まれ得る。ｍＲＮＡ安定化配列を含むこともまた、ミニ遺伝子の発現を増大させるために考慮され得る。免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）が、ＤＮＡワクチンの免疫原性において役割を担うことが、最近報告されている。これらの配列はまた、免疫原性を増強することが見出された場合、ベクター中のミニ遺伝子コード配列の外側に組み込まれ得る。

いくつかの実施形態において、バイシストロン性の発現ベクター（これは、ミニ遺伝子コード化エピトープ、および免疫原性を増大させるかまたは減少させるために含まれる第２のタンパク質の生成を可能にする）が使用され得る。免疫応答を有利に増強し得るタンパク質またはポリペプチドの例としては、同時発現される場合は、サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）または共刺激分子が挙げられる。さらに、ヘルパーＴ白血球（ＨＴＬ）エピトープが使用される場合、このＨＴＬエピトープは、細胞内標的化シグナルに連結され得、そして、ＣＴＬエピトープとは別に発現され得る。これは、ＣＴＬエピトープとは異なる細胞画分にＨＴＬエピトープを配向させる。これは、ＨＴＬエピトープのＭＨＣクラスＩＩ経路へのより効率的な流入を促進し得、その結果、ＣＴＬ誘導を促進し、そして、改善する。ＣＴＬ誘導とは対照的に、免疫抑制分子（例えば、ＴＧＦ−β）の共発現によって免疫応答を特異的に減少させることは、特定の疾患において有利であり得る。

いったん発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子はプロモーターの下流のポリリンカー領域にクローニングされる。このプラスミドは、適切なＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換され、そして、ＤＮＡは、標準的な技術を使用して調製される。ミニ遺伝子の配向およびＤＮＡ配列、ならびにベクター中に含まれる他の全てのエレメントは、制限酵素地図およびＤＮＡ配列分析を使用して確認される。正確なプラスミドを有する細菌細胞は、マスター細胞バンクおよびワーキング細胞バンクとして保存され得る。

プラスミドＤＮＡの治療量は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの発酵、続く精製によって生成される。ワーキング細胞バンクからのアリコートは、培養培地（例えば、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）に接種するために使用され、そして、周知の技術に従って、振盪フラスコまたはバイオリアクター中で飽和状態まで増殖させる。プラスミドＤＮＡは、標準的生物分離（ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）技術（例えば、Ｑｕｉａｇｅｎ製の固相陰イオン交換樹脂）を使用して、生成され得る。必要とされる場合、スーパーコイルのＤＮＡは、ゲル電気泳動または他の方法を使用して、開環状形態および直鎖状形態から単離され得る。

精製されたプラスミドＤＮＡは種々の処方物を使用して、注入のために調製され得る。この最も簡単なものは、滅菌リン酸緩衝液化生理食塩水（ＰＢＳ）中での、凍結乾燥されたＤＮＡの再構成である。種々の方法が記載されており、そして、新規な技術が利用可能になり得る。上記に記載したように、核酸は、カチオン性脂質と共に便利に処方される。さらに、保護相互作用的非凝縮物（ＰＩＮＣ）と集団的にいわれる糖脂質、融合誘導リポソーム、ペプチドおよび化合物はまた、可変物（例えば、安定性、筋肉内分散または特定の器官または細胞型への輸送）に影響するような精製されたプラスミドＤＮＡと複合体化し得る。

標的細胞感作はまた、ミニ遺伝子コード化ＣＴＬエピトープの発現およびＭＨＣクラスＩ提示のための機能的アッセイとして使用され得る。プラスミドＤＮＡは、標準的ＣＴＬクロム放出アッセイのための標的として適切な哺乳動物細胞株へ導入され得る。使用されるトランスフェクション法は、最終処方物に依存する。エレクトロポレーションは、「裸の」ＤＮＡのために使用され得る一方、カチオン性脂質は、直接のインビトロトランスフェクションを可能にする。緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドは、蛍光細胞分析装置（ＦＡＣＳ）を使用して、トランスフェクトされた細胞を濃縮させるために同時トランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、クロミウム５１で標識され、そして、エピトープ特異的ＣＴＬ系統についての標的細胞として使用される。５１ Ｃｒ放出により検出される細胞溶解は、ミニ遺伝子コード化ＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示の生成を示す。

インビボ免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ処方物の機能試験のための２番目のアプローチである。適切なヒトＭＨＣ分子を発現するトランスジェニックマウスは、ＤＮＡ産物を用いて免疫化され得る。投与の用量および経路は、処方物依存的である（例えば、ＰＢＳ中のＤＮＡについてのＩＭ、脂質複合体化ＤＮＡについてのＩＰ）。免疫化の２１日後に、脾細胞は回収され、そして、試験される各エピトープをコードするペプチドの存在下で、１週間再刺激される。これらのエフェクター細胞（ＣＴＬ）は、標準的技術を使用して、ペプチド負荷され、クロム５１標識された標的細胞の細胞溶解についてアッセイされる。ミニ遺伝子コード化エピトープに対応するペプチドのＭＨＣ負荷により感作された標的細胞の溶解は、インビボでのＣＴＬ誘導のためのＤＮＡワクチン機能を立証する。

適切なハプロタイプのトランスジェニック動物はさらに、ミニ遺伝子ＤＮＡのインビボでの免疫原性を最適化する際に、有用な手段を提供し得る。さらに、ヒトＭＨＣ分子によって認識されるＣＴＬエピトープに対して交叉反応を有する保存性ＨＬＡ分子を有する動物（例えば、サル）は、ＣＴＬエピトープのヒト免疫原性を決定するために使用され得る（Ｂｅｒｔｏｎｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４４４７〜４４５５（１９９８））。

このようなインビボ研究は、インビトロアッセイでは容易に評価できないワクチンの開発（例えば、投与経路、ワクチン処方、組織体内分布ならびに一次リンパ器官および二次リンパ器官の関与）にとって重要な変数を扱うために必要とさる。それらの単純性および可動性のために、ＨＬＡトランスジェニックマウスは、高等動物種（例えば、非ヒト霊長類）におけるより厄介で高価な研究と比較して、少なくとも初期のワクチン開発の研究にとっては魅力的な代替物である。

抗原性ペプチドは、同様に、エキソビボでＣＴＬを誘発するために使用され得る。得られたＣＴＬは、他の慣習的な形態の治療薬に対して応答しないか、または治療薬のペプチドワクチンアプローチに対して応答しない患者における慢性感染症（例えば、ウイルス性または細菌性）または腫瘍を処置するために使用され得る。特定の病原（病原菌または腫瘍抗原）に対するエキソビボのＣＴＬ応答は、組織培養物中で、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および適切な免疫原性ペプチドの供給源と一緒に患者のＣＴＬ前駆細胞（ＣＴＬｐ）をインキュベートすることで誘導される。適切なインキュベーション時間（典型的には１〜４週間）（このとき、ＣＴＬｐは活性化され、そして成熟し、そしてエフェクターＣＴＬに拡大する）後、細胞は患者に再度注入され、ここで、その細胞は、特定の標的細胞（感染された細胞または腫瘍細胞）を破壊する。

ペプチドはまた、診断試薬としての使用を見出し得る。例えば、本発明のペプチドは、このペプチドまたは関連するペプチドを使用する処置レジメンに対する特定の個人の感受性を決定するために使用され得、従って、現存の処置プロトコルの変更および罹患した個体の予後の決定において役立ち得る。

例えば、本発明のペプチドは、病原または免疫原への曝露後の抗原特異的ＣＴＬの存在について末梢血単球細胞を評価するための四量体染色アッセイにおいて使用され得る。ＨＬＡ四量体化複合体は、抗原特異的ＣＴＬを直接的に可視化するため（例えば、Ｏｇｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：２１０３〜２１０６、１９９８；およびＡｌｔｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １７４：９４〜９６、１９９６を参照のこと）、そして、末梢血単核球細胞のサンプル中の抗原特異的ＣＴＬ集団の頻度を決定するために使用される。本発明のペプチドを使用する四量体試薬は、以下のように生成される：対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子またはスーパータイプ分子に結合するペプチドは、対応するＨＬＡ重鎖およびβ_２ミクログロブリンの存在下でリフォールディングされて、３分子複合体を生成する。この複合体は、以前にタンパク質中に操作された部位の重鎖のカルボキシル末端でビオチン化される。次いで、四量体形成は、ストレプトアビジンの添加によって誘導される。蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて、四量体は、抗原特異的細胞を染色するために使用され得る。次いで、この細胞は、例えば、フローサイトメトリーを用いて同定され得る。このような分析は、診断的目的または予後の目的のために使用され得る。

さらに、このペプチドはまた、どの個体が慢性感染症を発症する実質的な危険性を有するかを予測するために使用され得る。

本出願は、以下に関する：米国特許出願番号第０８／５８９，１０８号（９６年１月２３日提出され、現在は取り下げられた）、および同第０８／２０５，７１３号（９４年３月４日に提出された）（これは、同第０８／１５９，１８４号（９３年１１月２９日に提出された）の一部継続であり、現在は取り下げられた（これは、同第０８／０７３，２０５（９３年６月４日に提出）の一部継続であり、現在は取り下げられた（これは、同第０８／０２７、１４６号（９３年３月５日に提出）の一部継続であり、現在は取り下げられた）））。この出願はまた、以下に関する：米国特許出願番号６０／０１３，９８０号（９６年３月２１日に提出され、現在は取り下げられた）、同第０８／４５４，０３３（９５年５月２６日提出）、同第０８／３４９，１７７号（９４年１２月２日提出）および同第０８／７５３，６２２号（９６年１月２７日提出、現在は取り下げられた。）。上記の出願の各々は、本明細書中に参考として援用される。

（実施例）
（実施例１：ペプチド）
利用するペプチドは、Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊら「Ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｃｈｏｒ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＨＬＡ−Ａ２．１ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｃｅｌｌ ７４：９２９〜９３７（１９９３）によって以前記載されたように合成するか、または、Ｃｈｉｒｏｎ Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から粗製物質として購入した。合成ペプチドを、典型的に、逆相ＨＰＬＣによって＞９５％の均一性まで精製した。合成ペプチドの純度を、分析用逆相ＨＰＬＣおよびアミノ酸分析、配列決定ならび／または質量分析を用いて決定した。凍結乾燥したペプチドを、１００％のＤＭＳＯ中に４〜２０ｍｇ／ｍｌで再懸濁し、次いで、ＰＢＳ＋０．０５％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０（Ｆｌｕｋａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中に必要濃度まで希釈した。

（実施例２．ＭＨＣ精製）
ＥＢＶ形質転換細胞株ＪＹ（Ａ^＊０２０１）、Ｍ７Ｂ（Ａ^＊０２０２）、ＦＵＮ（Ａ^＊０２０３）、ＤＡＨ（Ａ^＊０２０５）、ＣＬＡ（Ａ^＊０２０６）、ＫＮＥ（Ａ^＊０２０７）、ＡＰ（Ａ^＊０２０７）およびＡＭＡＩ（Ａ^＊６８０２）を、ＭＨＣ分子の一次供給源として使用した。単一のＭＨＣ対立遺伝子をトランスフェクトした７２１．２２１株もまた、Ａ^＊０２０２およびＡ^＊０２０７の供給源として使用した。細胞を、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、１００Ｕ（１００μｇ／ｍｌ）のペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ＧＩＢＣＯ）、および１０％の熱不活性化ＦＣＳ（Ｈａｚｅｌｔｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭｃＬｅａｎ，ＶＡ）中で培養することで、インビトロに維持した。ラージスケール培養物を、ローラービン（ｒｏｌｌｅｒ ｂｏｔｔｌｅ）中に維持した。ＨＬＡ分子を細胞溶解物から精製した（Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、「Ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ＭＨＣ／Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｇｅｌ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ」Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８．３．１−１８．３．１９（１９９８））。簡単に言うと、細胞を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ ８．５）（１％（ｖ／ｖ）のＮＰ−４０ １５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡおよび２ｍＭのＰＭＳＦを含む）中に１０^８細胞／ｍｌの濃度で溶解した。次いで、溶解物を、０．４５μＭの濾紙を通過させ、１０，０００×ｇでの２０分間の遠心分離によって核および細片を取り除き、そしてＭＨＣ分子を、モノクローナル抗体に基づく親和クロマトグラフィーによって精製した。

親和精製のために、不活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４ＢおよびＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのカラムを、プレカラム（ｐｒｅ−ｃｏｌｕｍｎ）として使用した。クラスＩ分子を、抗ＨＬＡ（Ａ，Ｂ，Ｃ）抗体Ｗ６／３２（Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、前述）と結合体化したＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを繰り返し通過させることで捕獲した。ＨＬＡ−Ａ分子をさらに、Ｂ１．２３．２カラムを通過させることで、ＨＬＡ−Ｂ分子およびＨＬＡ−Ｃ分子から精製した。２〜４回の通過後、Ｗ６／３２カラムを、１０カラム体積の１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ ８．０）（１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０を含む）、２カラム体積のＰＢＳおよび２カラム体積のＰＢＳ（０．４％（ｗ／ｖ）のｎ−オクチルグルコシドを含む）で洗浄した。クラスＩ分子を、０．４％（ｗ／ｖ）のｎ−オクチルグルコシドを含む０．１５ＭのＮａＣｌ溶液中の５０ｍＭジメチルアミン（ｐＨ １１．５）で溶出した。１／２６体積の２．０Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ６．８）を溶出液に添加し、ｐＨを約８．０まで下げた。次いで、この溶出液を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ３０コンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）中で２０００ｒｐｍで遠心分離することによって濃縮した。タンパク質純度、濃度および枯渇工程の有効性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＢＣＡアッセイによってモニタリングした。

（実施例３．ＭＨＣ−ペプチド結合アッセイ）
ペプチドの可溶性クラスＩ分子への結合を測定するための定量アッセイは、放射性標識化標準ペプチドの結合阻害に基づく。これらのアッセイを、以前記載されたように（Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、前述）実施した。簡単に言えば、１〜１０ｎＭの放射性標識したペプチドを、１μＭのヒトβ_２ミクログロブリン（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびプロテアーゼインヒビターの混合物の存在下で、１μＭ〜１ｎＭの精製したＭＨＣと共に、室温で同時インキュベート（ｃｏ−ｉｎｃｕｂａｔｅ）した。２日間のインキュベーション後、放射能に結合したＭＨＣのパーセントを、ＴＳＫ ２０００カラムを使用して、サイズ除外ゲル濾過クロマトグラフィーによって決定した。あるいは、放射能に結合したＭＨＣのパーセントを、Ｗ６／３２抗体コーティングプレート上のＭＨＣ／ペプチド複合体を捕獲することによって、そして、ＴｏｐＣｏｕｎｔミクロシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｅｐｉ ０６３−９９）を使用して結合ｃｐｍを決定することで、決定した。

Ａ^＊０２０１アッセイ、Ａ^＊０２０２アッセイ、Ａ^＊０２０３アッセイ、Ａ^＊０２０５アッセイ、Ａ^＊０２０６アッセイおよびＡ^＊０２０７アッセイのために利用する放射性標識した標準ペプチドは、ＨＢＶコア１８〜２７エピトープのＦ_６＞Ｙアナログ（配列ＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶ）であった。各分子についてのこのペプチドの平均ＩＣ_５０は、各々、５．０ｎＭ、４．３ｎＭ、１０ｎＭ、４．３ｎＭ、３．７ｎＭおよび２３ｎＭであった。ＨＢＶ ｐｏｌ ６４６のＣ_４＞Ａアナログ（配列ＦＴＱＡＧＹＰＡＬ）、またはＭＡＧＥ １ ２８２（配列ＹＶＩＫＶＳＡＲＶ）を、Ａ^＊６８０２アッセイのための標識として利用した。Ａ^＊６８０２についてのこれらのＩＣ_５０は、各々４０ｎＭおよび８ｎＭであった。

競合アッセイの場合において、放射性標識したペプチドの結合を５０％阻害するペプチド濃度を算出した。ペプチドを、最初に、１または２の高用量で試験した。次いで、ポジティブな阻害を生じるペプチドのＩＣ_５０を続く実験で決定し、ここで、２〜６の希釈液を試験した。利用する条件下（ここで、［標識］＜［ＭＨＣ］およびＩＣ_５０≧［ＭＨＣ］）で、測定したＩＣ_５０値は、Ｋｄの真価の適切な近似値であった。各競合ペプチドを、２〜４の独立した実験において試験した。ポジティブコントロールとして、放射標識したプローブの非標識バージョンもまた、各実験において試験した。

（実施例４：代替的結合アッセイ）
Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）形質転換ホモ接合細胞株、線維芽細胞、ＣＩＲまたは７２１．２２形質導入体を、ＨＬＡクラスＩ分子の供給源として使用した。これらの細胞を、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、５０μＭの２−ＭＥ、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１０％の熱不活性化ＦＣＳ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で培養することで、インビトロに維持した。細胞を、２２５ｃｍ^２の組織培養フラスコ、またはラージスケール培養については、ローラービン装置中で増殖させた。細胞を、２５９ローターを備えるＩＥＣ−ＣＲＵ５０００遠心機を使用して、１５００ＲＰＭで遠心分離することで回収し、そして、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（０．０１ＭのＰＯ_４、０．１５４ＭのＮａＣｌ、ｐＨ ７．２）で３回洗浄した。

細胞をペレット化し、そして、−７０℃で保存するか、または洗浄溶解物を調製するために、洗浄溶解溶液で処置した。細胞溶解物を、ストック洗浄溶液［１％のＮＰ−４０（Ｓｉｇｍａ）またはＲｅｎｅｘ ３０（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ １１５９０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ８．０）］を細胞ペレット（以前に計測した）に、１ｍｌの洗浄溶液あたり５０×１０^６〜１００×１０^６細胞の比率で添加することで調製した。プロテアーゼインヒビターのカクテルを、細胞ペレットへの添加の直前に、予備測定した体積のストック洗浄溶液に添加した。プロテアーゼインヒビターカクテルの添加により、以下の最終濃度を生成した：フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、２ｍＭ；アプロチニン、５μｇ／ｍｌ；ロイペプチン、１０μｇ／ｍｌ；ペプスタチン、１０μｇ／ｍｌ；ヨードアセトアミド、１００μＭ；およびＥＤＴＡ、３ｎｇ／ｍｌ。細胞溶解物を、断続的に混合しながら、４℃で１時間進行させた。規定通りに、５×１０^９〜１０×１０^９の細胞を、５０ｍｌ〜１００ｍｌの洗浄溶液中で溶解した。溶解物を、１５，０００×ｇで、４℃で３０分間の遠心分離し、続いて上清画分を０．２μフィルター単位（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通過させることで、洗浄した。

ＨＬＡ−Ａ抗原の精製を、ｍＡｂ結合体化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを用いて調製した親和カラムを使用して達成した。抗体生成のために、細胞を、巨大組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ２５１６０−２２５）において、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で増殖させた。抗体を、硫酸アンモニウム細分化、続くプロテイン−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ）の親和クロマトグラフィーによって、洗浄した組織培養培地から精製した。簡単に言うと、飽和硫酸アンモニウムを、免疫グロブリンを沈殿化させるために、４℃で一晩、ゆっくり攪拌しながら４５％（体積／体積）となるまで組織培養上清に添加した。沈殿化したタンパク質を、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離することで回収した。次いで、この沈殿物を最小体積のＰＢＳに溶解し、そして、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｏ／Ｐｏｒ ２，Ｍｏｌ，ｗｔ．ｃｕｔｏｆｆ １２，０００−１４，０００，Ｓｐｅｃｔｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄ．）に移した。透析を、４℃で２４時間〜４８時間にわたり、透析緩衝液を４〜６回変えながら、ＰＢＳ（タンパク質溶液体積の≧２０倍）に対して行なった。透析したタンパク質溶液を、遠心分離（１０，０００×ｇ、３０分間）で洗浄し、そして、溶液のｐＨを、１ＮのＮａＯＨを用いてｐＨ ８．０に調整した。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を、製造者の説明書に従って水和し、そして、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを調製した。１０ｍｌのベッド体積（ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）のカラムは、典型的に、５０ｍｇ〜１００ｍｇのマウスＩｇＧに結合する。

タンパク質サンプルを、多量の充填体積に関しては蠕動ポンプを使用して、または少量の体積（＜１００ｍｌ）に関しては重力で、プロテイン−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに充填した。このカラムを、ＰＢＳで数回洗浄し、そして、溶出液を、ベースラインに達するまで、分光光度計においてＡ２８０でモニタリングした。結合した抗体を、適切なｐＨ（１ＮのＮａＯＨで適切なｐＨに調整した）で０．１Ｍのクエン酸を使用して溶出した。マウスＩｇＧ−１について、ｐＨ ６．５を使用し、ＩｇＧ２ａについて、ｐＨ ４．５を使用し、そして、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３について、ｐＨ ３．０を使用した。２ＭのＴｒｉｓ塩基を使用し、溶出液を中性化した。抗体を含む画分（Ａ２８０でモニタリングした）をプールし、ＰＢＳに対して透析し、さらに、Ａｍｉｃｏｎ Ｓｔｉｒｒｅｄ Ｃｅｌｌシステム（ＹＭ３０膜を有するＡｍｉｃｏｎ Ｍｏｄｅｌ ８０５０）を使用して濃縮した。抗Ａ２ ｍＡｂ、ＢＢ７．２は、親和精製のために有用であった。

ＨＬＡ−Ａ抗原を、ｍＡｂ結合体化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを用いて調製した親和カラムを使用して、精製した。この親和カラムを、上記のような親和精製ｍＡｂとプロテイン−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ｓｉｇｍａ）をインキュベートすることで調製した。１ｍｌのビーズあたり５ｍｇ〜１０ｍｇのｍＡｂが好ましい比率である。ｍＡｂ結合ビーズを、ホウ酸塩緩衝液（ホウ酸緩衝液：１００ｍＭの四ホウ酸ナトリウム、１５４ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ ８．２））で、洗浄液がベースラインでＡ２８０を示すまで洗浄した。２００ｍＭのトリエタノールアミン中のジメチルピメリミデート（２０ｍＭ）を添加して、結合したｍＡｂをプロテイン−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅへ共有結合的に架橋させた（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１０７６６（１９８２））。ローテータ上で、室温で４５分間のインキュベーション後、過剰の架橋剤を、１０ｍｌ〜２０ｍｌの２０ｍＭエタノールアミン（ｐＨ ８．２）で２回ビーズを洗浄することで除去した。各洗浄工程の間に、懸濁液を室温で５分間、ローテータ上に配置した。ビーズを、ホウ酸塩緩衝液およびＰＢＳ＋０．０２％のアジ化ナトリウムを用いて洗浄した。

次いで、細胞溶解物（５〜１０×１０^９細胞当量）を、５〜１０ｍｌの親和カラムにゆっくり通過させ（１分あたり０．１〜０．２５ｍｌの流速）、固定化した抗体に抗原を結合させた。溶解物をカラムに通過させた後、このカラムを、２０カラム体積の洗浄ストック溶液＋０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、２０カラム体積の０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ８．０）および１０カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ８．０）で連続的に洗浄した。ｍＡｂに結合したＨＬＡ−Ａ抗原を、塩基性緩衝溶液（水中の５０ｍＭのジメチルアミン）で溶出した。代替物として、酸性溶液（例えば、０．１５〜０．２５Ｍの酢酸）をまた使用して、結合した抗原を溶出した。溶出液のアリコート（１／５０）を、比色アッセイ（ＢＣＡアッセイ、Ｐｉｅｒｃｅ）、もしくはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または両方のいずれかを使用するタンパク質定量のために除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、タンパク質標準として既知量のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を使用して、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０（１９７０））が記載したように実施した。対立遺伝子特異的抗体を使用して、特異的ＭＨＣ分子を精製した。ＨＬＡ−Ａ２の場合においては、ｍＡｂ ＢＢ７．２を使用した。

ペプチドのクラスＩ ＨＬＡ分子への結合を測定するために利用したプロトコルの詳細な説明は、出版されている（Ｓｅｔｔｅら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３，１９９４；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１８．３節、１９９８）。簡単に言えば、精製したＭＨＣ分子（５ｎＭ〜５００ｎＭ）を、プロテアーゼインヒビターカクテルの存在下で、ＰＢＳ（０．０５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ４０）（または、Ｈ−２ ＩＡアッセイについては、２０％ ｗ／ｖジギトニン）を含む）中、種々の非標識ペプチドインヒビター、および１〜１０ｎＭの^１２５Ｉ−放射性標識プローブペプチドと、４８時間インキュベートした。プロテアーゼインヒビター（各々、ＣａｌＢｉｏＣｈｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ製）の最終濃度は、１ｍＭのＰＭＳＦ、１．３ｎＭの１．１０フェナントロリン、７３μＭのペプスタチンＡ、８ｍＭのＥＤＴＡ、６ｍＭのＮ−エチルマレイミドおよび２００μＭのＮ α−ｐ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）であった。全てのアッセイを、ｐＨ ７．０で実施した。

インキュベーションに続いて、ＭＨＣ−ペプチド複合体を、７．８ｍｍ×１５ｃｍ ＴＳＫ２００カラム（ＴｏｓｏＨａａｓ １６２１５，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）のゲル濾過によって遊離ペプチドから分離し、０．５％のＮＰ４０および０．１％のＮａＮ_３を含むＰＢＳ（ｐＨ ６．５）を用いて、１．２ ｍｌ／分で溶出した。ＴＳＫカラムからの溶出液を、Ｂｅｃｋｍａｎ １７０放射性同位体検出器を通過させ、そして、放射能をプロットし、そして、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ３３９６Ａ積分器を使用して積分し、そして、ペプチド結合画分を決定した。

放射性標識したペプチドを、クロラミン−Ｔ−法を使用してヨウ素化した。特異的放射性標識プローブペプチドを、各アッセイで使用した。典型的に、予備実験において、各ＭＨＣ調製物を、固定量の放射性標識ペプチドの存在下で滴定し、全放射能の１０〜２０％に結合するのに必要なＨＬＡ分子の濃度を決定した。続く全ての阻害アッセイおよび直接結合アッセイを、これらのＨＬＡ濃度を使用して実施した。

［標識］＜［ＨＬＡ］およびＩＣ_５０≧［ＨＬＡ］の条件下なので、測定したＩＣ_５０値は、Ｋ_Ｄの真値の適切な近似値であった。ペプチドインヒビターを、典型的に、１２０μｇ／ｍｌ〜１．２ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で試験し、そして、２〜４の完全に独立した実験において試験した。異なる実験から得たデータを比較するために、相対的な結合数量を、阻害のためのポジティブコントロール（すなわち、各結合アッセイ中に含まれる参照ペプチド）のＩＣ_５０を各試験ペプチド（典型的に、放射性標識プローブペプチドの非標識バージョン）についてのＩＣ_５０で割ることによって、各ペプチドに対して算出した。データベースの目的および実験間の比較のために、相対結合値を編集した。これらの値を、続いて、参照ペプチドの標準ヒストリカルＩＣ_５０を目的のペプチドの相対的結合で割ることによって、正規化されたＩＣ_５０ｎＭ値へ変換し得る。このデータ編集の方法は、最も正確であること、そして、異なる日付に、または異なるロットの精製ＭＨＣを用いて試験したペプチドの比較について一貫性があることを証明した。例えば、本明細書中に記載したＨＬＡ−Ａ２．１結合アッセイのための標準参照ペプチド（またはポジティブコントロール）は、ＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶの配列を有するペプチドであって、このペプチドは、複数の繰り返される結合アッセイにおいて、５ｎＭの平均ヒストリカルＩＣ_５０値を有する。この標準値を使用して、本明細書中に記載したように、ＨＬＡ−Ａ２．１結合についての報告されたＩＣ_５０値を正規化する。従って、試験ＨＬＡ−Ａ２．１モチーフを有するペプチドの相対的結合値を、標準参照ＩＣ_５０値（すなわち５ｎＭ）を試験ＨＬＡ−Ａ２．１モチーフを有するペプチドの相対的結合値で割ることによって、正規化したＩＣ_５０に変換し得る。

（実施例５：配列および結合の分析）
実施例３に記載されるアッセイを使用して、阻害に対するポジティブなコントロールのＩＣ_５０をそれぞれ試験したペプチドに対するＩＣ_５０で割ることによって、相対結合値を、それぞれのペプチドについて計算した。これらの値は、続いて、阻害に対するポジティブなコントロールのＩＣ_５０ｎＭを目的のペプチドの相対結合値で割ることによって、ＩＣ_５０ｎＭ値に逆算され得る。データ編集のこの方法は、異なる日にかまたは異なるロットの精製されたＭＨＣで試験されたペプチドを比較して、正確であり、かつ矛盾しないことが証明されている。規格化された相対結合値はまた、特定の特徴を有する全てのペプチドについて、幾何学的平均、または平均相対結合値（ＡＲＢ）の計算を可能にする（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ら、「Ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｃｈｏｒ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＨＬＡ−Ａ２．１ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７（１９９３）；Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、「Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＨＬＡ−Ａ３−Ｌｉｋｅ Ｓｕｐｅｒｍｏｔｉｆ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｔｈｅ Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｏｆ Ｃｏｍｍｏｎ ＨＬＡ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３（１９９６）；Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、「Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＨＬＡ−Ｂ７−Ｌｉｋｅ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０（１９９６）；Ｋｏｎｄｏ，Ａ．ら、「Ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｃｈｏｒ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＨＬＡ−Ａ２４ Ｈｕｍａｎ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７−４３１２（１９９５）；Ｋｏｎｄｏ，Ａ．ら、「Ｔｗｏ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＨＬＡ−Ａ^＊０１０１−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｕｂｍｏｔｉｆｓ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｄｅｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５：２４９−２５８（１９９７）；Ｇｕｌｕｋｏｔａ，Ｋ．ら、「Ｔｗｏ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｎｃｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７：１２５８−１２６７（１９９７）；Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ，Ｓ．ら、「Ｓｅｖｅｒａｌ Ｃｏｍｍｏｎ ＨＬＡ−ＤＲ Ｔｙｐｅｓ Ｓｈａｒｅ Ｌａｒｇｅｌｙ Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：３３６３−３３７３（１９９８））。

ＡＲＢに基づくＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ（ｓｕｐｅｒｔｙｐｅ）分子に対して結合するペプチドに影響する二次相互作用のマップを、既に記載されるように導いた（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ら、「Ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｃｈｏｒ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＨＬＡ−Ａ２．１ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７（１９９３）；Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、「Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＨＬＡ−Ａ３−Ｌｉｋｅ Ｓｕｐｅｒｍｏｔｉｆ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｔｈｅ Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｏｆ Ｃｏｍｍｏｎ ＨＬＡ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３（１９９６）；Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、「Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＨＬＡ−Ｂ７−Ｌｉｋｅ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０（１９９６）；Ｋｏｎｄｏ，Ａ．ら、「Ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｃｈｏｒ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＨＬＡ−Ａ２４ Ｈｕｍａｎ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７−４３１２（１９９５）；Ｋｏｎｄｏ，Ａ．ら、「Ｔｗｏ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＨＬＡ−Ａ^＊０１０１−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｕｂｍｏｔｉｆｓ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｄｅｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５：２４９−２５８（１９９７）；Ｇｕｌｕｋｏｔａ，Ｋ．ら、「Ｔｗｏ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７：１２５８−１２６７（１９９７））。本質的に、与えられた大きさ（８個、９個、１０個または１１個のアミノ酸）および少なくとも１つの許容される主要なアンカー残基を有する全てのペプチドを、分析のために選択した。それぞれの大きさの群におけるペプチドの結合能力は、特定の位置に特定のアミノ酸残基を含有するペプチドについてのＡＲＢ値を決定することにより分析した。主要なアンカー位置での特異性の決定について、ＡＲＢ値を、最高の結合に関連する残基を保有するペプチドのＡＲＢと比較して規格化した。第２アンカー決定について、ＡＲＢ値を、考えられる全てのペプチドセットのＡＲＢに比較して規格化した。すなわち、例えば、ＡＲＢ値を、１番目の位置にＡ、または位置７にＦなどを含有する全ての９マーペプチドについて決定した。いくつかの分析のために、特定のアミノ酸のまれな出現について、残基を、既に記載されるような個々の化学的類似性に従って分類した（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ら、前出；Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、前出；Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、前出；Ｋｏｎｄｏ，Ａ．ら、前出；Ｋｏｎｄｏ，Ａ．ら、前出；Ｇｕｌｕｋｏｔａ，Ｋ．ら、前出；Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ，Ｓ．ら、前出）。

（ＨＬＡ−Ａ２−スーパータイプ分子の頻度）
主要な人種集団において最も頻繁な対立遺伝子の形態を代表するＡ２−スーパータイプ分子のパネルを選択するために、Ｄ．ＭａｎｎおよびＭ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖｉｎａが提供する非公開の人口分類データを利用した。これらのデータは、公開されたデータと一致し（Ｓｕｄｏ，Ｔ．ら、「ＤＮＡ Ｔｙｐｉｎｇ ｆｏｒ ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ａｌｌｅｌｅｓ：Ｉ．Ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ＨＬＡ−Ａ２ ａｎｄ ｏｆ −Ａ２８」，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１６３−１７３（１９９２）；Ｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｍ．ら、「Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ＨＬＡ−Ａ２ ａｌｌｅｌｅｓ ｉｎ Ｆｉｖｅ ＵＳ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐｓ」，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１：３３４−３４０（２０００）；Ｋｒａｕｓａ，Ｐ．ら、「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｗｉｔｈｉｎ ＨＬＡ−Ａ^＊０２：Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ａｌｌｅｌｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｒｅｖｅａｌｅｄ ｉｎ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ」，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４５：２３３−２３１（１９９５）およびＩｍａｎｉｓｈｉ，Ｔ．ら、「Ａｌｌｅｌｅ ａｎｄ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｆｏｒ ＨＬＡ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｌｏｃｉ ｉｎ Ｖａｒｉｏｕｓ Ｅｔｈｎｉｃ Ｇｒｏｕｐｓ」Ｔｓｕｊｉ，Ｋ．ら、（編）；ＨＬＡ １９９１，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｌｅｖｅｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｉｓｔｏ−Ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．１０６５−１２２０（１９９２））、そして表３に示される。考えられる４つの主要な人種集団について、７つのＨＬＡ対立遺伝子が、Ａ２スーパータイプ対立遺伝子の圧倒的多数を代表することが明らかであった。この集団に含まれるのは、Ａ^＊０２０１、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０５、Ａ^＊０２０６、Ａ^＊０２０７、およびＡ^＊６８０２である。これらの対立遺伝子のそれぞれは、全体的な人口の２％以上存在し、そしてまた少なくとも１つの主要な人種において５％より多い頻度で生じる。他の対立遺伝子は、いずれか１つの主要な人種集団において、１．３％以下の少数の頻度でのみ示される。さらに、少数の対立遺伝子は、全体的な人口において１％を越える頻度で示されない。これらの知見に基づいて、Ａ^＊０２０１、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０５、Ａ^＊０２０６、Ａ^＊０２０７、およびＡ^＊６８０２を、Ａ２−スーパータイプにおける、ペプチド結合特異性および交差反応性を規定する研究のために選択した。

（Ａ２スーパータイプ分子の主要なアンカー位置）
以前の研究は、Ａ２−スーパータイプとして命名されるクラスＩ分子のセットについて、大きく重複するペプチド結合特異性を示した。ここで、Ａ２−スーパータイプ分子の主要なペプチド結合特異性を、さらに詳細に試験した。これらの結果のいくつかは、既に公開され、そして参考の目的でのみここに示される（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ら、前出およびＳｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、「Ｔｈｅ ＨＬＡ−Ａ^＊０２０７ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ ａ Ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａ^＊０２０１ Ｒｅｐｅｔｏｉｒｅ」，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５８：１２−２０（１９９７））。

最初の一連の研究において、非保存的リジン（Ｋ）の置換を、複数のＡ２−スーパータイプ分子に結合することが既に記載された、２つのペプチドの全ての位置に導入した：１）ＨＣＶ ＮＳ３ ５９０ ９マーペプチド（配列ＹＬＶＡＹＱＡＴＶ）、および２）ＨＢＶコア１８Ｆ_６＞Ｙ １０マーアナログペプチド（配列ＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶ）。これらのペプチドを、Ａ^＊０２０１、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０５、Ａ^＊０２０６、Ａ^＊０２０７およびＡ^＊６８０２に結合するそれらの能力について試験した。表４ａおよび表４ｂにおいて、結合能力を、親ペプチドに対する相対的な比率として示す。結合能力が、最高の結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）の１０倍以内であるペプチドが、好ましいと考えられ；相対結合能力が、最高の結合剤よりも１０〜１００倍未満であるペプチドが、許容されると考えられる。ダッシュ「−」は、０．０１未満の相対結合を示す。ＨＣＶ ＮＳ３５９０ペプチド（表４ａ）の場合において、２番目の位置およびＣ末端のＫ置換は、それぞれのＨＬＡ分子に対する結合において、１００倍より大きい減少を生じた。結合において１００倍よりも大きい減少はまた、Ｋが１番目の位置および５番目の位置で置換された場合、Ａ^＊６８０２の場合においても観察された。置換がいくつかの他の位置（特に、３番目の位置および７番目の位置）でなされた場合、１０〜１００倍の範囲の結合能力の減少を観察した。１０マーＨＢＶコア１８Ｆ_６＞Ｙリガンド（表４ｂ）を調べた場合、結合能力における１００倍を越える減少をまた、このペプチドが２番目の位置およびＣ末端で置換されたときに観察した。結合における有意な減少をまた、以下の７番目の位置での置換で観察した。

同時に、これらのデータは、Ａ２−スーパータイプ分子が、位置２およびＣ末端におけるアンカー残基を介して、９マーペプチドリガンドおよび１０マーペプチドリガンドの両方に結合することを示す。ペプチドの中間に関するさらなる第１アンカーまたは第２アンカーの存在は、９マーペプチドおよび１０マーペプチドの両方の結合が、通常、７番目の位置での置換により減少される事実により、実証される。

（２番目の位置およびＣ末端のアンカー残基の特異性）
これらの結果に基づいて、２番目の位置およびＣ末端でのＡ２−スーパータイプ分子のリガンド特異性を、さらなるＨＣＶ ＮＳ３ ５９０およびＨＢＶコア１８Ｆ_６＞Ｙの単一置換アナログ、ならびにまたポリ−アラニンペプチド（ペプチド９５３．０１；配列ＡＬＡＫＡＡＡＡＶ）の単一置換アナログを使用して分析した。これらの分析について、アンカー残基について好ましいアミノ酸を、最適な残基の１０倍以内の結合能力に関連するアミノ酸として規定した。相対結合能力が、０．０１〜０．１の間であるアミノ酸を、許容されるとして規定し、そして０．０１未満の結合能力に関連するアミノ酸を、許容されないとして判断した。添付の表において、ダッシュ「−」は、０．０１未満の相対結合を示す。結合能力を、それぞれの個々の分子について最高の結合親和性を有する関連アナログに対する相対的な比率として表現する。

２番目の位置において、小さな脂肪族残基および疎水性残基は、一般的に許容されることを見出したが、他の残基（大きな極性残基、芳香族残基、および荷電した残基を含む）は、典型的に、十分に許容されなかった（表５ａ、表５ｂ、および表５ｃ）。Ｌ、Ｉ、Ｖ、およびＭは、ほとんどの場合（＞８０％）においてアンカー残基として好まれた（表５ｄ）。表５ｄにおける対立遺伝子／ペプチドの組合わせは、所定の残基が、１〜０．１の範囲（好まれる）または０．１〜０．０１の範囲（許容される）の相対結合に関連された事例の数について言及する。Ａ、Ｔ、Ｑ、およびＳは、アンカー残基としてそれほど頻繁に好まれないが、試験された状況の＞８０％において、好ましいかまたは許容されるかのいずれかであった。試験された他のアミノ酸は、いずれの状況においても好ましくなく、そして単にまれに許容されるのみではなかった。

Ｃ末端において、Ｖは、Ａ^＊０２０１、Ａ^＊０２０６、およびＡ^＊６８０２について全ての３つの親ペプチドの場合において、そしてＡ^＊０２０３およびＡ^＊０２０５についての３つの場合のうちの２つにおいて、最適な残基であることが見出された（表６ａ、表６ｂ、および表６ｃ）。全体的に、ＶまたはＬのいずれかは、試験されたペプチドに関係なく、それぞれの分子について最適なＣ末端残基であった。表６ｄにおける対立遺伝子／ペプチドの組合わせは、所定の残基が、１〜０．１の範囲（好ましい）または０．１〜０．０１の範囲（許容される）の相対結合に関連された事例の数について言及する。脂肪族アミノ酸／疎水性アミノ酸Ｖ、Ｌ、およびＩは、ＭＨＣ−ペプチドの場合の６６．７％を越えるアンカー残基として好ましい。Ｍ、Ａ、およびＴは、その際に約５０％許容された。試験した他の残基は、少しも許容されないか、またはまれに許容されるのみかのいずれかであった。

（Ａ Ａ^＊０２０１のペプチド結合特異性の再評価）
Ａ^＊０２０１結合の優れた特異性を、８残基長および１１残基長の間の４０００個を越えるペプチドのデータベースを使用してより詳細に研究した。２番目の位置にＬまたはＭを保有する３０％を越えるペプチドが、５００ｎＭ以上の親和性でＡ^＊０２０１に結合することが見出された（図１ａ）。脂肪族残基Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｔ、およびＱを保有する５％と１５％との間のペプチドは、５００ｎＭ以上のＩＣ_５０で結合した。芳香族残基（Ｆ、Ｗ、およびＹ）、荷電した残基（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、およびＥ）、極性残基（ＳおよびＮ）および小さい残基（Ｃ、Ｇ、およびＰ）を含む、他の残基は、５００ｎＭ以上のＩＣ_５０で会合しなかった。

単一置換分析に対応して、Ｖは、最適なＡ^＊０２０１ Ｃ末端アンカー残基であることが見出された（図１ｂ）。全体的に、Ｃ末端にＶを有するペプチドの３１．９％が、Ａ^＊０２０１結合剤であった。Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｃ、Ｍ、ＴおよびＡはまた、５００ｎＭ以上のＩＣ_５０で結合するペプチドの７．１〜２８．６％で許容された。

ペプチド長（８残基と１１残基との間）と結合能力との間の相関を、次に分析した。９マーペプチドの２７．６％は、以前の推定によく一致する、５００ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合することが見出された（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ら、前出）（表７ａ）。ＡＲＢ値を、最適な大きさのペプチドセットに対して規格化し、そして参考の目的のために示す。

より長いペプチドはまた、結合し得るが、いくぶん十分ではなかった；１０マーペプチドの１７．８％、および１１マーペプチドの１４．５％は、５００ｎＭ以上の親和性を有した。最終的に、８マーペプチドが、５００ｎＭを越える結合能力を有するペプチドの３．５％で、Ａ^＊０２０１にまれにしか結合しないことを観察した。

Ａ^＊０２０１ペプチド結合データベースを、さらに、Ａ^＊０２０１モチーフのストリンジェンシーを評価するために分析した。予想されるように、それぞれのアンカー位置に好ましい残基を有するペプチドは、最も頻繁に結合し（４８．７％）、そしてライブラリ中の他のペプチドよりもより高い平均相対結合能力を有した（表７ｂ）。１つの好ましい残基および１つの許容される残基を有するペプチドはまた、１７．６〜２８．４％の範囲で比較的頻繁に結合した。最終的に、少なくとも１つの許容されない残基を有するか、または両方の主要なアンカー位置に許容される残基を有する、ペプチドは、仮にあるとしても、０〜７．１％の範囲内の結合の頻度で、まれにしか結合しなかった。リガンドの大きさの関数としての主要なアンカー優先傾向に関して、有意な差は検出されなかった。

第２アンカー効果を同定するために、それぞれの大きさの群におけるペプチドのＡ^＊０２０１結合能力を、さらに、特異的であるが大きさに依存する位置の特定のアミノ酸残基を含有する、ペプチドについてのＡＲＢ値を決定することにより分析した。対応する残基／位置の対によって、８〜１１マーの配列について得られたＡＲＢ値を、表８ａ〜表８ｄに示す。表８ａ〜表８ｄにおける全てのペプチドは、主要なアンカー位置に、少なくとも１つの好ましいおよび１つの許容される残基を有した。第２アンカー位置で、３倍以上の結合能力の増加に対応する値を、強調およびボールド体のフォントにより示す。結合親和性において３倍の減少に関連したネガティブな効果を、下線およびイタリック体のフォントにより示す。さらに、好ましいアンカーまたは許容されるアンカーであることを決定された残基を、ボールド体のフォントにより示す。アンカー位置でのＡＲＢ値を、図１に記載される分析から導いた。予測的なアルゴリズムについての係数として、この表に示される値の使用を可能にするために、許容されないアンカー残基についての値を、非モチーフペプチドを除去するために、結合能力の１０００倍の減少に相当する、０．００１に設定した。

表８ａ、表８ｂ、表８ｃ、および表８ｄにおいて、それぞれ９３個の８マーペプチド、１３８９個の９マーペプチド、９５３個の１０マーペプチド、および９５個の１１マーペプチドのパネルの分析の結果は、種々のウイルス、細菌、または病原体の起源に由来する天然に存在する配列に基づく。示されるＡＲＢ値を、例えば、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６２：１２００（２００１）およびＳｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５７：３４８０（１９９６）に記載されるように計算した。９マーペプチドおよび１０マーペプチドについて、ＡＲＢ値を、個別に考えられるそれぞれの残基について導いた。８マーペプチドおよび１１マーペプチドの研究について（それぞれ、表８ａおよび表８ｄ）、ＡＲＢ値は、Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９（１９９３）に記載されるように、化学的に類似な残基の分類に基づいた。８マー、９マー、１０マー、および１１マーのパネルの平均幾何学的結合能力は、それぞれ１４４２０ｎＭ、１５８１ｎＭ、３１５５ｎＭ、および３７９３ｎＭであった。

概要のマップを、図２ａ〜図２ｄに示す。ほとんどの位置において、いくつかの二次的影響を検出し得る。ネガティブな影響の過半数（５５％）は、酸性残基（ＤおよびＥ）または塩基性残基（Ｒ、Ｈ、およびＫ）の存在に関連した。プロリン（Ｐ）および大きな極性残基（Ｑ、およびＮ）はまた、頻繁に破壊的（ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ）であった。一方、それぞれの特定の大きさは、独特の優先傾向に関連し、ほとんどの場合（７９％）、好ましい残基は、芳香族（Ｆ、Ｗ、またはＹ）または疎水性（Ｌ、Ｉ、Ｖ、またはＭ）であった。ほとんどのペプチド長は、３番目の位置において、Ｆ、Ｙ、およびＭに対して優先傾向を示した。同様に、全てのペプチドの大きさは、Ｃ−２位置において、芳香族残基または疎水性残基に対して優先傾向を共有した。

いくつかの異なる優先傾向のパターンをまた、所定の大きさのペプチドについて観察した。例えば、８マーペプチドは、９マーペプチド、１０マーペプチド、および１１マーペプチドにより好ましい疎水性残基または芳香族残基について、１番目の位置または３番目の位置のいずれにおいてもいかなる優先傾向を有さなかった。１１マーペプチドは、ペプチドの中間にわたる複数の位置におけるＧについての優先傾向において独特であった。

（他のＡ２−スーパータイプ分子の主要なアンカー特異性）
次のセットの分析において、Ａ^＊０２０１の次に最も有力なＡ２−スーパータイプ対立遺伝子の４つ、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０６、およびＡ^＊６８０２の主要なアンカー特異性を評価した。Ａ２−スーパータイプ結合データベースにおけるペプチドは、しばしば、Ａ^＊０２０１ベースの偏り（例えば、Ａ^＊０２０１結合ペプチドのみを選択するアルゴリズム、またはＡ^＊０２０１に高いスコアのペプチドを選択するアルゴリズム）を使用する選択を反映する。結果として、ほとんどの場合において、非−Ａ^＊０２０１分子についてのペプチド結合データは、スーパータイプに好ましいかまたは許容される残基を有する、ペプチドに対してのみ利用可能である。この制限にもかかわらず、約４００個のペプチドのデータベースが、研究のために利用可能であった。十分な大きさのデータベースは、Ａ^＊０２０５およびＡ^＊０２０７の分析を可能にするために利用できないが、Ａ^＊０２０７の特異性の分析は、既に公開されている（Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、前出）。

２番目の位置の特異性の分析を、図３ａ〜ｄにまとめる。一般に、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ｉ、およびＭは、それぞれの分子の場合において許容された。対立遺伝子特異的な優先傾向がまた、観察された。Ａ^＊０２０２の場合において、Ｑは、最も好ましい残基であった。他の残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、ＴおよびＭ）は、許容され、そして０．０８〜０．３０の範囲内のＡＲＢを有し、ほぼ等価であった。対照的に、Ａ^＊０２０３は、Ｌ、ＭおよびＱについて優先傾向を有した。残基Ｖ、Ａ、ＩおよびＴは、全体的により低い結合親和性で会合した。第３のパターンは、Ａ^＊０２０６について観察され、ここで、Ｑ、Ｖ、Ｉ、Ａ、およびＴは、０．４７と１．０との間のＡＲＢ値を有して、全て十分に許容であったが、ＬおよびＭは、あまり許容でなかった。最終的に、Ａ^＊６８０２について、ＶおよびＴが、ＡＲＢ＞０．４５を有して、最適な残基であった。Ａはまた、好ましいが、より低いＡＲＢ（０．１３）を有した。結合における有意な減少を、０．０５０と０．０２０との間のＡＲＢを有する、ＩおよびＭで観察した。ＬおよびＱは、ＡＲＢ＜０．０１０を有し、許容されなかった。Ｃ末端で、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ａ、ＭおよびＴは、試験された全てのＡ２−スーパータイプ分子を用いて、ＡＲＢ＞０．０６０を有し、許容された（図４ａ〜ｄ）。ＩおよびＶは、それぞれの対立遺伝子によって、最も好ましい２つの残基であった；Ｖは、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０６、およびＡ^＊６８０２について最適な残基であった。Ｌは、代表的に、次に最も好ましい残基であった。Ｔ、Ａ、およびＭは、通常、より低いＡＲＢ値で会合された。

結論として、Ａ^＊０２０１によって好ましいかまたは許容される、２番目の位置およびＣ末端のアンカー残基はまた、他のＡ２−スーパータイプ分子によって十分に許容された。それぞれの対立遺伝子は、２番目の位置で、幾分独特なパターンの優先傾向を有したが、Ｃ末端でそれぞれの対立遺伝子によって示された優先傾向のパターンは、全く同様であった。

（Ａ２−スーパータイプ分子に結合するペプチドに関する二次的影響）
ペプチドリガンドの同一のライブラリを、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０６、およびＡ^＊６８０２のリガンドの大きさの優先傾向を決定するために分析した。それぞれの対立遺伝子について、ＡＲＢ値を、最適な大きさのペプチドセットに対して規格化する。本発明者らは、それぞれの分子について、９〜１１マーのペプチドが、ＡＲＢ＞０．３６を有し、十分に許容されることを見出した（表９ａ〜ｄ）。Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０６、およびＡ^＊６８０２について、９マーのペプチドは、最適であるが、１０マーは、Ａ^＊０２０２の場合に最適であった。全ての対立遺伝子について、８マーのペプチドは、それぞれの場合においてＡＲＢ＜０．１１を有し、それほど十分に許容されなかった。

第２アンカー残基の、ペプチドのＡ^＊０２０２、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０６、およびＡ^＊６８０２を結合する能力に対する影響を、次に試験した。入手可能なペプチドの数のみが、９マーおよび１０マーのリガンドの分析を可能にした。９マーおよび１０マーのペプチドに対する、特定の位置での特定の残基の存在の関数としてのＡＲＢ値は、表１０〜１３に示され、要旨は図５〜８に描かれる。上に示されるように、ポジティブな効果およびネガティブな効果は、それぞれ結合親和性の３倍以上の増加または減少に関連して規定される。

表１０ａおよび１０ｂにおいて、２６８個の９マーペプチドのパネルおよび１２０個の１０マーペプチドのパネルそれぞれを、Ａ^＊０２０２対立遺伝子への結合に対して試験した。表１１ａおよび１１ｂにおいて、２７２個の９マーペプチドのパネルおよび１２２個の１０マーペプチドのパネルそれぞれを、Ａ^＊０２０３対立遺伝子への結合に対して試験した。表１２ａおよび１２ｂにおいて、２６８個の９マーペプチドのパネルおよび１２０個の１０マーペプチドのパネルそれぞれを、Ａ^＊０２０６対立遺伝子への結合に対して試験した。表１３ａおよび１３ｂにおいて、２６８個の９マーペプチドのパネルおよび１２０個の１０マーペプチドのパネルそれぞれを、Ａ^＊６８０２対立遺伝子への結合に対して試験した。全てのペプチドは、種々のウイルス起源、細菌起源または病原体起源由来の天然に生じる配列に基づいており、主要なアンカー位置に少なくとも１個の好ましい残基および許容される残基を有した。ＡＲＢ値は、概して、例えば、Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９（１９９３）に記載されるように、化学的に類似する残基からなる群に基づく。結合能力の３倍以上の増加に対応する第２アンカー位置における値は、太文字および拡大されたフォントによって示される。結合親和性の３倍の減少に関連する、ネガティブな効果は、下線を付され、そしてイタリック体のフォントによって示される。好ましいアンカーまたは許容されるアンカーであると決定される残基もまた、太文字フォントで示される。この表に示される値の、予測的アルゴリズムに対する係数としての使用を許容するために、許容されないアンカー残基に対する値を、結合能力の１０００倍の減少と等価な、０．００１にセットし、非モチーフペプチドを取り除いた。表１０ａ、１０ｂ、１１ａ、１１ｂ、１２ａ、１２ｂ、１３ａ、および１３ｂ中の各々のパネルの平均幾何学的結合能力は、それぞれ、４０１ｎＭ、３４２ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、３８７ｎＭ、６４３ｎＭ、８３８ｎＭ、および１０５５ｎＭであった。

概して、有害な影響は、しばしば（３５％）、荷電残基（Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｈ、またはＫ）に関連した。有害な影響のさらに３５％は、ＧまたはＰに起因し得る。ポジティブな影響は、比較的均等に、塩基性残基（Ｒ、Ｈ、Ｋ）、酸性残基（Ｄ、Ｅ）、疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ）または小さな残基（Ａ、Ｐ）に起因し得る。

各々の分子は、選択および忌避について独特のパターンを有するのに対し、いくつかの共通の傾向が１０マーペプチドの場合に示され得る。例えば、全ての分子に対して、ＱおよびＮは１番目の位置を好み、そしてＲ、Ｈ、およびＫは８番目の位置を好んだ。Ｄ、Ｅ、およびＧは、３番目の位置では、１０マーペプチドにとって、一様に有害であった。９マーペプチドについて、一致した選択も忌避も認められなかった。

要約すると、このセクションのこのデータは、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０６、およびＡ^＊６８０２に結合する９マーおよび１０マーのペプチドに対する詳細なモチーフを記載する。各々のモチーフは、良好な結合ペプチドまたは不十分な結合ペプチドと関連する特定の性質によって、特徴付けられる。

（コンセンサス Ａ２−スーパーモチーフ）
Ａ２スーパータイプ分子に対する、上に記載されるモチーフは、非常に類似し、大部分が重複する。この点において、分子特異的モチーフによって、通常共有される性質を組み込むコンセンサスモチーフが、同定され得る（図９）。コンセンサスモチーフは、ペプチドリガンドの２番目の位置の疎水的かつ脂肪族残基の存在を指示する。この位置で、Ｖ、ＬおよびＭが好ましいのに対して、Ｔ、Ｑ、Ａ、およびＩは、全て許容される。各々のＡ２−スーパータイプ分子に関して各々の残基の選択のランクに基づいて、Ｖが最も好ましい残基である。Ｃ末端において、コンセンサスモチーフは、疎水的な脂肪族残基Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、およびＴの存在を指示する。Ｖは最も頻出する最適残基であるのに対して、ＬおよびＩはまた好ましく、代表的には、次に最も最適な残基であると考えられる。Ｍ、Ａ、およびＴは、許容される残基であると考えられる。

Ａ^＊０２０１、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０６、およびＡ^＊６８０２に対する、第２アンカーマップは、９マーおよび１０マーのペプチドに対して、スーパータイプコンセンサス第２アンカーモチーフを誘導するために使用された（図９）。任意の分子に対して有害ではなく、３個以上のＡ２−スーパータイプ分子に対して好ましいと考えられる残基は、スーパータイプコンセンサスモチーフに対して好ましいと考えられた。逆に、３個以上の分子に対して有害であると同定された残基は、コンセンサスモチーフにおいて、有害であると示された。コンセンサスモチーフは、詳細なＡ^＊０２０１モチーフと有意に重複し、そして、１番目の位置および／または３番目の位置での芳香族残基に対する選択、ならびに３番目の位置での荷電残基に対する共有された忌避を含む。

（Ａ^＊０２０１の結合親和性とＡ２−スーパータイプ交差反応性との間の相関）
他のＡ２−スーパータイプ対立遺伝子と比較した、Ａ^＊０２０１の４つの主要なエスニシティ（ｅｔｈｎｉｃｉｔｙ）における優勢のために（例えば、表３を参照のこと）、Ａ^＊０２０１結合体が、どのように良好に、他のＡ２−スーパータイプ分子と結合するかを決定することは、興味深かった。Ａ^＊０２０１と良好な親和性（ＩＣ_５０＜５００ｎＭ）で結合するペプチドは、しばしば、他のＡ２−スーパータイプ分子と結合することが見出された（表１４ａ）。３６．１％と７３．６％との間のＡ^＊０２０１結合ペプチドは、他のＡ２−スーパータイプ分子と結合した。Ａ^＊０２０１親和性の関数として、Ａ２−スーパータイプの縮重の分析はまた、興味深い結果を出した。ＩＣ_５０＜５００ｎＭでＡ^＊０２０１に結合するペプチドの７２．８％は、３個以上のＡ２−スーパータイプ分子と結合する（表１４ｂ）。一般的な規則として、ペプチドのＡ^＊０２０１に対する結合親和性が高ければ高いほど、このペプチドがまた、３個以上のスーパータイプ分子に結合する可能性はより高くなる。２０ｎＭ以上の親和性で、Ａ^＊０２０１に結合するペプチドの９６％を越えるペプチドはまた、３個以上のＡ２−スーパータイプ分子を結合する。対比すると、５００ｎＭよりよい親和性でＡ^＊０２０１に結合しなかったＡ２−スーパーモチーフペプチドは、わずか（１０％）のみが、３個以上のＡ２スーパーモチーフ分子を結合し、４個以上の分子を結合しない。

要約すると、ペプチドの、Ａ^＊０２０１および他のＡ２−スーパータイプ分子への交差反応結合のこの分析は、このファミリーのＨＬＡ分子がこれらのペプチドリガンドにおける類似する構造的特徴を認識するという事実を確認する。Ａ^＊０２０１結合親和性は、複数のＡ２−スーパータイプ対立遺伝子を結合する傾向と相関することが示された。

（分析）
本分析の結果は、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１および他のＡ２−スーパータイプ分子に結合するペプチドの特性の詳細な定義を可能にする。Ａ２−スーパータイプ分子は、大いに重複するペプチド結合特異性だけでなく、有意に重複するペプチド結合レパートリーも共有する。縮重するＡ２スーパータイプ結合能力と関連するペプチドリガンドの特異的な特徴を同定した。この特徴は、スーパータイプ関係に対する論理的説明を提供する。
以前の研究において、Ａ^＊０２０１のペプチド結合特異性が分析され、第２アンカー特徴の同定を含む、詳細なモチーフを構築した。本分析において、１０倍大きなデータベースで実行した場合、本発明者らは、このデータを確認し、分析を拡張して８マーおよび１１マーペプチドを含めた。全体的に、８マーおよび１１マーペプチドに対するＡ^＊０２０１の特異性は、大いに、９マーおよび１０マーペプチドに対する特異性に類似した。例えば、ペプチドの大きさに関わらず、結合能力へのネガティブな影響の大部分は、第２アンカー位置における荷電残基の存在に関連したのに対して、ポジティブな影響の大部分は、疎水性残基の存在に関連した。８マーおよび１１マーペプチドに対する詳細なモチーフの定義は、より完全なエピトープの同定を許容するはずである。Ａ^＊０２０１結合体の同定は、ＡＲＢ値に基づくアルゴリズムの使用によって大いに容易化されている。本発明の分析において、以前に利用可能であったデータベースよりも実質的に大きなデータベースを使用し、アルゴリズム係数の精密化を許容する。より新規の係数が有意により大きなデータセットに基づくので、これらは統計的により正確になり、エピトープのより効率的でより正確な予測を供給するはずである。それどころか最近の分析は、より大きなデータセットに基づく、改訂されたＡ^＊０２０１ ９マー多項式アルゴリズムが、小さなデータセットおよびニューラルネットワーク予想方法論の両方に基づく、より古いアルゴリズムより正確であることを示している。エピトープ予想の正確さの増加に加えて（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ら、（上述）；Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、（上述）；Ｋｏｎｄｏ，Ａ．ら、（上述）；Ｇｕｌｕｋｏｔａ，Ｋ．ら、（上述）；Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．Ｃ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｍｏｔｉｆｓ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ， ＨＬＡ−Ａ２」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−３５８７（１９９２）およびＭｉｌｉｋ，Ｍ．ら、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｔｏ Ｐｒｅｄｉｃｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＨＣ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、Ｎａｔｕｒｅ（Ｂｉｏｔｅｃｈ）１６：７５３−７５６（１９９８））、第１アンカー位置および第２アンカー位置の両方を規定する詳細なペプチド結合モチーフは、最適化されたリガンドの合理的設計を可能にする。例えば、第１位置および／または第２位置で準最適残基を有する天然の配列を同定し得る。この準最適残基は、増大した結合親和性を有するエピトープを生成する最適のアンカーで置換され得る（Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、（上述）；Ｐｏｇｕｅ，Ｒ．Ｒ．ら、「Ａｍｉｎｏ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｐｏｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９２：８１６６−８１７０（１９９５）およびＢａｋｋｅｒ，Ａ．Ｂ．ら、「Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅｓ Ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ−Ｉ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｅｌｉｃｉｔ Ａｎｔｉ−Ｍｅｌａｎｏｍａ ＣＴＬ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ｔｈｅ Ｗｉｄｅ−Ｔｙｐｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７０：３０２−３０９（１９９７））。この型の改変に従った場合、応答を誘発できないまたは貧弱な免疫原である野生型ペプチドは、高度に免疫原性になり得る（Ｐｏｇｕｅ，Ｒ．Ｒ．ら、（上述）；Ｂａｋｋｅｒ，Ａ．Ｂ．ら、（上述）；Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ，Ｍ．Ｒ．，「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＴＬ Ｗｉｔｈ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ１００ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｔ ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２５３９−２５４８（１９９６）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｍｅｌａｎｏｍａ」、Ｎａｔｕｒｅ（Ｍｅｄ）４：３２１−３２７（１９９８）；Ｓａｒｏｂｅ，Ｐ．ら、「Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ＣＴＬ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｆｒｏｍ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｔ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ＨＬＡ−Ａ２．１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：１２３９−１２４８（１９９８）およびＡｈｌｅｒｓ，Ｊ．Ｄ．ら、「Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＨＩＶ−１ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｂｙ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９４：１０８５６−１０８６１（１９９７））。そのようなアナログペプチドによって誘導されたＣＴＬは、ほとんどの例において、野生型抗原配列を発現する標的細胞を認識し得ることが示されている。この現象は、ナイーブなＴ細胞の、分化をエフェクターに誘導する刺激に対して必要とされる現象と比べて、標的細胞認識に対する、より低いストリンジェント性の、エピトープ結合の必要性を反映する可能性がある（Ｃｈｏ，Ｂ．Ｋ．ら、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｍｅｍｏｒｙ ａｎｄ Ｎａｉｖｅ ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：２９７６−２９８１（１９９９）；Ｓｙｋｕｌｅｖ，Ｙ．ら、「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ Ｔｈａｔ Ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｏｎ Ａ Ｔａｒｇｅｔ Ｃｅｌｌ Ｃａｎ Ｅｌｉｃｉｔ Ａｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：５６５−５７１（１９９６））。従って、本明細書中に記載される詳細なモチーフは、天然に存在するＣＴＬエピトープの同定だけでなく、増加した結合能力および／または免疫原性特性を有する、操作されたエピトープの設計も容易にする。

他のＡ２−スーパータイプ分子に対するペプチド結合特異性はまた、単一置換アナログペプチドおよびペプチドライブラリーを使用して調査された。以前の報告（ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏ，Ｍ−Ｆら、「Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ｔｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＨＬＡ Ａｌｌｅｌｅｓ Ａｌｌｏｗｓ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａ２−Ｌｉｋｅ Ｓｕｐｅｒｔｙｐｅ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５−６９３（１９９５）および（Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｓｕｐｅｒｍｏｔｉｆｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １７：２６１−２６６（１９９６））；ＮＩＨ−ＮＩＡＩＤ ｃｏｎｔｒａｃｔ ＮＯ１−ＡＩ−４５２４１に提出された報告も参照のこと）と一致して、本発明者らは、Ａ２−スーパータイプ分子の第１アンカーモチーフが顕著に類似することを見出した。ペプチドライブラリーの使用は、第２アンカー選択および各々の分子の忌避の詳細な特徴づけを可能にした。各々のＡ２−スーパータイプ分子が独特の特異性を有するのに対して、コンセンサスパターンに基づくスーパーモチーフが、同定され得ることが示された。スーパーモチーフが、Ａ２−スーパータイプ分子間に共有されるペプチドリガンドの特徴を記載するので、高度に交差反応性のペプチドの効果的な同定を可能にすることが予期され、そして、ペプチドリガンドのスーパータイプ縮重の調整を可能にする、アンカー固定のための適切な戦略を示す。本分析のさらなる結果は、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０６、およびＡ^＊６８０２に結合するペプチドを予測するためにアルゴリズムにおいて、使用され得る係数の偏差であった。

ＨＬＡ Ａ^＊０２０１が、一般的な集団でのおよび主要なエスニック（ｅｔｈｎｉｃ）集団の両方における断然最も有力なＡ２−スーパータイプ対立遺伝子である場合、使用されたペプチドスクリーニング戦略は、まず、Ａ^＊０２０１結合体の同定に注目した。Ａ^＊０２０１に結合するペプチドの７０％以上は、少なくとも２個のさらなるＡ２−スーパータイプ分子にもまた結合し、他のＡ２−スーパータイプ対立遺伝子に結合する傾向は、Ａ^＊０２０１結合親和性と関連したことが決定された。

結論として、本明細書中に記載されるデータは、Ａ２−スーパータイプとして示される、ＨＬＡ−Ａ分子の群の、共有されたペプチド結合特異性の正式な証明を提供する。これらの分子が、これらのペプチドリガンドの第１アンカー位置および第２アンカー位置での、類似する特徴を認識するだけでなく、これらはまた、主に重複するペプチド結合レパートリーも共有する。これらの分子が主に重複するレパートリーも共有することの証明は、潜在的なワクチン構築物の設計に対する有意な含みを有する。それどころか、Ａ２−スーパータイプのペプチド結合レベルでの交差反応性が、免疫的に妥当であり得るという考えは、感染症（Ｋｈａｎｎａ Ｒ．ら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ Ｗｉｔｈｉｎ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｌａｔｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＬＭＰ１）：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ＨＬＡ Ａ２ Ｓｕｐｅｒｔｙｐｅ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＥＢＶ−Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＬＭＰ１−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２８：４５１−４５８（１９９８）；Ｂｅｒｔｏｌｅｔｔｉ，Ａ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅ １８−２７： Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ ＨＬＡ Ａｎ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２６：１０２７−１０３４（１９９７）；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｂ．Ｄ．ら、「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＨＢＶ Ｃｏｒｅ １８−２７ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｅｌｉｃｉｔｓ ＣＴＬ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＨＬＡ−Ａ２ Ｓｕｐｅｒｔｙｐｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６０：１０１３−１０１７，（１９９９）；Ｂｅｒｔｏｎｉ，Ｒ．ら、「Ｈｕｍａｎ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｕｐｅｒｍｏｔｉｆｓ Ｐｒｅｄｉｃｔ Ｂｒｏａｄｌｙ Ｃｒｏｓｓ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ａｃｕｔｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ」、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １００：５０３−５１３（１９９７）；およびＤｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．ら、「Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｆｒｏｍ Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｂｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＨＬＡ−Ａ ａｎｄ ＨＬＡ−Ｂ Ｓｕｐｅｒｔｙｐｅ Ａｌｌｅｌｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：９７−１１２（１９９７））および癌（Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｕｅｒ，Ｋ．ら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＨＬＡ−Ａ Ａｌｌｅｌｅｓ Ｃａｎ Ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１ Ｔｏ Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１＋Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５７：７８７−７９７（１９９６）；Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉ，Ｌ．ら、「Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｆｒｏｍ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ＭＡＲＴ−１ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−１００ ｂｙ ＨＬＡ−Ａ２ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５６：３８８２−３８９１（１９９６）；Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．，「Ｔｈｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｅｐｉｔｏｐｅ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｖｅｒａｌ ＣＴＬ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｆｒｏｍ Ｖａｒｉｏｕｓ Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ Ｓｏｌｉｄ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｔｕｍｏｒｓ」、Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５９：１−１４（１９９８））設定の両方における、多くの研究で示された。

（実施例６：予防的使用に対するペプチド組成物）
本発明のワクチン組成物は、ヒトにおいて感染の防止または癌の処置に対して使用される。例えば、複数のＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを含む、ポリエピトープ性ペプチドエピトープ組成物は、ＨＣＶ感染に対する危険にある個体に投与される。この組成物は、複数のエピトープを含む、単一の脂質化されたポリペプチドとして提供される。ワクチンは、フロイントの不完全アジュバントから構成される水性キャリアで投与される。初期の免疫に対するペプチドの用量は、ヒト用量容積で投与される７０ｋｇの患者について、約１μｇ〜約５０，０００μｇまでである。ワクチンの初期の投与に続いて、４週間でブースター投薬量を投与され、続いて、ＰＢＭＣサンプル中にエピトープ特異的ＣＴＬ集団の存在を決定する技術によって、患者における免疫応答の大きさの評価を行う。さらなるブースター用量は、必要な場合に投与される。この組成物は、ＨＣＶ感染に対する予防として、安全でかつ効果的であることが見出される。

あるいは、ポリエピトープ性組成物は、当該技術分野で公知でかつ本明細書中に開示される方法論に従って核酸として投与され得る。

上記議論は、本発明を例示するために提供され、本発明の範囲を限定しない。本発明のほかの改変体は、当業者に直ちに明らかになり、そして、添付された特許請求の範囲に含まれる。本明細書中に引用される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、参考として本明細書によって援用される。

図１ａは、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１の２位およびＣ末端の詳細な特異性を示す。２番目の位置（ａ）またはＣ末端（ｂ）の特定の残基の優先性が、５００ｎＭまたはそれより好ましいＩＣ５０でＡ^＊０２０１に結合する特定の残基を保有するペプチドのパーセントの関係として示される。２番目の位置（ａ）あるいはＣ末端（ｂ）に特定の残基を保有するペプチドのＡＲＢ値は、本明細書中に記載されるように計算され、最も高い結合能力を有する残基に対して表示される。２番目の位置にＬを有するペプチドの平均（幾何学的）結合能力は、１９９１ｎＭであった。Ｃ末端にＶを有するペプチドの平均（幾何学の的）結合能力は、２１３３ｎＭであった。分析に含まれるペプチドは、２番目の位置かＣ末端で、本明細書中に記載されるように少なくとも１つの寛容化されたアンカー残基を有した。 図１ｂは、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１の２位およびＣ末端の詳細な特異性を示す。２番目の位置（ａ）またはＣ末端（ｂ）の特定の残基の優先性が、５００ｎＭまたはそれより好ましいＩＣ５０でＡ^＊０２０１に結合する特定の残基を保有するペプチドのパーセントの関係として示される。２番目の位置（ａ）あるいはＣ末端（ｂ）に特定の残基を保有するペプチドのＡＲＢ値は、本明細書中に記載されるように計算され、最も高い結合能力を有する残基に対して表示される。２番目の位置にＬを有するペプチドの平均（幾何学的）結合能力は、１９９１ｎＭであった。Ｃ末端にＶを有するペプチドの平均（幾何学の的）結合能力は、２１３３ｎＭであった。分析に含まれるペプチドは、２番目の位置かＣ末端で、本明細書中に記載されるように少なくとも１つの寛容化されたアンカー残基を有した。 図２は、Ａ^＊０２０１モチーフのマップを示す。８マー（ｂ）ペプチド、１０マー（ｃ）ペプチドおよび１１マー（ｄ）ペプチドのＡ^＊０２０１モチーフの概要マップ。第２のアンカー位置で、好ましい（または有害な）ように示された残基は、同じ位置で他の残基を有する同じサイズのペプチドの少なくとも３倍以上（または３倍未満）の平均結合能力に関連する。第１のアンカー位置で、好ましい残基は、同じ位置で最適な残基の１０倍以内の平均の結合能力に関連するものである。寛容化された第１のアンカー残基は、同じ位置で最適な残基の１０倍と１００倍との間の平均の結合能力に関連するものである。 図３ａは、ＨＬＡ−Ａ２−スーパータイプ分子の２番目の位置の詳細な特異性を示す。２番目の位置に特定の残基を保有するペプチドのＡＲＢ値は、本明細書中に記載されるように、それぞれのＡ２スーパータイプ分子について計算され、そしてそれぞれの特異的分子について最も高いＡＲＢを有する残基に対して表示される。最も高いＡＲＢを有するの残基を保有するペプチドの平均（幾何学的）結合能力は、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０６およびＡ^＊６８０２について、それぞれ、５５ｎＭ、５９ｎＭ、８９ｎＭおよび４１ｎＭであった。 図３ｂは、ＨＬＡ−Ａ２−スーパータイプ分子の２番目の位置の詳細な特異性を示す。２番目の位置に特定の残基を保有するペプチドのＡＲＢ値は、本明細書中に記載されるように、それぞれのＡ２スーパータイプ分子について計算され、そしてそれぞれの特異的分子について最も高いＡＲＢを有する残基に対して表示される。最も高いＡＲＢを有するの残基を保有するペプチドの平均（幾何学的）結合能力は、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０６およびＡ^＊６８０２について、それぞれ、５５ｎＭ、５９ｎＭ、８９ｎＭおよび４１ｎＭであった。 図３ｃは、ＨＬＡ−Ａ２−スーパータイプ分子の２番目の位置の詳細な特異性を示す。２番目の位置に特定の残基を保有するペプチドのＡＲＢ値は、本明細書中に記載されるように、それぞれのＡ２スーパータイプ分子について計算され、そしてそれぞれの特異的分子について最も高いＡＲＢを有する残基に対して表示される。最も高いＡＲＢを有するの残基を保有するペプチドの平均（幾何学的）結合能力は、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０６およびＡ^＊６８０２について、それぞれ、５５ｎＭ、５９ｎＭ、８９ｎＭおよび４１ｎＭであった。 図３ｄは、ＨＬＡ−Ａ２−スーパータイプ分子の２番目の位置の詳細な特異性を示す。２番目の位置に特定の残基を保有するペプチドのＡＲＢ値は、本明細書中に記載されるように、それぞれのＡ２スーパータイプ分子について計算され、そしてそれぞれの特異的分子について最も高いＡＲＢを有する残基に対して表示される。最も高いＡＲＢを有するの残基を保有するペプチドの平均（幾何学的）結合能力は、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０６およびＡ^＊６８０２について、それぞれ、５５ｎＭ、５９ｎＭ、８９ｎＭおよび４１ｎＭであった。 図４ａは、ＨＬＡ−Ａ２−スーパータイプ分子のＣ末端の詳細な特異性を示す。Ｃ末端に特定の残基を保有するペプチドのＡＲＢ値は、本明細書中に記載されるように、それぞれのＡ２スーパータイプ分子について計算され、そしてそれぞれの特異的分子について最も高いＡＲＢを有する残基に対して表示される。最も高いＡＲＢを有するの残基を保有するペプチドの平均（幾何学的）結合能力は、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０６およびＡ^＊６８０２について、それぞれ、２９１ｎＭ、４８ｎＭ、２５０ｎＭおよび５５３ｎＭであった。 図４ｂは、ＨＬＡ−Ａ２−スーパータイプ分子のＣ末端の詳細な特異性を示す。Ｃ末端に特定の残基を保有するペプチドのＡＲＢ値は、本明細書中に記載されるように、それぞれのＡ２スーパータイプ分子について計算され、そしてそれぞれの特異的分子について最も高いＡＲＢを有する残基に対して表示される。最も高いＡＲＢを有するの残基を保有するペプチドの平均（幾何学的）結合能力は、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０６およびＡ^＊６８０２について、それぞれ、２９１ｎＭ、４８ｎＭ、２５０ｎＭおよび５５３ｎＭであった。 図４ｃは、ＨＬＡ−Ａ２−スーパータイプ分子のＣ末端の詳細な特異性を示す。Ｃ末端に特定の残基を保有するペプチドのＡＲＢ値は、本明細書中に記載されるように、それぞれのＡ２スーパータイプ分子について計算され、そしてそれぞれの特異的分子について最も高いＡＲＢを有する残基に対して表示される。最も高いＡＲＢを有するの残基を保有するペプチドの平均（幾何学的）結合能力は、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０６およびＡ^＊６８０２について、それぞれ、２９１ｎＭ、４８ｎＭ、２５０ｎＭおよび５５３ｎＭであった。 図４ｄは、ＨＬＡ−Ａ２−スーパータイプ分子のＣ末端の詳細な特異性を示す。Ｃ末端に特定の残基を保有するペプチドのＡＲＢ値は、本明細書中に記載されるように、それぞれのＡ２スーパータイプ分子について計算され、そしてそれぞれの特異的分子について最も高いＡＲＢを有する残基に対して表示される。最も高いＡＲＢを有するの残基を保有するペプチドの平均（幾何学的）結合能力は、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０６およびＡ^＊６８０２について、それぞれ、２９１ｎＭ、４８ｎＭ、２５０ｎＭおよび５５３ｎＭであった。 図５は、Ａ^＊０２０２モチーフのマップを示す。９マー（ａ）ペプチドおよび１０マー（ｂ）ペプチドのＡ^＊０２０２モチーフの概要マップ。第２のアンカー位置で、好ましい（または有害な）と示された残基は、同じ位置で他の残基を有する同じサイズのペプチドの少なくとも３倍以上（または３倍未満）の平均結合能力に関連する。第１のアンカー位置で、好ましい残基は、同じ位置で最適な残基の１０倍以内の平均結合能力に関連するものである。寛容化された第１のアンカー残基は、同じ位置で最適な残基の１０倍と１００倍との間の平均結合能力に関連するものである。 図６は、Ａ^＊０２０３モチーフのマップを示す。９マー（ａ）ペプチドおよび１０マー（ｂ）ペプチドのＡ^＊０２０３モチーフの概要マップ。第２のアンカー位置で、好ましい（または有害な）と示された残基は、同じ位置で他の残基を有する同じサイズのペプチドの少なくとも３倍以上（または３倍未満）の平均結合能力に関連する。第１のアンカー位置で、好ましい残基は、同じ位置で最適な残基の１０倍以内の平均結合能力に関連するものである。寛容化された第１のアンカー残基は、同じ位置で最適な残基の１０倍と１００倍との間の平均結合能力に関連するものである。 図７は、Ａ^＊０２０６モチーフのマップを示す。９マー（ａ）ペプチドおよび１０マー（ｂ）ペプチドのＡ^＊０２０６モチーフの概要マップ。第２のアンカー位置で、好ましい（または有害な）と示された残基は、同じ位置で他の残基を有する同じサイズのペプチドの少なくとも３倍以上（または３倍未満）の平均結合能力に関連する。第１のアンカー位置で、好ましい残基は、同じ位置で最適な残基の１０倍以内の平均結合能力に関連するものである。寛容化された第１のアンカー残基は、同じ位置で最適な残基の１０倍と１００倍との間の平均結合能力に関連するものである。 図８は、Ａ^＊６８０２モチーフのマップを示す。９マー（ａ）ペプチドおよび１０マー（ｄ）ペプチドのＡ^＊６８０２モチーフの概要マップ。第２のアンカー位置で、好ましい（または有害な）と示された残基は、同じ位置で他の残基を有する同じサイズのペプチドの少なくとも３倍以上（または３倍未満）の平均結合能力に関連する。第１のアンカー位置で、好ましい残基は、同じ位置で最適な残基の１０倍以内の平均結合能力に関連するものである。寛容化された第１のアンカー残基は、同じ位置で最適な残基の１０倍と１００倍との間の平均結合能力に関連するものである。 図９は、９マー（ａ）ペプチドおよび１０マー（ｂ）ペプチドのＡ２−スーパータイプ結合能力に対する、第２のアンカーの影響および第１のアンカーの影響のＡ２スーパーモチーフの要約を示す。示される残基は、３つ以上のＡ２−スーパータイプ分子に対する結合に有意な影響を及ぼす。影響した分子の数は、括弧で示される。第２アンカーの位置で、残基が、１つ以上の分子への有害な影響がない場合にのみ、好ましいとみなされる。１つの分子の関系において、有害であった好ましい残基は、小さい、イタリック体で示される。第１のアンカー位置での評価は、本明細書中で考察されるように、単一の置換およびペプチドライブラリー分析に基づく。

Claims (28)

1. ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ制限ペプチドを同定するための方法であって：
   ８〜１１アミノ酸からなるペプチドをＡ^＊０２０１、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０４、Ａ^＊０２０５、Ａ^＊０２０６、Ａ^＊０２０７、Ａ^＊６８０２、およびＡ^＊６９０１の対立遺伝子によってコードされる３つ以上のＨＬＡ分子と接触させる工程であって、ここで、該ペプチドのＮ末端から２番目の位置のアミノ酸が、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＱであり、そしてＣ末端のアミノ酸が、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＴである、工程；
   ＩＣ_５０の値を測定する工程；および
   ５００ｎＭより小さいＩＣ_５０値で、少なくとも３つのＨＬＡ分子に結合するペプチドをＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ制限ペプチドとして、同定する工程、
   を包含する方法。
2. 前記ペプチドの２番目の位置のアミノ酸が、Ｖ、Ａ、ＴまたはＱである、請求項１に記載の方法。
3. 前記ペプチドの２番目の位置のアミノ酸が、Ｌ、Ｉ、Ｍ、またはＱである、請求項１に記載の方法。
4. 前記ペプチドの２番目の位置のアミノ酸が、ＩまたはＱである、請求項１に記載の方法。
5. 前記Ｃ末端アミノ酸が、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＴである、請求項５７に記載の方法。
6. 前記Ｃ末端アミノ酸が、Ｔである、請求項１に記載の方法。
7. 前記ペプチドが、ＨＩＶ抗原、ＨＢＶ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＰＶ抗原、ＰＳＡ抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、ＫＳＨＶ抗原、ラッサウイルス抗原、ＭＴ抗原、ｐ５３抗原、ＣＥＡ抗原、ＴＳＡ抗原、ＭＡＧＥ抗原、またはＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原に由来する、請求項１に記載の方法。
8. 免疫原性ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ制限ペプチドを同定するための方法であって：
   ８〜１１アミノ酸からなるペプチドをＡ^＊０２０１、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０４、Ａ^＊０２０５、Ａ^＊０２０６、Ａ^＊０２０７、Ａ^＊６８０２、およびＡ^＊６９０１の対立遺伝子によってコードされる３つ以上のＨＬＡ分子と接触させる工程であって、ここで、ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体を形成するために、該ペプチドのＮ末端から２番目の位置のアミノ酸が、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＱであり、そしてＣ末端のアミノ酸が、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＴである、工程；
   該ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体が、ＣＴＬ応答を誘導するか否かを決定する工程、および
   少なくとも３つのＨＬＡと複合して該ＣＴＬ応答を誘導するペプチドをＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ制限ペプチドとして、同定する工程、
   を包含する方法。
9. 前記ペプチドの２番目の位置のアミノ酸が、Ｖ、Ａ、Ｔ、またはＱである、請求項８に記載の方法。
10. 前記ペプチドの２番目の位置のアミノ酸が、Ｌ、Ｉ、Ｍ、またはＱである、請求項８に記載の方法。
11. 前記ペプチドの２番目の位置のアミノ酸が、ＩまたはＱである、請求項８に記載の方法。
12. 前記Ｃ末端アミノ酸が、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＴである、請求項８に記載の方法。
13. 前記Ｃ末端アミノ酸が、Ｔである、請求項８に記載の方法。
14. 前記ペプチドが、ＨＩＶ抗原、ＨＢＶ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＰＶ抗原、ＰＳＡ抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、ＫＳＨＶ抗原、ラッサウイルス抗原、ＭＴ抗原、ｐ５３抗原、ＣＥＡ抗原、ＴＳＡ抗原、ＭＡＧＥ抗原、またはＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原に由来する、請求項８に記載の方法。
15. ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ制限ペプチドを作製するための方法であって：
    目的の抗原のアミノ酸配列を提供する工程；
    推定Ｔ細胞エピトープを該配列内で同定する工程であって、ここで、該推定エピトープは、８〜１１アミノ酸からなり、ここで、該エピトープのＮ末端から２番目の位置のアミノ酸が、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｔ、またはＱであり、そしてＣ末端アミノ酸が、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＴである工程；
    該エピトープを含む該目的の抗原の１つ以上のペプチドフラグメントを調製する工程；
    該ペプチドをＡ^＊０２０１、Ａ^＊０２０２、Ａ^＊０２０３、Ａ^＊０２０４、Ａ^＊０２０５、Ａ^＊０２０６、Ａ^＊０２０７、Ａ^＊６８０２、およびＡ^＊６９０１の対立遺伝子によってコードされる３つ以上のＨＬＡ分子と接触させる工程；
    ＩＣ_５０の値を測定する工程；および
    ５００ｎＭより小さいＩＣ_５０値を有し、少なくとも３つのＨＬＡ分子に結合するペプチドをＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ制限ペプチドとして、選択する工程、
    を包含する方法。
16. 前記ペプチドの２番目の位置のアミノ酸が、Ｖ、Ａ、Ｔ、またはＱである、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ペプチドの２番目の位置のアミノ酸が、Ｌ、Ｉ、Ｍ、またはＱである、請求項１５に記載の方法。
18. 前記ペプチドの２番目の位置のアミノ酸が、ＩまたはＱである、請求項１５に記載の方法。
19. 前記Ｃ末端アミノ酸が、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＴである、請求項１５に記載の方法。
20. 前記Ｃ末端アミノ酸が、Ｔである、請求項１５に記載の方法。
21. 前記抗原が、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＰＳＡ、エプスタイン−バーウイルス、ＫＳＨＶ、ラッサウイルス、ＭＴ、ｐ５３、ＣＥＡ、ＴＳＡ、ＭＡＧＥ、またはＨｅｒ２／ｎｅｕである、請求項１５に記載の方法。
22. 免疫原性ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ制限ペプチドを作製するための方法であって：
    目的の抗原のアミノ酸配列を提供する工程；
    推定Ｔ細胞エピトープを該配列内で同定する工程であって、ここで、該推定エピトープは、８〜１１アミノ酸からなり、ここで、該エピトープのＮ末端から２番目の位置のアミノ酸が、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｔ、またはＱであり、そしてＣ末端アミノ酸が、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＴである工程；
    該エピトープを包含する該目的の抗原の１つ以上のペプチドフラグメントを調製する工程；
    ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体が、ＣＴＬ応答を誘導するか否かを決定する工程、および
    少なくとも３つのＨＬＡと複合してＣＴＬ応答を誘導するペプチドをＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ制限ペプチドとして、選択する工程、
    を包含する方法。
23. 前記ペプチドの２番目の位置のアミノ酸が、Ｖ、Ａ、Ｔ、またはＱである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記ペプチドの２番目の位置のアミノ酸が、Ｌ、Ｉ、Ｍ、またはＱである、請求項２２に記載の方法。
25. 前記ペプチドの２番目の位置のアミノ酸が、ＩまたはＱである、請求項２２に記載の方法。
26. 前記Ｃ末端アミノ酸が、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＴである、請求項２２に記載の方法。
27. 前記Ｃ末端アミノ酸が、Ｔである、請求項２２に記載の方法。
28. 前記抗原が、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＰＳＡ、エプスタイン−バーウイルス、ＫＳＨＶ、ラッサウイルス、ＭＴ、ｐ５３、ＣＥＡ、ＴＳＡ、ＭＡＧＥ、またはＨｅｒ２／ｎｅｕである、請求項２２に記載の方法。
    

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