JP4873810B2 - ペプチドおよび核酸組成物を使用する、ヒト免疫不全ウイルス−１に対する細胞性免疫応答の誘導 - Google Patents

ペプチドおよび核酸組成物を使用する、ヒト免疫不全ウイルス−１に対する細胞性免疫応答の誘導 Download PDF

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Description

【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本願は、１９９９年１０月５日付けで出願された米国特許出願番号０９／４１２，８６３号（本明細書中で参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（連邦政府によって支援された研究および開発）
本発明は、国立衛生研究所による助成金のもとで、米国政府によって一部資金提供された。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（目次）
Ｉ． 発明の背景
ＩＩ． 発明の要旨
ＩＩＩ．図面の簡単な説明
ＩＶ． 発明の詳細な説明
Ａ．定義
Ｂ．ＣＴＬおよびＨＴＬ応答の刺激
Ｃ．ＨＬＡ分子に対するペプチドエピトープの結合親和性
Ｄ．ペプチドエピトープ結合モチーフおよびスーパーモチーフ
１． ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ
２． ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ
３． ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ
４． ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフ
５． ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ
６． ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフ
７． ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフ
８． ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフ
９． ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフ
１０．ＨＬＡ−Ａ１モチーフ
１１．ＨＬＡ−Ａ２．１モチーフ
１２．ＨＬＡ−Ａ３モチーフ
１３．ＨＬＡ−Ａ１１モチーフ
１４．ＨＬＡ−Ａ２４モチーフ
１５．ＨＬＡ−ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフ
１６．ＨＬＡ−ＤＲ３モチーフ
Ｅ．ワクチンの集団適用範囲の増強
Ｆ．免疫応答刺激ペプチドエピトープアナログ
Ｇ．スーパーモチーフ含有エピトープまたはモチーフ含有エピトープに対する疾患関連抗原由来のタンパク質配列のコンピュータースクリーニング
Ｈ．ペプチドエピトープの調製
Ｉ．Ｔ細胞応答を検出するためのアッセイ
Ｊ．免疫応答を評価するためのペプチドエピトープの使用
Ｋ．ワクチン組成物
１．ミニ遺伝子ワクチン
２．ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組み合わせ
Ｌ．治療目的または予防目的のためのワクチンの投与
Ｍ．キット
Ｖ． 実施例
ＶＩ． 特許請求の範囲
ＶＩＩ．要約
（Ｉ．発明の背景）
ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）による感染によって引き起こされる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、主要な世界的保健衛生問題を提示する。推定上、毎日、世界中で約１６，０００人の人々がＨＩＶに感染することが示されている。
【０００４】
抗ウイルス薬物の開発は、ＨＩＶ感染患者におけるウイルス負荷（ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ）を減少するにおいて、大きく前進してきた。高度活性レトロウイルス療法（Ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ）（ＨＡＡＲＴ）は、ほぼ検出不可能なレベルまで、ウイルス血症を減少させることが示された。しかし、現在の薬物療法は、ＨＩＶ流行に対する長期の解決策として実用的ではない。ＨＡＡＲＴ療法は、薬物に対する乏しい耐性および薬物耐性ウイルスの出現に起因して、極めて制限される。さらに、複製能を有するＨＩＶは、ＨＡＡＲＴに応答性の患者のリンパ組織中に持続し、従って、ウイルスの貯蔵所として作用する。最後に、現在の抗レトロウイルス薬物療法は、世界的な流行に対してほとんど影響を有さない：世界中のＨＩＶ感染集団のほぼ９０％が、これらの薬物に対する財源を欠く国々に存在する。従って、ＨＩＶ感染を予防および処置するという両方のために有効なワクチンについての必要性が存在する。
【０００５】
ウイルス特異的なヒトリンパ球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、インビボにおけるウイルス感染の予防およびクリアランスにおいて主要な役割を果たすことが公知である（Ｏｌｄｓｔｏｎｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：２３９，１９８９；Ｊａｍｉｅｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１．３９３０，１９８７；Ｙａｐら，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：２３８，１９７８；Ｌｕｋａｃｈｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：８１４，１９９４；ＭｃＭｉｃｈａｅｌら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９：１３，１９８３；Ｓｅｔｈｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６４：４４３，１９８３；Ｗａｔａｒｉら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：４５９，１９８７；Ｙａｓｕｋａｗａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２０５１，１９８９；Ｔｉｇｇｅｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６２２，１９９３；Ｒｅｄｄｅｎｈａｓｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５５：２６３，１９８５；Ｑｕｉｎｎａｎら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０７：６，１９８２）。ＨＬＡクラスＩ分子は、ほぼすべての有核細胞の表面上に発現されている。抗原の細胞内プロセシング後、抗原由来のエピトープは、このような表面上のＨＬＡクラスＩ分子との複合体として提示される。ＣＴＬは、ペプチド−ＨＬＡクラスＩ複合体を認識し、次いで、ＣＴＬによって直接的にか、および／または、ウイルス複製を阻害する非破壊的機構（例えば、インターフェロンの産生）の活性化を介して、ＨＬＡ−ペプチド複合体を保有する細胞の破壊を生じさせる。
【０００６】
ＨＩＶ感染に対する防御的免疫の免疫相関は十分に規定されていないが、ＣＴＬがＨＩＶ感染を制御するにおいて重要であることを示唆する、増大しつつある一連の証拠が存在する。ＨＩＶ特異的ＣＴＬ応答は、感染初期に検出され得、そして応答の出現は、最初のウイルス血症が低減される、感染中の時点に対応する（Ｐａｎｔａｌｅｏら，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：４６３，１９９４；Ｗａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：９５１４，１９８９）。さらに、感染リンパ球中におけるＨＩＶ複製は、自己ＣＴＬとのインキュベーションによって阻害され得る（例えば、Ｔｓｕｂｏｔａら，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９．１４２１，１９８９を参照のこと）。これらのデータは、ＣＴＬがＳＩＶ／アカゲザル動物モデルにおけるウイルス複製を制御するために必要とされるという近年の研究によって支持され（Ｓｃｈｍｉｔｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：８５７，１９９９）、そしてさらに、ＣＴＬがＨＩＶ集団に対して選択圧を及ぼすということを実証する研究によって支持される。これは、ＣＴＬ応答が指向されるウイルスのそれらの領域においてアミノ酸置換を有するウイルスが最終的に優勢であることによって、証拠付けられる（例えば、Ｂｏｒｒｏｗら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：２０５−２１１，１９９７；Ｐｒｉｃｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２８９０−１８９５，１９９７；Ｋｏｅｎｉｇら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：３３０−３３６，１９９５；およびＨａａｓら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４２１２−４２２１，１９９６を参照のこと）。
【０００７】
ウイルス特異的Ｔヘルパーリンパ球もまた、慢性ウイルス感染において有効な免疫を維持するために重要であることが公知である。歴史的に、ＨＴＬ応答は、特定のＣＴＬおよびＢ細胞集団の増殖を主に支持するものと見られていた；しかし、より近年のデータによって、ＨＴＬは、ウイルス複製の制御に直接的に寄与し得ることが示されている。例えば、ＣＤ４+Ｔ細胞における減少およびＨＴＬ機能において対応する損失は、ＨＩＶによる感染を特徴付ける（Ｌａｎｅら，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．３１３：７９，１９８５）。さらに、ＨＩＶ感染患者における研究によって、ウイルス特異的ＨＴＬ応答とウイルス負荷との間に逆比例関係が存在することもまた示された。これは、ＨＴＬが、ウイルス血症において役割を果たすことを示唆する（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１４４７，１９９７を参照のこと）。
【０００８】
有効なＨＩＶワクチンの開発における基礎的難題は、ＨＩＶにおいて観察される不均質性である。他のレトロウイルスと同様に、このウイルスは、複製の間に急速に変異して、抗ウイルス療法および免疫認識をエスケープし得るウイルスの生成を生じる（Ｂｏｒｒｏｗら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：２０５，１９９７）。さらに、ＨＩＶは、顕著な配列分岐を示す種々のサブタイプに分類され得る（例えば、Ｌｕｋａｓｈｏｖら，ＡＩＤＳ １２：Ｓ４３，１９９８を参照のこと）。ＨＩＶの不均質性質およびＨＩＶ感染で観察される不均質性免疫応答の点から、複数のＨＩＶエピトープに対して同時に指向される多重特異性細胞性免疫応答の誘導が、ＨＩＶに対して有効なワクチンの開発のために重要であるように思われる。ＨＩＶ感染を予防および／または一掃するに十分な幅および力の免疫応答を誘発するようなワクチン実施形態を確立する必要性が存在する。
【０００９】
本発明者らが記載するような、このエピトープアプローチは、このアプローチが、単一のワクチン組成物における、種々のタンパク質由来の種々の抗体エピトープ、ＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープの組み込みを可能にするという点で、この問題の解決を提示し得る。このような組成物は、複数の優性および亜優性エピトープを同時に標的し得、これによって、多様な集団において効果的な免疫を達成するために使用され得る。
【００１０】
この節において提供される情報は、本出願の出願日時点での当時理解されている技術状態を開示することが意図される。本出願の優先日後に得られた情報は、この節に含まれる。従って、この節の情報は、いかようにも、本発明の優先日で線引きすることが意図されない。
【００１１】
（ＩＩ．発明の要旨）
本発明は、例えば、ＨＩＶに対するエピトープに基づくワクチンを開発するために、抗原がＴ細胞によって認識される機構についての本発明者らの知識を適用する。より詳細には、この適用が、特異的エピトープの薬学的組成物ならびにＨＩＶ感染の予防および処置における使用方法についての、本発明者らの発見を導く。
【００１２】
適切な技術の開発により、このエピトープに基づくワクチンの使用は、特に、ワクチン組成物における抗原全体の使用と比較した場合に、現在のワクチンを超えるいくつかの利点を有する。抗原全体に対する免疫応答が、抗原の可変領域にほとんど指向され、このことが、変異に起因して免疫回避を可能にするという証拠が存在する。エピトープに基づくワクチンに含めるためのエピトープは、ウイルス抗原または腫瘍関連抗原の保存領域から選択され得、これによって、回避性変異体の可能性を減少する。さらに、抗原全体において存在し得る免疫抑制エピトープは、このエピトープに基づくワクチンの使用によって避けられ得る。
【００１３】
エピトープベースワクチンのアプローチのさらなる利点は、選択されたエピトープ（ＣＴＬおよびＨＴＬ）を組み合わせる能力であり、さらに（例えば、増強された免疫原性を達成する）これらのエピトープの組成を改変する能力である。従って、免疫応答は、標的疾患について適切なように調節され得る。この応答の類似の操作は、従来のアプローチでは可能でない。
【００１４】
エピトープに基づく免疫刺激ワクチンの別の主な利点は、その安全性である。それ自体の内因性の生物学的活性を有し得る感染因子またはタンパク質抗原全体によって引き起こされる、可能性のある病理学的副作用は、排除される。
【００１５】
エピトープに基づくワクチンはまた、同じ病原体由来の複数の選択された抗原に対して免疫応答を指向する能力を提供する。従って、特定の病原体に対する免疫応答における患者間の可変性は、ワクチン組成物に、この病原体由来の複数の抗原由来のエピトープを含めることによって軽減される。ＨＩＶの場合、複数の株由来のエピトープもまた含まれ得る。「病原体」とは、感染因子または腫瘍関連分子であり得る。
【００１６】
しかし、広く効果的なエピトープに基づく免疫療法剤の開発に対する最も困難な障壁の１つは、ＨＬＡ分子の極度な多型性であった。今日まで、効果的な非遺伝子学的傾向にあった集団の適用範囲は、かなり複雑な課題であり；このような適用範囲は、各々個々のＨＬＡ対立遺伝子に対応するＨＬＡ分子に特異的なエピトープを使用することを必要とした。従って、民族的に多様な集団をカバーするためには、実行不可能な多くの数のエピトープを使用しなければならなかった。従って、エピトープに基づくワクチンにおける使用のための、複数のＨＬＡ抗原分子が結合したペプチドエピトープの必要性が存在していた。結合するＨＬＡ抗原分子数が多いほど、ワクチンによる集団の適用範囲の広さは大きくなる。
【００１７】
さらに、より詳細に本明細書中に記載されるように、ペプチド結合特性を調節する（例えば、複数のＨＬＡ抗原に結合し得るペプチドが、免疫応答を刺激する親和性で複数のＨＬＡ抗原に結合するように）必要性が存在していた。免疫原性に相関する親和性で１より多いＨＬＡ対立遺伝子によって限定されるエピトープの同定が、十分な集団適用範囲を提供するため、そしてその集団の多様な部分において感染を予防または排除するに十分に強力な応答の誘発を可能にするために、重要である。このような応答はまた、広範な多くのエピトープを標的し得る。本明細書中に開示される技術は、このような好ましい免疫応答を提供する。
【００１８】
好ましい実施形態において、本発明のワクチン組成物に含むためのエピトープは、既知の抗原のタンパク質配列を、モチーフ保有エピトープまたはスーパーモチーフ保有エピトープの存在について評価するプロセスによって、選択される。次いで、モチーフ保有エピトープまたはスーパーモチーフ保有エピトープに対応するペプチドを合成し、そしてそれらのペプチドを、その選択されたモチーフを認識するＨＬＡ分子に結合する能力について試験する。中程度の親和性または高い親和性（すなわち、ＨＬＡクラスＩ分子ついては、５００ｎＭ未満のＩＣ50（またはＫD値）、またはＨＬＡクラスＩＩ分子については、１０００ｎＭ未満のＩＣ50）で結合するこれらのペプチドを、ＣＴＬ応答またはＨＴＬ応答を誘導するそれらの能力についてさらに評価する。免疫原性ペプチドエピトープを、ワクチン組成物に含むために選択する。
【００１９】
スーパーモチーフ保有ペプチドを、ＨＬＡスーパータイプファミリー内の複数の対立遺伝子に結合する能力について、さらに試験し得る。さらに、ペプチドエピトープを、ＨＬＡスーパータイプ内の複数の対立遺伝子に対する結合親和性および／または結合する能力を改変するために、アナログ化し得る。
【００２０】
本発明はまた、既知のＨＬＡ型を有する患者において、ＨＩＶに対する免疫応答をモニターまたは評価するための方法を含む、実施形態を包含する。このような方法は、患者由来のＴリンパ球サンプルを、ＨＩＶエピトープを含むペプチド組成物と共にインキュベートする工程であって、このＨＩＶエピトープは、その患者に存在する少なくとも１つのＨＬＡ対立遺伝子の産物を結合する、表ＶＩＩ〜表ＸＸに記載のアミノ酸配列を有する、工程、および、このペプチドに結合するＴリンパ球の存在について検出する工程を包含する。ＣＴＬペプチドエピトープは、例えば、この型の分析のためのテトラマー複合体の成分として使用され得る。
【００２１】
本発明に従うペプチドエピトープを規定するための代替的様式は、特定の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子または対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子のグループへの結合に相関される、物理的特性（例えば、長さ；一次構造；または電荷）を引用することである。ペプチドエピトープを規定するためのさらなる様式は、ＨＬＡ結合ポケットの物理的特性またはいくつかの対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合ポケットに共有される特性（例えば、ポケットの形状および電荷分布）を引用すること、およびこのペプチドエピトープがポケット（単数または複数）に適合しそして結合することを引用することである。
【００２２】
以下の議論から明らかなように、他の方法および実施形態もまた意図される。さらに、本明細書中の方法のいずれかによって生成された新規合成ペプチドもまた、本発明の一部である。
【００２３】
（ＩＶ．発明の詳細な説明）
本発明のペプチドエピトープおよび対応する核酸組成物は、ＣＴＬ応答またはＨＴＬ応答の生成を刺激することによって、ＨＩＶに対する免疫応答を刺激するために有用である。これらのペプチドエピトープは、ネイティブＨＩＶタンパク質アミノ酸配列に直接的または間接的に由来し、ＨＬＡ分子に結合し得そしてＨＩＶに対する免疫応答を刺激し得る。分析されるＨＩＶタンパク質の完全配列は、Ｇｅｎｂａｎｋより入手され得る。以下に提供する開示から明らかなように、ペプチドエピトープおよびそのアナログはまた、配列情報から容易に決定され得、配列情報は、今後、以前に未知であったＨＩＶの改変体について発見されるかもしれない。
【００２４】
本発明のペプチドエピトープは、以下で議論されるように、多くの方法で同定された。特定のアミノ酸残基を改変して、変化した免疫原性を示すペプチドアナログを作製することによって、アナログペプチドを誘導し、そしてＨＬＡ分子の結合活性が調節されることもまた、より詳細に議論する。さらに、本発明は、種々の対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子と相互作用し得るエピトープに基づくワクチンに、先行技術のワクチンよりも広い集団適用範囲を提供させ得る、組成物および組成物の組み合わせを提供する。
【００２５】
（ＩＶ．Ａ．定義）
本発明は、アルファベット順に列挙した、以下の定義を参照してより良好に理解され得る。
【００２６】
「コンピューター」または「コンピューターシステム」は、一般に、以下を備える：プロセッサー；少なくとも１つの情報記憶／検索装置（例えば、ハードドライブ、ディスクドライブまたはテープドライブなど）；少なくとも１つの入力装置（例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーン、またはマイクロホンなど）；およびディスプレイ構造。さらに、コンピューターは、ネットワークと連絡する通信チャネルを備える。このようなコンピューターは、多かれ少なかれ、上記に列挙したものを備え得る。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「構築物」は、一般に、天然に存在しない組成物を示す。構築物は、核酸またはアミノ酸についての合成技術（例えば、組換えＤＮＡの調製および発現）または化学合成技術によって、生成され得る。構築物はまた、結果としてその形態が天然において見い出されないように、ある材料への別の材料の付加または添加によって生成され得る。
【００２８】
「交差反応結合」とは、１より多いＨＬＡ分子がペプチドに結合することを示し；同義語は、縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）結合である。
【００２９】
「潜在エピトープ」は、単離されたペプチドとの免疫によって応答を誘導するが、そのエピトープを含むインタクトなタンパク質全体が抗原として使用される場合に、その応答は、インビトロで交差反応性でない。
【００３０】
「優性エピトープ」は、ネイティブ抗原全体での免疫に際して免疫応答を誘導するエピトープである（例えば、Ｓｅｒｃａｒｚら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：７２９−７６６，１９９３を参照のこと）。このような応答は、単離されたペプチドエピトープでは、インビトロで交差反応性である。
【００３１】
特定のアミノ酸配列に関して、「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセットであるか、またはＴ細胞の状況下では、Ｔ細胞レセプタータンパク質および／または主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識に必要な残基である。インビボまたはインビトロでの免疫系の設定において、エピトープは、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子によって認識される部位を共に形成する、分子（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造および三次ペプチド構造のような）および電荷の集団的特徴である。本開示を通して、エピトープおよびペプチドは、しばしば、交換可能に使用される。しかし、本発明のエピトープより大きくかつ本発明のエピトープを含む単離または精製されたタンパク質またはペプチド分子が、なお本発明の範囲内にあることが理解される。
【００３２】
本発明のエピトープおよびさらなるアミノ酸を含むタンパク質またはペプチド分子が、なお本発明の範囲内にあることが理解される。特定の実施形態において、さもなければ構築物ではない本発明のペプチドの長さに対して、制限が存在する。長さが制限される実施形態は、本発明のエピトープを含むタンパク質／ペプチドがネイティブ配列と１００％同一性を有する領域（すなわち、一連の連続するアミノ酸）を含む場合に、生じる。例えば、天然分子全体に対する読み枠由来のエピトープの定義を回避するために、ネイティブペプチド配列との１００％同一性を有する任意の領域の長さに対して制限が存在する。従って、本発明のエピトープおよびネイティブペプチド配列との１００％同一性を有する領域を含み、そしてさもなければ構築物ではない、ペプチドについて、ネイティブ配列に対する１００％同一性を有するその領域は、一般に、６００アミノ酸以下、しばしば、５００アミノ酸以下、しばしば、４００アミノ酸以下、しばしば、２５０アミノ酸以下、しばしば、１００アミノ酸以下、しばしば、８５アミノ酸以下、しばしば、７５アミノ酸以下、しばしば、６５アミノ酸以下、そしてしばしば、５０アミノ酸以下を有する。特定の実施形態において、本発明の「エピトープ」は、ネイティブペプチド配列に対して１００％同一性を有する５１アミノ酸未満（任意の数（４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５）のアミノ酸から５アミノ酸まで）の領域を有するペプチドに含まれる。
【００３３】
従って、６００アミノ酸より長いペプチドまたはタンパク質配列は、それらが、構築物でない場合に、ネイティブペプチド配列との１００％同一性を有する６００アミノ酸よりも大きいいかなる連続する配列を含まない限り、本発明の範囲内にある。ネイティブ配列に対応する５以下連続する残基を有する任意のペプチドについては、本発明の範囲内にあるための、そのペプチドの最大長さに対する制限は存在しない。本発明において、ＣＴＬエピトープは、６００未満の任意の残基長から８アミノ酸残基であることが好ましい。
【００３４】
「ヒトリンパ球抗原」または「ＨＬＡ」は、ヒトクラスＩまたはクラスＩＩの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質（例えば、Ｓｔｉｔｅｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８版、Ｌａｎｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，ＣＡ（１９９４）を参照のこと）である。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「ＨＬＡスーパータイプまたはＨＬＡファミリー」とは、共有するペプチド結合特性に基づいてグループ化したＨＬＡ分子のセットを記載する。特定のアミノ酸モチーフを保有するペプチドに対する幾分類似の結合親和性を共有するＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡスーパータイプにグループ化される。用語ＨＬＡスーパーファミリー、ＨＬＡスーパータイプファミリー、ＨＬＡファミリーおよびＨＬＡ ｘｘ様分子（ここで、ｘｘは、特定のＨＬＡ型を示す）は、同義である。
【００３６】
本開示を通して、結果を、用語「ＩＣ50」で表す。ＩＣ50は、参照ペプチドの結合の５０％阻害が観察される、結合アッセイにおけるペプチドの濃度である。アッセイを行う条件（すなわち、律速のＨＬＡタンパク質濃度および標識ペプチド濃度）を考慮して、これらの値は、ＫD値と近似する。結合を測定するためのアッセイは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２０１２７およびＷＯ９４／０３２０５に、詳細に記載される。ＩＣ50値が、アッセイ条件が変化する場合に、そして使用する特定の試薬（例えば、ＨＬＡ調製物など）に依存して、（しばしば、劇的に）変化し得ることに留意する。例えば、過剰濃度のＨＬＡ分子は、所定のリガンドの見かけの測定されたＩＣ50を増加する。
【００３７】
あるいは、結合は、参照ペプチドと関連して表される。特定のアッセイが、より高感度またはより低感度になるにつれて、試験するペプチドのＩＣ50は、幾分変化し得るが、参照ペプチドに関連する結合は、有意に変化しない。例えば、参照ペプチドのＩＣ50が１０倍増加するような条件下で行うアッセイにおいて、試験ペプチドのＩＣ50もまた、約１０倍シフトする。従って、あいまい性を回避するために、ペプチドが良好な結合因子であるか、中程度の結合因子であるか、弱い結合因子であるかまたはネガティブな結合因子であるかの評価は、一般に、標準ペプチドのＩＣ50に対する、そのペプチドのＩＣ50に基づく。
【００３８】
結合はまた、以下を使用するアッセイ系を含む、他のアッセイ系を使用して測定され得る：生細胞（例えば、Ｃｅｐｐｅｌｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９２，１９８９；Ｃｈｒｉｓｔｎｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６７、１９９１；Ｂｕｓｃｈら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４３、１９９９０；Ｈｉｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１８９、１９９１；ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５，１９９５）、界面活性剤溶解物を使用する無細胞系（例えば、Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２０６９，１９９１）、固定した精製ＭＨＣ（例えば、Ｈｉｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２８９０，１９９４；Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：４９４６，１９９４）、ＥＬＩＳＡ系（例えば、Ｒｅａｙら、ＥＭＢＯ Ｊ．１１：２８２９，１９９２）、表面プラスモン共鳴（例えば、Ｋｈｉｌｋｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５４２５，１９９３）；高フラックス可溶相アッセイ（Ｈａｍｍｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３５３，１９９４）、およびクラスＩ ＭＨＣの安定化またはアセンブリの測定（例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４７６、１９９０；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｃｅｌｌ ６２：５６３、１９９０；Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｃｅｌｌ ６２：２８５、１９９０；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９；１８９６，１９９２）。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、ＨＬＡクラスＩ分子に関する「高い親和性」とは、５０ｎＭ未満のＩＣ50またはＫD値での結合として定義され；「中程度の親和性」とは、約５０ｎＭと約５００ｎＭとの間のＩＣ50またはＫD値での結合である。ＨＬＡクラスＩＩ分子に関する「高い親和性」とは、１００ｎＭ未満のＩＣ50またはＫD値での結合として定義され；「中程度の親和性」とは、約１００ｎＭと約１０００ｎＭとの間のＩＣ50またはＫD値での結合である。
【００４０】
２以上のペプチド配列の状況下で、用語「同一性」またはパーセント「同一性」とは、配列比較アルゴリズムを使用してかまたは手動の整列化および目視検査によって測定されるように、比較ウインドウにわたる最大対応について比較および整列化した場合に、同じであるかまたは特定のパーセンテージの同じであるアミノ酸残基を有する、２以上の配列またはサブ配列をいう。
【００４１】
「免疫原性ペプチド」または「ペプチドエピトープ」とは、そのペプチドがＨＬＡ分子を結合しそしてＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答を誘導するような、対立遺伝子特異的モチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドである。従って、本発明の免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ分子に結合し得、そしてその後、免疫原性ペプチドが由来する抗原に対する、細胞傷害性Ｔ細胞応答またはヘルパーＴ細胞応答を誘導し得る。
【００４２】
句「単離された」または「生物学的に純粋」とは、そのネイティブ状態において見い出される場合に通常その材料に付随する成分を、実質的または本質的に含まない材料をいう。従って、本発明に従う単離されたペプチドは、好ましくは、そのインサイチュ環境下でそのペプチドに通常会合する物質を含まない。
【００４３】
「連結」または「結合」とは、ペプチドを機能的に接続するための当該分野で公知の任意の方法をいい、これらには、組換え融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合、および静電結合が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
「主要組織適合性複合体」または「ＭＨＣ」は、生理的免疫応答に応答可能な細胞性相互作用の制御において役割を担う遺伝子のクラスターである。ヒトにおいて、ＭＨＣ複合体はまた、ＨＬＡ複合体として既知である。ＭＨＣ複合体およびＨＬＡ複合体の詳細な記載については、Ｐａｕｌ、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第３版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３を参照のこと。
【００４５】
用語「モチーフ」は、規定された長さのペプチドにおける残基のパターンをいう。一般に、クラスＩ ＨＬＡモチーフについて約８〜約１３アミノ酸およびクラスＩＩ ＨＬＡモチーフについて約６〜約２５アミノ酸のペプチドであり、これは、特にＨＬＡ分子によって認識される。ペプチドモチーフは、代表的には、各々のヒトＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる各々のタンパク質について異なり、そして一次アンカー残基および二次アンカー残基のパターンにおいて異なる。
【００４６】
「陰性な結合残基」または「有害な残基」は、ペプチドエピトープにおける特定の位置に存在する場合（代表的には一次アンカー位置ではない）、対応するＨＬＡ分子に対するペプチドの結合親和性の減少を生じるアミノ酸である。
【００４７】
「非ネイティブ」な配列または「構築物」は、天然には見出されない（すなわち、「非天然に存在する」）配列をいう。このような配列としては、例えば、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅ）されるかさもなくば改変されるペプチド、およびネイティブなタンパク質配列中に連続しないエピトープを含むポリエピトープ性（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）組成物が挙げられる。
【００４８】
用語「ペプチド」は、本明細書中において「オリゴペプチド」と相互変換可能に使用され、（代表的には、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって）互いに連結される一連の残基（代表的にはＬ−アミノ酸）を示す。本発明の好ましいＣＴＬ誘導ペプチドは、１３以下の残基長であり、そして通常、約８残基と約１１残基との間（好ましくは９または１０残基）からなる。好ましいＨＴＬ誘導オリゴペプチドは、約５０残基長未満であり、そして通常、約６残基と約３０残基との間、より通常には、約１２残基と２５残基との間、そしてしばしば約１５残基と２０残基との間からなる。
【００４９】
「薬学的に受容可能な」は、一般に、非毒性の、不活性な、および／または薬理学的に適合性の組成物をいう。
【００５０】
「一次アンカー残基」は、免疫原性ペプチドとＨＬＡ分子との間の接触点を提供することが理解されるペプチド配列の間で特定の位置におけるアミノ酸をいう。規定された長さのペプチド内の１〜３（通常は２）の一次アンカー残基は、一般に、免疫原性ペプチドについての「モチーフ」を規定する。これらの残基は、結合溝（ｇｒｏｏｖｅ）自身の特定のポケットにおいて埋められるこれらの側鎖を有する、ＨＬＡ分子のペプチド結合溝（ｇｒｏｏｖｅ）と密接に接触して適合することが理解される。１つの実施形態において、例えば、一次アンカー残基は、本発明に従って９残基ペプチドエピトープの位置２（アミノ末端位から）およびカルボキシル末端位に配置される。各々のモチーフおよびスーパーモチーフについての一次アンカー位置は、表１に示される。例えば、アナログペプチドは、これらの一次アンカー位置における特定の残基の存在または非存在を変更することによって作製され得る。このようなアナログを使用して、特定のモチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を調節する。
【００５１】
「乱雑な認識」は、種々のＨＬＡ分子に関連して別々のペプチドが同一のＴ細胞クローンによって認識されることである。乱雑な認識または結合は、交差反応性結合と同義である。
【００５２】
「防御免疫応答」または「治療的免疫応答」は、感染性因子または腫瘍抗原由来の抗原に対するＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答をいい、これは、疾患の症状または進行を予防するかまたは少なくとも部分的に抑制する。免疫応答はまた、ヘルパーＴ細胞の刺激によって容易にされた抗体応答を含み得る。
【００５３】
用語「残基」は、アミド結合またはアミド結合模倣物によってオリゴペプチドに組み込まれるアミノ酸またはアミノ酸模倣物をいう。
【００５４】
「二次アンカー残基」は、ペプチドにおける一次アンカー位置以外の位置での、ペプチド結合を影響し得るアミノ酸である。二次アンカー残基は、結合したペプチドの中で１つの位置でのアミノ酸の無秩序な分布によって期待されるより顕著に高い頻度で生じる。二次アンカー残基は、「二次アンカー位置」で生じるといわれる。二次アンカー残基は、高い親和性もしくは中程度の親和性で結合するペプチドの中でより高頻度で存在する残基、またはさもなくば高い親和性もしくは中程度の親和性の結合と関連する残基として同定され得る。例えば、アナログペプチドは、これらの二次アンカー位置における特定の残基の存在または非存在を変更することによって作製され得る。このようなアナログを使用して、特定のモチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を良好に調節する。
【００５５】
「亜優性エピトープ」は、エピトープを含む抗原全体での免疫に対して応答をほとんど引き起こさないかまたは全く引き起こさないが、単離されたペプチドでの免疫によって応答が得られ得るエピトープであり、そして（潜在エピトープの場合とは異なり）この応答は、タンパク質全体を使用してインビトロまたはインビボでの応答をリコール（ｒｅｃａｌｌ）する場合に、検出される。
【００５６】
「スーパーモチーフ」は、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子によって共有されるペプチド結合特異性である。好ましくは、スーパーモチーフ保有ペプチドは、２つ以上のＨＬＡ抗原によって高い親和性または中程度の親和性（本明細書中に規定される場合）で認識される。
【００５７】
「合成ペプチド」は、化学合成または組換えＤＮＡ技術のような方法を使用してヒトが作製したペプチドをいう。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、「ワクチン」は、本発明の１つ以上のペプチドを含む組成物である。本発明に従うワクチンの実施形態（例えば、１つ以上のペプチドのカクテルによって；ポリエピトープ性のペプチドによって含まれる本発明の１以上のエピトープ；または、このようなペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸（例えば、ポリエピトープ性のペプチドをコードするミニ遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）））が多く存在する。「１つ以上のペプチド」は、１〜１５０の単位整数全体のいずれか（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５もしくは１５０またはそれ以上）の本発明のペプチドを含み得る。これらのペプチドまたはポリペプチドは、必要ならば、例えば、脂質化、標的化配列もしくは他の配列の付加によって改変され得る。本発明のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは、細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球の両方の活性化を容易にするために、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと混合され得るかまたは連結され得る。ワクチン接種はまた、ペプチドでパルスされた抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含む。
【００５９】
ペプチド化合物を記載するために使用される命名法は、慣用的な実践に従い、ここで、アミノ基は各々のアミノ酸残基の左（Ｎ末端）そしてカルボキシル基は右（Ｃ末端）に示される。アミノ酸残基位置がペプチドエピトープにおいていわれる場合、これらは、エピトープ、または一部分であり得るペプチドもしくはタンパク質のアミノ末端に近接する位置である位置を有してアミノからカルボキシルの方向において番号付けられる。本発明の選択された特定の実施形態を示す形式において、特定には示されないが、さもなくば特定されない場合は、アミノ末端基およびカルボキシル末端基は、生理学的ｐＨ値でとる形態である。アミノ酸構造の形式において、各残基は、一般に、標準的な３文字表記または１文字表記によって示される。Ｌ−型のアミノ酸残基は、大文字の１文字または３文字記号の最初の文字の大文字によって示され、そしてＤ−型を有するこれらのアミノ酸についてのＤ−型は、小文字の１文字または小文字の３文字記号によって示される。グリシンは、非対称の炭素原子を有さず、そして単に「Ｇｌｙ」またはＧとしていわれる。アミノ酸についての記号は、以下に示される。
【００６０】
【化５】
【００６１】
（ＩＶ．Ｂ．ＣＴＬおよびＨＴＬ応答の刺激）
Ｔ細胞が抗原を認識する機構は、１０年前もの間描写されてきた。免疫系の本発明者らの理解に基づいて、本発明者らは、広範な集団においてＨＩＶに対する治療的免疫応答または予防的免疫応答を誘導し得る、効果的なペプチドエピトープワクチン組成物を開発した。特許請求された組成物の価値および効力の理解について、免疫関連技術の簡単な総説が提供される。
【００６２】
ＨＬＡ分子とペプチド抗原との複合体は、ＨＬＡ拘束されたＴ細胞によって認識されるリガンドとして働く（Ｂｕｕｓ，Ｓら、Ｃｅｌｌ ４７：１０７１，１９８６；Ｂａｂｂｉｔｔ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７：３５９，１９８５；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ａ．およびＢｏｄｍｅｒ，Ｈ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６０１，１９８９；Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：４０３，１９９３）。単一アミノ酸置換された抗原アナログの研究、および内因性に結合され、天然にプロセスされたペプチドの配列決定を通じて、ＨＬＡ抗原分子に特異的に結合するために必要とされるモチーフに対応する重要な残基は、同定されかつ本明細書中に記載され、そして表Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩに示される（また、例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３，１９９８；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１７８，１９９５；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、（ｈｔｔｐ：／／１３４．２．９６．２２１／ｓｃｒｉｐｔｓ．ｈｌａｓｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍでのｗｅｂを介してアクセスする）；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＳｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４７８，１９９８；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｖ．Ｈ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１３，１９９４；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＧｒｅｙ，Ｈ．Ｍ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：７９，１９９２；Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ，Ｆ．およびＨａｍｍｅｒ、Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：５２、１９９４；Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７，１９９３；Ｋｏｎｄｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７−４３１２，１９９５；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０，１９９６；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１９９６；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＳｉｄｎｅｙ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、印刷中、１９９９を参照のこと）。
【００６３】
さらに、ＨＬＡペプチド複合体のＸ線結晶構造解析は、対立遺伝子特異的形態でペプチドリガンドによって提示される残基を適応する、ＨＬＡ分子のペプチド結合開裂内のポケットを示し；これらの残基が存在するペプチドのＨＬＡ結合能を、これらの残基は順に決定する（例えば、Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｒ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５８７，１９９５；Ｓｍｉｔｈら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：２０３、１９９６；Ｆｒｅｍｏｎｔら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：３０５，１９９８；Ｓｔｅｒｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：２４５，１９９４；Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７５，１９９７；Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６４：３３，１９９３；Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０５３，１９９３；Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：３６４，１９９２；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：３６７，１９９２；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９２７，１９９２；Ｍａｄｄｅｎら、Ｃｅｌｌ ７０：１０３５，１９９２；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｄ．Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９１９，１９９２；Ｓａｐｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．およびＷｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：２７７，１９９１を参照のこと）。
【００６４】
従って、クラスＩおよびクラスＩＩの対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合モチーフ、またはクラスＩもしくはクラスＩＩのスーパーモチーフの規定は、特定のＨＬＡ抗原を結合する可能性を有するタンパク質内の領域の同定を可能にする。
【００６５】
本発明者らは、本明細書中に記載される免疫原性との結合親和性の相関が、候補ペプチドを評価する場合に考慮されるべき重要な因子であることを見出した。従って、モチーフ探索とＨＬＡペプチド結合アッセイとの組合わせによって、エピトープに基づくワクチンについての候補が、同定された。これらの結合親和性を決定した後、さらなる確認の研究を実施して、これらのワクチン候補の中から集団適用範囲、抗原性および免疫原性についての好ましい特徴を有するエピトープを選択し得る。
【００６６】
以下を含む種々の戦略が利用されて免疫原性を評価し得る：
１）正常の個体由来のＴ細胞初代培養の評価（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６０３，１９９５；Ｃｅｌｉｓ，Ｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２１０５，１９９４；Ｔｓａｉ，Ｖら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１７９６，１９９７；Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：１，１９９８を参照のこと）；この手順は、抗原提示細胞の存在下で数週間にわたる正常被験体由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の試験ペプチドでの、インビトロにおける刺激を含む。ペプチドに特異的なＴ細胞は、この期間中活性化され、そして例えば、ペプチド感受性標的細胞を含む51Ｃｒ放出アッセイを使用して検出される
２）ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７，１９９６；Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５１，１９９６；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３，１９９７を参照のこと）；この方法において、不完全フロインドアジュバント中のペプチドは、ＨＬＡトランスジェニックマウスに皮下的に投与される。免疫の数週間後、脾細胞を回収して、そして試験ペプチドの存在下で約１週間インビトロで培養する。ペプチド特異的Ｔ細胞は、例えば、ペプチド感受性標的細胞および内因性に作製された抗原を発現する標的細胞を含む51Ｃｒ放出アッセイを使用して検出される
３）効果的にワクチン接種されて感染から回復した免疫個体からの、および／または慢性的に感染した患者からのリコール（ｒｅｃａｌｌ）Ｔ細胞応答の実証（例えば、Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１０４７，１９９５；Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：９７，１９９７；Ｂｅｒｔｏｎｉ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３，１９９７；Ｔｈｒｅｌｋｅｌｄ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１６４８，１９９７；Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６０１１，１９９７を参照のこと）；この戦略を適用する際に、リコール応答は、抗原に対して天然に曝露され（例えば、感染を通じて）従って免疫応答を「天然に」作製された被験体由来、または感染に対してワクチン接種された患者由来のＰＢＬを培養することによって検出される。被験体由来のＰＢＬを、試験ペプチドに加えて抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下でインビトロで１〜２週間培養し、「ナイーブ」Ｔ細胞に比べて「メモリー」Ｔ細胞の活性化を可能にする。培養期間の最後に、Ｔ細胞活性化を、ペプチド感受性標的を含む51Ｃｒ放出、Ｔ細胞増殖、またはリンホカイン放出を含むＴ細胞活性についてのアッセイを使用して検出する。
【００６７】
本発明のペプチドエピトープおよび対応する核酸を、以下に記載する。
【００６８】
（ＩＶ．Ｃ．ＨＬＡ分子に対するペプチドエピトープの結合親和性）
本明細書中に示されるように、かなりの程度のＨＬＡ多型は、ワクチン開発のためにエピトープに基づく手段を考慮されるべき重要な因子である。この因子を扱うために、多様なＨＬＡ分子に対して高い親和性または中程度の親和性で結合し得るペプチドの同定を含むエピトープ選択は、好ましくは利用され、最も好ましくは、これらのエピトープは、２以上の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子に対して高い親和性または中程度の親和性で結合する。
【００６９】
ワクチン組成物について目的のＣＴＬ誘導ペプチドは、好ましくは５００ｎＭまたはそれよりよい（すなわち、値が≦５００ｎＭである）クラスＩ ＨＬＡ分子に対するＩＣ50または結合親和性値を有するものを含む。ＨＴＬ誘導ペプチドは、好ましくは、１０００ｎＭまたはそれよりよい（すなわち、値が≦１０００ｎＭである）クラスＩＩ ＨＬＡ分子に対するＩＣ50または結合親和性値を有するものを含む。例えば、ペプチド結合は、インビトロで精製ＨＬＡ分子に結合する候補ペプチドの能力を試験することによって評価される。次いで、高い親和性または中程度の親和性を示すペプチドは、さらなる分析について考慮される。選択されるペプチドは、スーパータイプファミリーの他のメンバーに試験される。好ましい実施形態において、交差反応性の結合を示すペプチドは、次いで、細胞性スクリーニング分析またはワクチンにおいて使用される。
【００７０】
本明細書中に記載されるように、より高いＨＬＡ結合親和性は、より高い免疫原性に相関する。より高い免疫原性は、いくつかの異なる方法において明示され得る。免疫原性は、免疫応答が少しでも誘発されるか否か、および任意の特定の応答の活力、ならびに応答が誘発される集団の範囲に相関する。例えば、ペプチドは、多様なアレイの集団において免疫応答を誘発し得るが、活発な応答を産生する例は未だない。これらの原理に従って、中程度の親和性で結合するペプチドの約５０％と比較して、高度に結合するペプチドの９０％近くは、免疫原性であることが見出されている。さらに、より高度な結合親和性のペプチドは、より活発な免疫原性応答を導く。結果として、高い親和性で結合するペプチドが使用される場合、同様の生物学的効果を誘発することが必要とされるペプチドはほとんどない。従って、本発明の好ましい実施形態において、高い親和性の結合エピトープは、特に有用である。
【００７１】
ＨＬＡクラスＩ分子の結合親和性と、結合した抗原上の別個のペプチドエピトープの免疫原性との間の関係は、本発明者らにより当該分野で初めて決定された。結合親和性と免疫原性との間の相関を、２つの異なる実験的アプローチにおいて分析した（例えば、Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：５５８６−５５９２，１９９４を参照のこと）。第１のアプローチにおいて、１０，０００倍の範囲を超えるＨＬＡ結合親和性に及ぶ潜在エピトープの免疫原性を、ＨＬＡ−Ａ*０２０１トランスジェニックマウスにおいて分析した。第２のアプローチにおいて、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来の約１００の異なる潜在的エピトープ（全て、Ａ*０２０１結合モチーフを有する）の抗原性を、急性肝炎患者に由来するＰＢＬを用いて評価した。これらのアプローチに続いて、約５００ｎＭ（好ましくは、５０ｎＭ以下）の親和性閾値により、ペプチドエピトープがＣＴＬ応答を誘起する能力が決定されることを決定した。これらのデータは、天然にプロセシングされたペプチドについて、および合成Ｔ細胞エピトープについてのクラスＩ結合親和性測定値に該当する。これらのデータはまた、Ｔ細胞応答の方向付け（ｓｈａｐｉｎｇ）における決定基選択の重要な役割を示す（例えば、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４６４９−４６５３，１９８９を参照のこと）。
【００７２】
ＨＬＡクラスＩＩ ＤＲ分子の状況において免疫原性と関連した親和性閾値もまた記載されている（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：３３６３−３３７３，１９８９および９８年１月２１日出願の同時係属中の米国特許出願第０９／００９，９５３号を参照のこと）。ＤＲ結合親和性の生物学的に有意な閾値を規定するために、ＤＲ拘束エピトープの拘束エレメント（すなわち、モチーフを結合するＨＬＡ分子）について、３２のＤＲ拘束エピトープのの結合親和性のデータベースをコンパイルした。例の約半分（３２エピトープのうち１５）において、ＤＲ拘束は、高い結合親和性（すなわち、１００ｎＭ以下の結合親和性値）と関連していた。例の他方の半分（３２のうち１６）においては、ＤＲ拘束は、中間の親和性（１００〜１０００ｎＭ範囲の結合親和性値）と関連していた。３２例のうちわずか１つにおいて、ＤＲ拘束は、１０００ｎＭ以上のＩＣ50と関連していた。従って、１０００ｎＭがＤＲ分子の状況において免疫原性と関連した親和性閾値であると規定され得る。
【００７３】
ＨＬＡ分子についてのペプチドの結合親和性は、以下の実施例１に記載のように決定され得る。
【００７４】
（ＩＶ．Ｄ．ペプチドエピトープ結合モチーフおよびスーパーモチーフ）
１アミノ酸置換抗原アナログ、および内因的に結合した、天然にプロセシングされたペプチドの配列決定の研究を通して、ＨＬＡ分子に対する対立遺伝子特異的結合に必要な重要残基を同定した。これらの残基の存在は、ＨＬＡ分子の結合親和性と相関する。高い親和性結合および中間の親和性結合と相関するモチーフおよび／またはスーパーモチーフの同定は、ワクチンに含ませるための免疫原性ペプチドエピトープの同定に関して重要な論点である。Ｋａｓｔら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：３９０４−３９１２，１９９４）は、モチーフ保有ペプチドが、対立遺伝子特異的ＨＬＡクラスＩ分子に結合するエピトープの９０％を担うことを示した。この研究において、９アミノ酸長かつ８アミノ酸だけ重複する全ての可能なペプチド（２４０ペプチド）（これらは、ヒトパピローマウイルス１６型のＥ６およびＥ７タンパク質の配列全体を包含する）を、種々の人種群の中で高い頻度で発現される、５つの対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子に対する結合について評価した。このペプチドの偏りのないセットは、ＨＬＡクラスＩモチーフの推定値の評価を可能にした。２４０ペプチドのセットから、２２ペプチドが、高親和性または中間の親和性で対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子に結合したことが同定された。これらの２２ペプチドのうち、２０（すなわち、９１％）が、モチーフを保有していた。従って、この研究により、ワクチンに含ませるためのペプチドエピトープを同定するためのモチーフの値が示される：モチーフに基づく同定技術の適用により、標的抗原タンパク質配列における潜在的エピトープの約９０％が同定される。
【００７５】
このようなペプチドエピトープを以下の表において同定する。
【００７６】
本発明のペプチドはまた、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ分子に結合するエピトープを含み得る。このペプチドのＮ末端およびＣ末端に対して、モチーフのサイズおよび結合フレーム位置の両方におけるより大きな不均質性の程度がクラスＩＩペプチドリガンドに存在する。ＨＬＡクラスＩＩペプチドリガンドのこの増加した不均質性は、ＨＬＡクラスＩ対応分子とは異なり、両方の末端で開いているＨＬＡクラスＩＩ分子の結合溝の構造に起因する。ＨＬＡクラスＩＩ ＤＲＢ*０１０１ペプチド複合体の結晶解析により、主要な結合エネルギーはＤＲＢ*０１０１分子上の相補性ポケットと複合体化したペプチド残基により与えられていることが示された。重要なアンカー残基は、最も深いところにある疎水性ポケットに結合し（例えば、Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｒ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５８７，１９９５を参照のこと）、そして１位（Ｐ１）と呼ばれる。Ｐ１は、クラスＩＩ結合ペプチドエピトープのＮ末端残基を表し得るが、より代表的には、１以上の残基だけＮ末端の方向に隣接している。他の研究によってもまた、種々のＤＲ分子に対する結合のために、Ｐ１に対して、Ｃ末端の方向の６位のペプチド残基の重要な役割が指摘された。
【００７７】
過去数年間に、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子の大部分が比較的少ないスーパータイプ（各々、大きく重複するペプチド結合レパートリーおよびお主要なペプチド結合ポケットのコンセンサス構造により特徴付けられる）に分類され得ることを実証する証拠が蓄積された。従って、本発明のペプチドは、いくつかのＨＬＡ特異的アミノ酸モチーフのいずれか１つ（例えば、表Ｉ〜ＩＩＩを参照のこと）、またはモチーフの存在がいくつかの対立遺伝子特異的ＨＬＡ抗原に結合する能力に対応する場合はスーパーモチーフにより同定される。特定のアミノ酸スーパーモチーフを有するペプチドに結合するＨＬＡ分子はまとめて、ＨＬＡ「スーパータイプ」とよばれる。
【００７８】
以下に記載され、そして表Ｉ〜ＩＩＩにまとめたペプチドモチーフおよびスーパーモチーフは、本発明に従ってペプチドエピトープの同定および使用についての手引きを提供する。
【００７９】
それぞれのスーパーモチーフまたはモチーフを有するペプチドエピトープの例を、以下の各モチーフまたはスーパーモチーフの説明に示されるように、表に含める。この表は、ペプチドエピトープのいくつかを列挙する結合親和性比を含む。この比は、以下の式を用いることによりＩＣ50に変換され得る：標準的ペプチドのＩＣ50／比＝試験ペプチド（すなわち、ペプチドエピトープ）のＩＣ50。クラスＩペプチドに対する結合親和性を決定するために用いた標準的ペプチドのＩＣ50値を、表ＩＶに示す。クラスＩＩペプチドに対する結合親和性を決定するために用いた標準的ペプチドのＩＣ50値を、表Ｖに示す。本明細書中に記載の結合アッセイについての標準物質として用いたペプチドは、標準物質の例である；代わりの標準的ペプチドもまた、結合研究を行う場合に用いられ得る。
【００８０】
各表において列挙されたペプチドエピトープ配列を得るために、１９９９年Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ）に示されたＨＩＶ−１単離物の全てについてのタンパク質配列データを、指定されたスーパーモチーフまたはモチーフの存在について評価した。株の表を、表ＸＸＶＩに示す。９つのＨＩＶ−１構造タンパク質および調節タンパク質（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、ｒｅｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕ）を、分析に含めた。ペプチドエピトープを、さらに、各ＨＩＶ抗原に対して利用可能なタンパク質配列の中で、それらの保存性（すなわち、分散量）に基づいて評価した。表ＶＩＩ〜ＸＸに示されたペプチドを生成するために用いた保存性の基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの配列全体が、特定のＨＩＶ抗原に利用可能な配列の１５％で完全に保存されていることを必要とする。同様に、保存性の基準は、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの９マーコア領域全体が、特定のタンパク質について利用可能な配列の１５％で完全に保存されていることを必要とする。選択されたペプチドエピトープの保存性％を、表に示す。頻度（すなわち、完全に保存されたペプチド配列が同定されるＨＩＶタンパク質抗原の配列の数）もまた示す。表中の「ｐｏｓ（位置）」列は、エピトープの最初のアミノ酸残基に対応するＨＩＶタンパク質におけるアミノ酸位置を示す。「アミノ酸の数」は、エピトープ配列中の残基の数を示す。
【００８１】
（ＣＴＬ誘導性ペプチドエピトープを示すＨＬＡクラスＩモチーフ）
以下に示したＨＬＡクラスＩペプチドエピトープのスーパーモチーフおよびモチーフの第１のアンカー残基を、表Ｉにまとめる。表Ｉ（ａ）に示されたＨＬＡクラスＩモチーフは、本願発明に最も詳細に関連するものである。一次および二次アンカー位置を、表ＩＩにまとめる。ＨＬＡクラスＩスーパータイプファミリーを含む対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに列挙する。いくつかの場合、ペプチドエピトープをモチーフおよびスーパーモチーフ表の両方に列挙し得る。特定のモチーフと代表的なスーパーモチーフとの関係は、個々のモチーフの説明に示される。
【００８２】
（ＩＶ．Ｄ．１． ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ）
ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフを、２位に小さな（ＴまたはＳ）または疎水性（Ｌ、Ｉ、ＶまたはＭ）の一次アンカー残基がペプチドリガンド中に存在し、そしてエピトープのＣ末端位置に芳香族（Ｙ、ＦまたはＷ）の一次アンカー残基が存在することにより特徴付けた。Ａ１スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、ＨＬＡ−Ａ１スーパータイプ）は、少なくともＡ*０１０１、Ａ*２６０１、Ａ*２６０２、Ａ*２５０１、およびＡ*３２０１を含む（例えば、ＤｉＢｒｉｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：５９３０，１９９３；ＤｉＢｒｉｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：６２０，１９９４；Ｋｏｎｄｏ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５：２４９，１９９７を参照のこと）。Ａ１スーパーファミリーのメンバーであると推定された他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。個々のＨＬＡタンパク質の各々に結合するペプチドを、第１および／または二次アンカー位置での置換により、好ましくは、スーパーモチーフに特化されたそれぞれの残基を選択することにより調節し得る。
【００８３】
Ａ１スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＶＩＩに示す。
【００８４】
（ＩＶ．Ｄ．２．ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ）
対立遺伝子特異的ＨＬＡ−Ａ２．１分子に対する一次アンカーの特異性（例えば、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６，１９９１；Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１５６１−１２６３，１９９２；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−３５８７，１９９２；Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７，１９９３）およびＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２８分子の間での交差反応性結合を示した（例えば、関連データの総説については、Ｆｒｕｃｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１８７−１９２，１９９３；Ｔａｎｉｇａｋｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９：１５５−１６２，１９９４；Ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５−６９３，１９９５；Ｋａｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９０４−３９１２，１９９４を参照のこと）。これらの一次アンカー残基は、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフを規定し；ペプチドリガンド中の存在は、いくつかの種々のＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２８分子を結合する能力に対応する。ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフは、２位に一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＱを有するペプチドリガンド、およびエピトープのＣ末端位置に一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＴを有するペプチドリガンドを含む。
【００８５】
ＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、これらのペプチドを結合するＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ）は、少なくとも以下を含む：Ａ*０２０１、Ａ*０２０２、Ａ*０２０３、Ａ*０２０４、Ａ*０２０５、Ａ*０２０６、Ａ*０２０７、Ａ*０２０９、Ａ*０２１４、Ａ*６８０２およびＡ*６９０１。Ａ２スーパーファミリーのメンバーであると推定される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。以下で詳細に説明されるように、個々の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々に対する結合を、一次および／または二次アンカー位置での置換により、好ましくは、スーパーモチーフに特化されたそれぞれの残基を選択することにより調節し得る。
【００８６】
Ａ２スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＶＩＩＩに示す。２位に一次アンカー残基Ｖ、Ａ、ＴまたはＱを、Ｃ末端位置にＬ、Ｉ、Ｖ、ＡまたはＴを含むモチーフは、本願発明に最も詳細に関連するものである。
【００８７】
（ＩＶ．Ｄ．３． ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ）
ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフは、２位に一次アンカーとしてＡ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳまたはＴがペプチドリガンド中に存在し、そしてエピトープのＣ末端位置に（例えば、９マーの９位に）正に荷電した残基ＲまたはＫが存在することにより特徴付けられる（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９，１９９６を参照のこと）。Ａ３スーパーモチーフを結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ）の例示的メンバーとしては、少なくとも以下が挙げられる：Ａ*０３０１、Ａ*１１０１、Ａ*３１０１、Ａ*３３０１およびＡ*６８０１。Ａ３スーパータイプのメンバーであると推測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。以下で詳細に説明されるように、個々の対立遺伝子特異的ＨＬＡタンパク質の各々に結合するペプチドを、ペプチドの一次および／または二次アンカー位置でのアミノ酸の置換により、好ましくは、スーパーモチーフに特化されたそれぞれの残基を選択することにより調節し得る。
【００８８】
Ａ３スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを表ＩＸに示す。
【００８９】
（ＩＶ．Ｄ．４． ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフ）
ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフは、２位に一次アンカーとして芳香族残基（Ｆ、Ｗ、またはＹ）または疎水性脂肪族残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、またはＴ）がペプチドリガンド中に存在し、そしてエピトープのＣ末端位置に一次アンカーとしてＹ、Ｆ、Ｗ、Ｌ、ＩまたはＭが存在することにより特徴付けられる（例えば、ＳｅｔｔｅおよびＳｉｄｎｅｙ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（印刷中）１９９９を参照のこと）。Ａ２４スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、Ａ２４スーパータイプ）としては、少なくともＡ*２４０２、Ａ*３００１およびＡ*２３０１が挙げられる。Ａ２４スーパータイプのメンバーであると推測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々に結合するペプチドを、一次および／または二次アンカー位置での置換により、好ましくは、スーパーモチーフに特化されたそれぞれの残基を選択することにより調節し得る。
【００９０】
Ａ２４スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを表Ｘに示す。
【００９１】
（ＩＶ．Ｄ．５． ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ）
ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフは、２位に一次アンカーとしてプロリンを有するペプチド、およびエピトープのＣ末端位置に一次アンカーとして疎水性アミノ酸または脂肪族アミノ酸（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｆ、Ｗ、またはＹ）により特徴付けられる。Ｂ７スーパーモチーフを結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプ）は、少なくとも２６のＨＬＡ−Ｂタンパク質を含み、これらとしては以下が挙げられる：Ｂ*０７０２、Ｂ*０７０３、Ｂ*０７０４、Ｂ*０７０５、Ｂ*１５０８、Ｂ*３５０１、Ｂ*３５０２、Ｂ*３５０３、Ｂ*３５０４、Ｂ*３５０５、Ｂ*３５０６、Ｂ*３５０７、Ｂ*３５０８、Ｂ*５１０１、Ｂ*５１０２、Ｂ*５１０３、Ｂ*５１０４、Ｂ*５１０５、Ｂ*５３０１、Ｂ*５４０１、Ｂ*５５０１、Ｂ*５５０２、Ｂ*５６０１、Ｂ*５６０２、Ｂ*６７０１、およびＢ*７８０１（例えば、関連データの総説については、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２４７，１９９５；Ｂａｒｂｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：１７９，１９９５；Ｈｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：４３４，１９９２；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１７８，１９９５を参照のこと）。Ｂ７スーパータイプのメンバーであると推測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。以下により詳細に説明されるように、個々の対立遺伝子特異的ＨＬＡタンパク質の各々に結合するペプチドを、ペプチドの一次および／または二次アンカー位置での置換により、好ましくは、スーパーモチーフに特化されたそれぞれの残基を選択することにより調節し得る。
【００９２】
Ｂ７スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを表ＸＩに示す。
【００９３】
（ＩＶ．Ｄ．６． ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフ）
ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフは、２位に一次アンカーとして正に荷電した残基（Ｒ、Ｈ、またはＫ）がペプチドリガンド中に存在し、そしてエピトープのＣ末端位置に一次アンカーとして疎水性残基（Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ｉ、Ａ、またはＶ）が存在することにより特徴付けられる（例えば、ＳｉｄｎｅｙおよびＳｅｔｔｅ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（印刷中）１９９９を参照のこと）。Ｂ２７スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプ）の例示的なメンバーとしては、少なくとも以下が挙げられる：Ｂ*１４０１、Ｂ*１４０２、Ｂ*１５０９、Ｂ*２７０２、Ｂ*２７０３、Ｂ*２７０４、Ｂ*２７０５、Ｂ*２７０６、Ｂ*３８０１、Ｂ*３９０１、Ｂ*３９０２、およびＢ*７３０１。Ｂ２７スーパータイプのメンバーであると推測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々に結合するペプチドを、一次および／または二次アンカー位置での置換により、好ましくは、スーパーモチーフに特化されたそれぞれの残基を選択することにより調節し得る。
【００９４】
Ｂ２７スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを表ＸＩＩに示す。
【００９５】
（ＩＶ．Ｄ．７． ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフ）
ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフは、２位に一次アンカーとして負に荷電した残基（ＤまたはＥ）がペプチドリガンド中に存在し、そしてエピトープのＣ末端位置に一次アンカーとして疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、またはＡ）が存在することにより特徴付けられる（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：２６１，１９９６参照のこと）。Ｂ４４スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、Ｂ４４スーパータイプ）の例示的なメンバーとしては、少なくとも以下が挙げられる：Ｂ*１８０１、Ｂ*１８０２、Ｂ*３７０１、Ｂ*４００１、Ｂ*４００２、Ｂ*４００６、Ｂ*４４０２、Ｂ*４４０３、およびＢ*４００６。対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々に結合するペプチドを、一次および／または二次アンカー位置での置換により、好ましくは、スーパーモチーフに特化されたそれぞれの残基を選択することにより調節し得る。
【００９６】
（ＩＶ．Ｄ．８． ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフ）
ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフは、ペプチドリガンドにおける、小さな脂肪族残基（Ａ、Ｓ、またはＴ）の、エピトープの２位での一次アンカー残基としての存在、および芳香族または疎水性の残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、またはＡ）の、Ｃ末端位置での一次アンカー残基としての存在によって、特徴付けられる（例えば、関連するデータの概説についてはＳｉｄｎｅｙおよびＳｅｔｔｅ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，印刷中、１９９９を参照のこと）。Ｂ５８スーパーモチーフ（例えば、Ｂ５８スーパータイプ）に結合するＨＬＡ分子の対応するファミリーの例示的なメンバーとしては、少なくとも以下が挙げられる：Ｂ*１５１６、Ｂ*１５１７、Ｂ*５７０１、Ｂ*５７０２、およびＢ*５８０１。Ｂ５８スーパータイプのメンバーであると予測された他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。対立遺伝子特異的ＬＨＡ分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置および／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはこのスーパーモチーフに対して特異的なそれぞれの残基を選択して、調節され得る。
【００９７】
Ｂ５８スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＸＩＩＩに示す。
【００９８】
（ＩＶ．Ｄ．９． ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフ）
ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフは、ペプチドリガンドにおける、極性脂肪族残基Ｑまたは疎水性脂肪族残基（Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｉ、またはＰ）の、エピトープの２位での一次アンカーとしての存在、および疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、またはＡ）の、Ｃ末端位置での一次アンカーとしての存在によって、特徴付けられる（例えば、ＳｉｄｎｅｙおよびＳｅｔｔｅ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，印刷中、１９９９を参照のこと）。Ｂ６２スーパーモチーフ（例えば、Ｂ６２スーパータイプ）に結合するＨＬＡ分子の対応するファミリーの例示的なメンバーとしては、少なくとも以下が挙げられる：Ｂ*１５０１、Ｂ*１５０２、Ｂ*１５１３、およびＢ５２０１。Ｂ６２スーパータイプのメンバーであると予測された他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。対立遺伝子特異的ＬＨＡ分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置および／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはこのスーパーモチーフに対して特異的なそれぞれの残基を選択して、調節され得る。
【００９９】
Ｂ６２スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＸＩＶに示す。
【０１００】
（ＩＶ．Ｄ．１０． ＨＬＡ−Ａ１モチーフ）
ＨＬＡ−Ａ１モチーフは、ペプチドリガンドにおける、Ｔ、Ｓ、またはＭの、２位での一次アンカー残基としての存在、およびＹの、エピトープのＣ末端位置での一次アンカー残基としての存在によって、特徴付けられる。代替の対立遺伝子特異的Ａ１モチーフは、２位よりむしろ３位における、一次アンカー残基によって特徴付けられる。このモチーフは、Ｄ、Ｅ、Ａ、またはＳの、一次アンカー残基としての３位における存在、およびＹの、エピトープのＣ末端位置における一次アンカー残基としての存在によって、特徴付けられる（例えば、関連するデータの概説については、ＤｉＢｒｉｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：６２０、１９９４；Ｋｏｎｄｏら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５：２４９、１９９７；およびＫｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３、１９９４を参照のこと）。ＨＬＡ Ａ１に結合するペプチドは、一次アンカー位置および／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはこのモチーフに対して特異的なそれぞれの残基を選択して、調節され得る。
【０１０１】
いずれかのＡ１モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＸＶに示す。Ｔ、Ｓ、またはＭを２位に含み、そしてＹをＣ末端位置に含むエピトープもまた、表ＶＩＩに列挙するＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープの列挙に含まれる。なぜなら、これらの残基は、Ａ１スーパーモチーフ一次アンカーのサブセットであるからである。
【０１０２】
（ＩＶ．Ｄ．１１ ＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフ）
ＨＬＡ−Ａ２*０２０１モチーフは、ペプチドリガンドにおける、ＬまたはＭの、９残基ペプチドの２位での一次アンカー残基としての存在、およびＬまたはＶの、Ｃ末端位置での一次アンカー残基としての存在によって特徴付けられることが決定され（例えば、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６、１９９１を参照のこと）、そしてさらに、９アミノ酸ペプチドの２位にＩを含み、そしてＣ末端位置にＩまたはＡを含むことが、見出された（例えば、Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−１２６３、３月６日、１９９２；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−３５８７、１９９２を参照のこと）。Ａ*０２０１対立遺伝子特異的モチーフはまた、本発明者らによって、さらにＶＡ、Ｔ、またはＱを、一次アンカー残基としてこのエピトープの２位に含み、そしてＭまたはＴを、一次アンカー残基としてＣ末端位置に含むことが決定された（例えば、Ｋａｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９０４−３９１２、１９９４を参照のこと）。従って、ＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフは、２位における一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｔ、またはＱを有し、そしてこのエピトープのＣ末端位置における一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＴを有する、ペプチドリガンドを含む。ＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフの一次アンカー位置を特徴付ける、好ましい許容される残基は、Ａ２スーパーモチーフを記載する残基と同一である（関連するデータの概説に関しては、例えば、Ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５−６９３，１９９５；Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７、１９９３；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：２６１−２６６、１９９６；ＳｅｔｔｅおよびＳｉｄｎｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４７８−４８２、１９９８を参照のこと）。Ａ*０２０１モチーフを特徴付ける二次アンカー残基は、さらに規定されている（例えば、Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７、１９９３を参照のこと）。これらを表ＩＩに示す。ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子に結合するペプチドは、一次アンカー位置および／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはこのモチーフに対して特異的なそれぞれの残基を選択して、調節され得る。
【０１０３】
Ａ*０２０１モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＶＩＩＩに示す。一次アンカー残基Ｖ、Ａ、Ｔ、またはＱを２位に含み、そしてＬ、Ｉ、Ｖ、Ａ、またはＴをＣ末端に含むＡ*０２０１モチーフは、本明細書中で特許請求される本発明に最も特に関連するモチーフである。
【０１０４】
（ＩＶ．Ｄ．１２．ＨＬＡ−Ａ３モチーフ）
ＨＬＡ−Ａ３モチーフは、ペプチドリガンドにおける、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｃ、Ｇ、またはＤの、２位での一次アンカー残基としての存在、およびＫ、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｆ、またはＡの、エピトープのＣ末端位置での一次アンカー残基としての存在によって、特徴付けられる（例えば、ＤｉＢｒｉｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１５０８、１９９３；およびＫｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３−３９２４、１９９４を参照のこと）。ＨＬＡ−Ａ３に結合するペプチドは、一次アンカー位置および／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはこのモチーフに対して特異的なそれぞれの残基を選択して、調節され得る。
【０１０５】
Ａ３モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＸＶＩに示す。Ａ３スーパーモチーフをも含むエピトープもまた、表ＩＸに列挙する。Ａ３スーパーモチーフ一次アンカー残基は、Ａ３およびＡ１１対立遺伝子特異的モチーフ一次アンカー残基のサブセットを含む。
【０１０６】
（ＩＶ．Ｄ．１３． ＨＬＡ−Ａ１１モチーフ）
ＨＬＡ−Ａ１１モチーフは、ペプチドリガンドにおける、Ｖ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、またはＦの、２位での一次アンカー残基としての存在、およびＫ、Ｒ、Ｙ、またはＨの、エピトープのＣ末端位置での一次アンカー残基としての存在によって、特徴付けられる（例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２２１７−２２２１、１９９３；およびＫｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３−３９２４、１９９４を参照のこと）。ＨＬＡ−Ａ１１に結合するペプチドは、一次アンカー位置および／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはこのモチーフに対して特異的なそれぞれの残基を選択して、調節され得る。
【０１０７】
Ａ１１モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＸＶＩＩに示す；Ａ３対立遺伝子特異的モチーフ含むペプチドエピトープもまた、この表に存在する。なぜなら、Ａ３とＡ１１とのモチーフ間の一次アンカー特異性が広範に重なるからである。さらに、Ａ３スーパーモチーフを含むペプチドエピトープはまた、表ＩＸに列挙される。
【０１０８】
（ＩＶ．Ｄ．１４． ＨＬＡ−Ａ２４モチーフ）
ＨＬＡ−Ａ２４モチーフは、ペプチドリガンドにおける、Ｙ、Ｆ、Ｗ、またはＭの、２位での一次アンカー残基としての存在、およびＦ、Ｌ、Ｉ、またはＷの、エピトープのＣ末端位置での一次アンカー残基としての存在によって、特徴付けられる（例えば、Ｋｏｎｄｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７−４３１２、１９９５；およびＫｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３−３９２４、１９９４を参照のこと）。ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプチドは、一次アンカー位置および／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはこのモチーフに対して特異的なそれぞれの残基を選択して、調節され得る。
【０１０９】
Ａ２４モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＸＶＩＩＩに示す。これらのエピトープはまた、ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープを示す表Ｘに列挙される。なぜなら、Ａ２４対立遺伝子特異的モチーフを特徴付ける一次アンカー残基は、Ａ２４スーパーモチーフ一次アンカー残基のサブセットを含むからである。
【０１１０】
（クラスＩＩ ＨＴＬ誘導ペプチドエピトープを示すモチーフ）
ＨＬＡクラスＩＩペプチドエピトープスーパーモチーフおよび以下に描写するモチーフの一次および二次アンカー残基を、表ＩＩＩに要約する。
【０１１１】
（ＩＶ．Ｄ．１５． ＨＬＡ ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフ）
モチーフをまた、３つの共通のＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子（ＨＬＡ ＤＲＢ１*０４０１、ＤＲＢ１*０１０１、およびＤＲＢ１*０７０１）に結合するペプチドに関して同定した（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄらによる概説、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：３３６３−３３７３、１９９８を参照のこと）。包括的に、これらのモチーフ由来の共通の残基は、ＨＬＡ ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフを描写する。これらのＤＲ分子に結合するペプチドは、１位の一次アンカー残基としての大きな芳香族または疎水性の残基（Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ｖ，またはＭ）、および９マーコア領域の６位の一次アンカー残基としての小さな非荷電残基（Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ａ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ）によって特徴付けられる、スーパーモチーフを保有する。これらのＨＬＡ型の各々に対する対立遺伝子特異的二次効果および二次アンカーもまた、同定された（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、前出）。これらを表ＩＩＩに示す。ＨＬＡ−ＤＲＢ１*０４０１、ＤＲＢ１*０１０１、および／またはＤＲＢ１*０７０１に結合するペプチドは、一次アンカー位置および／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはこのスーパーモチーフに対して特異的なそれぞれの残基を選択して、調節され得る。
【０１１２】
ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフを含む保存された９マーコア領域（すなわち、分析のために使用されるＨＩＶ抗原タンパク質配列の少なくとも１５％において１００％保存される配列）（ここで、このスーパーモチーフの１位は、９残基コアの１位にある）を、表ＸＩＸａに示す。１５アミノ酸残基長の代表的な例示的なペプチドエピトープ（これらの各々が、保存された９残基コアを含む）もまた、表の「ａ」部分に示される。例示的な１５残基のスーパーモチーフ保有ペプチドについての交差反応性結合データを、表ＸＩＸｂに示す。
【０１１３】
（ＩＶ．Ｄ．１６． ＨＬＡ ＤＲ３モチーフ）
２つの対立遺伝子モチーフ（すなわち、サブモチーフ）は、ＨＬＡ−ＤＲ３分子に結合するペプチドエピトープを特徴付ける（例えば、Ｇｅｌｕｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５７４２，１９９４を参照のこと）。第一のモチーフ（サブモチーフＤＲ３Ａ）において、大きな疎水性の残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、またはＹ）は、９マーコアのアンカーの１位に存在し、そしてＤは、このエピトープのカルボキシル末端に向かう４位のアンカーとして存在する。他のクラスＩＩモチーフにおいてと同様に、コアの１位は、ペプチドのＮ末端を占有しても占有しなくてもよい。
【０１１４】
代替のＤＲ３スーパーモチーフは、このエピトープのカルボキシル末端に向けて６位の正の電荷の存在によって、アンカーの１位における大きな疎水性の残基の欠失、および／または負に荷電したかもしくはアミド様のアンカー残基の４位における欠失を提供する。従って、代替の対立遺伝子特異的ＤＲ３のチーフ（サブモチーフＤＲ３Ｂ）に関して：Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ａ、またはＹは、アンカーの１位に存在し；Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｓ、またはＴは、アンカーの４位に存在し；そしてＫ、Ｒ、またはＨは、アンカーの６位に存在する。ＨＬＡ−ＤＲ３に結合するペプチドは、一次アンカー位置および／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはこのモチーフに対して特異的なそれぞれの残基を選択して、調節され得る。
【０１１５】
ＤＲ３Ａサブモチーフを含む９残基配列に対応する保存された９マーコア領域（すなわち、分析のために使用されるＨＩＶ抗原タンパク質配列の少なくとも１５％において１００％保存される配列）（ここで、このサブモチーフの１位は、９残基コアの１位にある）を、表ＸＸａに示す。１５アミノ酸残基長の代表的な例示的なペプチドエピトープ（これらの各々が、保存された９残基コアを含む）もまた、表ＸＸａに示される。表ＸＸｂは、例示的なＤＲ３サブモチーフＡ保有ペプチドの結合データを示す。
【０１１６】
ＤＲ３Ｂサブモチーフを含む保存された９マーコア領域（すなわち、分析のために使用されるＨＩＶ抗原タンパク質配列の少なくとも１５％において１００％保存される配列）、およびＤＲ３サブモチーフＢエピトープを含むそれぞれの例示的な１５マーペプチドを、表ＸＸｃに示す。表ＸＸｄは、例示的なＤＲ３サブモチーフＢ保有ペプチドの結合データを示す。
【０１１７】
本明細書中の表に示される、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩのペプチドエピトープの各々は、別々に、本願発明の局面であるとみなされる。さらに、各ペプチドエピトープが他の任意のペプチドエピトープと組み合わせて使用され得ることもまた、本願発明の局面である。
【０１１８】
（ＩＶ．Ｅ．ワクチンの集団適用範囲の増強）
広範な集団適用範囲を有するワクチンは、好ましい。なぜなら、これらは商業的により価値があり、そして一般に、大部分の人々に対して適用可能であるからである。広範な集団適用範囲は、全体で考慮した場合に集団の大部分に存在するＨＬＡ対立遺伝子に結合するペプチドエピトープを選択することによって、本発明のペプチド（およびこのようなペプチドをコードする核酸組成物）を使用して得られ得る。表ＸＸＩは、種々の民族性におけるＨＬＡクラスＩスーパータイプの全体的な頻度（表ＸＸＩａ）、ならびにＡ２、Ａ３、およびＢ７スーパータイプによって達成される組み合わせられた集団適用範囲（表ＸＸＩｂ）を列挙する。Ａ２、Ａ３、およびＢ７スーパータイプは、各々が、これら５つの主要な民族性群の各々において、平均４０％を超えて存在する。８０％を超える適用範囲は、これらのスーパーモチーフの組み合わせによって達成される。これらの結果は、効果的かつ民族的に変位していない集団適用範囲が、制限された数の交差反応性ペプチドの使用の際に達成されることを示唆する。これら３つの主要なペプチド特異性を用いて達成される集団適用範囲は高いが、適用範囲は、９５％以上の集団適用範囲に達するよう拡張され得、そしてさらなるスーパーモチーフまたは対立遺伝子特異的モチーフを保有するペプチドの使用によって、真に多重特異性の応答をより容易に達成する。
【０１１９】
Ｂ４４、Ａ１、およびＡ２４スーパータイプは、平均して、これらの主要な民族性集団において２５％〜４０％の範囲で各々存在する（表ＸＸＩａ）。全体としてはさほど流行していないが、Ｂ２７、Ｂ５８、およびＢ６２スーパータイプは、各々が、少なくとも１つの主要な民族性群において、２５％より大きな頻度で存在する（表ＸＸＩａ）。表ＸＸＩｂは、５つの主要な民族性群において同定されたＨＬＡスーパータイプの組み合わせの推定された流行を要約する。Ａ１、Ａ２４、およびＢ４４スーパータイプを、Ａ２、Ａ３、およびＢ７の適用範囲に含めることによって得られる増加した適用範囲、ならびに本明細書中に記載される全てのスーパータイプを用いて得られる適用範囲を示す。
【０１２０】
本明細書中に提供されるデータは、Ａ２、Ａ３、およびＢ７スーパータイプの以前の定義とともに、全ての抗原（Ａ２９、Ｂ８、およびＢ４６の例外が可能である）が、合計で９のＨＬＡスーパータイプに分類され得ることを示す。６つの最も頻繁なスーパータイプ由来のエピトープを含めることによって、平均９９％の集団適用範囲が、５つの主要な民族性群に対して得られる。
【０１２１】
（ＩＶ．Ｆ．免疫応答刺激ペプチドアナログ）
一般に、ＣＴＬおよびＨＴＬの応答は、可能なエピトープ全てに指向されるわけではない。むしろ、これらは、少数の「免疫優性な」決定因子に制限される（Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５１５９、１９７９；Ｂｅｎｎｉｎｋら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１９３５−１９３９、１９８８；Ｒａｗｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３９７７−３９８４、１９９１）。免疫優性（Ｂｅｎａｃｅｒｒａｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １７５：２７３−２７９、１９７２）は、所定のエピトープが選択的に特定のＨＬＡタンパク質を結合する能力（決定因子選択理論）（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：１６３５、１９８３；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、Ｎａｔｕｒｅ ２６７：１５６−１５８、１９７７）、または既存のＴＣＲ（Ｔ細胞レセプター）特異性によって選択的に認識されること（レパートリー理論）（Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＯＦ ＳＥＬＦＮＯＮＳＥＬＦ ＤＩＳＣＲＩＭＩＮＡＴＩＯＮ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２７０−３１０頁、１９８２）のいずれかによって説明され得ることが、理解された。さらなる因子（大部分が先行する事象に連結する）もまた、制限された免疫原性を超えて、多くの潜在決定因子のどれが免疫優性として提示されるかを決定する際に、主要な役割を果たし得ることが、実証された（Ｓｅｒｃａｒｚら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：７２９−７６６、１９９３）。
【０１２２】
優性および亜優性の概念は、感染性疾患と癌との両方の免疫療法に関連する。例えば、慢性ウイルス性疾患の経過において、亜優性エピトープの漸増は、優性のＣＴＬまたはＨＴＬ特異性がウイルスの機能的許容、抑制、変異および他の機構によって不活化された場合に特に、感染の首尾よいクリアランスのために重要であり得る（Ｆｒａｎｃｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：５２４−５３１，１９９５）。癌および腫瘍の抗原の場合には、最も高い結合親和性のペプチドの少なくともいくらかを認識するＣＴＬは、機能的に不活化され得る。より低い結合親和性のペプチドは、優先的に、これらの時点で認識され、従って、治療用または予防用の抗癌ワクチンにおいて、好ましくあり得る。
【０１２３】
特に、公知の非ウイルス性腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来の有意な数のエピトープが、中程度の親和性（５０〜５００ｎＭの範囲のＩＣ50）でＨＬＡクラスＩを結合することが、注目された。例えば、１５の公知のＴＡＡペプチドのうちの８つが、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）によって認識されるかまたは５０〜５００ｎＭの範囲でＣＴＬに結合されることが見出された。（これらのデータは、９０％の既知のウイルス性抗原がＨＬＡクラスＩ分子によって５０ｎＭ以下のＩＣ50で結合され、一方でほんの約１０％が５０〜５００ｎＭの範囲で結合されるという推定と、対照的である（Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：５５８−５５９２、１９９４））。癌の硬化において、この現象は恐らく、Ｔ細胞許容事象に恐らく起因する、最も結合が高いペプチドのいくつかを認識するＣＴＬの排除または機能的阻害に起因する。
【０１２４】
理論に束縛されることを意図しないが、優性エピトープに対するＴ細胞は、クローン的に除去され得、亜優性（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）なエピトープの選択は、補強されるＴ細胞の存在を可能にし、これは次いで、治療的応答または予防的応答を導くと考えられる。しかし、ＨＬＡ分子の亜優性エピトープに対する結合は、しばしば、優性エピトープに対するより活発ではない。従って、１以上のＨＬＡ分子に対する特定の免疫原性エピトープの結合親和性を調節し得、それによって、例えば、より活発な応答を誘発するアナログペプチドを調製するために、ペプチドによって誘発される免疫応答を調節する必要がある。この能力は、ペプチドエピトープに基づくワクチンおよび治療剤の有用性を非常に向上する。
【０１２５】
スーパーファミリーの全ての対立遺伝子間の適切な交差反応性を有するペプチドは、上記のスクリーニング手順によって同定されるが、交差反応性は、必ずしも可能な限り完全ではなく、特定の場合において、ペプチドの交差反応性を増加するための手順は、有用であり得；さらに、このような手順はまた、結合親和性またはペプチド安定性のようなペプチドの他の特性を改変するために使用され得る。所与のモチーフまたはスーパーモチーフ内のＨＬＡ対立遺伝子についてのペプチドの交差反応性を支配する一般的法則が確立しているため、より広い（または別に改変された）ＨＬＡ結合能力を達成するための特定の目的のペプチドの構造の改変（すなわち、アナログ化）が実施され得る。より具体的には、最も広い交差反応性パターンを示すペプチドは、本明細書中の教示に従って産生され得る。アナログ発生に関する本概念は、１／６／９９に出願した同時係属中Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２２６，７７５により詳細に記載される。
【０１２６】
簡略的には、使用されるストラテジーは、特定のＨＬＡ分子への結合に相関するモチーフまたはスーパーモチーフを利用する。このモチーフまたはスーパーモチーフは、一次アンカー、多くの場合は、二次アンカーを有することによって定義される。アナログペプチドは、一次アンカー、二次アンカー、または一次および二次アンカー位置において、アミノ酸残基を置換することによって形成され得る。一般的に、アナログは、すでにモチーフまたはスーパーモチーフを有するペプチドに対して作製される。ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドおよびＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドについて規定されているスーパーモチーフおよびモチーフの好ましい二次アンカー残基は、それぞれ、表ＩＩおよびＩＩＩに示される。
【０１２７】
本発明に従う多くのモチーフまたはスーパーモチーフの場合、残基は、対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子または各モチーフまたはスーパーモチーフに結合するＨＬＡスーパータイプのメンバーに対する結合に対して有毒であると定義される（表ＩＩおよびＩＩＩ）。従って、結合に対して有害であるこのような残基の除去は、本発明に従って実施され得る。例えば、Ａ３スーパータイプの場合、このような有害残基を有する全てのペプチドが、分析に使用されるペプチドの集団から除去される場合、交差反応性の発生率は、２２％から３７％まで増加した（例えば、Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊら、Ｈｕ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９、１９９６を参照のこと）。従って、所与のスーパーモチーフ内のペプチドの交差反応性を改善する１つのストラテジーは、ペプチド内に存在する有害残基の１つ以上を除去し、そしてＡｌａ（ペプチドのＴ細胞認識に影響を及ぼし得ない）のような小さな「中性」残基を置換するのに簡単である。交差反応性の向上した見込みは、ペプチド内の有害残基の排除とともに、対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子またはスーパーファミリー内の複数ＨＬＡ分子に対する高親和性結合に関連した「好ましい」残基が挿入される場合に期待される。
【０１２８】
アナログペプチドが、ワクチンとして使用される場合、実際にインビボで天然エピトープに対するＣＴＬ応答を誘発する（または、クラスＩＩエピトープの場合、野生型ペプチドと交差反応するヘルパーＴ細胞を誘発する）ことを確実にするため、このアナログペプチドは、適切なＨＬＡ対立遺伝子の個体からインビトロでＴ細胞を免疫するために使用され得る。従って、野生型ペプチド感作標的細胞の溶解を誘導するための免疫した細胞の能力が評価される。抗原提示細胞として、適切な遺伝子で感染またはトランスフェクトされた細胞、あるいは、クラスＩＩエピトープのみの場合、全タンパク質抗原でパルス化された細胞を使用することが所望され、それによって、内生的に産生された抗原が関連Ｔ細胞によっても認識されるかどうかを確実にする。
【０１２９】
本発明の別の実施形態は、弱い結合ペプチドのアナログを形成することであり、それによって、適切な数の交差反応性細胞バインダーを確実にする。５００〜５０００ｎＭの結合親和性を示し、そして１つまたは２つの位置において受容可能であるが、部分最適な一次アンカー残基を保有する、クラスＩ結合ペプチドは、それぞれのスーパータイプに従って、好ましいアンカー残基を置換することによって「固定」され得る。次いで、アナログペプチドは、交差結合活性について試験され得る。
【０１３０】
有効なペプチドアナログを発生するための別の実施形態は、例えば、液体環境におけるペプチド安定性または溶解性に悪影響を有する残基の置換を含む。この置換は、ペプチドエピトープの任意の位置にて起こる。例えば、システイン（Ｃ）は、α−アミノ酪酸を選択して置換され得る。その化学的性質のために、システインは、ジスルフィド架橋を形成し、そして構造的に十分にペプチドを変更して、結合能力を低減する傾向を有する。Ｃの代わりにα−アミノ酪酸で置換することは、この問題を緩和するのみならず、実際に、特定の場合における結合能力および交差結合能力を改善する（例えば、Ｓｅｔｔｅら、Ｉｎ：Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ編、Ｒ．ＡｈｍｅｄおよびＩ．Ｃｈｅｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ、１９９９による総説を参照のこと）。システインのα−アミノ酪酸による置換は、ペプチドエピトープの任意の残基、すなわち、アンカー位置または非アンカー位置のいずれかにおいて生じ得る。
【０１３１】
（ＩＶ．Ｇ．スーパーモチーフ保有ペプチドまたはモチーフ保有ペプチドに対する疾患関連抗原由来のタンパク質配列のコンピュータースクリーニング）
標的抗原内のスーパーモチーフまたはモチーフ保有エピトープを同定するために、天然タンパク質配列、例えば、腫瘍関連抗原、または感染生物由来の配列、または移植のためのドナー組織は、計算するための手段（例えば、知的計算またはコンピューター）を使用してスクリーンされ、この配列内のスーパーモチーフまたはモチーフの存在を決定する。天然ペプチドの分析から得られた情報は、天然ペプチドの状態を評価するために直接使用され得るか、またはペプチドエピトープを発生するために続いて利用され得る。
【０１３２】
アナログペプチドの発生を可能にするプログラムのように、本スーパーモチーフまたはモチーフの発生のためのタンパク質配列の迅速なスクリーニングを可能にするコンピュータープログラムは、本発明によって包含される。これらのプログラムは、任意の同定されたアミノ酸配列を分析するか、または未知の配列に作動して同時にその配列を決定し、そのモチーフ保有エピトープを同定するために実施される；アナログは、同様に、同時に決定され得る。一般的に、同定された配列は、病原性生物由来または腫瘍関連ペプチド由来である。例えば、本明細書中で考慮される標的分子として、ＨＩＶのｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、ｒｅｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、およびｖｐｕタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
この同じ標的タンパク質の複合変異体の配列が利用可能である場合、潜在ペプチドエピトープもまた、それらの保存に基づいて選択され得る。例えば、保存についての基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの全配列またはクラスＩＩ結合ペプチドの全９マーコアが、特異的なタンパク質抗原について評価された配列の示されたパーセントで保存されることを規定し得る。
【０１３４】
ＨＩＶは迅速に変異し、それによって異なるアミノ酸配列を有するウイルス株の発生を生じるため、ワクチン組成物中への封入のためのエピトープを選択する代替の方法が、本明細書中で利用される。多くの異なる株で感染され得る広範な集団を標的化するために、異なるＨＩＶ株由来のＨＩＶ抗原配列の代表であるエピトープをワクチン組成物に含むことが好ましい。例えば、同じ領域から５エピトープを選択することによって、それらの各々は、ＨＩＶ株間で２０％保存され、それらのエピトープの組み合わせは、その領域の１００％の範囲を達成する。当業者によって理解されるように、より低いかまたはより高い程度の保存（例えば、表ＶＩＩ−ＸＸに設定されたエピトープの同定のために使用される１５％保存）が、所与の抗原性標的に適切であるとして使用され得る。
【０１３５】
ペプチド結合の予測に利用される選択基準は、実際の結合と最も効率よく相関するように、可能な限り正確であることが重要である。適切な一次アンカーの存在に基づいて、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に結合するペプチドの予測は、約３０％の割合で陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）である（例えば、Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９、１９９３を参照のこと）。しかし、本明細書中に開示されるペプチド−ＨＬＡ結合データ、関連した特許出願のデータ、および当該分野のデータを広範に分析することによって、本発明者らは、一次アンカー残基単独の存在を基準に、同定についての予測的な値を劇的に増加する多数の対立遺伝子特異的な多項式アルゴニズムを開発した。これらのアルゴニズムは、一次アンカーの存在または非存在のみならず、（異なる位置の異なるアミノ酸の影響を説明するために）二次アンカー残基の陽性または有害な存在を考慮する。このアルゴニズムは、本質的に、ペプチド−ＨＬＡインターカレーションの全親和力（またはΔＧ）が、以下：
【０１３６】
【化６】
【０１３７】
の型の線形多項式関数として近似され得るとの仮定に基づき、ここで、ａjiは、ｎ個のアミノ酸のペプチドの配列に沿った所与の位置（ｉ）における所与のアミノ酸（ｊ）の存在の影響を表す係数である。この方法の重要な仮定は、各位置における影響が、本質的に互いに独立しているという点である。この仮定は、ペプチドがＨＬＡ分子に結合され、本質的に伸長したコンフォメーションでＴ細胞によって認識されることを証明した研究によって、妥当とされる。特定のアルゴニズム係数の誘導は、例えば、Ｇｕｌｕｋｏｔａ，Ｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７：１２５８，１９９７に記載されている。
【０１３８】
好ましいペプチド配列を同定するさらなる方法（これはまた、特定のモチーフを使用する）は、中性ネットワークおよび分子モデリングプログラムの使用を含む（例えば、Ｍｉｌｉｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：７５３、１９９８；Ａｌｔｕｖｉａら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５８：１、１９９７；Ａｌｔｕｖｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：２４４、１９９５；Ｂｕｕｓ，Ｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：２０９−２１３、１９９９；Ｂｒｕｓｉｃ、Ｖら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４：１２１−１３０、１９９８；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３、１９９３；Ｍｅｉｓｔｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ １３：５８１、１９９５；Ｈａｍｍｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３３５，１９９４；Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：５５５ １９９９を参照のこと）。
【０１３９】
例えば、任意の有害な二次アンカー残基の存在を回避しながら、少なくとも１個の好ましい二次アンカー残基を含むＡ*０２０１モチーフ保有ペプチドのセットにおいて、ペプチドの６９％が５００ｎＭ未満のＩＣ50を有するＡ*０２０１と結合することが示されている（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９，１９９３）。これらのアルゴニズムはまた、カットオフが、所望される際に、より高いまたはより低い予測された結合特性を有するペプチドの組を選択するために調節され得るという点で融通性がある。
【０１４０】
ペプチドエピトープを同定するためのコンピュータースクリーニングを使用する場合、タンパク質配列または翻訳された配列は、モチーフについて研究するために開発されたソフトウエア（例えば、「ＦＩＮＤＰＡＴＴＥＲ」プログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５、１９８４）またはＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈ １．４ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｄ．Ｂｒｏｗｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を使用して分析され、適切なＨＬＡ結合モチーフを含有する潜在ペプチド配列を同定し得る。この同定されたペプチドは、カスタマイズされた多項式アルゴニズムを使用して記録され（ｓｃｏｒｅ）、特異的なＨＬＡクラスＩ対立遺伝子またはＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子を結合する能力を予測し得る。当業者によって理解されるように、多くのコンピュータープログラミングソフトウエアおよびハードウエアオプションは、公知または未知のペプチド配列を評価するために（例えば、限定されないが、エピトープを同定するために、単位ペプチド長あたりのエピトープ濃度を同定するために、またはアナログを発生するために）、本発明のモチーフを実施するために使用され得る関連分野において利用可能である。
【０１４１】
上記の手順に従って、ＨＬＡスーパータイプ群または対立遺伝子特異的なＨＬＡ分子と結合し得るＨＩＶペプチドエピトープおよびそれらのアナログが、同定された（表ＶＩＩ−ＸＸ）。
【０１４２】
（ＩＶ．Ｈ．ペプチドエピトープの調製）
本発明に従うペプチドは、合成的に、組換えＤＮＡ技術または化学合成によって、あるいは、天然腫瘍または病原性生物のような天然源から、調製され得る。ペプチドエピトープは、個々にまたはポリエピトープペプチドとして、合成され得る。ペプチドが好ましくは、幾つかの実施形態において、他の天然に存在する宿主細胞タンパク質およびそれらのフラグメントを実質的に有しないが、これっらのペプチドは、天然フラグメントまたは粒子に合成的に複合体化され得る。
【０１４３】
本発明に従うペプチドは、種々の長さであり得、そしてそれらの中性（非電荷）形態または塩である形態であり得る。本発明に従うペプチドは、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化反応のような修飾を有しないか、またはそれらは修飾が本明細書中に記載されるようなペプチドの生物学的活性を破壊しない条件に供せられるこれらの修飾を含む。
【０１４４】
可能である場合、本発明のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドエピトープを約８〜約１３アミノ酸残基の長さ、好ましくは９〜１０に最適化することが所望され得る。ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドエピトープは、約６〜約３０のアミノ酸長、好ましくは、約１３残基と約２０残基との間に最適化され得る。好ましくは、ペプチドエピトープは、関連ＨＬＡ分子に結合される内生的に処理された病原体誘導ペプチドまたは腫瘍細胞ペプチドとサイズが釣り合っている。
【０１４５】
代替の実施形態において、本発明のエピトープは、ポリエピトープペプチドとして、またはポリエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子として、連結され得る。
【０１４６】
別の実施形態において、高濃度のクラスＩエピトープおよび／またはクラスＩＩエピトープを含む天然ペプチド領域を同定することが好ましい。このような配列は、一般的に、単位アミノ酸長あたり最大数のエピトープを含むことに基づいて選択される。エピトープが、入れ子または重なり合った様式で存在し得、例えば、１０アミノ酸長のペプチドが、２個の９アミノ酸長のエピトープおよび１個の１０アミノ酸長のエピトープを含み；細胞内処理の際に、各エピトープが、曝露され得、そしてこのようなペプチドの投与の際にＨＬＡ分子によって結合され得ることが理解される。このより長い、好ましくは、多重エピトープ性ペプチドは、合成的に、組換え的に、または天然源からの切断を介して、発生され得る。
【０１４７】
本発明のペプチドは、広範な種々の様式で調製され得る。好ましい比較的短いサイズの場合、このペプチドは、従来の技術に従って、溶液中でまたは固体支持体上で合成され得る。種々の自動合成装置は、市販され、公知のプロトコールに従って使用され得る。（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第二版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、１９８４）。さらに、個々のペプチドエピトープは、化学連結を使用して接合され、本発明の範囲内にあるより大きなペプチドを産生し得る。
【０１４８】
あるいは、組換えＤＮＡ技術が使用され得、ここで、目的の免疫原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、発現ベクター内に挿入され、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、そして発現に適切な条件下で培養される。これらの手順は、一般にＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されるように、一般に当該分野で公知である。従って、本発明の１個以上のペプチド配列を含む組換えポリペプチドは、適切なＴ細胞エピトープを提示するために使用され得る。
【０１４９】
本明細書中で考慮された好ましい長さのペプチドエピトープについてのヌクレオチドコード配列は、化学的技術（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１）のホスホトリエステル法）によって合成され得る。ペプチドアナログは、天然ペプチド配列をコードする核酸塩基を適切かつ所望の核酸塩基に置き換えることによって単純に作製され得る；例示的な核酸置換は、本明細書中において、モチーフ／スーパーモチーフによって規定されるアミノ酸をコードする置換である。次いで、コード配列は、適切なリンカーが提供され得、そして当該分野で市販される発現ベクターに溶解され得、そしてベクターは、所望の融合タンパク質を産生するために適切な宿主を形質転換するために使用される。多くのこのようなベクターおよび適切な宿主系は、ここで利用可能である。この融合タンパク質の発現のために、コード配列は、作動可能に連結した開始コドンおよび終止コドン、プロモーターおよびターミネーター領域および通常、複製システムを備え、所望の細胞性宿主における発現のための発現ベクターを提供する。例えば、細菌性宿主と適合したプロモーター配列は、所望のコード配列の挿入のための好都合な制限部位を含むプラスミドに提供される。得られる発現ベクターは、適切な細菌性宿主に形質転換される。当然のことながら、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞宿主もまた、適切なベクターおよびコントロール配列を利用して、使用され得る。
【０１５０】
（ＩＶ．Ｉ．Ｔ細胞応答を検出するためのアッセイ）
一旦、ＨＬＡ結合ペプチドが同定されると、それらは、Ｔ細胞応答を誘発する能力について試験され得る。モチーフ保有ペプチドの調製および評価は、ＰＣＴ公報ＷＯ９４／２０１２７およびＷＯ９４／０３２０５に記載される。簡単に述べると、特定の抗原由来のエピトープを含むペプチドが合成され、適切なＨＬＡタンパク質に結合するそれらの能力について試験される。これらのアッセイは、放射ヨウ素標識した参照ペプチドの結合に関して、精製されたＨＬＡクラスＩ分子への本発明のペプチドの結合を評価する工程を包含し得る。あるいは、空のクラスＩ分子を発現する細胞（すなわち、その中にペプチドを含まない）は、免疫蛍光染色およびフロー微蛍光測定によってペプチド結合について評価され得る。ペプチド結合を評価するために使用され得る他のアッセイは、ペプチド依存クラスＩアセンブリアッセイおよび／またはペプチド競合によるＣＴＬ認識の阻害を含む。代表的に、５００ｎＭ以下の親和性でクラスＩ分子に結合するそれらのペプチドは、感染された個体または免疫された個体から誘導体化されたＣＴＬのための標的として作用する能力について、および、疾患に付随した選択された標的細胞と反応し得るＣＴＬ集団を誘発し得る一次インビトロＣＴＬ応答または一次インビボＣＴＬ応答を誘発する能力について、さらに評価される。対応するアッセイは、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの評価のために使用される。代表的に、１０００ｎＭ以下の親和性で結合することが示されるＨＬＡクラスＩＩモチーフ保有ペプチドは、ＨＴＬ応答を刺激する能力についてさらに評価される。
【０１５１】
Ｔ細胞応答を検出するために使用される従来のアッセイとして、増殖アッセイ、リンホカイン分泌アッセイ、直接細胞傷害性アッセイ、および制限希釈アッセイ（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）が挙げられる。例えば、ペプチドを用いて培養された抗原提示細胞は、応答細胞集団（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）のＣＴＬ応答を誘発する能力についてアッセイされ得る。抗原提示細胞が、末梢血液単核細胞または樹状細胞のような正常細胞であり得る。あるいは、内部的に処理されたペプチドを有するクラスＩ分子を装填するそれらの能力に欠乏し、そして適切なヒトクラスＩ遺伝子でトランスフェクトされた変異体非ヒト哺乳動物細胞株が、ペプチドのインビトロで一次ＣＴＬ応答を誘発する能力について試験するために使用され得る。
【０１５２】
末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＣＴＬ前躯体の応答細胞源として使用され得る。適切な抗原提示細胞は、ペプチドと共にインキュベートされ、次いで、ペプチド装填した抗原提示細胞が、最適な培養条件下で応答細胞集団と共にインキュベートされる。陽性ＣＴＬ活性化は、放射標識した標的細胞を殺傷するＣＴＬの存在について培養物をアッセイすることによって決定され得る。特定のペプチドパルス化標的およびペプチド配列が誘導される抗原の内生的に処理された形態を発現する標的細胞。
【０１５３】
より最近では、フルオレセイン標識したＨＬＡテトラマー複合体で染色することによって抗原特異的Ｔ細胞の直接的定量を可能にする方法が、考案された（Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１９９３；Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４，１９９６）。他の比較的最近の技術的開発として、細胞内リンホカインを染色する工程、およびインターフェロン放出アッセイまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイが挙げられる。テトラマー染色、細胞内リンホカイン染色およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイは全て、より従来のアッセイより少なくとも１０倍より感度が高いようである（Ｌａｌｖａｎｉ，Ａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９、１９９７；Ｄｕｎｂａｒ、Ｐ．Ｒ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：４１３、１９９８；Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：１７７、１９９８）。
【０１５４】
ＨＴＬの活性化はまた、当該分野で公知の技術（例えば、Ｔ細胞増殖およびリンホカイン（例えば、ＩＬ−２）の分泌）を使用して評価され得る（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１〜７６１、１９９４を参照のこと）。
【０１５５】
あるいは、ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫は、ペプチドエピトープの免疫原性を決定するために使用され得る。いくつかのトランスジェニックマウスモデル（ヒトＡ２．１、Ａ１１（これはＨＬＡ−Ａ３エピトープを分析するためにさらに使用され得る）、およびＢ７対立遺伝子を有するマウスを含む）が特徴付けられ、そして他のマウス（例えば、ＨＬＡ−Ａ１およびＡ２４に対するトランスジェニックマウス）が開発されている。ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ３マウスモデルもまた開発されている。他のＨＬＡ対立遺伝子を有するさらなるトランスジェニックマウスモデルが、必要に応じて作製され得る。マウスは、不完全フロイトアジュバントに乳化したペプチドで免疫され得、そして得られるＴ細胞は、ペプチドパルス化（ｐｕｌｓｅｄ）標的細胞を認識し、適切な遺伝子でトランスフェクトされた細胞を標的化するそれらの能力について試験される。ＣＴＬ応答は、上記の細胞傷害性アッセイを使用して分析され得る。同様に、ＨＴＬ応答は、Ｔ細胞増殖またはリンホカインの分泌のようなアッセイを使用して分析され得る。
【０１５６】
代表的な免疫原性ペプチドエピトープを、表ＸＸＩＩＩに記載する。
【０１５７】
（ＩＶ．Ｊ．診断薬としておよび免疫応答を評価するためのペプチドエピトープの使用）
本発明の一実施形態において、本明細書中に記載されるようなＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ結合ペプチドが、免疫応答を評価するための試薬として使用される。評価されるべき免疫応答は、免疫源として、試薬として用いられるペプチドエピトープを認識しそしてこれに結合する抗原特異性ＣＴＬまたはＨＴＬを生成し得る任意の物質を使用することによって、誘導され得る。ペプチド試薬は、免疫原として使用される必要はない。このような分析のために使用され得るアッセイシステムとしては、比較的最近の技術開発（例えば、細胞内リンホカインおよびインターフェロン放出アッセイのためのテトラマー染色、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）が挙げられる。
【０１５８】
例えば、本発明のペプチドは、病原または免疫原に曝露された後の抗原特異性ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価するために、テトラマー染色アッセイにおいて使用され得る。ＨＬＡテトラマー複合体を使用して、抗原特異性ＣＴＬを直接可視化し（例えば、Ｏｇｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：２１０３〜２１０６、１９９８；およびＡｌｔｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １７４：９４〜９６、１９９６を参照のこと）、そして末梢血単核細胞のサンプル中の抗原特異性ＣＴＬ集団の頻度を決定する。
【０１５９】
本発明のペプチドを使用するテトラマー試薬は、典型的に以下のように生成され得る：ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、三分子複合体を生成するために、対応するＨＬＡ重鎖およびβ2−ミクログロブリンの存在下で再折り畳みされる。この複合体は、先にタンパク質に操作された部位において重鎖のカルボキシル末端でビオチン化される。テトラマー形成は、次いで、ストレプトアビジンの付加によって誘導される。蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて、抗原特異性細胞を染色するためにテトラマーが使用され得る。これらの細胞は、次いで、例えば、フローサイトメトリーによって同定され得る。このような分析は、診断目的または予後目的のために使用され得る。
【０１６０】
本発明のペプチドはまた、免疫リコール応答を評価するための試薬として使用される（例えば、Ｂｅｒｔｏｎｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３〜５１３、１９９７、およびＰｅｎｎａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１５６５〜１５７０、１９９１を参照のこと）。例えば、ＨＩＶに罹患した個体由来の患者のＰＢＭＣサンプルは、特定のペプチドを使用して、抗原特異性ＣＴＬまたはＨＴＬの存在について分析され得る。単核細胞を含む血液サンプルは、ＰＢＭＣを培養し、そして本発明のペプチドでその細胞を刺激することによって評価され得る。適切な培養期間の後、拡大された細胞集団は、例えば、ＣＴＬまたはＨＴＬ活性について分析される。
【０１６１】
ペプチドはまた、ワクチンの効力を評価するための試薬として使用される。免疫原をワクチン接種された患者から得たＰＢＭＣは、例えば、上記の方法のいずれかを使用して分析され得る。患者は、ＨＬＡタイプであり、そしてその患者に存在する対立遺伝子特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬は、分析のために選択される。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣサンプル中のＨＩＶエピトープ特異性ＣＴＬおよび／またはＨＴＬの存在によって示される。
【０１６２】
本発明のペプチドはまた、当該分野で周知の技術を使用して、抗体を作製するために使用され（例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ＮＹ；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｈａｒｌｏｗ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照のこと）、これはＨＩＶ感染を診断するための試薬として有用であり得る。このような抗体としては、ＨＬＡ分子の状況においてペプチドを認識する抗体（すなわち、ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体）が挙げられる。
【０１６３】
（ＩＶ．Ｋ．ワクチン組成物）
ワクチン、および本明細書中で記載されるような免疫原性的に有効量の１つ以上のペプチドを含むワクチンを調製する方法は、本発明のさらなる実施形態である。一旦適切な免疫原性ペプチドが規定されると、これらは様々な手段によって識別されそして送達され得る（本明細書中で「ワクチン」組成物と称される）。このようなワクチン組成物としては、例えば、リポペプチド（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３４１，１９９５）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）ミクロスフェアにカプセル化されたペプチド組成物（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２８７〜２９４，１９９１：Ａｌｏｎｓｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ １２：２９９〜３０６，１９９４；Ｊｏｎｅｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ １３：６７５〜６８１，１９９５を参照のこと）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）に含まれたペプチド組成物（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３４４：８７３〜８７５，１９９０；Ｈｕら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：２３５〜２４３，１９９８）、多抗原ペプチドシステム（ＭＡＰ）（例えば、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５４０９〜５４１３、１９８８；Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９６：１７〜３２，１９９６）、多価ペプチドして処方されたペプチド；弾道的（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達システムで使用するためのペプチド、典型的に結晶化されたペプチド、ウイルス送達ベクター（Ｐｅｒｋｕｓ、Ｍ．Ｅ．ら、Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ、Ｓ．Ｈ．Ｅ．編、３７９頁、１９９６；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５３５，１９８６；Ｈｕ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５３７、１９８６；Ｋｉｅｎｙ，Ｍ．Ｐ．ら、ＡＩＤＳ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：７９０、１９８６；Ｔｏｐ，Ｆ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２４：１４８，１９７１；Ｃｈａｎｄａ，Ｐ．Ｋ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７５：５３５，１９９０）、ウイルスまたは合成起源の粒子（例えば、Ｋｏｆｌｅｒ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９２：２５，１９９６；Ｅｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３；Ｆｏｌｏ，Ｌ．Ｄ．Ｊｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．７：６４９，１９９５）、アジュバント（Ｗａｒｒｅｎ，Ｈ．Ｓ．、Ｖｏｇｅｌ，Ｆ．Ｒ．およびＣｈｅｄｉｄ，Ｌ．Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３６９，１９８６；Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ １１：２９３，１９９３）、リポソーム（Ｒ４ｅｄｄｙ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５８５、１９９２；Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：１３１，１９９６）、または裸のまたは粒子吸収性のｃＤＮＡ（Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５，１９９３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．、Ｈｕｎｔ，Ｌ．Ａ．、およびＷｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．、Ｖａｃｃｉｎｅ １１：９５７、１９９３；Ｓｈｉｖｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．編、４２３頁、１９９６；Ｃｅａｓｅ，Ｋ．Ｂ．およびＢｅｒｚｏｆｓｋｙ、Ｊ．Ａ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：９２３、１９９４およびＥｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６、１９９３）が挙げられ得る。Ａｖａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｅｄｈａｍ．Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の技術のようなレセプター媒介性標的化として公知のトキシン標的化送達技術もまた使用され得る。
【０１６４】
本発明のワクチン組成物は、核酸媒介様式を含む。本発明の１つ以上のペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡもまた、患者に投与され得る。このアプローチは、例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５（１９９０）、ならびに米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，８０４，５６６号；同第５，７３９，１１８号；同第５，７３６，５２４号；同第５，６７９，６４７号；ＷＯ ９８／０４７２０に記載され、そして以下でより詳細に記載される。ＤＮＡに基づく送達技術の例としては、「裸のＤＮＡ」、（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性の）促進化（ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）送達、カチオン性脂質複合体送達、および粒子媒介性（「遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）」）または圧力媒介性送達（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照のこと）が挙げられる。
【０１６５】
治療的または予防的免疫目的のため、本発明のペプチドは、ウイルス性ベクターまたは細菌性ベクターによって発現され得る。発現ベクターの例としては、ワクチンまたは鶏痘のような弱毒化ウイルス宿主が挙げられる。このアプローチは、例えば、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしてワクチンウイルスを使用することを包含する。急性または慢性的に感染された宿主あるいは非感染宿主へ導入されると、組換えワクチンウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、それにより宿主ＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を誘発する。免疫プロトコールにおいて有用なワクチンベクターおよび方法は、米国特許第４，７２２，８４８号に記載される。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６〜４６０（１９９１）に記載される。本発明のペプチドの治療的投与または免疫のために有用な広範な他のベクター（例えば、アデノおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉベクター、弱毒化炭疽毒素ベクターなど）は、本明細書中の記載から当業者に明らかである。
【０１６６】
さらに、本発明に従うワクチンは、１つ以上の本発明のペプチドの組成物を含む。ペプチドは、個々にワクチン中に存在し得る。あるいは、ペプチドは、同じペプチドの複数のコピーを含むホモポリマーとして、または様々なペプチドのヘテロポリマーとして存在し得る。ポリマーは、増加した免疫反応（ここで、異なるペプチドエピトープはポリマーを作製するために使用される）の利点である、免疫応答について標的化された病原体または腫瘍関連ペプチドの異なる抗原性決定因子と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導するさらなる能力を有する。この組成物は、天然に存在する範囲の抗原であり得るか、または例えば、組換え的にまたは化学合成によって調製され得る。
【０１６７】
本発明のワクチンと共に使用され得るキャリアは、当該分野で公知であり、そして例えば、サイクログロブリン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸（例えば、ポリＬ−リジン、ポリＬ−グルタミン酸）、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などが挙げられる。このワクチンは、生理学的耐性の（すなわち、受容可能な）希釈剤（例えば、水、または生理食塩水、好ましくは、リン酸緩衝生理食塩水）を含み得る。ワクチンはまた、典型的にアジュバントを含む。アジュバント（例えば、非完全フロイトアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはミョウバン）は、当該分野で周知の材料の例である。さらに、本明細書中に開示されるように、ＣＴＬ応答は、脂質（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインリセリル（ｇｌｙｃｅｒｙｌｃｙｓｔｅｉｎｌｙｓｅｒｙｌ）−セリン（Ｐ3ＣＳＳ）に本発明のペプチドを結合することによってプライム化され得る。
【０１６８】
注射、エアロゾル、経口、経皮、筋内、胸内、くも膜下腔内、または他の適切な経路を介して本発明に従うペプチド組成物で免疫すると、宿主の免疫系は、所望の抗原に対して特異的な多量のＣＴＬおよび／またはＨＴＬを産生することによって、ワクチンに応答する。従って、この宿主は、少なくとも部分的に後の感染に対して免疫があるか、または少なくとも部分的に進行中の慢性的な感染の発症に対して耐性であるか、または抗原が腫瘍関連である場合、少なくともいくつかの治療的利点を誘導する。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、クラスＩペプチド成分と、目的の標的抗原に対する中和抗体および／またはヘルパーＴ細胞の応答を誘導または促進する成分とを組み合わせることが所望され得る。このような組成物の好ましい実施形態は、本発明に従うクラスＩおよびクラスＩＩｐエピトープを含む。このような組成物の代替の実施形態は、本発明に従うクラスＩおよびクラスＩＩエピトープを、汎（Ｐａｎ）ＤＲ分子（例えば、ＰＡＤＲＥTM）と共に含む（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；例えば、米国特許第５，７３６，１４２号に記載される）。
【０１７０】
本発明のワクチンはまた、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞（ＤＣ））を本発明のペプチドを提示するためのベシクルとして含み得る。ワクチン組成物は、樹状細胞の可動化および収集に続いてインビトロで作製され得、それにより、樹状細胞の負荷はインビトロで起こる。例えば、樹状細胞は、本発明に従うミニ遺伝子でトランスフェクトされるか、またはペプチドでパルス化される。次いで、樹状細胞は、インビボでの免疫応答を誘発するために患者に投与され得る。
【０１７１】
ワクチン組成物（ＤＮＡに基づくかまたはペプチドに基づくかのいずれか）はまた、樹状細胞可動化と組み合わせてインビボで投与され得、これにより樹状細胞の負荷はインビボで起こる。
【０１７２】
抗原性ペプチドは、同様に、エキソビボにおけるＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を誘導するために使用される。得られるＣＴＬまたはＨＴＬ細胞は、他の従来の形態の治療に応答しないか、または本発明に従う治療的ワクチンペプチドまたは核酸に応答しない患者における慢性感染または腫瘍を処置するために使用され得る。特定の抗原（感染または腫瘍関連の抗原）に対するエキソビボにおけるＣＴＬまたはＨＴＬ応答は、組織培養において、患者の、すなわち遺伝的に適合性のＣＴＬまたはＨＴＬ前駆細胞をＡＰＣの供給源（例えば、ＣＤ）および適切な免疫原性ペプチドと共にインキュベートすることによって誘導される。適切なインキュベート時間（典型的には、約７〜２８日）の後、この前駆細胞は活性化され、そしてエフェクター細胞に拡大され、これらの細胞は患者に注入し戻され、ここでこれらの細胞は特定の標的細胞（感染細胞または腫瘍細胞）を破壊するかまたはその破壊を促進する。トランスフェクトされた樹状細胞はまた、抗原提示細胞として使用され得る。
【０１７３】
本発明のワクチン組成物はまた、ＨＩＶ感染のために使用される他の処置薬と共に使用され得、プロテアーゼインヒビターおよびＬＩ−２のような他の免疫アジュバントを含む治療レジメンと組み合わせた使用を含む。
【０１７４】
好ましくは、以下の原理はワクチンにおいて使用するためのポリエピトープ組成物に含有するためのエピトープのアレイを選択する場合、またはワクチンに含有されるべき別個のエピトープおよび／またはミニ遺伝子のような核酸によってコードされるべきエピトープを選択するために、使用される。ＨＩＶ感染を処置または予防するためのワクチンにおいて使用され得る代表的な例示的なエピトープは、表ＸＸＸＶＩＩおよびＸＸＸＶＩＩＩに記載される。以下の原理の各々が、選択を行うためにバランスを保たれることが好ましい。所定のワクチン組成物に組み込まれる複数のエピトープは、エピトープが駆動されるネイティブの抗原における配列で連続し得るが、これは必ずしもその必要はない。
【０１７５】
１）投与されると、ＨＩＶクリアランスに相関することが観察された免疫応答を模倣するエピトープが選択される。ＨＬＡクラスＩについて、これはＨＩＶの少なくとも１つの抗原に由来する３〜４個のエピトープを含む。ＨＬＡクラスＩＩに付いて、類似の原理が用いられる；また３〜４個のエピトープは、少なくとも１つのＨＩＶ抗原から選択される（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１４４７〜１４５０を参照のこと）。
【０１７６】
２）免疫原性と相関することが確立された必須結合親和性を有するエピトープ眼選択される：ＨＬＡクラスＩは、５００ｎＭ以下のＩＣ50を有し、クラスＩＩについて、１０００ｎＭ以下のＩＣ50を有する。
【０１７７】
３）十分なスーパーモチーフ保有ペプチドまたは対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイは、広い集団適用範囲を与えるように選択される。例えば、少なくとも８０％の集団適用範囲を有することが好ましい。Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ分析（当該分野で公知の統計的評価）を使用して、集団適用範囲の広さまたは重複性を評価し得る。
【０１７８】
４）癌関連性抗原からエピトープを選択する場合、患者はネイティブのエピトープに対して発達した耐性を有し得るため、アナログを選択することがしばしば有用である。感染疾患関連性抗原についてエピトープを選択する場合、ネイティブのエピトープまたはアナログのエピトープのいずれかを選択することが好ましい。
【０１７９】
５）「入れ子状（ｎｅｓｔｅｄ）エピトープ」と称されるエピトープは特定の関連性を有する。少なくとも２つのエピトープが所定のペプチド配列において重複している入れ子状エピトープが生じる。入れ子状ペプチド配列は、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩエピトープの両方を含み得る。入れ子状エピトープを提供する場合、一般的な目的は、一配列あたりの最多数のエピトープを提供することである。従って、１つの局面は、ペプチド中のアミノ末端エピトープのアミノ末端およびカルボキシル末端エピトープのカルボキシル末端より長いペプチドを提供しないようにすることである。多重エピトープ性配列（例えば、入れ子状エピトープを含む配列）を提供する場合、一般に、これが病理学的または他の有害な生物学的特性を有さないことを保証するために、この配列をスクリーニングすることが重要である。
【０１８０】
６）ポリエピトープタンパク質が作製される場合、またはミニ遺伝子を作製する場合、目的のエピトープを含む最小のペプチドを生成することが目的である。入れ子状エピトープを含むペプチドを選択する場合に用いられるものと同じではない場合、この原理は類似している。しかし、人工ポリエピトープペプチドを用いて、サイズ最小化の目的は、ポリエピトープタンパク質中のエピトープ間の任意のスペーサー配列を組み込む必要性に対してバランスを保たれる。スペーサーアミノ酸残基は、例えば、接合部エピトープ（免疫系により認識されるエピトープであって、標的抗原には存在せず、そしてエピトープの人工並列によってのみ作製される）を回避するため、またはエピトープ間の切断を促進し、それによりエピトープ提示を増大するために導入され得る。接合部エピトープは一般的に回避される。なぜなら、レシピエントは、非ネイティブのエピトープに対する免疫応答を生成し得ないからである。「優性エピトープ」である接合部エピトープは特に関心をもたれる。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減少または抑制されるこのような強力な応答を導き得る。
【０１８１】
７）同一の標的タンパク質の複数の改変体の配列が利用可能である場合、強力なペプチドエピトープはまたそれらの保存性に基づいて選択され得る。例えば、保存性についての基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの配列全体またはクラスＩＩ結合ペプチドの９マーコア全体が、特定のタンパク質抗原について評価された配列の指定された割合で保存されることを定義する。
【０１８２】
（ＩＶ．Ｋ．１．ミニ遺伝子ワクチン）
複数のエピトープを同時に送達し得る多数の異なるアプローチが利用可能である。本発明のペプチドをコードする核酸は、本発明の特に有用な実施形態である。ミニ遺伝子に含まれるエピトープは、好ましくは、前の章に記載されるガイドラインに従って選択される。本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段は、本発明の１つまたは複数のエピトープを含むペプチドをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。
【０１８３】
多重エピトープ性ミニ遺伝子の使用は、以下に記載される（例えば、同時継続中の出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ． ０９／３１１，７８４；Ｉｓｈｉｏｋａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２：３９１５−３９２５，１９９９；Ａｎ，Ｌ．およびＷｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１：２２９２，１９９７；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７：８２２，；Ｗｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．ら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６７：３４８，１９９３；Ｈａｎｋｅ，Ｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ １６：４２６，１９９８）。例えば、９個の優性ＨＬＡ−Ａ*０２０１−をコードする多重エピトープ性ＤＮＡプラスミド、ならびにポリメラーゼ、エンベロープ、ならびにＨＢＶおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の中心タンパク質、ＰＡＤＲＥTM汎用ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）エピトープ、ならびに小胞体転座シグナル配列由来の全制限エピトープを遺伝子操作した。
【０１８４】
多重エピトープ性ミニ遺伝子の免疫原性をトランスジェニックマウスで試験して、この試験したエピトープに対するＣＴＬ誘導応答の大きさを評価し得る。さらに、インビボにおいてＤＮＡでコードされたエピトープの免疫応答を、ＤＮＡプラスミドで形質移入した標的細胞に対する特異的ＣＴＬ系統のインビトロ応答と相関させ得る。従って、これらの実施例は、このミニ遺伝子が以下の両方に有用であることを示し得る：１）ＣＴＬ応答を発生させること、および２）コードされたエピトープを発現する誘導ＣＴＬ認識細胞。
【０１８５】
例えば、ヒトの細胞中での発現のために、選択したエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を産生するために、このエピトープのアミノ酸配列は、逆転写され得る。ヒトコドン使用表を利用して、各アミノ酸配列に対するコドン選択を誘導し得る。これらのエピトープをコードするＤＮＡ配列は、直接隣接されてもよく、翻訳される場合、連続ポリペプチド配列を産生する。発現および／または免疫原性を最適にするために、さらなるエレメントがミニ遺伝子の設計に取り込まれ得る。逆転写され、そしてミニ遺伝子配列に含まれ得るアミノ酸配列の例としては、以下が挙げられる：ＨＬＡクラスＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、ユビキチン結合シグナル配列、および／または小胞体標的シグナル。さらに、ＣＴＬおよびＨＴＬエピトープのＨＬＡ提示は、合成（例えば、ポリ−アミン）または天然に存在する、ＣＴＬエピトープまたはＨＴＬエピトープに隣接する側方配列を含むことによって改良され得；エピトープ（単数または複数）を含むこれらのより大きなペプチドは、本発明の範囲内である。
【０１８６】
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子の＋鎖および−鎖をコードするオリゴヌクレオチドを構築することによってＤＮＡに変換され得る。重複性オリゴヌクレオチド（３０〜１００の塩基長）を、周知の技術を使用する適切な条件下で、合成、リン酸化、精製およびアニールし得る。オリゴヌクレオチドの末端を、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して結合し得る。次いで、この合成ミニ遺伝子（エピトープポリペプチドをコードする）を、所望の発現ベクターにクローニングし得る。
【０１８７】
当業者に周知の標準調節配列を、好ましくは、標的細胞での発現を確実にするためにベクター中に含まれる。いくつかのベクターエレメントが所望される；ミニ遺伝子の挿入のための下流クローニング部位を有するプロモーター；効果的な転写終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点；およびＥ．ｃｏｌｉ分泌標識（例えば、アンプリコンまたはカナマイシン耐性）。多数のプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター）が、この目的のために使用され得る。他の適切なプロモーター配列について、例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照のこと。
【０１８８】
さらなるベクターの改変は、ミニ遺伝子の発現および免疫原性を最適化するために所望される。いくつかの場合において、イントロンは、効果的な遺伝子発現のために必要とされ、そして１以上の合成イントロンまたは天然に存在するイントロンは、ミニ遺伝子の転写領域に取り込まれ得る。ミニ遺伝子の発現を増加させるために、ｍＲＮＡ安定化配列および哺乳動物細胞中での複製のための配列の封入が考慮され得る。
【０１８９】
一旦、発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子は、プロモーターの下流のポリリンカー領域にクローニングされる。このプラスミドを、適切なＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換され、そしてＤＮＡが標準的な技術を使用して調製される。ミニ遺伝子の起点およびＤＮＡ配列、ならびにベクター中に含まれる他の全エレメントは、制限マップおよびＤＮＡ配列分析を使用して確認される。正確なプラスミドを有する細菌細胞は、マスター細胞バンクおよび作業用細胞バンクとして保存され得る。
【０１９０】
さらに、免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）は、ＤＮＡワクチンの免疫原性の役割を果たすようである。これらの配列は、所望の場合、免疫原性を増強するために、ミニ遺伝子コード配列の外側のベクター中に含まれ得る。
【０１９１】
いくらかの実施形態において、ミニ遺伝子コードエピトープおよび第２タンパク質の両方の産生を可能にするｂｉ−シストロン発現ベクター（免疫原性を増強または減少させるために含まれる）を使用し得る。同時発現する場合、免疫応答を有利に増強し得るタンパク質またはポリペプチドの例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン−誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、同時刺激分子、またはＨＴＬ応答、汎ＤＲ結合タンパク質（ＰＡＤＲＥTM、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープを細胞内標的シグナルに結合し、そして発現したＣＴＬエピトープから別個に発現し得る。これにより、ＨＴＬエピトープをＣＴＬエピトープと異なる細胞画分に指向することを可能にする。必要である場合、これにより、ＨＴＬエピトープのＨＬＡクラスＩＩ経路へのより効果的な侵入を可能にし、これによりＨＴＬ誘導を改良する。ＨＴＬまたはＣＴＬ誘導に対して、免疫抑制分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現による免疫応答を特異的に減少させることは、特定の疾患において有用であり得る。
【０１９２】
治療量のプラスミドＤＮＡを、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの発酵、続く精製により産生され得る。作業用細胞バンクからのアリコートを、増殖培地を播種するために使用し、周知の技術に従って、振盪フラスコまたはバイオリアクター中で飽和まで増殖させる。プラスミドＤＮＡを、標準的なバイオ分離技術（例えば、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって供給される固相陰イオン交換樹脂）を使用して精製され得る。必要とされる場合、高次コイルＤＮＡを、ゲル電気泳動または他の方法を使用する、開環形態および線状形態から単離し得る。
【０１９３】
精製したプラスミドＤＮＡを、種々の処方物を使用する注入のために調製し得る。これらの最も単純なものは、滅菌リン酸−緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の凍結乾燥したＤＮＡの再構築物である。「裸のＤＮＡ」として公知のこのアプローチは、現在、臨床試験において筋内（ＩＭ）投与のために使用されている。ミニ遺伝子のＤＮＡワクチンの免疫治療効果を最大にするために、精製したプラスミドＤＮＡを処方するための代替方法が所望され得る。種々の方法が記載され、そして新規の技術が利用可能であり得る。カチオン性脂質、糖脂質、および融合誘導リポソームがまた処方物中で使用され得る（例えば、ＷＯ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｓｑｕｅｓ６（７）：６８２（１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号；ＷＯ９１／０６３０９号；およびＦｅｌｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３（１９８７）を参照のこと）。さらに、保護的、相互作用的、非融合化合物（ＰＩＮＣ）として集合的に言及されるペプチドおよび化合物はまた、精製されたプラスミドＤＮＡに複合体化され、安定性、筋内分散、または特定の器官もしくは細胞型の輸送に影響を与える。
【０１９４】
標的細胞の感作は、ミニ遺伝子コード化ＣＴＬエピトープの発現およびＨＬＡクラスＩ提示のための機能的アッセイとして使用され得る。例えば、プラスミドＤＮＡを、標準的なＣＴＬのクロム放出アッセイに対する標的として適切である、哺乳動物細胞株に導入される。使用される形質移入方法は、最終の処方物に依存する。エレクトロポレーションが「裸の」ＤＮＡのために使用され、一方、カチオン性脂質は、インビトロでの形質移入に指向することを可能にする。プラスミド発現緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を同時形質移入して、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を使用する形質移入細胞の濃縮を可能にし得る。次いで、これらの細胞は、エピトープ−特異的ＣＴＬ株のための標的細胞として標識および使用されるクロミウム−５１（51Ｃｒ）であり；51Ｃｒ放出によって検出された細胞溶解は、ミニ遺伝子コード化ＣＴＬエピトープの産物およびミニ遺伝子コード化ＣＴＬエピトープのＨＬＡ提示の両方を示す。ＨＴＬエピトープの発現は、ＨＴＬ活性を評価するためのアッセイを使用して、類似様式で評価され得る。
【０１９５】
インビボでの免疫原性は、ミニ遺伝子のＤＮＡ処方物の機能的試験についての第２のアプローチである。適切なヒトＨＬＡタンパク質を発現するトランスジェニックマウスは、ＤＮＡ産物で免疫される。投与の用量および経路は、処方物に依存する（例えば、ＰＢＳ中でのＤＮＡに対するＩＭ、脂質複合体化ＤＮＡに対する腹腔内（ＩＰ））。免疫の２１日後、球状赤血球を収集し、そして試験される各エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間、再刺激した。その後、ＣＴＬエフェクター細胞について、標準的な技術を使用してペプチド負荷した51Ｃｒ標識でした標的細胞の細胞溶解についてアッセイを行った。ミニ遺伝子コード化エピトープに対応する、ペプチドエピトープで負荷したＨＬＡによって感作された標的細胞の溶解は、ＣＴＬのインビボでの誘導についてＤＮＡワクチン機能を証明する。ＨＴＬエピトープの免疫原性を、アナログ様式でトランスジェニックマウスにおいて評価する。
【０１９６】
あるいは、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されるような弾道送達を使用して、核酸を投与し得る。この技術を使用して、単独でＤＮＡを含む粒子を投与する。さらなる代替の実施形態において、ＤＮＡは、粒子（例えば、金粒子）に接着され得る。
【０１９７】
（ＩＶ．Ｋ．２．ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組み合わせ）
本発明のペプチドを含むワクチン組成物、またはそのアナログ（これは、免疫刺激性活性を有する）を改変して、所望の属性（例えば、改良された血清の半減期）を提供するか、または免疫原性を増強し得る。
【０１９８】
例えば、ＣＴＬ活性を誘導するためのペプチドの能力を、Ｔヘルパー細胞応答を含み得る少なくとも１つのエピトープを含む配列にペプチドを連結することによって増強し得る。免疫原性を増強するために、ＣＴＬエピトープと組合せたＴヘルパーエピトープの使用は、例えば、同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／８２０，３６０号、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／１９７，４８４号、およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／４６４，２３４号に例示される。
【０１９９】
ＣＬＴペプチドをＴヘルパーペプチドに直接的に連結し得るが、しばしばＣＴＬエピトープ／ＨＴＬエピトープ結合体をスペーサー分子によって連結する。このスペーサーは、代表的に、比較的小さな中性分子（例えば、アミノ酸またはアミノ酸模倣物）からなり、これは生理学的条件下で実質的に荷電されていない。このスペーサーは、代表的に、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または非極性アミノ酸もしくは中性の極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意に、本スペーサーは、同一の残基を含む必要がなく、従ってヘテロ−オリゴマーまたはホモ−オリゴマーであり得ることが理解される。存在する場合、このスペーサーは、通常、少なくとも１個または２個の残基、より通常、３〜６個の残基、そして時々、１０以上の残基である。ＣＴＬペプチドエピトープは、ＣＴＬペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかのスペーサーを介して、または直接的かのいずれかで、Ｔヘルパーペプチドエピトープに連結され得る。免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端をアシル化し得る。
【０２００】
特定の実施形態において、このＴヘルパーペプチドは、複数の集団中に存在するＴヘルパー細胞によって認識されるペプチドである。これは、多くの、ほとんどの、または全てのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドを選択することによって達成され得る。これらは、「緩やかにＨＬＡで拘束された」または「乱雑」Ｔヘルパー配列として公知である。乱雑であるアミノ酸配列の例としては、位置８３０〜８４３（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ；配列番号５１４８４）の破傷風トキソイド、位置３７８〜３９８（ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ；配列番号５１４８５）のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ（ＣＳ）タンパク質および位置１１６（ＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡ；配列番号５１４８６）のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ１８ｋＤタンパク質のような抗原由来の配列を含む。他の例としては、ＤＲ１−４−７過剰モチーフ、またはＤＲ３モチーフのいずれかを有するペプチドが挙げられる。
【０２０１】
あるいは、緩やかにＨＬＡで拘束された様式で、天然に存在しないアミノ酸配列を使用して、Ｔヘルパーリンフォサイトを刺激し得る合成ペプチドを調製することが可能である（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７７０７を参照のこと）。汎ＤＲ−結合エピトープと呼ばれる合成化合物（例えば、ＰＡＤＲＥTM、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、最も好ましくは、ほとんどのＨＬＡ−ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子に結合するように設計される。例えば、以下の式を有する汎ＤＲ−結合エピトープペプチド：ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（ここで、「Ｘ」は、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、またはチロシンのいずれかであり、そしてａは、Ｄ−アラニンまたはＬ−アラニンのいずれかである）は、ほとんどＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に結合し、そしてＨＬＡ型に関係なく、ほとんどの固体由来のＴヘルパーリンホカインの応答を刺激することが見出された。汎ＤＲ結合エピトープの代替物は、全て「Ｌ」点検アミノ酸を含み、そしてこのエピトープをコードする核酸の形態で提供され得る。
【０２０２】
ＨＴＬペプチドエピトープはまた、それらの生物学的特性を変えるように改変され得る。例えば、このエピトープは、Ｄ−アミノ酸を有するように改変され得、プロテアーゼに対する耐性を上げ、従って血清の半減期を伸ばすか、またはこのエピトープは、脂質、タンパク質、炭水化物などのような他の分子に結合され、生物学的活性を上げ得る。例えば、Ｔヘルパーペプチドを、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかで１以上のパルミチン酸鎖に結合させ得る。
【０２０３】
（ＩＩＩ．Ｋ．３．ＣＴＬペプチドとＴ細胞初回刺激剤との組合せ）
いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物中に、細胞傷害Ｔリンフォサイトを初回刺激する少なくとも１成分を含むことが所望され得る。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを初回刺激し得る薬剤として同定された。例えば、パルミチン酸残基は、リシン残基のε−およびα−アミノ基に結合され得、次いで、例えば、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなどの１以上の連結残基を介して免疫原性ペプチドに連結される。次いで、この脂質化ペプチドを、ミセルまたは粒子のいずれかで直接投与し、リポソームに組み込まれるか、またはアジュバント（例えば、フロイント不完全アジュバント）に乳化され得る。好ましい実施形態において、特に有効な免疫原性組成物は、Ｌｙｓのε−アミノ基およびα−アミノ基に結合するプラスミン酸を含み、これは、例えばＳｅｒ−Ｓｅｒの連結を介して、免疫原性ペプチドのアミノ末端に結合される。
【０２０４】
ＣＴＬ応答を初回刺激する脂質の別の例として、Ｅ．ｃｏｌｉリポタンパク質（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ3ＣＳＳ））を使用して、適切なペプチドに共有結合する場合に、ウイルス特異的ＣＴＬを初回刺激し得る（例えば、Ｄｅｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：５６１，１９８９を参照のこと）。例えば、本発明のペプチドをＰ3ＣＳＳに連結して、そしてリポペプチドを、標的抗原に対するＣＴＬ応答を特異的に初回刺激するために、個体に投与され得る。さらに、抗体を中和する誘導は、Ｐ3ＣＳＳ結合体化エピトープで初回刺激され得るので、これらの２種の組成物は、体液性応答と細胞媒介応答との両方をより有効に惹起するように組み合わせられる。
【０２０５】
ＣＴＬおよび／またはＨＴＬペプチドをまた、ペプチドの末端にアミノ酸を付加することによって改変され得、キャリア支持体またはより大きなペプチドに連結するため、ペプチドまたはオリゴペプチドの物理学的特性または化学的特性を改変するためなどに、一方のペプチドを別のペプチドに連結する容易性を提供する。アミノ酸（チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸など）を、ペプチドまたはオリゴペプチド（特に、クラスＩペプチド）のＣ末端またはＣ末端に誘導し得る。しかし、ＣＴＬエピトープのカルボキシル末端の改変は、いくらかの場合、ペプチドの結合特性を変化させ得ることに注目すべきである。さらに、ペプチドまたはオリゴペプチド配列は、末端−ＮＨ2アシル化（例えば、アルカノイル（Ｃ１−Ｃ２０）またはチオグリコリルアセチル化、カルボキシル末端のアミド化（例えば、アンモニアまたはメチルアミンなど））によって改変することによって天然の配列とは異なり得る。いくつかの場合において、これらの改変体は、支持体または他の分子に連結するための部位を提供し得る。
【０２０６】
（ＩＶ．Ｋ．４ ＣＴＬおよび／またはＨＴＬペプチドでパルスされたＤＣを含むワクチン組成物）
本発明に従うワクチン組成物の実施形態は、エピトープ含有ペプチドのカクテルの、患者の血液からのＰＢＭＣまたはそこから単離されたＤＣへのエキソビボでの投与を含む。ＤＣの収集を促進するための薬学的組成物（例えば，ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎTM（Ｍｏｎｓａｎｔｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４）が使用される。ＤＣをペプチドでパルスした後、および患者への再灌流の前に、ＤＣを洗浄して、非結合ペプチドを除去する。この実施形態において、パルス化ペプチドエピトープに存在する、ペプチドパルス化ＤＣを含むワクチンを、それらの表面上でＨＬＡ分子と共に複合体化した。
【０２０７】
このＤＣを、ペプチドのカクテルと共にエキソビボでパルスし得、これらのいくらかは、目的の１以上のＨＩＶ抗原に対するＣＴＬ応答を刺激する。必要に応じて、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）ペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥファミリー分子）を誘導して、ＣＴＬ応答を促進し得る。従って、本発明の従うワクチン（好ましくは、複数のＨＩＶ抗原由来のエピトープを含む）を使用して、ＨＩＶ感染を処置する。
【０２０８】
（ＩＶ．Ｌ．治療目的または予防目的のためのワクチンの投与）
本発明のペプチドならびに本発明の薬学的組成物およびワクチン組成物は、哺乳動物（特に、ヒト）への投与のために有用であり、ＨＩＶ感染を処置および／または予防する。本発明のペプチドを含むワクチン組成物は、ＨＩＶに感染した患者あるいはＨＩＶに感染しやすい、または危険性がある患者に投与され、ＨＩＶ抗原に対する免疫応答を惹起し、従って患者自身の免疫応答能力を向上させる。
【０２０９】
本明細書中に記載されるように、本発明のＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープを含むペプチドは、ＨＬＡ分子によって提示される場合、およびペプチドによって含まれるエピトープに特異的なＣＴＬまたはＨＴＬと接触される場合に、免疫応答を誘導する。このペプチド（またはこのペプチドをコードするＤＮＡ）は、個々に、または１以上のペプチド配列の融合として投与され得る。このペプチドをＣＨＬまたはＨＴＬと接触させる様式は、本発明にとって重要ではない。例えば、このペプチドは、インビボまたはインビトロのいずれかでＣＴＬまたはＨＴＬと接触され得る。インビボでこの接触が生じる場合、このペプチド自体は、患者に投与され得るか、または他のベシクル（例えば、１以上のペプチドをコードするＤＮＡベクター、このペプチドをコードするウイルスベクター、リポソームなど）が、本明細書中に記載されるように使用され得る。
【０２１０】
ペプチドがインビトロで接触される場合、ワクチン接種剤は、集団の細胞（例えば、ペプチドパルス樹状細胞、またはＨＩＶ特異的ＣＴＬ）を含み得、これは、抗原提示細胞をインビトロでペプチドに適用することによってか、または抗原提示細胞を本発明のミニ遺伝子でトランスフェクトすることによって導入されている。続いて、このような細胞集団は、治療的有効用量で患者に投与される。
【０２１１】
治療的適用において、ペプチドおよび／または核酸組成物は、ウイルス抗原に対する有効なＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を引き出し、そして症状および／または合併症を治癒するかあるいは少なく部分的に阻止するかまたは遅くするのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療的有効用量」として規定される。この使用に有効な量は、例えば、投与される特定の組成物、投与の方法、処置される疾患の段階および重症度、患者の体重および健康の一般的状態、ならびに処方する医師の判断に依存する。
【０２１２】
本発明のワクチン組成物はまた、予防薬として純粋に使用され得る。一般的に、最初の予防的免疫についての投薬量は、下限の値が約１、５、５０、５００、または１０００μｇであり、そして上限の値が約１０，０００；２０，０００；３０，０００；または５０，０００μｇである単位投薬範囲で一般に存在する。ヒトについての投薬量の値は、典型的に、７０キログラムの患者あたり約５００μｇ〜約５０，０００μｇの範囲である。これに続いて、ワクチンの最初の投与の約４週間〜６ヶ月後に、規定された間隔で投与される約１．０μｇと約５０，０００μｇの間のペプチドの投薬量をブーストする。ワクチンの免疫原性は、患者の血液のサンプルから得られたＣＴＬおよびＨＴＬの特異的活性を測定することによって評価され得る。
【０２１３】
感受性の個体が感染の前に同定される場合、組成物は、彼らに対して標的化され得、従って、より大きな集団への投与の必要を最小化する。
【０２１４】
薬学的組成物について、本発明の免疫原性ペプチド、またはそれらをコードするＤＮＡは、一般的にＨＩＶですでに感染された個体に投与される。ペプチドまたはそれらをコードするＤＮＡは、個々にまたは１つ以上のペプチドの配列の融合物として投与され得る。ＨＩＶ感染患者は、免疫原性ペプチドを用いて別々にまたは適切なように他の処置と組み合わせて処置され得る。治療的使用のために、投与は、一般的に、ＨＩＶ感染の最初の診断において始まる。これに続いて、少なくとも症状が実質的に弱めるまでそしてその後のある期間の間、用量をブーストする。患者に送達されるワクチン組成物の実施形態（すなわち、ペプチドカクテル、ポリエピトープポリペプチド、ミニ遺伝子、あるいはＨＩＶ抗原特異的ＣＴＬまたはパルス樹状細胞のような実施形態を含むが、これらに限定されない）は、疾患の段階または患者の健康状態に従って変化し得る。例えば、いくつかの患者において、ＨＩＶ特異的ＣＴＬを含むワクチンは、ＨＩＶ感染細胞を殺傷する際に、代替の実施形態よりも効果的であり得る。
【０２１５】
ＨＩＶ感染の処置または予防に使用されるペプチドまたは他の組成物は、例えば、疾患の症状を表していないが、疾患ベクターとして働くヒトにおいて使用され得る。この文脈において、細胞傷害性Ｔ細胞応答を効果的に刺激するのに十分な投与の様式によって送達される量のペプチドエピトープを提供することが一般的に重要である；ヘルパーＴ細胞応答を刺激する組成物はまた、本発明のこの実施形態に従って与えられ得る。
【０２１６】
最初の治療的免疫のための投薬量は、一般的に、下限の値が約１、５、５０、５００、または１０００μｇであり、そして上限の値が約１０，０００；２０，０００；３０，０００；または５０，０００μｇである単位投薬範囲で存在する。ヒトについての投薬量の値は、典型的に、７０キログラムの患者あたり約５００μｇ〜約５０，０００μｇの範囲である。数週間〜数ヶ月（例えば、４週間〜６ヶ月）にわたってブースティングレジメンに従って約１．０μｇ〜約５０，０００μｇのペプチドのブースティング投薬は、多分、個体を効果的に免疫するための長期の時間の間、必要とされ得る。ブースティング用量は、患者の血液から得られるＣＴＬおよびＨＴＬの特異的活性を測定することによって決定される患者の応答および状態に依存して投与され得る。
【０２１７】
本発明のペプチドおよび組成物は、重症な疾患、すなわち、生命を危うくする状況または潜在的に生命を危うくする状況で使用され得る。このような場合において、最小量の外来の物質および本発明の好ましい組成物におけるペプチドの比較的非毒性の性質の結果として、これらの記述された投薬量に対して実質的に過剰のこれらのペプチド組成物を投与することが、可能であり、そして処置する患者によって望ましいと感じられ得る。
【０２１８】
少なくとも臨床的症状または実験的試験が、ウイルス感染が除去されたかまたは実質的に弱まったことを示すまでそしてその後のある期間の間、投薬が続けられるべきである。投薬、投与の経路、および投薬スケジュールは、当該分野で公知の方法論に従って調節される。
【０２１９】
治療的処置のための薬学的組成物は、非経口的投与、局所的投与、経口投与、くも膜下投与、または局所投与に意図される。好ましくは、薬学的組成物は、非経口的に、例えば、静脈内に、皮下に、皮内に、または筋内に投与される。従って、本発明は、受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）に溶解されるかまたは懸濁される免疫原性ペプチドの溶液を含む非経口投与のための組成物を提供する。種々の水性キャリアは、例えば、水、緩衝化水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などが使用され得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌化技術によって滅菌化され得るか、または滅菌濾過され得る。得られる水溶液は、そのままでの使用のためにパッケージングされ得るか、または凍結乾燥され得、この凍結乾燥された調製物は、投与の前に滅菌溶液と組み合わせられる。この組成物は、およそ生理学的条件に必要とされる薬学的に受容可能な補助物質、例えば、ｐＨ調節剤、緩衝化剤、張性調節剤、湿潤剤、保存剤など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンなど）を含み得る。
【０２２０】
薬学的処方物中の本発明のペプチドの濃度は、幅広く、すなわち、約０．１重量％未満、通常、約２重量％または少なくとも約２重量％から、２０重量％〜５０重量％以上の多さまでで変化し得、主に、選択される投与の特定の様式に従って、流体容積、粘度などによって選択される。
【０２２１】
ペプチド組成物のヒト単位用量形態は、代表的に、ヒト単位用量の受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）を含む薬学的組成物中に含まれ、そしてこのような組成物のヒトへの投与に使用されるための当業者によって公知の流体の容積で投与される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７th Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｅｄｉｔｏｒ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１９８５）。
【０２２２】
本発明のペプチドはまた、リポソームを介して投与され得、リポソームは、ペプチドを特定の組織（例えば、リンパ組織）に標的化させるために、または感染した細胞に選択的に標的化させるために、そしてペプチド組成物の半減期を増加させるために役立つ。リポソームには、エマルジョン、泡状物、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、層状層などが挙げられる。この調製物において、送達されるべきペプチドは、リポソームの一部として、単独であるいはリンパ系細胞に広く行き渡るレセプターに結合する分子（例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体）とともに、または他の治療組成物もしくは免疫原性組成物とともに組み込まれる。従って、本発明の所望のペプチドで負荷されるかまたは装飾（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）されるかのいずれかのリポソームが、リンパ球の部位に指向され、ここで、そのときリポソームがペプチド組成物を送達する。本発明に従う使用のためのリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、これには、一般的に、中性および陰性に荷電されたリン脂質およびステロール（例えば、コレステロール）が挙げられる。脂質の選択は、一般的に、例えば、リポソームサイズ、酸不安定性および血流中のリポソームの安定性を考慮してガイドされる。種々の方法が、リポソームを調製するために利用可能であり、例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）および米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載される。
【０２２３】
免疫系の細胞を標的化するために、リポソームに組み込まれるリガンドには、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはそのフラグメントが挙げられ得る。ペプチドを含むリポソーム懸濁物は、静脈内、局所的（ｌｏｃａｌｌｙ、ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）などで、特に投与の方法、送達されるペプチド、および処置される疾患の段階に従って変化する用量で投与され得る。
【０２２４】
固体組成物について、従来の非毒性固体キャリアが使用され得、これには、例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。経口投与のために、薬学的に受容可能な非毒性組成物は、任意の通常使用される賦形剤（例えば、先に列挙されたもの）および一般的に１０〜９５％の活性成分（すなわち、本発明の１つ以上のペプチド）、より好ましくは、２５％〜７５％の濃度で組み込むことによって形成される。
【０２２５】
エアロゾル投与のために、免疫原性ペプチドは、好ましくは、界面活性剤および噴霧剤とともに細かく分割された形態で供給される。ペプチドの代表的な割合は、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは、１重量％〜１０重量％である。界面活性剤は、もちろん非毒性でなければならず、そして好ましくは噴霧剤に可溶である。このような薬剤の代表は、６〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸のエステルまたは部分エステル、例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）およびオレイン酸と、脂肪族多水酸基アルコールまたはその環式無水物である。混合エステル（例えば、混合または中性グリセリド）が使用され得る。界面活性剤は、組成物の０．１重量％〜２０重量％、好ましくは、０．２５〜５重量％を構成し得る。組成物の残りは、通常、噴霧剤である。キャリアはまた、望ましいならば、例えば、鼻腔内送達のためのレシチンとともに含まれ得る。
【０２２６】
（ＩＶ．Ｍ．キット）
本発明のペプチドおよび核酸組成物は、ワクチン投与のための指示書とともにキットの形態で提供され得る。代表的なキットは、容器内に、好ましくは、単位用量形態の所望のペプチド組成物および投与のための指示書を含む。代替的なキットは、投与のための指示書とともに、容器内に、好ましくは単位用量形態で、本発明の所望の核酸を伴なうミニ遺伝子構築物を含む。ＩＬ−２またはＩＬ−１２のようなリンホカインもまた、キットに含まれ得る。所望であり得る他のキット構成要素には、例えば、滅菌シリンジ、ブースター投薬、および他の所望の賦形剤が挙げられる。
【０２２７】
（要旨）
本発明に従うエピトープは、免疫応答を誘導するために首尾良く使用された。これらのエピトープを用いる免疫応答は、種々の形態においてエピトープを投与することによって導入された。エピトープは、ペプチドとして、核酸として、そして本発明のエピトープをコードする核酸を含むウイルスベクターとして投与された。ペプチドに基づくエピトープ形態の投与において、免疫応答は、エピトープを細胞で発現される空のＨＬＡ分子上に直接負荷することによって、そしてエピトープのインターナリゼーションを介して、そしてＨＬＡ Ｉ型経路を介してプロセスすることによって導入された；いずれの場合においても、エピトープを発現するＨＬＡ分子は、次いで、相互作用し得、そしてＣＴＬ応答を誘導し得た。ペプチドは、直接的に、またはリポソームのような薬剤を使用して送達され得る。これらは、さらに、弾道的送達（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（ここで、ペプチドは、代表的には、結晶形態である）を使用して送達され得る。ＤＮＡが免疫応答を誘導するために使用される場合、裸のＤＮＡとして（一般的に、約１〜５ｍｇの投薬範囲）または銃式「遺伝子銃」送達を介して（代表的に、約１０〜１００μｇの投薬範囲）のいずれかで投与される。ＤＮＡは、種々のコンホメーション（例えば、線状、環状など）で送達され得る。種々のウイルスベクターもまた、本発明に従ってエピトープをコードする核酸を含んで首尾良く使用されている。
【０２２８】
従って、本発明に従う組成物は、いくつかの形態で存在する。本発明に従うこれらの組成物形態のそれぞれの実施形態は、免疫応答を誘導するために首尾良く使用されている。
【０２２９】
本発明に従う１つの組成物は、複数のペプチドを含む。この複数またはカクテルのペプチドは、一般的に、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤と混合される。ペプチドカクテルは、同じペプチドの複数のコピーを含み得るか、またはペプチドの混合物を含み得る。ペプチドは、天然のエピトープのアナログであり得る。ペプチドは、人工のアミノ酸および／または化学的改変（例えば、脂質化；アセチル化、グリコシル化、ビオチニル化、リン酸化のような表面活性分子の添加）を含み得る。ペプチドは、ＣＴＬまたはＨＴＬエピトープであり得る。好ましい実施形態において、ペプチドカクテルは、複数の異なるＣＴＬエピトープおよび少なくとも１つのＨＴＬエピトープを含む。ＨＴＬエピトープは、天然または非天然（例えば、ＰＡＤＲＥ（登録商標）、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）であり得る。本発明の実施形態における異なるエピトープの数は、一般的に、１〜１５０の整数（ｗｈｏｌｅ ｕｎｉｔ ｉｎｔｅｇｅｒ）である（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、または１５０）。
【０２３０】
本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、ポリペプチド多重エピトープ性構築物（すなわち、ポリエピトープペプチド）を含む。本発明に従うポリエピトープペプチドは、当該分野において周知の技術の使用によって調製される。これらの公知の技術の使用によって、本発明に従うエピトープは、互いに接続される。ポリエピトープペプチドは、線状または非線状（例えば、多価）であり得る。これらのポリエピトープ構築物は、人工アミノ酸、スペーシングまたはスペーサーアミノ酸、隣接アミノ酸、または隣接エピトープ間の化学改変を含み得る。ポリエピトープ構築物は、ヘテロポリマーまたはホモポリマーであり得る。ポリエピトープ構築物は、一般的に、２〜１５０の間の任意の整数の量（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、または１５０）でエピトープを含む。ポリエピトープ構築物は、ＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープを含み得る。構築物中の１つ以上のエピトープは、例えば、表面活性物質（例えば、脂質）の付加によって改変され得るか、または化学的に改変され得る（例えば、アセチル化など）。さらに、多重エピトープ性構築物における結合は、ペプチド結合以外（例えば、共有結合、エステルまたはエーテル結合、ジスルフィド結合、水素結合、イオン結合など）であり得る。
【０２３１】
あるいは、本発明に従う組成物は、ネイティブな配列に対する相同性を有する（すなわち、対応するかまたは接触する）アミノ酸の系列、配列、ストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を含む構築物を含む。このアミノ酸のストレッチは、より長い系列のアミノ酸から切断されるかまたは単離される場合、本発明に従って、ＨＬＡ Ｉ型エピトープまたはＨＬＡ ＩＩ型エピトープとして機能するアミノ酸の少なくとも１つのサブ配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。この実施形態において、ペプチド配列は、当該分野で公知であるかまたは提供される多数の技術を使用することによって、本明細書中に規定されるような構築物になるように改変される。ポリエピトープ構築物は、７０〜１００％（例えば、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）の任意の整数の増分でネイティブな配列に対して相同性を含み得る。
【０２３２】
本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、本発明に従う１つ以上のエピトープを含む抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、「専門的」抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）であり得る。抗原提示細胞は、当該分野において公知の任意の手段または当該分野において決定された任意の手段によって本発明のエピトープを含み得る。このような手段には、樹状細胞を１つ以上の個々のエピトープまたは複数のエピトープを含む１つ以上のペプチドで、銃式核酸送達のような核酸投与によって、または核酸の投与について当該分野の他の技術（ベクターに基づく（例えば、ウイルスベクター）核酸の送達を含む）によって適用することを含む。
【０２３３】
本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、本発明の１つ以上のペプチドをコードする核酸、または本発明に従うポリエピトープペプチドをコードする核酸を含む。当業者によって理解されるように、種々の核酸組成物が、遺伝子コードの重複性に起因して同じペプチドをコードする。これらの核酸組成物のそれぞれは、本発明の範囲内に含まれる。本発明のこの実施形態は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み、特定の実施形態において、ＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせを含む。本発明に従うペプチドをコードする核酸を含む任意の組成物または本発明に従う任意の他のペプチドに基づく組成物が、本発明の範囲内であることが理解される。
【０２３４】
本発明のペプチドに基づく形態（ならびに、これらをコードする核酸）が、当該分野で既に公知であるかまたは公知になる原理を使用して作製される、本発明のエピトープのアナログを含み得ることが理解される。アナログ化に関する原理は、現在、当該分野において公知であり、本明細書中に開示される；さらに、アナログ化原理（ヘテロクリティックアナログ化）が、１９９９年１月６日に出願された同時係属出願シリアル番号Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第０９／２２６，７７５号に開示される。一般的に、本発明の組成物は、単離されているかまたは精製されている。
【０２３５】
本発明を、特定の実施例によってより詳細に記載する。以下の実施例は、例示の目的のために提供され、そして任意の様式においても本発明を制限することを意図しない。当業者は、本発明に従って代替の実施形態を得るために変化または改変され得る重要でない種々のパラメータを容易に認識する。
【０２３６】
（Ｖ．実施例）
以下の実施例は、ワクチン組成物に含ませるための免疫原性クラスＩおよびクラスＩＩペプチドエピトープの同定、選択、および使用を例示する。
【０２３７】
（実施例１．ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ結合アッセイ）
ＨＬＡに結合するペプチドの以下の例は、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩペプチドの結合親和性の定量化を示す。結合アッセイは、モチーフを保有するかまたはモチーフを保有しないペプチドを用いて実施され得る。
【０２３８】
細胞溶解物を調製し、そしてＨＬＡ分子を開示されたプロトコールに従って精製した（Ｓｉｄｎｅｙら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８．３．１（１９９８）；Ｓｉｄｎｅｙ，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２４７（１９９５）；Ｓｅｔｔｅ，ら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３（１９９４））。ＨＬＡ分子の供給源として使用される細胞株（表ＸＸＩＶ）および細胞溶解物からのＨＬＡ分子の抽出のために使用される抗体もまた、これらの刊行物に記載される。
【０２３９】
Ｅｐｓｔｅｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）−形質転換されたホモ接合性細部株、線維芽細胞、ＣＩＲまたは７２１．２２１−形質転換体を、ＨＬＡクラスＩ分子の供給源として使用した。これらの細胞を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、５０μＭ ２−ＭＥ、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１０％熱非働化ＦＣＳ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。
【０２４０】
細胞溶解物を、以下のように調製した。簡潔には、細胞を、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（Ｆｌｕｋａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、１５０ｍＭ ＮａＣＩ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および２ｍＭ ＰＭＳＦを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ ８．５中に、１０8細胞／ｍｌの濃度で溶解した。溶解物は、壊死組織片および核を、１５，０００×ｇで３０分間の遠心分離によって取り除かれた。
【０２４１】
ＨＬＡ分子をアフィニティクロマトグラフィーによって溶解物から精製した。溶解物を不活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４−ＢおよびプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの２つのプレカラムに通過させた。次いで、溶解物を、適切な抗体に結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４−Ｂビーズのカラムに通過させた。抗ＨＬＡカラムを、１％ＮＰ−４０、ＰＢＳ、２−カラム容量のＰＢＳ、および２カラム容量のＰＢＳ（０．４％ｎ−オクチルグルコシドを含む）中の１０カラム容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ ８．０で洗浄した。最後に、ＭＨＣ分子を、０．４％ｎ−オクチルグルコシドを含む０．１５ｍＭ ＮａＣｌ中の５０ｍＭジエチルアミン、ｐＨ １１．５で溶出した。１／２５容量の２．０Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ６．８を溶出液に添加し、ｐＨを約８．０に減少させた。次いで、溶出液をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ３０濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）における２０００ｒｐｍでの遠心分離によって濃縮した。タンパク質含量を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって評価し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
【０２４２】
クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣへのペプチドの結合を測定するために使用されるプロトコールの詳細な記述が公開されている（Ｓｅｔｔｅら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３，１９９４；Ｓｉｄｎｅｙら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１８．３節，１９９８）。簡潔には、精製されたＭＨＣ分子（５〜５００ｎＭ）は、プロテアーゼインヒビターカクテルの存在下で、種々の非標識ペプチドインヒビターおよび１〜１０ｎＭ 125Ｉ放射標識プローブペプチドと共に、０．０５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ４０）（またはＨ−２ ＩＡアッセイのための２０％ ｗ／ｖジギトニン）を含むＰＢＳにおいて４８時間インキュベートした。プロテアーゼインヒビター（各々は、ＣａｌＢｉｏＣｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡから得た）の最終濃度は、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１．３ｎＭ １．１０フェナントロリン、７３μＭペプスタチンＡ、８ｍＭ ＥＤＴＡ、６ｍＭＮ−エチルマレイミド（クラスＩＩアッセイについて）、そして２００μＭ Ｎα−ｐ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）であった。全てのアッセイを、ＤＲＢ１*０３０１（これは、ｐＨ ４．５で実施した）ならびにＤＲＢ１*１６０１（ＤＲ２ｗ２１β1）およびＤＲＢ４*０１０１（ＤＲｗ５３）（これらは、ｐＨ ５．０で実施した）を除いてｐＨ ７．０で実施した。ｐＨを、他に記載されるように調節した（Ｓｉｄｎｅｙら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１８．３節，１９９８を参照のこと）。
【０２４３】
インキュベーションに続いて、ＭＨＣ−ペプチド複合体を、遊離ペプチドから、７．８ｍｍ×１５ｃｍ ＴＳＫ２００カラム（ＴｏｓｏＨａａｓ １６２１５，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）上でのゲル濾過によって分離し、そして０．５％ ＮＰ４０および０．１％ ＮａＮ3を含むＰＢＳ ｐＨ ６．５を用いて、１．２ｍｌ／分で溶出した。ＤＲＢ１*１５０１（Ｄｒ２ｗ２β1）アッセイに使用される大きなサイズの放射標識されたペプチドが未結合ピークからの結合ピークの分離を、これらの条件下でより困難にしているので、全てのＤＲＢ１*１５０１（ＤＲ２ｗ２β1）アッセイを、０．６ｍｌ／分で溶出する７．８ｍｍ×３０ｃｍ ＴＳＫ２０００カラムを使用して実施した。ＴＳＫカラムからの溶出液を、Ｂｅｃｋｍａｎ １７０放射性同位体検出器を通過させ、そして放射能を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ３３９６Ａ積分器を使用して、プロットおよび積分し、そして結合したペプチドの画分を決定した。
【０２４４】
放射標識ペプチドを、クロラミン−Ｔ方法を使用しヨウ素化した。各アッセイにおいて使用される代表的な放射標識プローブペプチド、およびそのアッセイ特異的なＩＣ50 ｎＭを、表ＩＶおよびＶに要約する。代表的に、予備実験において、各ＭＨＣ調製物を、全放射能の１０〜２０％を結合するに必要とされるＨＬＡの濃度を決定するために、固定量の放射標識ペプチドの存在下で滴定した。全ての引く続く阻害および直接結合アッセイを、これらのＨＬＡ濃度を用いて実施した。
【０２４５】
［標識］＜［ＨＬＡ］およびＩＣ50≧［ＨＬＡ］のこれらの条件下で、測定されたＩＣ50値は、真のＫD値の適切な近似である。ペプチドインヒビターは、代表的に、１２０μｇ／ｍｌ〜１．２ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で試験され、そして２〜４の完全に独立した実験において試験される。異なる実験から得られてたデータの比較を可能にするために、相対的な結合の数値が、各々の試験されたペプチド（代表的に、放射標識されたプローブペプチドの標識されていなバージョン）についてのＩＣ50で、阻害についての陽性コントロールのＩＣ50を割ることによって、各ペプチドについて計算した。実験間比較のために、相対的な結合値を編集する。これらの値は、続いて、目的の相対的な結合によって、阻害についての陽性コントロールのＩＣ50 ｎＭを割ることによってＩＣ50ｎＭ値に変換し得る。このデータの編集方法は、異なる日、または精製されたＭＨＣの異なるロットで試験されたペプチドを比較するために、最も正確でかつ一貫していることが証明された。
【０２４６】
ＨＬＡ−ＤＲ精製（ＬＢ３．１）のために使用される抗体は、α−鎖特異的であるために、β1分子は、β3（および／またはβ4およびβ5）分子から分離されない。結合アッセイのβ1特異性は、ＤＲＢ１*０１０１（ＤＲ１）、ＤＲＢ１*０８０２（ＤＲ８ｗ２）およびＤＲＢ１*０８０３（ＤＲ８ｗ３）の場合に明らかであり、ここで、β3は、発現されない。これはまた、ＤＲＢ１*０３０１（ＤＲ３）およびＤＲＢ３*０１０１（ＤＲ５２ａ）、ＤＲＢ１*０４０１（ＤＲ４ｗ４）、ＤＲＢ１*０４０４（ＤＲ４ｗ１４）、ＤＲＢ１*０４０５（ＤＲ４ｗ１５）、ＤＲＢ１*１１０１（ＤＲ５）、ＤＲＢ１*１２０１（ＤＲ５ｗ１２）、ＤＲＢ１*１３０２（ＤＲ６ｗｌ９）ならびにＤＲＢ１*０７０１（ＤＲ７）についても立証されている。ＤＲＢ１*１５０１（ＤＲ２ｗ２β1）、ＤＲＢ５*０１０１（ＤＲ２ｗ２β2）、ＤＲＢ１*１６０１（ＤＲ２ｗ２１β1）、ＤＲＢ５*０２０１（ＤＲ５１Ｄｗ２１）およびＤＲＢ４*０１０１（ＤＲｗ５３）アッセイについてのβ鎖特異性の問題は、線維芽細胞の使用によって回避される。ＤＲβ分子特異性に関するアッセイの開発および確証は、以前に記載されている（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３，１９９８を参照のこと）。
【０２４７】
上に概説された結合アッセイは、例えば、実施例２に記載されるようなスーパーモチーフおよび／またはモチーフを保有するエピトープを分析するために使用され得る。
【０２４８】
（実施例２．ＨＬＡスーパーモチーフおよびモチーフを保有するＣＴＬ候補エピトープの同定）。
【０２４９】
本発明のワクチン組成物は、広範な集団適用範囲を達成するための、複数のＨＬＡすスーパーモチーフまたはモチーフを含む複数のエピトープを含み得る。この実施例は、このようなワクチン組成物に含ませるためのスーパーモチーフおよびモチーフを保有するエピトープの同定を例示する。集団適用範囲の計算を、以下に記述されるストラテジーを用いて実施した。
【０２５０】
（スーパーモチーフおよび／またはモチーフを保有するエピトープの同定のためのコンピュータ検索およびアルゴリズム）
実施例２および５において、モチーフ保有ペプチド配列を同定するために実施される検索は、１９９４ Ｌｏｓ Ａｌｍａｏｓデータベースにおいて入手可能であったＨＩＶ−１クレードＢウイルス株からのタンパク質配列データを使用した。
【０２５１】
エピトープを保有するＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩのスーパーモチーフまたはモチーフについてのコンピュータ検索は、以下のように実施された。全ての翻訳されたＨＩＶタンパク質配列を、テキスト記号検索（ｔｅｘｔ ｓｔｒｉｎｇ ｓｅａｒｃｈ）ソフトウェアプログラム（例えば、ＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈ １．４（Ｄ．Ｂｒｏｗｎ，Ｓｎａ Ｄｉｅｇｏ））を使用して分析して、適切なＨＬＡ結合モチーフを含む潜在ペプチド配列を同定した；代替のプログラムは、明細書中でのモチーフ／スーパーモチーフの開示の観点から、当該分野の情報に従って容易に生成される。さらに、このような計算は、頭の中で行われ得る。同定されたＡ２スーパーモチーフ配列、Ａ３スーパーモチーフ配列およびＤＲスーパーモチーフ配列を、特定のＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合するそれらの能力を予測するための多項式アルゴリズムを使用してスコア付けした。これらの多項式アルゴリズムは、伸長したモチーフおよび精製されたモチーフの両方を考慮し（すなわち、異なる位置で異なるアミノ酸の影響を考慮すること）、そしてペプチド−ＨＬＡ分子相互作用の全親和性（つまり、ΔＧ）が以下の型の線形多項式関数として近似され得るという事実に本質的に基づく：
【０２５２】
【化７】
【０２５３】
ここで、ａjiは、ｎ個のアミノ酸のペプチドの配列に沿った所定の位置（ｉ）での所定のアミノ酸（ｊ）の存在の効果を表す係数である。この方法の重要な仮定は、各位置での効果が、本質的に互いに独立である（すなわち、個々の側鎖の独立な結合）ことである。残基ｊが、ペプチドの位置ｉに生じる場合、一定の量のｊiがペプチドの残りの配列に関わらず、このペプチドの結合の自由エネルギーに寄与することを仮定する。この仮定は、ペプチドが、実質的に伸びたコンホメーションで、ＭＨＣに結合し、そしてＴ細胞によって認識されるということを立証した本発明者らの研究室からの研究によって証明される（本明細書においてデータは省略した）。
【０２５４】
特定のアルゴリズム係数の導出方法は、Ｇｕｌｕｋｏｔａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７：１２５８−１２６，１９９７に記載されている；（Ｓｉｄｎｅｙら，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１９９６；およびＳｏｕｔｈｗｏｏｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３，１９９８をまた、参照のこと）。簡潔には、全てのｉ位置について、アンカーおよび非アンカーと同様に、ｊを保有する全てのペプチドの平均相対結合（ＡＲＢ）の幾何平均は、群の残りに対して計算され、そしてｊiの推定値として使用される。クラスＩＩペプチドについて、複数の整列が可能である場合、最も高いスコアの配列のみが使用され、反復手順に続く。試験セットにおける所定のペプチドのアルゴリズムスコアを計算するために、ペプチドの配列に対応するＡＲＢ値が、掛け算される。この積が、選択された閾値を超えた場合、このペプチドは、結合すると予測される。適切な閾値は、所望の予測の厳密さの程度の関数として選択される。
【０２５５】
（ＨＬＡ−２スーパータイプ交差反応性ペプチドの選択）
９つのＨＩＶ構造的タンパク質および調節タンパク質からの完全なタンパク質配列が、モチーフ同定ソフトウェアを使用して、整列され、次いでスキャンされて、ＨＬＡ−Ａ２−スパーモチーフ一次アンカー特異性を含む保存された９マーおよび１０マー配列を同定した。この分析は、１９９４ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓデータベースにおける全ての単離物を含む。保存基準は、抗原に従って変化した：ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖについてはクレードＢ単離物の８０％より大きい；ｎｅｆ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｖｐｒについては７０％より大きい；ｖｐｕについては６０％より大きい。
【０２５６】
総計２３３の保存されたＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフー陽性配列を同定した。次いで、これらの配列に対応するペプチドを合成し、そしてインビトロで精製したＨＬＡ−Ａ*０２０１分子を結合するそれらの能力について試験した（ＨＬＡ−Ａ*０２０１は、原型のＡ２スーパータイプ分子であると考えられる）。３０のペプチドが、≦５００ｎＭのＩＣ50値で結合した；３０のうちの５個は、高い結合親和性（ＩＣ50値≦５０ｎＭ）を有し、そして２５個は、中程度の結合親和性（５０〜５００ｎＭの範囲）を有した（表ＸＸＶＩＩ）。
【０２５７】
３０のＡ*０２０１結合ペプチドを、続いて、さらなるＡ２スーパータイプ分子（Ａ*０２０２、Ａ*０２０３、Ａ*０２０６およびＡ*６８０２）に結合する能力について試験した。表ＸＸＶＩＩに示されるように、３０のペプチドのうちの２０は、試験された５つのＡ２−スーパータイプ対立遺伝子の少なくとも３つを結合するＡ２スパータイプ交差反応性バインダーであることが見出された。
【０２５８】
（ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープの選択）
上記でスキャンされたＨＩＶタンパク質配列をまた、ＨＬＡ−Ａ３スパーモチーフ一次（ｐｒｉｍａｒｙ）アンカーを有するペプチドの存在について試験した。総計３５３個の保存された９マーまたは１０マーモチーフ含有配列を同定した。対応するペプチドを合成し、そしてＨＬＡ−Ａ*０３０１およびＨＬＡ−Ａ*１１０１分子（２つの最も一般的なＡ３スーパータイプ対立遺伝子）への結合について試験した。６６のペプチドが、２つの対立遺伝子のうちの１つに、≦５００ｎＭの結合親和性で結合することが見出された（表ＸＸＶＩＩＩ）。これらのペプチドを、次いで、他の一般的なＡ３スーパータイプ対立遺伝子（Ａ*３１０１、Ａ*３３０１、およびＡ*６８０１）への結合交差反応性について試験した。２１個のペプチドが、試験された５個のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ分子のうちの少なくとも３個に結合した（表ＸＸＶＩＩＩ）。表ＸＸＶＩＩＩはまた、上に概略された検索基準を使用して選択されなかったが、Ａ３スーパータイプ交差反応性バインダーであることが示されている２つの１１マーペプチドを含む。
【０２５９】
（ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有エピトープの選択）
同じＨＩＶ標的抗原タンパク質配列をまた、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフを有する保存された９マーまたは１０マーの存在について分析する場合、５４の配列が同定された。対応するペプチドを合成し、そしてＨＬＡ−Ｂ*０７０２（も最も一般的なＢ７スーパータイプ対立遺伝子（すなわち、原型のＢ７スーパータイプ対立遺伝子））への結合について試験した。１６のペプチドは、Ｂ*０７０２に、≦５００ｎＭのＩＣ50で結合した（表ＸＸＩＸ）。次いで、これらのペプチドを、他の一般的なＢ７スーパータイプ分子（Ｂ*３５０１、Ｂ*５１０１、Ｂ*５３０１およびＢ*５４０１）への結合について試験した。表ＸＸＩＸに示されるように、１６のペプチドのうちの８が、試験された５個のＢ７スーパータイプ対立遺伝子の３つ以上に結合し得た。
【０２６０】
（Ａ１およびＡ２４モチーフ保有エピトープの選択）
集団適用範囲をさらに増加させるために、ＨＬＡ−Ａ１エピトープおよびＨＬＡ−Ａ２４エピトープを、ワクチン構築物に組み込み得る。上で利用されたＨＩＶ標的抗原からのタンパク質配列データの分析をまた、保存配列を含むＨＬＡ−Ａ１−およびＡ２４−モチーフを同定するために実施する。
【０２６１】
５の保存されたＨＩＶ誘導ペプチドが同定され、これらのペプチドは、Ａ*０１０１に、５００ｎＭ以下のＩＣ50で結合する（表ＸＸＸ）。１１の保存されたＨＬＡ−Ａ*２４０２結合ＨＩＶ誘導ペプチドをまた同定し、これらのうちの５つは、１００ｎＭ以下のＩＣ50で結合した（表ＸＸＸＩ）。
【０２６２】
（実施例３．免疫原性の確認）
（Ａ*０２０１免疫原性の評価）
Ａ*０２０１／Ｋbトランスジェニックマウスにおいて誘導されたＣＴＬは、ヒト系で誘導されたＣＴＬに類似する特異性を示すことが示されている（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７−１０１５，１９９１；Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７−１０１，１９９６を参照のこと）。従って、これらのマウスは、上の実施例２に同定された２０のＡ２スーパータイプ交差反応性ペプチドの免疫原性を評価するために使用した。
【０２６３】
ペプチド免疫に続く、トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ誘導が記述されている（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７−１０１５，１９９１；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３−４７６１，１９９７）。これらの研究において、マウスに、過剰のＩＡb拘束ヘルパーペプチド（１４０μｌ／マウス）の存在下でＩＦＡに乳化された各ペプチド（５０μｌ／マウス）を用いて、尻尾の根元に皮下注射した（ＨＢＶコア１２８〜１４０、Ｓｅｔｔｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：５５８６−５５９２，１９９４）。注射の１１日後、脾細胞をペプチド負荷同系ＬＰＳ芽細胞（ｂｌａｓｔ）の存在下でインキュベートした。６日後、培養物を、ペプチドパルス標的を使用して細胞傷害活性についてアッセイした。表ＸＸＸＩＩに要約されたデータは、８つのペプチドがＡ*０２０１／Ｋbトランスジェジェニックマウスにおいて初期ＣＴＬ応答を誘導し得たことを示す。（これらの研究について、ペプチドは、それがＣＴＬを誘導する場合、陽性であると考えられた（少なくとも２つのトランスジェニック動物において、Ｌ．Ｕ．３０／１０6細胞≧２（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７−１０１，１９９６）））。
【０２６４】
交差反応性候補ＣＴＬエピトープをまた、リコール（ｒｅｃａｌｌ）ＣＴＬＣＴＬ応答ＨＩＶ感染患者を刺激する能力について試験した。簡潔には、ＨＩＶに感染した患者からのＰＢＭＣを、１０μｇ／ｍｌの合成ペプチドの存在下で培養した。７日目および１４日目の後に、培養物をペプチドで再刺激した。この培養物を、２１日目に、51Ｃｒ放出アッセイにおける特定のペプチドでパルスされた標的細胞を使用して、細胞溶解活性についてアッセイした。これらのデータをまた、表ＸＸＸＩＩに要約する。示されるように、分析した１９のペプチドのうちの１５は、ＨＩＶ感染患者からのＰＢＭＣを使用してリコールＣＴＬ応答において認識された。
【０２６５】
免疫原性に関してスクリーニングされるペプチドのセットは、２つの過剰なペプチド、１２６１．１４および１２６１．０４（これらは単一アミノ酸で長さが異なる）を含んだ。両方のペプチドは、スーパータイプの縮重結合を示すが、２つのペプチドのうちの短いもののみが、免疫原性を示した。試験されなかった１つのスーパータイプペプチド（１２１１．０９）は、ＨＩＶ感染患者から単離されたＣＴＬ株によって認識されることが報告された。要約すると、ヒトにおいて免疫原性である１６個のＡ２−スーパータイプ交差反応性ペプチドが、同定され；これらのペプチドのうちの５３％はまた、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおいて認識される。１６個のペプチドは、５つのＨＩＶ抗原由来のエピトープを提示する：ｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｐｒ、およびｎｅｆ。
【０２６６】
（Ａ*０３／Ａ１１免疫原性の評価）
上記実施例２で同定されたＡ３−スーパータイプ交差反応性ペプチドのうちの２１個を、免疫原性に関して評価した（表ＸＸＸＩＩＩ）。ペプチドをＨＬＡ−Ａ１１／Ｋbトランスジェニックマウスを用いて、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスに関して上記のプロトコールを用いて（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３−４７６１、１９９７）およびＨＩＶ感染患者から得られたＰＢＭＣを用いてスクリーニングし、ＣＴＬリコール応答を刺激するための能力に関して試験した。ＨＬＡ−Ａ１１トランスジェニックマウスにおいてＣＴＬを誘導し得た１０個のペプチドを同定した。
【０２６７】
３個のペプチド９６６．０１、９４０．０３、および１０６９．４７は、ＨＩＶ感染患者において免疫原性であることが共同研究者によって示された。ペプチド９６６．０１および１０６９．４７はまた、トランスジェニックマウスにおいてＣＴＬ応答を誘導し、ペプチド９４０．０３は、患者のみにおいて免疫原性を示した。
【０２６８】
要約すると、２３個のＡ３−スーパータイプ交差反応性結合ペプチドのうちの１１個が、ＨＬＡ−Ａ１１トランスジェニックマウスまたはＨＩＶ感染患者のいずれかにおいて免疫原性であることが見出された。これらのペプチドは、３つのＨＩＶ抗原由来のエピトープを提示する：ｐｏｌ、ｅｎｖ、およびｎｅｆ。
【０２６９】
（Ｂ７免疫原性の評価）
実施例２で同定されたＢ７−スーパータイプ交差反応性結合ペプチドの免疫原性スクリーニングを使用して、ＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスおよびＨＩＶ感染患者由来のＰＢＭＣを用いて、Ａ２−スーパーモチーフ保有ペプチドおよびＡ３−スーパーモチーフ保有ペプチドの評価と類似の様式で免疫原性を評価する。これらのペプチドのうちの３つは、ＨＩＶ感染患者において免疫原性であると報告されている。
【０２７０】
（実施例４．アナログを作製することによるネイティブなエピトープの結合能力を改善するための、拡大されたスーパーモチーフの実行）
ＨＬＡモチーフおよびＨＬＡスーパーモチーフ（第１の残基および／または第２の残基を含む）は、本明細書中に実証されるように、高度に交差反応性のネイティブなペプチドの同定および調製において有用である。さらに、ＨＬＡモチーフおよびＨＬＡスーパーモチーフの定義はまた、アナログ化され得るかあるいはペプチドに特定の特徴（例えば、スーパータイプを含むＨＬＡ分子の群内でのより大きな交差反応性、および／またはこれらのＨＬＡ分子のうちのいくらかもしくは全てに対するより大きな結合親和性）を与えるために「固定化」され得るネイティブなペプチド配列内の残基を同定することによって、高度に交差反応性のエピトープを操作することを可能にする。調節された結合親和性を示すアナログペプチドの例を、本実施例に示す。
【０２７１】
（一次アンカー残基におけるアナログ化（ａｎａｌｏｇｉｎｇ））
実施例２に示されるように、２０個のＨＩＶ由来のＡ２−スーパータイプ拘束エピトープを同定した。ペプチド操作戦略を実行して、試験されたＡ２スーパータイプ対立遺伝子の３／５を結合する上記で同定された候補エピトープの交差反応性をさらに増加する。開示されたデータ（例えば、関連かつ同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２２６，７７５）に基づいて、Ａ２−スーパーモチーフ保有ペプチドの主要なアンカーを、例えば、好ましくは２位にＬ、Ｉ、Ｖ、もしくはＭを、およびＣ末端にＩもしくはＶを導入するために変更する。
【０２７２】
アナログペプチドの交差反応性を分析するために、各操作されたアナログを、原型Ａ２スーパータイプ対立遺伝子Ａ*０２０１への結合に関して最初に試験して、次いで、Ａ*０２０１結合能力が維持される場合、Ａ２スーパータイプ交差反応性に関して試験した。
【０２７３】
あるいは、ペプチドを、１つもしくは全てのスーパータイプメンバーへの結合に関して試験し得、次いで、アナログ化して、集団の適用範囲を付加するためにいずれか１つ（またはより多く）のスーパータイプメンバーへの結合親和性を調節する。
【０２７４】
同様に、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープのアナログをまた操作する。例えば、Ａ３−スーパータイプ分子のうちの３／５へのペプチド結合を、２位に好ましい残基（Ｖ、Ｓ、Ｍ、またはＡ）を保有するために一次アンカー残基において操作し得る。
【０２７５】
次いで、アナログペプチドを、Ａ*０３およびＡ*１１（原型Ａ３スーパータイプ対立遺伝子）を結合する能力に関して試験する。次いで、代表的に、５００ｎＭ以下の結合能力を示すペプチドを、Ａ３−スーパータイプ交差反応性に関して試験する。
【０２７６】
Ａ２モチーフ保有ペプチドおよびＡ３モチーフ保有ペプチドと同様に、Ｂ７スーパーモチーフ保有ペプチドをまたアナログ化（ａｎａｌｏｇｕｅ）する。例えば、３以上のＢ７−スーパータイプ対立遺伝子を結合するペプチドを、増加した交差反応性結合を達成するために調節する。Ｂ７スーパーモチーフ保有ペプチドは、例えば、Ｓｉｄｎｅｙら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０、１９９６）によって示されるように、Ｃ末端の一次アンカー位置に好ましい残基（Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＦ）を保有するために操作され得る。
【０２７７】
（二次アンカー残基におけるアナログ化）
ＨＬＡモチーフおよびＨＬＡスーパーモチーフに関して規定される２次アンカー残基をまた、改変された結合活性、代表的には増加した交差反応性結合および／または増加した親和性を有するペプチドを操作するために使用する。例えば、１位に控えめな単一アミノ酸置換を提示するＢ７スーパーモチーフ保有ペプチドの結合能力を分析する。例えば、ペプチド１２６１．０１（表ＸＸＩＸ）のようなペプチドを、１位においてＦの代わりにＬを置換するためにアナログ化し得、続いて、改変された結合活性（例えば、増加した結合親和性および／または増加した交差反応性）に関して評価し得る。この手順は、改変された結合特性を有するアナログ化ペプチドを同定する。
【０２７８】
改善された結合能力または交差反応性を有する操作されたアナログを、例えば、ＩＦＡ免疫またはリポペプチド免疫の後に、ＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスにおいて免疫原性に関して試験する。アナログ化ペプチドを、代表的に、ＨＩＶ感染患者由来のＰＢＭＣを用いてリコール応答を刺激する能力に関してさらに試験する。
【０２７９】
従って、たった１つのアミノ酸置換の使用によって、ＨＬＡスーパータイプ分子に対するペプチドリガンドの結合親和性および／または交差反応性を増加することは可能である。
【０２８０】
（実施例５．ＨＬＡ−ＤＲ結合モチーフを有するＨＩＶ由来配列の同定）
ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフまたはＨＬＡクラスＩＩモチーフを保有するペプチドエピトープは、実施例１〜３に記載される方法論と同様の方法論を用いて以下に概説されるように同定される。
【０２８１】
（ＨＬＡ−ＤＲ−スーパーモチーフ保有エピトープの選択）
ＨＩＶ由来のＨＬＡクラスＩＩ ＨＴＬエピトープを同定するために、ＨＬＡクラスＩスーパーモチーフ／モチーフ配列の同定のために使用された同じＨＩＶ抗原由来のタンパク質配列を、ＨＬＡ−ＤＲ−モチーフまたはＨＬＡ−ＤＲ−スーパーモチーフを保有する配列の存在に関して分析した。詳細には、ＤＲ−スーパーモチーフを含む１５マーの配列（９マーのコア、ならびにＮ末端およびＣ末端の隣接領域に３つの残基をさらに含む（全部で１５アミノ酸））を選択した。
【０２８２】
ＤＲ分子へのペプチド結合を推定するためのプロトコールは、開発されている（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３、１９９８）。個々のＤＲ分子に特異的なこれらのプロトコールは、９マーコア領域のスコア付けおよび格付けを可能にする。各プロトコールは、９マーコア内のＤＲ−スーパーモチーフ一次アンカーの存在に関してペプチド配列をスコア付けする（すなわち、１位および６位において）のみでなく、二次アンカーの存在に関して配列をさらに評価する。対立遺伝子特異的選択表（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、同書を参照のこと）を用いて、これらのプロトコールが、特定のＤＲ分子を結合する高い可能性を有するペプチド配列を効率的に選択することが見出されている。さらに、これらのプロトコールを連繋して実施すること（詳細には、ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４、およびＤＲ７に関するもの）が、効率的にＤＲ交差反応性ペプチドを選択し得ることが見出されている。
【０２８３】
上記で同定されたＨＩＶ由来のペプチドを、種々の一般的なＨＬＡ−ＤＲ分子に対するその結合能力に関して試験した。全てのペプチドを、一次パネルにおいてＤＲ分子（ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４、およびＤＲ７）への結合に関して最初に試験した。次いで、これら３個のＤＲ分子のうちの少なくとも２個に結合するペプチドを、２次アッセイにおいてＤＲ２ｗ２ β１分子、ＤＲ２ｗ２ β２分子、ＤＲ６ｗ１９分子、およびＤＲ９分子への結合に関して試験した。最後に、４個の二次パネルのＤＲ分子のうちの少なくとも２個（従って、蓄積的に７個の異なるＤＲ分子のうちの少なくとも４個）に結合するペプチドを、３次アッセイにおいてＤＲ４ｗ１５分子、ＤＲ５ｗ１１分子、およびＤＲ８ｗ２分子への結合に関してスクリーニングした。１次、２次および３次スクリーニングアッセイを含む１０個のＤＲ分子のうちの少なくとも７個を結合するペプチドを、交差反応性ＤＲ結合因子とみなした。これらのスクリーニングパネルの組成物および関連抗原の表現型頻度を、表ＸＸＸＩＶに示す。
【０２８４】
１３個のＨＩＶ由来ペプチドが、１０個の一般的なＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子のうちの少なくとも７個に結合することを見出した。これらの１３個のペプチドの配列、および１次〜３次パネルにおける各アッセイに関するこれらの結合能力を、表ＸＸＸＶに示す。ペプチドエピトープのこのセットは、主にｐｏｌから由来するが、ｇａｇおよびｅｎｖ由来のエピトープもまた含む。
【０２８５】
（ＤＲ３モチーフペプチドの選択）
ＨＬＡ−ＤＲ３は白色人種集団、黒色人種集団およびヒスパニック集団において優勢な対立遺伝子であるので、ＤＲ３結合能力は、ＨＴＬエピトープの選択において重要な判断基準である。しかし、以前に作成されたデータは、ＤＲ３が単にめったに他のＤＲ対立遺伝子と交差反応しないことを示した（Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２６３４−２６４０、１９９２；Ｇｅｌｕｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５７４２−５７４８、１９９４；Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：３３６３−３３７３、１９９８）。ＤＲ３ペプチド結合モチーフが大部分の他のＤＲ対立遺伝子の特異性と異なるようである点から、これは全く驚くべきことではない。ワクチン候補物を開発する際の最大効率のために、ＤＲ３モチーフがＤＲスーパーモチーフ領域に近接してクラスター形成されることが望ましい。従って、候補物であることが示されたペプチドはまた、そのＤＲ３結合能力に関してアッセイされ得る。しかし、ＤＲ３モチーフの異なる結合特異性を考慮して、ＤＲ３のみに対するペプチド結合はまた、ワクチン処方物中の含有物に関する候補物としてみなされ（ｏｃｎｓｉｄｅｒ）得る。
【０２８６】
ＤＲ３を結合するペプチド効率的に同定するために、９個の標的ＨＩＶ抗原を、Ｇｅｌｕｋら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５７４２−５７４８、１９９４）によって報告された２つのＤＲ３特異的結合モチーフのうちの１つの保有する保存配列に関して分析した。次いで、対応するペプチドを、合成し、そして１μＭまたはより良好な親和性（すなわち、１μＭ未満）を有するＤＲ３を結合する能力に関して試験した。（ｉｖｅ）この結合判断基準に合うペプチドを見出し（表ＸＸＸＶＩ）、そしてこれによって、ＨＬＡクラスＩＩの高い親和性結合因子として性格付けた。これら５個のうち、４個は、ｐｏｌ由来のエピトープを提示し、そして１個はｖｐｕ由来である。
【０２８７】
ＤＲ３結合エピトープはまた、ワクチン組成物中に含まれ得る。
【０２８８】
（実施例６．ＨＩＶ由来のＨＴＬエピトープの免疫原性）
ＨＴＬエピトープの免疫原性を、代表的には、適切なトランスジェニックマウスモデルを用いたＣＴＬエピトープの免疫原性の決定に類似した様式で、そして／またはＨＩＶ感染個体から単離されたＰＢＭＣを用いてリコール応答を刺激する能力を評価することによって、評価する。
【０２８９】
実施例５で同定された１３個のＨＬＡクラスＩＩ ＤＲ−スーパーモチーフ結合エピトープのうちの１１個の免疫原性を、リコール増殖応答に関して、ＨＩＶ感染された個体から単離されたＰＢＭＣを試験する研究において評価した。これらのペプチドの全て１１個は、ＤＲ拘束増殖応答を刺激することが見出された（表ＸＸＸＶＩＩ）。
【０２９０】
ＤＲ３−モチーフ保有ペプチドは、代表的に、同様の様式で評価される。このような研究は、ＨＩＶ患者由来のクラスＩＩエピトープの免疫原性を実証する。
【０２９１】
（実施例７．集団適用範囲の幅を決定するための、種々の民族背景におけるＨＬＡ−スーパータイプの表現型頻度の算出）
本実施例は、複数スーパーモチーフおよび／または複数モチーフを含む多重エピトープからなるワクチン組成物の集団適用範囲の幅に関する評価を示す。
【０２９２】
集団適用範囲を分析するために、ＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子頻度分布を決定した。各ＨＬＡ対立遺伝子に関する遺伝子頻度分布は、二項式分布式 ｇｆ＝１−（ＳＱＲＴ（１−ａｆ））を使用して抗原または対立遺伝子頻度から算出した（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３、１９９６を参照のこと）。全部の表現型頻度を得るために、累積遺伝子頻度を算出し、そして累積抗原頻度を逆関数式［ａｆ＝１−（１−Ｃｇｆ）2］の使用によって誘導した。
【０２９３】
頻度データがＤＮＡタイピングのレベルにおいて利用可能でない場合、対応する血清学的に規定された抗原頻度を、想定した。全ての潜在スーパータイプ集団の適用範囲を得るために、連鎖不平衡は想定せず、そして、スーパータイプの各々に属することが確認された対立遺伝子のみ、含めた（最小概算）。座の間（ｉｎｔｅｒ−ｌｏｃｉ）の組み合わせによって達成された潜在適用範囲の全体の概算は、Ａ適用範囲に非Ａでカバーされた集団の比（これは、考慮されるＢ対立遺伝子によってカバーされると予想され得る）を加算することによって作成した（例えば、全体＝Ａ＋Ｂ*（１−Ａ））。Ａ３様スーパータイプの確認されたメンバーは、Ａ３、Ａ１１、Ａ３１、Ａ*３３０１、Ａ*６８０１である。Ａ３様スーパータイプはＡ３４、Ａ６６、およびＡ*７４０１もまた含み得るが、これらの対立遺伝子は、全体の頻度算出には含まれなかった。同様に、Ａ２様スーパータイプファミリーの確認されたメンバーは、Ａ*０２０１、Ａ*０２０２、Ａ*０２０３、Ａ*０２０４、Ａ*０２０５、Ａ*０２０６、Ａ*０２０７、Ａ*６８０２、およびＡ*６９０１である。最後にＢ７様スーパータイプの確認された対立遺伝子は、Ｂ７、Ｂ*３５０１−０３、Ｂ５１、Ｂ*５３０１、Ｂ*５４０１、Ｂ*５５０１−２、Ｂ*５６０１、Ｂ*６７０１、およびＢ*７８０１である（潜在的には、Ｂ*１４０１、Ｂ*３５０４−０６、Ｂ*４２０１およびＢ*５６０２もである）。
【０２９４】
Ａ２−スーパータイプ、Ａ３−スーパータイプ、およびＢ７−スーパータイプを組み合わせることによって達成される集団適用範囲は、５個の主要な民族群において約８６％である（表ＸＸＩを参照のこと）。適用範囲は、Ａ１モチーフおよびＡ２４モチーフを保有するペプチドを含むことによって拡大され得る。平均して、５個の異なる主要な民族群（白人、北米黒人、中国人、日本人、およびヒスパニック）にわたって、Ａ１は、集団の１２％で、そしてＡ２４は集団２９％で存在する。これらを考え合わせると、これらの対立遺伝子は、これら同じ民族集団において３９％の平均頻度で提示される。Ａ１およびＡ２４がＡ２−スーパータイプ対立遺伝子、Ａ３−スーパータイプ対立遺伝子、Ｂ７−スーパータイプ対立遺伝子の適用範囲と組み合わされる場合、主要な民族集団にわたる全適用範囲は、９５％より上である。類似のアプローチを使用して、クラスＩＩモチーフ保有エピトープの組み合わせを用いて達成される集団適用範囲を概算し得る。
【０２９５】
（好ましいＨＬＡクラスＩエピトープの要約）
要約すると、上記実施例に示されたデータに基づいて、ＨＩＶから誘導された４７個の免疫原性および／または交差反応性結合の好ましいＣＴＬペプチドエピトープが、同定された（表ＸＸＸＶＩＩＩを参照のこと）。これら４７個のエピトープのうち、６個は、ｇａｇ由来であり、２２個はｐｏｌ由来であり、１０個はｅｎｖ由来であり、３個はｎｅｆ由来であり、そして各々ｒｅｖ由来の１つ、ｖｉｆ由来の１つ、およびｖｐｒ由来の１つのエピトープである。このエピトープのセットは、１６個のＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有エピトープ（２個はｇａｇ由来、８個はｐｏｌ由来、３個はｅｎｖ由来、２個はｖｐｒ由来、１つはｎｅｆ由来）を含み、これらの全ては、ＨＩＶ感染患者において認識される。１０個のＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有候補エピトープは、６個のｐｏｌ由来エピトープ、２個のｅｎｖ由来エピトープおよび各々ｇａｇから１つ、ｖｉｆから１つおよびｎｅｆから１つのエピトープを含む。ペプチド１２７３．０８および１２７３．０３を除外して、全てのエピトープは、ＨＬＡトランスジェニックマウスにおいて免疫原性である。抗原多様性を増強するために２個のさらなるペプチドが含まれる。
【０２９６】
ＣＴＬエピトープセットはまた、８個のＢ７拘束ペプチドを含む。これら８個のうち、３個のエピトープは、患者において免疫原性であると報告されている。５個のＢ７スーパーモチーフ保有ペプチドを、スーパータイプ結合に基づく候補物として含めた。ヒトにおける免疫原性研究（例えば、Ｂｅｒｔｏｎｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３，１９９７；Ｄｏｏｌａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：９７、１９９７；およびＴｈｒｅｌｋｅｌｄら、Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１６４８、１９９７）は、高度に交差反応性な結合ペプチドがほとんど常にエピトープとして認識されることを示した。これらの結果を提供し、そしてＢ７スーパーモチーフ保有ペプチドに関して利用可能な制限された免疫原性データを考慮すると、Ｂ７−スーパータイプ結合親和性の使用は、多様な集団において免疫原性であるワクチンへの封入に関して候補エピトープを同定する際に、重要な選択判断基準である。
【０２９７】
同様に、Ａ１拘束ペプチドおよびＡ２４拘束ペプチドを、候補エピトープの実証された免疫原性および結合親和性の両方に基づいて含めた。好ましいエピトープのうちの５個は、ＨＩＶ感染患者由来（ｆｏｒｍ）のリコールＣＴＬ応答において認識されることが報告されている。１００ｎＭ以下の結合親和性を有する高いパーセンテージペプチドが免疫原性であることが見出されているので、４個のＡ２４拘束ペプチドを、ワクチン候補物として含めた。５００ｎＭ以下のＩＣ50を有するそれぞれの対立遺伝子に結合する、さらなる５個のＡ２４拘束エピトープおよび４個のＡ１拘束エピトープをまた含めて、より大きな程度の集団適用範囲を提供した。
【０２９８】
これらの４７個のＣＴＬエピトープに関して、平均集団適用範囲は、５個の主要な民族集団の各々において９５％よりも大きいことが予想される。ゲーム理論モンテカルロシミュレーション分析（これは、当該分野で公知である（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｍ．Ｊ．およびＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ａ．「Ａ ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ ｇａｍｅ ｔｈｅｏｒｙ」ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ、１９９４））を用いて、白人、北米黒人、日本人、中国人、およびヒスパニックの民族群からなる集団において９０％の個体が、本明細書中に記載されるワクチンエピトープの７個以上を認識することが概算された（図１）。
【０２９９】
（好ましいＨＬＡクラスＩＩエピトープの要約）
ワクチン組成物に関して好ましいＨＩＶ由来のＨＴＬエピトープの列挙を、表ＸＸＸＩＸに要約する。ＨＴＬエピトープのセットは、１３個のＤＲスーパーモチーフ保有ペプチドおよび５個のＤＲ３モチーフ保有ペプチドを含む。大多数のエピトープは、ｐｏｌから誘導され、３個はｇａｇから、２個はｅｎｖから、そして１個はｖｐｕから誘導される。ＨＴＬエピトープのこのパネルによって示される概算された集団適用範囲全体は、５個の主要な民族群の各々において９１％よりも多いことを概算する（表ＸＬ）。
【０３００】
（実施例８．プライミング後の内因性プロセシング抗原のＣＴＬ認識）
本実施例は、実施例１〜６において記載されるように同定されそして選択されたネイティブなペプチドエピトープおよびアナログペプチドにより誘導されるＣＴＬが、内因的に合成された（すなわち、ネイティブな）抗原を認識することを決定する。
【０３０１】
実施例３におけるようなペプチドエピトープ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有エピトープ）で免疫されたトランスジェニックマウスから単離したエフェクター細胞を、ペプチドコーティングされた刺激細胞を使用してインビトロで刺激する。６日後、細胞傷害性についてエフェクター細胞をアッセイし、そしてペプチド特異的細胞傷害性活性を含む細胞株をさらに再刺激する。さらに６日後、ペプチドの存在下または非存在下で51Ｃｒ標識化Ｊｕｒｋａｔ−Ａ２．１／Ｋb標的に対する細胞傷害性活性についてこれらの細胞株を試験し、そしてまた、内因的に合成された抗原を保有する51Ｃｒ標識化標的細胞（すなわち、ＨＩＶ発現ベクターで安定にトランスフェクトした細胞）に対して試験する。
【０３０２】
その結果は、ペプチドエピトープでプライム（ｐｒｉｍｅ）した動物から得たＣＴＬ株が、内因的に合成されたＨＩＶ抗原を認識することを実証する。このような分析のために使用されるトランスジェニックマウスモデルの選択は、評価されるエピトープに依存する。ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋbトランスジェニックマウスに加えて、ヒトＡ１１（これはまた、Ａ３エピトープを評価するために使用され得る）およびＢ７対立遺伝子を有するマウスを含むいくつかの他のトランスジェニックマウスモデルを特徴づけ、そして他（例えば、ＨＬＡ−Ａ１およびＡ２４についてのトランスジェニックマウス）が開発されている。ＨＬＡ−ＤＲ１マウスおよびＨＬＡ−ＤＲ３マウスモデル（これは、ＨＴＬエピトープを評価するために使用され得る）も開発されている。
【０３０３】
（実施例９．トランスジェニックマウスにおける、ＣＴＬ−ＨＴＬ結合体化エピトープの活性）
本実施例は、ＨＩＶ ＣＴＬ／ＨＴＬペプチド結合体の使用によるトランスジェニックマウスにおけるＣＴＬおよびＨＴＬの誘導を例示する。ここでワクチン組成物は、ＨＩＶに感染した患者またはＨＩＶの危険にある個体に投与されるペプチドを含む。このペプチド組成物は、多重ＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープを含み得る。この分析は、ワクチン組成物に１以上のＨＴＬエピトープを含ませることにより達成され得る免疫原性の増強を示す。このようなペプチド組成物は、例えば、表ＸＸＶＩ−ＸＸＩＸから選択される少なくとも１つのＣＴＬエピトープまたはそのエピトープのアナログを含む好ましいＣＴＬエピトープに結合体化されたＨＴＬエピトープを含み得る。ＨＴＬエピトープは、例えば、表ＸＸＸＩＩから選択される。このペプチドは、所望ならば、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅ）され得る。
【０３０４】
免疫手順：トランスジェニックマウスの免疫を、記載される（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３〜４７６１、１９９７）ように行った。例えば、Ａ２／Ｋbマウス（これは、ヒトＨＬＡ Ａ２．１対立遺伝子についてトランスジェニックであり、そしてＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフまたはＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有エピトープの免疫原性の評価のために有用である）を、不完全フロイントアジュバント中か、またはペプチド組成物が脂質化ＣＴＬ／ＨＴＬ結合体である場合は、ＤＭＳＯ／生理食塩水中、またはペプチド組成物がポリペプチドである場合にはＰＢＳまたは不完全フロイトアジュバント中で０．１ｍｌのペプチドで皮下に（尾部の基部）プライムする。プライミングの７日後、これらの動物から得た脾細胞をペプチドでコーティングした同系照射ＬＰＳ活性化リンパ芽球で再刺激する。
【０３０５】
細胞株：ペプチド特異的細胞傷害性アッセイのための標的細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋbキメラ遺伝子でトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞である（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７，１９９１）。
【０３０６】
インビトロＣＴＬ活性化：プライミングの１週間後、脾細胞（３０×１０6細胞／フラスコ）を１０ｍｌの培養培地／Ｔ２５フラスコ中で、同系照射（３０００ラド）ペプチドコートリンパ芽球（１０×１０6細胞／フラスコ）と共に、３７℃にて共存培養する。６日後、エフェクター細胞を回収し、そして細胞傷害性活性についてアッセイする。
【０３０７】
細胞傷害性活性についてのアッセイ：標的細胞（１．０〜１．５×１０6）を２００μｌの51Ｃｒの存在下で、３７℃にてインキュベートする。６０分後、細胞を３回洗浄し、そしてＲ１０培地に再懸濁する。必要な場合、ペプチドを１μｇ／ｍｌの濃度で添加する。アッセイのために、Ｕ字型底の９６ウェルプレートにおいて１０4の51Ｃｒ標識化標的細胞を異なる濃度のエフェクター細胞に添加する（２００μｌの最終容量）。３７℃にて６時間インキュベーション後、上清の０．１ｍｌのアリコートを各ウェルから取りだし、そして放射活性をＭｉｃｒｏｍｅｄｉｃ自動γ計数器において決定する。パーセント比溶解を、式：パーセント比溶解＝１００×（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）により決定する。同じ条件化で行った別のＣＴＬアッセイ間の比較を容易にするために、51Ｃｒ放出データ（％）を溶解単位／１０6細胞として表現する。１溶解単位は、６時間51Ｃｒ放出アッセイにおける１０，０００標的細胞の３０％溶解を達成するために必要とされるエフェクター細胞の数として任意に決定する。比溶解単位／１０6を得るために、ペプチドの非存在下で得た溶解単位／１０6をペプチドの存在下で得た溶解単位／１０6から減算する。例えば、ペプチドの非存在下にて３０％51Ｃｒ放出を５０：１のエフェクター（Ｅ）：標的（Ｔ）比（すなわち、１０，０００標的について５×１０5エフェクター細胞）で得る場合およびペプチド存在下（すなわち、１０，０００標的について５×１０4エフェクター細胞）で５：１にて得る場合、比溶解単位は：［（１／５０，０００）−（１／５００，０００）］×１０6＝１８ＬＵである。
【０３０８】
結果を、免疫原性ＣＴＬ／ＨＴＬ結合体化ワクチン調製物を注射した動物のＣＴＬ応答の大きさを評価するために分析し、そして実施例３において概説したようにＣＴＬエピトープを使用して達成したＣＴＬ応答の大きさと比較する。これに類似の分析を行い、複数のＣＴＬエピトープおよび／または複数のＨＴＬエピトープを含むペプチド結合体の免疫原性を評価し得る。これらの手順に従って、ＣＴＬ応答が誘導されること、そして同時に、ＨＴＬ応答が、このような組成物の投与の時に誘導されることを見出した。
【０３０９】
（実施例１０．ＨＩＶ特異的ワクチンに含ませるためのＣＴＬおよびＨＴＬエピトープの選択）
本実施例は、本発明のワクチン組成物についてのペプチドエピトープの選択のための手順を例示する。組成物中のペプチドは、核酸配列の形態、ペプチドをコードする単一または１以上のいずれかの配列（すなわちミニ遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ））での形態あり得るか、または単一ペプチドおよび／またはポリエピトープペプチドであり得る。
【０３１０】
以下の原則を、ワクチン組成物に含ませるためのエピトープのアレイを選択する時に使用する。以下の原則の各々は、選択を行うために平衡化される。
【０３１１】
投与の際に、ウイルスクリアランスと相関する免疫応答を模倣するエピトープが選択される。例えば、ＨＩＶを一掃する患者が、少なくとも１つのＨＩＶ抗原における少なくとも３エピトープに対する免疫応答を生じることが観察された場合、３〜４エピトープが、ＨＬＡクラスＩについて含まれるべきである。同様の比率をＨＬＡクラスＩＩエピトープを決定するために使用する。
【０３１２】
ＨＩＶエピトープのアレイを選択する場合に、エピトープの少なくともいくつかが初期タンパク質または後期タンパク質から誘導されることが好ましい。急性感染または、潜伏感染のいずれかの後に、ウイルスが複製される場合に、ＨＩＶの初期プロモーターが発現される。従って、可能な最も初期の段階で疾患の症状を軽減するために初期段階タンパク質由来のエピトープを使用することが特に好ましい。
【０３１３】
ＨＬＡクラスＩ分子については５００ｎＭ以下のＩＣ50、クラスＩＩについては、１０００ｎＭ以下のＩＣ50の結合親和性を有するエピトープがしばしば選択される。十分なスーパーモチーフ保有ペプチドまたは対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイを、広範な集団適用範囲を与えるために選択する。例えば、エピトープを、少なくとも８０％集団適用範囲を提供するために選択する。モンテカルロ分析（当該分野で公知の統計学的評価）が、集団適用範囲の幅または重複性を評価するために使用され得る。
【０３１４】
ポリエピトープ組成物（例えば、ミニ遺伝子）を作製する場合、典型的に、目的のエピトープを含む可能な限り最小のペプチドを生成することが所望される。使用される原理は、入れ子状（ｎｅｓｔｅｄ）エピトープを含むペプチドを選択する場合に使用される原理と、同一でなければ類似するものである。
【０３１５】
同一標的タンパク質の複数の改変体の配列が利用可能である場合には、潜在ペプチドエピトープはまた、それらの保存に基づいて選択され得る。例えば、保存基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの配列全体、またはクラスＩＩ結合ペプチドの９マーのコア全体が、特定のタンパク質抗原について評価される配列に関して指示されたパーセンテージで保存されていることを規定し得る。
【０３１６】
ワクチン組成物に含まれるペプチドエピトープは、例えば、表ＸＸＶＩ〜ＸＸＩＸおよび表ＸＸＸＩＩに列挙されたものから選択される。選択されたペプチドから構成されるワクチン組成物は、投与された場合に、安全であり、有効であり、そして急性ＨＩＶ感染を一掃する免疫応答と同様の大きさで免疫応答を誘発する。
【０３１７】
（実施例１１．ミニ遺伝子多重エピトープ性ＤＮＡプラスミドの構築）
本実施例は、ミニ遺伝子発現プラスミドの構築のための一般的指針を提供する。当然のことながら、ミニ遺伝子プラスミドは、本明細書中に記載されるような、種々の構造のＣＴＬおよび／またはＨＴＬのエピトープまたはエピトープアナログを含み得る。発現プラスミドは、例えば、同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３１１，７８４（５／１３／９９付け出願）およびＩｓｈｉｏｋａら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２：３９１５−３９２５，１９９９において記載されるように構築され、そして評価される。ＨＩＶエピトープの発現のためのこのようなプラスミドの例を、図２に示す。図２は、ミニ遺伝子構築物におけるＨＩＶペプチドエピトープの方向を例示する。
【０３１８】
ミニ遺伝子発現プラスミドは、代表的に、複数のＣＴＬおよびＨＴＬペプチドエピトープを含む。本実施例では、ＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３、−Ｂ７スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープ、およびＨＬＡ−Ａ１および−Ａ２４モチーフ保有ペプチドエピトープが、ＤＲ−スーパーモチーフ保有エピトープおよび／またはＤＲ３エピトープと組み合わせて使用される（図２）。好ましいエピトープは、例えば、表ＸＸＶＩ〜ＸＸＩＸおよびＸＸＸＩＩにおいて同定される。ＨＬＡクラスＩスーパーモチーフまたは複数のＨＩＶ抗原由来のモチーフ保有ペプチドエピトープが選択され、その結果、複数のスーパーモチーフ／モチーフが提示されて、広範な集団適用範囲を保証する。同様に、ＨＬＡクラスＩＩエピトープを、複数のＨＩＶ抗原から選択して、広範な集団適用範囲を提供する。すなわち、ＨＬＡ−１−４−７スーパーモチーフ保有エピトープおよびＨＬＡ ＤＲ３モチーフ保有エピトープの両方が、ミニ遺伝子構築物に含まれるために選択される。次いで、選択されたＣＴＬおよびＨＴＬエピトープは、発現ベクターにおける発現のためにミニ遺伝子中に組み込まれる。
【０３１９】
このような構築物はさらに、小胞体にＨＴＬエピトープを指向させる配列を含み得る。例えば、Ｉｉタンパク質を、同時係属中の出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３１１，７８４（５／１３／９９付け出願）に記載のように、１以上のＨＴＬエピトープに融合し得る。ここで、Ｉｉタンパク質のＣＬＩＰ配列は取り除かれ、そしてＨＬＡクラスＩＩエピトープ配列で置き換えられ、その結果、ＨＬＡクラスＩＩエピトープは小胞体に指向され、この小胞体で、エピトープはＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する。
【０３２０】
本実施例は、ミニ遺伝子保有発現プラスミドの構築のために使用される方法を例示する。ミニ遺伝子組成物のために使用され得る他の発現ベクターは利用可能であり、そして当業者に公知である。
【０３２１】
ミニ遺伝子ＤＮＡプラスミドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列およびコンセンサスマウスκＩｇ軽鎖シグナル配列を含み、次いで、本明細書中に開示された原理に従って選択されたＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープを含む。この構築物はまた、例えば、配列を含み得、この配列は、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｍｙｃ−ＨｉｓベクターによってコードされるＭｙｃおよびＨｉｓ抗体エピトープタグに融合されたオープンリーディングフレームをコードする。
【０３２２】
平均して１５ヌクレオチドの重複を有する約７０ヌクレオチド長の重複性オリゴヌクレオチド（例えば、８オリゴヌクレオチド）は、合成され、そしてＨＰＬＣ精製される。このオリゴヌクレオチドは、選択されたペプチドエピトープ、ならびに適切なリンカーヌクレオチド、Ｋｏｚａｋ配列、およびシグナル配列をコードする。最終的な多重エピトープ性ミニ遺伝子は、ＰＣＲを使用する３セットの反応において重複性オリゴヌクレオチドを伸長させることによってアセンブルされる。Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ ９６００ ＰＣＲ機を使用し、そして以下の条件を使用して、合計３０回実施する：９５℃にて１５秒間、アニーリング温度（各プライマー対に関して最も低く算出されたＴｍより５度低い）で３０秒間、および７２℃にて１分間。
【０３２３】
最初のＰＣＲ反応については、各５μｇの２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、そして伸長する：オリゴヌクレオチド１＋２、３＋４、５＋６、および７＋８を、Ｐｆｕポリメラーゼ緩衝液（１×＝１０ｍＭ ＫＣＬ，１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩化物，ｐＨ８．７５，２ｍＭ ＭｇＳＯ4，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、各０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、および２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含む１００μｌの反応物中で組み合わせる。全長のダイマー産物をゲル精製し、そして１＋２および３＋４の産物、ならびに５＋６および７＋８の産物を含む２つの反応物を混合し、アニーリングし、そして１０回伸長させる。次いで、２つの反応物の半分を混合し、そして５回のアニーリングおよび伸長を実施し、次いで、隣接プライマーを添加して、さらに２５回、全長産物を増幅する。全長産物をゲル精製し、そしてｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化し、そして個々のクローンを、配列決定によってスクリーニングする。
【０３２４】
（実施例１２．プラスミド構築物およびプラスミド構築物が免疫原性を誘導する程度）
プラスミド構築物（例えば、実施例１１に従って構築されるプラスミド）が、免疫原性を誘導し得る程度は、エピトープ発現核酸構築物でのＡＰＣの形質導入またはトランスフェクション後の、このＡＰＣによるエピトープ提示を試験することによって、インビトロで評価され得る。このような研究は、「抗原性」を決定し、そしてヒトＡＰＣの使用を可能にする。このアッセイは、細胞表面上でのエピトープ−ＨＬＡクラスＩ複合体の密度を定量することによって、Ｔ細胞によって認識される状況下でエピトープがＡＰＣによって提示される能力を決定する。定量は、ＡＰＣから溶出されるペプチドの量を直接測定することによって実施され得るか（例えば、Ｓｉｊｔｓら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５６：６８３−６９２，１９９６；Ｄｅｍｏｔｚら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：６８２−６８４，１９８９を参照のこと）；または、ペプチド−ＨＬＡクラスＩ複合体の数は、感染もしくはトランスフェクトされた標的細胞によって誘導される溶解もしくはリンホカイン放出の量を測定し、次いで、溶解もしくはリンホカイン放出の等価な量を得るために必要とされるペプチドの濃度を決定することによって推定され得る（例えば、Ｋａｇｅｙａｍａら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５４：５６７−５７６，１９９５を参照のこと）。
【０３２５】
あるいは、免疫原性は、マウスへのインビボ注射と、その後のＣＴＬおよびＨＴＬ活性のインビトロ評価とを通して評価され得る。これらは、同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３１１，７８４（５／１３／９９付け出願）およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１−７６１，１９９４において詳述されるように、それぞれ、細胞傷害性アッセイおよび増殖アッセイを使用して分析される。
【０３２６】
例えば、少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２スーパーファミリーペプチドを含むＤＮＡミニ遺伝子構築物（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３１１，７８４に記載のように生成されたｐＭｉｎミニ遺伝子構築物）が、インビボでＣＴＬを誘導する能力を評価するために、例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋbトランスジェニックマウスに、筋内で１００μｇの裸のｃＤＮＡを用いて免疫する。ｃＤＮＡ免疫によって誘導されるＣＴＬのレベルを比較するための手段として、コントロール群の動物もまた、実際のペプチド組成物で免疫する。この実際のペプチド組成物は、それらがミニ遺伝子によってコードされるような、単一のポリペプチドとして合成される多重性エピトープを含む。
【０３２７】
免疫された動物由来の脾細胞を、個々の組成物（ミニ遺伝子においてコードされるペプチドエピトープまたはポリエピトープ性ペプチド）の各々で２回刺激し、次いで、51Ｃｒ放出アッセイにおいて、ペプチド特異的細胞傷害性活性についてアッセイする。この結果によって、Ａ２拘束エピトープに対して指向されたＣＴＬ応答の大きさが示され、このようにして、ミニ遺伝子ワクチンおよびポリエピトープ性ワクチンのインビボ免疫原性が示される。従って、ミニ遺伝子は、ポリエピトープ性ペプチドワクチンと同様に、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドエピトープに対して指向された免疫応答を誘発することが見出された。同様の分析もまた、他のＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを使用して実施し、ＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７モチーフまたはスーパーモチーフエピトープによるＣＴＬの誘導を評価する。
【０３２８】
クラスＩＩエピトープをコードするミニ遺伝子が、インビボでＨＴＬを誘導する能力を評価するために、例えば、ＤＲトランスジェニックマウス、または適切なマウスＭＨＣ分子と交差反応するようなエピトープについては、Ｉ−Ａb拘束マウスに、筋内で１００μｇのプラスミドＤＮＡを用いて免疫する。ＤＮＡ免疫によって誘導されるＨＴＬのレベルを比較する手段として、コントロール動物群もまた、完全フロイントアジュバント中に乳化された実際のペプチド組成物で免疫する。ＣＤ４＋Ｔ細胞（すなわち、ＨＴＬ）を、免疫した動物の脾細胞から精製し、そして各個々の組成物（ミニ遺伝子中にコードされるペプチド）で刺激する。ＨＴＬ応答を、3Ｈ−チミジン取り込み増殖アッセイ（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１−７６１，１９９４を参照のこと）を使用して、測定する。この結果によって、ＨＴＬ応答の大きさが示され、このようにして、ミニ遺伝子のインビボ免疫原性が示される。
【０３２９】
実施例１１に記載されるように構築されたＤＮＡミニ遺伝子はまた、プライムブーストプロトコールを使用するブースト剤と組み合わせるワクチンとして評価され得る。ブースト剤は、組換えタンパク質（例えば、Ｂａｒｎｅｔｔら，Ａｉｄｓ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４，補遺３：Ｓ２９９−Ｓ３０９，１９９８）または例えば、目的の完全なタンパク質をコードするミニ遺伝子またはＤＮＡを発現する組換えワクシニア（例えば、Ｈａｎｋｅら，Ｖａｃｃｉｎｅ １６：４３９−４４５，１９９８；Ｓｅｄｅｇａｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：７６４８−５３，１９９８；ＨａｎｋｅおよびＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ６６：１７７−１８１，１９９９；ならびにＲｏｂｉｎｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：５２６−３４，１９９９を参照のこと）から構成され得る。
【０３３０】
例えば、プライムブーストプロトコールにおいて使用されるＤＮＡミニ遺伝子の効力を、最初にトランスジェニックマウスにおいて評価する。この実施例において、Ａ２．１／Ｋbのトランスジェニックマウスを、少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドを含む免疫原性ペプチドをコードするＤＮＡミニ遺伝子１００μｇを用いて、ＩＭで免疫する。インキュベーション期間の後（３〜９週間の範囲）、このマウスを、このＤＮＡミニ遺伝子によってコードされる同じ配列を発現する組換えワクシニアウイルスの１０7ｐｆｕ／マウスを用いてＩＰでブーストする。コントロールマウスを、ミニ遺伝子配列を有さないか、またはこのミニ遺伝子をコードするＤＮＡを有するがワクシニアブーストを有さない、ＤＮＡまたは組換えワクシニアの１００μｇで免疫する。２週間のさらなるインキュベーション期間の後、マウス由来の脾細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてペプチド特異的活性について直ちにアッセイする。さらに、脾細胞を、ミニ遺伝子および組換えワクシニアにおいてコードされるＡ２−拘束ペプチドエピトープを用いてインビトロで刺激し、次いで、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡにおいてペプチド特異的についてアッセイする。
【０３３１】
プライムブーストプロトコールにおいて利用されるミニ遺伝子は、ＤＮＡ単独を有する場合よりも、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドに対するより大きな免疫応答を誘発することが見出される。このような分析はまた、ＨＬＡ−Ａ１１またはＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いて行われて、ＨＬＡ−Ａ３またはＨＬＡ−Ｂ７モチーフあるいはスーパーモチーフエピトープによるＣＴＬ誘導を評価し得る。
【０３３２】
ヒトにおけるプライムブーストプロトコールの使用は、実施例２０に記載される。
【０３３３】
（実施例１３．予防的使用のためのペプチド組成物）
本発明のワクチン組成物を、ＨＩＶ感染の危険性を有する人において、このような感染を防ぐために使用し得る。例えば、複数のＣＴＬおよびＨＴＬエピトープ（例えば、実施例９および／または１０で選択されるもの）を含むポリエピトープ性（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）ペプチドエピトープ組成物（まはた同じものを含む核酸）（これらはまた、集団の８０％より多くを標的化するために選択される）を、ＨＩＶ感染の危険性を有する個体に投与する。
【０３３４】
例えば、ペプチドに基づく組成物は、複数のエピトープを含む単一のポリペプチドとして提供され得る。このワクチンを、典型的には、アジュバント（例えば、不完全フロイントアジュバント）を含む生理学的溶液中で投与する。最初の免疫のためのペプチドの用量は、７０ｋｇの患者について約１〜約５０，０００μｇであり、一般的には１００〜５，０００μｇである。ワクチンの最初の投与の後に、４週間でブースター投薬量を投与し、その後ＰＢＭＣサンプル中のエピトープ特異的ＣＴＬ集団の存在を決定する技術によって、この患者における免疫応答の大きさを評価する。さらなるブースター用量を、必要に応じて投与する。この組成物は、ＨＩＶ感染に対する予防法として安全および有効の両方であることが見出される。
【０３３５】
あるいは、典型的にはトランスフェクト因子を含む組成物を、当該分野で公知の方法論および本明細書中で開示される方法論に従って、核酸に基づくワクチンの投与のために使用し得る。
【０３３６】
（実施例１４．ネイティブＨＩＶ配列由来のポリエピトープ性ワクチン組成物）
好ましくは、クラスＩおよび／またはクラスＩＩのスーパーモチーフまたはモチーフの各々について規定されるコンピュータアルゴリズムを用いて、ネイティブＨＩＶポリタンパク質配列がスクリーニングされて、複数のエピトープを含むポリタンパク質の「比較的短い」領域を同定し、そしてこのネイティブＨＩＶポリタンパク質配列は、好ましくはネイティブの抗原全体よりも長さが短い。複数の異なるエピトープ（重複したものでさえ）を含むこの比較的短い配列は、ミニ遺伝子構築物を作製するために選択され、そして使用される。この構築物は、このペプチドを発現するために操作され、これはネイティブのタンパク質配列に対応する。この「比較的短い」ペプチドは、一般には２５０アミノ酸長未満であり、しばしば１００アミノ酸長未満であり、好ましくは７５アミノ酸長未満であり、そしてより好ましくは５０アミノ酸長未満である。このワクチン組成物のタンパク質配列を選択する。なぜなら、これは、この配列内に含まれるエピトープの最大数を有する（すなわち、これは高濃度のエピトープを有する）ためである。本明細書中に示されるように、エピトープモチーフは、入れ子状でも重複してもよく、例えば、２つの９マーエピトープおよび１つの１０マーエピトープが、１０アミノ酸ペプチド中に存在し得る。このようなワクチン組成物を、治療目的または予防目的のために投与する。
【０３３７】
このワクチン組成物は、好ましくは、例えばＨＩＶ由来の３つのＣＴＬエピトープおよび少なくとも１つのＨＴＬエピトープを含む。このポリエピトープ性のネイティブ配列を、ペプチドとしてか、またはこのペプチドをコードする核酸配列をしてかのいずれかで投与する。あるいは、このネイティブ配列のアナログが作製され得、これによってエピトープの１つ以上が、このポリエピトープ性ペプチドの交差反応性および／または結合親和性特性を変更する置換を含む。
【０３３８】
この実施例の実施形態は、免疫系のまだ未知の局面として、プロセシングがネイティブの入れ子状配列に適用され、それによって治療的または予防的な免疫応答を誘導するワクチン組成物の生成を容易にするという可能性を提供する。さらに、このような実施形態は、現在未知のＨＬＡの構成についてのモチーフ保有エピトープの可能性を提供する。さらに、この実施形態（アナログを欠く）は、ネイティブのＨＩＶ抗原に実際に存在する複数のペプチド配列に対する免疫応答に関し、従って、任意の接合性エピトープの評価の必要性を回避する。最後に、この実施形態は、核酸ワクチン組成物の生成の場合に、規模の節約を提供する。
【０３３９】
この実施形態と関連して、当該分野の原理に従ってコンピュータプログラムが誘導され得、これは、標的配列において、配列長当たりのエピトープの最大数を同定する。
【０３４０】
（実施例１５．複数の疾患に関するポリエピトープ性ワクチン組成物）
本発明のＨＩＶペプチドエピトープを、１つ以上の他の疾患と関連する標的抗原由来のペプチドエピトープと共に使用して、ＨＩＶならびに１つ以上の他の疾患の予防または処置に有用なワクチン組成物を生成する。他の疾患の例としては、ＨＣＶおよびＨＢＶが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３４１】
例えば、集団の９８％より多くを標的とする複数のＣＴＬおよびＨＴＬエピトープを含むポリエピトープ性ペプチド組成物を、ＨＢＶおよびＨＩＶ感染の両方の危険性を有する個体に投与するために生成し得る。この組成物は、種々の疾患に関連する原因由来の複数のエピトープを取り込む単一のポリペプチドとして提供され得るか、または１つ以上の分散したエピトープを含む組成物として投与され得る。
【０３４２】
（実施例１６．免疫応答を評価するためのペプチドの使用）
本発明のペプチドを、ＨＩＶに関する特定のＣＴＬまたはＨＴＬ集団の存在に対する免疫応答を分析するために使用し得る。このような分析を、Ｏｇｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：２１０３−２１０６，１９９８によって記載されるような様式で行い得る。以下の実施例において、本発明に従うペプチドを、免疫原としてではなく、診断目的または予後判定目的のための試薬として使用する。
【０３４３】
この実施例において、高度に感受性のヒト白血球抗原テトラマー複合体（「テトラマー」）を、例えば、感染の異なる段階で、またはＡ*０２０１モチーフを含むＨＩＶペプチドを使用する免疫の後に、ＨＬＡ Ａ*０２０１−陽性個体からのＨＩＶ ＨＬＡ−Ａ*０２０１特異的ＣＴＬの頻度の断面分析のために使用する。テトラマー複合体を、記載されるように合成する（Ｍｕｓｅｙら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：１２６７，１９９７）。手短に言うと、精製されたＨＬＡ重鎖（この実施例においてはＡ*０２０１）およびβ２−ミクログロブリンを、原核生物発現系によって合成する。この重鎖を、膜貫通細胞質ゾルの尾の欠失およびＢｉｒＡ酵素学的ビオチン化部位を含む配列のＣＯＯＨ末端付加によって改変する。この重鎖（２−ミクログロブリン）およびペプチドを、希釈によって再折り畳みする。４５ｋＤの再折り畳み産物を、高速タンパク質液体クロマトグラフィーによって単離し、次いで、ビオチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、アデノシン５’三リン酸およびマグネシウムの存在下でＢｒｉＡによってビオチン化する。ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体を、１：４のモル比で加え、そしてこのテトラマー産物を１ｍｇ／ｍｌまで濃縮する。得られた産物をテトラマー−フィコエリトリンと呼ぶ。
【０３４４】
患者の血液サンプルの分析のために、約１００万のＰＢＭＣを３００×ｇで５分間遠心分離し、そして５０μｌの冷却リン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁する。三色（Ｔｒｉ−ｃｏｌｏｒ）分析を、抗ＣＤ８−三色、および抗ＣＤ３８と一緒に、テトラマー−フィコエリトリンを用いて行う。このＰＢＭＣを、テトラマーおよび抗体と一緒に３０〜６０分間氷上でインキュベートし、次いで、ホルムアルデヒド固定化の前に２回洗浄する。コントロールサンプルのうち９９．９８％より多くを含むために、ゲートを適用する。このテトラマーについてのコントロールは、Ａ*０２０１−陰性個体およびＡ*０２０１−陽性の非感染ドナーの両方を含む。次いで、このテトラマーで染色された細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって決定する。この結果は、エピトープ拘束ＣＴＬを含むＰＢＭＣサンプル中の細胞の数を示し、これによってＨＩＶエピトープに対する免疫応答の程度を容易に示し、従って、ＨＩＶでの感染の段階、ＨＩＶへの曝露の状態、または防御応答または治療応答を誘発するワクチンへの曝露の状態を示す。
【０３４５】
（実施例１７．リコール応答を評価するためのペプチドエピトープの使用）
本発明のペプチドエピトープを、患者におけるＴ細胞応答（例えば、急性応答またはリコール応答）を評価するための試薬として使用する。このような分析を、感染から回復した患者、ＨＩＶで慢性的に感染した患者、またはＨＩＶワクチンでワクチン接種した患者で行い得る。
【０３４６】
例えば、ワクチン接種された人のクラスＩ拘束ＣＴＬ応答を、分析し得る。このワクチンは、任意のＨＩＶワクチンであり得る。ＰＢＭＣを、ワクチン接種された個体およびＨＬＡ型から収集する。次いで、本発明の適切なペプチドエピトープ（最適には、複数のＨＬＡスーパータイプファミリーメンバーとの交差反応性を提供するためのスーパーモチーフを保有するペプチドエピトープ）を、このＨＬＡ型を保有する個体由来のサンプルの分析のために使用する。
【０３４７】
ワクチン接種された個体由来のＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度勾配（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で分離し、ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で３回洗浄し、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、および１０％の熱不活性化ヒトＡＢ血清を含むＨｅｐｅｓ（１０ｍＭ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（完全ＲＰＭＩ）中に再懸濁し、そしてミクロ培養形式を使用してプレーティングする。本発明のエピトープを含む合成ペプチドを、各ウェルに１０μｇ／ｍｌで加え、そして刺激の最初の週の間のＴ細胞援助（ｈｅｌｐ）の供給源として、ＨＢＶコア１２８〜１４０エピトープを各ウェルに１μｇ／ｍｌで加える。
【０３４８】
このミクロ培養形式において、４×１０5ＰＢＭＣを、９６ウェルの丸底プレート中の１００μｌ／ウェルの完全ＲＰＭＩにおいて、８つの複製培養物中のペプチドで刺激する。３日目および１０日目に、１００ｍｌの完全ＲＰＭＩおよび２０Ｕ／ｍｌの最終濃度のｒＩＬ−２を各ウェルに加える。７日目に、この培養物を９６ウェルの平底プレートに移し、そしてペプチド、ｒＩＬ−２および１０5の照射された（３，０００ｒａｄ）自己支持細胞で再刺激する。この培養物を、１４日目に細胞傷害活性について試験する。陽性のＣＴＬ応答は、以前に記載されるように（Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：１１０４，１１０８，１９９６；Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１６５５−１６６５，１９９６；およびＲｅｈｅｒｍａｎｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１４３２−１４４０，１９９６）、非感染のコントロール被験体との比較に基づいて、１０％より高い特異的51Ｃｒ放出を示すために、８つの複製培養物のうちの２つ以上を必要とする。
【０３４９】
標的細胞株は、自己および同種異系ＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬであり、これは、米国組織適合性および免疫遺伝学協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）（ＡＳＨＩ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入するか、または記載されるように（Ｇｕｉｌｈｏｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２６７０−２６７８，１９９２）患者のプールから樹立するかのいずれかである。
【０３５０】
細胞傷害性アッセイを、以下の様式で行う。標的細胞は、同種異系ＨＬＡと一致したか、または自己のＥＢＶで形質転換されたＢリンパ芽球腫細胞株のいずれかからなり、これを本発明の合成ペプチドエピトープと一緒に１０μＭで一晩インキュベートし、そして１００μＣｉの51Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いて１時間標識し、その後これらをＨＢＳＳで４回洗浄する。
【０３５１】
細胞溶解活性を、３，０００標的／ウェルを含むＵ底９６ウェルプレートを使用して、標準的な４−ｈ、分割ウェル51Ｃｒ放出アッセイにおいて決定する。刺激されたＰＢＭＣを、１４日目に、２０〜５０：１のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で試験する。細胞傷害性パーセントを、以下の式：１００×［（実験の放出−自発性の放出）／最大放出−自発性の放出）］から決定する。最大放出は、界面活性剤（２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）による標的の溶解によって決定する。自発性の放出は、全ての実験において最大放出の２５％未満である。
【０３５２】
このような分析の結果は、ＨＩＶまたはＨＩＶワクチンへの以前の曝露によってＨＬＡ拘束ＣＴＬ集団が刺激される程度を示す。
【０３５３】
クラスＩＩ拘束ＨＴＬ応答をまた、分析し得る。精製したＰＢＭＣを、１．５×１０5細胞／ウェルの密度で９６ウェル平底プレートで培養し、そして１０μｇ／ｍｌの合成ペプチド、抗原全体、またはＰＨＡで刺激する。細胞を、各条件について４〜６ウェルの複製物中に日常的にプレーティングする。７日の培養後、この培地を除去し、そして１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮な培地に交換する。２日後、１μＣｉ 3Ｈ−チミジンを各ウェルに加え、そしてさらに１８時間インキュベーションを続ける。次いで、細胞ＤＮＡをガラス繊維マットの上に収集し、そして3Ｈ−チミジンの取り込みについて分析する。抗原特異的Ｔ細胞の増殖を、抗原の存在下での3Ｈ−チミジン取り込みを抗原の非存在下での3Ｈ−チミジン取り込みで除算した比として計算する。
【０３５４】
（実施例１８．ヒトにおける特異的ＣＴＬ応答の誘導）
本発明のＣＴＬおよびＨＴＬエピトープを含む免疫原性組成物についてのヒトの臨床試験を、ＩＮＤのＩ期として調整し、段階的研究を行い、そして無作為で二重盲のプラシーボ制御試験として行う。このような試験を、例えば以下のように設計する：
合計約２７の被験体を登録（ｅｎｒｏｌｌ）し、そして３つのグループに分ける：
グループＩ：３つの被験体にプラシーボを注射し、そして６つの被験体に５μｇのペプチド組成物を注射する；
グループＩＩ：３つの被験体にプラシーボを注射し、そして６つの被験体に５０μｇのペプチド組成物を注射する；
グループＩＩＩ：３つの被験体にプラシーボを注射し、そして６つの被験体に５００μｇのペプチド組成物を注射する。
【０３５５】
最初の注射の４週間後に、全ての被験体に同じ投薬量でブースター接種を受けさせる。
【０３５６】
この研究で測定される終点は、このペプチド組成物の安全性および耐容性、ならびにその免疫原性に関する。このペプチド組成物に対する細胞の免疫応答は、このペプチド組成物の内因性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）活性の指標であり、そして従って、生物学的有効性の測定としてみなされ得る。以下は、安全性および有効性の終点に関連する臨床的データおよび研究室データを要約する。
【０３５７】
安全性：有害な事象の発生率を、プラシーボ処置グループおよび薬物処置グループでモニターし、そして程度および可逆性の観点から評価する。
【０３５８】
ワクチンの有効性の評価：ワクチンの有効性の評価のために、被験体を、注射の前および注射の後に出血させる。末梢血単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって新鮮なヘパリン処理した血液から単離し、凍結媒体中に等分し、そして凍結保存する。サンプルを、ＣＴＬおよびＨＴＬ活性についてアッセイする。
【０３５９】
このワクチンは、安全および有効の両方であることが見出される。
【０３６０】
（実施例１９．ＨＩＶで感染した患者におけるＩＩ期試験）
ＣＴＬ−ＨＴＬペプチド組成物のＨＩＶ感染患者への投与の効果を研究するために、ＩＩ期試験を行う。この試験の主な目的は、慢性的に感染したＨＩＶ患者においてＣＴＬを誘導するために効率的な用量およびレジメンを決定すること、これらの患者におけるＣＴＬおよびＨＴＬ応答の誘導の安全性を証明すること、およびウイルス負荷における減少およびＣＤ４+細胞の数における増加によって明らかにされるように、慢性的に感染したＨＩＶ患者の臨床画像を改善するＣＴＬの活性化の程度を見ることである。このような研究は、例えば以下のように設計される：
この研究は、複数の中央施設（ｃｅｎｔｅｒ）で行われる。この試験設計は、開放性標識（ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ）で非管理の用量段階的プロトコールであり、ここでこのペプチド組成物は単一用量として投与され、その６週間後に同用量の単一のブースターを投与する。この投薬量は、１回の注射当たり５０、５００および５，０００マイクログラムである。薬物に関連する有害な効果（重症度および可逆性）を記録する。
【０３６１】
３つの患者分類が存在する。最初のグループは、５０マイクログラムのペプチド組成物を注射され、第２および第３のグループは、それぞれ５００および５，０００マイクログラムのペプチド組成物を注射される。各グループの患者は、２１〜６５歳の範囲（男性および女性の両方を含む）であり、そして多様な民族的背景を表す。この患者の全てを５年間にわたってＨＩＶで感染させ、そしてこの患者はＨＣＶ、ＨＢＶおよびデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）陰性であるが、陽性レベルのＨＩＶ抗原を有する。
【０３６２】
このペプチド組成物の投与の効果を評価するために、ウイルス負荷およびＣＤ４+レベルをモニターする。このワクチン組成物は、ＨＩＶ感染の処置において安全および有効の両方であることが見出される。
【０３６３】
（実施例２０．プライムブーストプロトコールを用いるＣＴＬ応答の誘導）
プライムブーストプロトコールはまた、ヒトへのこのワクチンの投与のために使用され得る。このようなワクチンレジメンは、例えば、裸のＤＮＡの最初の投与、続いてこのワクチンをコードする組換えウイルス、あるいはアジュバントにおいて投与される組換えタンパク質／ポリペプチドまたはペプチド混合物を使用するブーストを含み得る。
【０３６４】
例えば、最初の免疫を、複数の部位に０．５〜５ｍｇの量でＩＭ（あるいはＳＣまたはＩＤ）で投与される裸の核酸の形態の発現ベクター（例えば、実施例１１において構築される発現ベクター）を使用して行う。この核酸（０．１〜１０００μｇ）をまた、遺伝子銃を使用して投与し得る。３〜４週間のインキュベーション期間の後、ブースター用量を投与する。このブースターは、例えば５−１０7〜５×１０9ｐｆｕの用量で投与される組換え鶏痘ウイルスである。代替的な組換えウイルス（例えば、ＭＶＡ、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス）をまた、ブースターについて使用し得るか、あるいはこのポリエピトープ性タンパク質またはこのペプチドの混合物を、投与し得る。ワクチンの有効性の評価のために、患者の血液サンプルを免疫の前、ならびに最初のワクチンおよびこのワクチンのブースター用量の投与の後の間隔に得る。末梢血単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって新鮮なヘパリン処理した血液から単離し、凍結媒体中に等分し、そして凍結保存する。サンプルを、ＣＴＬおよびＨＴＬ活性についてアッセイする。
【０３６５】
この結果の分析は、ＨＩＶに対する防御免疫を達成するために十分な大きさの応答が作製されていることを示す。
【０３６６】
（実施例２１．樹状細胞を使用するワクチン組成物の投与）
本発明のペプチドエピトープを含むワクチンを、ＡＰＣ、またはＤＣのような「専門的」ＡＰＣを使用して投与し得る。この実施例において、ペプチドパルスされたＤＣを患者に投与して、インビボでＣＴＬ応答を刺激する。この方法において、樹状細胞を単離し、拡大し、そして本発明のペプチドＣＴＬおよびＨＴＬエピトープを含むワクチンでパルスする。この樹状細胞を患者に注入して戻して、インビボのＣＴＬおよびＨＴＬ応答を誘発する。次いで、この誘導されたＣＴＬおよびＨＴＬは、このワクチン中のエピトープが誘導されるタンパク質を保有する特定の標的細胞を破壊するか、またはこの標的細胞の破壊を促進する。
【０３６７】
例えば、エピトープ保有ペプチドのカクテルを、ＰＢＭＣ、またはそれから単離されるＤＣにエキソビボで投与する。ＤＣの収集を容易にするための薬学（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎTM（Ｍｏｎｓａｎｔｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４）を使用し得る。ペプチドでＤＣをパルスした後かつ患者に再注入する前に、このＤＣを洗浄して未結合ペプチドを除去する。
【０３６８】
臨床的に理解されるように、そして臨床的結果に基づいて当業者によって容易に決定されるように、患者に再注射されたＤＣの数は変化し得る（例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４：３２８，１９９８；Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：５２，１９９６およびＰｒｏｓｔａｔｅ ３２：２７２，１９９７を参照のこと）。患者当り２〜５０×１０6ＤＣが代表的に投与されるが、より大きい数のＤＣ（例えば、１０7または１０8）もまた提供され得る。このような細胞集団は、代表的に５０〜９０％間のＤＣを含む。
【０３６９】
いくつかの実施形態においては、ペプチド負荷ＰＢＭＣをＤＣの精製なしで患者に注射する。例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎTMなどの薬剤を使用して処理後に産生された、ＤＣを含むＰＢＭＣを、ＤＣを精製せずに、患者に注射する。投与されたＰＢＭＣの総数は、しばしば、１０8〜１０10まで変化する。一般的に、患者に注射される細胞用量は、例えば、特異的な抗ＤＣ抗体を用いる免疫蛍光分析によって決定されるような、各患者の血液中のＤＣの割合に基づく。従って、例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎTMが、所定の患者の末梢血液における２％ＤＣを動員し、その患者が、５×１０6ＤＣを受容する場合、この患者は、総量２．５×１０8ペプチド負荷ＰＢＭＣで注射される。ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎTMなどの薬剤によって動員される％ＤＣは、代表的には、２〜１０％の間であると推定されるが、当業者によって理解されるように変化し得る。
【０３７０】
（ＣＴＬ／ＨＴＬ応答のエキソビボ活性化）
あるいは、ＨＩＶ抗原に対するエキソビボＣＴＬまたはＨＴＬ応答は、ＡＰＣの供給源（例えば、ＤＣ）および適切な免疫原性ペプチドと共に患者または遺伝的に適合性のＣＴＬまたはＨＴＬ前駆細胞を組織培養の際に、インキュベートすることによって誘導され得る。適切なインキュベーション時間後（代表的には、約７〜２８日間）（ここで、前駆細胞は活性化され、そして、エフェクター細胞へと増殖する）、細胞を患者に注入し戻す（ここで、エフェクター細胞は、これらの特異的な標的細胞を破壊するかまたはその破壊を容易にする）。
【０３７１】
（実施例２２．モチーフ保有ペプチドの同定の代替的な方法）
モチーフ保有ペプチドを同定する別の方法は、規定されたＭＨＣ分子を保有する細胞からこれらを溶出することである。例えば、組織分類に使用されるＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株は、どのＨＬＡ分子をこれらが発現するかを決定するために広範に特徴付けられている。特定の場合において、これらの細胞は、ＨＬＡ分子の単一の型のみを発現する。次いで、これらの細胞は、病原性生物によって感染され得るかまたは目的の抗原（例えば、ＨＩＶ調節または構造タンパク質）を発現する核酸でトランスフェクトされ得る。その後、感染の結果として（またはトランスフェクションの結果として）産生されたペプチドの内因性抗原のプロセシングによって産生されたペプチドは、細胞内のＨＬＡ分子に結合し、そして輸送され、そして細胞表面に提示される。
【０３７２】
次いで、ペプチドを穏やかな酸性条件に曝すことによって、ＨＬＡ分子から溶出し、そして、これらのアミノ酸配列を、例えば、質量スペクトル分析（例えば、Ｋｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３，１９９４）によって決定した。特定のＨＬＡ分子に結合する大部分のペプチドはモチーフを保有しているので、このことは、細胞上に発現される特定のＨＬＡ分子と相関するモチーフ保有ペプチドを獲得するための代替的な様式である。
【０３７３】
あるいは、いかなる内因性ＨＬＡ分子も発現しない細胞株は、単一のＨＬＡ対立遺伝子をコードする発現構築物でトランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、記載されるように使用され得る（すなわち、これらは、細胞の表面に提示された目的の病原体または抗原に対応するペプチドを単離するために、目的の抗原をコードする核酸を有する病原体生物で感染され得るかまたは目的の抗原をコードする核酸でトランスフェクトされ得る）。このような分析から得られたペプチドは、細胞中で発現される単一のＨＬＡ対立遺伝子への結合に対応するモチーフを保有する。
【０３７４】
当業者によって理解されるように、当業者は、１より多くのＨＬＡ対立遺伝子を保有する細胞に対して同様の分析を行ない得、続いて、発現される各ＨＬＡ対立遺伝子に特異的なペプチドを決定し得る。さらに、当業者はまた、感染またはトランスフェクション以外の手段（例えば、タンパク質抗原の負荷）が抗原の供給源を細胞に提供するために使用され得ることを認識する。
【０３７５】
上記実施例は、本発明を例示するために提供されるのであって、その範囲を制限するためではない。例えば、主要組織適合遺伝子複合体（すなわち、ＨＬＡ）についてのヒトの専門用語が、この文書の全体で使用される。これらの原則が他の種に対してもまた及び得ることが理解される。従って、本発明の他の改変体は、当業者にとって容易に明らかであり、添付の特許請求の範囲によって含まれる。本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のために本明細書中で参考として援用される。
【０３７６】
（表Ｉ）
【０３７７】
【表１】
【０３７８】
太文字の残基が好ましく、イタリック体の残基はさほど好ましくない：上記の表に示されるように、ペプチドが、モチーフまたはスーパーモチーフの各主要なアンカー位置に主要なアンカーを有する場合、ペプチドはモチーフ保有であるとみなされる。
【０３７９】
（表Ｉａ）
【０３８０】
【表２】
【０３８１】
*２がＶまたはＱの場合、Ｃ末端はＬではない。
太文字の残基が好ましく、イタリック体の残基はさほど好ましくない：上記の表に示されるように、ペプチドが、モチーフまたはスーパーモチーフの各主要なアンカー位置に主要なアンカーを有する場合、ペプチドはモチーフ保有であるとみなされる。
【０３８２】
（表ＩＩ）
【０３８３】
【表３】
【０３８４】
【０３８５】
【０３８６】
【０３８７】
【０３８８】
【０３８９】
イタリック体の残基は、さほど好ましくないかまたは「許容的な」残基を示す。表ＩＩの情報は、他に示されない限り、９マーに特異的である。
【０３９０】
（表ＩＩＩ）
【０３９１】
【表４】
【０３９２】
イタリック体の残基は、さほど好ましくないかまたは「許容的な」残基を示す。
【０３９３】
（表ＩＶ．ＨＬＡクラスＩ標準ペプチド結合親和性）
【０３９４】
【表５】
【０３９５】
（表Ｖ．ＨＬＡクラスＩＩ標準ペプチド結合親和性）
【０３９６】
【表６】
【０３９７】
「命名」欄は、表ＸＩＸおよびＸＸにおいて使用される対立遺伝子の名称を列挙する。
【０３９８】
【表７】
【０３９９】
【表８】
【０４００】
【０４０１】
【０４０２】
【０４０３】
【０４０４】
【０４０５】
【０４０６】
【０４０７】
【０４０８】
【表９】
【０４０９】
【０４１０】
【０４１１】
【０４１２】
【０４１３】
【０４１４】
【０４１５】
【０４１６】
【０４１７】
【０４１８】
【０４１９】
【０４２０】
【０４２１】
【０４２２】
【０４２３】
【０４２４】
【０４２５】
【０４２６】
【０４２７】
【０４２８】
【０４２９】
【０４３０】
【０４３１】
【０４３２】
【０４３３】
【０４３４】
【０４３５】
【０４３６】
【０４３７】
【０４３８】
【０４３９】
【０４４０】
【０４４１】
【０４４２】
【０４４３】
【０４４４】
【０４４５】
【０４４６】
【０４４７】
【０４４８】
【０４４９】
【０４５０】
【０４５１】
【０４５２】
【０４５３】
【０４５４】
【０４５５】
【表１０】
【０４５６】
【０４５７】
【０４５８】
【０４５９】
【０４６０】
【０４６１】
【０４６２】
【０４６３】
【０４６４】
【０４６５】
【０４６６】
【０４６７】
【０４６８】
【０４６９】
【０４７０】
【０４７１】
【０４７２】
【０４７３】
【表１１】
【０４７４】
【０４７５】
【０４７６】
【０４７７】
【０４７８】
【０４７９】
【０４８０】
【０４８１】
【０４８２】
【０４８３】
【０４８４】
【０４８５】
【０４８６】
【０４８７】
【０４８８】
【０４８９】
【０４９０】
【０４９１】
【０４９２】
【０４９３】
【０４９４】
【０４９５】
【０４９６】
【０４９７】
【０４９８】
【０４９９】
【０５００】
【０５０１】
【０５０２】
【０５０３】
【表１２】
【０５０４】
【０５０５】
【０５０６】
【０５０７】
【０５０８】
【０５０９】
【０５１０】
【０５１１】
【表１３】
【０５１２】
【０５１３】
【０５１４】
【０５１５】
【０５１６】
【０５１７】
【０５１８】
【０５１９】
【０５２０】
【０５２１】
【０５２２】
【０５２３】
【０５２４】
【表１４】
【０５２５】
【０５２６】
【０５２７】
【０５２８】
【０５２９】
【０５３０】
【０５３１】
【０５３２】
【０５３３】
【０５３４】
【０５３５】
【０５３６】
【０５３７】
【０５３８】
【０５３９】
【０５４０】
【０５４１】
【表１５】
【０５４２】
【０５４３】
【０５４４】
【０５４５】
【０５４６】
【０５４７】
【０５４８】
【０５４９】
【０５５０】
【０５５１】
【０５５２】
【０５５３】
【０５５４】
【０５５５】
【０５５６】
【０５５７】
【０５５８】
【０５５９】
【０５６０】
【０５６１】
【０５６２】
【０５６３】
【０５６４】
【０５６５】
【０５６６】
【０５６７】
【表１６】
【０５６８】
【０５６９】
【０５７０】
【表１７】
【０５７１】
【０５７２】
【０５７３】
【０５７４】
【０５７５】
【０５７６】
【０５７７】
【０５７８】
【０５７９】
【０５８０】
【０５８１】
【０５８２】
【０５８３】
【０５８４】
【０５８５】
【０５８６】
【０５８７】
【０５８８】
【０５８９】
【０５９０】
【０５９１】
【０５９２】
【０５９３】
【０５９４】
【０５９５】
【０５９６】
【０５９７】
【０５９８】
【０５９９】
【０６００】
【０６０１】
【０６０２】
【０６０３】
【０６０４】
【０６０５】
【０６０６】
【０６０７】
【０６０８】
【０６０９】
【０６１０】
【０６１１】
【０６１２】
【０６１３】
【０６１４】
【０６１５】
【０６１６】
【０６１７】
【０６１８】
【０６１９】
【０６２０】
【表１８】
【０６２１】
【０６２２】
【０６２３】
【０６２４】
【０６２５】
【０６２６】
【０６２７】
【０６２８】
【０６２９】
【０６３０】
【０６３１】
【０６３２】
【０６３３】
【０６３４】
【０６３５】
【０６３６】
【０６３７】
【０６３８】
【０６３９】
【０６４０】
【０６４１】
【０６４２】
【０６４３】
【０６４４】
【０６４５】
【０６４６】
【０６４７】
【０６４８】
【０６４９】
【０６５０】
【０６５１】
【０６５２】
【０６５３】
【０６５４】
【０６５５】
【０６５６】
【表１９】
【０６５７】
【０６５８】
【０６５９】
【０６６０】
【０６６１】
【０６６２】
【０６６３】
【表２０】
【０６６４】
【０６６５】
【０６６６】
【０６６７】
【０６６８】
【０６６９】
【０６７０】
【０６７１】
【０６７２】
【０６７３】
【０６７４】
【表２１】
【０６７５】
【０６７６】
【０６７７】
【０６７８】
【０６７９】
【０６８０】
【０６８１】
【０６８２】
【０６８３】
【０６８４】
【０６８５】
【０６８６】
【０６８７】
【０６８８】
【０６８９】
【０６９０】
【０６９１】
【０６９２】
【０６９３】
【０６９４】
【０６９５】
【０６９６】
【表２２】
【０６９７】
【０６９８】
【表２３】
【０６９９】
【０７００】
【０７０１】
【０７０２】
【表２４】
【０７０３】
【０７０４】
【表２５】
【０７０５】
【０７０６】
【０７０７】
【０７０８】
【表２６】
【０７０９】
【表２７】
【０７１０】
【表２８】
【０７１１】
【表２９】
【０７１２】
【表３０】
【０７１３】
【表３１】
【０７１４】
【０７１５】
【表３２】
【０７１６】
【表３３】
【０７１７】
【表３４】
【０７１８】
【表３５】
【０７１９】
【表３６】
【０７２０】
【表３７】
【０７２１】
【表３８】
【０７２２】
【表３９】
【０７２３】
【表４０】
【０７２４】
【表４１】
【０７２５】
【表４２】
【０７２６】
【表４３】
【０７２７】
【表４４】
【０７２８】
【表４５】

【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、平均集団における、ＨＬＡ−Ａ分子およびＨＬＡ−Ｂ分子によって結合されるＰＦ候補エピトープの数の関数としての、遺伝子型の総頻度のグラフを提供する。
【図２】 図２は、実験モデルミニ遺伝子構築物における、ペプチドエピトープの位置を例示する。

Claims (15)

  1. 調製されたヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）エピトープを含む組成物であって、該エピトープが、以下の配列：
    からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、組成物。
  2. 請求項１に記載の群から選択される２個のエピトープを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 請求項１に記載の群から選択される３個のエピトープを含む、請求項１に記載の組成物。
  4. 請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、以下：
    からなる群から選択される細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープをさらに含む、組成物。
  5. 前記組成物がヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記ＨＴＬエピトープが、汎ＤＲ結合分子である、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記エピトープが、リポソーム上またはリポソーム内にある、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記ペプチドが脂質に結合されている、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記エピトープが、ＨＬＡ重鎖とβ２−ミクログロブリンとストレプトアビジンとの複合体に結合され、それによってテトラマーを形成する、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記エピトープが、抗原提示細胞上のＨＬＡ分子に結合されている、請求項１に記載の組成物。
  11. 前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１に記載の組成物。
  12. 前記組成物が薬学的賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  13. 前記エピトープが単位用量形態である、請求項１に記載の組成物。
  14. 前記エピトープが、該エピトープをコードする組換え核酸分子から発現される、請求項１に記載の組成物。
  15. 請求項１に記載の調製されたエピトープをコードする組換え核酸分子を含む、発現ベクター。
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