KR20210093287A

KR20210093287A - 면역원성 아르기나제 2 폴리펩티드

Info

Publication number: KR20210093287A
Application number: KR1020217017730A
Authority: KR
Inventors: 매즈 할드 안데르센
Original assignee: 아이오 바이오테크 에이피에스
Priority date: 2018-11-14
Filing date: 2019-11-14
Publication date: 2021-07-27
Also published as: CN113164545A; SG11202104881VA; EP3880225A1; GB201818576D0; US20210403566A1; IL283133A; JP2022507373A; CA3118794A1; AU2019378076A1; WO2020099582A1

Abstract

본 발명은 아르기나제 2로부터 유래된 신규 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

면역원성 아르기나제 2 폴리펩티드

아르기나제(Arginase)는 아미노산 L-아르기닌(L-arginine)을 L-오르니틴(L-ornithine) 및 요소(urea)로 전환시키는 반응을 촉매하는 효소이다. 이는 아르기닌의 미세환경을 고갈시키고, 종양-특이적 세포독성 T세포 반응의 억제를 야기한다. 증가된 아르기나제 활성은 예를 들어 유방암, 폐암, 결장암 또는 전립선암 환자의 암세포에서 검출된 바 있다. 랫트 아르기나제 유전자로 형질감염된 마우스 대식세포가 공-배양된 종양 세포의 증식을 촉진한다는 것은 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 모두에서 나타났다. 또한 대식세포에 의한 아르기나제 발현의 유도는 폴리아민(polyamine) 합성을 통해 종양의 혈관화(tumour vascularization)를 증가시키는 것으로 나타났다. 쥐 폐암종 모델의 결과는 높은 수준의 아르기나제를 발현하는 성숙한 종양-연관 골수성 세포(myeloid cell)의 아집단(subpopulation)이 존재함을 나타냈다. 이들 종양-연관 골수성 세포는 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)의 항원-특이적 증식을 억제하는 세포 외 L-아르기닌을 고갈시켰다. 아르기나제 억제제의 주입은 마우스에서 폐암종의 성장을 차단하였다. 이는 종양 세포 및 종양 연관 골수성 세포에서의 아르기나제 발현 유도가 TIL에 대한 부정적 영향을 통해 항-종양 면역 반응을 억제함으로써 어떻게 종양 성장을 촉진할 수 있는지를 보여준다.

골수-유래 억제 세포들(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)은 이펙터 T세포(effector T cells)와 자연 살해 세포(natural killer cells)의 활성, 증식 및 세포독성을 억제하고, 뿐만 아니라 Treg 분화 및 확장(expansion)을 유도한다. 암세포와 MDSC 모두 효소 산화질소 합성효소(nitric-oxide synthase, NOS)와 아르기나제를 통해 L-아르기닌 대사를 조절함으로써 T세포를 억제할 수 있다. 많은 종양들은 아르기나제와 유도성 NOS(inducible NOS, iNOS)의 증가된 발현을 나타내며, 이는 종양 미세환경으로부터 아르기닌 고갈을 초래한다. 여러 연구들은 종양-특이적 T세포 반응의 억제에 있어서 이러한 변경된 종양 아르기닌 대사의 중요성을 강조하며, 최근에 급성골수성백혈병(Acute Myeloid Leukemia, AML) 모세포(blast)가 T세포 증식과 조혈모세포(hematopoietic stem cells)를 억제하는 아르기나제-의존적 능력을 나타낸다는 것이 입증되었다. 또한, 아르기나제 및 iNOS 억제제는 AML의 억제 활성을 감소시킨다.

포유류에서, 2개의 아르기나제 동종효소가 존재한다: 아르기나제 1 및 아르기나제 2. 두 동종효소는 동일한 생화학적 반응을 촉매하지만(따라서 효소 분석에 의해 구별될 수 없음) 세포 발현, 조절 및 세포 내 국소화(subcellular localisation)가 다르다.

발명의 요약

본 발명자들은 면역원성의 “핫스팟(hot spot)”인 아르기나제 1 및 아르기나제 2의 50개 아미노산 영역을 이전에 확인하였다. 이 영역은 전장 인간 아르기나제 1(서열번호 53)의 161-210번 위치 또는 전장 인간 아르기나제 2(서열번호 51)의 180-229번 위치, 또는 쥐 아르기나제에서 상응하는 위치에 해당한다. 이 영역 및 그로부터 유래된 펩티드는 WO2018065563에 기재되어 있다. 본 발명자들은 또한 아르기나제 1의 “핫스팟” 영역으로부터 유래된 폴리펩티드의 특정 서브-세트가 면역 반응을 자극하는데 특히 효과적이라는 것을 확인하였다. 이들 펩티드들은 전장 인간 아르기나제 1의 169-206번 위치, 전장 인간 아르기나제 1의 169-200번 위치 또는 전장 인간 아르기나제 1의 169-210번 위치(또는 인간 아르기나제 2 또는 쥐 아르기나제 1에서 상응하는 위치)에 해당한다. 이 폴리펩티드의 서브-세트는 PCT/EP2019/075731 및 이의 우선권 출원 GB1815549.9에 기재되어 있다.

본 발명자들은 인간 아르기나제 2의 완전히 다른 영역으로부터 유래된 폴리펩티드가 면역 반응을 자극하는데 특히 효과적이라는 것을 확인하였다. 놀랍게도, 이 영역은 인간 아르기나제 2의 트랜짓 펩티드(transit peptide)의 C-말단에 걸쳐있다(서열번호 51의 22번 위치 - 도 7의 개략도 참조). 인간 아르기나제 1에 대한 서열 동일성은 이 영역에서 상대적으로 낮다.

본 발명의 폴리펩티드는 아르기나제 2 및 아르기나제 2-발현 세포에 대한 유익한 면역 반응을 자극하는데 특히 효과적일 것으로 예상된다. 암에 대한 새로운 면역 요법의 개발은 병인(pathogenesis)에 관여하는 분자뿐만 아니라 면역계에 의해 인식되는 특이적 단백질에 대한 철저한 이해를 필요로 한다. 임상에서 아르기나제 특이적 면역 반응의 유도는 암세포의 사멸 이외에 일반적으로 아르기나제 발현 세포, 특히 MDSC와 종양-연관 대식세포(tumor-associated macrophage, TAM)의 면역 억제 기능을 억제함으로써 항암 면역 반응을 지지할 수 있다. 그러므로, 아르기나제-발현 세포들이 골수성 수지상세포를 표적하는 다른 면역치료적 접근, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 사용한 백신접종에 의한 원하는 효과를 길항하기 때문에, 결과적으로 추가적인 항암 면역요법과 높은 상승 효과가 있을 것이다.

본 발명은 (i) 적어도 서열번호 51의 21, 22 및 23번 위치의 아미노산을 포함하거나, 또는 (ii) 서열번호 51의 180-229번 위치로부터 선택된, 서열번호 51의 적어도 9개의 연속적인 아미노산의 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 인간 아르기나제 2(서열번호 51)의 면역원성 단편인 폴리펩티드를 제공한다. 상기 폴리펩티드는 상기 (i) 또는 (ii)에서 정의된 바와 같은 서열번호 51의 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개까지의 연속적인 아미노산을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열번호 59, 58, 57, 54, 55, 56, 2, 3, 19, 20, 21, 60 또는 61 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 상기 폴리펩티드는 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 아미노산의 최대 길이를 갖거나 및/또는 C-말단 아미노산이 상응하는 아미드(amide)로 대체될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 분리된 것일 수 있다.

본 발명은 또한 (i) 적어도 서열번호 52의 21, 22 및 23번 위치의 아미노산을 포함하거나, 또는 (ii) 서열번호 52의 180-229번 위치로부터 선택된, 서열번호 52의 적어도 9개의 연속적인 아미노산의 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 쥐(murine) 아르기나제 2(서열번호 52)의 면역원성 단편인 폴리펩티드를 제공한다. 상기 폴리펩티드는 상기 (i) 또는 (ii)에서 정의된 바와 같은 서열번호 52의 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개까지의 연속적인 아미노산을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 상기 폴리펩티드는 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 아미노산의 최대 길이를 갖거나 및/또는 C-말단 아미노산이 상응하는 아미드(amide)로 대체될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 분리된 것일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 보존제, 및 선택적으로 아쥬반트를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 또는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

도 1은 인간 아르기나제 1 및 인간 아르기나제 2 모두의 “핫스팟” 영역에 걸쳐있는 특정 폴리펩티드의 설계를 나타낸다. 서열 식별자 번호는 명세서의 표 X에 제공된다.
도 2는 핫스팟 영역에 해당하는 ARG2 펩티드가 건강한 기증자 및 흑색종 환자(AA914.30)의 PBMC에 의해 인식됨을 보여준다. 스팟 계수는 펩티드로 자극된 웰과 펩티드가 없는 대조군 웰의 평균 간의 차이로 제공된다. 5*10⁵개 세포를 웰당 플레이팅하고 펩티드 및 대조군 자극을 3회 반복으로 수행하였다. 반응은 DFR(distribution free resampling) 규칙을 사용하여 분석하였다.
도 3은 다수 ARG2 라이브러리 펩티드가 건강한 기증자의 PBMC에 의해 인식된다는 것을 나타낸다. 스팟 계수는 펩티드로 자극된 웰과 펩타이드가 없는 대조군 웰의 평균 간의 차이로 제공된다. 4-4.5*10⁵개 세포를 웰당 플레이팅하고 펩티드 및 대조군 자극은 3회 반복으로 수행하였다. 박스는 6명의 건강한 기증자의 스크리닝 후 가장 높고 가장 풍부한 반응을 나타낸 펩티드를 의미한다.
도 4는 핫스팟 영역 펩티드에 대한 반응을 검증한다. 스팟 계수는 펩티드로 자극된 웰과 펩타이드가 없는 대조군 웰의 평균 간의 차이로 제공된다. 5*10⁵개 세포를 웰당 플레이팅하고 펩티드 및 대조군 자극은 3회 반복으로 수행하였다. 박스는 얻어진 반응을 쉽게 비교하기 위해 거의 동일한 서열을 갖는 펩티드를 나타낸다.
도 5는 ARG2_1, ARG2_5, ARG2_8, ARG2_13 및 ARG2_22에 대한 반응의 검증을 나타낸다. 스팟 계수는 펩티드로 자극된 웰과 펩타이드가 없는 대조군 웰의 평균 간의 차이로 제공된다. 3*10⁵개 세포를 웰당 플레이팅하고 펩티드 자극 유무와 함께 3회 반복으로 수행하였다. ARG2_1에 대해 강력하고 두드러진 반응이 관찰되었다.
도 6A 및 6B는 2명의 건강한 기증자의 ARG2_1에 대한 또는 펩티드가 없는 경우의 CD4+ T 세포 반응을 나타낸다. PBMC 세포를 CD4 항체로 염색하고 ARG2_1 자극 유무와 함께 유세포분석에 의한 세포 내 사이토카인 방출 분석에서 분석하였다. CD4 세포는 ARG2-유래 펩티드로 자극되었을 때 IFN-감마(y축) 또는 TNF-알파(x축)를 모두 방출한다는 것을 도면을 통해 볼 수 있다.
도 7은 ARG2_1 단편의 위치를 나타내는 아르기나제 2의 개략도를 나타낸다.
도 8은 핫스팟 영역에 상응하는 ARG2 펩티드가 건강한 기증자(BC 또는 Buf-M) 및 암 환자(AA, 흑색종; UR, 신장세포암종)의 PBMC에 의해 인식되는 것을 나타낸다. 스팟 계수는 펩티드로 자극된 웰과 펩티드가 없는 대조군 웰의 평균 간의 차이로 제공된다. 4*10⁵개 세포를 웰당 플레이팅하고 펩티드 및 대조군 자극을 3회 반복으로 수행하였다. 반응은 DFR(distribution free resampling) 규칙을 사용하여 분석하였다. *- p≤0.05, **- p≤0.01.
도 9는 1명의 암 환자에서 ARG2_1에 대한 또는 펩티드가 없는 경우의 CD8+ T 세포 반응을 나타낸다. PBMC 세포를 CD8 항체로 염색하고 ARG2_1 자극 유무와 함께 유세포분석에 의한 세포 내 사이토카인 방출 분석에서 분석하였다. CD8+ T 세포는 TNF-알파의 일부 백그라운드 방출이 관찰되었음에도 불구하고 ARG2-유래 펩티드로 자극되었을 때 IFN-감마(y축) 또는 TNF-알파(x축)를 더 많이 방출한다는 것을 도면을 통해 볼 수 있다.
도 10은 ELISPOT 플레이트에서 사전-자극 없이 72시간 인큐베이션 +/- 펩티드 후 ARG2_1에 대한 생체 외(ex vivo) ELISPOT 반응을 나타낸다. 9*10⁵개 세포를 웰당 플레이팅하고 펩티드 ARG2_1과 함께 또는 없이(대조군) 3회 반복으로 수행하였다. 스팟 계수는 펩티드로 자극된 웰과 펩티드가 없는 대조군 웰의 평균으로 제공된다.
도 11은 생체 내(in vivo) 쥐 Arg2 시험을 위한 실험 계획을 나타낸다. 각 그룹에서 3마리의 마우스를 6개의 펩티드 중 하나로 피하(s.c.) 백신접종한다. 7일 후, 마우스를 희생시키고, 비장을 균질화하고 PBMC를 mIFNy ELISPOT에 사용한다.
도 12는 도 11의 실험 후에 수행된 mIFNy ELISPOT의 결과를 나타낸다. 스팟 계수는 펩티드로 자극된 웰과 펩티드가 없는 대조군 웰의 평균 간의 차이로 제공된다. 8*10⁵개 세포를 웰당 플레이팅하고 펩티드의 유무와 함께 3회 반복으로 수행되었다. 괄호는 동일한 펩티드로 백신접종된 마우스를 나타내고, 박스는 가장 강력하고 가장 두드러진 반응을 갖는 마우스를 강조 표시한다.
도 13은 mARG2_188-196 백신접종이 mArg2_188-196 및 mArg2_182-197 모두에 대해 강력한 mIFNy 반응을 제공함을 나타낸다. 8*10⁵개 세포를 웰당 플레이팅하고, 펩티드 및 대조군 자극은 3회 반복으로 수행하였다.
도 14는 ARG2-1이 건강한 기증자 및 고형 종양 또는 AML을 갖는 암 환자 모두의 PBMC 모두에 의해 널리 인식됨을 나타낸다. (A) 건강한 기증자(n=33), 고형 종양을 갖는 암 환자(n=19) 또는 AML을 갖는 암 환자(n=19)의 PBMC에서 ARG2-1 펩티드에 대한 IFNy ELISPOT 반응. 3-4*10^5개 세포를 웰당 플레이팅하였다. 펩티드 및 대조군 자극은 3회 반복으로 수행하였다. 각 스팟은 1명의 기증자를 나타내며, 펩티드-특이적 IFNy 분비 세포의 수이다(펩티드로 자극된 웰과 대조군 웰의 평균 간의 차이). (B) ARG2-1로 자극되거나 또는 비자극된 대조군에서, 건강한 기증자(HD49 및 HD50) 및 고형 종양을 갖는 암 환자(AA27)에서 IFNy 및 TNFa 생산에 대한 대표적인 세포 내 사이토카인 염색.
도 15는 긴 ARG2 펩티드 A2L2가 건강한 기증자 및 암 환자에서 강력하고 빈번한 CD4+ T-세포 반응을 유발함을 나타낸다. (A) 6명의 건강한 기증자의 PBMC에서 긴 펩티드 A2L1, A2L2 및 A2L3에 대한 IFNy ELISPOT 반응. 4*10^5개 세포를 웰당 플레이팅하고 펩티드 및 대조군 자극이 3회 반복으로 수행되었다. 특정 스팟 계수(펩티드-특이적 IFNy 분비 세포)는 펩티드로 자극된 웰과 대조군 웰의 평균 간의 IFNy 스팟 수의 차이로 제공된다. 펩티드에 대한 반응은 3개 설정으로 카운트하기에는 너무 많았으며(too numerous to count, TNTC), >750 스팟으로 설정되었다. (B) 6명의 건강한 기증자의 PBMC에서 A2L2 및 ARG2-1에 대한 IFNy ELISPOT 반응. 4*10^5개 세포를 웰당 플레이팅하고 펩티드 및 대조군 자극이 3회 반복으로 수행되었다. 특정 스팟 계수(펩티드-특이적 IFNy 분비 세포)는 펩티드로 자극된 웰과 대조군 웰의 평균 간의 IFNy 스팟 수의 차이로 제공된다. DFR 규칙에 따라 * p≤0.05 또는 ** p≤0.01. (C) 건강한 기증자(n=30) 및 고형 종양을 갖는 암 환자(n=18)의 PBMC에서 A2L2 펩티드에 대한 IFNy ELISPOT 반응. 3-4*10^5개 세포를 웰당 플레이팅하였다. 펩티드 및 대조군 자극이 3회 반복으로 수행되었다. 각 스팟은 1명의 기증자를 나타내며, 펩티드-특이적 IFNy 분비 세포의 수이다(펩티드로 자극된 웰과 대조군 웰의 평균 간의 차이). (D) A2L2로 자극되거나 또는 비자극된 대조군에서, 건강한 기증자(HD48 및 HD53) 및 고형 종양을 갖는 암 환자(AA27)에서 IFNy 및 TFNa 생산에 대한 대표적인 세포 내 사이토카인 염색. (E) 두 펩티드에 대한 반응의 크기를 비교하기 위한, 건강한 기증자(n=26) 및 고형 종양을 갖는 암 환자(n=11)의 PBMC에서 ARG2-1 및 A2L2에 대한 IFNy ELISPOT 반응. 4*10^5개 세포를 웰당 플레이팅하고 펩티드 및 대조군 자극이 3회 반복으로 수행되었다. 특정 스팟 계수(펩티드-특이적 IFNy 분비 세포)는 펩티드로 자극된 웰과 대조군 웰의 평균 간의 IFNy 스팟 수의 차이로 제공된다. ns: p = 0.7038.
도 16은 ARG2-특이적 T 세포가 ARG2-발현 수지상세포를 인식함을 나타낸다. (A) ARG2-특이적 T 세포는 전립선암 환자로부터 확장되었다. T 세포 배양물의 특이성은 펩티드 자극된 세포 및 비자극된 대조군에서 TNFa 및 IFNy 생산에 대한 세포 내 사이토카인 염색에 의해 평가되었다. 왼쪽: ARG2-1 펩티드 자극 및 비자극(대조군) 세포에 대한 도트 플롯. 오른쪽: 대조군 자극(펩티드 없음), ARG2-1 펩티드 자극 또는 A2L2 펩티드 자극에 대한 반응에서 IFNy, TNFa 또는 둘 다를 생산하는 % CD4+ T 세포. (B) 대조군 자극(펩티드 없음), ARG2-1 펩티드 또는 A2L2 펩티드에 대한 ELISPOT 반응에 의해 평가된 ARG2-특이적 T 세포의 특이성. 4*10^4 개 세포가 웰당 플레이팅되었다. TNTC = 카운트하기에 너무 많음(500개 이상의 스팟). (C) ARG2-특이적 T-세포의 HLA-제한을 조사하였다. 상이한 클래스 II 차단제의 존재 하에 ARG2-1 펩티드에 대한 ARG2-특이적 T 세포의 IFNy ELISPOT 반응. (D) 무관한 대조군 mRNA (mock mRNA) 또는 ARG2 mRNA로 형질감염된 자가 유래 수지상세포에 대한 ARG2-특이적 T 세포에 의한 IFNy ELISPOT 반응. 이펙터 대 표적 비율 5:1이고 웰당 5*10^4 개 이펙터 세포가 플레이팅됨. DFR 규칙에 따라 * p≤0.05 또는 ** p≤0.01.
도 17은 ARG2-특이적 T 세포가 ARG2-발현 악성 골수성 세포를 인식함을 나타낸다. (A) HLA-매치된 악성 세포를 확인하기 위해 ARG2-1 펩티드로 사전-펄싱된 상이한 관련 암 세포주에 대한 IFNy ELISPOT 반응에서 ARG2-특이적 T 세포를 조사하였다. 펩티드 자극이 없는 동일한 암 세포주는 대조군으로 조사했다. 이펙터 대 표적 비율 1:1이고 웰당 1*10^4개 이펙터 세포가 플레이팅됨. DFR 규칙에 따라 * p≤0.05 또는 ** p≤0.01. TNTC = 카운트하기에 너무 많음(>500). (B) ARG2-1 펩티드 및 클래스 II 차단제로 펄싱된 THP-1 세포에 대한 ARG2-특이적 T 세포의 IFNy ELISPOT 반응. (C) 상이한 사이토카인으로 THP-1 세포의 48시간 인큐베이션 후 RT-qPCR에 의해 평가된 THP-1에서 ARG2 발현. 데이터는 자극되지 않은 THP-1 세포에 대한 배수 변화로 표시된다, mean+SD, n=4. (D) 사이토카인 칵테일로 자극된 THP-1 세포에 대한 ARG2-특이적 T 세포의 IFNy ELISPOT 반응. 웰당 플레이팅된 1.5*10^5개 이펙터 세포에서 이펙터 대 표적 비율 5:1. DFR 규칙에 따라 ** p≤0.01 및 ns=유의하지 않음(not significant). (E) 자극되지 않은 THP-1 세포 또는 48시간 동안 사이토카인 칵테일로 사전-자극된 THP-1 세포를 사용하여 인큐베이션되었을 때 ARG2-특이적 T 세포 배양물에서 CD4+ T 세포로부터 TNFa 및 IFNy 생산의 세포 내 염색. 이펙터 대 표적 비율 2:1이며, 조건 당 500,000개 이펙터 세포가 사용됨. (F) 사이토카인 칵테일로 48시간 인큐베이션 후 RT-qPCR에 의해 평가된 THP-1 세포에서 ARG1및 ARG2 발현. 자극되지 않은 THP-1 세포는 대조군으로 사용되었다. 데이터는 하우스키핑 유전자 ACTB에 대한 상대적 발현으로 표시했다, mean+SD, n=4. (G) 사이토카인 칵테일(THP-1 + cyto) 및 클래스 II 차단제, aHLA-DR로 자극된 THP-1 세포에 대한 ARG2-특이적 T 세포의 IFNy ELISPOT 반응. 이펙터 대 표적 비율 5:1이고, 웰당 1.5*10^5개 이펙터 세포가 플레이팅됨. DFR 규칙에 따라 ** p≤0.01 및 ns = 유의하지 않음(not significant). (H) 사이토카인 칵테일 또는 IFNy로 48시간 자극 후 RT-qPCR에 의해 평가된 THP-1 세포에서 ARG2 발현. 자극되지 않은 THP-1 세포는 대조군으로 포함되었다. 데이터는 하우스키핑 유전자 RPLPO에 대한 상대적 발현으로 표시된다, mean+SD, n=4. (I) 사이토카인 칵테일(THP-1 + cytokines) 또는 IFNy (THP-1 + IFNy)로 사전-자극된 THP-1 세포에 대한 ARG2-특이적 T 세포의 IFNy ELISPOT 반응. 이펙터 대 표적 비율 2.5:1이며, 웰당 5*10^4개 이펙터 세포가 플레이팅됨. DFR 규칙에 따라 ** p≤0.01 및 ns = 유의하지 않음(not significant).
도 18은 ARG2-특이적 T-세포가 여러 ARG2-발현 악성 골수성 세포를 인식하는 것을 나타낸다. (A) 사이토카인 칵테일로 48시간 인큐베이션 후 RT-qPCR에 의해 평가된 MONO-MAC-1 (MM1) 세포에서 ARG2 발현. 데이터는 자극되지 않은 MM1 세포에 대한 배수 변화로 표시된다, mean+SD, n=4. (B) 사이토카인 칵테일 또는 IFNy로 48시간 인큐베이션 후 RT-qPCR에 의해 평가된 MM1 세포에서 ARG2 발현. 데이터는 자극되지 않은 MM1 세포에 대한 배수 변화로 표시된다, mean+SD, n=4. (C) 사이토카인 칵테일(MM1 + cytokine cocktail) 또는 IFNy (MM1 + IFNy)로 사전-자극된 MM1 세포에 대한 ARG2-특이적 T 세포의 IFNy ELISPOT 반응. 이펙터 대 표적 비율 2.5:1이며, 웰당 5*10^4개 이펙터 세포가 플레이팅됨. DFR 규칙에 따라 ** p≤0.01 및 ns = 유의하지 않음(not significant).
도 19는 ARG2-특이적 T 세포에 의한 ARG2-발현 세포의 인식이 표적 세포의 항원 처리 장치 이외에 ARG2 발현의 수준에 의존하는 것을 나타낸다. (A) 자극되지 않거나 또는 사이토카인 칵테일로 사전-자극되고 mock 형질감염되거나 또는 ARG1 또는 ARG2 mRNA로 형질감염된 THP-1 세포에 대한 ARG2-특이적 T 세포의 IFNy ELISPOT 반응. 이펙터 대 표적 비율 2.5:1이며, 웰당 5*10^4개 이펙터 세포가 플레이팅됨. DFR 규칙에 따라 ** p≤0.01 및 ns = 유의하지 않음(not significant). (B) 자극되지 않은 THP-1 세포 또는 사이토카인 칵테일로 사전-자극된 THP-1 세포로 인큐베이션한 후 mock (mock) 또는 ARG2 mRNA (mRNA) 형질감염시켰을 때 ARG2-특이적 T 세포 배양물에서 CD4+ T 세포로부터 TNFa 및 IFNy 생산의 세포 내 염색. 이펙터 대 표적 비율 2:1이고, 조건 당 500,000개 이펙터 세포가 사용됨. (C) ARG2-특이적 siRNA로 형질감염 48시간 후 RT-qPCR에 의해 평가된 THP-1 세포에서 ARG2 발현. 데이터는 mock 형질감염된 THP-1 세포에 대한 배수 변화로 표시된다, mean+SD, n=4. (D) 설정 전 48시간 동안 자극되지 않은 또는 사이토카인 칵테일 자극된 조건 하에서 유지되는 mock 또는 siRNA 형질감염된 세포와 인큐베이션될 때 ARG2-특이적 T 세포 배양물에서 CD4+ T 세포로부터 TNFa 및 IFNy 생산의 세포 내 염색. 이펙터 대 표적 비율 2:1이고 조건 당 500,000개 이펙터 세포가 사용됨. (E) ARG2-특이적 siRNA로 형질감염 48시간 후 사이토카인 칵테일 자극하고 RT-qPCR에 의해 평가된 THP-1 세포에서 ARG2 발현. 데이터는 자극되지 않은 mock 형질감염된 THP-1 세포에 대한 배수 변화로 표시된다, mean+SD, n=4.
도 20 (A) 6개의 상이한 예측된 Arg2 에피토프 중 하나로 백신접종된 C57BL/6 마우스로부터의 비장 세포의 쥐 IFNy ELISPOT 스크리닝. 8*10^5개 세포가 웰당 플레이팅되고, 펩티드 및 대조군 자극은 3회 반복으로 수행되었다. 특정 스팟 계수(펩티드-특이적 IFNy 분비 세포)는 펩티드로 자극된 웰과 대조군 웰의 평균 간의 IFNy 스팟 수의 차이로 제공된다. (B) Arg2 펩티드 P4 (M1-M5) 또는 대조군 백신접종(Ctrl1-4)으로 백신접종된 C57BL/6 마우스로부터의 비장 세포의 쥐 IFNy ELISPOT. 8*10^5개 세포가 웰당 플레이팅되고, 펩티드 및 대조군 자극은 3회 반복으로 수행되었다. 특정 스팟 계수(펩티드-특이적 IFNy 분비 세포)는 펩티드로 자극된 웰과 대조군 웰의 평균 간의 IFNy 스팟 수의 차이로 제공된다. (C) C57BL/6 백그라운드에서 상이한 기원의 이식된 종양에서의 Arg2 발현. 3개의 이식된 종양이 종양 유형별로 평가되었다. 데이터는 하우스키핑 유전자 Hprt1에 대한 상대적 발현으로 표시된다, mean+SD, n=3. (D) 항-PD-1 치료를 추가하거나 추가하지 않고 LL2 접종된 마우스에서 Arg2 백신접종을 사용한 2개의 개별 효능 연구에 대한 치료 스케줄. 5*10^5개 LL2 세포를 0일차에 우측 옆구리에 피하 주사한 후 (E) 대조군 또는 Arg2 펩티드로 Arg2 백신접종(두 그룹 모두에 대해 n=20) 또는 (F) 대조군 백신접종, Arg2 백신접종, 항-PD-1 치료, 또는 Arg2 백신접종 + 항-PD-1 치료(모든 그룹에 대해 n=10)를 하였다. (E-F) 개별 효능 연구에서 LL2 종양의 평균 종양 성장. 오차 박대는 평균의 표준 오차(the standard error of the mean, SEM)를 나타낸다, **** = p ≤ 0.0001. (G) (E)에 설명된 치료 그룹의 개별 종양 크기. 오차 막대는 표준 편차(standard deviation, SD)를 나타낸다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1 내지 38은 각각 인간 아르기나제 2로부터 유래된 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
서열번호 39 및 40은 각각 인간 아르기나제 2 및 아르기나제 1의 상응하는 “핫스팟” 영역이다.
서열번호 41 내지 44는 각각 인간 아르기나제 1로부터 유래된 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
서열번호 45 내지 50은 각각 쥐 아르기나제 2로부터 유래된 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
서열번호 51은 전장 인간 아르기나제 2의 아미노산 서열이다.
서열번호 52는 전장 쥐 아르기나제 2의 아미노산 서열이다.
서열번호 53은 전장 인간 아르기나제 1의 아미노산 서열이다.
서열번호 54 내지 56은 각각 인간 아르기나제 2로부터 유래된 폴리펩티드의 아미노산 서열이며, 이는 서열번호 2(Arg2_1)의 폴리펩티드 내에서 예측된 HLA-A2 또는 A3 에피토프의 서열에 상응한다.
서열번호 57 내지 59는 각각 서열번호 54 내지 56의 에피토프 중 적어도 하나를 포함하는 인간 아르기나제 2로부터 유래된 추가 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
서열번호 60 내지 61은 각각 서열번호 39의 “핫스팟” 영역으로부터의 서열을 포함하는 인간 아르기나제 2로부터 유래된 추가 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
서열번호 62는 인간 아르기나제 2의 예측된 신호 서열이다.

개시된 물질 및 방법의 상이한 적용이 이 기술 분야의 특정 요구에 맞춰질 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 본 발명의 특정 구체예를 설명하기 위한 것일 뿐이며, 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다.

추가로, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수 형태 “a”, “an” 및 “the”는 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, “폴리펩티드”에 대한 언급은 “폴리펩티드들” 등을 포함한다.

“폴리펩티드”는 2개 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체(analogs), 또는 다른 펩티드모방체(peptidomimetics)의 화합물을 지칭하기 위해 가장 넓은 의미로 본원에서 사용된다. 따라서 용어 “폴리펩티드”는 짧은 펩티드 서열 및 더 긴 폴리펩티드 및 단백질도 포함한다. 본원에서 사용된 용어 “아미노산”은 D 또는 L 광학 이성질체, 및 아미노산 유사체 및 펩티드모방체를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다.

용어 “환자” 및 “개체”는 상호교환적으로 사용되며, 일반적으로 인간을 지칭한다.

본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 상기 또는 하기에 관계없이 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.

본 발명자들은 트랜짓 펩티드의 C-말단에 걸쳐있는 인간 아르기나제 2의 영역이 특히 면역원성임을 확인하였다. 트랜짓 펩티드의 C-말단 잔기는 서열번호 51의 22번 위치에 상응한다. 따라서, 트랜짓 펩티드의 C-말단에 걸쳐있는 영역은 적어도 서열번호 51의 21, 22 및 23번 위치의 아미노산을 포함한다.

본원에서 “면역원성(immunogenic)”은 폴리펩티드가 아르기나제 2 단백질에 대한 면역 반응을, 바람직하게는 상기 단백질이 아르기나제 2 단백질을 발현하는 세포 내에 또는 그 위에 존재할 때, 유발할 수 있음을 의미한다. 다시 말해서, 상기 폴리펩티드는 아르기나제 2에 대한 면역원성으로 설명될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 대안적으로 아르기나제 2의 면역원성 단편으로 설명될 수 있다. 면역 반응은 바람직하게는 T 세포 반응이므로, 상기 폴리펩티드는 T 세포 에피토프를 포함하는 아르기나제 2의 면역원성 단편으로 설명될 수 있다. 면역 반응은 적어도 하나의 개인에서(또는 개인으로부터 채취한 샘플에서) 상기 개인(또는 상기 샘플)에게 상기 폴리펩티드의 투여 후에 검출될 수 있다.

폴리펩티드는 시험관 내(in vitro) 방법을 포함하는 임의의 적합한 방법을 사용하여 면역원성으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 하기 특징 중 적어도 하나를 갖는 경우 면역원성으로 확인될 수 있다:

(i) ELISPOT 분석에 의해 결정된 건강한 개체 및/또는 암 환자의 PBL 집단에서 IFN-γ 생산 세포를 유발할 수 있고, 및/또는

(ii) 아르기나제 2와 반응성인 CTL의 종양 조직 샘플에서 원위치(in situ) 검출이 가능하고; 및/또는

(iii) 특이적 T-세포의 시험관 내(in vitro) 성장을 유도할 수 있다.

폴리펩티드가 면역원성인지 여부를 결정하기 위한 적합한 방법은 하기 실시예 섹션에서도 설명된다.

본 발명의 폴리펩티드는 (i) 적어도 서열번호 51의 21, 22 및 23번 위치의 아미노산을 포함하거나, 또는 (ii) 서열번호 51의 180-229번 위치로부터 선택된, 서열번호 51의 적어도 9개의 연속적인 아미노산의 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 인간 아르기나제 2(서열번호 51)의 면역원성 단편이다. 상기 폴리펩티드는 상기 (i) 또는 (ii)에서 정의된 바와 같은 서열번호 51의 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개까지의 연속적인 아미노산을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열번호 59, 58, 57, 54, 55, 56, 2, 3, 19, 20, 21, 60 또는 61 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 상기 폴리펩티드는 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 아미노산의 최대 길이를 갖거나 및/또는 C-말단 아미노산이 상응하는 아미드로 대체될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 분리된 것일 수 있다.

폴리펩티드는 바람직하게는 적어도 서열번호 51의 21, 22 및 23번 위치의 아미노산, 즉 서열 KSV를 포함하는 서열번호 51의 적어도 9개의 연속적인 아미노산의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 서열번호 51의 적어도 9개의 연속적인 아미노산은 바람직하게는 서열번호 54 (ILKKSVHSVA), 서열번호 55 (ILKKSVHSV) 또는 서열번호 56 (SILKKSVHSV)의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 서열번호 54, 55 또는 56의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 이들 서열을 포함하는 서열번호 51의 더 긴 폴리펩티드 단편이 특히 바람직하다. 예를 들어, 본 발명은 서열번호 51의 50개까지의 연속적인 아미노산의 폴리펩티드를 제공하며, 상기 연속적인 아미노산은 서열번호 54, 55 또는 56 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 이 유형의 예시적인 폴리펩티드는 서열번호 2, 3, 57, 58, 또는 59 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드이다. 서열번호 59, 58 및 57 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드가 바람직하다. 서열번호 59의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드가 특히 바람직하다.

본원에 설명된 임의의 폴리펩티드에서, 아미노산 서열은 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개(즉 최대 5개) 추가, 결실 또는 치환에 의해 변형될 수 있으며, 단, 변형된 서열을 갖는 폴리펩티드는 변형되지 않은 서열을 갖는 폴리펩티드와 비교하여 아르기나제 2에 대한 동일하거나 증가된 면역원성을 나타낸다. “동일한”이라는 것은 변형된 서열의 폴리펩티드가 변형되지 않은 서열의 폴리펩티드와 비교하여 아르기나제 2에 대한 유의적으로 감소된 면역원성을 나타내지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 서열 간의 면역원성의 비교는 동일한 분석을 사용하여 수행되어야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 폴리펩티드 서열에 대한 변형은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다. 보존적 치환은 아미노산을 유사한 화학적 구조, 유사한 화학적 특성 또는 유사한 측쇄 부피의 다른 아미노산으로 대체한다. 도입된 아미노산은 그들이 대체하는 아미노산과 유사한 극성, 친수성, 소수성, 염기성, 산성, 중성 또는 전하를 가질 수 있다. 대안적으로, 보존적 치환은 기존의 방향족 또는 지방족 아미노산 대신 방향족 또는 지방족인 또 다른 아미노산을 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 변화는 당업계에 잘 알려져 있으며, 아래 표 A1에 정의된 20개의 주요 아미노산의 특성에 따라 선택될 수 있다. 아미노산이 유사한 극성을 갖는 경우, 이는 표 A2의 아미노산 측쇄에 대한 소수성 척도(hydropathy scale)를 참조하여 결정될 수 있다.

표 A1 - 아미노산의 화학적 특성

표 A2 - 소수성 척도(Hydropathy scale)

본원에 개시된 임의의 폴리펩티드에서, 물리화학적 특성(예: 안정성)을 개선하기 위해 임의의 하나 이상의 하기 변형이 이루어질 수 있으며, 단, 폴리펩티드는 변형되지 않은 서열을 갖는 폴리펩티드와 비교하여 아르기나제 2에 대한 동일하거나 증가된 면역원성을 나타낸다:

a) C-말단 아미노산을 상응하는 아미드로 대체(카르복시펩티다제에 대한 저항성을 증가시킬 수 있음);

b) N-말단 아미노산을 상응하는 아실화된 아미노산으로 대체(아미노펩티다제에 대한 저항성을 증가시킬 수 있음);

c) 하나 이상의 아미노산을 상응하는 메틸화된 아미노산으로 대체(단백질 분해 저항성을 개선시킬 수 있음);

d) 하나 이상의 아미노산을 D-배열에서 상응하는 아미노산으로 대체(단백질 분해 저항성을 개선시킬 수 있음).

본원에 개시된 임의의 폴리펩티드는 용해도, 안정성을 개선하거나 및/또는 제조/분리를 돕기 위해 N 및/또는 C 말단에 적어도 하나의 추가 모이어티를 부착할 수 있으며, 단, 상기 폴리펩티드는 추가 모이어티가 결여된 폴리펩티드와 비교하여 아르기나제 2에 대한 동일하거나 증가된 면역원성을 나타낸다. 적합한 모이어티는 친수성 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 아미노산 서열 KK, KR 또는 RR은 N 말단 및/또는 C 말단에 추가될 수 있다. 다른 적합한 모이어티는 알부민 또는 PEG(폴리에틸렌 글리콜)을 포함한다.

본원에 개시된 폴리펩티드는 임의의 적절한 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 당업계에 공지된 표준 기술, 예컨대 Fmoc 고체상 화학, Boc 고체상 화학을 사용하거나 또는 용액상 펩티드 합성에 의해 직접 합성될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 벡터로 세포, 전형적으로 박테리아 세포를 형질전환시킴으로써 생산될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 그러한 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

용어 “핵산 분자” 및 “폴리뉴클레오티드”는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이의 유사체와 같은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예는 유전자, 유전자 단편, 메신저 RNA (mRNA), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 분리되거나 실질적으로 분리된 형태로 제공될 수 있다. 실질적으로 분리된다는 것은 임의의 주변 배지로부터 폴리펩티드의 실질적이지만 전체가 아닌 분리가 있을 수 있음을 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 의도된 용도를 방해하지 않을 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있고 여전히 실질적으로 분리된 것으로 간주될 수 있다. 선택된 폴리펩티드를 “코딩하는” 핵산 서열은 적절한 조절 서열의 제어 하에 배치될 때, 예를 들어 발현 벡터에서, 생체 내(in vivo)에서 전사되고(DNA의 경우) 폴리펩티드로 번역되는(mRNA의 경우) 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단의 시작 코돈과 3' (카르복시) 말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 본 발명의 목적을 위해, 이러한 핵산 서열은 바이러스, 원핵 또는 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 바이러스 또는 원핵 DNA 또는 RNA로부터의 게놈 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 전사 종결 서열은 코딩 서열의 3'에 위치될 수 있다.

폴리뉴클레오티드는 Sambrook et al.(1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)에 예를 들어 설명된 바와 같이 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 합성될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 삽입된 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 발현 카세트의 형태로 제공될 수 있으며, 따라서 생체 내(in vivo)에서 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 가능하게 한다. 이들 발현 카세트는, 차례로, 일반적으로 벡터(예: 플라스미드 또는 재조합 바이러스 벡터) 내에 제공된다. 이러한 발현 카세트는 숙주 개체에게 직접 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 숙주 개체에게 투여될 수 있다. 바람직하게는 폴리뉴클레오티드는 유전적 벡터를 사용하여 제조 및/또는 투여된다. 적합한 벡터는 충분한 양의 유전 정보를 수송할 수 있고 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 가능하게 할 수 있는 임의의 벡터일 수 있다.

따라서 본 발명은 이러한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 이러한 발현 벡터는 분자 생물학 분야에서 일상적으로 구축되며, 예를 들어 플라스미드 DNA 및 적절한 개시제, 프로모터, 인핸서 및 기타 요소, 예를 들어 본 발명의 펩티드의 발현을 가능하게 하기 위하여, 필요할 수 있고 올바른 방향(correct orientation)으로 위치한 폴리아데닐화 신호의 사용을 수반할 수 있다. 다른 적합한 벡터는 당업자에게 명백할 것이다. 이와 관련된 추가 예로서 Sambrook et al.를 참조한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 발현하도록 변형된 세포를 포함한다. 이러한 세포는 전형적으로 박테리아 세포, 예를 들어 대장균(E. coli)과 같은 원핵 세포를 포함한다. 이러한 세포는 일상적인 방법을 사용하여 배양되어 본 발명의 폴리펩티드를 생산할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 실질적으로 분리된 형태일 수 있다. 이는 의도된 용도를 방해하지 않는 담체, 보존제 또는 희석제(하기에 논의됨) 및/또는 아쥬반트(또한 하기에 논의됨)와 혼합되어 여전히 실질적으로 분리된 것으로 간주될 수 있다. 이는 또한 실질적으로 정제된 형태일 수 있고, 이 경우 이는 일반적으로 제제에서 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 98% 또는 99%의 단백질을 포함할 것이다.

폴리펩티드를 포함하는 조성물

또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드, 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체, 보존제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 담체, 보존제 및 부형제는 조성물의 다른 성분과 양립할 수 있고 조성물이 투여될 개체에게 해롭지 않다는 의미에서 '허용가능한' 것이어야 한다. 일반적으로, 모든 구성요소와 최종 조성은 무균이며 발열원이 없다. 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 바람직하게는 아쥬반트(adjuvant)를 포함할 수 있다.

아쥬반트는 조성물로의 혼합물이 조성물에 의해 유발되는 면역 반응을 증가시키거나 달리 변형시키는 임의의 물질이다. 광범위하게 정의된 아쥬반트는 면역 반응을 촉진시키는 물질이다. 아쥬반트는 또한 바람직하게는 투여 부위로부터 활성제의 느리고 지속적인 방출을 초래한다는 점에서 저장소 효과(depot effect)를 가질 수 있다. 아쥬반트의 일반적인 논의는 Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (2nd edition, 1986)의 61-63 페이지에서 제공된다.

아쥬반트는 AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4 (SO4), 실리카, 알룸(alum), Al(OH)3, Ca3 (PO4)2, 카올린(kaolin), 탄소(carbon), 수산화알루미늄(aluminum hydroxide), 무라밀 디펩티드(muramyl dipeptides), N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-DMP), N-아세틸-노르누라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (CGP 11687, 이는 nor-MDP로도 지칭됨), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'2'-디팔미토일-sn -글리세로-3-히드록스포스포릴옥시)-에틸아민 (CGP 19835A, 이는 MTP-PE로도 지칭됨), 2% 스쿠알렌/Tween-80.RTM. 에멀젼 중 RIBI (MPL+TDM+CWS), 리포폴리사카라이드 및 리피드 A를 포함하는 이의 다양한 유도체, FCA (Freund's Complete Adjuvant), FIA (Freund´s Incomplete Adjuvants), 머크 아쥬반트 65(Merck Adjuvant 65), 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, 폴리 IC 및 폴리 AU 산), 결핵균으로부터의 왁스 D, 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 및 브루셀라(Brucella) 속의 멤버에서 발견되는 물질, 티터맥스(Titermax), ISCOMS, Quil A, ALUN (US 58767 및 5,554,372 참조), 리피드 A 유도체, 콜레라독소 유도체, HSP 유도체, LPS 유도체, 합성 펩티드 매트릭스 또는 GMDP, 인터류킨 1, 인터류킨 2, 몬타니드(Montanide) ISA-51 및 QS-21로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다양한 사포닌 추출물도 면역원성 조성물에서 아쥬반트로서 유용한 것으로 제안된 바 있다. 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)도 아쥬반트로서 사용될 수 있다.

본 발명과 함께 사용되는 바람직한 아쥬반트는 오일/계면활성제 기반 아쥬반트, 예컨대 몬타니드 아쥬반트(Seppic, Belgium에서 이용가능함), 바람직하게는 몬타니드 ISA-51를 포함한다. 다른 바람직한 아쥬반트는 박테리아 DNA 기반 아쥬반트, 예컨대 CpG 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 아쥬반트이다. 또 다른 바람직한 아쥬반트는 바이러스 dsRNA 기반 아쥬반트, 예컨대 폴리 I:C이다. GM-CSF 및 이미다조키닐린(Imidazochinilines)도 바람직한 아쥬반트의 예이다.

아쥬반트는 가장 바람직하게는 몬타니드 ISA 아쥬반트이다. 몬타니드 ISA 아쥬반트는 바람직하게는 몬타니드 ISA 51 또는 몬타니드 ISA 720이다.

Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (2nd edition, 1986)의 61-63 페이지에서, 관심있는 항원이 저분자량이거나 면역원성이 좋지 않은 경우, 면역원성 담체에 커플링하는 것이 권장된다는 점에 주목한다. 따라서 본 발명의 폴리펩티드는 담체에 커플링될 수 있다. 담체는 아쥬반트와 독립적으로 존재할 수 있다. 담체의 기능은 예를 들어 폴리펩티드 단편의 분자량을 증가시켜 활성 또는 면역원성을 증가시키거나, 안정성을 부여하거나, 생물학적 활성을 증가시키거나, 또는 혈청 반감기를 증가시키는 것일 수 있다. 또한, 담체는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 T-세포에 제시하는 것을 도울 수 있다. 따라서, 조성물에서, 폴리펩티드는 하기에 기재된 바와 같은 담체와 결합될 수 있다.

상기 담체는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 담체, 예를 들어 단백질 또는 수지상세포(dendritic cell, DC)와 같은 항원 제시 세포(antigen presenting cell)일 수 있다. 담체 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 트렌스페린(transferrin), 소태아 혈청(bovine serum albumin), 인간 혈청 알부민(human serum albumin), 갑상선글로불린(thyroglobulin) 또는 오브알브민(ovalbumin)과 같은 혈청 단백질, 면역글로불린(immunoglobulins), 또는 인슐린(insulin)과 같은 호르몬 또는 팔미트산을 포함한다. 대안적으로 담체 단백질은 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid) 또는 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid)일 수 있다. 대안적으로, 담체는 세파로스(sepharose)와 같은 덱스트란(dextran)일 수 있다. 담체는 인간에게 생리적으로 적합하고 안전해야한다.

조성물이 부형제를 포함하는 경우, 조성물의 다른 성분과 양립할 수 있고 이의 수령자에게 해롭지 않다는 의미에서 '약학적으로 허용가능한' 것이어야 한다. 부형제에는 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질(auxiliary substances)이 존재할 수 있다. 이들 부형제 및 보조 물질은 일반적으로 조성물을 받아들이는 개인에서 면역 반응을 유도하지 않는 약학적 제제이며, 이는 과도한 독성 없이 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 물, 식염수(saline), 폴리에틸렌글리콜, 히알루론산(hyaluronic acid), 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 약학적으로 허용가능한 염에는, 예를 들어, 염산염(hydrochlorides), 브롬화수소산염(hydrobromides), 인산염, 황산염 등과 같은 무기산 염(mineral acid salts); 및 아세트산염, 프로피온산염, 말산염, 벤조산염 등과 같은 유기산의 염이 포함될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제, 비히클 및 보조 물질에 대한 철저한 논의는 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)에서 알 수 있다.

적합한 조성물의 제형은 표준 약학적 제형 화학 및 방법론을 사용하여 수행될 수 있으며, 이들 모두는 합리적 숙련된 기술자가 쉽게 이용할 수 있다. 이러한 조성물은 볼루스(bolus) 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 주사 가능한 조성물은 앰플과 같은 단위 투여 형태로 또는 선택적으로 보존제를 함유하는 다중-용량 용기로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 조성물은 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 내 에멀젼, 페이스트, 및 이식가능한 서방형 또는 생분해성 제형을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 조성물의 일 구체예에서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 투여 전에 적합한 비히클(예: 발열성 물질이 없는(pyrogen-free) 멸균수)과의 재구성을 위하여 건조된(예: 분말 또는 과립) 형태로 제공된다. 조성물은 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 이 현탁액 또는 용액은 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있으며, 활성 성분 이외에, 본원에 설명된 아쥬반트, 부형제 및 보조 물질과 같은 추가 성분을 포함할 수 있다. 이러한 멸균 주사 가능한 제형은 비독성의 비경구적으로-허용가능한 희석제 또는 용매, 예컨대 물 또는 1,3-부탄디올을 예를 들어 사용하여 제조될 수 있다. 다른 허용가능한 희석제 및 용매는 링거 용액(Ringer's solution), 등장성 염화나트륨 용액(isotonic sodium chloride solution), 및 합성 모노- 또는 디-글리세라이드(synthetic mono-or di-glyceride)와 같은 고정 오일(fixed oil)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 유용한 다른 조성물은 활성 성분을 미정질(microcrystalline) 형태에, 리포좀 제제에, 또는 생분해성 중합체 시스템의 구성성분으로서 포함하는 것들을 포함한다. 서방형 또는 이식용 조성물은 에멀젼, 이온 교환 수지, 난용성 중합체(sparingly soluble polymer), 또는 난용성 염(sparingly soluble salt)과 같은 약학적으로 허용가능한 중합체성(polymeric) 또는 소수성 물질을 포함할 수 있다. 대안적으로, 조성물의 활성 성분은 미립자 담체(particulate carrier)와 캡슐화, 흡착 또는 결합될 수 있다. 적합한 미립자 담체는 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate) 중합체로부터 유래된 것, 뿐만 아니라 폴리락타이드(poly(lactides)) 및 폴리락티드-글리코리드 공중합체(poly(lactide-co- glycolides))으로부터 유래된 PLG 미세입자를 포함한다. 예를 들어, Jeffery et al. (1993) Pharm. Res.10:362-368 참조. 기타 미립자 시스템 및 중합체는 예를 들어, 폴리리신(polylysine), 폴리아르기닌(polyarginine), 폴리오르니틴(polyornithine), 스페르민(spermine), 스페르미딘(spermidine), 뿐만 아니라 이들 분자의 컨쥬게이트(conjugates)와 같은 중합체도 사용될 수 있다.

사용 방법

본 발명의 폴리펩티드 또는 조성물은 개체에서 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 조성물은 개체에서 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. 상기 방법은 상기 폴리펩티드 또는 상기 조성물을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 투여는 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양의 상기 폴리펩티드 또는 상기 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것일 수 있다.

상기 질병 또는 상태는 적어도 부분적으로 아르기나제 2의 부적절하거나 과도한 면역 억제 기능을 특징으로 할 수 있다. 상기 질병 또는 상태는 암, 바람직하게는 아르기나제 2를 발현하거나 및/또는 아르기나제 2의 부적절하거나 과도한 면역 억제 기능과 연관된 암일 수 있다. 상기 암은 신장암, 전립선암, 유방암, 뇌암, 두경부암 또는 소장암이거나, 결장직장암 또는 위암이거나, 흑색종이거나, 백혈병, 바람직하게는 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML) 또는 만성 림프구성 백혈병(Chronic lymphocytic leukemia, CLL)일 수 있다. 상기 암은 다른 암 요법에 내성이 있을 수 있고, 특히 이는 항-PD1 요법과 같은 면역계 체크포인트 억제제에 내성이 있을 수 있다.

상기 방법은 추가 암 요법의 동시 또는 순차적 투여를 포함할 수 있다. 상기 추가 암 요법은 사이토카인 요법, T-세포 요법, NK 요법, 면역계 체크포인트 억제제, 화학요법, 방사선요법, 면역자극 물질(예컨대 추가 백신), 또는 유전자 요법으로부터 선택될 수 있다.

면역계 체크포인트 억제제는 추가 암 요법으로 특히 바람직하다. 아르기나제 2에 대한 백신접종은 면역계 체크포인트의 억제와 조합할 때 상승 효과를 가질 수 있다. 면역계 체크포인트의 예는 하기를 포함한다:

a) 인돌아민 2,3-디옥시게나제(Indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO1)와 그 기질 사이의 상호작용;

b) PD1과 PDL1 및/또는 PD1과 PDL2 간의 상호작용;

c) CTLA4와 CD86 및/또는 CTLA4와 CD80 간의 상호작용;

d) B7-H3 및/또는 B7-H4와 이들 각각의 리간드 간의 상호작용;

e) HVEM과 BTLA 간의 상호작용;

f) GAL9과 TIM3 간의 상호작용;

g) MHC 클래스 I 또는 II와 LAG3 간의 상호작용; 및

h) MHC 클래스 I 또는 II와 KIR 간의 상호작용.

체크포인트 (a), (b) 및 (c)의 억제는 추가 암 요법으로 특히 바람직하다.

체크포인트 억제제는 면역계 체크포인트를 차단 또는 억제하는 임의의 면역조절 제제(예컨대 항체)이거나, 면역계 체크포인트의 구성요소 또는 상기 구성요소의 면역원성 단편을 포함하는 면역치료 조성물일 수 있으며, 이는 면역계에 의한 체크포인트의 표적화를 자극한다.

상기 추가 암 요법은 항체일 수 있다.

상기 항체는 아바고보맙(Abagovomab), 압식시맙(Abciximab), 악토주맙(Actoxumab), 아달리무맙(Adalimumab), 아데카투무맙(Adecatumumab), 아펠리모맙(Afelimomab), 아푸투주맙(Afutuzumab), 알라시주맙 페골(Alacizumab pegol), ALD518, 알렘투주맙(Alemtuzumab), 알리로쿠맙(Alirocumab), 알투모맙 펜테테이트(Altumomab pentetate), 아마투시맙(Amatuximab), 아나투모맙 마페나톡스(Anatumomab mafenatox), 안루킨주맙(Anrukinzumab), 아포리주맙(Apolizumab), 아르시투모맙(Arcitumomab), 아셀리주맙(Aselizumab), 아티누맙(Atinumab), 아틀리주맙(Atlizumab) (= 토실리주맙(tocilizumab)), 아토롤리무맙(Atorolimumab), 바피뉴주맙(Bapineuzumab), 바실릭시맙(Basiliximab), 바비툭시맙(Bavituximab), 벡투모맙(Bectumomab), 벨리무맙(Belimumab), 벤랄리주맙(Benralizumab), 베르틸리무맙(Bertilimumab), 베실레소맙(Besilesomab), 베바시주맙(Bevacizumab), 베즐로톡주맙(Bezlotoxumab), 비시로맙(Biciromab), 비마그루맙(Bimagrumab), 비바투주맙 메르탄신(Bivatuzumab mertansine), 블리나투모맙(Blinatumomab), 블로소주맙(Blosozumab), 브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab vedotin), 브리아키누맙(Briakinumab), 브로달루맙(Brodalumab), 카나키누맙(Canakinumab), 칸투주맙 메르탄신(Cantuzumab mertansine), 칸투주맙 라브탄신(Cantuzumab ravtansine), 카플라시주맙(Caplacizumab), 카프로맙 펜데티드(Capromab pendetide), 카를루맙(Carlumab), 카투막소맙(Catumaxomab), CC49, 세달리주맙(Cedelizumab), 세르톨리주맙 페골(Certolizumab pegol), 세툭시맙(Cetuximab), Ch.14.18, 시타투주맙 보가톡스(Citatuzumab bogatox), 식수투무맙(Cixutumumab), 클라자키주맙(Clazakizumab), 클레놀릭시맙(Clenoliximab), 클리바투주맙 테트라제탄(Clivatuzumab tetraxetan), 코나투무맙(Conatumumab), 콘시주맙(Concizumab), 크레네주맙(Crenezumab), CR6261, 다세투주맙(Dacetuzumab), 다클리주맙(Daclizumab), 달로투주맙(Dalotuzumab), 다라투무맙(Daratumumab), 뎀시주맙(Demcizumab), 데노수맙(Denosumab), 데투모맙(Detumomab), 돌리모맙 아리톡스(Dorlimomab aritox), 드로지투맙(Drozitumab), 둘리고투맙(Duligotumab), 두필루맙(Dupilumab), 두시지투맙(Dusigitumab), 에크로멕시맙(Ecromeximab), 에쿨리주맙(Eculizumab), 에도바코맙(Edobacomab), 에드레콜로맙(Edrecolomab), 에팔리주맙(Efalizumab), 에푼구맙(Efungumab), 엘로투주맙(Elotuzumab) 엘실리모맙(Elsilimomab), 에나바투주맙(Enavatuzumab), 엔리모맙 페골(Enlimomab pegol), 에노키주맙(Enokizumab), 에노티쿠맙(Enoticumab), 엔시툭시맙(Ensituximab), 에피투모맙 시투제탄(Epitumomab cituxetan), 에프라투주맙(Epratuzumab), 에를리주맙(Erlizumab), 에르투막소맙(Ertumaxomab), 에타라시주맙(Etaracizumab), 에트롤리주맙(Etrolizumab), 에볼로쿠맙(Evolocumab), 엑스비비루맙(Exbivirumab), 파놀레소맙(Fanolesomab), 파랄리모맙(Faralimomab) 팔레투주맙(Farletuzumab), 파시누맙(Fasinumab), FBTA05, 펠비주맙(Felvizumab), 페자키누맙(Fezakinumab), 피클라투주맙(Ficlatuzumab), 피지투무맙(Figitumumab), 플란보투맙(Flanvotumab), 폰톨리주맙(Fontolizumab), 포랄루맙(Foralumab), 포라비루맙(Foravirumab), 프레솔리무맙(Fresolimumab), 풀라누맙(Fulranumab), 푸툭시맙(Futuximab), 갈릭시맙(Galiximab), 가니투맙(Ganitumab), 간테네루맙(Gantenerumab), 가빌리모맙(Gavilimomab), 겜투주맙 오조가미신(Gemtuzumab ozogamicin), 게보키주맙(Gevokizumab), 기렌툭시맙(Girentuximab), 글렘바투무맙 베도틴(Glembatumumab vedotin), 골리무맙(Golimumab), 고밀릭시맙(Gomiliximab),GS6624, 이발리주맙(Ibalizumab), 이브리투모맙 티우제탄(Ibritumomab tiuxetan), 이크루쿠맙(Icrucumab), 이고보맙(Igovomab), 임시로맙(Imciromab), 임가투주맙(Imgatuzumab), 인클라쿠맙(Inclacumab), 인다툭시맙 라브탄신(Indatuximab ravtansine), 인플릭시맙(Infliximab), 인테투무맙(Intetumumab), 이놀리모맙(Inolimomab), 이노투주맙 오조가미신(Inotuzumab ozogamicin), 이필리무맙(Ipilimumab), 이라투무맙(Iratumumab), 이톨리주맙(Itolizumab), 이제키주맙(Ixekizumab), 켈릭시맙(Keliximab), 라베투주맙(Labetuzumab), 람팔리주맙(Lampalizumab), 레브리키주맙(Lebrikizumab), 레말레소맙(Lemalesomab), 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바람직한 항체는 나탈리주맙, 베돌리주맙, 벨리무맙, 아타시셉트(Atacicept), 알레파셉트(Alefacept), 오텔릭시주맙, 테플리주맙, 리툭시맙, 오파투무맙, 오크렐리주맙, 에프라투주맙, 알렘투주맙, 아바타셉트(Abatacept), 에쿨리주맙, 오말리주맙, 카나키누맙, 메플리주맙(Meplizumab), 레슬리주맙, 토실리주맙, 우스테키누맙, 브리아키누맙, 에타너셉트(Etanercept), 인플릭시맙(Inlfliximab), 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 골리무맙, 트라스투주맙, 겜투주맙 오조가미신, 이브리투모맙 티우제탄, 토스티투모맙(Tostitumomab), 세툭시맙, 베바시주맙, 파니투무맙, 데노수맙, 이필리무맙, 브렌툭시맙 및 베도틴을 포함한다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 특히 바람직한 항체는 다라투무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아벨루맙(avelumab), 리툭시맙, 트라스트주맙, 페르트주맙, 알렘투주맙, 세툭시맙, 파니투무맙, 토시투모맙 및 오파투무맙을 포함한다. 다라투무맙이 특히 바람직하다. 니볼루맙 및 펨브롤리주맙과 같은 항-PD1 항체도 특히 바람직하다.

추가 암 요법은 악티미드(Actimide), 아자시티딘(Azacitidine), 아자티오프린(Azathioprine), 블레오마이신(Bleomycin), 카르보플라틴(Carboplatin), 카페시타빈(Capecitabine), 시스플라틴(Cisplatin), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 시타라빈(Cytarabine), 다우노-루비신(Dauno-rubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 독시플루리딘(Doxifluridine), 독소루비신(Doxorubicin), 에피루비신(Epirubicin), 에토포시드(Etoposide), 플루다라빈(Fludarabine), 플루오로우라실(Fluor-ouracil), 겜시타빈(Gemcitabine), 히드록시우레아(Hydroxyurea), 이다루비신(Idarubicin), 이리노테칸(Irinotecan), 레날리도미드(Lenalidomide), 류코보린(Leucovorin), 메클로레타민(Mechlorethamine), 멜파란(Melphalan), 메르캅토퓨린(Mercaptopurine), 메토트레세이트(Methotrexate), 미톡산트론(Mitoxantrone), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 페메트렉세드(Pemetrexed), 레블리미드(Revlimid), 테모졸로미드(Temozolomide), 테니포시드(Teniposide), 티오구아닌(Thioguanine), 발루비신(Valrubicin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine) 및 비노렐빈(Vinorelbine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 조성물은 또한 CD4 및 CD8 T-세포와 같은 아르기나제 1-특이적 T 세포를 자극하는 방법에 사용될 수 있으며, 상기 방법은 세포를 상기 폴리펩티드 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 생체 외(ex vivo)에서 수행될 수 있다. 상기 세포는 건강한 개체 또는 암 환자로부터 채취한 샘플, 예컨대 종양 샘플에 존재할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이것이 보호 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 전술한 설명 및 하기 실시예에 개시된 특징은 개별적으로 그리고 이들의 임의의 조합으로 본 발명을 다양한 형태로 실현하기 위한 재료일 수 있다.

실시예 1

재료 및 방법

환자 물질

건강한 기증자의 PBMC는 Lymphoprep™ (STEMCELL Technologies)를 통한 밀도 구배 분리를 사용하여 분리하고, 10% DMSO가 보충된 FBS에서 -150°C에서 저온 보존하였다. 암 환자의 PBMC는 임의의 항암 요법 종료 후 최소 4주 후에 혈액 샘플에서 분리하였다. 이 프로토콜은 덴마크 수도 지역 과학 윤리위원회(Scientific Ethics Committee for The Capital Region of Denmark)에 의해 승인되었고, 헬싱키선언의 조항에 따라 수행되었다. 연구 시작 전에 환자로부터 서면 동의를 얻었다.

펩티드

펩티드는 표준 방법에 의해 합성하였고 DMSO에 용해시켜 10 mM의 스톡(stock) 농도를 얻었다. 이 실험에서 사용된 펩티드의 서열은 “서열”이라는 제목의 섹션에 나타냈다. 펩티드는 서열번호, 명칭, 또는 아르기나제 2의 전장 서열 내에 각 펩티드 서열의 시작 및 끝 위치를 참조하여 설명되었다. 각각은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 2의 펩티드는 대안적으로 명칭 Arg2_1로 지칭될 수 있고, 또는 대안적으로 Arg2 aa11-30 (시작 위치가 11번이고 끝 위치가 30번인 경우)로 지칭될 수 있다. 각 경우의 의도된 참조는 문맥에서 명확해질 것이다.

ELISPOT 분석

시험관 내(in vitro) ELISPOT을 위해, 암 환자 및 건강한 기증자의 PBMC는 ELISPOT 분석에 사용하기 전 7일 동안 24-웰 플레이트에서 20 μM의 아르기나제 1 유래 펩티드 (또는 대조군으로 펩타이드 없음) 및 120 U/ml IL-2로 펄싱되었다. 세포를 IFNγ 포획 항체(Mabtech)로 사전-코팅된 96-웰 니트로셀룰로오스 ELISPOT 플레이트(MultiScreen MAIP N45; Millipore)에 배치하였다. 아르기나제 펩티드를 5μM의 최종 농도에 첨가하고, 플레이트를 37°C에서 14-16시간 동안 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 후 세포를 씻어내고 2차 비오틴화된 Ab(Mabtech, cat. 3420-6-1000)를 2시간 동안 실온에서 첨가하였다. 결합되지 않은 2차 항체를 씻어내고 스트렙타비딘 접합 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase, AP) (Mabtech, cat. 3310- 10)를 1시간 동안 실온에서 첨가하였다. 결합되지 않은 접합된 효소를 씻어내고, BCIP/NBT 기질(Mabtech, cat. 3650-10)을 첨가하여 분석을 진전시켰다. 진전된 ELISPOT 플레이트는 CTL ImmunoSpot S6 Ultimate-V 분석기에서 Immunospot 소프트웨어 v5.1를 사용하여 분석하였다. 반응은 아르기나제 2로 자극된 웰과 펩티드가 첨가되지 않은 웰의 평균 스팟 수의 차이로 보고하였다.

세포 내 염색

PBMC를 BD GolgiPlug^TM (펩티드 자극의 첫 1시간 후에 추가됨)의 존재 하에 5시간 동안 아르기나제 유래 펩티드로 자극(또는 대조군으로서 펩티드 없이 인큐베이션) 한 후 세포 배양물의 세포 내 염색을 수행하였다. 자극된 세포는 표면 마커(CD3, CD4, CD8)에 대한 형광 표지된 항체로 염색한 다음, 제조사의 지침에 따라 고정/투과 및 투과 완충액(eBioscience, cat. 00-5123-43)을 사용하여 투과시켰다. 투과된 세포는 그 다음 IFNγ 및 TNFα에 대한 형광색소 표지된 항체로 염색하였다. FACSCanto^TM II (BD Biosciences)에서 유세포분석을 수행하였다. 사용된 항체: IFNγ-APC (cat.341117), TNFα-455 BV421 (cat.562783), CD4-FITC (cat.347413), CD8-PerCP (cat.345774), CD3-APC-H7 (cat. 560275) (모두 BD Biosciences에서 제공), 죽은 세포 염색- FVS510 (564406, BD Biosciences), 제조사의 지침에 따름.

결과

아르기나제 1 핫스팟에 기반한 아르기나제 2 펩티드 스크리닝

아르기나제 1의 161-210번 위치에서 이전에 확인된 50개 아미노산 길이의 아르기나제 1 핫스팟 영역을 기반으로, 아르기나제 2에서 상응하는 영역(180-229번 위치)을 커버하는 4개의 펩티드가 테스트를 위해 선택되었다. 이들 펩티드는 Arg2-E17 (aa180-199), Arg2-E18 (aa190-209), Arg2-E19 (aa200-219) 및 Arg2-E20 (210-229)이다 - 아르기나제 1 및 아르기나제 2에 관한 개략도는 도 1을 참조. Arg2-E17은 일상적인 방법으로 합성할 수 없었기 때문에, 나머지 3개의 펩티드로 실험을 수행하였다.

이들 펩티드가 아르기나제 2 반응을 확인하는 데 사용될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 12명의 건강한 기증자와 1명의 암 환자의 PBMC를 IFNγ ELISPOT에서의 반응에 대해 스크리닝했다. PBMC는 아르기나제 2 펩티드 및 저용량 IL-2로 ELISPOT 이전에 1주일 동안 자극시켰다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 펩티드들은 모두 적어도 한 명의 개체로부터의 PBMC에 의해 인식되었다. Arg2-E18은 가장 높고 가장 일관된 반응을 나타냈다.

다른 아르기나제 2 펩티드에 대한 펩티드 라이브러리 스크리닝

전체 아르기나제 2 단백질 서열을 중첩된 20-아미노산-길이의 펩티드(24개 아미노산의 최종 펩티드를 포함)로 나누어, 전체 서열을 커버하는 34개 펩티드의 라이브러리를 생성하였다(서열번호 1-34). 라이브러리의 각 펩티드는 다음 펩티드의 처음 10개 아미노산과 중첩되었다. 이 아르기나제 2 펩티드 라이브러리와 IFNγ ELISPOT 분석을 사용하여, 본 발명자들은 다음으로 6명의 건강한 기증자의 PBMC를 자발적(spontaneous) 반응에 대해 스크리닝했다. PBMC를 1주일 동안 3-4개의 인접한 20-mer 아르기나제 2 라이브러리 펩티드의 풀과 저용량 IL-2 (120 U/mL)로 자극하였다. 그 후 IFNγ ELISPOT 분석에 대해 설정하여 각 20-mer 펩티드에 대한 반응을 개별적으로 스크리닝하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 다음 8개의 펩티드가 가장 높고 가장 풍부한 반응을 나타냈다:

ARG2_1 (aa11-30), ARG2_5 (aa51-70), ARG2_8 (aa81-100), ARG2_13 (aa131-150), ARG2_18 (181-200), ARG2_20 (201-220), ARG2_21 (aa211-230) 및 ARG2_22 (221-240).

Arg2_18, Arg2_20, Arg2_21 및 Arg2_22는 모두 이전에 확인된 핫스팟 영역 내에 포함되거나 중첩되었다. 그러나, 다른 펩티드(가장 높은 반응을 갖는 펩티드, Arg2_1를 포함함)는 아르기나제 2 단백질의 다른 영역으로부터의 것이었다.

라이브러리 스크린의 검증 (핫스팟 영역)

2명의 건강한 기증자의 PBMC를 IFNγ ELISPOT 분석 전에 1주일 동안 단일 펩티드 및 저용량 IL-2 (120 U/mL)로 자극하여 라이브러리 스크린에서 관찰된 반응을 검증하였다.

ARG2_18, ARG2_19, ARG2_20 및 ARG2_21가 각각 이 검증 실험에서 테스트되었고, ARG2-E18, ARG2-E19 및 ARG2-E20도 아르기나제 2의 동일한 영역과 중첩되기 때문에 포함되었다. Arg2-E17은 일상적인 방법으로 합성할 수 없었기 때문에 다시 제외되었다.

6개의 테스트된 펩티드를 아래에 정렬하여 나타냈다:

도 4에 나타낸 바와 같이, 테스트된 펩티드 각각에 대한 반응이 관찰되어, 원래 스크린을 검증하였다. 중첩되는 펩티드 쌍은 ARG2_21 및 ARG2-E20를 제외하고는 거의 동일한 반응을 생성하였으며, ARG2-21에 대해 1명의 건강한 기증자에서 강한 반응이 관찰되었다. 이 실험에서 가장 강력하고 가장 일관된 반응은 ARG2_18로 얻어졌다.

라이브러리 스크린의 검증 (다른 영역)

4명의 건강한 기증자의 PBMC를 IFNγ ELISPOT 분석 전에 1주일 동안 단일 펩티드 및 저용량 IL-2 (120 U/mL)로 자극하여 라이브러리 스크린에서 관찰된 반응을 검증하였다. ARG2_1, ARG2_5, ARG2_13, ARG2_18 및 ARG2_22가 이 검증에서 테스트되었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 특히 Arg2_1에 대해 강력하고 두드러진 반응이 관찰되었다.

따라서 세포 내 사이토카인 염색 분석을 동일한 세포에 사용하여 CD4+ 또는 CD8+ 반응이 존재하는지 여부를 설명하였다. 두 명의 건강한 기증자, Buf-M-01 및 Buf-M-02에 대해, 0.2% 및 0.1% 이중 양성(double positive, DP) CD4+ 세포가 관찰되었으며(도 6A 및 6B의 대표적인 플롯 참조), 이는 이들 기증자에서 ARG2_1에 대한 CD4+ 반응을 시사한다.

ARG2_1에 대한 반응에 대한 암 환자 및 건강한 기증자의 추가 스크리닝

ARG2_1을 사용하여 8명의 흑색종 환자(AA07-AA31), 4명의 전립선암 환자(UR07-27) 및 13명의 건강한 기증자에서 반응을 스크리닝하였다. 각각의 PBMC를 IFNγ ELISPOT 분석 전에 1주일 동안 단일 펩티드 및 저용량 IL-2 (120 U/mL)로 자극하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 테스트된 25명의 기증자 중 15명(60%)에서 유의한 반응이 나타났고, 그 반응은 환자와 건강한 기증자에서 거의 동일하게 강력한 것으로 보인다.

IFNy ELISPOT에서 명확한 반응을 나타낸 PBMC는 세포 내 사이토카인 염색에도 사용되었다. 본 발명자들은 2명의 건강한 기증자의 CD4 세포를 분석하였고, 이들 두 기증자에서 CD4 세포가 ARG2_1에 특이적으로 반응하고 있음을 보여주었다. 또한, 본 발명자들은 전립선암 환자(UR12)의 PBMC 중에 ARG2_1에 대한 CD8+ 반응도 있음을 밝혔다(0.9% CD8+ DP 세포 vs. 대조군의 경우 0.5%) - 도 9 참조. 종합하면, 이러한 ICS 결과는 검출된 ARG2_1 반응이 T-세포 매개이며, 또한 CD4 및 CD8 T 세포 모두에 의해 매개될 수 있음을 나타낸다.

따라서 ARG2_1 내에 HLA-A2 및 HLA-A3 에피토프에 대한 예측은 www.syfpeithi.de 서버를 사용하여 수행되었다. 다음 에피토프는 ARG2_1 서열 내에 존재하는 것으로 예측되었다:

모든 3개의 예측된 에피토프는 서열번호 51의 21, 22 및 23번 위치의 트랜짓 펩티드 경계를 포함한다.

ARG2_1에 대한 반응은 사전-자극(pre-stimulation) 없이도 관찰된다(“생체 외(ex vivo) ELISPOT”)

이전 실험(시험관 내(in vitro) 또는 “간접” IFNy ELISPOT)에서 강력한 반응을 나타낸 암 환자와 3명의 건강한 기증자도 생체 외(ex vivo) ELISPOT에서 테스트되었다. 이는 PBMC가 사전-자극되지 않고 IFNγ ELISPOT 분석 이전에 72시간 동안 +/- Arg2_1 펩티드로 간단히 배양됨을 의미한다. 도 10에 나타낸 바와 같이, ARG2_1에 대한 반응이 검출되었다. 특이적 T-세포 반응이 생체 외(ex vivo)에서 직접적으로 검출 가능하다는 사실은 특히 주목할만하다. 극히 드문 예외를 제외하고는, 테트라머(tetramer) 염색에 의해 또는 ELISPOT에 의해 사전 시험관 내(in vitro) 펩티드 자극 없이 직접적으로 생체 외(ex vivo)에서 PBMC에서 종양 연관 항원-특이적 T 세포를 검출하는 것은 일반적으로 가능하지 않다. 시험관 내(in vitro)에서 사전-자극 단계 없이 비바이러스 항원에 대한 면역 반응을 검출할 수 있는 것은 매우 드문 일이다. 따라서, 이러한 결과는 ARG2_1 서열 및 그 안에 포함된 에피토프의 높은 면역원성을 강조한다. 그러므로 이 데이터는 면역계가 아르기나제 2-발현 세포를 선택적으로 표적하여, 아르기나제 발현의 면역조절 효과를 감소시키고, 그것에 의하여 항-종양 면역 반응을 강화시킬 수 있음을 암시하기 때문에, 이러한 서열은 우수한 백신접종 표적이다. 또한, 이들 데이터는 아르기나제 2-특이적 T 세포(특히 ARG2_1 내의 에피토프(들)을 인식하는 세포)가 면역계에서 자연적인 역할을 한다는 것을 시사한다. 이것은 그러한 서열에 대한 백신접종이 환자에서 독성을 유도하지 않을 가능성이 가장 높다는 것을 암시한다.

논의

암에서 아르기나제 2-발현 세포의 존재는 암-특이적 이펙터 림프구의 증식을 방지하는 면역억제 종양 미세환경에 기여한다. 따라서 이러한 아르기나제 2-발현 세포(종양 세포뿐만 아니라 기타 조절 세포를 포함할 수 있음)를 특이적으로 표적화하는 것은 면역억제 효과를 감소시켜, 암-특이적 이펙터 세포의 활성화 및 증식을 허용함으로써 직접적인 이점 및 간접적인 이점을 가질 것이다. 항암 면역요법이 종종 면역-억제 세포에 의해 길항된다는 점을 감안할 때, 아르기나제 2 에피토프를 표적으로 하는 이 이중 효과는 매우 상승적일 수 있다. 이들 실험은 아르기나제 2에 대한 천연 CD4 및 CD8 T-세포 매개 면역이 존재한다는 것을 보여주었으므로(특히 Arg2_1 서열 내의 에피토프에 대해), 백신접종 설정에서 아르기나제 2를 표적화하는 데 성공할 가능성이 높다.

실시예 2 - 인간 ARG2 펩티드의 추가 조사

재료 및 방법

환자 물질

건강한 기증자의 PBMC는 Lymphoprep™ (Alere)를 통한 밀도 구배 분리를 사용하여 분리하고, 10% DMSO가 보충된 FBS(Life Technologies)에서 -150°C에서 저온 보존하였다. 암 환자의 PBMC는 임의의 항암 요법 종료 후 최소 4주 후에 혈액 샘플에서 분리하였다. AML 환자의 PBMC는 상이한 질병 및 치료 상태에 있는 환자의 혈액 샘플에서 분리하였고, 그러므로 치료 중인 환자를 포함한다. 모든 프로토콜은 덴마크 수도 지역 과학 윤리위원회(Scientific Ethics Committee for The Capital Region of Denmark)에 의해 승인되었고, 헬싱키선언의 조항에 따라 수행되었다. 연구 시작 전에 환자로부터 서면 동의를 얻었다. PBMC는 5% 인간 혈청(Sigma Aldrich)이 보충된 X-vivo (BioNordika)에서 유지되었다.

세포 배양

THP-1은 10% FBS로 보충된 RPMI(Gibco)에서 배양되었다. Set2 세포는 20% FBS와 함께 RPMI에서 배양되었다. OCI-AML-2 세포는 10% FBS와 함께 Alpha-MEM(Life Technologies)에서 배양되었다. MONO-MAC-1 세포는 10% FBS, 1 mM 피루브산나트륨(Life Technologies), 2 mM L-글루타민(Life Technologies) 및 1x 비필수 아미노산(Life Technologies)으로 보충된 RPMI에서 배양되었다. 모든 세포주를 테스트하였고 마이코플라스마(mycoplasma)에 음성으로 확인되었다. 세포는 일주일에 2-3회 계대되었다.

IL-4 (400U/ml), IL-13 (50ng/ml), IFNy (100U/ml) 또는 사이토카인 칵테일 (400U/ml IL-4, 1000U/ml GM-CSF 및 1000U/ml TNFa)을 사용한 사이토카인 자극은 각각의 사이토카인이 보충된 0.5-0.75x10⁶ 세포/mL 배지를 시딩하고 다양한 실험을 위해 세포를 수확하기 전에 48시간 인큐베이션하여 수행하였다. 모든 사이토카인은 Trichem 제품이다.

펩티드

34개의 20mer 펩티드의 ARG2 펩티드 라이브러리는 PepScan에 의해 합성되었고, 면역 반응에 대한 스크리닝을 위해 DMSO에 10 mM로 용해시켰다. 나머지 실험을 위해, ARG2-1을 멸균수에 2 mM로 용해시켰다. 긴 ARG2 펩티드(A2L1, A2L2, A2L3 (서열번호 58, 59, 57))는 Sch

fer에 의해 합성되었고 멸균수에 2 mM로 용해시켰다. 멸균수에 용해된 펩티드는 사용 전에 0.22 μm 필터를 통해 여과하였다. 합성된 펩티드의 순도는 >90%였다. 모든 펩티드 목록은 표 1을 참조한다.

펩티드 자극 및 ELISPOT 분석

건강한 기증자 또는 암 환자의 PBMC를 시험관 내(in vitro)에서 10 μM의 ARG2-유래 펩티드로 자극하여 분석 감도를 향상시켰다. 2일째에, IL-2를 총 120 U/mL IL-2 (Novartis)로 첨가하였다. 7일 후, 4-6x10⁵ PBMC를 IFNy 포획 항체(Mabtech)로 사전-코팅된 ELISPOT 플레이트의 바닥에 위치시켰다. 각 기증자 또는 환자의 PBMC는 펩티드(5 μM ARG2-유래 펩티드) 및 대조군 자극에 대해 3회 또는 4회 반복으로 설정하였다. 세포를 항원의 존재 하에 ELISPOT 플레이트에서 14-16시간 동안 인큐베이션 한 후, 세척하고 2차 비오틴화 항체(Mabtech)를 첨가했다. 2시간 인큐베이션 후, 2차 항체를 씻어내고, 스트렙타비딘 접합된 알칼리 포스파타제(Mabtech)를 1시간 동안 첨가하였다. 그 다음, 결합되지 않은 효소를 씻어내고 BCIP/NBT 기질(Mabtech)을 첨가하여 분석을 진전시켰다. 진전된 ELISPOT 플레이트는 CTL Immunospot S6 Ultimate-V 분석기에서 Immunospot 소프트웨어 버전 5.1를 사용하여 분석하였다. 반응은 ARG2-유래 펩티드로 자극된 웰과 대조군 웰의 평균 스팟 수의 차이로 보고하였다.

ARG2-특이적 T 세포(이펙터 세포) 및 표적 세포로서 다양한 면역 또는 암 세포(표적 세포)를 사용한 ELISPOT 분석은 1-5x10⁴ 이펙터 세포(지시된 바와 같음) 및 1-2.5x10⁴ 표적 세포(지시된 바와 같음)를 ELISPOT 웰의 바닥에 위치시키는 것에 의해 설정하였다. 표적 세포의 펩티드 펄싱(pulsing)은 1시간 동안 20 μM 펩티드로 세포를 인큐베이션 한 후 2회 세척하여 결합되지 않은 펩티드를 제거함으로써 수행되었다. 이 세포들은 양성 대조군으로 사용되었다. 표적 세포 없이 플레이팅된 이펙터 세포는 음성 대조군으로 사용되었다. 모든 조건은 3회 또는 4회 반복으로 설정되었다.

세포 내 사이토카인 염색 분석

세포 배양물의 세포 내 염색은 PBMC에서 시험관 내(in vitro)에서 1주일의 ARG2-유래 펩티드 자극 후에 수행되었다. 분석을 위해, 9x10⁵ PBMC를 BD GolgiPlug^TM의 존재 하에(펩티드 자극의 첫 1시간 후에 추가됨) 5시간 동안 ARG2-유래 펩티드로 재자극(또는 대조군으로서 펩티드 없이 인큐베이션) 하였다. 자극된 세포는 표면 마커(CD3, CD4, CD8)에 대한 형광 표지된 항체로 염색한 다음, 제조사의 지침에 따라 고정/투과 및 투과 완충액(eBioscience, cat. 00-5123-43)을 사용하여 투과시켰다. 투과된 세포는 그 다음 IFNγ 및 TNFα에 대한 형광색소 표지된 항체로 염색하였다. FACSCanto^TM II (BD Biosciences)에서 유세포분석을 수행하였다. 사용된 항체: IFNγ-APC, TNFα-BV421, CD4-PerCP, CD8-FITC, CD3-APC-H7, CD4-FITC, CD8-PerCP, 및 죽은 세포 염색- FVS510 (모두 BD Biosciences에서 제공), 제조사의 지침에 따름. 표적 세포에 대한 반응에서 ARG2-특이적 T 세포의 사이토카인 생성을 검출하기 위한 세포 내 사이토카인 염색을 위해, 5x10⁵ ARG2 특이적 세포를 2.5x10⁵표적 세포와 함께 5시간 동안 인큐베이션 하고, 첫 1시간 후에 GolgiPlug™를 첨가하였다.

ARG2-특이적 T 세포 배양의 확립

ARG2-특이적 T 세포 배양은 조사된(irradiated) ARG2-1 로딩된 자가 유래(autologous) 성숙 수지상세포로 전립선암 환자로부터의 PMBC를 초기 자극하는 것에 의해 확립되었다. 다음날 IL-12 (20U/ml) 및 IL-7 (40U/ml)를 첨가하였다. PBMC를 ARG2-1 펩티드 로딩된 자가 유래 DC로 8일마다 재자극한 후, 다음날 IL-2 (120U/ml)를 첨가하였다. ARG2-특이적 T 세포는 4회 자극 후 IFNy 농축 키트(MiltenyiBiotec)를 사용하여 농축시켰다. 세포를 확장하고 ARG2-특이적 T 세포를 CD4+ 농축 키트(MiltenyiBiotec)를 사용하여 추가로 농축시켰다.

시험관 내(in-vitro) 전사된 mRNA의 생산

ARG2 (NM_001172.4)를 코딩하는 cDNA를 합성하고, BamHI 제한 부위를 사용하여 HLA 클래스 II 표적 플라스미드 pGEM-sig-DC.LAMP (Dr. K. Thielemans, Medical School of the Vrije Universiteit Brussel에 의해 친절히 제공됨)로 클로닝시켰다. pGEM-ARG2-DC-LAMP 플라스미드는 SpeI로 선형화하여 시험관 내(in vitro) 전사를 위한 DNA 주형으로 사용하였다(ref to

M article**).

총 RNA 추출

세포를 수확하고, PBS로 세척하고, 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 세포 펠렛은 RNA 추출까지 얼음에 보관하거나 -80^oC에서 냉동시켰다. 총 RNA는 RNAeasy Plus Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 추출하고, RNA가 없는 물 30 μl에서 최종 용리했다. RNA 농도는 NanoDrop 2000 분광광도계(Thermo Scientific)에서 측정하였다. RNA는 -80^oC에서 보관하였다.

RT-qPCR

총 RNA는 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 역전사되었다. 각 반응에 대해, 1000ng RNA가 역전사되었다. RT-qPCR의 경우, cDNA를 1:5로 희석하고 Roche Lightcycler 480 기기에서 TaqMan 유전자 발현 분석을 사용하여 RT-qPCR 분석을 수행하였다. RT-qPCR은 4회 반복으로 수행하고, 데이터는 하우스키핑 유전자 RPLPO 및 대조군 샘플의 발현 수준에 대한 정규화와 함께 ddCT-방법을 사용하여 분석하였다. 증폭되지 않은 저농도 샘플의 경우, Ct는 40으로 설정되었다. 역전사효소가 없는 대조군(역전사효소 없이 cDNA 반응 설정)은 특이적 증폭의 대조군으로 사용하였다. 이 연구에서 사용된 프라이머 목록은 아래와 같다.

전기천공법

mRNA의 경우, DC 또는 암세포를 전술된 바와 같이 전기천공 파라미터를 사용하여 ARG1-DC-LAMP mRNA, ARG2-DC-LAMP mRNA 또는 eGFP를 코딩하는 대조군 mRNA로 형질감염시켰다. 간단하게, 세포를 Opti-MEM 배지(Thermo Scientific)에서 2회 세척하고, 9-12x106 세포/ml의 최종 세포 농도로 조정하였다. 350 μl 세포 현탁액은 얼음에서 5분 동안 사전인큐베이션 하고, 10 μg mRNA를 첨가하였다. 그 다음 세포 현탁액을 2-mm (암세포) 또는 4-mm (DC) 갭 전기천공 큐벳으로 신속하게 옮기고 전기천공하였다(ref: OM paper). 전기천공 후, 세포를 예열된 배지가 있는 디쉬로 신속하게 옮기고, 다른 실험 분석을 위한 사용 전에 5% CO2로 가습된 분위기에서 인큐베이션 하였다. mRNA 형질감염된 세포는 ELISPOT 분석에서 설정되기 전에 1시간 동안 그대로 두거나 세포 내 사이토카인 염색 분석에서 설정하기 전에 밤새 그대로 두었다. 전기천공 효율은 GFP 형질감염된 세포의 FACS 분석에 의해 형질감염 24시간 후에 결정되었다.

siRNA 매개 ARG2 침묵(silencing)

ARG2를 표적으로 하는 3개의 siRNA 듀플렉스의 세트를 Ambion으로부터 얻었다(ARG2 Silencer Select Validated siRNA, ID s1571, s1572, s1573). siRNA를 뉴클레아제가 없는 물에 0.1 nmol 스톡 용액으로 현탁하고, -80^oC에서 보관하였다. ARG2 침묵 실험을 위해, THP-1 세포를 위에서 설명한 바와 같이 전기천공을 위해 준비하였고, 0.02 nmol siRNA 용액의 작업 용액 10μl를 전술한 바와 같이 형질감염 전에 3개의 siRNA 각각에 첨가하였다. 형질감염 직후, 세포를 예열된 배지로 옮기고, 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 이어서 형질감염된 세포를 2개로 분할하고, 세포의 절반에 사이토카인 칵테일(400U/ml IL-4, 1000U/ml GM-CSF 및 1000U/ml TNFa)을 첨가하였다. 세포를 배지 또는 사이토카인 칵테일을 함유하는 배지에서 48시간 동안 인큐베이션 하고, 세포 내 사이토카인 염색 분석에 설정하였다. RT-qPCR에 의한 넉다운(knock down) 효율의 접근을 위해 48시간 후에 RNA를 위해 세포를 펠렛화하였다.

HLA-DR 발현의 유세포분석

HLA-DR 발현 분석은 mock (사이토카인 없음), IFNy (100U/ml) 또는 사이토카인 칵테일(400U/ml IL-4, 1000U/ml GM-CSF 및 1000U/ml TNFa)로 48시간 동안 자극된 세포에서 수행되었다. 간단하게, 세포를 세척하고 7-AAD (cat: 51-68981E, BD Bioscience) 및 FITC-접합된 마우스 항-인간 HLA-DR, DP, DQ (cat: 5555581, BD Bioscience) 또는 FITC-접합된 마우스 IgG1 K 아이소타입 ctrl (FC) (cat: 400109, BD Bioscience)로 30분 동안 4^oC에서 염색하였다. 과잉 항체를 씻어내고 세포를 FACSCanto™ II 기기에서 분석하였다. HLA-DR 발현 수준은 MHC 클래스 II 염색된 살아있는 세포와 아이소타입 대조군 염색된 살아있는 세포 간의 MFI의 차이로 제공된다.

통계 분석

ELISPOT 반응은 DFR(distribution free resampling) 방법을 사용하여 분석하였다. ELISPOT 반응의 통계 분석은 R studio를 사용하여 수행되었다. ARG2-1 및 A2L2에 대한 반응(특이적 IFNy -분비 세포)의 차이를 0.05의 유의 수준으로 윌콕슨 일치 쌍 부호순위 t 검정(Wilcoxon matched pairs signed ranked t test)(Prism 8을 사용함)의 사용으로 비교하였다. 대조군과 Arg2 백신접종이군 간의 평균 종양 성장에서의 차이의 통계 분석은 Prism 8을 사용한 혼합 효과 분석에 의해 수행되었다.

결과

ARG2에 대한 자발적 면역 반응

실시예 1에 서술된 바와 같이, ARG2-1은 스크리닝된 기증자에서 가장 높고 가장 빈번한 반응을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, ARG2-1은 ARG2의 트랜짓 서열(aa1-22)의 일부이다. 신호 펩티드 서열은 HLA 분자의 맥락에서 이들의 가공 및 제시를 위해 프로테오좀 분해 또는 TAP에 크게 의존하지 않는 흥미로운 유형의 펩티드 에피토프를 나타낸다. 또한, ARG2의 이 부분은 ARG1의 상응하는 서열과 거의 서열이 중첩되지 않는다 - 아래 정렬 참조:

따라서 ARG2-1은 IFNy ELISPOT 분석에 의해 33명의 HD 및 19명의 고형 종양을 갖는 환자(흑색종 환자 11명, 전립선암 환자 7명, 및 유방암 환자 1명)에서 ARG2 면역 반응에 대해 스크리닝하기 위해 사용되었다. 건강한 기증자와 고형 종양을 갖는 암 환자 모두에서 강력하고 빈번한 반응이 발견되었으며, 스크리닝된 기증자의 약 75%에서 유의한 반응을 보였다(도 14A 참조 - 이 도면의 일부 데이터 포인트는 또한 도 8에 존재한다).

ARG2는 급성 골수성 백혈병(AML) 환자에서 관찰된 면역억제 미세환경에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었기 때문에, AML로 진단된 환자의 PBMC 중에 ARG2-특이적 T 세포의 잠재적 존재도 IFNy ELISPOT에 의해 조사되었다. 이를 위해, 본 발명자들은 AML로 진단된 9명의 환자로부터 말초 혈액을 수집하였다. 혈액 수집 및 후속 PBMC 분리는 치료 상태와 관계 없이 수행되었고, 포함된 환자는 그러므로 매우 상이한 질병 단계 및 치료 단계를 나타낸다. 테스트된 9명의 환자 중 3명에서 유의한 반응이 관찰되었으며(도 14A 참조), 이는 ARG2-특이적 T 세포가 실제로 AML 환자에서 존재할 수 있다는 것을 시사한다. 건강한 기증자 및 고형 종양을 갖는 암 환자에서 IFNy 및 TFNa 생산에 대한 세포 내 사이토카인 염색은 주로 ARG2-1에 대한 CD4+ 반응을 나타냈다(도 14B).

긴 ARG2 펩티드 에피토프의 특징화

더 긴(38-mer) ARG1 펩티드가 20-mer 및 30mer ARG1 펩티드와 비교하여 ARG1-특이적 T 세포를 자극하는 데 우수하다는 것이 이전에 입증된 바 있다. 조직 유형과 관계 없이 개인에서 ARG2-특이적 T 세포의 자극을 위한 최적의 무차별(promiscuous) ARG2-유래 에피토프를 확인하기 위해, ARG2-1 주변 서열의 더 큰 부분에 걸쳐있는 더 긴 ARG2 펩티드 에피토프도 그러므로 HLA 예측 알고리즘(www.syfpeithi.de and cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 기반으로 설계되었다. 이들 서열은 인간 아르기나제 2의 예측된 신호 서열 및 ARG2-0, ARG2-1 및 ARG2-2의 20mer 서열과 정렬하여 하기에 나타냈다.

이러한 긴 ARG2 펩티드가 ARG2 반응을 확인하기 위해 사용될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 6명의 건강한 기증자의 PBMC를 3개의 긴 펩티드 각각으로 한 번 자극했다. 그 후, PBMC를 사용하여 IFNy ELISPOT에서 면역 반응에 대해 스크리닝했다. 도 15A에 나타낸 바와 같이, 모든 3개의 긴 펩티드에 대한 면역 반응이 확인되었지만, 그러나, 33-mer A2L2는 조사된 기증자에서 3개의 긴 펩티드의 가장 강력하고 가장 빈번한 면역 반응을 나타냈다. ARG2-1은 A2L2 내에 포함되어 있기 때문에, 더 긴 펩티드 A2L2가 ARG2-특이적 T 세포를 더 효과적으로 자극하는지를 결정하기 위해 조사되었다. 따라서, 6명의 건강한 기증자는 ARG2-1 또는 A2L2로 한 번 자극한 다음, IFNy ELISPOT 분석에서 설정되었다. 6명의 기증자 중 5명에서, A2L2 면역 반응은 유의하지는 않았으나(p=0.0625) ARG2-1 반응보다 높았고(도 15B), 이는 두 펩티드 모두 빈번한 면역 반응을 유발함을 시사한다.

A2L2의 면역원성을 특징화하기 위해, 30명의 건강한 기증자 및 18명의 암 환자(흑색종 환자 14명, 전립선암 환자 3명, 유방암 환자 1명)의 PBMC를 IFNy ELISPOT 분석에 의해 스크리닝하였다. 건강한 기증자와 암 환자 모두의 약 80%에서 강력하고 빈번한 반응이 관찰되었다(도 15C). IFNy 및 TNFα 생산에 대한 세포 내 사이토카인 염색은 ARG2-1에 대해 관찰된 것과 유사한 A2L2 자극에 대한 CD4+ 반응만을 나타내었다(도 15D). A2L2에 대한 면역 반응은 유의하지는 않지만(p=0.7038) 동일한 기증자에서 ARG2-1 반응에 비해 평균적으로 더 높았다(도 15E).

ARG2-특이적 T 세포의 특징화

ARG2에 대한 면역 반응을 추가로 특징화하기 위해, ARG2-특이적 CD4+ T 세포 배양이 생성되었다. 이는 ARG2 펩티드 로딩된 자가 유래 DC를 가진 전립선암 환자로부터 분리된 PBMC의 반복된 자극에 이어, 특이적 세포의 농축 및 급속한 확장에 의해 수행되었다. T 세포 배양은 TNFα 및 IFNy에 대한 세포 내 사이토카인 염색(도 16A)과 IFNy ELISPOT(도 16B)에서 ARG2 및 A2L2 모두에 매우 특이적이었다. 또한, 펩티드로 자극된 ARG2-특이적 T 세포 배양으로부터의 IFNy 생산은 IFNy ELISPOT에서 HLA-DR 차단제의 첨가에 의해 억제되었으나, HLA-DP 또는 HLA-DQ 차단제에 의해 억제되지 않았음이 밝혀졌다(도 16C). ARG2-특이적 T 세포 배양물의 특이성을 평가하기 위해 ARG2의 세포 내 발현을 갖는 세포를 인식하고 이에 대해 반응하는 ARG2-특이적 T 세포 배양물의 능력을 조사하였다. 이를 위해, 자가 유래 DC를 DC-LAMP 신호 서열에 융합된 ARG2를 코딩하는 mRNA로 형질감염시켰고, 이는 리소좀 구획을 향해 단백질을 표적하여 단백질을 클래스 II 제시로 향하게 한다. Mock 형질감염된 DC에 비해 ARG2 mRNA 형질감염된 DC에 대한 더 높은 반응성이 관찰되었다(도 16D). 형질감염된 세포의 FACS 분석은 >90% 형질감염 효율을 나타내었고, mock 및 mRNA 형질감염된 DC의 mRNA 분석은 형질감염 24시간 후 ARG2 발현에서 큰 증가를 나타내었다(데이터 미도시).

ARG2-생산 면역 세포에 대한 반응성을 보여준 ARG2-특이적 T 세포 배양물이 다른 암 세포를 인식하고 이에 대해 반응하는 능력을 IFNy ELISPOT 분석을 사용하여 조사했다. 특이적 T 세포 배양물에 대한 기증자의 HLA 시퀀싱 분석을 통해, 낮은 내인성 ARG2 발현을 갖는 3개의 HLA-매치된(HLA-DR01:01) AML 세포주를 선택하고(OCI-AML2, THP-1 및 MONO-MAC-1, - 데이터 미도시), ARG2-1 펩티드로 펄싱하여 이후에 IFNy ELISPOT에 대한 표적 세포로서 사용하였다. Set2는, 높은 내인성 ARG2 발현을 갖지만 ARG2-특이적 T 세포 배양과 HLA-미스매치되는 또 다른 AML 세포주인데, 음성 대조군으로 포함되었다. OCI-AML2, THP-1 및 MONO-MAC-1는 ARG2-특이적 T 세포에 의해 효과적으로 인식된 반면(도 17A), Set2는 그렇지 않았다. ARG2-특이적 T 세포의 HLA-DR 제한은 두 개의 서로 다른 HLA-DR 특이적 항체의 첨가에 의해 확인되었으며, 이는 두 개의 HLA-DR 차단제를 모두 첨가하면 ARG2-1 펄싱된 THP-1 세포의 인식이 폐기되었기 때문이다(도 17B).

THP-1 세포주는 AML 환자의 말초 혈액에서 유래된 단핵구 세포주이다. THP-1 세포는 이들 주변에 있는 특정 사이토카인의 존재에 따라 이들의 기능과 함께 약간의 가소성을 유지하는 것으로 보고되었다. IL-4 및 IL-13은 ARG1의 주요 유도제로 보고되었으나, 이들의 ARG2에 대한 기능은 잘 알려져 있지 않다. 더욱이, THP-1 세포는 IL-4, GM-CSF 및 TFNα의 사이토카인 칵테일(본원에서 “사이토카인 칵테일(cytokine cocktail)”로 지칭됨)로 48시간 자극 시 DC-유사 특징을 획득하는 것으로 보고되었다. 따라서 IL-4, IL-13 또는 사이토카인 칵테일에 의한 THP-1 세포의 자극이 THP-1 세포에서 ARG2 발현을 증가시킬지를 조사하였다. 2배 이상의 ARG2 발현 유도가 사이토카인 칵테일로 자극 시 발견된 반면, IL-4 및 IL-13은 ARG2 발현 수준에 많은 영향을 미치지 않았다(도 17C). 다음으로 사이토카인 칵테일 자극 후 ARG2 발현의 증가가 ARG2-특이적 T 세포로부터 면역 반응을 유발할 수 있는지 조사하였다. 실제로, 사이토카인 칵테일은 IFNy ELISPOT에서 자극된 THP-1 세포를 인식하고(도 17D), 세포 내 사이토카인 염색에 의해 검출된 TNFα 및 IFNy을 생산하는 것으로 밝혀졌다(도 17E). 사이토카인으로 THP-1 세포의 처리 후 ARG2 발현만 증가한 반면, ARG1 발현은 변하지 않았다(도 17F). 사이토카인 자극된 THP-1 세포에 대한 반응은 HLA-DR 특이적 항체에 의해 차단될 수 있다(도 17G).

중요하게, 사이토카인 칵테일 자극된 THP-1 세포는 더 많은 콜로니-형성, 작은 돌출부 및 후천적 부착성을 갖는 자극되지 않은 세포에 비해 형태를 변경했다(데이터 미도시). 중요하게는, 사이토카인 칵테일은 HLA-DR 발현을 상향조절하지 않았다(데이터 미도시). 대조적으로, THP-1 세포를 IFNy로 처리하면 세포 표면에서 HLA-DR 발현이 증가하지만(미도시), ARG2 발현은 그렇지 않았으며(도 17H), IFNy 자극된 THP-1 세포는 IFNy ELISPOT 분석에서 ARG2-특이적 T 세포에 의해 인식되지 않았다(도 17I).

MONO-MAC-1는 THP-1 세포와 마찬가지로 사이토카인 자극에 의해 분화되거나 영향을 받는 능력을 유지한 AML 세포주이다. THP-1 세포에 대한 관찰과 유사하게, 사이토카인에 의해 MONO-MAC-1 세포에서 ARG2 발현을 증가시키는 것이 가능했다(도 18A). 사이토카인 칵테일을 사용한 MONO-MAC-1 세포의 자극은 MONO-MAC-1 세포에서 자극되지 않은 세포에 비해 HLA-DR 발현을 증가시키지 않았다(미도시). 또한, IFNy로 자극된 MONO-MAC-1 세포는 ARG2 발현을 상향조절하지 않았으며(도 18B), 사이토카인 처리된 MONO-MAC-1 세포만이 IFNy ELISPOT에서 ARG2-특이적 T 세포에 의해 인식되었다(도 18C). 사이토카인 칵테일로 자극된 MONO-MAC-1은 또한 THP-1 세포에 대해 관찰된 것과 유사하게 형태를 변경한다(미도시).

ARG2 발현 의존적 T-세포 인식의 개념을 추가로 테스트하기 위해, THP-1 세포를 ARG2-DC-LAMP 구축물을 사용하여 ARG2 mRNA로 형질감염시켰다. DC-LAMP 서열은 성숙한 DC에 특이적인 것으로 보고되어 있지만, THP-1 세포는 DC-유사 세포로 분화될 수 있으므로, 이 구축물은 THP-1 세포의 형질감염에도 적용할 수 있다. 실제로, ARG2-특이적 T-세포 배양물이 ARG2-DC-LAMP mRNA로 형질감염된 THP-1 세포에 대해 반응하는 것이 관찰되었다(도 19A). 반응성은 또한 ARG1-DC-LAMP mRNA로 형질감염된 세포에 비해 ARG2-DC-LAMP mRNA로 형질감염된 세포에 대해 유의적으로 높았으며(도 7A), 이는 ARG2-특이적 T 세포의 특이성을 강조한다. 또한, 형질감염 이전에 사이토카인으로 48시간 자극은 mRNA 형질감염만 되거나 사이토카인 자극만 된 세포에 비해 면역 반응을 증가시켰다(도 19A). TNFα 및 IFNy 생산에 대한 세포 내 사이토카인 염색은 유사한 경향을 나타냈다(도 19B). 전기천공 효율은 GFP-발현 세포의 FACS 분석에 의해 형질감염 24시간 후에 평가되었고, 효율적인 형질감염(>99% GFP+ 세포)을 나타냈다(데이터 미도시). 이에 따라, mock 세포와 비교하여 ARG2 및 ARG1 발현에서 큰 배수 증가가 각각 ARG2-DC-LAMP mRNA 또는 ARG1-DC-LAMP mRNA로 형질감염 24시간 후에 관찰되었다(데이터 미도시). mRNA 형질감염된 THP-1 세포에서 ARG2 발현 수준은 Set2 세포에서 내인성 ARG2 발현 수준에 비해 높았다(데이터 미도시).

다음으로, 본 발명자들은 T 세포 인식 및 활성화가 ARG2 발현에 의존한다는 것을 추가로 증명하기 위해 siRNA 매개 ARG2 넉다운을 사용했다. 3개의 ARG2 특이적 siRNA의 풀을 사용한 THP-1 세포의 형질감염은 효율적인 ARG2 KD를 야기했다(도 19C). TNFα 및 IFNy 생산은 siRNA로 형질감염 및 사이토카인 자극 48시간 후 세포 내 사이토카인 염색에 의해 검사하였다. 본 발명자들은 mock+사이토카인 세포에 비해 siRNA+사이토카인 세포에 대한 ARG2-특이적 T 세포로부터의 TNFα 및 IFNy 생산 모두에서의 감소를 관찰하였으며, 생산을 완전히 폐기하지는 못했다(도 19D). 세포에서 ARG2 발현의 RT-qPCR은 또한 siRNA+사이토카인 세포에서 ARG2 KD를 나타냈지만, 그러나 ARG2 발현 수준은 siRNA KD만으로 얻은 수준보다 약간 높았다(도 19E).

실시예 3 - 쥐 모델에서 백신 원리의 증명

아르기나제 2에 대한 백신접종의 치료 잠재력을 입증하기 위해서, 마우스 모델을 개발하였다. 쥐 아르기나제 2는 인간 아르기나제 2와 85% 서열 상동성을 가지므로, 단순히 인간 서열을 사용하는 것은 불가능하다. 에피토프 예측 서버를 사용하여 C57 마우스(H-2Kb, H2-Db)에 대한 쥐 아르기나제 2에서 가능한 에피토프를 검색하였다.

H2-Kb 및 H2- Db에 대한 결합에 대해 예측된 에피토프는 두 개의 클러스터; aa85 및 aa182 주변에서 발견되었다. 이들은 중첩을 설명하기 위해 정렬하여 아래에 나타냈다.

각각의 예측된 에피토프는 H2-Kb 또는 H2-Db에 결합할 것으로 예측되지만, mArg2_P2는 2개의 예측된 에피토프에 의해 합쳐지고, 이론적으로는 H2-Kb 및 H2-Db 모두에 결합할 수 있다. mArg2_P6은 H2-Kb 및 H2-Db 모두에 결합할 것으로 예측되었다.

이러한 펩티드들은 백신접종 스크린에 사용되며(도 11의 실험 도식 참조), 여기에서 3마리의 C57 마우스가 6개의 펩티드 중 하나로 피하 백신접종된다. 1주일 후, 마우스를 희생시키고 비장을 균질화하여 PBMC를 얻었다. 이들을 사용하여 IFNy ELISPOT를 설정하여 백신접종에 사용된 펩티드 및 중첩되는 서열을 갖는 다른 예측된 에피토프 펩티드 모두에 대한 반응에 대해 스크리닝하였다.

도 12에 나타낸 바와 같이, mArg2 P5 (aa188-196)로 백신접종된 마우스는 가장 강력하고 가장 두드러진 반응을 나타냈다. 이 펩티드를 사용한 추가 백신접종 실험이 수행되었다. 도 13에 나타낸 바와 같이, mArg2 P5로 백신접종된 마우스에서 반응은 mArg2 P5 (aa188-196) 및 P4 (aa182-197) 모두에 대해 관찰된 반면, mArg2 P3 (as191-198)에 대해서는 반응이 없거나 약한 반응만 관찰되었다. 이는 주요 에피토프가 aa188-196 내에 위치함을 암시한다. 그러나, 전반적으로, 이 실험은 아르기나제 2 펩티드를 사용한 백신접종이 생체 내(in vivo)에서 면역 반응을 자극할 수 있고, 이는 아르기나제 2 백신접종의 치료 잠재력을 일반 원리로 검증함을 입증한다.

실시예 4 - 쥐 모델에서 백신 원리의 추가 증명 - 루이스폐암종(Lewis Lung carcinoma)

재료 및 방법

펩티드 설계 - 실시예 3 참조.

세포 배양

종양 유래 세포주 Lewis Lung (LL2)은 페니실린, 스트렙토마이신 및 10% FBS로 보충된 DMEM에서 배양되었다. 0.25% 트립신-EDTA(Gibco)로 플라스크로부터 분리하여 세포를 일주일에 2-3회 계대배양 하였다.

동물 실험

동물 실험은 Herlev 병원 종양학과의 동물 시설에서 수행되었다. 마우스를 사용한 모든 실험은 덴마크 동물 실험 위원회에 의해 검토 및 승인되었다. C57BL/6 마우스의 일일 관리 및 사육은 동물 시설의 동물 관리인에 의해 수행되었다. 치료 백신접종 연구를 위해, C57BL/6 마우스를 Taconic으로부터 구입하였다.

종양 주사

LL2 세포(5*10^5)를 100 ul의 무혈청 배지에 재현탁하고, 암컷 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사했다. 종양 부피는 디지털 캘리퍼로 측정되었고, 종양 연구의 종점은 종양이 800mm³의 임계 크기에 도달하거나 종양에서 궤양의 형성으로 인한 것이었다.

펩티드 백신접종 및 쥐 ELISPOT

쥐 Arg2 펩티드 (P1-P6)는 PepScan 또는 Sch

fer에 의해 합성되었고, 보고된 용해도에 따라 각각 초순수 또는 DMSO에서 2 mM 또는 10 mM로 용해되었다. 용해된 펩티드는 이어서 총 부피 100 ul로 주어진 100 ug 총 펩티드의 최적 용량을 위해 몬타니드 아쥬반트 (50ul/마우스) (Seppic Inc.)로 유화시켰다. 유화된 펩티드 백신접종은 27G 니들로 12-16주령 C57BL/6 마우스의 기저부 또는 꼬리 또는 옆구리에 피하 주사되었다. 대조군 마우스는 100 ul의 총 부피에서 물과 몬타니드 유화가 주어졌다. 종양 접종 마우스에서 치료 백신 연구의 경우, 각각 꼬리의 측면 및 왼쪽 옆구리에 종양 접종 후 0일차 및 7일차에 백신접종을 했다. 에피토프 스크리닝 - 및 검증 실험을 위해, 단일 용량의 백신을 마우스 오른쪽 옆구리에 투여하였다. 1주일 후, 마우스를 희생시키고, 비장을 회수하였다. 비장은 70 μM 필터를 통해 부수고, 적혈구 용해 완충액(Qiagen)을 사용하여 적혈구를 용해시켰다. 세포를 4회 세척하고, 쥐 IFNy ELISPOT 분석을 위한 설정 전에 웰당 8*10⁶ 세포로 계수하였다.

PD-1 차단 항체로 치료

항-마우스 PD-1 (CD279) 단일클론항체를 BioXCell (클론: RMP1-14)로부터 구입하였다. 효능 연구를 위해, 마우스는 200 μl PBS 중의 250 μg PD-1 차단 항체가 복강 내 주사되었다. 마우스는 LL2 접종 후 4일차부터 주당 3회 항-PD-1으로 치료되었다.

통계 분석

ELISPOT 반응은 Moodie 등(ref)에 의해 설명된 DFR(distribution free resampling) 방법을 사용하여 분석되었다. ELISPOT 반응의 통계 분석은 R studio를 사용하여 수행되었다. ARG2-1 및 A2L2에 대한 반응(특이적 IFNy-분비 세포)의 차이를 0.05의 유의 수준으로 윌콕슨 일치 쌍 부호순위 t 검정(Wilcoxon matched pairs signed ranked t test)(Prism 8을 사용함)의 사용으로 비교하였다. 대조군과 Arg2 백신접종 군 간의 평균 종양 성장에서의 차이의 통계 분석은 Prism 8을 사용한 혼합 효과 분석에 의해 수행되었다.

결과

실시예 1 및 2는 시험관 내(in vitro) 특이적 T 세포에 대한 표적으로서 ARG2를 나타내며, 여기에서 ARG2를 발현하는 면역 세포 및 암 세포 모두가 ARG2-특이적 T 세포에 의해 특이적으로 인식된다. 생체 내(in vivo) ARG2-특이적 T 세포의 잠재적인 기능적 효과를 조사하기 위해, 실시예 3은 추가로 평가된 관련 쥐 Arg2 펩티드 에피토프를 확인하였다. C57BL/6 마우스는 펩티드-몬타니드 에멀젼에서 마우스의 피하(s.c.) 백신접종에 의한 면역 반응에 대해 스크리닝되었다. 그룹당 3마리의 마우스를 6개의 후보 펩티드 각각으로 백신접종하고, 7일 후 마우스를 희생시키고, 비장세포를 분리하고, 생체 외(ex vivo) mIFNy ELISPOT 분석에서 분석하였다. 강력한 면역 반응이 P4로 백신접종된 3마리 마우스 모두에서 관찰되었다(도 12 참조, 또한 동일 데이터가 도 20A에도 제시됨). 이는 이후에 그룹당 더 많은 마우스를 사용한 유사 실험에서 확인되었다(도 20B).

가장 관련성이 높은 종양 모델을 확인하기 위해, Arg2 발현을 C57BL/6 기원의 다른 이식된 종양의 패널에서 평가하였다. 본 발명자들은 Lewis Lung (LL2) 종양 세포에 의해 형성된 종양에서 Arg2의 가장 일관된 높은 발현을 발견하였다(도 20C). LL2 종양 세포로 C57BL/6 마우스를 챌린지(challenge)하는 것에 이어 두 번의 백신접종(종양 접종 후 0일차 및 7일차 - 도 2D에 치료 스케줄 참조)은 mock 백신접종된 대조군(control group, Ctrl)에 비해 Arg2 백신접종된 마우스(P4)에서 종양 성장을 감소시켰다(도 20E). 종양에 대한 궤양 형성으로 인해 종양 접종 후 12일차에 마우스를 희생시켰다. Arg2 백신접종이 항-PD1 항체의 효과를 유도할 수 있는 방식으로 TME를 수정할 수 있는지 조사하기 위해, 본 발명자들은 LL2 모델에서 mARG2(188-197)(P4로 표시)에 대한 백신접종을 항-PD1과 조합하였다. 예상대로, 항-PD1 항체를 사용한 단일요법은 이 모델에서 종양 성장에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 항-PD1과 ARG2 백신접종의 조합은 부가적인 효과를 가졌다(도 20F 및 G). 종양에 대한 궤양 형성으로 인해 종양 접종 후 12일차에 마우스를 희생시켰다.

실시예 1 내지 4의 전체 요약 및 논의

실시예들은 ARG2가 특이적 T-세포의 표적이라는 점과 그러므로 특정 ARG2-특이적 이펙터 T 세포가 ARG2-발현 면역억제 세포를 표적화하는 가능한 신규 수단으로서 활용될 수 있다는 점을 보여주었다. 먼저, 실시예들은 전체 ARG2 서열을 커버하는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해 암 환자와 건강한 기증자 모두에서 자연적으로 존재하는 말초 ARG2-특이적 T 세포를 확인했다. 흥미롭게도, ARG2는 말초 T 세포에 의해 자주 인식되는 다수의 에피토프가 포함되어 있다는 것이 발견되었다. ARG2에 대한 빈번한 T-세포 반응은 ARG2의 높은 면역원성을 강조하고, ARG2 발현 암을 갖는 ARG2-특이적 면역 반응 환자, 예를 들어 전립선암 또는 AML 환자를 면역 반응 증폭시킬 가능성을 지지한다. 또한, 건강한 개인에서 강력한 면역 반응은 ARG2-특이적 T 세포가 면역계의 자연적인 일부이며 면역 항상성에 중요할 수 있음을 시사한다. 추가로 ARG2의 명백히 가장 면역원성인 영역으로부터 유래된 펩티드에 반응한 특이적 CD4+ T 세포를 분리하고 확장하였다. 그 결과는 ARG2-특이적 T 세포가 실제로 ARG2 발현 골수 세포를 인식하고 이에 반응함을 입증한다.

일반적으로, 종양은 면역 침윤(immune infiltration)에 따라 다른 카테고리로 나뉜다; (i) 부족한 면역 침윤(소위 '차가운(cold)' 종양에서); (ii) 악성 세포와의 접촉이 배제된 면역 침윤(소위 '배제된(excluded)' 종양에서); 또는 (iii) 강력한 면역억제 메커니즘에 의해 억제되는 풍부한 종양 침윤(소위 '뜨거운(hot)' 종양에서). 중요한 치료 전략은 '차가운(cold)' 및 '배제된(excluded)' 종양에서 '뜨거운(hot)' 종양으로 전환하는 임상 조합이며, 이는 후자가 일반적으로 면역 요법, 특히 체크포인트 차단(checkpoint blockade)에서 개선된 질병 결과와 관련되기 때문이다. 아르기나제의 중요한 특징은 이러한 종양에서 아르기나제-발현 면역억제 면역 세포로 인해 '배제된' 종양 유형에서 발현된다는 것이다. ARG1은 IL-10 및 TGF-β 외에도 IL-4 및 IL-13과 같은 Th2 사이토카인에 반응하여 M2-유사 대식세포에서 상향조절된다는 것이 잘 설명되었다. 대조적으로, ARG2의 조절은 매우 제한적으로 설명되었으나, 흥미롭게도 다량의 메틸화되지 않은 시토신 구아닌 모티프(CpG)를 함유하는 리포폴리사카라이드 및 올리고데옥시뉴클레오티드와 같은 Toll-유사 수용체 리간드가 쥐 대식세포에서 ARG2 발현을 유도한다는 것이 시사되었다.

또한 최근에는 IL1β 및 TNFα가 신경아세포종 세포에서 ARG2를 유도했다는 것이 설명되었다. 중요하게는, 현재 연구에서, 본 발명자들은 사이토카인의 혼합물, 즉 IL4, GM-CSF 및 TNF-α가 악성 골수성 세포에서 ARG2를 유도한다는 것을 추가로 보여주었다. 그러므로, ARG2는 배제된 종양에서뿐만 아니라 더욱 '중간(intermediate)'에서 '뜨거운' 종양까지에 존재하는 환경에 의해 유도되는 것으로 보인다. 따라서, ARG1 또는 ARG2가 유도되는 미세환경이 다르기 때문에, ARG1 및 ARG2가 종양 미세환경(tumor microenvironment, TME)에서 다른 세포에 의해 다른 종양 유형에서 발현되는 것으로 밝혀진 것은 놀라운 일이 아니다. 그러므로, ARG1은 주로 MDSC 및 TAM에 의해 발현되는 반면, ARG2는 다양한 고형 종양 세포, AML 모세포 및 CAF에 의해 발현되는 것으로 설명되었다. 따라서, 백신접종을 위한 ARG1 및 ARG2의 조합은 TME에서 다른 면역억제 아르기나제-발현 세포를 표적화하기 위해 유익할 수 있으며, 이는 더 많은 환자에게 유익할 수 있다. 또한, 염증을 전파하는 활성화된 M1 대식세포가 IFNγ와 같은 Th1 사이토카인에 반응하여 발생한다는 것이 잘 설명되어 있다. 중요하게는, 많은 간질 세포가 말기 분화 세포가 아니고, 전-염증 자극이 주어지면 면역적격(immunocompetent) 세포로 되돌아갈 수 있을 것이다. 예를 들어 백신접종에 의한 아르기나제-특이적 T-세포의 활성화는 실제로 종양 부위에서 Th1 염증을 유발해야 한다. 다른 유형의 항-조절 T 세포, 예를 들어 IDO- 및 PD-L1 특이적 전-염증성 T 세포가 존재하는 것으로 알려져 있으며, Th1-염증 신호, 예를 들어 IFNγ는 이러한 IDO- 또는 PD-L1 특이적 T 세포의 확장을 자발적으로 유도하는 것이 보고되었고, 이는 아르기나제의 IDO- 또는 PDL1-기반 백신과의 잠재적인 상승 작용을 시사한다. 이 시나리오에서, ARG1/ARG2 백신접종은 종양 부위에서 Th1 염증을 유도할 수 있으며, 여기에서 아르기나제 발현 세포는 그렇지 않으면 림프구 침윤을 방지한다. 차례로, 이 효과는 IDO 및/또는 PD-L1을 유도하여, 이러한 표적에서 유도된 에피토프를 인식하는 항-Treg에 의한 추가 표적화를 가능하게 할 것이다. 따라서, 상이한 항-Treg 표적 항원으로부터의 에피토프의 조합은 백신접종 접근법에서 부가적일 수 있다. 마찬가지로, ARG2-특이적 T 세포를 활성화하는 ARG2 면역 조절 백신과 체크포인트 차단 항체의 병용 요법은 염증이 있는 종양에서만 작동하는 체크포인트 차단 단독과 비교하여 치료에 반응할 수 있는 환자의 수를 증가시켜야 한다. 그러므로, 아르기나제-발현 세포는 종양 부위에서 이펙터 림프구 증식을 방지하므로, 많은 암 환자에서 항-PD1 요법의 효과가 부족한 중요한 이유가 된다. 현재 연구에서, 본 발명자들은 ARG2가 잘 설명된 PD-L1 내성 종양 모델 Lewis Lung에서 실제로 발현된다는 것을 보여준다. 본 발명자들은 백신접종에 의한 ARG2-특이적 T 세포의 활성화가 루이스 폐 세포 성장을 억제하고, 가장 중요하게는, 항-PD1과 상승적으로 기능한다는 것을 보여준다. 따라서, 면역 조절 ARG2 백신접종과의 조합은 실제로 내성 루이스 폐 세포를 항-PD1 요법에 민감하게 만들 수 있다.

전반적으로 실시예들은 ARG2 특이적 T 세포가 면역계의 자연적인 부분으로 존재하고, 암에서 면역 억제로부터 균형을 기울이는 데 쉽게 이용될 수 있다는 것을 보여준다. ARG2에 대한 치료적 백신접종은 암 세포에 대한 암-특이적 면역 반응을 선호하는 염증성 TME의 생성을 촉진해야 한다. 따라서 ARG2 기반 백신은 추가 면역요법, 특히 체크포인트 억제제와 상승적으로 기능할 가능성이 있다. 실시예에서 사용된 인간 ARG2로부터의 가장 면역원성인 펩티드는 ARG2-특이적 T-세포 반응을 자극하는 데 효율적이며, 이는 미세환경의 재균형에 필수적일 수 있고, 단일 접근 요법 또는 암세포만을 목표로 하는 현재 암 백신과 비교하여 체크포인트 차단제와 같은 T-세포-강화 약물의 효과를 증가시켜야 한다.

서열

시작 위치(Start pos) 및 끝 위치(End pos)는 달리 명시하지 않는 한 전장 인간 아르기나제 2(서열번호 51) 내의 위치를 나타낸다.

표 X

*은 인간 아르기나제 1의 서열을 나타낸다. 시작 및 끝 위치는 인간 아르기나제 1(서열번호 53)의 위치이다.

#은 쥐 아르기나제 2의 서열을 나타낸다. 시작 및 끝 위치는 쥐 아르기나제 2(서열번호 52)의 위치이지만, 쥐와 인간 단백질의 길이가 동일하기 때문에, 넘버링도 인간 아르기나제 2와 일치한다.

전장 인간 아르기나제 2 (NP_001163.1)(서열번호 51)

아르기나제 1 상동성(homology)을 기반으로 면역원성에 대한 핫스팟으로 확인된 영역은 볼드체 및 밑줄로 나타내었다. 이전에 인식되지 않은 핫스팟의 중심으로 확인된 트랜짓 펩티드 경계는 볼드체 및 이탤릭체 “KSV”로 나타내었다.

전장 쥐 아르기나제 2 (NP_033835.1)(서열번호 52)

전장 인간 아르기나제 1 (NP_000036.2)(서열번호 53)

면역원성에 대한 핫스팟으로 확인된 영역은 볼드체 및 밑줄로 나타냄

SEQUENCE LISTING <110> IO Biotech ApS <120> IMMUNOGENIC ARGINASE 2 POLYPEPTIDES <130> N414657WO <150> GB1818576.9 <151> 2018-11-14 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Leu Arg Gly Ser Leu Ser Arg Leu Leu Gln Thr Arg Val His 1 5 10 15 Ser Ile Leu Lys 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Leu Gln Thr Arg Val His Ser Ile Leu Lys Lys Ser Val His Ser Val 1 5 10 15 Ala Val Ile Gly 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Lys Ser Val His Ser Val Ala Val Ile Gly Ala Pro Phe Ser Gln Gly 1 5 10 15 Gln Lys Arg Lys 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Pro Phe Ser Gln Gly Gln Lys Arg Lys Gly Val Glu His Gly Pro 1 5 10 15 Ala Ala Ile Arg 20 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Val Glu His Gly Pro Ala Ala Ile Arg Glu Ala Gly Leu Met Lys 1 5 10 15 Arg Leu Ser Ser 20 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Ala Gly Leu Met Lys Arg Leu Ser Ser Leu 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Ala Ile Gly Thr Ile Ser Gly His Ala Arg His Cys Pro Asp 1 5 10 15 Leu Cys Val Val 20 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ala Arg His Cys Pro Asp Leu Cys Val Val Trp Val Asp Ala His Ala 1 5 10 15 Asp Ile Asn Thr 20 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Trp Val Asp Ala His Ala Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Ser Ser 1 5 10 15 Gly Asn Leu His 20 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Pro Leu Thr Thr Ser Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro Val Ser Phe 1 5 10 15 Leu Leu Arg Glu 20 <210> 17 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Arg Glu Leu Gln Asp Lys Val Pro 1 5 10 15 Gln Leu Pro Gly 20 <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Leu Gln Asp Lys Val Pro Gln Leu Pro Gly Phe Ser Trp Ile Lys Pro 1 5 10 15 Cys Ile Ser Ser 20 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Ile Ser Ser Ala Ser Ile Val Tyr Ile 1 5 10 15 Gly Leu Arg Asp 20 <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ala Ser Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Pro Glu His 1 5 10 15 Phe Ile Leu Lys 20 <210> 21 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Val Asp Pro Pro Glu His Phe Ile Leu Lys Asn Tyr Asp Ile Gln Tyr 1 5 10 15 Phe Ser Met Arg 20 <210> 22 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Asn Tyr Asp Ile Gln Tyr Phe Ser Met Arg Asp Ile Asp Arg Leu Gly 1 5 10 15 Ile Gln Lys Val 20 <210> 23 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Asp Ile Asp Arg Leu Gly Ile Gln Lys Val Met Glu Arg Thr Phe Asp 1 5 10 15 Leu Leu Ile Gly 20 <210> 24 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Glu Arg Thr Phe Asp Leu Leu Ile Gly Lys Arg Gln Arg Pro Ile 1 5 10 15 His Leu Ser Phe 20 <210> 25 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Lys Arg Gln Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Ile Asp Ala Phe Asp 1 5 10 15 Pro Thr Leu Ala 20 <210> 26 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Asp Ile Asp Ala Phe Asp Pro Thr Leu Ala Pro Ala Thr Gly Thr Pro 1 5 10 15 Val Val Gly Gly 20 <210> 27 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu Gly 1 5 10 15 Met Tyr Ile Ala 20 <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Leu Thr Tyr Arg Glu Gly Met Tyr Ile Ala Glu Glu Ile His Asn Thr 1 5 10 15 Gly Leu Leu Ser 20 <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Glu Glu Ile His Asn Thr Gly Leu Leu Ser Ala Leu Asp Leu Val Glu 1 5 10 15 Val Asn Pro Gln 20 <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ala Leu Asp Leu Val Glu Val Asn Pro Gln Leu Ala Thr Ser Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Lys Thr 20 <210> 31 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Leu Ala Thr Ser Glu Glu Glu Ala Lys Thr Thr Ala Asn Leu Ala Val 1 5 10 15 Asp Val Ile Ala 20 <210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Thr Ala Asn Leu Ala Val Asp Val Ile Ala Ser Ser Phe Gly Gln Thr 1 5 10 15 Arg Glu Gly Gly 20 <210> 33 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Ser Ser Phe Gly Gln Thr Arg Glu Gly Gly His Ile Val Tyr Asp Gln 1 5 10 15 Leu Pro Thr Pro 20 <210> 34 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 His Ile Val Tyr Asp Gln Leu Pro Thr Pro Ser Ser Pro Asp Glu Ser 1 5 10 15 Glu Asn Gln Ala Arg Val Arg Ile 20 <210> 35 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gly Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Ile Ser Ser Ala Ser Ile Val Tyr 1 5 10 15 Ile Gly Leu Arg 20 <210> 36 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Ser Ala Ser Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Pro Glu 1 5 10 15 His Phe Ile Leu 20 <210> 37 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Asp Val Asp Pro Pro Glu His Phe Ile Leu Lys Asn Tyr Asp Ile Gln 1 5 10 15 Tyr Phe Ser Met 20 <210> 38 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Lys Asn Tyr Asp Ile Gln Tyr Phe Ser Met Arg Asp Ile Asp Arg Leu 1 5 10 15 Gly Ile Gln Lys 20 <210> 39 <211> 50 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Gly Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Ile Ser Ser Ala Ser Ile Val Tyr 1 5 10 15 Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Pro Glu 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Lys Asp Phe Gly Asp Leu Ser Phe Thr Pro Val Pro Lys Asp Asp 65 70 75 80 Leu Tyr Asn Asn Leu Ile Val Asn Pro Arg Ser Val Gly Leu Ala Asn 85 90 95 Gln Glu Leu Ala Glu Val Val Ser Arg Ala Val Ser Asp Gly Tyr Ser 100 105 110 Cys Val Thr Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Thr Ile Ser 115 120 125 Gly His Ala Arg His Cys Pro Asp Leu Cys Val Val Trp Val Asp Ala 130 135 140 His Ala Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Ser Ser Gly Asn Leu His 145 150 155 160 Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Arg Glu Leu Gln Asp Lys Val Pro 165 170 175 Gln Leu Pro Gly Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Ile Ser Ser Ala Ser 180 185 190 Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Pro Glu His Phe Ile 195 200 205 Leu Lys Asn Tyr Asp Ile Gln Tyr Phe Ser Met Arg Asp Ile Asp Arg 210 215 220 Leu Gly Ile Gln Lys Val Met Glu Arg Thr Phe Asp Leu Leu Ile Gly 225 230 235 240 Lys Arg Gln Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Ile Asp Ala Phe Asp 245 250 255 Pro Thr Leu Ala Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr 260 265 270 Tyr Arg Glu Gly Met Tyr Ile Ala Glu Glu Ile His Asn Thr Gly Leu 275 280 285 Leu Ser Ala Leu Asp Leu Val Glu Val Asn Pro Gln Leu Ala Thr Ser 290 295 300 Glu Glu Glu Ala Lys Thr Thr Ala Asn Leu Ala Val Asp Val Ile Ala 305 310 315 320 Ser Ser Phe Gly Gln Thr Arg Glu Gly Gly His Ile Val Tyr Asp Gln 325 330 335 Leu Pro Thr Pro Ser Ser Pro Asp Glu Ser Glu Asn Gln Ala Arg Val 340 345 350 Arg Ile <210> 52 <211> 354 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 Met Phe Leu Arg Ser Ser Ala Ser Arg Leu Leu His Gly Gln Ile Pro 1 5 10 15 Cys Val Leu Thr Arg Ser Val His Ser Val Ala Ile Val Gly Ala Pro 20 25 30 Phe Ser Arg Gly Gln Lys Lys Leu Gly Val Glu Tyr Gly Pro Ala Ala 35 40 45 Ile Arg Glu Ala Gly Leu Leu Lys Arg Leu Ser Arg Leu Gly Cys His 50 55 60 Leu Lys Asp Phe Gly Asp Leu Ser Phe Thr Asn Val Pro Gln Asp Asp 65 70 75 80 Pro Tyr Asn Asn Leu Val Val Tyr Pro Arg Ser Val Gly Leu Ala Asn 85 90 95 Gln Glu Leu Ala Glu Val Val Ser Arg Ala Val Ser Gly Gly Tyr Ser 100 105 110 Cys Val Thr Met Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Thr Ile Ile 115 120 125 Gly His Ala Arg His Arg Pro Asp Leu Cys Val Ile Trp Val Asp Ala 130 135 140 His Ala Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Val Ser Gly Asn Ile His 145 150 155 160 Gly Gln Pro Leu Ser Phe Leu Ile Lys Glu Leu Gln Asp Lys Val Pro 165 170 175 Gln Leu Pro Gly Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Leu Ser Pro Pro Asn 180 185 190 Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Glu Pro Pro Glu His Phe Ile 195 200 205 Leu Lys Asn Tyr Asp Ile Gln Tyr Phe Ser Met Arg Glu Ile Asp Arg 210 215 220 Leu Gly Ile Gln Lys Val Met Glu Gln Thr Phe Asp Arg Leu Ile Gly 225 230 235 240 Lys Arg Gln Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Ile Asp Ala Phe Asp 245 250 255 Pro Lys Leu Ala Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr 260 265 270 Tyr Arg Glu Gly Val Tyr Ile Thr Glu Glu Ile His Asn Thr Gly Leu 275 280 285 Leu Ser Ala Leu Asp Leu Val Glu Val Asn Pro His Leu Ala Thr Ser 290 295 300 Glu Glu Glu Ala Lys Ala Thr Ala Arg Leu Ala Val Asp Val Ile Ala 305 310 315 320 Ser Ser Phe Gly Gln Thr Arg Glu Gly Gly His Ile Val Tyr Asp His 325 330 335 Leu Pro Thr Pro Ser Ser Pro His Glu Ser Glu Asn Glu Glu Cys Val 340 345 350 Arg Ile <210> 53 <211> 322 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser 1 5 10 15 Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg 20 25 30 Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys 35 40 45 Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe 50 55 60 Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu 65 70 75 80 Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val 85 90 95 Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Ser Ile Ser Gly His Ala 100 105 110 Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp 115 120 125 Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro 130 135 140 Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro 145 150 155 160 Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr 165 170 175 Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr 180 185 190 Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile 195 200 205 Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys 210 215 220 Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe 225 230 235 240 Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu 245 250 255 Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly 260 265 270 Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu 275 280 285 Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe 290 295 300 Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro 305 310 315 320 Pro Lys <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Ile Leu Lys Lys Ser Val His Ser Val Ala 1 5 10 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Ile Leu Lys Lys Ser Val His Ser Val 1 5 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Ser Ile Leu Lys Lys Ser Val His Ser Val 1 5 10 <210> 57 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Ser Leu Ser Arg Leu Leu Gln Thr Arg Val His Ser Ile Leu Lys Lys 1 5 10 15 Ser Val His Ser Val Ala Val Ile Gly Ala Pro Phe Ser 20 25 <210> 58 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Ser Leu Arg Gly Ser Leu Ser Arg Leu Leu Gln Thr Arg Val His Ser 1 5 10 15 Ile Leu Lys Lys Ser Val His Ser Val Ala Val Ile Gly Ala 20 25 30 <210> 59 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Ser Leu Arg Gly Ser Leu Ser Arg Leu Leu Gln Thr Arg Val His Ser 1 5 10 15 Ile Leu Lys Lys Ser Val His Ser Val Ala Val Ile Gly Ala Pro Phe 20 25 30 Ser <210> 60 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Ile Ser Ser Ala Ser Ile Val Tyr Ile 1 5 10 15 Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Pro Glu His Phe Ile Leu 20 25 <210> 61 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Leu Pro Gly Phe Ser Trp Ile Lys Pro Cys Ile Ser Ser Ala Ser Ile 1 5 10 15 Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Pro Glu His Phe Ile Leu 20 25 30 <210> 62 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Met Ser Leu Arg Gly Ser Leu Ser Arg Leu Leu Gln Thr Arg Val His 1 5 10 15 Ser Ile Leu Lys Lys Ser 20 <210> 63 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Met Ser Leu Arg Gly Ser Leu Ser Arg Leu Leu Gln Thr Arg Val His 1 5 10 15 Ser Ile Leu Lys Lys Ser Val His Ser Val Ala Val Ile Gly Ala Pro 20 25 30 Phe Ser Gln Gly Gln Lys Arg Lys Gly Val Glu His Gly Pro Ala Ala 35 40 45 Ile Arg Glu Ala Gly Leu Met Lys 50 55 <210> 64 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser 1 5 10 15 Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg 20 25 30 Lys Ala Gly Leu Leu Glu 35

Claims

(i) 적어도 서열번호 51의 21, 22 및 23번 위치의 아미노산을 포함하거나, 또는 (ii) 서열번호 51의 180 내지 229번 위치로부터 선택된, 서열번호 51의 적어도 9개의 연속적인 아미노산의 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 인간 아르기나제 2(서열번호 51)의 면역원성 단편인 폴리펩티드.
청구항 1에 있어서, 상기 (i) 또는 (ii)에서 정의된 바와 같은 서열번호 51의 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개까지의 연속적인 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 것인 폴리펩티드.
청구항 1 또는 2에 있어서, 서열번호 59, 58, 57, 54, 55, 56, 2, 3, 19, 20, 21, 60 또는 61 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 폴리펩티드.
선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 아미노산의 최대 길이를 갖거나 및/또는 C-말단 아미노산이 상응하는 아미드(amide)로 대체된 것인 폴리펩티드.
선행하는 청구항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 및 아쥬반트를 포함하는 조성물.
청구항 5에 있어서, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 보존제를 포함하는 것인 조성물.
청구항 5 또는 6에 있어서, 상기 아쥬반트는 박테리아 DNA 기반 아쥬반트, 오일/계면활성제 기반 아쥬반트, 바이러스 dsRNA 기반 아쥬반트, 이미다조키닐린(imidazochiniline), 및 몬타니드 ISA 아쥬반트로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 청구항 5 내지 7의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 적어도 부분적으로 아르기나제 2의 부적절하거나 과도한 면역 억제 기능을 특징으로 하고, 및/또는 상기 질병 또는 상태는 암인 것인 방법.
청구항 8 또는 9에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 암이고, 선택적으로 상기 방법은 추가 암 요법의 동시 또는 순차적 투여를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 추가 암 요법이 면역계 체크포인트 억제제, 바람직하게는 항체인 것인 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 항체는 항-PD1 항체인 것인 방법.
청구항 8 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 신장암, 전립선암, 유방암, 뇌암, 두경부암 또는 소장암이거나, 결장직장암 또는 위암이거나, 흑색종이거나, 백혈병, 바람직하게는 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML)이고, 선택적으로 상기 암은 면역계 체크포인트 억제제에 의한 치료에 내성인 것인 방법.
아르기나제 2-특이적 T 세포를 자극하는 방법으로서,
상기 방법은 상기 세포를 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 청구항 5 내지 7의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 선택적으로 상기 세포는 건강한 개체 또는 암 환자로부터 채취한 샘플, 선택적으로 종양 샘플에 존재하는 것인 방법.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.