JP2003521243A - ヘテロクリティックアナログおよび関連方法 - Google Patents

ヘテロクリティックアナログおよび関連方法

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Abstract

(57)【要約】 クラスＩエピトープのヘテロクリティックアナログは、これらのエピトープの３および／または５および／または７位で保存的または半保存的アミノ酸置換を提供することで調製される。このアナログは、対応する野生型エピトープに関連する免疫応答の誘発において有用である。本発明はまた、エピトープを含むペプチドの免疫原性を高める方法を提供する。本発明はまた、上記の方法によって得られ得るクラスＩエピトープを含むペプチドを少なくとも１つ含む組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願の引用） 本出願は、米国３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、特許仮出願番号６０
／１６６，５２９（１９９９年１１月１８日に出願）および同６０／２３９，０
０８（２０００年１０月６日に出願）に対する優先権を主張する。これらはその
全体が参照として援用される。
【０００２】 （発明の分野） 本発明は所定のＴ細胞に対する増加した刺激能力を有する、元のペプチドのヘ
テロクリティック（ｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｉｃ）アナログを生成するための方法
に関係する。
【０００３】 （発明の背景） 数々の研究は、細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）が、免疫系による感染性の疾患
およびガンの根絶に中心的な役割を果たすことを示唆する（Ｂｙｒｎｅら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｍｏｌ．５１：６８２（１９８４）、ＭｃＭｉｃｈｅａｌら、Ｎ．Ｅｎ
ｇｌｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．，３０９：１３（１９８３））。ＣＴＬはエピトープを
含むペプチドにより刺激されると、ＣＴＬ応答を刺激するエピトープに基づくワ
クチンの開発においてかなりの努力が進められている。ヘテロクリティックアナ
ログと命名したエピトープの一つのクラスは、ワクチン成分としての利点を提供
する。なぜならこれらのアナログは、ネイティブエピトープによって誘導される
Ｔ細胞応答よりも強力なＴ細胞応答を誘導するからである。ヘテロクリティック
アナログは、所定の用量に対する応答の増加もしくは同じ応答を達成するための
より少ない必要量によって測定されるような、特定のＴ細胞に対する増加した刺
激能力もしくは刺激効力を有するペプチドと定義される。
【０００４】 臨床適応におけるヘテロクリティックアナログの使用と関連する利点は、以下
のとおりである。第一に、ヘテロクリティックアナログは、Ｔ細胞アネルギーの
状態を逆転することによってか、Ｔ細胞の非寛容化交差反応クローンを活性化す
ることによってか、または、「免疫偏向」（すなわち、産生されるＣＴＬの型（
例えば、Ｔｈ１またはＴｈ２））を媒介することによって、寛容を崩壊／克服す
る能力を有する。最近の研究は、ヘテロクリティックアナログが内因的にプロセ
シングされたエピトープを認識するＣＴＬを誘導し得るという点で、ヘテロクリ
ティックアナログが免疫原であることを示す（Ｚａｒｅｍｂａら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５７：４５７０（１９９７）；Ｒｉｖｏｌｔｏｎｉら、Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５９：３０１（１９９９）；Ｓｅｌｂｙら、１
６２（２）：６６９（１９９９））。これは異なる免疫系における研究によって
確認される（Ｚｕｇｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：１７０５（１９９
８）、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９０：９８３（１９９９）、Ｍｅ
ｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２：３５６６（１９９９）。例えば、Ｚｕｇ
ｅｌらの研究（Ｚｕｇｅｌら、前出）は、成体マウスにおいて免疫優性のＴ細胞
エピトープに対するＴ細胞寛容が、ペプチドのそのヘテロクリティック交差反応
性ペプチドアナログで免疫することによって克服され得ることを示す。
【０００５】 この事は、ガンのワクチンの分野で特に有意であり、ここで、ＣＴＬエピトー
プの大部分が、自己抗原から誘導される。ガン関連抗体が、しばしば、自己抗原
であるという事実に起因して、これらの抗原に対する既存の寛容が存在し得ると
いう対応した現象が存在し、それによって、そのようなエピトープに対するＴ細
胞応答の発生が課題である。ヘテロクリティックアナログによる寛容の崩壊は、
マウスクラスＩＩ系における最近の研究で示されている（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１９０：９８３（１９９９）。この研究では、寛容の崩壊に関与す
るメカニズムがアネルギーの逆転よりむしろ、寛容化の低親和性クローンの刺激
であった。本明細書中で実証されるヘテロクリシティーは、高いアビディティの
ＣＴＬの誘導に関連しており、これは重要な差異を表す。
【０００６】 第二に、ペプチドアナログは、Ｔ細胞からのサイトカイン産生を調節すること
が示されている（Ｐｆｅｉｆｆｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８１：１５６
９（１９９５）、Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：４２３７（１９９
７）、Ｓａｌａｚａｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８５（６）：８２９−３
８（２０００）、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（２）
：２０５−１３（２０００））。そのようなアナログによって誘導される免疫偏
向は、Ｔｈ細胞応答の特定のサブセットの発生が腫瘍退行に相関する、（Ｚｉｔ
ｖｏｇｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８３：８７（１９９６）、Ｃｅｌｌｕ
ｚｚｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８３：２８３（１９９６））または、自己
免疫疾患もしくは感染性の疾患の臨床結果に影響を与える（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ
ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｍｏｌ．、１２：２２７−５７（１９９４））
数々の疾患状態と関連を有する。従って、ヘテロクリティックアナログを伴う免
疫は、エフェクターＴ細胞の特定のサブセットの誘導によってサイトカイン産生
を調節する能力を提供し、それによって、疾患の経過を変化させる。
【０００７】 第三に、ヘテロクリティックアナログは、薬剤の開発において利点を有する。
なぜなら、それらは強力な生物学的効力により、有意により少量のペプチドが、
処置用量に必要とされるからである。この特徴は、特定の製造および毒性の懸念
を克服する。この事については、黒色腫患者において抗原特異的Ｔ細胞を生じた
、ＭＡＲＴ−１ペプチドのヘテロクリティックアナログが、ネイティブエピトー
プよりはるかに低濃度で活性であることが示されている（Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉら
、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９：３０１（１９９９）。同様の結果が
、ＣＥＡ由来ＣＡＰ１エピトープのヘテロクリティックアナログに関して、Ｓｃ
ｈｌｏｍおよび共同研究者によって報告された。（Ｚａｒｅｍｂａら、Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：４５７０（１９９７））。しかし、野生型ペプ
チドに対する並行したｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ分析もしくはＴ
ＣＲアビディティ分析は、行われなかった。
【０００８】 従って、それらの生物学的関連性もために、所定のエピトープにヘテロクリテ
ィック活性を与えるアミノ酸置換を予測することが非常に有用である。しかしな
がら、本開示以前では、そのような置換を予想するための簡単な方法は存在しな
い。しかし、以前の研究では（Ｓｅｌｂｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２（
２）：６６９（１９９９）、Ｓｋｉｐｐｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：
５２７（１９９６））、黒色腫細胞から天然に存在する変異ペプチドを溶出する
ことによってか、または、エピトープ内のほとんど全ての位置での変異からなる
多くのアナログを系統的にスクリーニングすることによって、ヘテロクリティッ
クエピトープが、偶発的に同定された（Ｚａｒｅｍｂａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ ５７：４５７０（１９９７）、Ｌｏｆｔｕｓら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：２４３３（１９９８）、Ｂｌａｋｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１８：１２１（１９９６））。あるいは、ヘテロクリティックアナログ
は、ランダムコンビナトリアムペプチドライブラリーをスクリーニングすること
によって同定された。このライブラリーはまた、多くのペプチドの困難な合成お
よびスクリーニングを必要であった（Ｐｉｎｉｌｌａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐ
ｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１：１９３−２０２（１９９９）
）。ＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングのような、遺伝学的なアプローチ
が、ＣＴＬエピトープおよびアナログの生成のための別の方法を提供する（Ｂｏ
ｏｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：３３７−６５（１９９４）
、Ｇａｖｉｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（９）：２１２４−３３（
１９９４））。しかし、このアプローチは、生成されるエピトープの潜在的な少
ない量および複雑性が問題になり得る。
【０００９】 （発明の開示） 本発明は，対応する類似した野生型エピトープと比べて、免疫応答をもたらす
増強された能力を有するエピトープを含むペプチドを、調製する方法を提供する
。この得られた「ヘテロクリティックアナログ」は、ウイルス性疾患、ガン、お
よび標的細胞上の提示された抗原によって特徴付けられる他の疾患の処置のため
の、免疫学的組成物として有用である。
【００１０】 従って、一つの局面において、本発明は、エピトープを含むペプチドの免疫原
性を増強するための方法に関する。この方法は、以下の工程を包含する：Ｉ）第
一のクラスＩエピトープを含むペプチドを提供する工程であって、ここで、この
エピトープは、本質的に、Ｎ末端およびＣ末端ならびに少なくとも一つの一次ア
ンカー残基を有するアミノ酸配列からなり、ここで、このエピトープのアミノ酸
残基は連続的に番号付けられ、そして、このエピトープのＮ末端に最も近い一次
アンカー残基は、位置２または位置３である工程；ＩＩ）一次アンカー残基を含
まない位置３および／または５および／または７で、このエピト−プのＮ末端と
Ｃ末端との間に一つ以上の保存的または半保存的な置換を導入する工程で、これ
により、増強された第一のクラスＩエピトープと比較される抗原原性を示す第二
のクラスＩエピトープを含むペプチドを構成する工程。
【００１１】 上記の第二のクラスＩエピトープは、一般に「ヘテロクリティックアナログ」
と称する。
【００１２】 好ましい実施形態において、このヘテロクリティックアナログは、対応する野
生型クラスＩエピトープに比較して、特定のＴ細胞に対する少なくとも約５０％
増加した効力を示す。このアナログは、１つの置換のみを含み得るか、または２
もしくは３つの置換を含み得、そしてこの置換は、保存的または半保存的であり
得る。このヘテロクリティックアナログは、ＨＬＡクラスＩ分子に結合され、そ
して関連する細胞傷害性Ｔ細胞と接触された場合、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカ
インの両方を誘導し得る。好ましくは、クラスＩエピトープは、Ａ１、Ａ２、Ａ
３、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ４４、Ｂ５８およびＢ６２からなる群から選択さ
れたスーパーモチーフを含み、より好ましくは、クラスＩエピトープは、Ａ２ス
ーパーモチーフ、最も好ましくは、Ａ２．１モチーフを含む。
【００１３】 本発明はまた、事前に選択したクラスＩペプチドエピトープに対してヒト細胞
傷害性Ｔ細胞応答を誘導する方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含す
る：上記のヘテロクリティックアナログを提供する工程；および、ヒトＣＴＬに
このヘテロクリティックアナログを接触させる工程。
【００１４】 いくつかの局面において、この接触の工程は、インビトロで実施される。いく
つかの局面において、この接触の工程は、このヘテロクリティックアナログペプ
チドエピトープをコードする配列を含む核酸分子を、被験者に投与することによ
って実施される。
【００１５】 本発明はまた、上記の方法によって入手可能であるヘテロクリティックアナロ
グエピトープを含むペプチドに関する。特に、そして、好ましくは、そのような
ペプチドとしては、そのエピトープが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、
配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号
１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２０からな
る群から選択されるアミノ酸の配列からなる、ペプチドが挙げられる。このペプ
チドは、９〜２０アミノ酸、好ましくは、９〜１６アミノ酸、より好ましくは９
〜１５アミノ酸を含み得るが、また、全部で９、１０、１１、１２、１３または
１４アミノ酸のみを含み得る。定義されたヘテロクリティックアナログエピトー
プは、より長いポリペプチドまたはタンパク質に含まれ得、このタンパク質また
ポリペプチドは、同じエピトープのホモポリマーであるか、あるいは、種々のこ
のようなエピトープを含むかまたは野生型ペプチドと組み合わせてヘテロクリテ
ィックアナログエピトープを含む、ヘテロポリマーである。これらペプチドおよ
びタンパク質は、薬学的使用のために設計される組成物に含まれ得る。
【００１６】 ヘテロクリティックアナログエピトープを含むペプチドまたはヘテロポリマー
もしくはホモポリマーは、他の成分を結合させ、免疫応答の誘発におけるそれら
の活性をさらに増強し得るか、または調節し得る。これらさらなる変更物は、共
有結合的に結合され得るか、または混合物中に非共有結合的に含まれ得る。従っ
て、ヘテロクリティックアナログエピトープは、ＣＴＬエピトープまたはこのＨ
ＴＬエピトープに混合され得るか、または投与され得る。特にＨＴＬエピトープ
は、ｐａｎ−ＤＲ結合分子である。ヘテロクリティックアナログエピトープを含
む組成物は、さらにリポソームを含み得る。ここで、このエピトープは、リポソ
ーム上もしくはリポソーム中に存在するか、またはこのエピトープは、脂質に結
合され得る。このヘテロクリティックエピトープは、ＨＬＡ重鎖、β２−ミクロ
グロブリンおよびストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）複合体に結合
され得、それによって、４量体が形成される。さらに、このヘテロクリティック
エピトープは、抗原提示細胞を含む組成物において改変され得る。ここで、この
エピトープは、抗原提示細胞上または抗原提示細胞中にあり、ここで、このエピ
トープは、抗原提示細胞上のＨＬＡ分子に結合される。従って、ＨＬＡ分子に制
限される細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）が存在する場合、ＣＴＬのレセプターは
、ＨＬＡ分子とそのエピトープの複合体に結合する。抗原提示細胞は、樹状細胞
であり得る。この組成物はまた、単にＨＬＡ分子を含み得る。ここで、このエピ
トープを含むペプチドは、ＨＬＡ分子に結合される。この組成物は、モノクロー
ナル抗体が結合する標識（例えば、ビオチン）、蛍光部分、非哺乳動物性の糖、
放射標識または小さい分子をまた含み得る。
【００１７】 記載される組成物は、対応する野生型エピトープに対する免疫応答の誘発にお
いて有用である。代表的には、ヘテロクリティックアナログは、適切な賦形剤を
さらに含むそのような組成物に含まれる。活性な成分であるヘテロクリティック
エピトープは、投薬形態単位で存在し得る。被験体の処置に有用な組成物はまた
、これらの核酸分子は、上記のペプチドをコードする核酸分子を含み得、それら
の発現のための制御配列を必要に応じて含む。 （発明を実施するための形態） （１．概要） 本発明は、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するヘテロクリティックアナログの設計
の方法に関連する。本明細書中に記載される「ヘテロクリティックアナログ」は
、特定のＴ細胞に対する増強された効力を持つエピトープを含むペプチドである
。それは、所定の投与量に対する増強された応答によって、または相同性のある
クラスＩペプチドとして同じ応答を達成するより少ないの必要量によって測定さ
れる。本発明の方法は、特に、ヒトの癌および前癌性の状態に関連する、ウイル
ス、細菌、真菌および原生動物の寄生虫のような感染性の病原体に由来する、な
らびに任意のクラスＩペプチドの改変に有用である。
【００１８】 重要なことに、ヘテロクリシティーの現象は、個々のクラスＩエピトープに結
合するＨＬＡ分子にわたってあてはまる。例えば、Ａ２スーパーモチーフを有す
るヘテロクリティックアナログペプチドは、ＨＬＡ−スーパータイプ（例えば、
Ａ０２０１、Ａ０２０２、Ａ０２０３、Ａ０２０４、Ａ０２０５、Ａ０２０６、
Ａ０２０７など）における全てのＨＬＡ分子にわたって、ヘテロクリティック（
すなわち、より高い効力を有する）である。同様に、異なる配列モチーフ（例え
ば、Ａ１、Ａ３、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ４４、Ｂ５８、Ｂ６２など）を有す
るヘテロクリティックアナログペプチドは、その特定のＨＬＡ−スーパーファミ
リーにおける全てのＨＬＡ分子にわたって、免疫応答をより強力にする。
【００１９】 出願者は、対応する野生型エピトープに対する、免疫応答を高めるヘテロクリ
ティックアナログを設計する特定の法則を見つけた。これらの法則は、任意のク
ラスＩ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子に結合するモチーフ、または
ス−パーモチーフを有するエピトープに関して適応できる。従って、これらの法
則の使用によって、任意の「野生型」または「ネイティブ」クラスＩエピトープ
の免疫原性を高めることが可能である。
【００２０】 簡略には、この法則は、野生型クラスＩエピトープが、エピトープの位置３お
よび／または位置５および／または位置７として保存的または半保存的なアミノ
酸の置換によって改変されることを述べる。置換されるべき保存的または半保存
的アミノ酸の性質は、本明細書以下の、調製Ｂの記載によって定義され、この結
果は表２に要約される。従って、表２を参照すれば、これらの位置での置換のた
めの適した候補を決め得る。表２に示されるように、表の最上段にわたって示さ
れるそれぞれのアミノ酸は、残存する１９の遺伝的にコードされるアミノ酸と数
値的に規定された関係を有する。指標がより低いほど、保存性はより高く；同じ
アミノ酸は、１．０の類似性の割当を有し；最も大きく異なるアミノ酸は、２０
に近い類似割当を有する。調製Ｂ中で示す方法を使用すると、遺伝子コードされ
ないアミノ酸もまた、類似性の指標を割り当てられ得、そして保存的または半保
存的（または非保存的）として、任意に天然に存在するアミノ酸について、分類
され得る。
【００２１】 本発明のヘテロクリティックアナログペプチドは、被験体の免疫系が耐性とな
る抗原に対する免疫応答を誘導するのに特に有用である。ヒト被験体は、特に好
ましいが、この方法はまた、これらの被験体に関して、対応するＨＬＡモチーフ
を考慮にいれることにより、他の哺乳動物、例えば実験室マウスにも適用し得る
。耐性は、先立つ抗体への曝露によって誘導される特定の免疫学的な非反応性を
いう。耐性は、患者が耐性である特定のクラスＩペプチドエピトープを同定する
ことによって、本発明の方法に従ってペプチドエピトープ配列を改変することに
よって、および寛容化エピトープ（抗原）に対する交差反応をする免疫反応を誘
導することによって、克服され得る。例えば、被験体の免疫系がウイルス抗原ま
たは腫瘍関連抗原に耐性である場合、耐性の克服は特に望ましく、後者の抗原は
、細胞の形質転換の結果として、しばしば過剰発現する自己タンパク質である。
【００２２】 ヘテロクリティックを設計するための法則を決定するため、いくつかの種々の
ＣＴＬ株がアナログパネルに対する反応性によりスクリーニングされた。Ｔ細胞
刺激容量の改変は一次ＭＨＣアンカーの変更なしに達成された。
【００２３】 その野生型エピトープとしては、上皮細胞の癌において特異的に上方制御され
、そして免疫原性であることが示された自己抗原に由来する腫瘍エピトープが挙
げられる。ＨＩＶおよびＨＢＶのポリメラーゼ遺伝子由来のエピトープのような
使用されるウイルスのエピトープは、同様に免疫原性であることが示された。
【００２４】 本明細書中に記載した法則は、ヘテロクリティックなアナログを設計するため
の基盤を提供し、そうでなければ要求されるスクリーニングを劇的に減少させ、
そして癌および感染性疾患のためのエピトープを基礎としたワクチンの設計に非
常に有用である。
【００２５】 以下に示す実施例において、スクリーニングされた（本明細書に開示されるヘ
テロクリティックの法則に適合する）総アナログの１７％がヘテロクリティック
であった（１６／９５）。これは、二つの理由において有意である：第１に、ヘ
テロクリティック置換の法則に従ったアナログを使用することでヘテロクリティ
ック検出の効率が２．２％から１７％まで上昇した；第２に、合成されることが
必要なペプチドの数が一つのエピトープあたり約１００アナログから約１５アナ
ログに劇的に減少され、この工程費用を効果的にし、高い処理能力に耐えられる
ようにする。本発明のヘテロクリティック置換の法則の適用を通して、ヘテロク
リティックアナログが生じる効率は、１００から１０００倍近く、０．２％（２
３３のＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２アナログのスクリーニングから
４つが同定された）から３０％（９つの予測されたアナログのスクリーニングか
ら３つが同定された）まで増加した。後者の頻度は、最初のアッセイにおいて潜
在的なヘテロクリティック活性を示した６つのアナログのうちの４つのみをさら
なる分析に供したので、ひどい過小評価でありうる。
【００２６】 以前の研究は、ヘテロクリティックアナログによるＴ細胞応答の調節が、ＴＣ
Ｒ接触残基を含むことを示した（Ｂｙｒｎｅら、 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５
１：６８２（１９８４）、 ＭｃＭｉｃｈａｅｌら、 Ｎ． Ｅｎｇｌａｎｄ．
Ｊ． Ｍｅｄ． ３０９：１３（１９８３）、 Ｚｕｇｅｌら、 Ｊ． Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ． １６１：１７０５（１９９８）、 Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉら、 Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９：３０１（１９９９）、 Ｐａｒｈｕｒｓ
ｔら、 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７：２５３９（１９９６））が、本研究
ではこれを発見しなかった。例えば、ＣＥＡ．６９１エピトープに対しては、Ｔ
ＣＲ接触残基が８位であり、一方で、ヘテロクリティックは、３および５位でア
ナログ置換が認められた。いかなる仮定によっても束縛されることを意図しない
が、ＭＨＣ結合の変更は機構となり得る。このアナログに対して実施された結合
分析は、大多数の場合（８０％）において好むと好まざるとにかかわらずＭＨＣ
結合における変更があることを示した。ＨＬＡ−Ａ２結合について試験された１
３アナログのうち１０アナログはＭＨＣ結合の変更を持ち、６アナログは、野生
型のペプチドおよび野生型より結合の悪い４アナログよりも良好に結合するが、
まだ実質的に増加した生物学的応答を生じた。いくつかの研究ではＭＨＣ結合を
増強するために一次のＭＨＣアンカー残基を修飾する（この手段は、アナログを
生じるためにいくつかのグループによって用いられた（Ｐｆｅｉｆｆｅｒら、
Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８１：１５６９（１９９５）、 Ｖａｌｍｏｒｉ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１７５０−１７５８（１９９８））。一次の
ＴＣＲの接触残基あるいは一次のＭＨＣアンカー残基の変化無しに生物学的応答
の増加は本研究においては認められなかった。応答の増加がＭＨＣ結合における
変更にともない媒介されるので、その効果は二次アンカーの位置の変化により媒
介しうることを前提とする。これを支持するさらなる証拠は、ヘテロクリティッ
クの置換がそのペプチドの中間における奇数位置（３、５、７）で起こるという
発見から生じる。３、５および７のこれらの位置全ては、ＨＬＡ−Ａ２分子に対
する結合にとって二次アンカー位置であると示された（Ｂｏｏｎら、 Ａｎｎｕ
． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２：３３７−６５ （１９９４）、 Ｉｓ
ｈｉｏｋａら、 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２（７）：３９１５−２５ （
１９９９） ）。
【００２７】 これらの位置のうちの２つ（３および７）は、ＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合す
るための二次アンカー位置であることがいくつかのグループにより示された（Ｒ
ｕｐｐｅｒｔら、 Ｃｅｌｌ ７４：９２９（１９９３）、 Ｍａｄｄｅｎ、
Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３：５８７−６２２（１９９５）
）。そのような二次アンカー位置の変更は、Ｔ細胞認識差異に転換しうる（Ｖａ
ｌｍｏｒｉら、 Ｊ． Ｉｍｍｎｏｌ． １６０：１７５０（１９９８）； Ｄ
ａｖｉｓら、 Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｎｏｌ． １６：５２３ （１９
９８））が、これらの研究では、Ｔ細胞の認識差異は、ＭＨＣ結合における変化
に付随し、ヘテロクリティックの獲得に関与するアミノ酸置換の種類に関する法
則は規定されなかった。二次アンカーの変化からＴ細胞の認識の変化へのこのよ
うな転換が生じる機構は現在不明瞭である。しかし、いくつかのモデルは、二次
アンカーの位置の残基がＭＨＣと結合する様式の変化がＴＣＲ接触残基の配向に
おける変更あるいは増加した可撓性を引き起こし得ることを示唆しており、それ
は、ＴＣＲに対するこれらのアナログの結合の増加に帰着する（Ｋｅｒｓｈら、
Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８４：１２５９（１９９６）、 Ｅｖａｖｏｌ
ｄら、 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：３４７（１９９２）、 Ａｌａｍら
、 Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２２７（１９９９）、 Ｈａｍｐｌら、 Ｉｍｍ
ｕｎｉｔｙ ７：３７９−８５（１９９７））。また、いくつかの以前の研究で
は、ヘテロクリティックアナログによるＴ細胞応答の調節が主なＴＣＲ接触残基
に直接関与することを意味していた（Ｚａｒｅｍｂａら、 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ ５７：４５７０（１９９７）、 Ｌｏｆｔｕｓら、 Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：２４３３（１９９８）、 Ｄｒｅｓｓｅｌら、
Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９：４９４３（１９９７））。けれどもこの発見
は、現在の体系的解析により実証されない。本研究において同定されたアナログ
に対して増加したＴ細胞認識は、おそらくＭＨＣ結合容量の増加に起因しないが
、増加される結合は、おそらく一次アンカーの位置が最適化されたアナログの場
合において、重要な役割を果たす。本研究は、ヘテロクリティックアナログが、
おそらくＴＣＲあるいはＭＨＣの結合容量の大きな変更によるよりもむしろ構造
における微妙な変更により生じることを示唆する。
【００２８】 Ｔｈ１あるいはＴｈ２サイトカイン産生の調節差異は認められなかった。それ
どころか、本データは、ヘテロクリティックアナログがＴｈ１およびＴｈ２両応
答の産生を増加することを示唆したが、その増加の大きさおよび動力学が異なり
得る。事実、いくつかのグループ（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、 Ｉｎｔ． Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ． １２（２）：２０５−１３（２０００）、 Ｐａｒｈｕｒｓｔら、
Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７：２５３９（１９９６））は、最近ペプチド
アナログによるそのような全体刺激を報告した。これは、アナログによって誘起
されるより強いＴＣＲのシグナルに起因するが、そのような全体刺激の機構は、
今後解明されるべきである。
【００２９】 関連する腫瘍モデルあるいは自己抗原に対する寛容が存在するモデルを使用す
るインビボでのヘテロクリティックアナログの効力は評価される。従って、効果
的なＣＴＬを生じさせることが攻撃であるとこれまで判明している腫瘍に対する
ワクチン化として、ヘテロクリティックアナログでの免疫化がより効果的で有効
な戦略であることが見出される。
【００３０】 要約すると、本出願人らが癌およびウイルス起源のＨＬＡ−Ａ２．１制限ＣＴ
Ｌエピトープのいくつもの異なるヘテロクリティックアナログを同定した。その
適切な野生型エピトープは表１に示される。全てのこれらのエピトープは本発明
者らのより早い報告において免疫原性であることが示された（Ｋａｗａｓｈｉｍ
ａら、 Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５９：１−１４（１９９８）、
Ｉｓｈｉｏｋａら、 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２（７）：３９１５−２５
（１９９９））。最初の実験の中で、ＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２
ＣＴＬエピトープの２３３のアナログの抗原性が調査された。同定された４つの
ヘテロクリティックアナログの性質は、ヘテロクリティック置換が３、５および
７の位置で保存的な置換を含むことを示した。この仮説は、３つのさらなるエピ
トープであるＭＡＧＥ２．１５７、ＨＩＶＰｏｌ．４７６およびＨＢＶＰｏｌ．
４５５が関与する引き続きの研究において試験された。このように同定された全
てのヘテロクリティックアナログは、提案した本法則、すなわちヘテロクリティ
ックアナログが３、５および／または７の位置での保存的あるいは半保存的な置
換に付随されることに一致した。
【００３１】 癌免疫治療におけるヘテロクリティックアナログの臨床的適用をより綿密に模
倣するため、マウスのエピトープ、ｐ５３．２６１もまた修飾された。Ｔ細胞寛
容の部分的な状態はこのエピトープに関して報告された（Ｔｈｅｏｂａｌｄら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９２：１１９９３−１１９９
７（１９９５）、 Ｔｈｅｏｂａｌｄら、 Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８
５（５）：８３３−８４１（１９９７））。予想された９つのｐ５３．２６１ア
ナログのうち４つは、未変性ペプチドにより誘導されるＣＴＬ応答に比べてイン
ビボでのアナログ特異的ＣＴＬの応答をより強く誘導することが発見された。よ
り顕著に、ヘテロクリティックアナログによる免疫化により生じたＣＴＬの交差
反応性が解析された場合に、３つのｐ５３．２６１アナログが未変性のｐ５３．
２６１エピトープに対して活発に応答するＣＴＬを誘導した。最終的に、ヒトＣ
ＴＬについてこれらの発見の妥当性はＭＡＧＥ３．１１２エピトープのヘテロク
リティックアナログがインビトロでのヒトＴ細胞に対して免疫原性であることを
実証することにより考慮された。帰着するＣＴＬは腫瘍細胞株の形態において自
然に作用される野生型抗原を認識しうる。
【００３２】 ヘテロクリティックアナログが、研究されたすべてのエピトープに対して同定
されたので、本明細書に示した研究は、ヘテロクリシティーが全世界的な現象で
あることを証明する。加えて、本願は、クローンのＴ細胞集団（以前の研究で明
示されたような）およびインビボでの免疫化の後の大部分のＴ細胞集団の両方に
おけるヘテロクリティックアナログを検出することが可能であることを示す。さ
らに、本明細書において、ヘテロクリシティー（ＨＬＡ Ａ２．１系におけるも
のと他のクラスＩスーパーモチーフに関するものとの両方）が、合理的なヘテロ
クリシティーの予測を見込む別々の構造上の特徴に付随することが実証される。
【００３３】 さらに、ｐ５３．２６１ヘテロクリティックアナログがより高いアビディティ
によりＣＴＬを誘導し、また、野生型ペプチドにより誘導されるより多数の（前
駆体出現率）これらの細胞を誘導することが実証される；インビボでのヘテロク
リティックＣＴＬの誘導およびＴ細胞の寛容を中断するためのその適用は実証さ
れる。
【００３４】 ヘテロクリティックアナログは、インビボでの免疫化に続いて大部分の特異的
なＴ細胞集団を生じるのに効果的であった。多数のＴＣＲ遺伝子由来のＴＣＲを
提示するポリクローナルの応答は臨床背景で疾患状態を治療するのにより有効で
ある。最終的に、野生型エピトープに対する強い交差反応性のアビディティを有
するＣＴＬの高い前駆体出現率を生じるための能力が、通常は免疫系に対して寛
容であるエピトープに対する効果的なＣＴＬ応答が要求される例において重要で
ある。
【００３５】 （２．定義） 特定のアミノ酸配列に関して、「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによ
る認識に関与するアミノ酸残基のセットであるか、またはＴ細胞の状況において
は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によりコードされるＨＬＡの状況に提
示される場合にＴ細胞レセプタータンパク質による認識にとって必要な残基であ
る。インビトロまたはインビボでの免疫系の設定において、エピトープは、一次
、二次および三次ペプチド構造、ならびに電荷のような分子の集団的特徴であり
、これらは一緒になって、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子
によりコードされる部位を形成する。本開示を通してエピトープおよびペプチド
は、しばしば交換可能に使用される。しかし、本発明のエピトープより大きくか
つ本エピトープを含む、分離または精製されたタンパク質またはペプチド分子が
、まだ本発明の範囲内にあることは、評価されることである。
【００３６】 「クラスＩエピトープ」は、クラスＩ ＨＬＡ分子に対して結合するペプチド
をいう。本明細書において記載されたように、クラスＩエピトープは代表的に約
８から約１３アミノ酸長である。ＨＬＡ分子に対する結合は、２つの一次アンカ
ー残基により主に調節され、このうちの一方はエピトープのＣ末端にあり、そし
て他方は、２または３位にある。結合は、また、１つ以上の二次アンカー残基に
より補助されうる。読み手の利便性のために、様々な一次ＨＬＡクラスＩ結合ア
ンカーは、表４にて示される。アンカーのパターンは、「モチーフ」と称される
。「スーパーモチーフ」は、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるＨ
ＬＡ分子により共有されるペプチド結合の特異性である。好ましくは、スーパー
モチーフ保有ペプチドは、高いまたは中間の親和性（本明細書で定義されるよう
な）で２つ以上のＨＬＡ抗原により認識される。クラスＩスーパーモチーフの例
としては、例えば、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ４４、Ｂ５８
およびＢ６２が挙げられる。
【００３７】 本開示をとおして、「結合データ」の結果を、しばしば「ＩＣ50」に換算して
表す。ＩＣ50は、参照ペプチドの結合の５０％阻害が認められる、結合アッセイ
におけるペプチドの濃度である。アッセイを行う条件（すなわち、制限ＨＬＡタ
ンパク質濃度および標識ペプチド濃度）が付与されると、これらの値は、Ｋｄ値
を概算する。結合を測定するためのアッセイは、例えば、参考として本明細書に
援用される、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２０１２７およびＷＯ９４／０３２０５に、
詳細に記載される。ＩＣ50値が、アッセイ条件が変化する場合、そして使用する
特定の試薬（例えば、ＨＬＡ調製物など）に依存して、（しばしば、劇的に）変
化し得ることに留意する。例えば、過剰濃度のＨＬＡ分子は、所定のリガンドの
見かけの測定されたＩＣ50を増加する。あるいは、結合は、参照ペプチドと関連
して表される。特定のアッセイが、より高感度またはより低感度になるにつれて
、試験するペプチドのＩＣ50は、幾分変化し得るが、参照ペプチドに関連する結
合は、有意には変化しない。例えば、参照ペプチドのＩＣ50が１０倍増加するよ
うな条件下で行うアッセイにおいて、試験ペプチドのＩＣ50値もまた、約１０倍
シフトする。従って、あいまい性を回避するために、ペプチドが良好、中程度、
弱いあるいはネガティブな結合因子であるかの評価は、一般に、標準ペプチドの
ＩＣ50に対する、そのペプチドのＩＣ50に基づく。結合はまた、当該分野におい
て公知の他のアッセイ系を使用して測定され得る。
【００３８】 「カルボキシルあるいはＣ末端」としてのエピトープ中の残基の位置の指定は
、ペプチドのカルボキシル末端に最も近いエピトープの末端の残基の位置をいい
、これは以下に定義したような従来の命名法を使用して指定される。エピトープ
の「Ｃ末端」は、ペプチドあるいはポリペプチドの末端に実際に対応してもよい
し、対応しなくてもよい。
【００３９】 「Ｎ末端」または「アミノの末端の位置」としてのエピトープ中の残基の位置
の指定は、ペプチドのＮ末端に最も近いエピトープの末端の残基の位置をいい、
これは以下に定義したような従来の命名法を使用して指定される。エピトープの
「Ｎ末端」は、ペプチドあるいはポリペプチドの末端に実際に対応してもよいし
、対応しなくてもよい。
【００４０】 「コンピューター」または「コンピューターシステム」は、一般に、以下を備
える：プロセッサー；少なくとも１つの情報記憶／検索装置、例えば、ハードド
ライブ、ディスクドライブまたはテープドライブなど；少なくとも１つの入力装
置、例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーン、またはマイクロホンなど
；およびディスプレイ構造。さらに、コンピューターは、ネットワークと連絡す
る通信チャネルを備え得る。このようなコンピューターは、多かれ少なかれ、上
記に列挙したものを備え得る。
【００４１】 本明細書で使用される場合、「保存性」または「保存的」および「半保存性」
または「半保存的」であるアミノ酸は、調製Ｂに従って定義され、表２に示され
る。
【００４２】 本明細書中で使用される場合、ＨＬＡクラスＩ分子に関する「高い親和性」と
は、５０ｎＭ以下のＩＣ50またはＫD値での結合として定義され；「中程度の親
和性」とは、約５０ｎＭと約５００ｎＭとの間のＩＣ50またはＫD値での結合で
ある。ＨＬＡクラスＩＩ分子への結合に関する「高い親和性」とは、１００ｎＭ
以下のＩＣ50またはＫD値での結合として定義され；「中程度の親和性」とは、
約１００ｎＭと約１０００ｎＭとの間のＩＣ50またはＫD値での結合である。
【００４３】 「免疫原性ペプチド」または「ペプチドエピトープ」とは、そのペプチドがＨ
ＬＡ分子を結合し、そしてＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答を誘導するよう
な、対立遺伝子特異的モチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドである。
従って、本発明の免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ分子に結合し、そしてその
後、免疫原性ペプチドが由来する抗原に対する、細胞傷害性Ｔ細胞応答またはヘ
ルパーＴ細胞応答を誘導し得る。
【００４４】 句「単離された」または「生物学的に純粋」とは、そのネイティブ状態におい
て見い出されるような通常その材料に付随する成分を、実質的または本質的に含
まない材料をいう。従って、本発明に従う単離されたペプチドは、好ましくは、
そのインサイチュ環境下でそのペプチドに通常会合する物質を含まない。
【００４５】 「ＰａｎＤＲ結合ペプチド」は、１つより多くのＨＬＡクラスＩＩＤＲ分子（
例えば、ＰＡＤＲＥTMペプチド、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ、ＣＡ）を結合する分子ファミリーのメンバーである。ＰＡＤＲＥTMファミ
リーの分子を定義するパターンは、ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフとして考
えられ得る。ＰＡＤＲＥTM分子に見い出されたパターンを含むペプチドは、大部
分ＨＬＡ−ＤＲ分子に結合し、インビトロおよびインビボでヒトヘルパーＴリン
パ球（ＨＴＬ）応答を刺激する。
【００４６】 「薬学的に受容可能な」は、一般に、非毒性の、不活性な、および／または生
理学的に適合性の組成物をいう。
【００４７】 （３．本発明のペプチド） 本発明に従うペプチドは、組み換えＤＮＡ技術または化学合成によるか、ある
いは天然腫瘍あるいは病原性生物のような天然源から合成的に調製されうる。ペ
プチドエピトープは、個々にまたはポリエピトープペプチドとして合成され得る
。ペプチドは、好ましくは、他の天然に存在する宿主細胞のタンパク質およびそ
のフラグメントを実質的に有しないが、いくつかの実施形態において、ペプチド
は、天然フラグメントまたは粒子に合成的に結合体化され得る。
【００４８】 ＨＬＡクラスＩペプチドは、当該分野において周知であり、ＭＨＣクラスＩ分
子に結合するペプチドとして定義される。本発明に従うペプチドは、様々な長さ
であり、そしてそれらの中性（非荷電）形態または塩である形態のいずれかであ
り得る。本発明に従うペプチドは、グリコシル化、側鎖酸化、もしくはリン酸化
反応のような修飾を有しないか、またはそれらは修飾が本明細書中に記載される
ようなペプチドの生物学的活性を破壊しない条件を前提としてこれらの修飾を含
むかのいずれかである。
【００４９】 対応する「野生型」として役目を果たすクラスＩエピトープは、任意のタンパ
ク質源に由来し得る。例えば、クラスＩペプチドは、ウイルス性抗原、腫瘍付随
抗原、寄生物抗原、細菌抗原、または真菌抗原由来であり得る。本発明のいくつ
かの好ましい局面において、クラスＩペプチドは、被験体の免疫系が寛容（すな
わち先の抗原に対する曝露により引き起こされる特異的免疫学的非応答性）を発
現する抗原に由来する。
【００５０】 従って、いくつもの潜在的標的エピトープに基するヘテロクリティックアナロ
グは、本発明にて利用され得る。適合した腫瘍付随抗原の例としては、前立腺特
異的抗原（ＰＳＡ）、黒色腫抗原ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧ
Ｅ−１１、ＭＡＧＥ−Ａ１０、並びにＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＭＡＧＥ
−Ｃ１、ＬＡＧＥ−１、ＣＡＧ−３、ＤＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ１８
、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ４、ＢＲＣＡ２、ＮＹ−ＬＵ−１、ＮＹ−ＬＵ−７
、ＮＹ−ＬＵ−１２、ＣＡＳＰ８、ＲＡＳ、ＫＩＡＡ−２−５、ＳＣＣｓ、ｐ５
３、ｐ７３、ＣＥＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、チロシ
ナーゼ、ＴＲＰ２、ｇｐ７５／ＴＲＰ１、カリクレイン、前立腺特異的膜抗原（
ＰＳＭ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）
、ＰＴ１−１、Ｂ−カテニン、ＰＲＡＭＥ、テロメラーゼ、ＦＡＫ、サイクリン
Ｄ１タンパク質、ＮＯＥＹ２、ＥＧＦ−Ｒ、ＳＡＲＴ−１、ＣＡＰＢ、ＨＰＶＥ
７、ｐ１５、葉酸レセプターＣＤＣ２７、ＰＡＧＥ−１、そしてＰＡＧＥ−４が
挙げられる。適合した感染症付随抗原の例としては、Ｂ型肝炎コア抗原および表
面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン−バーウイルス抗
原、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）抗原、そしてヒトパピローマウイルス（
ＨＰＶ）抗原、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよび
Ｃｈｌａｍｙｄｉａが挙げられる。適合する真菌抗原の例としては、Ｃａｎｄｉ
ｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、
Ｃｏｃｃｉｄｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．および
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｉｓに由来する抗原が挙げられる。適
合する原性動物の寄生物抗原の例としては、Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｔｒ
ｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｓｐｐ．、Ｌｅｉｓ
ｈｍａｎｉａ ｓｐｐなどを含む、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐ．由来のもの
が挙げられる。
【００５１】 対応するヘテロクリティックアナログを構築するために本発明の法則が適用さ
れる野生型の配列として用いられ得るエピトープは、任意のクラスＩエピトープ
に対応することが見出され得る。上に記載されるもののような任意の抗原に対し
て、特定のクラスＩ対立遺伝子に付随するモチーフは、このようなエピトープが
備わっている抗原のアミノ酸配列中の位置を決定する指針として利用され得る。
この決定は、視覚的にかまたは好ましくはコンピューター技術および関連のソフ
トウェアを使用して行われ得る。従って、例えば２位のバリンおよびＣ末端のア
ルギニンを含むような、例えばＡ３スーパーモチーフの認識により、要求される
任意の抗原のアミノ酸配列は、このモチーフを保有するエピトープについて調査
され得る。次いで、そのエピトープは、要求されるアナログを獲得するために本
発明に記載される法則に従って修飾され得る。
【００５２】 可能ならば、本発明のＨＬＡクラスＩ結合エピトープを最適化することが所望
され得、例えばこれは、約８から約１３、しばしば８から１１、好ましくは９か
ら１０アミノ酸残基長に対するポリエピトープの構築に利用され得る。好ましく
は、ペプチドエピトープは、内在的に処理される関連するＨＬＡ分子に対して結
合される病原体由来ペプチドまたは腫瘍細胞ペプチドとサイズにおいて同一基準
であるが、本発明のエピトープを含むペプチドの同定および調製は、また、本明
細書に記載された技術を利用して行われ得る。
【００５３】 代替の実施形態において、本発明のエピトープは、ポリエピトープペプチドと
して、または、ポリエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子として関連づけ
られ得る。
【００５４】 別の実施形態において、高濃度のクラスＩエピトープおよび／またはクラスＩ
Ｉエピトープを含む天然のペプチド領域を同定することが好ましい。そのような
配列は、１つのアミノ酸長に対して最大のエピトープ数を含むことを基として通
常選択される。エピトープが、ネスティングされるか、もしくは重なる様式で存
在し得ることは、評価されることであり、例えば、１０アミノ酸長ペプチドは、
２つの９アミノ酸長エピトープならびに１つの１０アミノ酸長エピトープを含み
得た；細胞内のプロセシングにおいて、それぞれのエピトープは、そのようなペ
プチドの投与の際にＨＬＡ分子により曝露および結合されうる。このより大きく
、好ましいマルチ−エピトープのペプチドは、合成的、組換え、あるいは天然素
材からの切断を経て生じ得る。
【００５５】 本発明のペプチドは、広く多様な方法から調製され得る。好ましい比較的短い
サイズに関しては、ペプチドは、従来の技術に従って溶液中あるいは固体支持体
上で合成され得る。種々の自動合成機は、市販されており、公知のプロトコール
に従って使用され得る。（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ、ＳＯＬＩ
Ｄ ＰＨＡＳＥ ＰＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、１９８４年を参照）。さらに、個々のペプチドエ
ピトープは、いまだ本発明の範囲内であるより大きなペプチドを作製するために
化学連結を使用して結合され得る。
【００５６】 あるいは、目的の免疫原性ペプチドをコードするヌクレオチドの配列が、発現
ベクターに挿入され、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、
そして発現のために適切な条件下で培養される、組換えＤＮＡの技術が利用され
得る。これらの製法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９８９）に一般に記載されるように、当該分野において一般的に公
知である。従って、１つ以上の本発明のペプチド配列を含む組換えポリペプチド
は、適切なＴ細胞エピトープを提示するために使用され得る。
【００５７】 本明細書において企図される好ましい長さのペプチドエピトープに対応するヌ
クレオチドがコードする配列は、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１）のホスホトリエステル法のよう
な化学技術により合成され得る。ペプチドアナログは、天然ペプチド配列をコー
ドする核酸塩基を、適切で、また要求される核酸塩基で置換することにより簡単
に作製され得る；典型的な核酸の置換は、本明細書において、モチーフ／スーパ
ーモチーフにより定義されるアミノ酸をコードするものである。次いで、コード
配列は、適切なリンカーに供され、また当該分野において通例利用可能な発現ベ
クター中に連結され得、そしてそのベクターは、要求される融合タンパク質を作
製するために適切な宿主を形質転換するために使用され得る。いくつものそのよ
うなベクターおよび適切な宿主系は現在使用可能である。融合タンパク質の発現
のために、コードする配列は、作動可能に連結される開始および終止コドン、プ
ロモーターおよびターミネータ領域、ならびに通例要求される細胞の宿主での発
現のための発現ベクターを提供する複製系を提供される。例えば、細菌の宿主と
の適合性を持つプロモーター配列は、要求されるコード配列の挿入のための便利
な制限部位を含むプラスミドに提供される。得られる発現ベクターは、適切な細
菌の宿主に形質転換される。もちろん、酵母、昆虫あるいは哺乳動物の細胞の宿
主はまた、適切なベクター、ならびに制御配列を用いて使用され得る。
【００５８】 本発明のアナログは、生じるペプチドの物理的特性（例えば、安定性または溶
解性）を修飾するための置換を含むペプチドが含まれ得る。例えば、ペプチドは
システイン（Ｃ）のα−アミノ酪酸での置換によって修飾され得る。この化学的
特質に起因して、システインはジスルフィド架橋を形成する傾向を有し、そして
結合能力を減らすようにペプチド構造を十分に変化させる。Ｃの代わりにα−ア
ミノ酪酸を用いることは、この問題を緩和させるだけでなく、実際に特定の例に
おいて結合および交差結合能力を改善する。システインをα−アミノ酪酸と置換
することは、ペプチドエピトープの任意の残基で、すなわちアンカー位置または
非アンカー位置のいずれかで起こり得る。
【００５９】 種々のアミノ酸模倣物または非天然のアミノ酸を有する修飾されたペプチドは
特に有用である。なぜならそれらはインビボにおいて増加した安定性を表す傾向
があるからである。このようなアナログはまた、改善された貯蔵寿命または製造
の特性を有し得る。より詳細には、重要ではないアミノ酸はタンパク質中の天然
に存在するアミノ酸（例えばＬ−α−アミノ酸またはそれらのＤ−異性体）に制
限される必要はないが、非天然のアミノ酸、例えばアミノ酸の模倣物（例えばＤ
−ナフチルアラニン（ｎａｐｈｙｌａｌａｎｉｎ）またはＬ−ナフチルアラニン
；Ｄ−フェニルグリシンまたはＬ−フェニルグリシン；Ｄ−２−チエニルアラニ
ン（ｔｈｉｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）またはＬ−２−チエニルアラニン；Ｄ−
１、−２、３−もしくは４−ピレネイルアラニン（ｐｙｒｅｎｅｙｌａｌａｎｉ
ｎ）またはＬ−１、−２、３−もしくは４−ピレネイルアラニン；Ｄ−３−チエ
ニルアラニンまたはＬ−３チエニルアラニン；Ｄ−（２−ピリジニル）−アラニ
ンまたはＬ−（２−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−（３−ピリジニル）−アラニ
ンまたはＬ−（３−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−（２−ピラジニル）−アラニ
ンまたはＬ−（２−ピラジニル）−アラニン；Ｄ−（４−イソプロピル）−フェ
ニルグリシンまたはＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリ
フルオロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニル
アラニン；Ｄ−ρ−フルオロフェニルアラニン；Ｄ−ρ−ビフェニルフェニルア
ラニンまたはＬ−ρ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−ρ−メトキシビフェニ
ルフェニルアラニンまたはＬ−ρ−メトキシビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−
インドール（アルキル）アラニンまたはＬ−２−インドール（アルキル）アラニ
ンおよびＤ−２−アルキルアラニンまたはＬ−アルキルアラニン（ここでアルキ
ル基はメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル
、イソブチル、ｓｅｃ−イソチル、イソ−ペンチルまたは酸性ではないアミノ酸
に置換され得るかまたは置換されない）が挙げられ得る。非天然のアミノ酸の芳
香環として、例えばチアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンジミダゾリル
、ナフチル、フラニル、ピロリル、およびピリジル芳香環が挙げられる。
【００６０】 ペプチドの安定性は多数の方法でアッセイされ得る。例えば、ペプチダーゼお
よびヒト血漿および血清のような種々の生物学的培地は安定性を試験するために
用いられている。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａ
ｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ １１：２９１（１９８６）を参照のこ
と。本発明のペプチドの半減期は２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを用いて簡
便に決定される。そのプルトコールは一般的に以下のようである：プールしたヒ
ト血清（ＡＢ型、熱で不活性化されていない）を使用する前に遠心分離により脱
脂する。次いで血清をＲＰＭＩ−１６４０または別の適切な組織培養培地で２５
％に希釈する。予め決定された時間間隔で、少量の反応溶液が取り出され、そし
て６％のトリクロロ酢酸水溶液（ＴＣＡ）またはエタノールのいずれかを加えら
れる。濁った反応サンプルは４℃に１５分間冷却され、その後スピンして沈殿し
た血清タンパク質をペレットにする。次いでペプチドの存在は安定性特異的なク
ロマトグラフィ条件を用いて逆相ＨＰＬＣによって決定される。
【００６１】 （４．クラスＩモチーフ） 過去数年間で、ＨＬＡクラスＩ分子の巨大な割合が比較的少ないスーパータイ
プに分類され得、それぞれは広く重複するペプチド結合のレパートリーおよび主
なペプチド結合ポケットのコンセンサス構造によって特徴付ける、ということを
実証する証拠が集まってきている。従って本発明のペプチドは、いくつかのＨＬ
Ａ特異的アミノ酸モチーフのうちのいずれか１つによってか（例えば表３〜４を
参照のこと）、またはモチーフの存在がいくつかの対立遺伝子特異的ＨＬＡ抗原
に結合する能力に対応する場合はスーパーモチーフによって同定されている。特
定のアミノ酸スーパーモチーフを有するペプチドに結合するＨＬＡ分子は、集合
的にＨＬＡ「スーパータイプ」という。
【００６２】 読者に便利にするため、以下に記載され表３〜４に要約されるペプチドのモチ
ーフおよびスーパーモチーフは同定のための手引きおよび発明に従うペプチドエ
ピトープの用途を提供する。これは、アナログを構築するための本明細書中に示
される法則を適用するために、以下の実施例に示されるものとは異なる種々のク
ラスＩモチーフに対応する候補野生型エピトープまたは以下に示されるものを保
有するが異なる抗原の中にあるエピトープの同定を可能にする。
【００６３】 ヘテロクリティックアナログは、ペプチドが属するモチーフまたはスーパーモ
チーフに関わり無く、そのペプチドから発明の方法に従って設計され得る。下記
に描いたＨＬＡクラスＩペプチドエピトープのスーパーモチーフおよびモチーフ
の一次アンカー残基を表３に要約する。表３（ａ）で述べたＨＬＡクラスＩモチ
ーフは、ここで主張される本発明に最も著しい関連のモチーフである。ＨＬＡク
ラスＩスーパータイプファミリーを含む対立遺伝子特異的なＨＬＡ分子を表４に
列挙する。いくつかの例において、ペプチドエピトープはモチーフおよびスーパ
ーモチーフの両方に列挙され得る。特定のモチーフとそれぞれのスーパーモチー
フとの関係は、個々のモチーフの説明中に示される。
【００６４】 （ｉ．ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフは、２位おける小さな（ＴまたはＳ）または疎
水性（Ｌ、Ｉ、ＶまたはＭ）の一次アンカー残基のペプチドリガンド中の存在、
そしてエピトープのＣ末端位置における芳香族（Ｙ、ＦまたはＷ）の一次アンカ
ー残基の存在により特徴付けられる。Ａ１スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分
子の対応するファミリー（すなわち、ＨＬＡ−Ａ１スーパータイプ）は、少なく
ともＡ*０１０１、Ａ*２６０１、Ａ*２６０２、Ａ*２５０１、およびＡ*３２０
１を含む（例えば、ＤｉＢｒｉｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：５
９３０，１９９３；ＤｉＢｒｉｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：６
２０，１９９４；Ｋｏｎｄｏ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５：
２４９，１９９７を参照のこと）。Ａ１スーパーファミリーのメンバーであると
推定される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表４に示される。
【００６５】 （ｉｉ．ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ） 対立遺伝子特異的ＨＬＡ−Ａ２．１分子に対する一次アンカーの特異性（例え
ば、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６，１９９１；Ｈｕｎｔ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−１２６３，１９９２；Ｐａｒｋｅｒら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−３５８７，１９９２；Ｒｕｐｐｅｒ
ｔら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７，１９９３を参照のこと）およびＨＬＡ
−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２８分子の間での交差反応性結合が記載される（例えば
、関連データの総説については、Ｆｒｕｃｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．
３８：１８７−１９２，１９９３；Ｔａｎｉｇａｋｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．３９：１５５−１６２，１９９４；Ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５−６９３，１９９５；Ｋａｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１５２：３９０４−３９１２，１９９４を参照のこと）。これらの一次
アンカー残基は、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフを規定し；ペプチドリガンド中
の存在は、いくつかの異なるＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２８分子を結合する
能力に対応する。ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフは、２位に一次アンカー残基と
してＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＱを有するペプチドリガンド、およびエピト
ープのＣ末端位置に一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＴを有す
るペプチドリガンドを含む。
【００６６】 ＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、これらのペプチドを結合するＨ
ＬＡ−Ａ２スーパータイプ）は、少なくとも以下を含む：Ａ*０２０１、Ａ*０２
０２、Ａ*０２０３、Ａ*０２０４、Ａ*０２０５、Ａ*０２０６、Ａ*０２０７、
Ａ*０２０９、Ａ*０２１４、Ａ*６８０２およびＡ*６９０１。Ａ２スーパーファ
ミリーのメンバーであると推定される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表４
に示される。
【００６７】 （ｉｉｉ．ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフは、２位における一次アンカーとしてのＡ、Ｌ
、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳまたはＴのペプチドリガンド中の存在、そしてエピトープのＣ
末端位置における（例えば、９マーの９位に）正に荷電した残基ＲまたはＫの存
在により特徴付けられる（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
４５：７９，１９９６を参照のこと）。Ａ３スーパーモチーフを結合するＨＬＡ
分子の対応するファミリー（ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ）の例示的メンバーと
しては、少なくとも：Ａ*０３０１、Ａ*１１０１、Ａ*３１０１、Ａ*３３０１お
よびＡ*６８０１が挙げられる。Ａ３スーパータイプのメンバーであると推定さ
れる他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表３に示される。
【００６８】 （ｉｖ．ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフは、２位における一次アンカーとして芳香族
残基（Ｆ、Ｗ、またはＹ）または疎水性脂肪族残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、またはＴ
）がペプチドリガンド中に存在し、そしてエピトープのＣ末端位置に一次アンカ
ーとしてのＹ、Ｆ、Ｗ、Ｌ、ＩまたはＭの存在により特徴付けられる（例えば、
ＳｅｔｔｅおよびＳｉｄｎｅｙ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（印刷中）１９
９９を参照のこと）。Ａ２４スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子の対応する
ファミリー（すなわち、Ａ２４スーパータイプ）としては、少なくともＡ*２４
０２、Ａ*３００１およびＡ*２３０１が挙げられる。Ａ２４スーパータイプのメ
ンバーであると推定される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表３に示される
。
【００６９】 （ｖ．ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフは、一次アンカーとして２位にプロリンを有す
るペプチド、およびエピトープのＣ末端位置における一次アンカーとして疎水性
アミノ酸または脂肪族アミノ酸（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｆ、Ｗ、またはＹ）によ
り特徴付けられる。Ｂ７スーパーモチーフを結合するＨＬＡ分子の対応するファ
ミリー（すなわち、ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプ）は、少なくとも２６のＨＬＡ
−Ｂタンパク質を含み、これらとしては以下が挙げられる：Ｂ*０７０２、Ｂ*０
７０３、Ｂ*０７０４、Ｂ*０７０５、Ｂ*１５０８、Ｂ*３５０１、Ｂ*３５０２
、Ｂ*３５０３、Ｂ*３５０４、Ｂ*３５０５、Ｂ*３５０６、Ｂ*３５０７、Ｂ*３
５０８、Ｂ*５１０１、Ｂ*５１０２、Ｂ*５１０３、Ｂ*５１０４、Ｂ*５１０５
、Ｂ*５３０１、Ｂ*５４０１、Ｂ*５５０１、Ｂ*５５０２、Ｂ*５６０１、Ｂ*５
６０２、Ｂ*６７０１、およびＢ*７８０１（例えば、関連データの総説について
は、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２４７，１９９５；Ｂａｒ
ｂｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：１７９，１９９５；Ｈｉｌｌら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３６０：４３４，１９９２；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ ４１：１７８，１９９５を参照のこと）。Ｂ７スーパータイプのメ
ンバーであると推定される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表３に示される
。
【００７０】 （ｖｉ．ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフは、２位における一次アンカーとしての正に
荷電した残基（Ｒ、Ｈ、またはＫ）のペプチドリガンド中の存在、そしてエピト
ープのＣ末端位置における一次アンカーとして疎水性残基（Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｗ、Ｍ
、Ｉ、Ａ、またはＶ）の存在により特徴付けられる（例えば、Ｓｉｄｎｅｙおよ
びＳｅｔｔｅ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（印刷中）１９９９を参照のこと
）。Ｂ２７スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（すな
わち、Ｂ２７スーパータイプ）の例示的なメンバーとしては、少なくとも：Ｂ*
１４０１、Ｂ*１４０２、Ｂ*１５０９、Ｂ*２７０２、Ｂ*２７０３、Ｂ*２７０
４、Ｂ*２７０５、Ｂ*２７０６、Ｂ*３８０１、Ｂ*３９０１、Ｂ*３９０２、お
よびＢ*７３０１が挙げられる。Ｂ２７スーパータイプのメンバーであると推定
される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表３に示される。
【００７１】 （ｖｉｉ．ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフは、２位における一次アンカーとしての負に
荷電した残基（ＤまたはＥ）のペプチドリガンド中の存在、そしてエピトープの
Ｃ末端位置における一次アンカーとしての疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｍ
、Ｖ、またはＡ）の存在により特徴付けられる（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：２６１，１９９６参照のこと）。Ｂ４４スーパ
ーモチーフに結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、Ｂ４４スー
パータイプ）の例示的なメンバーとしては、少なくとも以下が挙げられる：Ｂ*
１８０１、Ｂ*１８０２、Ｂ*３７０１、Ｂ*４００１、Ｂ*４００２、Ｂ*４００
６、Ｂ*４４０２、Ｂ*４４０３、およびＢ*４００６。
【００７２】 （ｖｉｉｉ．ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフは、２位での一次アンカー残基としての小さ
な脂肪族残基（Ａ、Ｓ、またはＴ）のペプチドリガンド中の存在、およびエピト
ープのＣ末端位置における一次アンカー残基としての芳香族または疎水性の残基
（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、またはＡ）の存在によって、特徴付けられる（
例えば、関連するデータの総説についてはＳｉｄｎｅｙおよびＳｅｔｔｅ，Ｉｍ
ｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，印刷中、１９９９を参照のこと）。Ｂ５８スーパー
モチーフに結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、Ｂ５８スーパ
ータイプ）の例示的なメンバーとしては、少なくとも以下が挙げられる：Ｂ*１
５１６、Ｂ*１５１７、Ｂ*５７０１、Ｂ*５７０２、およびＢ*５８０１。Ｂ５８
スーパータイプのメンバーであると推定される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子
は、表３に示される。
【００７３】 （ｉｘ．ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフは、２位での一次アンカーとしての極性脂肪
族残基Ｑまたは疎水性脂肪族残基（Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｉ、またはＰ）のペプチドリガ
ンド中の存在、およびエピトープのＣ末端位置における一次アンカーとして疎水
性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、またはＡ）の存在によって、特徴付けら
れる（例えば、ＳｉｄｎｅｙおよびＳｅｔｔｅ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ
，印刷中、１９９９を参照のこと）。Ｂ６２スーパーモチーフに結合するＨＬＡ
分子の対応するファミリー（すなわち、Ｂ６２スーパータイプ）の例示的なメン
バーとしては、少なくとも以下が挙げられる：Ｂ*１５０１、Ｂ*１５０２、Ｂ*
１５１３、およびＢ５２０１。Ｂ６２スーパータイプのメンバーであると推定さ
れる他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表３に示される。
【００７４】 （ｘ．ＨＬＡ−Ａ１モチーフ） ＨＬＡ−Ａ１モチーフは、２位での一次アンカー残基としてのＴ、Ｓ、または
Ｍのペプチドリガンド中の存在、およびエピトープのＣ末端位置における一次ア
ンカー残基としてのＹの存在によって、特徴付けられる。代替の対立遺伝子特異
的Ａ１モチーフは、２位よりむしろ３位における、一次アンカー残基によって特
徴付けられる。このモチーフは、Ｄ、Ｅ、Ａ、またはＳの一次アンカー残基とし
ての３位における存在、および、エピトープのＣ末端位置における一次アンカー
残基としてのＹの存在によって、特徴付けられる（例えば、関連するデータの総
説については、ＤｉＢｒｉｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：６２０、１
９９４；Ｋｏｎｄｏら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５：２４９、１９９
７；およびＫｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３、１９９４を参
照のこと）。
【００７５】 （ｘｉ．ＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフ） ＨＬＡ−Ａ２*０２０１モチーフは、２位での一次アンカー残基としての、Ｌ
またはＭのペプチドリガンドにおける存在、およびＬまたはＶの９残基ペプチド
のＣ末端位置での一次アンカー残基としての存在によって特徴付けられることが
決定され（例えば、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６、１９
９１を参照のこと）、そしてさらに、９アミノ酸ペプチドの２位にＩを含み、そ
してＣ末端位置にＩまたはＡを含むことが、見出された（例えば、Ｈｕｎｔら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−１２６３、３月６日、１９９２；Ｐａｒｋ
ｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−３５８７、１９９２を参照の
こと）。Ａ*０２０１対立遺伝子特異的モチーフはまた、本発明者らによって、
さらにＶ、Ａ、Ｔ、またはＱを、一次アンカー残基としてこのエピトープの２位
に含み、そしてＭまたはＴを、一次アンカー残基としてこのエピトープのＣ末端
位置に含むことが規定された（例えば、Ｋａｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５
２：３９０４−３９１２、１９９４を参照のこと）。従って、ＨＬＡ−Ａ*０２
０１モチーフは、２位に一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｔ、また
はＱを有し、そしてこのエピトープのＣ末端位置に一次アンカー残基としてＬ、
Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＴを有する、ペプチドリガンドを含む。ＨＬＡ−Ａ*０
２０１モチーフの一次アンカー位置を特徴付ける、好ましい許容される残基は、
Ａ２スーパーモチーフを記載する残基と同一である。
【００７６】 （ｘｉｉ．ＨＬＡ−Ａ３モチーフ） ＨＬＡ−Ａ３モチーフは、２位での一次アンカー残基としてのＬ、Ｍ、Ｖ、Ｉ
、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｃ、Ｇ、またはＤのペプチドリガンドにおける存在、および
エピトープのＣ末端位置における一次アンカー残基としてのＫ、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｆ
、またはＡの、存在によって、特徴付けられる（例えば、ＤｉＢｒｉｎｏら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１５０８、１９９３；お
よびＫｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３−３９２４、１９９４
を参照のこと）。
【００７７】 （ｘｉｉｉ．ＨＬＡ−Ａ１１モチーフ） ＨＬＡ−Ａ１１モチーフは、２位での一次アンカー残基としてのＶ、Ｔ、Ｍ、
Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、またはＦのペプチドリガンド中の存在、およ
びエピトープのＣ末端位置における一次アンカー残基としてのＫ、Ｒ、Ｙ、また
はＨの存在によって、特徴付けられる（例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２２１７−２２２１、１９９３；およ
びＫｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３−３９２４、１９９４を
参照のこと）。
【００７８】 （ｘｉｖ．ＨＬＡ−Ａ２４モチーフ） ＨＬＡ−Ａ２４モチーフは、２位での一次アンカー残基としてのＹ、Ｆ、Ｗ、
またはＭのペプチドリガンド中の存在、およびエピトープのＣ末端位置における
一次アンカー残基としてのＦ、Ｌ、Ｉ、またはＷの存在によって、特徴付けられ
る（例えば、Ｋｏｎｄｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７−４３１２
、１９９５；およびＫｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３−３９
２４、１９９４を参照のこと）。
【００７９】 （５．Ｔ細胞応答を検出するためのアッセイ） 一旦、本発明のヘテロクリティックアナログが合成されると、それらは、Ｔ細
胞応答を誘発する能力について試験され得る。モチーフ保有ペプチド（例えば、
ヘテロクリティックアナログ）の調製および評価は、ＰＣＴ公報ＷＯ９４／２０
１２７およびＷＯ９４／０３２０５に記載される。簡単に述べると、特定の抗原
由来のエピトープを含むペプチドが合成され、適切なＨＬＡタンパク質に結合す
るそれらの能力について試験される。これらのアッセイは、放射性ヨウ素標識し
た参照ペプチドの結合に関して、精製されるＨＬＡクラスＩ分子への本発明のペ
プチドの結合を評価する工程を包含し得る。あるいは、空のクラスＩ分子を発現
する細胞（すなわち、その中にペプチドを含まない）は、免疫蛍光染色およびフ
ローマイクロ蛍光定量法によってペプチド結合について評価され得る。ペプチド
結合を評価するために使用され得る他のアッセイは、ペプチド依存クラスＩアセ
ンブリアッセイおよび／またはペプチド競合によるＣＴＬ認識の阻害を含む。代
表的に、５００ｎＭ以下の親和性でクラスＩ分子に結合するそれらのペプチドは
、感染された個体または免疫化された個体から誘導体化されたＣＴＬに対する標
的として作用する能力について、および、疾患に関連する選択された標的細胞と
反応し得るＣＴＬ集団を引き起こし得る一次インビトロＣＴＬ応答または一次イ
ンビボＣＴＬ応答を誘発する能力について、さらに評価される。
【００８０】 Ｔ細胞応答を検出するために使用される従来のアッセイとしては、増殖アッセ
イ、リンホカイン分泌アッセイ、直接細胞傷害性アッセイ、および限界希釈アッ
セイが挙げられる。このようなアッセイは、ヘテロクリティックアナログのペプ
チドによる免疫応答の誘導を、非ヘテロクリティックアナログのクラスＩペプチ
ド（例えば、ここからヘテロクリティックアナログ配列が基礎にされた）により
誘導される応答と比較する際に有用である。例えば、ペプチドを用いてインキュ
ベートされた抗原提示細胞は、応答細胞集団（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ ｃｅｌｌ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）においてＣＴＬ応答を誘導する能力についてアッセイさ
れ得る。抗原提示細胞は、末梢血単核細胞または樹状細胞のような正常細胞であ
り得る。あるいは、内部的にプロセスされたペプチドを有するクラスＩ分子を装
填するそれらの能力が欠乏し、そして適切なヒトクラスＩ遺伝子でトランスフェ
クトされた変異体非ヒト哺乳動物細胞株が、インビトロで一次ＣＴＬ応答を誘発
するペプチドの能力について試験するために使用され得る。
【００８１】 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＣＴＬ前躯体の応答細胞源として使用され得
る。適切な抗原提示細胞は、ペプチドと共にインキュベートされ、次いでこの後
、ペプチド装填した抗原提示細胞が、最適な培養条件下で応答細胞集団と共にイ
ンキュベートされる。陽性ＣＴＬ活性化は、放射性標識した標的細胞（特定のペ
プチドをパルスされた標的およびペプチド配列が誘導される内因的にプロセスさ
れた形態の抗原を発現する標的細胞）を殺傷するＣＴＬの存在について培養物を
アッセイすることによって決定され得る。
【００８２】 さらに、フルオレセイン標識したＨＬＡ四量体複合体で染色することによって
抗原特異的Ｔ細胞の直接的定量を可能にする方法が、もたらされた（Ａｌｔｍａ
ｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０
３３０、１９９３；Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４
，１９９６）。他の比較的最近の技術的開発としては、細胞内リンホカインの染
色、およびインターフェロン−γ放出アッセイまたはＥｌｉｓｐｏｔアッセイが
挙げられる。四量体染色、細胞内リンホカイン染色およびＥｌｉｓｐｏｔアッセ
イは全て、さらなる従来のアッセイより少なくとも１０倍より感度が高いようで
ある（Ｌａｌｖａｎｉ，Ａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９、１９９７
；Ｄｕｎｂａｒ、Ｐ．Ｒ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：４１３、１９９８；Ｍ
ｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：１７７、１９９
８）。
【００８３】 所望される場合、ＨＴＬの活性化はまた、当該分野で公知の技術（例えば、Ｔ
細胞増殖およびリンホカイン（例えば、ＩＬ−２）の分泌）を使用して評価され
得る（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１〜７６１
、１９９４を参照のこと）。
【００８４】 あるいは、ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫化は、ペプチドエピトープ
の免疫原性を決定するために使用され得る。いくつかのトランスジェニックマウ
スモデル（ヒトＡ２．１、Ａ１１（これはＨＬＡ−Ａ３エピトープを分析するた
めにさらに使用され得る）、およびＢ７対立遺伝子を有するマウスを含む）が特
徴付けられ、そして他のマウス（例えば、ＨＬＡ−Ａ１およびＡ２４に対するト
ランスジェニックマウス）が開発されている。ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−Ｄ
Ｒ３マウスモデルもまた開発されている。他のＨＬＡ対立遺伝子を有するさらな
るトランスジェニックマウスモデルが、必要な場合作製され得る。マウスは、不
完全フロイトアジュバント中の乳化したペプチドで免疫化され得、そして得られ
るＴ細胞は、ペプチドをパルスされた標的細胞および適切な遺伝子でトランスフ
ェクトされた標的細胞を認識するそれらの能力について試験される。ＣＴＬ応答
は、上記の細胞傷害性アッセイを使用して分析され得る。同様に、ＨＴＬ応答は
、Ｔ細胞増殖またはリンホカインの分泌のようなアッセイを使用して分析され得
る。
【００８５】 本発明のヘテロクリティックアナログは、しばしばＴｈ１サイトカイン応答お
よびＴｈ２サイトカイン応答の両方を誘導する。それゆえ、ヘテロクリティック
な候補物を予め選択されたクラスＩペプチドと比較するための１つの方法は、Ｔ
ｈ１サイトカインおよびＴｈ２サイトカインの誘導を試験するための方法である
。予め選抜したクラスＩペプチドは、代表的にヘテロクリティックアナログに誘
導されるペプチド、または、そのようなペプチドが存在しない場合は候補物に対
して最も高い類似性を有するクラスＩペプチドである。本発明のヘテロクリティ
ックアナログは、代表的にＴｈ１サイトカイン応答およびＴｈ２サイトカイン応
答の両方を誘導するが、これはアナログが誘導されたクラス１ペプチドに比較し
て非常に増強されたレベルにおいてである。例えば、所定のヘテロクリティック
アナログは、等しいレベルのＴｈ１サイトカインまたはＴｈ２サイトカイン（５
０〜１００ｐｇ／ｍｌ）を、このアナログが誘導された野生型ペプチドと比較し
て１０倍以下の用量で刺激する。さらに、クラスＩペプチドがＴｈ１応答または
Ｔｈ２応答のどちらかのみ、またはいずれかを主に誘導する場合、ヘテロクリテ
ィックアナログはＴｈ１応答およびＴｈ２応答の両方を誘導し得る。Ｔｈ１サイ
トカインとしては、例えばＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＩＬ３が挙げられる。Ｔｈ
２サイトカインとしては、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１
０が挙げられる。サイトカインの産生は、例えばＥＬＩＳＡ法または他の免疫学
的定量法を用いて測定される。（例えば、ＭｃＫｉｎｎｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３７：１０５〜１１
７、２０００を参照のこと） （６．診断薬としておよび免疫応答を評価するためのペプチドエピトープの使
用） 本発明の一実施形態において、本明細書中に記載されるようなヘテロクリティ
ックアナログペプチドが、免疫応答を評価するための試薬として使用される。評
価される免疫応答は、免疫原として任意の因子を使用することによって、誘導さ
れ、この因子は、試薬として用いられるペプチドエピトープを認識し、そしてこ
れに結合する抗原特異性ＣＴＬまたはＨＴＬの誘導を生成し得る。ペプチド試薬
は、免疫原として使用される必要はない。このような分析のために使用され得る
アッセイシステムとしては、比較的最近の技術開発（例えば、細胞内リンホカイ
ンに関する四量体染色およびインターフェロン放出アッセイ、またはＥｌｉｓｐ
ｏｔアッセイ）が挙げられる。
【００８６】 例えば、本発明のペプチドは、腫瘍細胞抗原または免疫原の曝露後の抗原特異
的ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価するために、四量体染色アッセイ
において使用される。ＨＬＡ四量体複合体を使用して、抗原特異性ＣＴＬを直接
可視化し（例えば、Ｏｇｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：２１０３〜２１０６、
１９９８；およびＡｌｔｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １７４：９４〜９６、１９
９６を参照のこと）、そして末梢血単核細胞のサンプル中の抗原特異的ＣＴＬ集
団の頻度を決定する。本発明のペプチドを使用する四量体試薬は、以下のように
生成され得る：ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、三分子複合体を生成するため
に、対応するＨＬＡ重鎖およびβ2−ミクログロブリンの存在下で再折り畳まれ
る。この複合体は、先にタンパク質中の操作された部位において重鎖のカルボキ
シル末端でビオチン化される。四量体形成は、次いで、ストレプトアビジンの付
加によって誘導される。蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて、抗原特異
的細胞を染色するために四量体が使用され得る。これらの細胞は、次いで、例え
ば、フローサイトメトリーによって同定され得る。このような分析は、診断目的
または予後目的のために使用され得る。この手順によって同定された細胞はまた
、治療目的のために使用され得る。
【００８７】 本発明のペプチドはまた、免疫リコール応答を評価するための試薬として使用
される（例えば、Ｂｅｒｔｏｎｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５
０３〜５１３、１９９７、およびＰｅｎｎａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：
１５６５〜１５７０、１９９１を参照のこと）。例えば、癌を有する個体由来の
患者のＰＢＭＣサンプルは、特定のペプチドを使用して、抗原特異的ＣＴＬまた
はＨＴＬの存在について分析され得る。単核細胞を含む血液サンプルは、ＰＢＭ
Ｃを培養し、そして本発明のペプチドでその細胞を刺激することによって評価さ
れ得る。適切な培養期間の後、拡大された細胞集団は、例えば、ＣＴＬまたはＨ
ＴＬ活性について分析され得る。
【００８８】 ペプチドはまた、ワクチンの効力を評価するための試薬として使用される。免
疫原をワクチン接種された患者から得たＰＢＭＣは、例えば、上記の方法のいず
れかを使用して分析され得る。患者は、ＨＬＡ型であり、そしてその患者に存在
する対立遺伝子特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬が、分析のために
選択される。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣサンプル中のエピトープ特異的Ｃ
ＴＬおよび／またはＨＴＬの存在によって示される。
【００８９】 本発明のペプチドはまた、当該分野で周知の技術を使用して、抗体を作製する
ために使用され（例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭ
ＵＮＯＬＯＧＹ、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ＮＹ；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａ
ｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ、１９８９を参照のこと）、これは癌を診断またはモニターするための試薬
として有用であり得る。このような抗体としては、ＨＬＡ分子の状況においてペ
プチドを認識する抗体（すなわち、ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体）が
挙げられる。
【００９０】 （７．ワクチン組成物） 免疫学的に有効な量の本明細書中に述べるような１つ以上のペプチドを含むワ
クチンおよびそのワクチンを準備する方法は、本発明のさらなる実施形態である
。一旦、適切な免疫原性エピトープが規定されると、それらは様々な手段により
分類され送達され得るが、本明細書中ではこれらを「ワクチン」組成物と呼ぶ。
このようなワクチン組成物は、例えば以下のようなものが挙げられる：リポペプ
チド（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏ、Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５
：３４１，１９９５）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ
」）ミクロスフィアに封入されたペプチド組成物（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅら
、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２８７−２９４，１９９１：Ａｌｏｎｓ
ｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ １２：２９９−３０６，１９９４；Ｊｏｎｅｓら、Ｖａ
ｃｃｉｎｅ １３：６７５−６８１，１９９５）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ
Ｓ）により包まれたペプチド組成物（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｎａｔｕ
ｒｅ， ３４４：８７３−８７５，１９９０；Ｈｕら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１１３：２３５−２４３，１９９８）、多抗原ペプチドシステム（
ＭＡＰｓ）（例えば、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８５：５４０９−５４１３，１９８８；Ｔａｍ、Ｊ．Ｐ．，Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９６：１７−３２，１９９６）、多価のペ
プチドとして処方されるペプチド；銃式送達システム（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｄ
ｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）に処方されるペプチド、代表的には結晶化され
たペプチド、ウイルス送達ベクター（Ｐｅｒｋｕｓ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｉｎ：Ｃｏｎ
ｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎ
，Ｓ．Ｈ．Ｅ．，編 ｐ．３７９，１９９６；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．ら
、Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５３５，１９８６、Ｈｕ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ
３２０：５３７，１９８６；Ｋｉｎｅｙ，Ｍ．−Ｐ．ら、ＡＩＤＳ Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：７９０，１９８６；Ｔｏｐ，Ｆ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １２４：１４８，１９７１；Ｃｈａｎｄａ，Ｐ．Ｋ．ら、
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７５；５３５，１９９０），ウイルス性もしくは合成起源
の粒子（例えば、Ｋｏｆｌｅｒ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
１９２：２５，１９９６；Ｅｌｄｒｉｄｇｅ、Ｊ．Ｈ．ら、Ｓｅｍ．Ｈｅｍａ
ｔｏｌ．３０：１６，１９９３；Ｆａｌｏ，Ｌ．Ｄ．，Ｊｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ
Ｍｅｄ．７：６４９，１９９５）、アジュバント（Ｗａｒｒｅｎ，Ｈ．Ｓ．，
Ｖｏｇｅｌ，Ｆ．Ｒ．および Ｃｈｅｄｉｄ，Ｌ．Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．４：３６９，１９８６；Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ
１１：２９３，１９９３）、リポソーム（Ｒｅｄｄｙ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１４８：１５８５，１９９２；Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｔｏｄａｙ １７：１３１，１９９６）、あるいは裸または粒子吸着されたｃＤ
ＮＡ（Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５，１９９３
；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｈｕｎｔ，Ｌ．Ａ．，およびＷｅｂｓｔｅｒ，
Ｒ．Ｇ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １１：９５７，１９９３；Ｓｈｉｖｅｒ，Ｊ．Ｗ．
ら、Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｋ
ａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．編、ｐ．４２３，１９９６；Ｃｅａｓｅ， Ｋ．
Ｂ．，およびＢｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ａ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１２：９２３，１９９４ および Ｅｌｄｒｉｄｇｅ， Ｊ． Ｈ． ら、
Ｓｅｍ． Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３）。Ａｖａｎｔ Ｉｍｍｕｎ
ｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ（Ｎｅｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅ
ｔｔｓ）の技術のようなレセプター媒介標的化（ｒｅｃｅｐｔｅｒ ｍｅｄｉａ
ｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）として公知の毒素標的とする送達技術もまた使用
され得る。
【００９１】 本発明のワクチンは核酸が介在する様式を含む。一つ以上の本発明のペプチド
をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡはまた患者に投与され得る。このアプロー
チは、例えば、Ｗｏｌｆｆ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５ （１９９
０）ならびに米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同
第５，８０４，５６６号；同第５，７３９，１１８号；同第５，７３６，５２４
号；同第５，６７９，６４７号；ＷＯ ９８／０４７２０に記載され、さらに詳
細は以下に記載される。ＤＮＡに基づく送達技術の例としては、「裸のＤＮＡ」
、促進（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド介在）送達、陽イオン性液体複合体
、粒子媒介（「遺伝子銃」）もしくは圧力媒介送達（例えば米国特許第５，９２
２，６８７号を参照のこと）が挙げられる。
【００９２】 治療的または予防的免疫処置の目的で、本発明のペプチドはまた、ウイルスベ
クターまたは細菌ベクターによって発現され得る。発現ベクターの例としては、
痘疹や鶏痘などの弱毒化したウイルス宿主が挙げられる。このアプローチの例の
ように、ワクシニアウイルスは本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列
を発現するベクターとして使用される。腫瘍を保有する宿主に導入する際、組換
え型ワクシニアウイルスは免疫原性のペプチドを発現し、それによってＣＴＬお
よび／またはＨＴＬを誘発する。ワクシニアベクターおよび免疫処置プロコトル
において有用な方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されてい
る。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉ
ｎ）である。ＢＣＧベクターについてはＳｔｏｖｅｒ ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５
１：４５６−４６０（１９９１）に記載されている。アデノウイルスベクターお
よびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｔｙｐｈｉベクター、無毒化した炭疽毒素ベクターなど発明のペプチドの
治療的投与または免疫処置に有用な幅広い種々の他のベクターは、本明細書中の
記載から当業者にとっては明白である。
【００９３】 さらに、本発明に従ったワクチンは、一つ以上の特許請求されるペプチドの組
成物を包含する。ペプチドは個々にワクチン中に存在し得る。あるいは、このペ
プチドは同一のペプチドの複数のコピーから構成されるホモポリマーまたは様々
なペプチドのヘテロポリマーとして存在し得る。ポリマーは免疫反応を増大する
という利点を有し、そしてこのポリマーをつくるために異種のペプチドエピトー
プが使われる場合、免疫応答の標的となる病原体生物または腫瘍関連ペプチドの
異なる抗原性決定因子と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導する更なる能
力という利点を持つ。本組成物は抗原の天然に存在する領域であり得るか、ある
いは例えば組換えまたは化学合成によって調製され得る。
【００９４】 本発明のワクチンとともに使われる担体は当該分野において周知であり、例え
ば、サイログロブリン、ヒト血清アルブミンのようなアルブミン、破傷風トキソ
イド、ポリＬ−ロイシン、ポリＬ−グルタミン酸のようなポリアミノ酸、インフ
ルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などが挙げられる。本ワクチンは水
または食塩水、好ましくはリン酸緩衝化食塩水のような生理学的に耐性な（すな
わち、受容されうる）希釈剤を含み得る。本ワクチンは、代表的なものにまたア
ジュバントを含む。フロイントの不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水
酸化アルミニウム、またはミョウバンのようなアジュバントは当該分野で周知の
材料例である。加えて、本明細書中で開示したように、ＣＴＬ応答はトリパルミ
トイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ3ＣＳＳ）のような本
発明のペプチドの脂質への結合によって開始され得る。
【００９５】 本発明に従ってペプチド組成物を用いて免疫処置を行う際、注入的、エアロゾ
ル的、経口的、経皮的、経粘膜的、胸膜内腔的、クモ膜下腔的、またはその他の
適切な経路を介して、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な多量のＣＴＬおよ
び／またはＨＴＬを産生することにより本ワクチンに応答する。結果として、宿
主はその後の感染に対して少なくとも部分的に免疫されるか、または現在進行中
の慢性的な感染が進展することに対して少なくとも部分的に耐性をもつか、ある
いは抗原が腫瘍関連の場合は少なくとも治療的利益を導き出す。
【００９６】 いくつかの実施形態において、本発明のヘテロクリティックアナログペプチド
を、中和抗体およびまたはヘルパーＴ細胞の興味ある標的抗原に対する応答を誘
導するか、あるいは促進する成分と結合することは望ましいことであり得る。こ
のような組成物の好ましい実施形態は本発明に従って、クラスＩエピトープとク
ラスＩＩエピトープを包含する。このような組成物の代替の実施形態は、ＰＡＤ
ＲＥTM（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）分子（例えば、米国特
許第５，７３６，１４２号に記載されている）のようなｐａｎ−ＤＲ結合ペプチ
ドに加え、本発明に従ったクラスＩエピトープおよび／またはクラスＩＩエピト
ープを包含する。
【００９７】 本発明のワクチンはまた、樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）
を本発明のペプチドを提供するための媒体として包含する。ワクチン組成物は樹
状細胞の動員および採取につづいてインビトロでつくられ得、これによって樹状
細胞の負荷がインビトロで生じる。例えば、樹状細胞は例えば、本発明に従った
ミニ遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）を伴ってトランスフェクションされるかまたは
ペプチドとともにパルスされる。それから、樹状細胞は、インビボで免疫応答を
誘発するために患者に投与され得る。
【００９８】 ＤＮＡまたはペプチドのいずれかに基づくワクチン組成物は、また樹状細胞の
動員と組み合わせてインビボに投与され得、これによって樹状細胞の負荷がイン
ビボで生じる。
【００９９】 抗原性のペプチドは同様にエキソビボでＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を誘
発するために用いられる。結果として生じるＣＴＬまたはＨＴＬ細胞は、他の従
来の治療形式では応答しないか、あるいは本発明の治療的なワクチンペプチドま
たは核酸に応答しない患者の腫瘍を処置するのに使われ得る。エキソビボでのあ
る特定の腫瘍関連する抗原に対するＣＴＬまたはＨＴＬ応答は、患者または遺伝
的に適合性のあるＣＴＬもしくはＨＴＬ前駆細胞を樹状細胞のような抗原提示細
胞の供給源と適切な免疫原性のペプチドとともに組織培養中でインキュベートす
ることにより誘導される。適切なインキュベーション時間（代表的には約７〜２
８日）経過後、この期間中この前駆細胞は活性化され効果細胞へと発展するが、
この細胞は患者に再注入され、ここでこれらは特定の標的細胞（感染した細胞ま
たは腫瘍細胞）を破壊するか（ＣＴＬ）またはその破壊の促進を行う（ＨＴＬ）
。トランスフェクションされた樹状細胞はまた抗原提示細胞として使われ得る。
【０１００】 本発明のワクチン組成物は、またＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦなどの
ような免疫アジュバントと組み合わせる使用法を含む、癌に対する他の処置と組
み合わせて使用され得る。
【０１０１】 好ましくは、ワクチンの用途でポリエピトープ組成物においてアレイのエピト
ープを封入のために選択する場合に、またはワクチンに取り込むため、および／
またはミニ遺伝子のように核酸にコードされるために別個のエピトープを選択す
る場合、次の原則が利用される。選択を行うために、以下の原則のそれぞれのバ
ランスを保つことが好ましい。所定のワクチン組成物に組み込まれた複数のエピ
トープは、エピトープが誘導される天然の抗原の配列と隣接し得るが、しかしな
がらこれは隣接する必要はない。
【０１０２】 １）投与されると、腫瘍クリアランスに相関することが観察された免疫応答を
模倣するエピトープが選択される。ＨＬＡ Ｉ型について、これは少なくとも１
つの腫瘍関連抗原（ＴＴＡ）に由来する３〜４個のエピトープを含む。ＨＬＡ
ＩＩ型について、類似の原理が採用される；再び、３〜４個のエピトープは、少
なくとも１つのＴＴＡから選択される（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７８：１４４７〜１４５０を参照のこと）。一つのＴＡＡからのエ
ピトープは一つ以上のさらなるＴＡＡからのエピトープとの組み合わせで使用さ
れ得、頻出発現ＴＡＡ（ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ＴＡＡ）
の様々な発現パターンを持つ腫瘍を標的とするワクチンを産生する。
【０１０３】 ２）免疫原性と相関することが確立された必須結合親和性を有するエピトープ
が選択される：ＨＬＡ Ｉ型は、５００ｎＭ以下しばしば２００ｎＭ以下のＩＣ 50 を有し、ＩＩ型については、１０００ｎＭ以下のＩＣ50を有する。
【０１０４】 ３）十分なスーパーモチーフ保有ペプチドまたは対立遺伝子特異的モチーフ保
有ペプチドの十分なアレイは、広い集団適用範囲を与えるように選択される。例
えば、少なくとも８０％の集団適用範囲を有することが好ましい。モンテカルロ
解析（当該分野で公知の統計的評価）を使用して、集団適用範囲の広さまたは冗
長性を評価し得る。
【０１０５】 ４）癌関連性抗原からエピトープを選択する場合、患者は天然のエピトープに
対して寛容性を発達し得ているため、アナログを選択することがしばしば有用で
ある。感染疾患関連性抗原についてエピトープを選択する場合、天然のエピトー
プまたはアナログのエピトープのいずれかを選択することが好ましい。
【０１０６】 ５）「入れ子状（ｎｅｓｔｅｄ）エピトープ」と称されるエピトープは特定の
関連性を有する。少なくとも２つのエピトープが所定のペプチド配列において重
複している場合、入れ子状エピトープが生じる。入れ子状ペプチド配列は、ＨＬ
ＡクラスＩとＨＬＡクラスＩＩエピトープの両方を包含する。入れ子状エピトー
プを提供する場合、一般的な目的は、一配列あたりの最多数のエピトープを提供
することである。従って、１つの局面は、ペプチド中のアミノ末端エピトープの
アミノ末端およびカルボキシル末端エピトープのカルボキシル末端より長いペプ
チドを提供しないようにすることである。多重エピトープ性配列（例えば、入れ
子状エピトープを含む配列）を提供する場合、一般的にこれが病理学的または他
の有害な生物学的特性を有さないことを保証するために、この配列をスクリーニ
ングすることが重要である。
【０１０７】 ６）ポリエピトープタンパク質が作製される場合、またはミニ遺伝子を作製す
る場合、目的のエピトープを含む最小のペプチドを生成することが目的である。
入れ子状エピトープを含むペプチドを選択する場合に用いられるものと同じでは
ない場合、この原理は類似している。しかし、人工ポリエピトープペプチドを用
いて、サイズ最小化の目的は、ポリエピトープタンパク質中のエピトープ間の任
意のスペーサー配列を組み込む必要性に対してバランスを保たれる。スペーサー
アミノ酸残基は、例えば、接合部エピトープ（免疫系により認識されるエピトー
プであって、標的抗原には存在せず、そしてエピトープの人工並列によってのみ
作製される）を回避するため、またはエピトープ間の切断を促進し、それにより
エピトープ提示を増大するために導入され得る。接合部エピトープは一般的に回
避されるべきである。なぜなら、レシピエントは、非ネイティブのエピトープに
対する免疫応答を生成し得るからである。「優性エピトープ」である接合部エピ
トープは特に関心をもたれる。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫
応答が減少または抑制されるこのような強力な応答を導き得る。
【０１０８】 （８．ミニ遺伝子ワクチン） 複数のエピトープを同時に送達し得る多数の異なるアプローチが利用可能であ
る。本発明のペプチドをコードする核酸は、本発明の特に有用な実施形態である
。ミニ遺伝子に含まれるエピトープは、好ましくは、前の章に記載されるガイド
ラインに従って選択される。本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ま
しい手段は、本発明の１つまたは複数のエピトープを含むペプチドをコードする
ミニ遺伝子構築物（ｍｉｎｉｇｅｎｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を使用する。
【０１０９】 多重エピトープ性ミニ遺伝子の使用は、以下に記載される（例えば、同時係属
出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３１１，７８４；Ｉｓｈｉｏｋａ ら、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１６２：３９１５−３９２５，１９９９；Ａｎ，Ｌ．およびＷｈｉｔ
ｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２２９２，１９９７；Ｔｈｏｍｓｏ
ｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：８２２，１９９６；Ｗｈｉｔｔ
ｏｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３４８，１９９３；Ｈａｎｋｅ，Ｒ
ら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６：４２６，１９９８）。例えば、ＴＡＡ、ＰＡＤＲ
ＥTM汎用ヘルパーＴ細胞エピトープのようなｐａｎ＿ＤＲ結合ペプチドおよび小
胞体トランスロケイティングシグナル（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕ
ｌｕｍ−ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）配列の複数の領域に由来
する、スーパーモチーフおよび／またはモチーフを保有するエピトープ（例えば
、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＡＰ、およびｈＫ２）をコードする多重エピトープ性ＤＮ
Ａプラスミドが操作され得る。ワクチンはまた、他のＴＡＡ由来のエピトープを
包含し得る。
【０１１０】 多重エピトープ性ミニ遺伝子の免疫原性をトランスジェニックマウスで試験し
て、この試験したエピトープに対するＣＴＬ誘導応答の大きさを評価し得る。さ
らに、インビボにおいてＤＮＡでコードされたエピトープの免疫原性を、ＤＮＡ
プラスミドでトランスフェクションした標的細胞に対する特異的ＣＴＬ株のイン
ビトロ応答と相関させ得る。従って、これらの実験は、このミニ遺伝子が以下の
両方に有用であることを示し得る：１）ＣＴＬ応答を発生させること、および２
）誘導ＣＴＬがコードされたエピトープを発現する細胞を認識すること。
【０１１１】 例えば、ヒトの細胞中での発現のために選択したエピトープ（ミニ遺伝子）を
コードするＤＮＡ配列を産生するために、このエピトープのアミノ酸配列は、逆
翻訳され得る。ヒトのコドン使用表を利用して、各アミノ酸に対するコドン選択
を誘導し得る。これらのエピトープをコードするＤＮＡ配列は、直接隣接されて
もよく、その結果、翻訳される場合、連続するポリペプチド配列を産生する。発
現および／または免疫原性を最適にするために、さらなるエレメントがミニ遺伝
子の設計に取り込まれ得る。逆翻訳され得、そしてミニ遺伝子配列に含まれ得る
アミノ酸配列の例としては、以下が挙げられる：ＨＬＡクラスＩエピトープ、Ｈ
ＬＡクラスＩＩエピトープ、ユビキチン結合シグナル配列、および／または小胞
体標的シグナル。さらに、ＣＴＬおよびＨＴＬエピトープのＨＬＡ提示は、合成
（例えば、ポリ−アラニン）または天然に存在する、ＣＴＬエピトープまたはＨ
ＴＬエピトープに隣接する隣接配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）
を含むことによって改良され得；エピトープ（単数または複数）を含むこれらの
より大きなペプチドは、本発明の範囲内である。
【０１１２】 ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖およびマイナス鎖をコードするオリ
ゴヌクレオチドを構築することによってＤＮＡに変換され得る。重複性オリゴヌ
クレオチド（３０〜１００の塩基長）を、周知の技術を使用する適切な条件下で
、合成、リン酸化、精製およびアニールし得る。オリゴヌクレオチドの末端を、
例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して結合し得る。この合成ミニ遺伝子（エ
ピトープポリペプチドをコードする）を、所望の発現ベクターにクローニングし
得る。
【０１１３】 当業者に周知の標準調節配列は、好ましくは、標的細胞での発現を確実にする
ためにベクター中に含まれる。いくつかのベクターエレメントが所望される：ミ
ニ遺伝子の挿入のための下流クローニング部位を有するプロモーター；効果的な
転写終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点；およびＥ
．ｃｏｌｉ 選択マーカー（例えば、アンピシリンまたはカナマイシン耐性）。
多数のプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモー
ター）が、この目的のために使用され得る。他の適切なプロモーター配列につい
て、例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号
を参照のこと。
【０１１４】 さらなるベクターの改変は、ミニ遺伝子の発現および免疫原性を最適化するた
めに所望され得る。いくつかの場合において、イントロンは、効果的な遺伝子発
現のために必要とされ、そして１つ以上の合成イントロンまたは天然に存在する
イントロンは、ミニ遺伝子の転写領域に取り込まれ得る。ミニ遺伝子の発現を増
加させるために、ｍＲＮＡ安定化配列（ｍＲＮＡ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および哺乳動物細胞中での複製のための配列の封入がまた
考慮され得る。
【０１１５】 一旦、発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子は、プロモーターの下流のポ
リリンカー領域にクローニングされる。このプラスミドを、適切なＥ．ｃｏｌｉ
株に形質転換し、そしてＤＮＡを標準的な技術を使用して調製する。ミニ遺伝子
の方向およびＤＮＡ配列、ならびにベクター中に含まれる他の全エレメントは、
制限マップおよびＤＮＡ配列解析を使用して確認される。正確なプラスミドを有
する細菌細胞は、マスター細胞バンク（ｍａｓｔｅｒ ｃｅｌｌ ｂａｎｋ）お
よび作業用細胞バンク（ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｅｌｌ ｂａｎｋ）として保存され
得る。
【０１１６】 さらに、免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）は、ＤＮＡワクチンの免疫原性
の役割を果たすようである。これらの配列は、所望の場合、免疫原性を増強する
ために、ミニ遺伝子コード配列の外側のベクター中に含まれ得る。
【０１１７】 いくつかの実施形態において、ミニ遺伝子コードエピトープと第二タンパク質
（免疫原性を増強または減少させるために含まれる）との両方の産生を可能にす
るｂｉ−シストロン（ｂｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現ベクターを使用し得る。
同時発現する場合、免疫応答を有利に増強し得るタンパク質またはポリペプチド
の例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）
、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、同時刺激分子（ｃｏｓｔｉｍｕ
ｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、またはＨＴＬ応答、ｐａｎ−ＤＲ結合タン
パク質（例えば、ＰＡＤＲＥTM，Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ
）が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープを細胞内標的シグナルに結合し
、そして発現したＣＴＬエピトープから別個に発現し得る。これにより、ＨＴＬ
エピトープをＣＴＬエピトープとは異なる細胞画分に指向させることを可能にす
る。必要である場合、これにより、ＨＴＬエピトープのＨＬＡクラスＩＩ経路へ
のより効果的な参加を可能にし、これによりＨＴＬ誘導を改良する。ＨＴＬまた
はＣＴＬ誘導に対して、免疫抑制性の分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現に
よる免疫応答を特異的に減少させることは、特定の疾患において有用であり得る
。
【０１１８】 治療量のプラスミドＤＮＡは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉでの発酵、続く精製によ
り産生され得る。作業用細胞バンクからのアリコートを、増殖培地に接種するた
めに使用し、周知の技術に従って、振盪フラスコまたはバイオリアクター中で飽
和まで増殖させる。プラスミドＤＮＡを、標準的なバイオ分離技術（例えば、Ｑ
ＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって供
給される固相陰イオン交換樹脂）を使用して精製し得る。必要とされる場合、ス
ーパーコイルＤＮＡを、ゲル電気泳動または他の方法を使用して開環形態および
線状形態から単離し得る。
【０１１９】 精製したプラスミドＤＮＡを、種々の処方物を使用して注入のために調製し得
る。これらの最も単純なものは、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の凍
結乾燥したＤＮＡの再構成物である。「裸のＤＮＡ」として公知のこのアプロー
チは、現在、臨床試験において筋内（ＩＭ）投与のために使用されている。ミニ
遺伝子のＤＮＡワクチンの免疫療法的効果を最大にするために、精製したプラス
ミドＤＮＡを処方するための代替方法が所望され得る。種々の方法が記載され、
そして新規の技術が利用可能になり得る。カチオン性脂質、糖脂質、およびフソ
ジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソームがまた処方物中で使用され得る（
例えば、ＷＯ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒ
ｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｓｑｕｅｓ６（７）：６８２（１９８８）；米国特
許第５，２７９，８３３号；ＷＯ９１／０６３０９号；およびＦｅｌｇｅｒら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３（１９８７
）を参照のこと）。さらに、保護的、相互作用的、非縮合（ｎｏｎ−ｃｏｎｄｅ
ｎｓｉｎｇ）化合物（ＰＩＮＣ）として集合的に言及されるペプチドおよび化合
物はまた、精製されたプラスミドＤＮＡに複合体化されて、安定性、筋内分散、
または特定の器官もしくは細胞型への輸送のような変数に影響を与える。
【０１２０】 標的細胞の感作は、ミニ遺伝子コード化ＣＴＬエピトープの発現およびＨＬＡ
クラスＩ提示のための機能的アッセイとして使用され得る。例えば、プラスミド
ＤＮＡは、標準的ＣＴＬのクロム放出アッセイ（ｓｔａｎｄａｒｄ ＣＴＬ ｃ
ｈｒｏｍｉｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ）に対する標的として適切である
哺乳動物細胞株に導入される。使用されるトランスフェクションの方法は、最終
の処方物に依存する。エレクトロポレーションが「裸の」ＤＮＡのために使用さ
れ、一方、カチオン性脂質は、直接的なインビトロでのトランスフェクションを
可能にする。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドは同時にトラ
ンスフェクションされて、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を使用してトランス
フェクションされた細胞の濃縮を可能にし得る。次いで、これらの細胞は、クロ
ミウム−５１（51Ｃｒ）で標識され、エピトープ特異的ＣＴＬ株のための標的細
胞として使用される；51Ｃｒ放出によって検出された細胞溶解は、ミニ遺伝子コ
ード化ＣＴＬエピトープの産生とミニ遺伝子コード化ＣＴＬエピトープのＨＬＡ
提示との両方を示す。ＨＴＬエピトープの発現は、ＨＴＬ活性を評価するための
アッセイを使用して、類似様式で評価され得る。
【０１２１】 インビボでの免疫原性は、ミニ遺伝子のＤＮＡ処方物の機能的試験についての
第２のアプローチである。適切なヒトＨＬＡタンパク質を発現するトランスジェ
ニックマウスは、ＤＮＡ産物で免疫される。投与の用量および経路は、処方物に
依存する（例えば、ＰＢＳ中でのＤＮＡに対するＩＭ、脂質複合体化ＤＮＡに対
する腹腔内（ＩＰ））。免疫の２１日後、脾細胞を収集し、そして試験される各
エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間、再刺激した。その後、ＣＴ
Ｌエフェクター細胞について、標準的な技術を使用してペプチド負荷した51Ｃｒ
で標識した標的細胞の細胞溶解についてアッセイを行う。ミニ遺伝子コード化エ
ピトープに対応する、ペプチドエピトープで負荷したＨＬＡによって感作された
標的細胞の溶解は、ＣＴＬのインビボでの誘導についてＤＮＡワクチン機能を証
明する。ＨＴＬエピトープの免疫原性を、類似の様式でトランスジェニックマウ
スにおいて評価する。
【０１２２】 あるいは、例えば、注入または例えば米国特許第５，２０４，２５３号に記載
されるような銃式送達によって、核酸を皮内に投与し得る。この技術を使用して
、単独でＤＮＡを含む粒子を投与する。さらなる代替の実施形態において、ＤＮ
Ａは、粒子（例えば、金粒子）に接着され得る。
【０１２３】 ミニ遺伝子はまた、当該分野で他の周知の細菌性またはウイルス性の送達シス
テムを使用して送達され得る。例えば本発明のエピトープをコードしている発現
構築物はワクシニアのようなウイルスベクターに組み込まれ得る。
【０１２４】 （９. ヘルパーペプチドとＣＴＬペプチドの組み合わせ） 本発明のペプチドを含むワクチンの組成物は、血清中における改良された半減
期のような所望の性質を与えるため、または免疫原性を増大させるために改変さ
れ得る。
【０１２５】 例えば、Ｔヘルパー細胞の応答を誘導し得るエピトープを少なくとも１つ含む
ペプチドを結合させることにより、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力は増大
され得る。免疫原性を増大させるための、ＣＴＬエピトープと組み合わせたＴヘ
ルパーエピトープの使用の例が、例えば以下の同時係属中出願、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ
．０８／８２０，３６０、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／１９７，４８４、およびＵ．
Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／４６４，２３４に記載されている。
【０１２６】 ＣＴＬペプチドはＴヘルパーペプチドと直接結合し得るが、しばしばＣＴＬエ
ピトープ／ＨＴＬエピトープ結合体はスペーサー分子により連結される。スペー
サーは、代表的に生理的条件下において、実質的に荷電を帯びていないアミノ酸
またはアミノ酸ミメティックのような、比較的小さな中性の分子を含む。スペー
サーは、代表的に、例えばＡｌａ、Ｇｌｙ、またはその他の中性の非極性アミノ
酸および中性の極性アミノ酸の中性スペーサーから選択される。必要に応じて存
在するスペーサーは同じ残基から構成される必要はなく、ヘテロオリゴマーまた
はホモオリゴマーであり得ることと理解される。スペーサーが存在する場合、通
常、スペーサーは少なくとも１つまたは２つの残基であるが、さらに通常には３
〜６つの残基、時には１０残基以上になる。ＣＴＬペプチドエピトープはＴヘル
パーペプチドエピトープと直接またはスペーサーを介してのどちらかで、ＣＴＬ
ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで結合され得る。免疫原
性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端はアシル化され得
る。
【０１２７】 特定の実施形態において、Ｔヘルパーペプチドは、集団の大部分に存在するＴ
ヘルパー細胞により認識されるものである。これは、多数の、ほとんどの、ある
いは全てのＨＬＡ クラスＩＩ分子と結合するアミノ酸配列の選択によって達成
され得る。これらのことは「ゆるいＨＬＡ制限」、または「乱雑な」Ｔヘルパー
配列として、公知である。乱雑なペプチドの例としては、破傷風毒の位置８３０
〜８４３（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃ
ｉｐａｒｕｍ ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ（ＣＳ）タンパク質の位置３
７８〜３９８（ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ）およびＳｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ １８ｋＤ タンパク質の位置１１６（ＧＡＶＤＳＩＬＧＧ
ＶＡＴＹＧＡＡ）のような抗原由来の配列が挙げられる。その他の例としては、
ＤＲ１−４−７スーパーモチーフ、もしくはＤＲ３モチーフのいずれかを保有す
るペプチドが挙げられる。
【０１２８】 あるいは、ゆるいＨＬＡ制限様式において、天然では見出されないアミノ酸配
列を使用して、Ｔヘルパーリンパ球を刺激し得る合成ペプチドを調製することが
可能である（例えば、ＰＣＴ刊行物ＷＯ９５／０７７０７を参照）。Ｐａｎ−Ｄ
Ｒ結合エピトープ（例えば、ＰＡＤＲＥTM、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ.，Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と呼ばれるこれらの合成化合物はほとんどのＨＬＡ−Ｄ
Ｒ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子に、最も優先的に結合するよう設計されている
。例えば、式：ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（ここで、「Ｘ」はシクロヘキシル
アラニン、フェニルアラニン、またはチロシンのいずれかであり、「ａ」はＤ−
アラニンまたはＬ−アラニンのいずれかである）を有するｐａｎ−ＤＲ結合エピ
トープペプチドは、それらのＨＬＡ型に関わらずほとんどのＨＬＡ−ＤＲ対立遺
伝子（ａｌｌｅｌｅ）と結合すること、およびほとんどの個体由来のＴヘルパー
リンパ球の応答を刺激することが見出されている。Ｐａｎ−ＤＲ結合エピトープ
の代替物は、全て「Ｌ」の天然アミノ酸を含み、エピトープをコードする核酸の
形態で提供され得る。
【０１２９】 ＨＴＬペプチドエピトープはまた、それらの生物学的性質を変えるように修飾
され得る。例えば、それらはＤ−アミノ酸を含むように修飾されて、それらのプ
ロテアーゼ耐性を増大させ、そしてそれらの血清中半減期を延長させ得、または
、それらを例えば、脂質、タンパク質、炭水化物などのような他の分子と結合さ
せて、それらの生物学的活性を増大し得る。例えば、Ｔヘルパーペプチドは、ア
ミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおいて１以上のパルミチン酸鎖と結
合され得る。
【０１３０】 （１０．Ｔ細胞刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）因子とＣＴＬペプチドの組み合わせ） いくつかの実施形態において、少なくとも１つの、細胞傷害性Ｔリンパ球を刺
激する成分が、本発明の薬学的組成物に含まれることが所望され得る。脂質は、
インビボでウイルス抗原に対し、ＣＴＬ刺激をなし得る因子として同定されてい
る。例えば、パルミチン酸残基は、リジン残基のε−アミノ基およびα−アミノ
基に結合され得、次いで、例えば１つ以上の連結した残基（例えばＧｌｙ、Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなど）を介して免疫原性ペプチドに結合
され得る。次いで、脂質化ペプチドは、直接にミセルまたは微粒子のいずれかで
投与され得るか、リポソームへ組み込まれ得るか、またはアジュバント（例えば
不完全フロイントアジュバント）へ乳化され得る。好ましい免疫原性組成物は、
Ｌｙｓのε−アミノ基およびα−アミノ基と結合したパルミチン酸を含み、この
Ｌｙｓは、例えばＳｅｒ−Ｓｅｒのような結合を介して、免疫原性ペプチドのア
ミノ末端と結合している。
【０１３１】 ＣＴＬ応答を刺激する脂質のもう１つの例として、Ｅ．ｃｏｌｉのリポタンパ
ク質、例えばトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（
ｔｒｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−Ｓ−ｇｌｙｃｅｒｙｌｃｙｓｔｅｉｎｌｙｓｅｒｙ
ｌ−ｓｅｒｉｎｅ：Ｐ3ＣＳＳ）は、ある適切なペプチドに共有結合した場合に
、ウイルス特異的ＣＴＬを刺激することに使用され得る（例えば、Ｄｅｒｅｓ，
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：５６１，１９８９を参照）。本発明のペプチドは、
例えば、Ｐ3ＣＳＳに結合され得、標的抗原に対するＣＴＬ応答を特異的に刺激
するため、個体に投与され得る。さらに、中和抗体の誘導もまた、Ｐ3ＣＳＳ結
合エピトープにより刺激され得るため、２つのそのような組成物は、組み合わさ
れて、体液性および細胞媒介性応答の両方をさらに効果的に誘発し得る。
【０１３２】 ＣＴＬおよび／あるいはＨＴＬペプチドは、ペプチドの末端へのアミノ酸の付
加によっても修飾され、あるペプチドをもう１つのペプチドへ結合することの容
易さ、キャリア支持体またはより大きなペプチドへの結合、ペプチド、オリゴペ
プチドなどの物理学的または化学的特性の修飾を提供し得る。アミノ酸（例えば
チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸など）は、ペプ
チドまたはオリゴペプチド、特にクラスＩペプチドのＣ−末端またはＮ−末端に
導入され得る。しかしながら、ＣＴＬエピトープのカルボキシ末端においての修
飾が、いくつかの場合において、ペプチドへの結合特性を変化させ得ることは注
意されるべきである。さらに、ペプチド配列またはオリゴペプチド配列は末端の
ＮＨ2アシル化（例えば、アルカノイル（Ｃ1〜Ｃ20）またはチオグリコリルアセ
チル化）による、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニア、メチルアミ
ンなど）によって修飾されることによって天然の配列と異なり得る。いくつかの
例において、これらの修飾は、支持体または他の分子との結合のための部位を提
供し得る。
【０１３３】 （１１．ＣＴＬおよび／またはＨＴＬペプチドでパルス化（ｐｕｌｓｅｄ）さ
れたＤＣを含むワクチン組成物） 本発明に従うワクチン組成物の実施形態は、患者の血液由来のＰＢＭＣへのエ
ピトープ保有ペプチドのカクテル、またはＰＢＭＣから単離したＤＣへのエピト
ープ保有ペプチドのカクテルのエキソビボ投与を包含する。ＤＣの採取を容易に
する薬（例えばＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎTM（Ｍｏｎｓａｎｔｏ，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４）が使用され得る。ペプチドで
ＤＣをパルス化した後でかつ、患者に再注入する前に、ＤＣは結合していないペ
プチドを除くため洗浄される。この実施形態において、ワクチンは、ＨＬＡ分子
とその表面で複合体になった、パルス化されたペプチドエピトープを提示するペ
プチドパルス化ＤＣを包含する。
【０１３４】 ＤＣは、エキソビボでペプチドカクテル（それらのうちのいくつかは、目的の
１つ以上の抗原に対するＣＴＬ応答を刺激する）でパルス化され得る。必要に応
じて、ヘルパーＴ細胞ペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥTMファミリー分子）は、Ｃ
ＴＬ応答を容易にするするため、含有され得る。
【０１３５】 （１２．治療目的または予防目的のためのワクチンの投与） 本発明のペプチド、本発明の薬学的組成物およびワクチン組成物は、代表的に
癌の処置のために治療的に使用される。本発明のペプチドを含有したワクチン組
成物は、代表的に、１つ以上の抗原の発現に関連した悪影響を有する癌患者へ投
与される。あるいは、ワクチン組成物は、癌の進行に対して影響を受けやすい、
さもなくば癌の進行の危険にある個人に対し投与され得る。
【０１３６】 治療適用において、ペプチド組成物および／もしくは核酸組成物は、腫瘍抗原
に対する効果的なＣＴＬ応答および／もしくはＨＴＬ応答を誘発するため、そし
て症状および／もしくは合併症を治癒するか、少なくとも部分的に止める、もし
くは遅らせるために十分な量で患者に投与される。これを満たすのに十分な量は
、「治療的有効用量」と定義される。この使用に十分な量は、例えば、投与され
る特定の組成物、投与方法、治療される疾患の段階および重篤度、患者の体重お
よび全般的な健康状態、ならびに処方医の判断に依存する。
【０１３７】 上に記載したように、本発明のＣＴＬエピトープおよび／もしくはＨＴＬエピ
トープを含むペプチドは、ＣＴＬまたはＨＴＬ特異的にＨＬＡ分子によって提示
される場合、およびこのペプチドに含まれるエピトープに特異的なＣＴＬまたは
ＨＴＬと接触される場合に、免疫応答を誘導する。ペプチド（またはそれらをコ
ードするＤＮＡ）は、個別に、または１つ以上のペプチド配列の融合物として投
与され得る。ペプチドがＣＴＬまたはＨＴＬと接触される方法は、本発明には重
要でない。例えば、ペプチドは、インビボもしくはインビトロのいずれかで、Ｃ
ＴＬまたはＨＴＬと接触し得る。接触が、インビボで起きる場合、ペプチド自体
が患者に投与され得るか、または他のビーイクル（例えば、１つ以上のペプチド
をコードしたＤＮＡベクター、ペプチドをコードしたウイルスベクター、リポソ
ームなど）が、本明細書中に記載されるように使用され得る。
【０１３８】 ペプチドが、インビトロで接触する場合、ワクチン因子は、細胞の集団（例え
ば、ペプチドパルス化樹状細胞）、または抗原提示細胞をペプチドでパルス化す
ること、もしくは本発明品のミニ遺伝子を抗原提示細胞にトランスフェクトする
ことによって誘導されたＴＡＡ特異的ＣＴＬを含有し得る。そのような細胞集団
は、続いて、治療的有効用量で患者に投与される。
【０１３９】 治療に用いるために、投与は、一般的に、最初の癌の診断の時点で始まるべき
である。これに続いて、少なくとも実質的に症状がやわらげられるまで、そして
その後ある期間にわたって追加抗原投与量がブーストされる。患者に送達される
ワクチン組成物の実施形態（すなわち、例えばペプチドカクテル、ポリエピトー
プ性ポリペプチド、ミニ遺伝子、またはＴＡＡ特異的ＣＴＬ、またはパルス化さ
れた樹状突起細胞のような実施形態を含むが、これらに限定されない）は、疾患
の段階、あるいは患者の健康状態によって変り得る。例えば、ＴＡＡ特異的ＣＴ
Ｌを含むワクチンは、進行した疾患を有する患者中において、腫瘍細胞を殺傷す
る際に、代変の実施形態より効果的であり得る。
【０１４０】 本発明のワクチン組成物はまた、外科手術などの処置と組み合わせても、治療
的に用いられ得る。１つの例は、患者が、原発性腫瘍を取り除くための手術を受
けており、次いで、ワクチンが、再発および／もしくは転移を、遅らせるか、ま
たは予防するために使用される状況である。
【０１４１】 感受性の個体（例えば、前立腺腫瘍を発病するような遺伝的素因があると診断
され得る個体）が、癌の診断に先立って特定される場合、組成物が、彼らに対し
て標的化され得、したがってより大きな集団への投与の必要性を最小にす得る。
【０１４２】 最初の、治療的免疫のための用量決定は、一般的に、下限の値が、約１、５、
５０、５００、または１，０００μｇであり、そして上限の値が、約１０，００
０；２０，０００；３０，０００；または５０，０００μｇの単位投薬範囲にあ
る。ヒトについての投薬量の値は、典型的に、７０キログラムの患者あたり約５
００μｇ〜約５０，０００μｇの範囲である。確立された間隔（例えば、４週間
から６ヶ月）で、ブースト投薬前の、最初の投薬は、患者を効果的に処置するた
め、ことによると長期の時間の間、必要とされ得る。ブーストレジメンに従って
、数週間から数ヶ月にわたる、ペプチドの約１．０μｇ〜約５０，０００μｇの
間のブースト投薬は、患者の血液から得られるＣＴＬおよびＨＴＬの特異的活性
を測定することによって決定される患者の応答および状態に依存して投与され得
る。
【０１４３】 少なくとも臨床的症状または実験的試験が、腫瘍が除去されたかまたは腫瘍細
胞荷重が実質的に減少したことを示すまでそしてその後のある期間の間、投薬が
続けられるべきである。投薬、投与の経路、および投薬スケジュールは、当該分
野で公知の方法論に従って調節される。
【０１４４】 ある実施形態において、本発明のペプチドおよび組成物は、重症な疾患状態、
すなわち、生命を危うくする状況または潜在的に生命を危うくする状況で使用さ
れる。このような場合において、最小量の外来の物質および本発明の好ましい組
成物におけるペプチドの比較的非毒性の性質の結果として、これらの記述された
投薬量に対して実質的に過剰のこれらのペプチド組成物を投与することが、可能
であり、そして処置する医師によって望ましいと感じられ得る。
【０１４５】 本発明のワクチン組成物は、予防因子としても使用され得る。例えば、組成物
は、前立腺癌進行の危険性を有する個体に投与され得る。一般的に、最初の予防
的免疫のための一般的な投与量は、下限の値が約１、５、５０、５００、または
１０００μｇであり、そして上限の値が約１０，０００；２０，０００；３０，
０００；または５０，０００μｇである単位投薬範囲にある。ヒトについての投
薬量の値は、典型的に、７０キログラムの患者あたり約５００μｇ〜約５０，０
００μｇの範囲である。これに続いて、最初のワクチン投与後、約４週間〜約６
ヶ月の規定された間隔で投与される、約１．０μｇ〜約５０，０００μｇの間の
ペプチドがブースト投薬される。ワクチンの免疫原性は、患者の血液のサンプル
から得られたＣＴＬおよびＨＴＬの特異的活性を測定することによって評価され
得る。
【０１４６】 治療的処置のための薬学的組成物は、非経口的投与、局所的投与、経口投与、
くも膜下投与、または局所投与に意図される。好ましくは、薬学的組成物は、非
経口的に、例えば、静脈内に、皮下に、皮内に、または筋内に投与される。従っ
て、本発明は、受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）に溶解される
かまたは懸濁される免疫原性ペプチドの溶液を含む非経口投与のための組成物を
提供する。種々の水性キャリアは、例えば、水、緩衝化水、０．８％生理食塩水
、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などが使用され得る。これらの組成物は、従
来の周知の滅菌化技術によって滅菌化され得るか、または滅菌濾過され得る。得
られる水溶液は、そのままでの使用のためにパッケージングされ得るか、または
凍結乾燥され得、この凍結乾燥された調製物は、投与の前に滅菌溶液と組み合わ
せられる。この組成物は、およそ生理学的条件に必要とされる薬学的に受容可能
な補助物質、例えば、ｐＨ調節剤、緩衝化剤、張性調節剤、湿潤剤、保存剤など
（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、
塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン
など）を含み得る。
【０１４７】 薬学的処方物中の本発明のペプチドの濃度は、幅広く、すなわち、約０．１重
量％未満、通常、約２重量％または少なくとも約２重量％から、２０重量％〜５
０重量％以上の多さまでで変化し得、主に、選択される投与の特定の様式に従っ
て、流体容積、粘度などによって選択される。
【０１４８】 ペプチド組成物のヒト単位用量形態は、代表的に、ヒト単位用量の受容可能な
キャリア（好ましくは、水性キャリア）を含む薬学的組成物中に含まれ、そして
このような組成物のヒトへの投与に使用されるための当業者によって公知の流体
の容積で投与される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７th Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ、
Ｅｄｉｔｏｒ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅ
ｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１９８５を参照）。
【０１４９】 本発明のペプチドはまた、リポソームを介して投与され得、リポソームは、ペ
プチドを特定の組織（例えば、リンパ組織）に標的化させるために、または感染
した細胞に選択的に標的化させるために、そしてペプチド組成物の半減期を増加
させるために役立つ。リポソームには、エマルジョン、泡状物、ミセル、不溶性
単層、液晶、リン脂質分散物、層状層などが挙げられる。この調製物において、
送達されるべきペプチドは、リポソームの一部として、単独であるいはリンパ系
細胞に広く行き渡るレセプターに結合する分子（例えば、ＣＤ４５抗原に結合す
るモノクローナル抗体）とともに、または他の治療組成物もしくは免疫原性組成
物とともに組み込まれる。従って、本発明の所望のペプチドで負荷されるかまた
は装飾（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）されるかのいずれかのリポソームが、リンパ系細
胞の部位に指向され得、ここで、そのときリポソームがペプチド組成物を送達す
る。本発明に従う使用のためのリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成さ
れ、これには、一般的に、中性および陰性に荷電されたリン脂質およびステロー
ル（例えば、コレステロール）が挙げられる。脂質の選択は、一般的に、例えば
、リポソームサイズ、酸不安定性および血流中のリポソームの安定性を考慮して
ガイドされる。種々の方法が、リポソームを調製するために利用可能であり、例
えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４
６７（１９８０）および米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７
２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載さ
れる。
【０１５０】 免疫系の細胞を標的化するために、リポソームに組み込まれるリガンドには、
例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはそのフラグメ
ントが挙げられ得る。ペプチドを含むリポソーム懸濁物は、静脈内、局所的（ｌ
ｏｃａｌｌｙ、ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）などで、特に投与の方法、送達されるペプ
チド、および処置される疾患の段階に従って変化する用量で投与され得る。
【０１５１】 固体組成物について、従来の非毒性固体キャリアが使用され得、これには、例
えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネ
シウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース
、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。経口投与のために、薬学的に受容可能な
非毒性組成物は、任意の通常使用される賦形剤（例えば、先に列挙されたもの）
および一般的に１０〜９５％の活性成分（すなわち、本発明の１つ以上のペプチ
ド）、より好ましくは、２５％〜７５％の濃度で組み込むことによって形成され
る。
【０１５２】 エアロゾル投与のために、免疫原性ペプチドは、好ましくは、界面活性剤およ
び噴霧剤とともに細かく分割された形態で供給される。ペプチドの代表的な割合
は、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは、１重量％〜１０重量％である。
界面活性剤は、もちろん非毒性でなければならず、そして好ましくは噴霧剤に可
溶である。このような薬剤の代表は、６〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸のエス
テルまたは部分エステル、例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パル
ミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸（ｏｌｅｓ
ｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）およびオレイン酸と、脂肪族多水酸基アルコールまたは
その環式無水物である。混合エステル（例えば、混合または中性グリセリド）が
使用され得る。界面活性剤は、組成物の０．１重量％〜２０重量％、好ましくは
、０．２５〜５重量％を構成し得る。組成物の残りは、通常、噴霧剤である。キ
ャリアはまた、望ましいならば、例えば、鼻腔内送達のためのレシチンとともに
含まれ得る。
【０１５３】 （１３．キット） 本発明のペプチドおよび核酸組成物は、ワクチン投与のための指示書とともに
キットの形態で提供され得る。代表的なキットは、容器内に、好ましくは、単位
用量形態の所望のペプチド組成物および投与のための指示書を含む。代替的なキ
ットは、投与のための指示書とともに、容器内に、好ましくは単位用量形態で、
本発明の所望の核酸を伴うミニ遺伝子構築物を含む。ＩＬ−２またはＩＬ−１２
のようなリンホカインもまた、キットに含まれ得る。所望であり得る他のキット
構成要素には、例えば、滅菌シリンジ、ブースター投薬、および他の所望の賦形
剤が挙げられる。
【０１５４】 本発明に従うエピトープは、免疫応答を誘導するために首尾良く使用された。
これらのエピトープを用いる免疫応答は、種々の形態においてエピトープを投与
することによって導入された。エピトープは、ペプチドとして、核酸として、そ
して本発明のエピトープをコードする核酸を含むウイルスベクターとして投与さ
れた。ペプチドに基づくエピトープ形態の投与において、免疫応答は、エピトー
プを細胞で発現される空のＨＬＡ分子上に直接負荷することによって、そしてエ
ピトープのインターナリゼーションを介して、そしてＨＬＡ Ｉ型経路を介して
プロセスすることによって導入された；いずれの場合においても、エピトープを
発現するＨＬＡ分子は、次いで、相互作用し得、そしてＣＴＬ応答を誘導し得た
。ペプチドは、直接的に、またはリポソームのような薬剤を使用して送達され得
る。これらは、さらに、銃式送達（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（
ここで、ペプチドは、代表的には、結晶形態である）を使用して送達され得る。
ＤＮＡが免疫応答を誘導するために使用される場合、裸のＤＮＡとして（一般的
に、約１〜５ｍｇの投薬範囲）または銃式「遺伝子銃」送達を介して（代表的に
、約１０〜１００μｇの投薬範囲）のいずれかで投与される。ＤＮＡは、種々の
コンホメーション（例えば、線状、環状など）で送達され得る。種々のウイルス
ベクターもまた、本発明に従ってエピトープをコードする核酸を含んで首尾良く
使用されている。
【０１５５】 従って、本発明に従う組成物は、いくつかの形態で存在する。本発明に従うこ
れらの組成物形態のそれぞれの実施形態は、免疫応答を誘導するために首尾良く
使用されている。
【０１５６】 本発明に従う１つの組成物は、複数のペプチドを含む。この複数またはカクテ
ルのペプチドは、一般的に、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤と混合される
。ペプチドカクテルは、同じペプチドの複数のコピーを含み得るか、またはペプ
チドの混合物を含み得る。ペプチドは、天然のエピトープのアナログであり得る
。ペプチドは、人工のアミノ酸および／または化学的改変（例えば、脂質化；ア
セチル化、グリコシル化、ビオチニル化、リン酸化のような表面活性分子の添加
）を含み得る。ペプチドは、ＣＴＬまたはＨＴＬエピトープであり得る。好まし
い実施形態において、ペプチドカクテルは、複数の異なるＣＴＬエピトープおよ
び少なくとも１つのＨＴＬエピトープを含む。ＨＴＬエピトープは、天然または
非天然（例えば、ＰＡＤＲＥ（登録商標）、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｃ．，Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）であり得る。本発明の実施形態における異なるエピトー
プの数は、一般的に、１〜１５０の整数（ｗｈｏｌｅ ｕｎｉｔ ｉｎｔｅｇｅ
ｒ）である（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２
、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４
、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６
、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８
、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０
、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２
、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４
、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６
、９７、９８、９９、１００、・・・、１５０）。
【０１５７】 本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、ポリペプチド多重エピトープ性構
築物（すなわち、ポリエピトープペプチド）を含む。本発明に従うポリエピトー
プペプチドは、当該分野において周知の技術の使用によって調製される。これら
の公知の技術の使用によって、本発明に従うエピトープは、互いに接続される。
ポリエピトープペプチドは、線状または非線状（例えば、多価）であり得る。こ
れらのポリエピトープ構築物は、人工アミノ酸、スペーシングまたはスペーサー
アミノ酸、隣接アミノ酸（ｆｌａｎｋｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）、また
は隣接エピトープユニット間の化学改変を含み得る。ポリエピトープ構築物は、
ヘテロポリマーまたはホモポリマーであり得る。ポリエピトープ構築物は、一般
的に、２〜１５０の間の任意の整数の量（例えば、２、３、４、５、６、７、８
、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、
２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、
３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、
４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、
５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、
６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、
８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、
９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、・・・、１５０）でエピ
トープを含む。ポリエピトープ構築物は、ＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトー
プを含み得る。構築物中の１つ以上のエピトープは、例えば、表面活性物質（例
えば、脂質）の付加によって改変され得るか、または化学的に改変され得る（例
えば、アセチル化など）。さらに、多重エピトープ性構築物における結合は、ペ
プチド結合以外（例えば、共有結合、エステルまたはエーテル結合、ジスルフィ
ド結合、水素結合、イオン結合など）であり得る。
【０１５８】 あるいは、本発明に従う組成物は、ネイティブな配列に対する相同性を有する
（すなわち、対応するかまたは接触（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）する）アミノ酸の
系列、配列、ストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を含む構築物を含む。このアミノ酸
のストレッチは、より長い系列のアミノ酸から切断されるかまたは単離される場
合、本発明に従って、ＨＬＡ Ｉ型エピトープまたはＨＬＡ ＩＩ型エピトープ
として機能するアミノ酸の少なくとも１つのサブ配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ
）を含む。この実施形態において、ペプチド配列は、当該分野で公知であるかま
たは提供される多数の技術を使用することによって、本明細書中に規定されるよ
うな構築物になるように改変される。ポリエピトープ構築物は、７０〜１００％
（例えば、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８
０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９
２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）の任意の整
数の増分でネイティブな配列に対して相同性を含み得る。
【０１５９】 本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、本発明に従う１つ以上のエピトー
プを含む抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、「専門的」抗原提示細胞（例え
ば、樹状細胞）であり得る。抗原提示細胞は、当該分野において公知の任意の手
段または当該分野において決定された任意の手段によって本発明のエピトープを
含み得る。このような手段には、樹状細胞を１つ以上の個々のエピトープまたは
複数のエピトープを含む１つ以上のペプチドで、銃式核酸送達のような核酸投与
によって、または核酸の投与について当該分野の他の技術（ベクターに基づく（
例えば、ウイルスベクター）核酸の送達を含む）によって適用することを含む。
【０１６０】 本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、本発明の１つ以上のペプチドをコ
ードする核酸、または本発明に従うポリエピトープペプチドをコードする核酸を
含む。当業者によって理解されるように、種々の核酸組成物が、遺伝子コードの
冗長性に起因して同じペプチドをコードする。これらの核酸組成物のそれぞれは
、本発明の範囲内に含まれる。本発明のこの実施形態は、ＤＮＡまたはＲＮＡを
含み、特定の実施形態において、ＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせを含む。本発
明に従うペプチドをコードする核酸を含む任意の組成物または本発明に従う任意
の他のペプチドに基づく組成物が、本発明の範囲内であることが理解される。
【０１６１】 （実施例） （調製Ａ） （ペプチド合成およびペプチドアナログの生成） これらの実施例で用いられるペプチドを表１に示す。腫瘍関連抗原に由来して
いる全ての野生型ヒトＣＴＬエピトープならびにＨＩＶおよびＢ型肝炎ウイルス
（ＨＢＶ2）のポリメラーゼ遺伝子に由来している野生型ウイルスエピトープは
、ヒトおよびトランスジェニックマウスの系における免疫原性が示されている（
Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）５９
：１；Ｉｓｈｉｏｋａ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６２：３
９１５）。
【０１６２】 ヘテロクリティックな活性について最初に試験されたペプチドは、Ｃｈｉｒｏ
ｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖｉｃｔｏｒ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって
合成された。さらなる生物学的特徴付けを必要としているペプチドは、（Ｒｕｐ
ｐｅｒｔ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ（１９９３）７４：９２９）の方法を用いてＥｐｉ
ｍｍｕｎｅにて合成され、分析用逆相ＨＰＬＣによって決定された場合に、これ
らのペプチドの純度は通常９５％より高かった。後者のペプチドの正体を質量ス
ペクトル分析によって確認した。
【０１６３】 （調製Ｂ） （単一アミノ酸置換の選択についてのスキーム） 表２は、所定のアミノ酸置換を、保存的置換、半保存的置換、または非保存的
置換であるとして特徴付けし得るように、任意の所定のアミノ酸対の間の類似性
の割り当てを示す。
【０１６４】 アミノ酸対の間の類似性の程度を、各アミノ酸対について、ＰＡＭ２５０に関
する順位係数スコア（ｒａｎｋ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｃｏｒｅ）、疎水
性度および以下に述べるような側鎖の体積を平均化することによって定量した。
これらの複合した順位の平均値に基づいて、この表は各対が保存されているか、
半保存されているか、または保存されていないかを示す。
【０１６５】 Ｄａｙｈｏｆｆ ＰＡＭ２５０スコア（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら、Ａｔｌ
ａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
，第５巻，補遺３．（１９７８）Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編．Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈ
ｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，３４５頁；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉ
ｅｓ（１９９３）（第２版）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ
，ＮＹ；ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｗｌ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ａａｉ
ｎｆｏ／ｐａｍ２５０．ｈｔｍｌ）は、規定された時間枠の範囲内で受容可能な
点変異（ＰＡＭ）の百分率を測定する、一般的に利用されるタンパク質アライン
メントスコア付けマトリクスである。これらの変異の頻度はランダム変異の確率
から予想されるものとは異なり、恐らく、置換に関与するアミノ酸対の物理的お
よび化学的類似性の程度に起因する偏向を反映する。類似性の他の尺度を用いて
標準化され得るアミノ酸類似性のスコアを得るために、ＰＡＭ２５０スコアを順
位値（ｒａｎｋ ｖａｌｕｅ）に変換した。ここで、１は受容された変異である
という最も高い確率を示している。
【０１６６】 ２０個の天然に存在するアミノ酸の相対的疎水性度を表すために、最もよく一
般的に利用されるスケール（Ｃｏｒｎｅｔｔｅ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
（１９８７）１９５：６５９）は、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｋｙｔ
ｅ，Ｊ．およびＲ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８
２）１５７：１０５）、ならびにＦａｕｃｈｅｒｅおよびＰｌｉｓｋａ（Ｆａｕ
ｃｈｅｒｅ，Ｊ．およびＶ．Ｐｌｉｓｋａ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（
１９８３）１８：３６９）による実験データを基礎として発展したものである。
Ｋｙｔｅ／Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅスケールは個々のアミノ酸のＨ2Ｏ／有機溶媒分
配を測定する。このスケールは折り畳まれたタンパク質のアミノ酸の位置を考慮
するので、このスケールは、タンパク質の状況下におけるネイティブな疎水性度
を最も正確に反映し得る。Ｆａｕｃｈｅｒｅ／ＰｌｉｓｋａスケールはＮ−アセ
チルアミノ酸アミドのオクタノール／Ｈ2Ｏ分配を測定し、変性タンパク質およ
び／または、低分子合成ペプチドの状況下における疎水性度を最も正確に反映す
る。疎水性度についてのスコアを得るために、各アミノ酸残基をＫｙｔｅ／Ｄｏ
ｏｌｉｔｔｌｅおよびＦａｕｃｈｅｒｅ／Ｐｌｉｓｋａ疎水性度スケールの両方
において順位付けした。２つのスケール間の平均順位を計算し、各対についての
疎水性度の差の平均を計算した。
【０１６７】 最後に、アミノ酸側鎖の体積を計算するために、１分子または１グラムのいず
れかのアミノ酸残基を添加した後の水の体積の増加を留意することによって得ら
れる溶液中の分体積を考慮した。（Ｚａｍｙａｔｎｉｎ，Ａ．Ａ．，Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９８４）１３：１４５；Ｚａｍｙａ
ｔｎｉｎ，Ａ．Ａ．，Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７
２）２４：１０７）。２０個の天然に存在するアミノ酸に関して可能な各対の分
体積の絶対的差異を計算し、そして順位付けた。ここで、１は最も類似する体積
を有する残基、そして２０は最も異なる体積を有する残基を示した。
【０１６８】 （調製Ｃ） （アッセイのための材料） （１．ＡＰＣ株） ＨＬＡ−Ａ２．１の状況下でぺプチドを提示する細胞株は以下のように調製さ
れた： ．２２１Ａ２．１細胞株は、ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子をＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−
Ｃ−ヌル変異体ＥＢＶ−形質転換ヒトＢ−リンパ芽球細胞株３Ａ４−７２１．２
２１（Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８
）５９：１）にトランスフェクションすることによって生成した。
【０１６９】 腫瘍細胞株はメチルコラントレン（ｍｅｔｈｙｌｃｈｏｌａｎｔｈｒｅｎｅ）
誘導性肉腫であるＭｅｔｈ Ａ細胞のトランスフェクションによって調製した。
そして、Ｊｕｒｋａｔ細胞株ではＨＬＡ−Ａ２．１またはＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋ b 導入遺伝子のトランスフェクションを、他（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ａ．らＪ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９１）１７３：１００７）で述べた方法を用いて行った。
ＨＬＡ型黒色腫細胞株６２４ｍｅｌ（Ａ２．１+，ＭＡＧＥ+）および８８８ｍｅ
ｌ（Ａ２．１-，ＭＡＧＥ-）の組み合わせはＹ．ＫａｗａｋａｍｉおよびＳ．Ｒ
ｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の
御好意により提供され、そして内因的にプロセシングされたＭＡＧＥ３エピトー
プの提示を測定するために用いられた。（Ｂｏｏｎ，Ｔ．ら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１２：３３７）。その黒色腫細胞株をＡＰＣとし
て使用する前に、１００ＩＵ／ｍｌヒトＩＦＮγ（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ，ＭＡ）で４８時間、３７℃で処理した。
【０１７０】 本研究で用いた全ての細胞は、抗生物質、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミ
ノ酸および１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地
で増殖させた。
【０１７１】 （２．インビトロでのヒトＰＢＭＣからのＣＴＬの誘導およびヒトＣＴＬ株の
誘導体化） ＭＡＧＥ３．１１２および癌胎児抗原（ＣＥＡ）エピトープであるＣＥＡ．６
９１に対するペプチド特異的なＣＴＬ株を生成するために、インビトロにおいて
正常な被験体からのＰＢＭＣを、（Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．らＨｕｍａｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）５９：１）に記載のようなペプチドを用いて繰り返
し刺激した。簡潔には、ペプチドを適用した（ｐｕｌｓｅｄ）樹状細胞（ＧＭ−
ＣＳＦおよびＩＬ４中で培養することによって接着性ＰＢＭＣから区別した）を
、抗体でコーティングしたビーズ（Ｄｙｎａｌ Ａ．Ｓ．，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｗａ
ｙ）を用いたポジティブ選択によって得られた自己ＣＤ８+Ｔ細胞とともに、４
８ウェルプレート中で共存培養した。ＩＬ２、ＩＬ７およびＩＬ１０の存在下で
の培養の７日目後、インビトロにおいて、ペプチドを適用した（ｐｕｌｓｅｄ）
接着性ＰＢＭＣを用いて各ＰＢＭＣ培養物（ウェル）を再刺激した。次いで、ペ
プチドの存在下または非存在下において、腫瘍ＡＰＣ．２２１Ａ２．１を用いて
刺激した後のＩＦＮγ生成を測定することによって、ＣＴＬ活性について培養物
を試験した。ＣＴＬ株はペプチド特異的なＩＦＮγ応答を示したＰＢＭＣ培養物
から、ペプチドを適用した接着性ＰＢＭＣを用いたさらなるインビトロ刺激よっ
て増殖した。
【０１７２】 （３．マウスＣＴＬ株） エピトープＨＢＶ Ｐｏｌ．４５５およびＨＩＶ Ｐｏｌ．４７６ペプチドに
対するＣＴＬ株を、他（Ｉｓｈｉｏｋａ、Ｇ．らＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９
９）１６２：３９１５）に記載されているようなＤＮＡ免疫によって、ＨＬＡ−
Ａ２．１／ＫbXSトランスジェニックマウス中で産生した。ＨＬＡ−Ａ２．１／
ＫbXSおよびＨＬＡ−Ａ２．１／ＫbXdトランスジェニックマウスはＥｐｉｍｍｕ
ｎｅで飼育された。これらの株は、Ｃ５７ＢＬ／６のバックグラウンド（Ｖｉｔ
ｉｅｌｌｏ，Ａ．らＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９１）１７３：１００７）にお
いて作製されたＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋbトランスジェニック株と、それぞれＳＪ
ＬまたはＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂ
ａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）との間の交雑のＦ１世代を表す。ＭＡＧＥ２．１５
７エピトープに対するＣＴＬ株は、８〜１２週齢ＨＬＡ−Ａ２．１／ＫbXSマウ
スの尾部の基部に、ＩＦＡ中で乳化された５０μｇのペプチドおよび１４０μｇ
のＨＢＶ Ｃｏｒｅ．１２８ＴｈエピトープであるＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ
（配列番号３０）を免疫し、そしてインビトロでペプチドを用いて繰り返し初回
刺激した脾細胞を再刺激することよって生じた。
【０１７３】 （調製Ｄ） （アッセイ方法） （１．ＨＬＡ−Ａ２．１分子に対するペプチド結合親和性の測定） 放射性標識された標準ペプチドのＨＬＡ−Ａ２．１への結合について、所定の
試験ペプチドによって誘導される競合のレベルを決定することによって、試験ペ
プチドのＨＬＡ−Ａ２．１への結合を測定した。ゲル濾過によってＭＨＣ結合性
放射能の百分率を決定し、そして、標識された標準ペプチドの結合の５０％を阻
害した試験ペプチドの濃度（ＩＣ50）を計算した（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ら、Ｃ
ｅｌｌ（１９９３）７４：９２９；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．（１９９４）３１：８１３）。標準ペプチドはＨＢＶ Ｃｏｒｅ．１８エピ
トープであった（配列ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ）。
【０１７４】 （２．ＣＴＬによるマウスおよびヒトのＩＦＮγ、ＩＬ５およびＩＬ１０産生
の測定） インサイチュの捕捉ＥＬＩＳＡを、ＣＴＬからのＩＦＮγ放出を測定するため
に使用した（ＭｃＫｉｎｎｅｙ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
（２０００）２３７：１０５）。簡潔には、ＣＴＬを抗マウスＩＦＮγ（クロー
ンＲ４−６Ａ２，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）または抗
ヒトＩＦＮγ ｍＡｂ（クローンＮＩＢ４２，Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）のいずれか
をプレコーティングしたＥＬＩＳＡ等級の９６ウェル平底ウェル中においてＡＰ
Ｃおよびペプチドを用いて刺激した。細胞培養後、ウェルを洗浄し、ビオチン化
した抗マウスＩＦＮγ（クローンＸＭＧ１．２，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）ｍＡｂ
または抗ヒトＩＦＮγ（クローン４Ｓ．Ｂ３，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）ｍＡｂを
加えた後、酵素結合体化ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ
Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）および３，３'，５，５'テトラメチルベンジジン
基質（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＴＭＢ基質キット、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏ
ｒｄ，ＩＬ）を加えることによって現像した。各ウェルの吸光度は４５０ｎｍで
Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＲＣ ＥＬＩＳＡプレートリーダ
ーにおいて測定した。各ウェルで生成されたＩＦＮγのレベルを、同じアッセイ
方法で確立されたマウスまたはヒトのＩＦＮγの検量線から外挿することによっ
て決定づけた。
【０１７５】 マウスおよびヒトのＩＬ５およびＩＬ１０をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いて培養上清中で測定
した。これらのアッセイを定量的サンドイッチＥＬＩＳＡ技術を用い、製造業者
のプロトコールに従って行った。
【０１７６】 （３．エキソビボＣＴＬ応答を測定するための酵素結合免疫スポット（Ｅｎｚ
ｙｍｅ−ｌｉｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）（Ｅｌｉｓｐｏｔ）アッセイ） Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを標準プロトコール（Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ
，Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９８）８：１７７；Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ｊ．ら
、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２０００）８７：３９１）に従って行った。簡潔
には、平底９６ウェルニトロセルロースプレート（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメン
ブレン，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を抗ＩＦＮγｍＡｂ（１
０μｇ／ｍｌ，クローンＲ４−６Ａ２）でコーティングし、４℃で一晩中インキ
ュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、プレートを１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培
地で３７℃で１時間でブロックした。磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ａｕｂｕ
ｒｎ，ＣＡ）によって単離された４×１０5個の脾性ＣＤ８+細胞および１０μｇ
／ｍｌのペプチドを適用された５×１０4個のＪｕｒｋａｔ−Ａ２．１／Ｋb細胞
を各ウェルに加え、細胞を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で２０時間インキュ
ベートした。インキュベーション後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いてプ
レートを徹底的に洗浄した後、ビオチン化した抗ＩＦＮγ ｍＡｂ（２μｇ／ｍ
ｌ，クローン ＸＭＧ１．２）を各プレートに加え、プレートを３７℃で４時間
インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を
含む）およびＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔａｓｔ
ａｉｎ Ｅｌｉｔｅ キット；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕ
ｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で４回洗浄した。室温で１時間インキュベートした後
、プレートを１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄し、次いでさ
らに３回１×ＰＢＳで洗浄した。スポットを現像するために１００μｌのＡＥＣ
溶液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えた。反
応は流水している水道水のもとで４−６分後に停止した。スポットをコンピュー
ター支援画像分析（Ｚｅｉｓｓ ＫＳ Ｅｌｉｓｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ，Ｊｅｎ
ａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてカウントした。１０6個のＣＤ８+細胞あたりの正
味のスポット数を、以下［(関連ペプチドに対するスポット数）−（非関連ペプ
チドに対するスポット数）］×２．５として計算した。
【０１７７】 （実施例１） （ヘテロクリティックな活性についてのペプチドアナログのスクリーニング） （Ａ．ＩＦＮγ放出の増加に関与しているＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．
１１２アナログの同定） アナログのスクリーニングの前に、広範囲な野生型ペプチド用量にわたってＣ
ＴＬ株からのＩＦＮγ生成のペプチド用量滴定を、行った。．２２１Ａ２．１腫
瘍細胞に異なる用量のペプチドを適用し、次いで、１０5個のペプチド負荷細胞
を同数のマウスまたはヒトＣＴＬと共に培養した。３７℃で２４時間（マウス）
または４８時間（ヒト）のインキュベーション後、ＣＴＬによって放出されたＩ
ＦＮγのレベルをインサイチュ捕捉ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。用量
滴定曲線を決定した後、ペプチドアナログのパネルの抗原性をスクリーニングす
るために、野生型ペプチドに対する活性がほとんど検出可能でない最適以下ペプ
チド用量を選択した。全てのマウスおよびヒトＣＴＬ株について、この最適以下
用量の範囲は０．１〜１μｇ／ｍｌであった。マウスＣＴＬ株は第３ドメイン内
のマウスＨ−２Ｋb配列を有しているＨＬＡ分子を発現するＨＬＡ−Ａ２．１／
Ｋbxsトランスジェニックマウスにおいて生成されたが、すべてがネイティブな
ＨＬＡ−Ａ２．１分子を発現するＡＰＣ上に提示されているペプチドに反応した
ということに留意すべきである。
【０１７８】 ペプチドアナログのスクリーニングについて、．２２１Ａ２．１細胞に選択さ
れた最適以下用量の各アナログを適用し、前述したようにペプチド負荷ＡＰＣを
ＣＴＬと共に培養した。次いで、さらなる特徴づけのために、野生型ペプチドと
比較して増強されたＣＴＬ応答を誘導するアナログを選択した。これらのアナロ
グを、前述したのと同じ条件のもとで野生型エピトープと並行してペプチド用量
滴定を行うことによって特徴付けた。
【０１７９】 ＨＬＡ−Ａ２．１拘束ＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２エピトープに
特異的なＣＴＬ株を、調製Ｃで記載したように、インビトロにおいてペプチド負
荷樹状細胞または接着性単球を用いてヒトＰＢＭＣの再刺激を繰り返すことによ
って、誘導した。
【０１８０】 １７個の異なる単一アミノ酸で各残基を体系的に置換することによって合計１
１７ＣＥＡ．６９１および１１６個のＭＡＧＥ３．１１２アナログを作製した。
ＣＥＡ．６９１はＩＭＩＧＶＬＶＧＶ（配列番号１）；ＭＡＧＥ３．１２２はＫ
ＶＡＥＬＶＨＦＬ（配列番号５）である。Ｃｙｓ、ＴｒｐおよびＭｅｔ残基は、
それらが保存的変化に対応しない限り、一般に回避した。主なＭＨＣアンカー位
置、位置２およびＣ末端以外のペプチドの全ての位置で置換を導入した。
【０１８１】 次いで、インビトロでこれらのアナログのを、その抗原性について試験した。
野生型ペプチドに応答するＩＦＮγ生成がほとんど検出可能でない抗原濃度を規
定にするために、前述したように、予備的な用量滴定実験を各ＣＴＬ株について
行った。ついで、Ｔ細胞刺激の許容量の増加に関連したアナログを同定するため
に、引き続きこの最適以下濃度をアナログペプチドの各エピトープについてのす
べての抗原性分析に用いた。このような抗原性分析の結果を図１に示す。図１Ａ
に示すように、最適以下１００ｎｇ／ｍｌ用量では、野生型ＣＥＡ．６９１ペプ
チドは最低限のＩＦＮγ生成（５０ｐｇ／ウェル未満）しか生じなかった。対照
的に、いくつかのＣＥＡ．６９１アナログ（Ｍ３、Ｌ４、Ｐ４、Ｈ５、Ｌ５、Ｈ
６、Ｔ６およびＩ７）は、同じ用量で、１５０〜３５０ｐｇ／ウェルの範囲内で
検出可能なレベルのＩＦＮγの産生を、誘導した。図１Ｂに示したように、野生
型ペプチドのＭＡＧＥ３．１１２特異的ＣＴＬ株１００ｎｇ／ｍｌが１００ｐｇ
／ｍｌのＩＦＮγの放出を誘導したが、２つのアナログ（Ｉ５およびＷ７）は３
００ｐｇ／ウェル以上のＩＦＮγレベルの誘導に関連していた。
【０１８２】 さらなる特徴付けのために、１００ｐｇ／ウェルを超えるＩＦＮγを刺激した
ＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２の全てのアナログを選択し、完全な用
量滴定はヘテロクリティックなアナログを同定するために実施した。ヘテロクリ
ティックなアナログは野生型ペプチドの１０倍以下のペプチド濃度で、有意なＩ
ＦＮγ放出（１００ｐｇ／ウェルより大きい）を刺激するアナログである。ＣＥ
Ａ．６９１エピトープについては２つの異なるアナログ、Ｍ３（配列番号２）お
よびＨ５（配列番号３）を同定した。図１Ｃで見られるように、エピトープＣＥ
Ａ６９１について、アナログＭ３およびＨ５が０．０１ｎｇ／ｍｌ程度の少ない
ペプチドを用いて有意な放出を刺激したが、野生型ペプチドは１〜１００μｇ／
ｍｌの用量範囲で有意に検出可能なＩＦＮγシグナルを産出した。これらの基準
によると、これらの２つのＣＥＡ．６９１アナログは、モル濃度に基づき、ＩＦ
Ｎγ放出の点において、その未改変野生型対応物よりも１００，０００倍以上強
力である。
【０１８３】 同様に、ＭＡＧＥ３．１１２エピトープについて、２つのヘテロクリティック
なアナログ、Ｉ５およびＷ７を同定した。図１Ｄに示すように、等価な応答を刺
激するためには、０．１ｎｇ／ｍｌのＩ５（配列番号６）またはＷ７（配列番号
７）アナログのいずれかが必要であったが、１μｇ／ｍｌの野生型ペプチド濃度
が有意なＩＦＮγの放出に必要とされた。これは、野生型ペプチドと比較して１
００，０００倍より高い生物学的な活性の増加に対応する。
【０１８４】 一般的に、ヘテロクリティックなアナログは用量応答変化を誘導するのみなら
ず、野生型ペプチドと比較してより高いレベルのＩＦＮγを産出するためのＣＴ
Ｌ応答を刺激した。その結果、アナログに応答して達成される最大用量応答（プ
ラトー）は未改変抗原に応答して得られる応答よりはるかに高かった。
【０１８５】 （実施例２） （さらなるヘテロクリティックなアナログの同定） ３つのさらなるＡ２．１拘束エピトープ、ＭＡＧＥ２．１５７ ＹＬＱＬＶＦ
ＧＩＥＶ、配列番号７腫瘍エピトープ、およびウイルス抗原からの２つのエピト
ープ、ＨＢＶ Ｐｏｌ．４５５、ＧＬＳＲＹＶＡＲＬ（配列番号１６）およびＨ
ＩＶ ｐｏｌ．４７６ ＩＬＫＥＰＶＨＧＦ（配列番号１８）を分析した。これ
らのエピトープは全て、ＣＴＬに対して免疫原性であることが以前に示されてい
る。
【０１８６】 調製Ｂおよび表２で述べたアミノ酸保存性割り当て（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）
を使って、２４０個の異なるアナログのパネルを、３つのエピトープのそれぞれ
においてエピトープ位置３、５、７、およびエピトープ位置１、４、６に、５つ
の保存的アミノ酸置換および５つの非保存的アミノ酸置換を含むように合成した
。これらのアナログを、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋbxsトランスジェニックマウスで
生じたマウスＴＣＬ株を使用し、そしてＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１
２エピトープについての実施例１で述べたものと類似した実験ストラテジーに従
い、へテロクリシティーについて試験した。マウス株の生成および維持に関連し
た技術的容易さに起因して、ＨＬＡトランスジェニックマウス由来のマウスＣＴ
Ｌ株をヒトＣＴＬ株の代わりに用いた。
【０１８７】 この結果を図２ＤのＨＩＶ ｐｏｌ．４６７について対応する用量滴定プロフ
ィールと共に図２Ａ（ＭＡＧＥ２．１５７）、２Ｂ（ＨＢＶ ｐｏｌ．４５５）
、および２Ｃ（ＨＩＶ ｐｏｌ．４７６）に示した（ＭＡＧＥ２．１５７および
ＨＩＶ Ｐｏｌ．４５５について、実施例３を参照のこと）。
【０１８８】 試験されたＭＡＧＥ２．１５７エピトープの総計８５個の異なるアナログの分
析は、野生型ペプチドより１／１００〜１／１００，０００倍の用量でＩＦＮγ
応答を刺激した２つのヘテロクリティックなアナログ、Ｉ５（配列番号８）およ
びＦ５（配列番号９）の同定を生じた（図１）；これらのアナログは両方ともペ
プチドの中央部の奇数位置（５位）において天然に存在している保存的または半
保存的な置換を有していた。
【０１８９】 ＨＩＶ ｐｏｌ．４７６エピトープについては、スクリーニングされた７８個
の異なるアナログの中から、２つ（Ｈ３（配列番号１９）およびＬ３（配列番号
２０））が、ヘテロクリティックな活性を有するとして同定された（表１)；両
方のアナログはペプチド中央部の奇数位置に保存的または半保存的置換のいずれ
かを保有していた。７７個の試験されたものの中から、ＨＩＶ ｐｏｌ．４５５
エピトープの１つのヘテロクリティックなアナログの正体が同定された。このア
ナログはペプチド（配列番号１７）の位置７に保存的置換基（Ｐ）を有していた
（表１)。
【０１９０】 従って、腫瘍およびウイルス起源の３つのさらなるエピトープ（ＭＡＧＥ２．
１５７、ＨＩＶ ｐｏｌ．４７６およびＨＢＶ Ｐｏｌ．４５５）についての２
４０個アナログから得られたデータは、実施例１で示したようなＭＡＧＥ３．１
１２およびＣＥＡ．６９１エピトープの分析と一致する。
【０１９１】 ヘテロクリシティーな分析をまた、２つのｐ５３エピトープにおいて行った。
１つのエピトープＰ５３．１４９Ｍ２、ＳＭＰＰＰＧＴＲＶ（配列番号１０）は
ＭＨＣ結合を増強するメチオニン残基置換を有するヒトｐ５３エピトープの固定
アンカーアナログ（ｆｉｘｅｄ ａｎｃｈｏｒ ａｎａｌｏｇ）を表す。第２の
エピトープ、Ｐ５３Ｍｕ．１８４、ＧＬＡＰＰＱＨＬＩＲＶ（配列番号１３）は
マウスとヒトとの間で完全に保存された配列を有している（Ｔｈｅｏｂａｌｄら
、９２（２６）：１１９９３（１９９５））。
【０１９２】 ｐ５３．１４９Ｍ２において行った用量滴定分析によって、１μｇ／ｍｌおよ
び０．１μｇ／ｍｌ用量範囲における最適および最適以下応答が明らかになった
。ｐ５３．１４９Ｍ２（各位置で５つの保存的および５つの半保存的置換）につ
いての７６個のアナログのパネルがスクリーニングされ、わずか２つのアナログ
、Ｃ１（配列番号１１）およびＰ７（配列番号１２）が同定された。この両方と
も、最適以下用量で１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγ放出を与える、図５。さらに
分析すると、両方のアナログは野生型ペプチドの１／１０倍の濃度で有意なＩＦ
Ｎγ産生を誘導した。さらに、Ｃ１アナログもまた１／１００倍のペプチド濃度
で有意なＩＬ１０レベルを誘導した、図６。
【０１９３】 ｐ５３ｍｕ．１８４エピトープに関して、用量滴定分析を行った後、ペプチド
の最適および最適以下レベルは、それぞれ５００ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍ
ｌであると決定した。６３個の保存的および半保存的置換アナログのパネルを免
疫原性について試験した。増強された免疫原性を有する２つのアナログが見い出
された−Ｔ３（配列番号１４）およびＴ３、Ｅ６（配列番号１５）。図７および
８を参照のこと。
【０１９４】 （実施例３） （ヘテロクリティックなアナログによって誘導されるリンホカインプロフィ ール） ヘテロクリティックなアナログはＴ細胞からのサイトカインの生成を示差的に
活性化することが以前に示されており、それにより、いくつかのアナログがＴｈ
１サイトカインを生成するために特異的にＴ細胞を活性化するが、他は優先的に
Ｔｈ２サイトカインの生成を活性化する。本発明のヘテロクリティックなアナロ
グに関連するリンホカイン放出のパターンを研究するため、ＣＴＬ株からのＴｈ
２サイトカインであるＩＬ５および／またはＩＬ１０の生成をＩＦＮγの生成と
比較した。２つの異なるエピトープからの代表的なデータを図３および４に示し
た。
【０１９５】 図３はＭＡＧＥ２．１５７アナログによって誘導されたリンホカインのプロフ
ィールを示す。アナログＩ５もしくはＦ５、または野生型（ＷＴ）ペプチドを適
用した．２２１Ａ２．１標的に応答して、ＭＡＧＥ２．１５７特異的ＣＴＬ株に
よって生成されたＩＦＮγ（Ａ）およびＩＬ１０（Ｂ）をいくつかの異なる用量
に対して測定した。点線はＩＦＮγ（１００ｐｇ／ウェル）またはＩＬ１０（５
０ｐｇ／ｍｌ）の有意なレベルを示している。図３Ａで見られるように、ＭＡＧ
Ｅ２．１５７のＦ５およびＩ５アナログは、それぞれ野生型ペプチドの１／１０
０倍または１／１０，０００倍の濃度でＩＦＮγ生成の有意なレベルを誘導した
。さらに、同じアナログはまた、野生型ペプチドの１／１０倍または１／１００
倍のペプチド濃度で、有意なＩＬ１０生成誘導した。
【０１９６】 同じ傾向を示す、別のエピトープＨＢＶ Ｐｏｌ．４５５からのデータを、図
４Ａおよび４Ｂに示した。いくつかの異なるペプチド用量に対して、アナログＰ
７または野生型（ＷＴ）ペプチドに応答してＨＢＶ Ｐｏｌ．４５５ＣＴＬ株に
よって放出されたＩＦＮγ（Ａ）またはＩＬ１０（Ｂ）を示した。再度、ＨＢＶ
Ｐｏｌ．４５５のＰ７アナログは、有意なレベルのＩＦＮγ（図４Ａ）および
ＩＬ１０（図４Ｂ）を野生型ペプチドの１／１００倍のペプチド濃度において誘
導した。Ｔｈ２サイトカイン（表１）の誘導について試験した全てのヘテロクリ
ティックなアナログをまとめたデータを総合すると、ほとんどのヘテロクリティ
ックなアナログは増加したＴｈ１およびＴｈ２サイトカインの両方の生成を刺激
することが示される。
【０１９７】 （実施例４） （ヘテロクリティックアナログのＨＬＡ−Ａ２．１との結合親和力） 観察されたＣＴＬ株によって向上した認識が、アナログエピトープとＭＨＣと
の結合能力における偶然の増加に起因しないことを実証するために、精製したＨ
ＬＡ−Ａ２．１分子を、インビトロで利用して全てのヘテロクリティックアナロ
グとＭＨＣとの結合親和力を測定し、そして調製Ｄに記載されているように未改
変の野生型対照物と比較した。
【０１９８】 表１に概説されているように、３つのアナログ（ＭＡＧＥ３．１１２Ｗ７、Ｈ
ＩＶ Ｐｏｌ．４７６Ｈ３、およびＨＩＶＰｏｌ．４７６Ｌ３）は、ＨＬＡ−Ａ
２．１と野生型ペプチドよりも４倍以上高い親和力で結合し、そして２つのアナ
ログ（ＭＡＧＥ２．１５７Ｉ５、ＭＡＧＥ２．１５７Ｆ５）は低い親和力で結合
した。残る４つのヘテロクリティックアナログであるＭＡＧＥ３．１１２Ｉ５、
ＣＥＡ．６９１Ｍ３、ＣＥＡ．６９１Ｈ５、およびＨＢＶ Ｐｏｌ．４５５Ｐ７
は、ＨＬＡ−Ａ２．１との結合能力において、ほとんどあるいは全く変化なしで
結合した。これらのデータからひとまとめにして、増加した結合性とヘテロクリ
シティーとの間に相関はないことが示唆される。
【０１９９】 （実施例５） （マウスｐ５３．２６１エピトープに関するアナログの予測および免疫原性） インビボで免疫原性に関して試験するために、ＨＬＡ−Ａ２．１を制限したマ
ウスｐ５３．２６１エピトープを使用した。この理由は、このエピトープに対す
るＣＴＬ応答は、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋbトランスジェニックマウスにおいて局
部的に寛容化されることが示されているためである。これはインビボでＴ細胞の
耐性を破壊すると予測されたヘテロクリティックアナログの能力の分析を可能に
する。従来まで、ヘテロクリティックアナログは野生型エピトープに対して引き
起こされるＣＴＬ株とともにインビトロでのスクリーニングを通じて検出されて
きたが、置換法によって同定したアナログは野生型エピトープに対してヘテロク
リティックであるＣＴＬをインビトロで潜在的に誘導し得り、寛容な腫瘍関連エ
ピトープに対するワクチンを設計するための目的の適応である。
【０２００】 ｐ５３．２６１の予測されるアナログに関する免疫原性を、ＨＬＡ−Ａ２．１
／Ｋbxdトランスジェニックマウスにおいて、ｐ５３．２６１エピトープ（ＬＬ
ＧＲＤＳＦＥＶ）５０μｇ、または予測されるアナログおよびＩＦＡにおけるＨ
ＢＶ Ｃｏｒｅ．１２８ヘルパーエピトープ１４０μｇとを用いてマウスを共同
免疫することで試験した。１１日後、プライム化脾臓細胞を収集し、そして１０
μｇ／ｍｌのペプチドでパルスした照射同系ＬＰＳ活性化脾臓細胞とともにイン
ビトロで培養した。培養から１０日後、ＣＴＬをＩＬ２の供給源としてＣｏｎ
Ａの馴化培地の存在下で、ペプチドでパルスしたＬＰＳ芽細胞で再刺激した（Ｉ
ｓｈｉｏｋａ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６２：３９１５）
。 予測アナログによって免疫化されたマウス由来の脾臓細胞を、野生型ペプチド（
交差反応性、アビディティおよび野生型抗原に応答するＣＴＬの前駆体度数を決
定するため）とそれぞれの免疫化アナログ（アビディティとアナログに応答する
ＣＴＬの前駆体度数を決定するため）の両方に対してインビトロで刺激した。Ａ
ＰＣとしてＪｕｒｋａｔ−Ａ２．１腫瘍細胞を用いることで、インビトロでの２
回目の再刺激の５日後でのＩＦＮγのインサイチュのＥＬＩＳＡアッセイによる
ペプチドの特異性に関して、ＣＴＬのバルク集団を全ての短い周期で試験した。
あるいは、ＣＴＬ応答を、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを用いて免疫化動物から新た
に単離した脾臓細胞上で実施した。
【０２０１】 ９マーペプチドの３、５および７の位置における３つの保存的、または半保存
的置換からなるｐ５３．２６１エピトープの９つのアナログのパネルを、ＨＬＡ
−Ａ２．１／Ｋbxdトランスジェニックマウスにおける免疫原性について試験し
た。その結果、それぞれ９つのアナログでのマウスの免疫、およびそれぞれの免
疫化アナログでのプライム化脾細胞のインビトロでの膨張により６つのアナログ
（Ｌ７、Ｄ３、Ｈ７、Ｈ３、Ｎ５、およびＧ５）を同定し、これは野生型ペプチ
ドを用いてインビボで誘導され、そしてインビトロで膨張されたＣＬＴと比較し
て、かなりより低いペプチド濃度で、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγ産生によっ
て特徴づけられたＣＴＬ応答が得られた。
【０２０２】 ＷＴペプチドまたは適応したアナログのいずれかによって免疫化されたマウス
由来の脾臓細胞を、インビトロで対応する免疫ペプチド（図９ＡおよびＢ）また
はＷＴペプチド（図９ＣおよびＤ）を用いて刺激した。次いで、これらのＣＴＬ
によるＩＦＮγの放出を、免疫ペプチド（図９ＡおよびＢ）またはＷＴペプチド
（図９ＣおよびＤ）を用いてパルス化した標的に対して用量範囲にわたって測定
した。１００ｐｇ／ウェルにおけるＩＦＮγの放出を点線で示す。これらの結果
より、アナログの有意なパーセンテージは、野生型ペプチドそれ自体で誘導され
たアビディティよりも高いアビディティのＣＴＬを誘導することが示される。
【０２０３】 野生型ペプチドに対するヘテロクリティックアナログでプライム化されたＣＴ
Ｌの交差反応性を、図９Ｃおよび図９Ｄに示す。野生型ペプチドで免疫化し、そ
して再刺激した動物由来のＣＴＬは、０．１から１０μｇ／ｍｌの間のペプチド
用量において１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγを誘導した。もう一方で、Ｌ７、Ｈ
３、およびＤ３アナログで免疫化し、そして野生型ペプチドを用いてインビトロ
で刺激し、そして試験した動物から得られたＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェルのＩ
ＦＮγを誘導するために、それぞれ１０倍、１００倍または１０００倍低い用量
の野生型ペプチドが必要であった（図４Ｃ）。これにより、６つのケースの内３
つのケースにおいて、予測されるヘテロクリティックアナログは、野生型抗原に
対して寛容である一部のＣＴＬが存在する条件において、野生型ペプチドと応答
するＣＴＬを誘導するのに１０〜１０００倍の活性および能力であったことが示
唆される。
【０２０４】 （実施例６） （野生型との交差反応性） Ｄ３およびＨ３アナログにより誘導されたＣＴＬの交差反応性もまた、自然処
理された野生型エピトープに対してＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋbを用いてトランスフ
ェクトされたｐ−５３発現Ｍｅｔｈ Ａ腫瘍細胞クローンによって試験した。野
生型エピトープに対してヘテロクリティックであるｐ−５３．２６１アナログに
よって産生したＣＴＬは、Ｍｅｔｈ Ａ／Ａ２．１Ｋb腫瘍細胞によって出現し
た内因的に処理されたｐ−５３．２６１エピトープと応答することが明らかとな
った。
【０２０５】 ＣＴＬ集団（１０5／ウェル）は、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋbと共にトランスフェ
クトされたＭｅｔｈ Ａクローン、または２．５×１０4のＭｅｔｈ Ａ腫瘍細
胞とともに培養し、ＩＦＮγの放出はインサイチュＥＬＩＳＡアッセイによって
測定した。図１０に示しているように、ｐ−５３．２６１エピトープのＤ３とＨ
３アナログの両方に対して増加したＣＴＬ株は、Ｍｅｔｈ Ａ／Ａ２．１Ｋb腫
瘍細胞クローンによって発現された内因性エピトープと応答し、親ＨＬＡ−Ａ２
．１ネガティブＭｅｔｈ Ａ腫瘍細胞株とは応答しなかった。
【０２０６】 （実施例７） （Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを用いた前駆体度数の分析） 野生型ペプチドに対する交差反応性ＣＴＬが、アナログで免疫化されたマウス
において産生されることを確証するために、インビトロでのさらなるＣＴＬ膨張
なしでアナログまたは野生型ペプチドで免疫化されたマウスの脾臓細胞からＣＤ
８+細胞を単離し、そして野生型またはアナログのどちらか一方に対するＣＴＬ
反応性の前駆体度数をＥｌｉｓｐｏｔアッセイを用いて測定した。
【０２０７】 ＷＴエピトープ、またはＤ３、Ｈ３、Ｌ７およびＨ７アナログの何れか一方で
免疫化されたマウスから単離したＣＤ８+細胞を、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにお
いてＷＴエピトープで刺激した場合のＩＦＮγの放出する能力について分析した
。図１１に示すように、野生型ペプチド反応性ＣＴＬの前駆体度数は、野生型ペ
プチドで免疫化されたマウスにおいて１／６６，０００（１５点／１０6）であ
ったのに対して、予測アナログで免疫化されたマウスにおける野生型ペプチド反
応性細胞の前駆体度数は、Ｄ３、Ｈ３およびＬ７アナログに対してほぼ１／１５
，０００（６０〜７５点／１０6細胞）であり、そしてＨ７アナログに対して１
／８３，０００（１２点／１０6）であった。これより、野生型反応性細胞は、
天然ペプチドで免疫化されたマウスに比べて４つのアナログのうち３つのアナロ
グで免疫化されたマウスにおいて４倍高い度数で存在していたことが示される。
この発見は、インビボ−プライム化ＣＴＬのインビトロでの膨張を回避する、よ
り直接的な分析システムを用いたヘテロクリティックアナログでのインビボ免疫
化は、野生型ペプチドに対して実際により複数のＣＴＬ反応性を誘導することを
示すので重要である。
【０２０８】 （実施例８） （ヘテロクリティックアナログはインビトロで腫瘍細胞を認識し得るヒトＣＴ
Ｌを誘導する） 調製Ｃに記載されているように、ＭＡＧＥ３．１１２のヘテロクリティックア
ナログの免疫原性もまた、ＭＡＧＥ３．１１２ペプチド、またはこのエピトープ
のＩ５およびＷ７アナログのどちらか一方に対するＰＢＭＣから１次ＣＴＬを誘
導することによって試験した。インビトロでの２回目の刺激の後、４８ウェルの
ＰＢＭＣ培養は、正味のＩＦＮγ産物が１００ｐｇ／ウェルより多い場合にはＣ
ＴＬ誘導に対して陽性を記録し、そして産物はペプチドの存在下、または非存在
下で．２２１−Ａ２．１ ＡＰＣで刺激した後ではバックグラウンドより少なく
とも２倍以上となった。
【０２０９】 ヒト腫瘍抗原に対する本発明者らの所見の生理学的な関連性を強調するために
、本発明者らはインビトロでの１次誘導システムにおいて、ＭＡＧＥ３．１１２
エピトープのヘテロクリティックアナログがヒトＣＴＬを誘導し得るかどうかを
試験した。正常のドナー由来の新しい未処理のヒトＰＢＭＣを、前述しているよ
うに野生型またはアナログのどちらか一方を用いてインビトロで繰り返し刺激し
た（Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）
５９：１）。ペプチド特異的ＣＴＬ応答を、野生型ペプチド（図１２Ａ）または
Ｉ５アナログ（図１２Ｂ）およびＷ７アナログ（図１２Ｃ）のいずれかで刺激さ
れた培地中で検出した。手短に言えば、．２２１−Ａ２．１細胞をＷＴペプチド
（図１２Ａ）、Ｉ５アナログ（図１２Ｂ）またはＷ７アナログ（図１２Ｃ）１０
μｇ／ｍｌで一晩パルスした。４８ウェルプレートの個々のウェルに成長してい
るＣＴＬによるＩＦＮγ産物を、ペプチドの存在下、または非存在下で．２２１
−Ａ２．１細胞に対して、あるいは内因性ネガティブエピトープ８８８メル腫瘍
細胞株および内因性ポジティブエピトープ６２４メル腫瘍細胞株に対して試験し
た。ポジティブペプチド特異的ＣＴＬ応答を示すウェルのみが示される。
【０２１０】 さらに重要なことに、これらのアナログとともに誘導された培地により、内因
的に処理し、そして野生型配列を示す６２４メル腫瘍細胞株が認識された。これ
は、ヘテロクリティックアナログは腫瘍細胞によって示される内因的に産生され
た野生型エピトープを認識する生理学的に関連性のあるヒトＣＴＬを誘導し得る
ことの証拠であり、そしてその現象は、ヒトとトランスジェニックマウスシステ
ムの両方に関連性があることの証拠である。
【０２１１】 （実施例９） （ＨＬＡ Ａ２スーパーファミリーメンバーにおけるＨＬＡ−Ａ２．１スーパ
ーモチーフから誘導されたヘテロクリティックアナログの合成および分析） Ａ２スーパーファミリー内部の他のＨＬＡ分子におけるヘテロクリティック置
換法則をさらに確認するために、３、５および７の位置における３つの保存的、
または半保存的置換よりなる、以前に議論したｐ５３．２６１エピトープの９つ
のアナログのパネルを、以下に示すヒトＨＬＡ分子（Ａ*０２０２、Ａ*０２０３
、Ａ*０２０４、Ａ*０２０５、Ａ*０２０６、Ａ*０２０７、Ａ*０２０９、Ａ*０
２１４、Ａ*６８０２、Ａ*６９０１）の１つを発現しているトランスジェニック
マウスにおける免疫原性についてインビボで試験した。
【０２１２】 上述したアナログで免疫化されたマウス由来のＣＴＬを、少なくとも１００ｐ
ｇ／ウェルのＩＦＮγ産生の誘導について試験した。代表的に、このＩＦＮγ産
生は、野生型ペプチド（例えば、ｐ５３．２６１エピトープ）で誘導され、そし
て再刺激されたペプチド濃度よりもさらに低いペプチド濃度で存在する。これら
の結果は、本発明者らの予測したヘテロクリティックアナログは、野生型エピト
ープ自体に対するよりも、天然野生型エピトープに対してより高いアビディティ
ＣＴＬを誘導するのにより強力であることを示す。
【０２１３】 代表的に、野生型ペプチドで免疫化され、そして再刺激された動物から得られ
たＣＴＬは、５〜１０μｇ／ｍｌ用量のペプチドにおいて１００ｐｇ／ウェルの
ＩＦＮγを誘導するが、上述したアナログで免疫化された動物から得られ、野生
型ペプチドでインビトロで刺激し、そして試験したＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェ
ルのＩＦＮγを誘導するために野生型ペプチドの用量よりもそれぞれ１０倍、１
００倍または１０００倍までも低い用量を必要とする。
【０２１４】 （実施例１０） （ＨＬＡ Ｂ７スーパーファミリーメンバーにおけるＨＬＡ−Ｂ７スーパーモ
チーフから誘導されたヘテロクリティックアナログの合成および分析） ヘテロクリティック置換法則をさらに確認するために、ＨＬＡ−Ｂ７スーパー
モチーフの内部に配列を持っているペプチドから誘導されたヘテロクリティック
アナログを用いて追加研究を行った。例えば、アナログをインビボで免疫原性に
ついて試験し得る。
【０２１５】 本研究では、ペプチドを持ったＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフであるＡＰＲＴ
ＬＶＹＬＬエピトープを選択し、そして合成した。９マーペプチドの３、５およ
び７の位置における３つの保存的、または半保存的置換よりなるアナログのパネ
ルを、ＨＬＡ−Ｂ*０７０２／Ｋbトランスジェニックマウスにおける免疫原性に
ついて試験した。パネルはＡＰＥＴＬＶＹＬＬ、ＡＰＲＴＷＶＹＬＬおよびＡＰ
ＲＴＬＶＰＬＬを含み、それぞれ３、５および７番目の位置における半保存的置
換と対応している。
【０２１６】 上述したアナログで免疫化されたマウス由来のＣＴＬを、少なくとも１００ｐ
ｇ／ウェルのＩＦＮγの誘導について試験した。代表的に、このＩＦＮγ産生は
、野生型ペプチド（例えば、ＡＰＲＴＬＶＹＬＬ）で誘導され、そして再刺激さ
れたペプチド濃度よりもさらに低いペプチド濃度で存在する。これらの結果は、
本発明者らの予測したヘテロクリティックアナログは、野生型ペプチド自体より
も高いアビディティＣＴＬを誘導するのにより強力であることを示す。
【０２１７】 代表的に、野生型ペプチドで免疫化され、そして再刺激された動物から得られ
たＣＴＬは、５〜１０μｇ／ｍｌ用量のペプチドにおいて１００ｐｇ／ウェルの
ＩＦＮγを誘導するが、上述したアナログで免疫化された動物から得られ、野生
型ペプチドでインビトロで刺激し、そして試験したＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェ
ルのＩＦＮγを誘導するために野生型ペプチドの用量よりもそれぞれ１０倍、１
００倍または１０００倍までも低い用量を必要とする。
【０２１８】 Ｂ７スーパーファミリー内部の他のＨＬＡ分子についてヘテロクリティック置
換法則をさらに確認するために、ＡＰＥＴＬＶＹＬＬ、ＡＰＲＴＷＶＹＬＬおよ
びＡＰＲＴＬＶＰＬＬペプチドを、以下のヒトＨＬＡ分子（Ｂ*０７０２、Ｂ*０
７０３、Ｂ*０７０４、Ｂ*０７０５、Ｂ*１５０８、Ｂ*３５０１、Ｂ*３５０２
、Ｂ*３５０３、Ｂ*３５０３、Ｂ*３５０４、Ｂ*３５０５、Ｂ*３５０６、Ｂ*３
５０７、Ｂ*３５０８、Ｂ*５１０１、Ｂ*５１０２、Ｂ*５１０３、Ｂ*５１０４
、Ｂ*５１０５、Ｂ*５３０１、Ｂ*５４０１、Ｂ*５５０１、Ｂ*５５０２、Ｂ*５
６０１、Ｂ*５６０２、Ｂ*６７０１、およびＢ*７８０１）の１つを発現してい
るトランスジェニックマウスにおける免疫原性についてインビボで試験した。
【０２１９】 上述したアナログで免疫化されたマウス由来のＣＴＬを、少なくとも１００ｐ
ｇ／ウェルのＩＦＮγ産生の誘導について試験した。代表的に、このＩＦＮγ産
生は、野生型ペプチド（例えば、ＡＰＲＴＬＶＹＬＬ）で誘導され、そして再刺
激されたペプチド濃度よりもさらに低いペプチド濃度で存在する。これらの結果
は、本発明者らの予測したヘテロクリティックアナログは、野生型ペプチド自体
より高いアビディティＣＴＬを誘導するのにより強力であることを示す。
【０２２０】 代表的に、野生型ペプチドで免疫化され、そして再刺激された動物から得られ
たＣＴＬは、５〜１０μｇ／ｍｌ用量のペプチドにおいて１００ｐｇ／ウェルの
ＩＦＮγを誘導するが、上述したアナログで免疫化された動物から得られ、野生
型ペプチドでインビトロで刺激し、そして試験したＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェ
ルのＩＦＮγを誘導するために野生型ペプチドの用量よりもそれぞれ１０倍、１
００倍または１０００倍までも低い用量を必要とする。
【０２２１】 （Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを用いた前駆体度数の分析） 野生型ペプチドに対する交差反応性ＣＴＬが、アナログで免疫化されたマウス
において産生されることを確証するために、インビトロでのさらなるＣＴＬ膨張
なしでアナログまたは野生型ペプチドで免疫化された脾臓からＣＤ８+細胞を単
離した。この材料より、野生型、またはアナログのどちらか一方に対するＣＴＬ
反応性の前駆体度数をＥｌｉｓｐｏｔアッセイを用いて測定した。代表的に、野
生型ペプチドの反応性ＣＴＬの前駆体度数は、アナログの前駆体度数よりもかな
り低い。
【０２２２】 （ヘテロクリティックアナログによってインビトロでエピトープを認識し得る
ヒトＣＴＬを誘導し得る） ヘテロクリティックアナログを、インビトロでの１次誘導システムにおけるＣ
ＴＬの誘導について分析し得る。前記のように、４８ウェルプレートにおいて正
常のドナーからの新しい未処理のヒトＰＢＭＣを、野生型またはアナログのどち
らか一方を用いてインビトロで繰り返し刺激した。次に、ペプチド特異的ＣＴＬ
応答を、野生型ペプチドまたはヘテロクリティックアナログのどちらか一方で刺
激された培地中で検出する。これらのアナログで誘導された培地において、内因
的に処理され、そして野生型配列を示す標的を認識し得る。これは、ヘテロクリ
ティックアナログが内因的に産生された細胞上で発現した野生型ペプチドを認識
する生理学的に関連性のあるヒトＣＴＬを誘導し得ることの証拠であり、そして
その現象はヒトとトランスジェニックマウスシステムの両方に関連性があること
の証拠である。
【０２２３】 （実施例１１） （ＨＬＡ Ａ３スーパーファミリーメンバーにおけるＨＬＡ−Ａ３スーパーモ
チーフから誘導されたヘテロクリティックアナログの合成および分析） ヘテロクリティック置換法則をさらに進んで確認するために、ＨＬＡ−Ａ３ス
ーパーモチーフの内部に配列を有するペプチドから誘導されたヘテロクリティッ
クアナログを用いて追加研究を行う。例えば、インビボで免疫原性についてアナ
ログを試験し得る。
【０２２４】 本研究では、ペプチドを有するＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフであるＫＶＦＰ
ＹＡＬＩＮＫ（配列番号２２）エピトープを選択し、そして合成する。９マーペ
プチドの３、５および７の位置における３つの保存的／半保存的置換よりなる配
列番号２２のアナログのパネルを、ＨＬＡ−Ａ*３１０１／Ｋbトランスジェニッ
クマウスにおける免疫原性について試験した。パネルはＫＶＨＰＹＡＬＩＮＫ、
ＫＶＦＰＱＡＬＩＮＫおよびＫＶＦＰＹＡＫＩＮＫを含み、それぞれ３、５およ
び７番目の位置における半保存的変化と対応している。
【０２２５】 上述したアナログで免疫化されたマウス由来のＣＴＬを、少なくとも１００ｐ
ｇ／ウェルのＩＦＮγ産生の誘導について試験した。代表的に、このＩＦＮγ産
生は、野生型ペプチド（例えば、ＫＶＦＰＹＡＬＩＮＫ）で誘導され、そして再
刺激されたペプチド濃度よりもさらに低いペプチド濃度で存在する。これらの結
果は、本発明者らの予測したヘテロクリティックアナログは、野生型ペプチド自
体より野生型に対して高いアビディティＣＴＬを誘導するのにより強力であるこ
とを示す。
【０２２６】 代表的に、野生型ペプチドで免疫化され、そして再刺激された動物から得られ
たＣＴＬは、５〜１０μｇ／ｍｌ用量のペプチドにおいて１００ｐｇ／ウェルの
ＩＦＮγを誘導するが、上述したアナログで免疫化された動物から得られ、野生
型ペプチドでインビトロで刺激し、そして試験したＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェ
ルのＩＦＮγを誘導するために野生型ペプチドの用量よりもそれぞれ１０倍、１
００倍または１０００倍までも低い用量を必要とする。
【０２２７】 Ａ３スーパーファミリー内部の他のＨＬＡ分子についてヘテロクリティック置
換法則をさらに確認するために、ＫＶＨＰＹＡＬＩＮＫ、ＫＶＦＰＱＡＬＩＮＫ
およびＫＶＦＰＹＡＫＩＮＫペプチドを、以下のヒトＨＬＡ分子（Ａ*０３０１
、Ａ*１１０１、Ａ*３１０１、Ａ*３３０１、Ａ*６８０１）の１つを発現してい
るトランスジェニックマウスにおけるインビボでの免疫原性について試験する。
【０２２８】 上述したアナログで免疫化されたマウス由来のＣＴＬを、少なくとも１００ｐ
ｇ／ウェルのＩＦＮγ産生の誘導について試験した。代表的に、このＩＦＮγ産
生は、野生型ペプチド（例えば、ＫＶＦＰＹＡＬＩＮＫ）で誘導され、そして再
刺激されたペプチド濃度よりもさらに低いペプチド濃度で存在する。これらの結
果は、本発明者らの予測したヘテロクリティックアナログは、野生型ペプチド自
体より高いアビディティＣＴＬを誘導するのにより強力であることを示す。
【０２２９】 代表的に、野生型ペプチドで免疫化され、そして再刺激された動物から得られ
たＣＴＬは、５〜１０μｇ／ｍｌ用量のペプチドにおいて１００ｐｇ／ウェルの
ＩＦＮγを誘導するが、上述したアナログで免疫化された動物から得られ、野生
型ペプチドでインビトロで刺激し、そして試験したＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェ
ルのＩＦＮγを誘導するために野生型ペプチドの用量よりもそれぞれ１０倍、１
００倍または１０００倍までも低い用量を必要とする。
【０２３０】 （Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを用いた前駆体度数の分析） 野生型ペプチドに対する交差反応性ＣＴＬが、アナログで免疫化されたマウス
において産生することを確証するために、インビトロでのさらなるＣＴＬ膨張な
しでアナログまたは野生型ペプチドで免疫化された脾臓からＣＤ８+細胞を単離
した。この材料より、野生型、またはアナログのどちらか一方に対するＣＴＬ反
応性の前駆体度数をＥｌｉｓｐｏｔアッセイを用いて測定した。代表的に、野生
型ペプチドの反応性ＣＴＬの前駆体度数は、アナログの前駆体度数よりもかなり
低い。
【０２３１】 （ヘテロクリティックアナログはインビトロでエピトープを認識し得るヒトＣ
ＴＬを誘導し得る。） ヘテロクリティックアナログを、インビトロでの１次誘導システムにおけるＣ
ＴＬの誘導について分析する。前記したように、４８ウェルプレートにおいて正
常のドナー由来の新しい未処理のヒトＰＢＭＣを、野生型またはアナログのどち
らか一方を用いてインビトロで繰り返し刺激した。次に、ペプチド特異的ＣＴＬ
応答を、野生型ペプチドまたはヘテロクリティックアナログのどちらか一方で刺
激された培地中で検出する。これらのアナログで誘導された培地において、内因
的に処理し、そして野生型配列を示す標的を認知する。これは、ヘテロクリティ
ックアナログが内因的に産生される細胞上に発現した野生型ペプチドを認識する
生理学的に関連性のあるヒトＣＴＬを誘導することの証拠であり、そしてその現
象はヒトとトランスジェニックマウスシステムの両方に関連性があることの証拠
である。
【０２３２】 本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示の目的のためだけであ
り、本発明に照らして、様々な改良または変更は当業者に示唆され、そして本出
願の意図および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解され
る。この結果、本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は
、全ての目的のためにその全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａおよび１Ｂは、ＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２のそれぞれの
アナログのパネルを、その対応するＣＴＬにおいてＩＦＮγ産生を誘導する能力
について、試験した結果を示す。図１Ｃおよび１Ｄは、それぞれＣＥＡ．６９１
およびＭＡＧＥ３．１１２ヘテロクリティックアナログについてその対応する用
量応答曲線である。
【図２】 図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは、ＭＡＧＥ２．１５７、ＨＩＶＰｏｌ．４７６、
およびＨＢＶＰｏｌ．４５５エピトープアナログのアナログのパネルを、対応す
るＣＴＬにおいてＩＦＮγ産生を誘導するこれらのアナログの能力に関して、試
験した結果を示す。図２Ｄは、首尾よいＨＩＶＰｏｌ．４７６アナログについて
の関連した用量応答曲線である。
【図３】 図３Ａおよび３Ｂは、適切なＣＴＬからＩＦＮγ産生またはＩＬ１０産生を誘
導する能力に関して、野生型との比較におけるＭＡＧＥ２．１５７のヘテロクリ
ティックアナログの用量応答曲線の結果を示す。
【図４】 図４Ａおよび４Ｂは、適切なＣＴＬにおいてＩＦＮγおよびＩＬ１０の産生に
対する、野生型およびＨＩＶＰｏｌ．４７６のヘテロクリティックアナログにつ
いての用量応答曲線である。
【図５】 図５は、エピトープｐ５３．１４９Ｍ２の潜在的なヘテロクリティックアナロ
グのパネルを、適切なＣＴＬからのＩＦＮγの産生に関して、試験した結果であ
る。
【図６】 図６Ａおよび６Ｂは、ｐ５３．１４９Ｍ２の首尾よいヘテロクリティックアナ
ログによるＩＦＮγおよびＩＬ１０の産生に対する、対応する用量応答曲線であ
る。
【図７】 図７は、ＣＴＬにおけるＩＦＮγ産生に対するｐ５３．Ｍｕ１８４エピト−プ
の潜在的なアナログのパネルを試験した結果である。
【図８】 図８は、ＩＦＮγ産生に関する、野生型、およびｐ５３．Ｍｕ１８４の２つ首
尾よいヘテロクリティックアナログについての用量応答曲線である。
【図９】 図９Ａ〜Ｄは、対応する野生型エピトープに関する、ヘテロクリティックアナ
ログの反応交差性を示す。図９Ａおよび９Ｂにおいて、ＩＦＮγ産生は、免疫ペ
プチドによる刺激を使用して、濃度の関数としてプロットされる。図９Ｃおよび
９Ｄは、野生型エピトープが、ＣＴＬの初期誘導のために使用されるヘテロクリ
ティックアナログとは対抗的に、刺激剤として使用される場合の、対応する結果
である。
【図１０】 図１０は、ｐ５３．２６１およびそのヘテロクリティックアナログによる誘導
に関する、ＩＦＮγの放出である。
【図１１】 図１１は、種々のヘテロクリティックアナログに関するＥｌｉｓｐｏｔの結果
である。
【図１２】 図１２は、種々のヘテロクリティックアナログを使用する内因性のペプチドに
対するＣＴＬ活性の刺激の結果である。
【図１０１】 図１０１は、実施例で用いられるペプチド、および腫瘍抗原およびウイルス抗
原から同定されたヘテロクリティックアナログの特徴を示す、表１である。
【図１０２】 図１０２は、所定のアミノ酸置換を、保存的置換、半保存的置換、または非保
存的置換であるとして特徴付けし得るように、任意の所定のアミノ酸対の間の類
似性の割り当てを示す、表２である。
【図１０３】 図１０３は、表３である。
【図１０４】 図１０４は、表４である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/10 31/10 31/12 31/12 33/00 33/00 35/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 7/00 Ｃ０７Ｋ 7/00 16/18 16/18 19/00 19/00 Ａ６１Ｋ 39/002 Ｃ１２Ｎ 5/10 39/02 // Ａ６１Ｋ 39/002 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 39/02 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 イシオカ， グレン アメリカ合衆国 カリフォルニア 92075， ソラナ ビーチ， ナブド アベニュー 7255 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 BA36 CA04 DA02 EA04 GA11 4B065 AA94X AA99Y AB01 AC14 AC20 BA02 CA24 CA44 CA45 4C084 AA13 MA52 MA55 MA66 NA14 ZB262 ZB332 ZB352 ZB372 4C085 AA03 BA01 BA07 BA51 BB01 EE01 GG02 GG03 GG04 GG05 GG08 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA16 BA17 BA41 CA40 CA41 DA75 DA86 EA28 EA31 FA74 【要約の続き】

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 エピトープを含むペプチドの免疫原性を高める方法であって
    、該方法が、以下： ｉ）第一のクラスＩエピトープを含むペプチドを提供する工程であって、ここ
    で該エピトープが、本質的にＮ末端およびＣ末端ならびに少なくとも１つの一次
    アンカー残基を有するアミノ酸配列からなり、ここで該アミノ酸残基が、連続し
    て数えられ、そして該エピトープのＮ末端に最も近い一次アンカー残基が、２位
    または３位である、工程；および ｉｉ）該エピトープのＮ末端とＣ末端との間の３位および／もしくは５位およ
    び／もしくは７位での１つ以上の保存的、または半保存的置換を誘導する工程で
    あって、ただし、該位が一次アンカー残基でない、工程、 それにより第二のクラスＩエピトープを含むペプチドを構築する工程であって、
    該エピトープが、該第一のクラスＩエピトープと比較して高められた免疫原性を
    示す、工程、 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記第二のクラスＩエピトープが、前記第一のクラスＩエピ
    トープと比較して、特定のＴ細胞について少なくとも約５０％増加した効力を示
    す、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 １つの置換のみが導入される、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記置換が保存的置換である、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記置換が半保存的置換である、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載の方法であって、前記ペプチドがＨＬＡクラ
    スＩ分子によって結合されそして細胞傷害性のＴ細胞と接触する場合、前記第二
    のクラスＩエピトープを含むペプチドが、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカインの両
    方を誘導する、方法。
  7. 【請求項７】 前記第一のクラスＩエピトープが、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２
    ４、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ４４、Ｂ５８およびＢ６２からなる群より選択されるスー
    パーモチーフを含む、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記第一のクラスＩ
    エピトープが、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、寄生生物抗原、細菌抗原または真
    菌抗原由来である、方法。
  9. 【請求項９】 請求項１の方法によって調製された第二のクラスＩエピトー
    プを含むペプチド。
  10. 【請求項１０】 免疫応答を誘発する方法であって、該方法が細胞傷害性Ｔ
    リンパ球（ＣＴＬ）と請求項９に記載のペプチドとを接触させる工程を包含する
    、方法。
  11. 【請求項１１】 前記接触させる工程がインビトロで、抗原提示細胞の存在
    下で実施される、請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記接触工程が、被験体に前記ペプチドをコードするヌク
    レオチド配列を含む核酸分子を投与する工程によって実施される、請求項１０に
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】 少なくとも１つのペプチドを含む組成物であって、該ペプ
    チドが、請求項１に記載の方法によって得られ得るクラスＩエピトープを含む、
    組成物。
  14. 【請求項１４】 前記ペプチドが、９個〜１５個のアミノ酸を含む、請求項
    １３に記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 請求項１３に記載の組成物であって、前記ペプチドが、配
    列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配
    列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列
    番号１９および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、組
    成物。
  16. 【請求項１６】 前記ペプチドがＣＴＬエピトープと混ぜられるか、または
    連結される、請求項１３に記載の組成物。
  17. 【請求項１７】 前記ペプチドが、ＨＴＬエピトープと混ぜられるか、また
    は連結される、請求項１３に記載の組成物。
  18. 【請求項１８】 前記ＨＴＬエピトープが、ｐａｎ−ＤＲ結合分子である、
    請求項１７に記載の組成物。
  19. 【請求項１９】 リポソームをさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
  20. 【請求項２０】 前記エピトープが、脂質に結合される、請求項１３に記載
    の組成物。
  21. 【請求項２１】 前記エピトープが、ヘテロポリマーに含まれる、請求項１
    ３に記載の組成物。
  22. 【請求項２２】 前記エピトープが、ホモポリマーに含まれる、請求項１３
    に記載の組成物。
  23. 【請求項２３】 前記エピトープが、ＨＬＡ重鎖、β２ミクログロブリン、
    およびストレプトアビジン複合体に結合され、これによりトリマーが形成される
    、請求項１３に記載の組成物。
  24. 【請求項２４】 請求項１３に記載の組成物であって、抗原提示細胞をさら
    に含み、ここで、前記エピトープが、該抗原提示細胞上または抗原提示細胞内に
    ある、組成物。
  25. 【請求項２５】 請求項２４に記載の組成物であって、前記エピトープが前
    記抗原提示細胞上のＨＬＡ分子に結合し、これにより、該ＨＬＡ分子に制限され
    る細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）が存在する場合、該ＣＴＬのレセプターが該Ｈ
    ＬＡ分子と該エピトープとの複合体に結合する、組成物。
  26. 【請求項２６】 前記抗原提示細胞が、樹状細胞である、請求項２５に記載
    の組成物。
  27. 【請求項２７】 請求項１３に記載の組成物であって、ＨＬＡ分子をさらに
    含み、ここで、前記ペプチドが、該ＨＬＡ分子により結合される、組成物。
  28. 【請求項２８】 標識をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
  29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の組成物であって、ここで、前記標識が
    、ビオチン、蛍光部分、非哺乳動物糖、放射性標識、またはモノクローナル抗体
    が結合する低分子である、請求項２８に記載の組成物。
  30. 【請求項３０】 請求項１３に記載の組成物であって、以下： 前記ペプチドの単位投薬量、および 薬学的賦形剤、 を含む、ワクチンである、組成物。
  31. 【請求項３１】 請求項１に記載の方法により得られ得る第二のクラスＩエ
    ピトープを含む、９〜１５個のアミノ酸のペプチドをコードするヌクレオチド配
    列を含む核酸分子。
  32. 【請求項３２】 請求項３１に記載の核酸分子であって、前記ペプチドが、
    配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、
    配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配
    列番号１９、および配列番号２０、からなる群より選択されるアミノ酸配列から
    なるエピトープを含む、核酸分子。
  33. 【請求項３３】 前記ヌクレオチド配列の発現のための制御配列をさらに含
    む、請求項３２に記載の核酸分子。
  34. 【請求項３４】 請求項３１に記載の核酸分子を、活性成分として含む、薬
    学的組成物。
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