CZ149998A3

CZ149998A3 - Použití proteinového produktu neurotrofického faktoru (GDNF) odvozeného od gliální buněčné linie pro výrobu farmaceutické kompozice

Info

Publication number: CZ149998A3
Application number: CZ981499A
Authority: CZ
Inventors: Qiao Yan; Jean-Claude Marcel Louis
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 1995-11-29
Filing date: 1996-11-22
Publication date: 1998-08-12
Also published as: AU696772B2; WO1997019695A1; DK0866719T3; NO982276D0; JP4066201B2; SK65898A3; US5641749A; CA2236158A1; NO982276L; DE69609084D1; CN1203531A; KR19990071541A; BR9611748A; ATE194081T1; IL124600A0; HUP0001078A2; MX9803968A; AU1163197A; EP0866719B1; PT866719E

Description

Oblast techniky . Předkládaný vynález se obecně týká způsobů léčby poškození nebo degenerace gangliových buněk sítnice podáním proteinového * produktu neurotrofického faktoru (GDNF) odvozeného od gliální buněčné linie. Vynález se přesněji týká způsobů pro léčbu glaukomu nebo jiných onemocnění/stavů, při kterých dochází k degeneraci gangliových buněk sítnice.

Dosavadní stav techniky

Neurotrofické faktory jsou přirozené proteiny nacházené v nervovém systému nebo v jiných než nervových tkáních inervovaných nervovým systémem, jejichž funkcí je podporovat přežívání a udržovat fenotypovou diferenciaci jistých nervů a/nebo populací gliálních buněk (Varon et al., Ann. Rev. Neuroscience, 1: 327, 1979; Thoenen et al., Science, 229: 238, 1985). Vzhledem k této fyziologické roli jsou neurotrofické faktory užitečné v léčbě degenerace takových nervových buněk a při ztrátě diferencované funkce, která vzniká při poškození nervu. Poškození nervu je způsobené stavy, které ohrožují přežívání a/nebo správnou funkci jednoho nebo více typů nervových buněk, včetně: (1) fyzikálního poškození, které způsobuje degeneraci axonálních výběžků (což potom způsobuje smrt nervové buňky) a/nebo těl nervových buněk poblíž místa poškození, (2) přechodného nebo trvalého zpomalení toku krve (ischemie) do části nervového systému, jako je mrtvice, (3) záměrného nebo náhodného vystavení neurotoxinům, jako jsou

• ·-· · • · protinádorové léky a léky proti AIDS, cisplatina a dideoxycytidin, v příslušném pořadí, (4) chronických metabolických onemocnění, jako je diabetes nebo porucha funkce ledvin, nebo (5) neurodegenerativních onemocnění jako je Parkinsonova nemoc, Alzheimerova nemoc a amyotrofická laterální sklerosa, které vznikají v důsledku degenerace specifických neuronálních populací. Proto, aby byl určitý neurotrofický faktor potenciálně použitelný v léčbě poškození nervu, musí třída nebo třídy nervových buněk reagovat na faktor. Bylo určeno, že ne všechny neuronové populace reagují nebo reagují stejně na všechny neurotrofické faktory.

Prvním identifikovaným neurotrofickým faktorem byl nervový růstový faktor (NGF). NGF je prvním členem definované rodiny trofických faktorů, nazývané neurotrofiny, která nyní zahrnuje z mozku odvozený neurotrofický faktor (BDNF), neurotrofin-3 (NT-3), NT-4/5, a NT-6 (Thoenen, Trends Neurosci., 14: 165 - 170, (1991);

Snider, Cell, 77: 627 - 638 (1994); Bothwell, Ann. Rev. Neurosci., 18: 223 - 253, 1995). Tyto neurotrofiny působí cestou rodiny trk receptorů pro tyrosin kinasu, t.j. trkA, trkB, trkC a nízko afinitního p75 receptorů (Snider, Cell, 77: 627 - 638 (1994); Bothwell, Ann. Rev. Neurosci., 18: 223 - 253, 1995); Chao et al., TINS 18: 321 - 326, (1995).

Od gliální buněčné linie odvozený faktor (GDNF) je nově objevený protein identifikovaný a přečištěný za použití testů založených na jeho účinnosti v navození přežívání a stimulace transmiterového fenotypu mesencephalických dopaminergních neuronů in vitro (Lin et al., Science, 260: 1130 - 1132, 1993). GDNF je glykosylovaný homodimer vázaný disulfidovou vazbou, který má určitou strukturální homologii se super rodinou transformujícího • · • · růstového faktoru beta (TGF-β) (Lin et al., Science, 260: 1130 1132, 1993; Krieglstein et al., EMBO J., 14: 736 - 742, (1995);

Poulsen et al., Neuron, 13: 1245 - 1252, (1994). GDNF mRNA byla detekována ve svalech a ve Schwanových buňkách v periferním nervovém systému (Henderson et al., Science, 266: 1062 - 1064, (1994); Trupp et al., J. Cell. Biol., 130: 137 - 148, (1995) a v astrocytech typu 1 v centrálním nervovém systému (Schaar et al., Exp. Neurol., 124: 368 - 371, (1993). In vivo stimuluje léčba exogenním GDNF dopaminergní fenotyp neuronů substantia nigra a obnovuje funkční deficit indukovaný axotomií nebo dopaminergními neurotoxiny ve zvířecích modelech Parkinsonovi nemoci (Hudson et al., Brain Res. Bull., 36: 425 - 432, (1995); Beck et al.,

Nátuře, 373: 339 - 341, (1995); Tomac et al., Nátuře, 373: 335 339, (1995); Hoffer et al., Neurosci. Lett., 182: 107 - 111, (1994). Ačkoliv původně se soudilo, že je relativně specifický pro dopaminergní neurony, alespoň in vitro, nyní se začínají objevovat důkazy, že GDNF může mít širší spektrum neurotrofických cílů kromě mesencephalických dopaminergních a somatických motorických neuronů (Yan and Matheson, Nátuře, 373: 341 - 344, (1995); Oppenheim et al., Nátuře, 373: 344 - 346, (1995);

Matheson et al., Soc. Neurosci. Abstr., 21: 544, 1995; Trupp et al., J. Cell Biol., 130: 137 - 148, (1995). Konkrétně, bylo zjištěno, že GDNF má neurotrofické účinky na cholinergní motorické neurony v mozkovém kmeni a krční míše, jak in vivo, tak in vitro (Oppenheim et al., Nátuře, 373: 344 - 346, (1995); Zurn et al., Neroreport, 6: 113 - 118, 1994; Yan et al., Nátuře, 373: 341 - 344, 1995; Henderson et al., Science, 266: 1062 - 1064, 1994) .

Tematicky příbuzou k předkládanému vynálezu je WO93/06116 (Lin et al., Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture), publikovaná • · • · · · • ·

·· · ·· · ♦ * · · • · · β · · • · · · · ·· · ·

1.5.1993, která popisuje, že GDNF je použitelný v léčbě nervového poškození, včetně poškození asociovaného s Parkinsonovou nemocí. Také související jsou zprávy od Schmidt-Kastner et al., Mol. Brain Res., 26:325 - 330, 1994, že GDNF mRNA se stala detekovatelnou a byla up-regulována po pilokarpinem indukovaných záchvatech; zprávy od Schaar et al., Exp. Neurol., 124: 368 - 371, 1993 a Schaar et al., Exp. Neurol., 130: 387 393, 1994, že astrocyty předního mozku exprivují střední hladiny GDNF mRNA při kultivačních podmínkách, ale že GDNF nealteruje bazální ChAT aktivitu předního mozku; a související je nynější U.S. přihláška sériové č. 08/535682, podaná 28.10.1995, že GDNF je užitečný v léčbě poškození nebo degenerace cholinergních neuronů bazálního předního mozku. U GDNF nebylo nikdy předtím ukázáno, že by navozoval přežívání nebo regeneraci poškozených gangliových buněk sítnice.

Gangliové buňky sítnice hrají hlavní roli ve vizuální percepci, která má několik stadií. Nejprve, světlo je konvertováno na elektrické signály specializovanými neurony, nazývanými fotoreceptory, které jsou umístěné ve vnější vrstvě sítnice. Tyto signály jsou potom kombinovány a přenášeny interneurony do gangliových buněk sítnice, které potom předávají tuto informaci do zrakové oblasti kůry mozkové. Axony gangliových buněk sítnice se spojují a tvoří optický nerv, který se projikuje do nucleus geniculatus lateralis a colliculus superior mozku, stejně jako do jader mozkového kmene.

Poškození gangliových buněk sítnice je primární poškození pozorované u glaukomu, který je třetí nej častější příčinnou slepoty. Glaukom je termín používaný pro skupinu onemocnění charakterizovaných optickou neuropatií obsahující progresivní • · ·· · · ···· ·· • · · · » · • · · · · · · · ····· * · · ··** · • · · · · · · ztrátu gangliových buněk sítnice. Toto poškození gangliových buněk sítnice je charakterizováno dysfunkcí axonálního transportu a histopatologickými abnormalitami axonů v papile optického nervu, a je asociováno s typickou excavací papily optického nervu. Degenerace optického nervu může také vznikat z jiných poruch optického disku, např. z edemu papily ze zvýšeného nitrolebního tlaku, papilitidi (formy optické neuritidy) nebo ischemie.

Ve většině případů glaukomu je poškození optického nervu způsobeno zvýšeným nitroočním tlakem. Hlavní typy glaukomu asociované se zvýšeným nitroočním úhlem jsou s otevřeným úhlem, uzavřeným úhlem a sekundární glaukomy. V některých případech glaukomu se vyskytuje podobná exkavace papily nervu i přes normální nitrooční tlak. Ve všech případech platí, že vyšší nitrooční tlak je obecně asociován s vyšším poškozením nervu. Glaukom je obvykle léčen pokusy o snížení nitroočního tlaku, bud' léky nebo chirurgicky.

Chronický glaukom s otevřeným úhlem je nejběžnějším typem a vyskytuje se u 0,5 % Amerických a Evropských dospělých. V tomto typu glaukomu je blokáda resorpce vodnaté tekutiny uvnitř oka, což způsobuje zvýšení nitroočního tlaku nad normální maximum 21 mm Hg a stupňující se destrukci axonů a podpůrné tkáně v optickém disku.Tento typ glaukomu je pravidelně asymptomatický, dokud není pokročilý. Počáteční ztráta zraku je pozorována v periferním zrakovém poli. Diagnosa se provádí měřením nitroočního tlaku, vyšetřením optického disku a testováním zorného pole pacienta. Léčba je primárně medikamentosní, lokálním podáváním parasympatomimetik (pilokarpinu a karbacholu) beta-adrenergních blokátorů (timololu) a sympatomimetik (epinefrinu), které působí • · • ··· · ··· ··· · · ·· · · · ·· · · snížení nitroočního tlaku. Pokud tato medikace, jednotlivě nebo v kombinacích, dále nezabraňuje progresivnímu poškození, pak jsou předepisována nepřímá parasympatomimetika (echothiofat) a inhibitory karboanhydrasy (acetazolamid a methazolamid).

Pokud selže medikamentosní terapie, pak může být provedena chirurgická léčba pro otevření výtokových kanálů. Podtřída glaukomů s otevřeným úhlem je kongenitální, vznikající z vývojové vady jistých anatomických struktur v oku.

U glaukomů s uzavřeným úhlem je výtoku vodnaté tekutiny mechanicky zabraňováno mělkou přední komorou. Nitrooční tlak zůstává normální, dokud pupilární blok (způsobující odpor průtoku kapaliny přes pupilu) neuzavře resorptivní povrch úhlu. Tlak potom prudce stoupá, obvykle nad 50 mm Hg. Tento glaukom je obyčejně monookulární a je charakterizovaný červeným a bolestivým okem, fixovanou a dilatovanou pupilou, zhoršením zraku, citlivostí a nevolností. Akutní ataka je neodkladnou událostí a je léčena parenterálním acetazolamidem, orálním glycerolem nebo intravenosním manitolem, a lokálním podáním pilokarpinu a někdy timololu. Po zvládnutí akutní ataky může být anatomická překážka eliminována chirurgicky.

Sekundární glaukom se vyvíjí v důsledku jiných očních onemocnění. Příkladem jsou glaukomy vzniklé nabobtnáním čočky, neovaskularizací (tvorbou nových cév) ve strukturách úhlu, chronickým zánětem, nebo vážným tupým poraněním struktur úhlu. Léčbou sekundárního čočkou indukovaného glaukomu je chirurgické odstranění čočky. Většina ostatních sekundárních glaukomů je zvládána medikamentosně stejným způsobem jako primární glaukomy s otevřeným úhlem. Glaukom způsobený neovaskularizací je obtížně léčitelný, ale může být zlepšen laserovou fotokoagulací.

Stále zde existuje potřeba způsobů a terapeutických kompozic použitelných pro léčbu poškození gangliových buněk sítnice asociovaných se stavy jako je glaukom. Takové způsoby a terapeutické kompozice budou ideálně chránit gangliové buňky sítnice a optický nerv před progresivním poškozením a budou navozovat přežívání a regeneraci poškozených neuronů, bez vážných nežádoucích vedlejších účinků.

Oblast vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje způsoby pro léčbu poškození nebo degenerace gangliových buněk sítnice podáním terapeuticky účinného množství proteinového produktu neurotrofického faktoru odvozeného od gliální buněčné linie (GDNF). Podle jednoho specifického aspektu vynálezu jsou poskytnuty způsoby pro léčbu glaukomu podáním terapeuticky účinného množství GDNF proteinového produktu. V jiném aspektu jsou poskytnuty způsoby pro léčbu poškození nebo degenerace optického nervu způsobeného stavy poškozujícími papilu optického nervu jako je glaukom, edem papily, papilitis a ischemie. Terapeuticky účinné množství GDNF proteinového produktu je podáno pro navození přežívání nebo regenerace axonů gangliových buněk sítnice tvořících optický nerv. Je předpokládáno, že takový GDNF proteinový produkt bude zahrnovat GDNF protein tak, jak je znázorněn aminokyselinovou sekvencí danou SEQ ID NO: 1, stejně jako jeho varianty a deriváty. Předkládaný vynález je založen na objevu, že gangliové buňky sítnice selektivně vychytávají a retrográdně transportují GDNF proteinový produkt a že GDNF navozuje přežívání gangliových buněk sítnice in vitro a na objevu, že GDNF navozuje přežívání poškozených gangliových buněk sítnice in vivo, t.j. přežívání hlavní populace neuronů poškozených u glaukomu.

• · · · • · • ·

Podle vynálezu, GDNF proteinový produkt může být podán parenterálně v dávce od 1 Mg/kg/den do asi 100 mg/kg/den, typicky v dávce 0,1 mg/kg/den až 25 mg/kg/den a obvykle v dávce asi 5 mg/kg/den až 20 mg/kg/den. Je také předpokládáno, že v závislosti na potřebách jednotlivých pacientů a na způsobu podání, může být GDNF proteinový produkt podán nižší frekvencí, jako je jednou týdně nebo několikrát týdně, spíše než denně. Je také předpokládáno, že GDNF proteinový produkt může být podán přímo intraokulárně. Odborníkům v oboru bude jasné, že k takovému intraokulárnímu podání může být použito menší množství GDNF proteinového produktu, například může být intraokulární dávka v rozsahu okolo 1 ^g/oko až asi 1 mg/oko v jedné injekci nebo jako více injekcí. Dále se předpokládá, že GDNF protinový produkt může být podán v kombinaci nebo v konjunkci s účinným množstvím druhého terapeutického agens pro glaukom.

Vynález také poskytuje použití GDNF proteinového produktu ve výrobě léku nebo farmaceutické kompozice pro léčbu poškození nebo degenerace gangliových buněk sítnice, včetně léčby glaukomu. Takové farmaceutické kompozice zahrnují lokální, orální nebo parenterální formulace GDNF proteinového produktu. Odborníkům bude také jasné, že proces podání může být proveden prostředky buněčné a genové terapie, jak je popsáno dále. Mnoho dalších aspektů a výhod vynálezu budou zřejmé odborníkům v oboru po seznámení se s následujícím podrobným popisem vynálezu, které popisují jeho preferovaná provedení.

Předkládaný vynález poskytuje způsob pro léčbu poškození nebo degenerace gangliových buněk sítnice podáním terapeuticky účinného množství proteinového produktu neurotrofického faktoru • · · · • · ♦ · · ···· ··>- « • · · · *··· · • ··««· · ·« • · · · · ··· ·· · · ··· ·· ·· odvozeného od gliální buněčné linie (GDNF). Podle jednoho aspektu vynálezu jsou poskytnuty metody pro léčbu degenerace gangliových buněk sítnice způsobené glaukomem, kde tyto metody obsahují podání terapeuticky účinného množství GDNF proteinového produktu ve farmaceutické kompozici, implantací GDNF exprivujících buněk, nebo GDNF genovou terapií. Vynález může být prováděn za použití jakéhokoiv biologicky aktivního GDNF proteinového produktu, včetně GDNF proteinu representovaného aminokyselinovou sekvencí danou v SEQ ID NO: 1, včetně jejích variant a derivátů. Kromě orálního, parenterálního nebo lokálního podání GDNF proteinového produktu je také předpokládáno podání prostřednictvím postupů buněčné a genové terapie.

Předkládaný vynález je založen na počátečním objevu, že GDNF navozuje přežívání gangliových buněk sítnice v kultuře a že gangliové buňky sítnice selektivně vychytávají a retrográdně transportují GDNF receptorově specifickým způsobem. Potom bylo určeno, že GDNF hraje roli ve vývoji, přežívání a zachování funkce těchto neuronů. Kromě toho, vynález je založen na objevu, že GDNF proteinový produkt zvyšuje in vivo přežívání poškozených gangliových buněk sítnice, kde tyto buňky tvoří hlavní populaci neuronů poškozených u glaukomu. Je stanoveno, že podání exogenního GDNF proteinového produktu bude chránit gangliové buňky sítnice před traumatickým poškozením vznikajícím v důsledku chybění neurotrofických faktorů, což je způsobeno přerušením tranportu faktorů z axonů do buněčných těl. Od takové léčby se očekává, že umožní gangliovým buňkám tolerovat přerušované insulty buď z tlaku očního, chabé vaskulární nutrice nebo z jiných příčin, které mohou jinak způsobit glaukom nebo jiné onemocnění optického nervu, a že umožní zachování funkční integrity optického nervu.

Podle vynálezu může být GDNF proteinový produkt podán parenterálně v dávce od asi 1 μ9/^9/άβη do asi 10 mg/kg/den, typicky v dávce okolo 0,1 mg/kg/den do asi 25 mg/kg/den, a obvykle v dávce okolo 5 mg/kg/den do asi 20 mg/kg/den. GDNF proteinový produkt může být podán přímo intraokuárně. V takovém případě bude použito menší množství GDNF proteinového produktu, například od asi 1 μg/oko do asi 1 mg/oko v jedné injekci nebo v několika injekcích. GDNF může být také podán do subretinálního prostoru mezi fotoreceptorovou vrstvou a pigmentovou epiteliální vrstvu sítnice. Dále se předpokládá, že GDNF proteinový produkt může být podán spolu s účinným množstvím druhého terapeutického agens pro léčbu glaukomu. Taková druhá agens budou zahrnovat, například, parasympatomimetika (pilokarpin a karbachol), beta-adrenergní blokátory (timolol) , sympatomimetika (epinefrin), nepřímá parasympatomimetika (echothiofat) a inhibitory karboanhydrasy (acetazolamid a methazolamid) . Vynález také poskytuje použití GDNF proteinového produktu v přípravě léku pro léčbu poškození nebo degenerace gangliových buněk sítnice, včetně léčby glaukomu. Mnoho farmaceutických formulací a různých technik podání je podrobně popsáno dále.

Jak je zde použito, zahrnuje termín GDNF proteinový produkt přečištěný přirozený, syntetický nebo rekombinantní neurotrofický faktor odvozený od gliální buněčné linie, biologicky aktivní varianty GDNF (včetně inserčních, substitučních a delečních variant), a jeho chemicky modifikované deriváty. Také jsou zahrnuty GDNF, které jsou významně homoogní k lidskému GDNF majícímu aminokyselinovou sekvenci danou SEQ ID NO: 1. GDNF proteinový produkt může existovat ve své aktivní formě jako homodimery nebo jako heterodimery.

• * · · · «

Termín biologicky aktivní, jak je zde použit, znamená, že GDNF proteinový produkt vykazuje podobné neurotrofické vlastnosti, ale ne nutně úplně stejné vlastnosti, a ne nutně ve stejném rozsahu, jako GDNF mající aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 1. Výběr požadovaných určitých neurotrofických vlastností závisí na účelu, pro který je GDNF proteinový produkt podáván.

Termín významně homologní, jak je zde použit, znamená mající takový stupeň homologie s GDFN majícím aminokyselinovou sekvenci danou v SEQ ID NO: 1, který preferovaně přesahuje 70%, lépe přesahuje 80% a nejlépe přesahuje 90 nebo 95%. Například, homologie mezi krysím a lidským proteinem je asi 93% a předpokládá se, že preferované savčí GDNF budou mít podobně vysoký stupeň homologie. Procento homologie jak je zde popsáno je počítáno jako procento aminokyselinových zbytků nalezených v menší ze dvou sekvencí, které odpovídá identickým aminokyselinovým zbytkům v sekvenci, která je srovnávána, za předpokladu, že na délku 100 aminokyselin mohou být zavedeny čtyři mezery pro usnadnění sestavení (jak je dáno v Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, svazek 5, str. 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C.

(1972), což je zde uvedeno jako odkaz). Jako významně homologní jsou také zahrnuty GDNF proteinové produkty, které mohou být izolovány pomocí zkřížené reaktivity s protilátkami k GDNF podle SEQ ID NO: 1 nebo jejichž geny mohou být izolovány hybridizací s genem nebo segmenty genu kóduj ícími GDNF SEQ ID NO: 1.

GDNF proteinový produkt podle předkládaného vynálezu může být izolován nebo může být generován jakýmikoliv prostředky, které jsou odborníkům známy. Příkladné způsoby pro produkci GDNF proteinových produktů použitelných v předkládaném vynálezu jsou popsány v U.S. přihlášce pořadové č. 08/182183, podané 23.5.1994 a v její sesterských přihláškách; PCT přihlášce č.

PCT/US92/07888, podané 17.9.1992, publikované jako WO 93/06116 (Lin et al., Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture); Evropské patentové přihlášce č. 92921022, publikované jako EP 610254; a v související U.S. přihlášce pořadové č. 08/535681, podané 28.9.1995 (Truncated Glial Cell-line Derived Neurotrophic Factor), jejichž objevy jsou zde uvedeny jako odkaz.

Přirozeně se vyskytující GDNF proteinové produkty mohou být izolovány z přípravků savčích neuronálních buněk, nebo ze savčích buněčných linií secernujících nebo exprivujících GDNF. Například, WO 93/06116 popisuje izolaci GDNF z bezsérového kondicionovaného media B49 glioblastomových buněk. GDNF proteinové produkty mohou být také syntetizovány chemicky jakýmikoliv prostředky, které jsou známy odborníkům v oboru. GDNF proteinové produkty jsou preferovaně produkovány rekombinantními technikami, protože ty jsou schopné dosáhnout významně vyšších množství proteinů vyšší čistoty. Rekombinantní formy GDNF proteinového produktu zahrnují glykosylované a neglykosylováné formy proteinu, a protein exprivovaný v bakteriálních, savčích nebo hmyzích buněčných systémech.

Obecně, rekombinantní techniky vyžadují izolaci genů odpovědných za kódování GDNF, klonování genů ve vhodných vektorech a typech buněk, modifikaci genů, pokud je to nutné pro kódování požadované varianty a expresi genů tak, aby produkovaly GDNF proteinový produkt. Alternativně, nukleotidová sekvence kódující požadovaný GDNF proteinový produkt může být syntetizována chemicky. Předpokládá se, že GDNF proteinový • · · · produkt může být exprivován za použití nukleotidových sekvencí, které se liší v pořadí kodonů díky degeneraci genetického kódu nebo alelickým variacím. WO 93/06116 popisuje izolaci a sekvencování cDNA klonu krysího GDNF genu a izolaci, sekvencování a expresi genomového DNAklonu lidského GDNF genu. WO 93/06116 také popisuje vektory, hostitelské buňky a kultivační podmínky kultury pro expresi GDNF proteinového produktu. Další vektory vhodné pro expresi GDNF proteinového produktu v E. coli jsou popsány v publikované Evropské patentové přihlášce č. EP 0 423 980 (Stem Cell Faktor, publikované 24.4.1991, jejíž objev je zde uveden jako odkaz. DNA sekvence genu kódujícího zralý lidský GDNF a aminokyselinová sekvence GDNF jsou ukázány na obrázku 19 (SEQ ID NO: 5) WO 93/06116. Obrázek 19 neukazuje celou kódující sekvenci pro pre-pro část GDNF, ale prvních 50 aminokyselin lidského pre-pro GDNF je ukázáno na obrázku 22 (SEQ ID NO: 8) W093/06116.

Přirozeně se vyskytující GDNF je disulfidovou vazbou vázaný dimer ve své biologicky aktivní formě. Materiál izolovaný po expresi v bakteriálním systému je v podstatě biologicky inaktivní, a existuje jako monomer. Skládání je nezbytné pro produkci biologicky aktivního dimeru vázaného disulfidovou vazbou. Procesy pro skládání a naturaci GDNF exprivovaného v bakteriálníh systémech jsou popsány ve WO 93/06116. Standartní in vitro testy pro určení aktivity GDNF jsou popsány v WO93/06116 a v související U.S. přihlášce pořadové č. 08/535681, podané 28.9.1995, a jsou zde uvedeny jako odkaz.

• · · ·

A. Varianty GDNF

Termín varianty GDNF jak je zde použit zahrnuje polypeptidy, ve kterých byly aminokyseliny deletovány (deleční varianty), insertovány do (adiční varianty), nebo substituovány za (substituční varianty) zbytky uvnitř aminokyselinové sekvence přirozeně se vyskytujícího GDNF. Takové varianty jsou připraveny zavedením vhodných nukleotidových změn do DNA kódující polypeptid nebo in vitro chemickou syntesou požadovaného polypeptidu. Odborníkům v oboru bude jasné, že může být provedeno mnoho kombinací delecí, insercí, a substitucí, při kterých vznikne konečná molekula mající biologickou aktivitu GDNF.

Techniky mutagenese pro náhradu, inserci nebo deleci jednoho nebo více vybraných aminokyselinových zbytků jsou odborníkům v oboru dobře známé (např. U.S. patent č. 4518584, jehož objev je zde uveden jako odkaz). Existují dvě základní proměnné v konstrukci variant: umístění místa mutace a charakter mutace. V projekci variant GDNF bude výběr místa mutace a charakteru mutace záviset na charakteristice GDNF, která má být modifikována. Místa pro mutaci mohou být modifikována jednotlivě nebo v sérii, např. (1) substitucí nejprve konzervativní aminokyselinou a potom více radikální selekcí v závislosti na dosažených výsledcích, (2) delecí cílového aminokyselinového zbytku nebo (3) insercí aminokyselinových zbytků do sousedství vybraného místa.

Jsou preferovány konzervativní změny od 1 do 20 aminokyselin. Jakmile je určena aminokyselinová sekvence požadovaného GDNF proteinového produktu, pak je snadno určena sekvence nukleové kyseliny, která je použita v expresi proteinu. N-terminální a C-terminální deleční varianty mohou být také generovány proteolytickými enzymy.

Pro deleční varianty GDNF je delece obecně v rozsahu od 1 do 30 zbytků, lépe od 1 do 10 zbytků a typicky od 1 do 5 sousedících zbytků. N-terminální, C-terminální a vnitřní intrasekvencové delece jsou brány v úvahu. Delece mohou být zavedeny do regionů s malou homologií s jinými členy superrodiny TGF-β pro modifikaci aktivity GDNF. Delece v oblasti s významnou homoogií s jinými sekvencemi ze superrodiny TGF-β budou s větší pravděpodobností modifikovat biologickou aktivitu GDNF významněji. Počet po sobě jdoucích delecí bude vybrán tak, aby byla zachována terciální struktura GDNF proteinového produktu v postižené doméně, např. cysteinová zkřížená vazba. Neomezující příklady delečních variant zahrnují zkrácené GDNF proteinové produkty postrádající od jedné do čtyřiceti N-terminálních aminokyselin GDNF, nebo varianty postrádající C-terminální zbytek GDNF, nebo jejich kombinace, jak je popsáno v související U.S. přihlášce pořadové č. 08/535681, podané 28.9.1995, která je zde uvedena jako odkaz.

Pro adiční varianty GDNF obsahují aminokyselinové adice typicky N-a/enbo C-terminální fúze délky od 1 zbytku do polypeptidů obsahujících stovky nebo více zbytků, stejně jako vnitřní intrasekvenční adice jednoho nebo mnoha aminokyselinových zbytků. Vnitřní adice mohou být obecně v rozsahu od 1 do 10 zbytků, častěji od 1 do 5 zbytků a obvykle od 1 do 3 aminokyselinových zbytků. Příklady N-terminálních adičních variant zahrnují GDNF s N-terminálním methionylovým zbytkem (artefaktem přímé exprese GDNF v bakteriálních rekombinantních buněčných kulturách), který je označen (Met^-1)GDNF, a fúze heterologní N-terminální koncové sekvence na N-konec GDNF pro usnadnění sekrece zralého GDNF z rekombinantních hostitelských buněk. Takové signální sekvence budou obyčejně získány z, a tak budou homologní k, zamýšlenému druhu hostitelských buněk. Adice • · ·· • · ·· · · • · · « · ·· • · ·· • · · · · · · mohou také obsahovat aminokyselinové sekvence odvozené od sekvencí jiných neurotrofických faktorů. Preferovaný GDNF proteinový produkt pro použití podle předkládaného vynálezu rekombinantní (Met¹)GDNF.

• ·· •« • · ·· •· • · je

Substituční varianty GDNF mají alespoň jeden aminokyselinový zbytek aminokyselinové sekvence GDNF odstraněn a jiný zbytek umístěn na jeho místo. Takové substituční varianty zahrnují alelické varianty, které jsou charakterizovány změnami přirozeně se vyskytující nukleotidové sekvence v populaci druhu, které mohou, ale nemusí vést ke změně aminokyselin. Příklady substitučních variant (viz např. SEQ ID NO: 50) jsou popsány v související U.S. přihlášce pořadové č. 08/535681, podané 28.9.1995, a jsou zde uvedeny jako odkaz.

Specifické mutace aminokyselinové sekvence GDNF mohou obsahovat modifikace glykosylačního místa (např. šeřinu, threoninu nebo asparaginu). Absence glykosylace nebo pouze částečná glykosylace vede k aminokyselinové substituci nebo deleci v jakémkoliv na asparagin vázaném glykosylačním rozpoznávacím místě nebo v jakémkoliv místě molekuly, které je modifikováno adicí O-vázaného uhlovodanu. Asparagin vázané rozpoznávací místo pro glykosylaci obsahuje tripeptidovou sekvenci, která je specificky rozpoznávána vhodnými buněčnými glykosylačními enzymy. Tyto tripeptidové sekvence jsou bud' Asn-Xaa-Thr nebo Asn-Xaa-Ser, kde Xaa může být jakákoliv aminokyselina jiná než Pro. Mnoho aminokyselinových substitucí nebo deleci v jedné nebo obou první nebo třetí aminokyselinové pozici rozpoznávacích míst pro glykosylaci (a/nebo aminokyselinových deleci ve druhé pozici) vede k tomu, že neproběhne glykosylace v modifikované tripeptidové sekvenci. Tak a · exprese vhodně změněných nukleotidových sekvencí produkuje varianty, které nejsou v tomto místě glykosylovány. Alternativně může být aminokyselinová sekvence GDNF modifikována pro přidání míst pro glykosylaci.

Jednou metodou pro identifikaci aminokyselinových zbytků nebo regionů GDNF pro mutagenesi je alanin snímací mutagenese jak jí popsal Cunningham a Wells (Science, 244: 1081 - 1085, 1989). V této metodě jsou identifikovány aminokyselinové zbytky nebo skupina cílových aminokyselinových zbytků (např. nabité zbytky jako je Arg, Asp, His, Lys a Glu) a jsou nahrazeny neutrálními aminokyselinami nebo aminokyselinami s negativním nábojem (nejlépe alaninem nebo polyalaninem) pro narušení interakce aminokyselin s okolním vodným prostředím mimo buňku. Ty domény, které ukazují funkční sensitivitu na substituce jsou potom upraveny zavedením adičních nebo alternativních zbytků do místa substituce. Tak je určeno cílové místo pro zavedení variace aminokyselinové sekvence, na odpovídajícím cílovém kodonu nebo regionu DNA sekvence je provedeno alaninové snímání nebo náhodná mutagenese a exprivované GDNF varianty jsou vyšetřovány na optimální kombinace požadované aktivity a stupně aktivity.

Nejdůležitější místa pro substituční mutagenesi zahrnují místa, kde jsou aminokyseliny nacházené v GDNF proteinech z různých druhů významně odlišné ve smyslu velikosti postraních řetězců, náboje, a/nebo hydrofobnosti. Jiná důležitá místa jsou ty, kde jsou určitá místa GDNF podobných proteinů, získaných od různých druhů, identická. Takové pozice jsou obecně důležité pro biologickou aktivitu proteinu. Nejprve jsou tato místa substituována relativně konzervativním způsobem. Takové konzervativní substituce jsou ukázány v tabulce 1 pod záhlavím • · ·

preferované substituce.Pokud takové substituce vedou ke změně biologické aktivity, pak jsou zavedeny podstatnější změny (příkladné substituce) a/nebo mohou být provedeny jiné adice nebo delece a je vyšetřována aktivita vzniklého produktu.

Tabulka 1 - Aminokyselinové substituce

Původní zbytek	Preferované substituce	Příkladné substituce
Ala (A)	Val	Val, Leu, Ile
Arg (R)	Lys	Lys, Gin, Asn
Asn (N)	Gin	Gin, His, Lys, Arg
Asp (D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser	Ser
Gin (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro	Pro
His (H)	Arg	Asn, Gin, Lys, Arg
Ile (I)	Leu	Leu, Val, Met, Ala,

Phe, norleucin

Leu	(L)	Ile	norleucin, Met, Ala,	Ile, Phe	Val
Lys	(K)	Arg	Arg, Gin,	Asn
Met	(M)	Leu	Leu, Phe,	Ile
Phe	(F)	Leu	Leu, Val,	Ile,	Ala
Pro	(P)	Gly	Gly
Ser	(S)	Thr	Thr
Thr	(T)	Ser	Ser
Trp	(W)	Tyr	Tyr
Tyr	(Y)	Phe	Trp, Phe,	Thr,	Ser
Val	(V)	Leu	Ile, Leu,	Met,	Phe,

Ala, norleucin • · • * · ·

• «

Konzervativní modifikace aminokyselinové sekvence (a odpovídající modifikace kódující sekvence nukleových kyselin by měly produkovat GDNF proteinové produkty mající funkční a chemické charakteristiky podobné těm, které má přirozený GDNF. Oproti tomu, významné modifikace funkčních a/nebo chemických charakteristik GDNF proteinových produktů mohou být provedeny výběrem substitucí, které se významně liší v jejich účinku na uchování (a) struktury polypeptidové kostry v oblasti substitucí, jako je například, struktura listu nebo šroubovice, (b) náboje nebo hydrofobicity molekuly v cílovém místě, nebo (c) velikosti postraních řetězců. Přirozeně se vyskytující zbytky se dělí na skupiny na základě společných vlastností postraních řetězců:

1) hydrofobní: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) neutrální hydrofilní: Cys, Ser, Thr;

3) kyselé: Asp, Glu;

4) basické: Asn, Gin, His, Lys, Arg;

5) zbytky, které ovlivňují orientaci řetězce: Gly, Pro; a

6) aromatické: Trp, Tyr, Phe.

Nekonzervativní substituce mohou obsahovat změnu z člena jedné skupiny za Člen jiné. Takové substituované zbytky mohou být zavedeny do regionů GDNF proteinu, které jsou homologní s jinými proteiny superrodiny TGF-β, nebo do nehomologních regionů molekuly.

B. Deriváty GDNF

Chemicky modifikované deriváty GDNF nebo GDNF varianty mohou být odborníkem v oboru podle objevů zde popsaných. Chemické skupiny nejvíce vhodné pro derivatizaci zahrnují ve vodě • · rozpustné polymery. Ve vodě rozpustný polymer je žádoucí, protože protein, na který je připojen, se nesráží ve vodném prostředí, jako je fyziologické prostředí. Preferovaně bude polymer farmaceuticky přijatelný pro přípravu terapeutického produktu nebo kompozice. Odborník v oboru bude schopen vybrat polymer na základě takových okolností, jako zda bude konjugat protein/polymer použit terapeuticky, a pokud ano, tak požadovanou dávku, dobu cirkulace, resistenci na proteolýzu a jiných. Účinnost derivátizace může být ověřena podáním derivátu, požadovaným způsobem (t.j. osmotickou pumpou, nebo lépe injekcí nebo infusí, nebo dále formulovaného derivátu pro orální, pulmonální nebo jiné podání), a určením jeho účinnosti.

Vhodné ve vodě rozpustné polymery zahrnují, ale nejsou omezeny na, polyethylenglykol (PEG), kopolymery ethylenglykol/ propylenglykol, karboxymethylcelulosa, dextran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, poly-1,3-dioxolan, poly-1,3,6-trioxan, ethylen/malein anhydrid kopolymer, polyaminokyseliny (buď homopolymery nebo náhodné kopolymery), a dextran nebo póly(n-vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, propylenglykolové homopolymery, propylen oxid/ethylen oxid ko-polymery, polyoxyethylované polyoly (např. glycerol), polyvinylalkohol, a jejich směsi. Polyethylenglykolpolyaldehyd může být výhodný ve výrobě vzhledem ke své stabilitě ve vodě.

Polymer může mít jakoukoliv molekulovou hmotnost, a může být rozvětvený nebo nerozvětvený. Pro polyethylenglykol, preferované rozmezí molekulové hmotnosti je od asi 2 kDa do asi 100 kDa pro snadné manipulování a zpracování (termín asi znamená, že v přípravcích polyethylenglykolu mohou mít některé molekuly větší a některé menší hmotnost, než je uvedená molekulová hmotnost). Mohou • · • · · · • · být použity jiné velikosti, v závislosti na požadovaném terapeutickém profilu (např. na trvání požadovaného zpomaleného uvolňování, na účinku, pokud je nějaký, na biologickou aktivitu, na snadné manipulaci, na stupni nebo chybění antigenicity nebo na jiných známých účincích polyethylenglykolu na terapeutický protein nebo variantu).

Počet molekul polymeru takto připojených se může lišit, a odborník v oboru bude schopen zjistit účinek na funkci. Je možné mono-derivátizovat, nebo je možné vyrobit di-, tri-, tetra-, nebo některé kombinace derivatizace, se stejnými chemickými skupinami (např. polymery, jako jsou polyethylenglykoly o různé hmotnosti). Poměr molekul polymeru k molekulám proteinu (nebo peptidu) se bude lišit, stejně jako jejich koncentrace v reakční směsi. Obecně, optimální poměr (ve smyslu účinnosti reakce, kde není přebytek nezreagovaného proteinu nebo polymeru) bude určen faktory jako je stupeň derivatizace (např. mono-, di-, tri-, atd.), molekulovou hmotností vybraného polymeru a reakčními podmínkami.

Molekuly polyethylenglykolu (nebo jiných chemických skupin) by měly být připojeny na protein po zvážení účinku na funkční nebo antigenní domény proteinu. Tři metody připojení jsou odborníkům v oboru dostupné. Viz např. EP 0401384, jejíž objev je zde uveden jako odkaz (připojování PEG na G-CSF) , viz také Malik et al. , Exp. Hematol., 20: 1028 - 1035, 1992 (popisuje pegylaci GM-CSF za použití tresylchlorid. Například, polyethylenglykol může být kovalentně vázán přes reaktivní skupinu aminokyselinového zbytku, jako je volná amino nebo karboxylová skupina. Reaktivní skupiny jsou ty, na které může být vázána aktivovaná polyethylenglykolová molekula. Aminokyselinové zbytky mající volnou aminoskupinu • · zahrnují lysinové zbytky a N-terminální aminokyselinové zbytky. Ty, které mají volnou karboxylovou skupinu mohou zahrnovat zbytek kyseliny aspartové, zbytek kyseliny glutamové a C-terminální aminokyselinové zbytky. Sulfhydrylové skupiny mohou také být použity jako reaktivní skupiny pro připojení polyethylenglykolových molekul. Pro terapeutické účely je preferováno připojení v místě amino skupiny, jako je připojení na N-konec nebo na lysinovou skupinu. Mělo by být vyloučeno připojení v místě zbytků důležitých pro vazbu na receptor, pokud je vazba na receptor žádoucí.

Může být specificky požadován N-terminálně chemicky modifikovaný protein. Za použití polyethylenglykolu jako ilustrace předkládaných kompozic je možné vybrat z mnoha polyethylenglykolových molekul (podle molekulové hmotnosti, větvení atd.), poměrů polyethylenglykolových molekul ku proteinovým (nebo peptidovým) molekulám v reakčni směsi, typů provedené pegylační reakce, a metod pro získání vybraného N-terminálně pegylovaného proteinu. Metoda pro získání N-terminálně pegylovaného přípravku (t.j. separace této skupiny od jiných monopegylováných skupin, pokud je to nutné) může být přečištění N-terminálně pegylovaného materiálu z populace pegylovaných molekul proteinu. Selektivní N-terminální chemická modifikace může být provedena redukční alkylací, která využívá různé reaktivity různých typů primárních amino skupin (lysinové versus N-terminální) dostupných pro derivátizaci v určitém proteinu. Za vhodných reakčnich podmínek je dosaženo v podstatě selektivní derivatizace proteinu v N-konci polymerem obsahujícím karbonyl skupinu. Například, je možné selektivně N-terminálně pegylovat protein provedením reakce při pH, které umožňuje využití rozdílu pK mezi e-amino skupinou lysinových zbytků a • · • · a-amino skupinou N-terminálního zbytku proteinu. Takovou selektivní derivatizací je kontrolováno připojení ve vodě rozpustného polymeru na protein: konjugace s polymerem probíhá především na N-konci proteinu a bez signifikantní modifikace jiných reaktivních skupin, jako jsou amino skupiny postraního řetězce lysinu. Při použití redukční alkylace, ve vodě rozpustný polymer může být typu popsaného výše, a měl by mít jeden reaktivní aldehyd pro navázání na protein. Polyethylenglykol propionaldehyd, obsahující jeden reaktivní aldehyd, může být použit.

Předkládaný vynález navrhuje použití derivátů, které jsou v prokaryontech exprivovanými GDNF, nebo jejich varianty, navázané na alespoň jednu molekulu polyethylenglykolu, stejně jako použití GDNF nebo jeho variant, připojených na jednu nebo více molekul polyethylenglykolu acylovou nebo alkylovou vazbou.

Pegylace může být provedena jakoukoliv z pegylačních reakcí v oboru popsaných. Viz například: Focus on Growth Factors, 3 (2): 4 - 10, 1992; EP 0154316, jejíž objev je zde uveden jako odkaz; EP 0401384; a jiné publikace zde citované týkající se pegylace. Pegylace může být provedena acylační reakcí nebo alkylační reakcí s reaktivní molekulou polyethylenglykolu (nebo analogického ve vodě rozpustného polymeru).

Pegylace nebo acylace obecně vyžaduje reakci aktivního esterového derivátu polyethylenglykolu s GDNF proteinem nebo variantou. Jakákoliv známá nebo v budoucnu objevená reaktivní PEG molekula může být použita pro provedení pegylace GDNF proteinu nebo varianty. Preferovaným aktivovaným PEG esterem je PEG esterifikovaný na N-hydroxysukcimid. Jak je zde použito., • · · · acylace je míněna tak, že zahrnuje bez omezení následující typy vazeb mezi terapeutickým proteinem a ve vodě rozpustným polymerem jako je PEG: amidovou, karbaminanovou, uretanovou a podobně. Viz Bioconjugate Chem., 5: 133 - 140, 1994. Reakční podmínky mohou být jakékoliv, které jsou známé v oboru pegylace nebo které budou dále vyvinuty, ale měly by být vyloučeny podmínky teploty, rozpouštědla, a pH, které by mohly inaktivovat GDNF nebo variantu, která je modifikována.

Pegylace acylací bude obyčejně vést k poly-pegylovanému GDNF proteinu nebo variantě. Preferovaně, spojující vazba bude amidová. Také preferovaně bude vzniklý produkt v podstatě pouze (např. > 95%) mono-, di-, nebo tri-pegylovaný. Nicméně, některé druhy s vyšším stupněm pegylace mohou být tvořeny v množství závisejícím na specifických použitých reakčních podmínkách. Pokud je to žádoucí, více přečištěné pegylováné druhy mohou být separovány ze směsi, zejména nezreagované druhy, standartními technikami purifikace, včetně, mimo jiných, dialýzy, vysolování, ultrafiltrace, iontové výměnné chromatografie, gelové filtrační chromatografie a elektroforesy.

Pegylace alkylací obyčejně vyžaduje reakci terminálního aldehydového derivátu PEG s GDNF proteinem nebo variantou za přítomnosti redukčního činidla. Pegylací alkylací může také vzniknout poly-pegylovaný GDNF protein nebo varianta. Kromě toho, je možné upravit reakční podmínky tak, že upřednostňují pegylaci v podstatě na pouze a-amino skupině N-konce GDNF proteinu nebo varianty (t.j. monopegylováný protein). Aú v případě monopegylace nebo polypegylace, PEG skupiny jsou preferovaně připojeny na protein přes -CH2-NH- skupinu. S ohledem na -CH2- skupinu je tento typ vazby zde označován jako alkylová vazba.

• · ·

• · < · · · · • ···· k ^ ·· • · · · ···· · • · · · · · • · · ·· · * »·

Derivatizace redukční alkylací pro produkci monopegylováných produktů využívá různé reaktivity různých typů primárních amino skupin (lysin versus N-koncová) dostupných pro derivatizaci. Reakce je provedena při pH, které umožňuje využít výhody rozdílu pK mezi e-amino skupinami lysinových zbytků a a-amino skupinami N-terminálního zbytku proteinu. Takovou selektivní derivatizaci je kontrolováno připojení ve vodě rozpustného polymeru, který obsahuje reaktivní skupinu jako je aldehyd, na protein: konjugace s polymerem probíhá především na N-konci proteinu a bez signifikantní modifikace jiných reaktivních skupin, jako jsou amino skupiny postraního řetězce lysinu. V jednom důležitém aspektu předpokládá předkládaný vynález použití v podstatě homogenních přípravků molekul konjugátů monopolymer/GDNF protein (nebo varianta) (což znamená GDNF proteinu nebo varianty, na který byla molekula polymeru připojena v podstatě pouze (t.j. > 95%) v jediném místě). Přesněji, pokud je použit polyethylenglykol, pak předkládaný vynález také obsahuje pegylovaný GDNF protein nebo variantu bez možné antigenní vazebné skupiny, který má molekulu polyethylenglykolu přímo navázanou na GDNF protein nebo variantu.

Tak, předpokládá se, že GDNF proteinový produkt použitý podle předkládaného vynálezu může obsahovat pegylovaný GDNF protein nebo variantu, kde PEG skupiny jsou připojeny přes acylové nebo alkylové skupiny. Jak bylo uvedeno výše, takové produkty mohou být monopegylovane nebo polypegylováné (např. obsahující 2-6, a lépe 2-5 PEG skupin). PEG skupiny jsou obyčejně připojeny na protein v e- nebo a- amino skupinách aminokyselin, ale předpokládá se také, že PEG skupiny mohou být připojeny na jakoukoliv aminoskupinu připojenou na protein, která je dostatečně reaktivní pro připojení na PEG skupinu za vhodných

reakčních podmínek.

Polymerové molekuly použité v acylačních a alkylačních přístupech mohou být vybrány z polymerů rozpustných ve vodě jak bylo popsáno výše. Vybraný polymer by měl být modifikován tak, aby obsahoval jednu reaktivní skupinu, jako je aktivní ester pro acylaci nebo aldehyd pro alkylaci, preferovaně tak, že stupeň polymerizace může být kontrolován, jak je dáno pro použité metody. Příkladem reaktivního PEG aldehydu je polyethylenglykol propionaldehyd, který je ve vodě stabilní, nebo jeho mono C1-C10 alkoxy nebo aryloxy deriváty (viz U.S. patent 5252714). Polymer může být rozvětvený nebo nerozvětvený. Pro acylační reakce by vybrané polymery měly mít jednu reaktivní esterovou skupinu. Pro předkládanou redukční alkylaci by vybrané polymery měly mít jednu reaktivní aldehydovou skupinu. Obecně, ve vodě rozpustné polymery nebudou vybrány z přirozeně se vyskytujících glykosylových zbytků, protože ty jsou výhodněji vyráběny savčími rekombinantními expresními systémy. Polymer může mít jakoukoliv molekulovou hmotnost, a může být rozvětvený nebo nerozvětvený.

Zejména preferovaným ve vodě rozpustným polymerem pro použití v předkládaném vynálezu je polyethylenglykol. Jak je zde použito, polyethylenglykol znamená jakoukoliv formu PEG, která může být použita pro derivatizaci jiných proteinů, jako je mono-(C1-C10) alkoxy- nebo aryloxy-polyethylenglykol.

Obecně, chemická derivatizace může být provedena za jakýchkoliv vhodných podmínek použitých pro reakci biologicky aktivní substance s aktivovanou molekulou polymeru. Metody pro přípravu pegylováných GDNF proteinů nebo variant budou obecně obsahovat krok (a) reajce GDNF proteinu nebo varianty s polyethylenglykolem (jako je reaktivní esterový nebo aldehydový derivát PEG) za podmínek, kdy se protein naváže na jednu nebo více PEG skupin, a (b) získání produktů reakce. Obecně, optimální reakční podmínky pro acylační reakce budou určeny individuálně na základě známých parametrů a požadovaného výsledku. Například, větší poměr PEG:protein znamená vyšší procento polypegylováného produktu.

Redukční alkylace pro produkci v podstatě homogenní polulace molekul konjugatu mono-polymer/GDNF protein (nebo varianta) bude obecně obsahovat kroky: (a) reakci GDNF proteinu nebo varianty s reaktivní PEG molekulou za podmínek redukční alkylace, při pH vhodném pro umožnění selektivní modifikace a-amino skupiny na amino konci uvedeného GDNF proteinu nebo varianty; a (b) získání produktů reakce.

Pro v podstatě homogenní populaci molekul konjugatů mono-polymer/GDNF protein (nebo varianta) jsou reakční podmínky redukční alkylace ty, které umožňují selektivní připojení ve vodě rozpustné polymerové skupiny na N-konec GDNF protein nebo varianty. Takové reakční podmínky obecně využívají rozdílů pKa mezi lysinovými amino skupinami a a-amino skupinami v N-konci (pKa je pH, při kterém 50% amino skupin je protonováno a 50% není). pH také ovlivňuje použitý poměr polymeru ku proteinu. Obecně, pokud je pH nižší, pak je žádoucí větší přebytek polymeru nad proteinem (t.j. čím méně reaktivní N-terminální a-aminoskupina, tím více polymeru je potřeba pro dosažení optimálních podmínek). Pokud je pH vyšší, pak poměr polymer:protein nemusí být tak vysoký (t.j. je dostupných více reaktivních skupin, takže je potřeba méně polymerových molekul). Pro účely předkládaného vynálezu bude pH obvykle v rozsahu 3-9, lépe 3-6.

Jinou významnou vlastností je molekulová hmotnost polymeru. Obecně, čím vyšší molekulová hmotnost polymeru, tím méně molekul polymeru může být připojeno na protein. Obdobně, při optimalizaci parametrů by mělo být vzato do úvahy větvení polymeru. Obecně, čím vyšší molekulová hmotnost (nebo více větvení), tím vyšší poměr polymer:protein. Obecně, pro pegylační reakce zde předpokládané je preferovaná průměrná molekulová hmotnost okolo 2 kDa až 100 kDa. Preferovaná průměrná molekulová hmotnost je od asi 5 kDa do asi 50 kDa, zejména okolo 12 kDa až 25 kDa. Poměr ve vodě rozpustného polymeru ku GDNF proteinu nebo variantě bude obecně 1:1 až 100:1, preferovaně (pro polypegylaci) 1:1 až 20:1 a (pro monopegylaci) 1:1 až 5:1.

Při použití podmínek ukázaných výše bude redukční alkylace poskytovat selektivní připojení polymeru na jakýkoliv GDNF protein nebo variantu mající a-amino skupinu na amino konci, a bude dávat v podstatě homogenní přípravek konjugátu monopolymer/GDNF protein (nebo varianta). Termín konjugát monopolymer/GDNF protein (nebo varianta) jak je zde použit znamená kompozici obsahující jednu molekulu polymeru připojenou na molekulu GDNF protein nebo GDNF variantního proteinu. Konjugát monopolymer/GDNF protein (nebo varianta) bude preferovaně mít polymerovou molekulu umístěnou na N-konci, ale ne na postraních amino skupinách lysinu. Přípravek by měl být preferovaně více než 90% konjugát monopolymer/GDNF protein (nebo varianta), a lépe více než 95% konjugát monopolymer/GDNF protein (nebo varianta), kde jsou zbývající pozorvatelné molekuly nezreagované (t.j. proteiny bez polymerové skupiny).

Pro předkládanou redukční alkylaci, redukční činidlo by mělo být stabilní ve vodném roztoku a preferovaně by mělo být schopné redukovat pouze Schiffovu bázi tvořenou v počátečním procesu redukční alkylace. Preferovaná redukční činidla mohou být vybrána ze borohydridu sodného, kyanoborohydridu sodného, dimethylamin boranu, trimethylamin boranu a pyridin boranu. Zejména preferovaným redukčním činidlem je kyanoborohydrid sodný. Jiné parametry reakce, jako je rozpouštědlo, reakční doby, teploty atd., a způsoby přečištění produktů, mohou být určeny jednotlivě na základě publikovaných informací týkajících se derivatizace proteinů s ve vodě rozpustnými polymery /viz publikace zde citované).

C. Farmaceutické kompozice GDNF proteinového produktu

Farmaceutické kompozice GDNF proteinového produktu typicky obsahují terapeuticky účinné množství GDNF proteinového produktu ve směsi s jedním nebo více farmaceuticky a fyziologicky přijatelnými materiály pro formulaci. Vhodné formulační materiály zahrnují, ale nejsou omezeny na, antioxidanty, konzervační činidla, barviva, příchutě a ředidla, emulsifikační činidla, suspendační činidla, rozpouštědla, plnidla, objemová činidla, pufry, vehikula pro podání, ředidla, přísady a/nebo farmaceutická adjuvans. Například, vhodným vehikulem může být voda pro injekce, fyziologický roztok, nebo arteficiální CSF, podle možností doplněný jinými materiály běžnými v kompozicích pro parenterální podání. Neutrální pufrovaný fyziologický roztok nebo fyziologický roztok ve směsi se sérovým albuminem jsou dalšími příkladnými vehikuly.

Primární rozpouštědlo ve vehikulu může být vodného nebo

nevodného charakteru. Kromě toho, vehikulum může obsahovat jiné farmaceuticky přijatelné přísady pro modifikaci nebo udržení pH, osmolarity, viskozity, čirosti, barvy, sterility, stability, stupně rozpustnosti, nebo zápachu formulace. Podobně, vehikulum může obsahovat ještě jiné farmaceuticky přijatelné přísady pro modifikaci nebo udržení stupně uvolňování GDNF proteinového produktu, nebo pro navození absorpce nebo penetrace GDNF proteinového produktu přes membrány v oku. Takové přísady jsou substance, které se obvykle využívají k formulaci dávek pro parenterální podání buď ve formě jediné dávky, nebo ve formě mnoha dávek.

Jakmile je farmaceutická kompozice formulována, může být skladována ve sterilních nádobkách jako roztok, suspense, emulse, gel, pevná látka, nebo dehydratovaný nebo lyofilizovaný prášek. Takové formulace mohou být skladovány buď ve formě k okamžitému použití, nebo např. v lyofilizované formě vyžadující rekonstituci před podáním.

Optimální farmaceutická kompozice bude odborníkem určena na základě způsobu podání a požadované dávky. Viz např. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), str. 1435 - 1712, jejíž objevy jsou zde uvedeny jako odkaz. Takové formulace mohou ovlivňovat fyzikální stav, stabilitu, stupeň uvolňování in vivo, a stupeň odplavování in vivo presentovaných GDNF proteinů, variant nebo derivátů.

Jiné účinné formy pro podání, jako jsou parenterální formulace se zpomaleným uvolňováním, inhalační spraye nebo orálně aktivní formulace jsou také obsaženy. Například, ve formulaci se zpomaleným uvolňováním, GDNF proteinový produkt může být vázán na • · · · · • · · · ·· * · · ·♦ • · · · · · * • · ·· * · · · · ♦ · » · · ·

nebo může být inkorporován do jednotlivého přípravku polymerní sloučeniny (jako je polymléčná kyselina, polyglykolová kyselina, atd.) nebo do liposomů. Také může být použita kyselina hyaluronová a ta může mít účinek na vznik prodlouženého trvání cirkulace. Farmaceutická kompozice GDNF proteinového produktu může být také formulována pro parenterální podání, např. intraokulární infusí nebo injekcí, a může také obsahovat formulace se zpomaleným uvolňováním nebo prodlouženou cirkulací. Takové parenterálně podávané terapeutické kompozice jsou typicky ve formě pyrogen-prostého, parenterálně akceptovatelného vodného roztoku obsahujícího GDNF proteinový produkt ve farmaceuticky přijatelném vehikulu. Jedním preferovaným vehikulem je sterilní deštilováná voda.

Také se předpokládá, že určité formulace obsahující GDNF proteinový produkt budou podávány orálně. GDNF proteinový produkt, který se podává tímto způsobem, může být v kasplích nebo může být formulován s nebo bez nosičů běžně používaných ve výrobě pevných dávkových forem. Kapsle mohou být projektovány tak, aby uvolňovaly aktivní část formulace v tom místě zažívacího traktu, kde je biodostupnost maximální a kde je pre-systemová degradace minimální. Mohou být obsaženy další přísady pro usnadnění absorpce GDNF proteinového produktu. Ředidla, příchutě, vosky s nízkou teplotou tání, rostlinné oleje, kluzné látky, suspedující činidla, a pojivá mohou být také použity.

Formulace pro lokální podání do oka, včetně očních roztoků, suspenzí a mastí jsou odborníkům v oboru dobře známé (viz Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, kapitola 86, str. 1581 - 1592, Mack Publishing Company, 1990). Dostupné jsou i jiné způsoby podání, včetně intrakomorové injekce (která může být • · · · · · • ·

provedena přímo do přední komory nebo přímo do zadní komory oční), subkonjunktivální injekce a retrobulbární injekce, a metody a prostředky pro produkci očních přípravků vhodných pro takové způsoby podání jsou také dobře známé.

Jak je použito v této přihlášce, extraokulární označuje oční povrch a (zevní) prostor mezi očním bulbem a očním víčkem. Příkady extraokulárních regionů zahrnují fornix očního víčka nebo cul-de-sac, povrch spojivky nebo povrch rohovky. Tato lokalizace je externí ke všem očním tkáním a pro dosažení tohoto prostoru není nutný invazivní postup. Příklady extraokulárních systémů zahrnují inserty a lokálně aplikované kapky, gely nebo masti, které mohou být použity pro dopravení terapeutického materiálu do těchto oblastí. Extraokulární prostředky jsou obecně snadno odstranitelné, i pacientem samotným.

Následující patenty popisují extraokulární prostředky, které jsou použity pro podání léčiv do extraokulárních prostor. Higuchi et al popisuje v U.S. patent č. 3681303, 3986510 a 3995510 biodegradovatelné oční inserty, které obsahují léčivo. Insert může být upravován do různých tvarů pro retenci v cul-de-sac očního bulbu, extraokulárního prostoru mezi očním bulbem a očním víčkem. Mnoho běžných biokompatibilních polymerů je popsáno jako vhodné pro použití ve výrobě takového prostředku. Tyto polymery zahrnují alginat zinku, póly (kyselinu mléčnou), póly (vinylalkohol), póly (anhydridy), a póly (kyselinu glykolovou). Patent také popisuje memránou potažený prostředek s redukovaným unikáním léčiva a dutou komůrku udržující formulaci léčiva.

Theeuwes, U.S. patent č.4217898, popisuje mikroporosní reservoáry. které jsou použity pro kontrolované podání léčiva.

• · • · · · • ·

Tyto prostředky jsou umístěny extraokulárně v očním cul-de-sac. Mezi použitými polymerovými systémy jsou póly (vinylchlorid)-ko-poly (vinylacetat) kopolymery. Kaufman popisuje v U.S. patentech č. 4865846 a 4882150 systém pro podání léčiva do oka, který obsahuje alespoň jeden bio-erodovatelný materiál nebo masúový nosič pro spojivkový vak. Patent popisuje polymerové systémy, jako je poly(laktid), póly(glykolid), póly(vinylalkohol) a zesíúovaný kolagen jako vhodné systémy pro podání.

V nyní popisovaném použití GDNF proteinového produktu pro léčbu onemocnění nebo poškození sítnice je také výhodné, že lokálně aplikované oční formulace obsahují činidlo pro zprostředkování penetrace nebo transportu terapeutického agens do oka. Taková činidla jsou v oboru známá. Například, Ke et al., U.S. 5221696, popisuje použití materiálů pro zvýšení penetrace očních přípravků přes rohovku.

Intraokulární systémy jsou ty systémy, které jsou vhodné pro použití v jakémkoliv tkáňovém kompartmentu uvnitř, mezi a okolo tkáňových vrstev oka samotného. Tyto lokalizace zahrnují podspojivkovou oblast (pod oční slizniční membránou naléhající k očnímu bulbu), orbitální oblast (za očním bulbem), a nitrokomorovou oblast (uvnitř komor očního bulbu). Oproti extraokulárním systémům je nutná invazivní procedura spočívající v injekci nebo implantaci pro dosažení těchto regionů.

Následující patenty popisují intraokulární prostředky. Wong, U.S. patent č. 4853224, popisuje mikrokapslované léčivo pro zavedení do oční komory. Polymery, které jsou využity v tomto systému, zahrnují polyestery a polyethery. Lee, U.S. patent č. 4863457, popisuje biodegradovatelný prostředek, který je ·· · · chirurgicky implantován intraokulárne pro prodloužené uvolňování terapeutického agens. Prostředek je projektován pro chirurgickou implantaci pod spojivku (slizniční membránu oka). Krezancaki, U.S. patent č. 4188373, popisuje farmaceutické vehikulum, které se stává gelem při tělesné teplotě. Toto vehikulum je vodná suspense léčiva a syntetických derivátů gumy nebo celulosy. Haslam et al. popisuje v U.S. patentech č. 4474751 a 4474752 systém polymer-léčivo, který je kapalný při pokojové teplotě a který se stává gelem při tělesné teplotě. Vhodné polymery použité v tomto systému zahrnují polyoxyethylen a polyoxypropylen. Davis et al. popisuje v U.S. patentu č. 5384333 biodegradovatelný injikovatelný polymer transportující léčivo, který způsobuje dlouhodobé uvolňování léku. Kompozice léku je vyrobena z farmaceuticky aktivního agens v matrici z biodegradovatelného polymeru, kde polymerová matrice je v pevném stavu při teplotě v rozmezí 20 °C až 37 °C, a je kapalná při teplotách v rozmezí 38 °C až 52 °C. Polymer transportující léčivo naní omezen na transport rozpustné nebo kapalné formulace léčiva. Například, polymer může být použit jako matrice pro stabilizaci a zadržení léčivo obsahujících mikrosfér, liposomů nebo jiných částic s navázaným léčivem v místě injekce.

Zejména vhodným vehikulem pro intraokulární injekci je sterilní destilovaná voda, ve které je GDNF proteinový produkt formulován jako sterilní, izotonický roztok, řádně konzervovaný. Ještě jiný očním přípravek může obsahovat GDNF proteinový produkt s činidlem, jako jsou injikovatelné mikrosféry nebo liposomy, které umožňují zpomalené nebo prodloužené uvolňování proteinu, který může být potom podán jako depotní injekce. Jiné vhodné prostředky pro intraokulární podání GDNF proteinového produktu zahrnují implantovatelné prostředky pro podání léčiva, které

•	··	• 9	• · · ·	• ·	• · ¢. ·
• · •	9 9 9 * • · *	♦ * 9 * • « »	• · · • ·		• · « •
·· ·		• · ··	• • •r	··	• *

obsahují GDNF proteinový produkt.

Oční přípravky podle předkládaného vynálezu, zejména přípravky pro lokální podání, mohou obsahovat jiné složky, například opthalmicky přijatelná konzervační činidla, tonizujíc činidla, ko-rozpouštědla, zvlčovací činidla, komplexující činidla, pufrovací činidla, antimikrobiální činidla, antioxidanty a surfaktanty, jak jsou v oboru dobře známy. Například, vhodná tonicitu zvyšijící činidla zahrnují halidy alkalických kovů (preferovaně chlorid sodný nebo draselný) , manitol, sorbitol a podobně. Dostatečné tonicitu zvyšující činidlo je výhodně přidáno tak, aby formulace, která má být instilována do oka byla hypotonická nebo v podstatě izotonická. Vhodná konzervační činidla zahrnují, ale nejsou omezena na, benzalkonium chlorid, thimerosal, fenethyl alkohol, methylparaben, propylparaben, chlorhexidin, kyselinu sorbovou a podobně. Peroxid vodíku může být také použit jako konzervační činidlo. Vhodná ko-rozpouštědla zahrnují, ale nejsou omezena na, glycerin, propylenglykol a polyethylenglykol. Vhodná komplexující činidla zahrnují koffein, polyvinylpyrrolidon, beta-cyklodextrin nebo hydroxypropyl-betacyklodextrin. Vhodné surfaktanty nebo zvlčovací činidla zahrnují, ale nejsou omezeny na, estery sorbitanu, polysorbaty jako je polysorbat 80, tromethamin, lecitin, cholesterol, tyloxapol a podobně.Pufry mohou být běžné pufry jako je boritanový, citrátový, fosfátový, bikarbonatový nebo Tris-HCl.

Složky formulace jsou přítomny v koncentracích, které jsou přijatelné pro extraokulární nebo intraokulární místo podání. Například, pufry jsou použity pro udržení kompozice při fyziologickém nebo o něco nižším pH, typicky při pH v rozmezí 5 až 8.

• · · ·

Další složky formulace mohou obsahovat materiály, které umožňují prodlouženou přítomnost v oku extraokulárně podaného terapeutického agens tak, že maximalizují lokální kontakt a podporují absorpci. Vhodné materiály zahrnují polymery nebo gely formující materiály, které zvyšují viskozitu očního přípravku. Chitosan je zejména vhodný přípravek jako činidlo kontrolující uvolňování v oku v kapalné formulaci očního léčiva s prodlouženým uvolňováním (viz U.S. 5422116, Yen et al.). Vhodnost formulací podle předkládaného vynálezu s kontrolovaným uvolňováním (např. se zpomaleným nebo s prodlouženým uvolňováním) očního terapeutického agens v oku může být určena různými postupy v oboru popsanými, např. jak je popsáno v Journal of Controlled Release, 6: 367 - 373, 1987, stejně jako jejich variacemi.

Ještě jiný oční přípravek může obsahovat účinné množství GDNF proteinového produktu ve směsi s netoxickou ophthalmologicky přijatelnou přísadou, která je vhodná pro výrobu tablet. Rozpuštěním tablet ve sterilní vodě, nebo v jiném vhodném vehikulu, může být připraven oční roztok v jednotkové dávkové formě. Vhodné přísady zahrnují, ale nejsou omezeny na, inertní ředidla, jako je uhličitan vápenatý, uhličitan sodný nebo bikarbonat, laktosa, nebo fosforečnan vápenatý; nebo pojivá jako je škrob, želatina nebo akacia; nebo kluzná činidla jako je stearan horečnatý, kyselina stearová nebo talek.

D. Podání/dopravení GDNF proteinového produktu

GDNF proteinový produkt může být podán parenterálně subkutáním, intramuskulárním, intravenosním, transpulmonárním, transdermílním, intrathekalním nebo intracerebrálním způsobem.

• ·

Pro léčbu očních onemocnění může být GDNF proteinový produkt podán extraokulárně nebo intraokulárně, jak bylo popsáno výše, lokálním podáním, insercí, injekcí, implantací, buněčnou terapií nebo genovou terapií. Například, implantáty se zpomaleným uvolňováním obsahující neurotrofický faktor v biodegradovatelné polymerové matrici mohou dopravovat GDNF proteinový produkt. GDNF proteinový produkt může být podán extracerebrálně ve formě, která byla chemicky modifikována nebo zpracována tak, aby procházela hematoencefalickou barierou, nebo může být podán spolu s jedním nebo více činidly schopnými způsobit penetraci GDNF proteinového produktu přes barieru. Podobně, GDNF proteinový produkt může být podán intraokulárně, nebo může být podán extraokulárně spolu s jedním nebo více činidly schopnými způsobit penetraci nebo transport GDNF proteinového produktupřes oční membrány. Frekvence dávkování bude záviset na farmakokinetických parametrech GDNF proteinového produktu jak je formulován, a na způsobu podání.

Specifická dávka může být vypočítána na základě tělesné hmotnosti, povrchu těla nebo velikosti orgánu. Další úprava výpočtů nutných pro určení vhodné dávky pro léčbu obsahuje každou z výše uvedených formulací je rutinně prováděna odborníky v oboru a je v rozsahu rutnně prováděných požadavků, zejména ve světle informací o dávce a testů, které jsou zde uvedeny. Vhodná dávka může být zjištěna použitím zavedených testů pro určení dávek ve spojení s odpovídajícími daty dávka-odpověď. Odborníky v oboru bude oceněno, že dávka použitá v intraokulárně podaných formulacích bude minimální ve srovnání s dávkou použitou při systémové injekci nebo při orálním podání.

Konečný dávkový režim obsažený v metodě pro léčbu výše uvedených stavů bude určen ošetřujícím lékařem, po zvážení • » • · · · různých faktorů, které mohou ovlivňovat účinek léčiva, např. věku, kondice, tělesné hmotnosti, pohlaví a diety pacienta, závažnosti jakékoliv infekce, době podání a jiných klinických faktorů. Jak jsou prováděny studie, budou se objevovat další informace týkající se vhodných dávkových hladin pro léčbu různých onemocnění a stavů.

Předpokládá se, že kontinuální podání nebo prodloužené podání GDNF může být pro danou léčbu výhodné. Zatímco kontinuální podání může být provedeno mechanickými prostředky, jako je infusní pumpa, předpokládá se, že mohou být prováděny jiné způsoby kontinuálního nebo téměř kontinuálního podání. Například, chemickou derivatizací nebo enkapsulací mohou vznikat formy s prodlouženým uvolňováním proteinu, které mají účinek kontinuální přítomnosti, v předpověditelném množstí, na základě určeného dávkového režimu. Tak zahrnují GDNF proteinové produkty proteiny derivatizované nebo jinak formulované pro provedení takového kontinuálního podání.

Buněčná terapie GDNF proteinovým produktem, např. intraokulární implantace buněk produkujících GDNF proteinový produkt, je také zamýšlena. Toto provedení bude obsahovat implantaci buněk schopných syntézy a sekrece biologicky aktivní formy GDNF proteinového produktu do pacienta. Takové GDNF proteinový produkt-produkující buňky mohou být buňky, které přirozeně produkují GDNF proteinový produkt (analogické k B49 glioblastomovým buňkácm), nebo to mohou být rekombinantní buňky, jejichž schopnost produkovat GDNF proteinový produkt byla zvýšena transformací genem kódujícím požadovaný GDNF proteinový produkt ve vektoru vhodném pro navození jeho exprese a sekrece. Pro minimalizaci potenciálních imunologických reakcí u pacienta, • · • · • ·

kterému je podáván GDNF proteinový produkt cizího druhu je preferováno, aby přirozenými buňkami produkujícími GDNF proteinový produkt byly buňky lidského původu a produkovaly lidský GDNF proteinový produkt. Podobně, je preferováno, aby rekombinantní buňky produkující GDNF proteinový produkt byly transformovány expresním vektorem obsahujícím gen kódující lidský GDNF proteinový produkt. Implantované buňky mohou být enkapsulovány pro zamezení infiltrace okolní tkání. Lidské nebo non-lidské zvířecí buňky mohou být implantovány do pacienta v biokompatibilním, semipermeabilním polymerickém kontaineru nebo v membránách, které umožňují uvolňování GDNF proteinového produktu, ale které brání destrukci buněk imunitním systémem pacienta nebo jinými poškozujícími faktory z okolní tkáně. Takové implantáty, například, mohou být připojeny na skleru za produkce a uvolňování GDNF proteinového produktu přímo do sklivce.

Také se předpokládá, že vlastní buňky pacienta mohou být transformovány ex vivo na produkci GDNF proteinového produktu a mohou být přímo implantovány bez enkapsulace. Například, neurony sítnice mohou být odebrány, buňky mohou být kultivovány a transformovány vhodným vektorem a mohou být transplantovány zpět do sítnice pacienta, kde mohou produkovat a uvolňovat požadovaný GDNF protein nebo variantu GDNF proteinu.

Genová terapie GDNF proteinovým produktem in vivo se také předpokládá, zavedením genu kódujícího GDNF proteinový produkt do cílových buněk sítnice lokální injekcí konstruktu nukleové kyseliny nebo jiných vhodných transportních vektorů. (Hefti, J. Neurobiol., 25: 1418 - 1435, 1994). Například, sekvence nukleové kyseliny kódující GDNF proteinový produkt může být obsažena v adeno-asociovaném virovém vektoru nebo v adenovirovém vektoru pro ···· ··· ··· • · · · ···· · · • ····· · ·· ···· dopravu do buněk sítnice. Alternativní virové vektory zahrnují, ale nejsou omezeny na, retrovirové vektory, vektory viru herpes simplex a vektory papiloma viru. Fyzikální přenos, buď in vivo, nebo ex vivo, může být také proveden přenosem zprostředkovaným liposomy, přímou injekcí (holá DNA), receptory zprostředkovaným přenosem (komplex ligand-DNA), elektroporací, srážením fosforečnanem vápenatým nebo bombardováním mikročásticemi (genové ostřelování).

Metody pro membránovou enkapsulaci živých buněk jsou odborníkům v oboru dobře známy a příprava enkapsulovaných buněk a jejich implantace pacientům může být provedena bez zbytečných pokusů. Viz např. U.S. patenty č. 4892538, 5011472 a 5106627, kde každý z nich je zde uveden jako odkaz. Systém pro enkapsulaci živých buněk je popsán v PCT přihlášce WO 91/10425 od Aebischer et al., zde uvedené jako odkaz. Viz také PCP přihlášku WO 91/10470 od Aebischer et al., Winn et al., Exper. Neurol. 113: 322 - 329, 1991; Aebischer et al., Exper. Neurol., 111: 269 275, 1991; Tresco et al., ASAIO, 38: 17 - 23, 1992, kde každý je zde uveden jako odkaz. Techniky pro formulaci různých jiných prostředků pro zpomalené nebo kontrolované uvolňování, jako jsou liposomové nosiče, bioerodovatelné částice nebo korálky a depotní injekce, jsou také odborníkům dobře známé.

Mělo by být zmíněno, že formulace GDNF proteinového produktu zde popsané mohou být použity pro veterinární, stejně jako pro lidské aplikace, a že termín pacient by neměl být omezující. V případě veetrinárních aplikací by dávkové rozsahy měly být stejné jak je uvedeno výše.

Jiné aspekty a výhody předkládaného vynálezu budou zřejmé po • · • · pochopení následujících ilustrativních příkladů. Příklad 1 se týká účinku GDNF proteinového produktu podaného v kultivačním systému tkáně gangliových buněk sítnice. Příklad 2 se týká použití radioaktivně značeného GDNF proteinového produktu pro vyšetření potenciální populace neuronů, která může vázat, internalizovat a retrográdně transportovat GDNF proteinový produkt receptory zprostředkovaným způsobem. Příklad 3 se týká účinku podání GDNF proteinového produktu v modelu poškození gangliových buněk sítnice. Výsledky studie poškození gangliových buněk sítnice ukazují, že GDNF proteinový produkt má neurotrofickou aktivitu pro tuto neuronální populaci, o které nebylo dosud známo, že reaguje na GDNF.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

GDNF proteinový produkt podporuje přežívání a vývoj gangliových buněk sítnice in vitro

Materiály: Materiály získané v následujícím příkladu byly získány tímto způsobem.

Buněčná kultivační media

Dullbecovo modifikované Eaglovo medium s vysokým obsahem glukosy (DMEM; č. 11965-092), Hamovo F12 medium (F12, č. 11765-021), Leibovitzovo L15 medium bez bikarbonatu sodného (č. 41300-039); B27 medium doplněk (č. 17504-010); penicilin/streptomycin (č. 15070-014); L-glutamin (č. 25030-016), Dullbecův fosfátem pufrovaný salinický roztok (D-PBS, č.

• · · · ·

14190-052) , Hankův vyvážený solný roztok s vápenatými a hořečnatými solemi (HBSS, č. 24020-026), N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonová kyselina (HEPES, č. 15630-015), myší laminin (č. 23017-015), hovězí sérový albumin a frakce V (č. 110-18-017) byly všechny od GIBCO/BRL, Grand Island, NY. Tepelně inaktivované koňské sérum bylo od HyClone, Logan, Utah. Póly-L-ornítin-hydrobromid (P-3655), hovězí inzulín (1-5500), lidský transferin (T-2252), putrescin (P-6024), progesteron (P-6149) a selenit sodný (S-9133) byly všechny od Sigma Chemical Company, Saint-Louis, MO. Papain, deoxyribonukleasa I (DNAsa) a ovalbumin (papainový disociační systém) byly od Worthington Biochemicals, Freehold, NJ. Falcon sterilní 96-jamkové mikroplotny (č. 3072), tkáňové kultivační plastové výrobky a polypropylenové centrifugační tuby byly od Becton-Dickinson, Oxnard, CA. Nitex 20 μπι nylonové síto (č. 460) bylo od Tetko, Elmsdorf, NY. 4 dissekční kleště a 4 dissekční nůžky byly od Roboz Surgical, Washington, D.C.

Protilátky a související činidla

Myší/krysí monoklonální protilátky proti myšímu Thy-1,2 byly od Boehringer-Mannheim (Indianapolis, IN). Králičí polyklonální anti-krysí a anti-myší IgG protilátky, biotynylované koňské anti myší IgG a s peroxidasou konjugované avidin/biotin komplexy (ABC Elitě; kit PK-6100) byly od Vector Laboratories, Burlingame, CA. 3',3'-diaminobenzidin byl od Cappel Laboratories, West Chester, PA. Superblok blokující pufr v PBS (č. 37515) byl od Pierce, Rockford, IL. Triton X-100 (X-100), Nonidet P-40 (N6507) a peroxid vodíku (30%, objem/objem, H1009) byly od Sigma. Všechny ostatní reagens byly získány od Sigma Chemical Company (Saint Louis, MO), pokud není jinak upřesněno.

Metody

Příprava media

Základní medium bylo připraveno jako směs 1:1 DMEM a F12 media, a bylo doplněno B27 doplňkem media přidaným jako 50-krát koncentrovaný zásobní roztok. B27 doplněk media se skládá z biotinu, L-karnitinu, kortikosteronu, ethanolaminu,

D ( + )-galaktosy, redukovaného glutathionu, kyseliny linoleové, progesteronu, putrescinu, retinylacetatu, selenu, T3 (trijodo-l-thyronin, DL-a-tokoferol, vitamin E), DL-atokoferolacetatu, hovězího sérového albuminu, katalasy, insulinu, superoxiddismutasy a transferinu. Byl přidán L-glutamin v konečné koncentraci asi 2 mM, penicilín v koncentraci asi 100 UI/1, a streptomycin v koncentraci asi 100 mg/1. Teplem inaktivované košké sérum bylo přidáno v konečné koncentraci asi 2,5%, D-glukosa v konečné koncentraci asi 5 g/1, HEPES pufrovací činidlo bylo přidáno v konečné koncentraci asi 20 mM, hovězí inzulín byl přidán v konečné koncentraci asi 2,5 mg/ml a lidský transferin byl přidán v konečné koncentraci asi 0,1 mg/ml. Po míchání bylo pH upraveno na asi 7,3 a medium bylo uchováváno při 4 °C. Medium bylo čerstvě připraveno bezprostředně před použitím pro minimalizaci interexperimentálních variací. Plastové pipety a kontainery byly použity pro minimalizaci adsorpce proteinu.

Roztoky GDNF proteinového produktu

Purifikované lidské rekombinantní GDNF proteinové produkty byly připraveny jako 1 mg/ml roztoky v D-PBS (fosfátem pufrovaný salinický roztok připravený s destilovanou vodou) obsahujícím pět procent hovězího sérového albuminu. Roztoky byly uskladněny při • · • · · ·

-85 °C v aliquotách. Sériová ředění byla připravena v 96-jamkových mikroplotnách. Deset mikrolitrů desetkrát koncentrovaných roztoků GDNF proteinových produktů bylo přidáno do buněčných kultur obsahujících kultivační medium (90 μΐ). Kontrolní kultury dostaly D-PBS s 5% albuminem (10 μΐ). Ošetření GDNF proteinovým produktem bylo iniciováno jednu hodinu po usazení buněk a, v některých případech, bylo opakováno každý druhý den.

Kultivační substrát

Pro podporu optimálního uchycení gangliových buněk sítnice na substrátu a růstu neuritů byly povrchy mikrotitrační plotny (kultivační substrát) modifikovány sekvenčním potažením poly-L-ornitinem a potom lamininem podle následujícího postupu. Povrch plotny byl zcela pokryt 0,1 mg/ml sterilním roztokem polyornitinu v 0,1 M kyselině borité (pH 8,4) po dobu alespoň jedné hodiny při pokojové teplotě, a potom následovalo sterilní promytí Super-Q-vodou. Proplachovací voda byla potom aspirována a byl přidán 1 μg/ml roztok myšího lamininu v PBS a byl inkubován při 37 °C po dobu dvou hodin. Tyto postupy byly provedeny bezprostředně před použitím ploten pro zajištění reprodukovatelnosti -výsledků.

Příprava kultur krysích gangliových buněk sítnice

Sedm dní stará mláďata Sprague-Dawley krys (získaná od Jacson Laboratories, Bar Harbor, Maine) byla usmrcena dekapitací a jejich oči byly sterilně vyříznuty a uloženy do L15 media (bez bikarbonátu sodného). Maximálně bylo na pokus zpracováno 24 očí. Oči byly rozříznuty na polovinu a čočka a sklivec byly • · · · • · odstraněny. Nervové sítnice byly opatrně odstraněny a odpreparovány od pigmentového epitelu, rozřezány na malé fragmenty (asi 1 mm² nebo menší) a umístěny do D-PBS ochlazeného na teplotu ledu.Buňky byly shromážděny a potom přeneseny do 10 ml disociačního media (120 jednotek papainu a 2000 jednotek DNAsy v HBSS). Buňky byly inkubovány po dobu 45 minut při asi 37 °C na rotační třepačce ploten při asi 200 rpm. Potom byly buňky dispersovány triturací pomocí ohněm upravených Pasterových pipet, prosety přes 20 μτη Nitex nylonovou síť. pro odstranění nedisociované tkáně a centrifugovány po dobu 5 minut při 200 x g za použití IEC kinické centrifugy. Vzniklá buněčná peleta byla resuspendována v HBSS obsahujícím ovalbumin a asi 500 jednotek DNAsy, potom byla umístěna na povrch čtyřprocentního roztoku ovalbuminu (v HBSS) a byla centrifugována po dobu 10 minut při 500 x g. Konečná peleta byla resuspendována do DMEM/F12 doplněném 20% fetálním hovězím sérem v koncentraci 10^v buněk/ml, a gangliové buňky byly přečištěny imunootiskem podle dříve popsané metody (Lehwalder et al., J. Neurosci. Res., 24: 329 - 337, 1989).

Pro otisk byly 35 mm tkáňové kultivační plastové plotny předem potaženy anti-myší IgG protilátkou (ředěnou 1:100 v PBS) po dobu 2 hodin při pokojové teplotě, promyty 3-krát PBS obsahujícím 1% hovězí sérový albumin a potom byly inkubovány s myší monoklonální protilátkou proti Thy-1,2 (ředěnou 1:100). Po promytí ploten DMEM/F12 se asi 1 ml suspenze buněk sítnice inkuboval na předem ošetřených kultivačních plotnách po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Neadherované buňky byly odplaveny opakovaným promytím kultivačním mediem, dokud nezůstaly pouze pevně adherované buňky. Navázané buňky byly získávány za použití skleněné tyčinky s kouskem pryže a byly resuspendovány v kompletním kultivačním • * mediu (jak bylo ppsáno výše). Koncentrace buněk byla upravena na asi 11000 buněk/ml a buněčná suspenze byla umístěna v 90 μΐ aliquotách při hustotě asi 1000 buněk na 6 mm jamku do 96-jamkových mikroploten předem potažených polyornitinem a lamininem media. Navázání buněk probíhalo rychle a účinost plotnování byla asi 50%.

Imunohistochemie ganliových buněk sítnice

Pro charakterizaci krysích gangliových buněk sítnice byla použita nepřímá imunoperoxidasová metoda, jak ji popsal Louis et al., (J. Pharmacol. Exp. Therap., 262: 1274 - 1283, 1992;

Science, 259: 689 - 692, 1993), s následujícími drobnými modifikacemi. Kultury gangliových buněk sítnice byly fixovány po dobu 30 minut při pokojové teplotě ve 4% formaldehydu v D-PBS, pH 7,4, potom následovaly tři promytí v D-PBS (200 μΐ na 6 mm jamku). Fixované kultury byly potom inkubovány v Superblock blokujícím pufru v PBS, obsahujícím jedno procento Nonidet P-40 pro zvýšení penetrace protilátky. Myší monoklonální anti-Thy-1 protilátky (Boehringer-Mannheim) byly potom aplikovány v ředění mezi 1:100 - 1:400 ve stejném pufru a kultury byly inkubovány po dobu jedné hodiny při 37 °C na rotační třepačce. Po třech promytích D-PBS byly protilátky navázané na gangliové buňky sítnice detekovány za použití koňského anti-myšího biotynylovaného IgG (Vactastain kit od Vector Laboratories, Burlingame, CA) v ředění asi 1:500; tyto sekundární protilátky byly inkubovány s buňkami asi po odbu jedné hodiny při 37 °C, buňky byly potom promyty 3-krát D-PBS. Sekundární protilátky byly potom značeny komplexem avidin-biotin-peroxidasa ředěným 1:500, a buňky byly inkubovány po dobu asi 45 minut při 37 °C. Po třech dalších promytích D-PBS byly značené buněčné kultury reagovány po • · · · dobu 5-20 minut v roztoku 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, obsahujícím 0,04% 3' , 3'-diaminobenzidin-(HC1)4, 0,06% NiCl₂ a 0,02% peroxid vodíku.

Určení přežívání gangliových buněk sítnice

Po různých dobách v kultuře (24 hodin, 3 dny a 6 dní) byly kultury krysích gangliových buněk sítnice fixovány, zpracovány a imunobarveny na Thy-1,2 jak je popsáno výše a kultury byly byly potom vyšetřovány optickou mikroskopií při zvětšení 200-násobném. Byly počítány všechny Thy-1,2 pozitivní neurony přítomné 6-mm jamce. Životaschopné gangliové buňky sítnice byly charakterizovány tím, že měly velké (30 - 40 gm v průměru) tělo pravidelného tvaru, s asi třemi dlouhými neuritovými výběžky, z nichž jeden byl axon. Gangliové buňky sítnice vykazující známky degenerace, jako je nepravidelné, vakualizované perykaryum nebo fragmentované neurity, nebyly počítány (většina z degenerovaných gangliových buněk sítnice byla nicméně oddělena z kultivačního substrátu). Počet buněk byl vyjádřen buď jako buňky/6-mm jamku, nebo jako násobek kontrolní buněčné hustoty.

Výsledky

Kultury purifikovaných krysích gangliových buněk sítnice byly použity pro demonstraci účinku GDNF proteinového produktu na přežívání a morfologickou maturaci. Gangliové buňky byly purifikovány ze sítnic sedm dní starých krys imunootiskem na plastovém povrchu potaženém anti-Thy-1,2 protilátkami. Je známo, že v krysí sítnici je Thy-1 antigen lokalizován na gangliových buňkách sítnice (Leifer et al., Exp. Neurol., 113: 386 - 390, 1991). Čisté kultury gangliových buněk sítnice byly potom • · « ·

ustanoveny usazením vzniklé čisté populace kultur gangliových buněk sítnice na polyornitinem-lamininem potažené mikroplotny v hustotě asi 1000 na 6-mm jamku v DMEM/F12 doplněném B27 doplňkem media, 2,5 % teplem inaktivovaným koňským šerem, D-glukosou, HEPES, inzulínem a transferinem. Gangliové buňky sítnice byly identifikovány přítomností Thy-1,2 imunoreaktivity. Tato metoda vedla k relativně nízkému zisku gangliových buněk sítnice (asi 5000buněk na sítnici), ale k vysokému stupni čistoty (asi 90% Thy-1,2 pozitivních buněk.

Kultury krysích gangliových buněk sítnice byly hodnoceny na účinek podání GDNF proteinového produktu na přežívání a morfologickou maturaci. Kultury gangliových buněk sítnice byly ošetřeny lidským rekombinantním GDNF proteinovým produktem (trojnásobná sériová ředění v rozsahu od 10 ng/ml do 1 pg/ml). Kultury byly fixovány po 24 hodinách, 3 dnech a 6 dnech in vitro, byly fixovány 4% paraformaldehydem a imunobarveny na Thy-1,2. V kulturách, které nebyly ošetřeny GDNF proteinovým produktem pouze asi 32+4 procent (n = 6) usazených gangliových buněk sítnice přežívalo po 24 hodinách v kulruře. Asi 11+3 procent (n = 6) původního množství gangliových buněk bylo přítomno po třech dnech, a pouze 3+2 procenta (n = 3) bylo nacházeno ještě po šesti dnech v kultuře. Ošetření kultur rekombinantním lidským GDNF proteinovým produktem exprivovaným v E. coli vedlo k asi 2,5 násobnému zvýšení počtu životaschopných gangliových buněk sítnice po 24 hodinách v kultuře (80+6, n = 6). Po třech dnech za přítomnosti GDNF proteinového produktu asi 50+5 procent (n = 5) původního počtu gangliových buněk sítnice přežívalo (4,5 násobné zvýšení proti kontrole) a po šesti dnech, asi 39+4 procent (n = 3) bylo stále životaschopných (9,6 násobné zvýšení proti kontrole). Účinek GDNF proteinového produktu na přežívání gangliových buněk sítnice po třech dnech in vitro byl maximální při asi 300 pg/ml, s ED50 asi 30 pg/ml.

Kromě podpory přežívání gangliových buněk sítnice přidání GDNF proteinového produktu také stimuluje jejich morfologický vývoj. Léčba GDNF proteinovým produktem vede ke zvýšení velikosti těla gangliových buněk sítnice a délky a větvení jejich neuritických výběžků. Po třech dnech in vitro, mnoho gangliových buněk sítnice v GDNF ošetřených kulturách mělo neurity délky 500 až 1000 μπι, zatímco nejdelší neurity pozorované v kontrolních kulturách měly délku 300 μπι.

Retrográdní transport GDNF proteinového produktu v gangliových buňkách sítnice

V tomto pokusu byl ¹²⁵I radiaktivně značený GDNF proteinový produkt injikován do krysích mozků pro identifikaci potenciálních neuronových populací, které mohou vázat, internalizovat a retrográdně transportovat GDNF receptorem zprostředkovaným způsobem. Testovaný GDNF proteinový produkt byl rekombinantní lidský (Met^-1)GDNF a byl produkován expresí v E. coli jak je obecně popsáno v příkladu 6B a 6CWO93/06116. Purifikovaný (Met^-1)GDNF byl jodinován za použití laktoperoxidasové techniky a byl separován z volného ¹²⁵I za použití G-25 Sephadex kolon s rychlým odstřeďováním jak to popisuje Yan et al. , J.

Neurobiol., 24: 1555-77, 1993. Dospělé Sprague-Dawley krysy byly anestezovány směsí 43 mg/ml ketamin hydrochloridu, 8,6 mg/ml xylazinu a 1,43 mg/ml acepromazinu, v dávce 0,7 ml/kg tělesné hmotnosti. V jedné skupině 6 krys bylo buď 5 μΐ ^12SI-(Met^-1)GDNF (obsahující celkem 4-5 x 10⁶ cpm radioaktivity) nebo 5 μΐ ^12SI-(Met^-1)GDNF se 111-násobkem neznačeného (Met^-1)GDNF • ·

v PBS/BSA stereotakticky injikováno do pravé laterální komory 5 μΐ Hamiltonovou injekční stříkačkou. Ve druhé skupině byl 1 μΐ ¹²⁵I-(Met^x)GDNF s nebo bez 111-násobného přebytku neznačeného (Met^-1)GDNF injikován do prostředka pravého striata. Ve třetí skupině byl 1 μΐ ¹²⁵I-(Met^-1)GDNF s nebo bez 111-násobného přebytku neznačeného (Met^-1)GDNF injikován do colliculus superior. Rychlost injekce byla 0,1 μΐ za 15 sekund pro všechny inj ekce.

Po 20-24 hodinách doby přežívání byla zvířata usmrcena a perfusována 4% paraformaldehydem a 1% glutaraldehydem v 0,1 M pufru fosforečnanu sodného, pH 7,2. Mozky byly odebrány a zmraženy. Krysy, které dostaly injekci do colliculus superior byly usmrceny a jejich oči byly odebrány a imersně fixovány stejným fixačním činidlem. Radioaktivita očí byla měřena scintilační kamerou. Zmrazené temenní řezy mozku o tloušťce 25 μνα byly nařezány na kluzném mikrotomu a 10 Mm řezy oka byly připraveny na kryostatu. Řezy byly umístěny na skleněné blány a ponořeny do Kodak NTB-3 emulse. Expoziční čas se pohyboval od 15 do 30 dní. Blány byly potom vyvíjeny, barveny toluidinovou modří a vyšetřovány pod mikroskopem.

Po intra-striatální nebo intracerebroventrikulární (ICV) injekci do centrálního nervového sytému (CNS) bylo vychytávání a transport ^12SI-(Met^-1)GDNF pozorováno v dopaminergních neuronech v substantia nigra a ventrální tegmentální oblasti. Současná injekce nadbytku neznačeného (Met^-1)GDNF může kompletně blokovat neuronální značení ať ICV, nebo intrastriatální injekcí ^12SI-(Met^-1)GDNF. Tyto dopaminergní neurony, které jsou biologicky reaktivní na GDNF, by měly exprivovat funkční GDNF receptory, které jsou schopné vychytávání a retrográdního • · · · ·· ·· • · · • · · • e · · • * · · • · ·· ·· transportu. Specifické značení těchto dopaminergních neuronů ICV a intrastriatálně injikovaným ^12SI-(Met^-1)GDNF tak slouží jako dobrá pozitivní kontrola.

tak po ICV injekci. Vychytávání značeného blokováno současnou injekcí nadbytku neznačeného naznačuje, že vychytávání probíhá receptorem

Kromě toho, nízké značení neuronů bylo pozorováno v centrálním lineárním jádře raphe a dorsálním jádře raphé jak po intrastriatální, (Met^-1)GDNF bylo (Met^-1)GDNF, což zprostředkovaným mechanismem. Žádné značení neuronů v jiných sousedních jádrech raphe nebo v jakýchkoliv jiných neuronálních populacích v celém mozku dospělých krys nebylo pozorováno po intrastriatální nebo ICV injekci.

Při pokusech o nalezení jiných neuronálních populací, jako v oku, které nemají spojení s komorovým systémem, ale které mohou být schopné vychytávat a retrográdně trasportovat GDNF byl ^12£5I-(Met^-1) GDNF injikován do colliculus superior. Radioaktivita pozorovaná po přímém snímání oka ukázala selektivní akumulaci v kontralaterálním oku, ale ne v ipsilaterálním oku. Tato selektivita pravděpodobně vzniká díky zkřížené projekci gangliových buněk sítnice do kontralaterálního colliculus superior. Akumulace injekcí neznačeného těchto očí ukázaly, gangliovými buňkami ^12SI-(Met^-1)GDNF byl selektivně transportován do kontralaterálních, ale ne do ipsilaterálních gangliových buněk sítnice receptorem zprostředkovaným mechanismem.

radioaktivity může být blokována současnou (Met^-1)GDNF. Autoradiogramy zkřížených řezů že radioaktivita byla specificky asociována s sítnice. Výsledky ukazují, že

Příklad 3

Podpora přežívání gangliových buněk sítnice podáním GDNF proteinového produktu

V tomto pokusu byl hodnocen účinek podání GDNF proteinového produktu nebo vehikula na zvířecím modelu axotomie optického nervu podle metody, kterou popsal Mansour-Robaey et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 91: 1632 - 1636, 1994. V tomto modelu způsobuje axotomie optického nervu reprodukovatelnou smrt gangliových buněk sítnice u dospělých krys. Gangliové buňky sítnice byly předem značeny apikování Fluorogold soaked Gelfoam na povrch jak levého, tak pravého colliculus superior dospělých samic Sprague Dawley krys. Za jeden týden po aplikaci Fluorogold (den 0)byl pravý optický nerv přeťat 0,5 mm od oka (n = 3-6, pro každé ošetření). Levé oko sloužilo jako vnitřní kontrola vykazující značení gangliových buněk sítnice.

Zvířata byla předem ošetřena 1 μΐ buď (Met^-1)GDNF (1 mg/ml v PBS) nebo cytochromu c jako negativní kontrolou intraokulární injekcí dopravého oka v den 0 nebo v den 7. Účinek axotomie a léčby byl vyšetřován v den 7 nebo v den 14, jak je ukázáno v tabulce 2, po přetětí optického nervu.

Tabulka 2

Skupina Data injekce Data vyšetření

0, 7

Oči byly imersně fixovány 4% paraformaldehydem po dobu 1 hodiny. Byla označena orientace sítnice. Sítnice byla rozříznuta, celá upevněna na skleněné blány, vyšetřována a fotografována pod fluorescenčním mikroskopem. Počet gangliových buněk sítnice byl potom počítán na fotografiích. Bylo pozorováno, že axotomie s nebo bez cytochromu c (negativní kontroly) vede ke dramatickému snížení počtu značených gangliových buněk sítnice v den 7, který se dále snižuje v den 14. Léčba (Met“¹)GDNF v den 0 vedle k jasné záchraně gangliových buněk sítnice v den 7 a v den 14. Dvě léčby 1 μΐ (Met^-1)GDNF v den 0 a den 7 vedly k dalšímu zlepšení přežívání gangliových buněk sítnice v den 14. iyto výsledky ukazují, že ganglioé buňky sítnice reagují na GDNF a že léčba GDNF proteinovým produktem zvyšuje přežívání poškozených gangliových buněk sítnice, které jsou hlavní populací neuronů poškozených u glaukomu.

Po seznámení se s tímto popisem vynálezu a jeho preferovanými provedeními bude odborníkům v oboru jasné množství modifikací a variací. V důsledku toho, jediná omezení rozsahu předkládaného vynálezu jsou ta, která jsou uvedena v připojených patentových nárocích.

• ···· · ·· • · ·· · · · · ·

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Přihlašovatel: Yan, Qiao (ii) Název vynálezu: Způsob léčby poškození gangliových buněk sítnice za použití proteinového produktu neurotrofického faktoru (GDNF) odvozeného od gliální buněčné linie (iii) Počet sekvencí: 1 (iv) Adresa pro korespondenci

(A)	Adresa: AMGEN INC.
(B)	Ulice	: 1840 DeHavilland Drive
(C)	Město	: Thousand Oaks
(D)	Stát:	California
(E)	Země:	USA
(F)	ZIP:	91320

(v) Počítačová čtecí forma:

(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.25 (vi) Údaje o současné přihlášce:

(A) Číslo přihlášky:

(B) Datum podání:

(C) Klasifikace:

(viii) Zástupce/agent informace (A) Jméno: Curry, Daniel R.

(B) Registrační číslo: 32727 (C) Reference/číslo rejstříku: A-360 (ix) Telekomunikační informace:

	(A)	Telefon:	805-447-8102
	(B)	Telefax:	805-499-8011
w	(C)	Telex:

(2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 134 aminokyselinových zbytků (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ix) Vlastnosti (A) Jméno/Klíč: Odvozená aminokyselinová sekvence pro zralý lidský GDNF • *

(xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 1:

Ser 1

Pro

Asp

Lys

Gin 5

Met

Ala

Val

Leu

Pro 10

Arg

Glu

Arg

Asn 15

Arg

Gin

Ala

Ala 20

Ala

Asn

Pro

Glu

Asn 25

Ser

Arg

Gly

Lys

Gly 30

Arg

Gly

Gin

Arg 35

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly 40

Cys

Val

Leu

Thr

Ala 45

Ile

His

Leu

Asn

Val 50

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu 55

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys 60

Glu

Leu

Ile

Phe 65

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly 70

Ser

Cys

Asp

Ala

Ala 75

Glu

Thr

Tyr

Asp 80

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn 85

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg 90

Arg

Leu

Val

Ser

Asp 95

Lys

Val

Gly

Gin

Ala 100

Cys

Arg

Pro

Ile 105

Ala

Phe

Asp

Asp 110

Leu

Ser

Phe

Leu

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

Ser

Ala

115 120 125

Lys Arg Cys Gly Cys Ile

Claims

1. Použití proteinového produktu neurotrofického faktoru odvozeného od gliální buněčné linie (GDNF) pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčbu poškození nebo degenerace gangliových buněk sítnice.

2. Použití podle nároku 1, kde poškození nebo degenerace gangliových buněk sítnice je asociováno s glaukomem.

3. Použití podle nároku 2, kde farmaceutická kompozice dále obsahuje druhé terapeutické agens pro léčbu glaukomu.

4. Použití proteinového produktu neurotrofického faktoru odvozeného od gliální buněčné linie pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčbu poškození nebo degenerace axonů gangliových buněk sítnice, které tvoří optický nerv.

5. Použití podle nároku 4, kde poškození nebo degenerace optického nervu je asociováno se stavy poškozujícími papilu optického nervu, které jsou vybrány ze skupiny skládající se z glaukomu, edemu papily, papilitidy a ischemie.

6. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5, kde farmaceutická kompozice obsahuje GDNF aminokyselinové sekvence dané v SEQ ID NO: 1 nebo j eho variantu nebo derivát.

7. Použití podle nároku 6, kde farmaceutická kompozice je (Met¹)GDNF.

8. Použití podle nároku 6, kde derivát obsahuje polymer rozpustný ve vodě.

9. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5, kde farmaceutická kompozice je farmaceutická kompozice s prodlouženým uvolňováním.

10. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5, kde kompozice obsahuje buňky modifikované tak, aby produkovaly a secernovaly GDNF proteinový produkt.