CN1203531A - 用胶质细胞系衍生神经营养因子(gdnf)蛋白产物治疗视网膜神经节细胞损伤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明总体上涉及通过使用胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)来治疗视网膜神经节细胞损伤或变性的方法。本发明具体涉及治疗与青光眼相关的视神经损伤或变性的方法。

Description

用胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF) 蛋白产物治疗视网膜神经节细胞损伤的方法

发明背景

本发明一般涉及通过施用胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)蛋白产物治疗视网膜神经节损伤或变性的方法。本发明特别涉及治疗青光眼或与视网膜神经节细胞变性相关的其它疾病/情况的方法。

神经营养因子是在神经系统或神经系统支配的非神经组织中发现的天然蛋白，其机能是提高存活并维持特定神经和/或胶质细胞群的表型分化(Varon等，神经科学年评，1：327，1979；Thoenen等，科学，229：238，1985)。由于这种生理作用，神经营养因子在治疗上述神经细胞的变性和神经损伤导致的已分化机能失去是有用的。神经损伤是由危及一类或多类神经细胞生存和/或适当功能的情况引起，包括：(1)物理性损伤，它使受损部位的轴突变性(这反过来引起神经细胞死亡)和/或神经细胞胞体变性；(2)对神经系统某些部分的血供暂时或永久性终止(局部缺血)，如中风时的情况；(3)有意地或意外地接受神经毒素，如患癌症和AIDS病时分别使用化疗剂顺铂和双脱氧胞苷；(4)慢性代谢性疾病，如糖尿病或肾功能不良；或(5)神经变性疾病，如由特异神经元群变性引起的帕金森氏病、阿尔采默氏病和肌萎缩性侧索硬化症。为使一种特定的神经营养因子在治疗神经损伤中可能有用，一类或几类受损的神经细胞应对此因子有反应。已经证明不是所有神经元群体都有反应或受所有神经营养因子的影响相同。

已鉴定的第一个神经营养因子是神经生长因子(NGF)。NGF是已明确的称为神经营养素的营养因子家族的第一位成员，该营养因子家族目前包括脑源神经营养因子(BDNF)，神经营养素-3(NT-3)，NT-4/5和NT-6(Thoenen，神经科学趋势，14：165-170，1991；Snider，细胞，77：627-638，1994；Bothwell，神经科学年评，18：223-253，1995)。已知这些神经营养素通过trk酪氨酸激酶受体家族，即trkA、trkB、trkC和低亲合力p75受体起作用(Snider，细胞，77：627-638，1994；Bothwell，神经科学年评，18：223-253，1995；Chao等，TINS，18：321-326，1995)。

胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)是最近被发现的一种蛋白质，根据它在体外能延长中脑多巴胺能神经元的存活并刺激其表达递质传递者表型进行实验而鉴定和纯化出来(Lin等，科学，260：1130-1132，1993)。GDNF是一种糖基化具二硫键的同源双体，与转化生长因子-β(TGF-β)超家族蛋白有一些结构同源性(Lin等，科学，260：1130-1132，1993；Krieglstein等，EMBO J.，14：736-742，1995；Poulsen等，神经元，13：1245-1252，1994)。在肌肉和外周神经系统的许旺细胞(Henderson等，科学，266：1062-1064，1994；Trupp等，细胞生物学杂志，130：137-148；1995；)和中枢神经系统I型星形细胞(Schaar等，实验神经学，124：368-371，1993)中发现了GDNF mRNA。在体内，外源GDNF处理刺激帕金森氏症动物模型中黑质神经元的多巴胺能表型以及恢复由轴突节开术或多巴胺能神经毒素诱导的机能缺失(Hudson等，脑研究通报，36：425-432，1995；Beck等，自然，373：339-341，1995；Tomac等，自然，373：335-339，1995，Hoffer等，Neurosci Lett.，182：107-111，1994)。虽然原来认为GDNF对多巴胺能神经元是相对特异的，但是至少在体外，已有证据表明除中脑多巴胺能和体运动神经元外，GDNF可能有范围较大的神经营养目标(Yan和Matheson，自然，373：341-344，1995；Oppenheim等，自然，373：344-346，1995；Matheson等，神经科学学会摘要，21，544，1995；Trupp等，细胞生物学杂志，130：137-148，1995)。具体来说，在体内和体外都发现GDNF对脑干和脊髓胆碱能运动神经元具有神经营养作用(Oppenheim等，自然，373：344-346，1995；Zurn等，神经报道，6：113-118，1994；Yan等，自然，373：341-344，1995；Henderson等，科学，266：1062-1064，1994)。

本发明一般感兴趣的是发表于1993年4月1日的WO 93/06116(Lin等，Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture)，它报道了GDNF对神经损伤包括与帕金森氏症相关损伤的治疗是有用的。另一个感兴趣的是Schmidt-Kastner等，在1994年脑的分子研究26：325-330的报道，GDNF mRNA可以检测到了，并且在毛果芸香碱诱导的癫痫发作后上调；Schaar等1993年实验神经学124：368-371和Schaar等1994年实验神经学130：387-393的报道是，在培养条件下前脑基底部星形细胞表达中等水平的GDNF mRNA，但GDNF不能改变前脑基底部ChAT活性；以及1995年9月28日提交的目前未决的美国申请系列号08/535,682的报导，指出GDNF对治疗前脑基底部胆碱能神经元的损伤或变性是有用的。以前GDNF一直未显示能提高受损视网膜神经节细胞的存活或再生。

视网膜神经节细胞在几个阶段发生的视觉中起主要作用，首先，光线通过位于视网膜外层的称为光感受器的特异神经元转化为电信号。然后这些信号结合并通过中间神经元传递到位于视网膜内层的视网膜神经节细胞，然后将这种信息传递到大脑的视皮质区。视网膜神经节细胞轴突聚集形成视神经，延伸至大脑的侧膝状核和上丘，以及脑干核。

视网膜神经节细胞损伤是青光眼中所见的主要损伤，是导致视觉缺失的第三大流行因素。青光眼是用于一组疾病的术语，其特征为涉及视网膜神经节细胞进行性丢失的视神经病。视网膜神经节细胞损伤以轴突运输机能障碍和视神经头内轴突组织病理畸形为特征，并与典型的视神经头陷凹相关。视神经变性也可由视神经乳头的其它情况引起，例如由于增高的颅内压，视神经乳头炎(一种视神经炎)或局部缺血造成的视神经乳头水肿。

在大多数青光眼病例中，视神经损伤是由于升高的眼内压造成的。与升高的眼内压相关的青光眼主要类型是开角、闭角和继发性青光眼。在一些青光眼病例中，尽管眼内压为正常范围，但是产生相似的神经头陷凹。在所有病例中，较高的眼内压通常与较严重的神经损伤相关。通常通过服药或手术降低眼内压来治疗青光眼。

慢性开角青光眼是最常见类型，大约0.5％的美国和欧洲成年人中可见此病。在此种青光眼中，存在眼内水状液重吸收的阻滞，造成眼内压升高超过正常最大值21mmHg，并逐渐破坏视神经乳头中的轴突和支持组织。这种青光眼常常是无症状，直到相对晚期。在视觉外周区域中可见初期的视觉缺失。通过测量眼内压，检查视神经乳头和测试病人视觉区域进行诊断。治疗基本上是服药，表面施用拟副交感神经药(毛果芸香碱和卡巴可)，β-肾上腺素能抑制剂(噻吗洛尔)和拟交感神经药(肾上腺素)，其作用是减小眼内压。当这些药品单独或结合使用不再抑制进行性损伤时，须使用间接拟交感神经药(二乙氧磷酰硫胆碱)和碳酸酐酶抑制剂(乙酰唑胺和甲醋唑胺)。如果药用治疗失败，施行手术治疗打开流出通道。一种开角青光眼是先天的，由于眼内特定解剖结构发育不足所致。

在闭角青光眼中，由于浅前房，水状液的流出受到机械阻碍。眼内压维持正常直到瞳孔阻滞(造成经过瞳孔的水状液受阻)阻塞了角中重吸收面。然后压力突然升高，通常超过50mmHg。通常这种青光眼是单眼的，其特征为眼红痛，固定的和散大的瞳孔，视觉减弱，出汗和恶心。急性发作是一种医疗急症，并用非肠道注射的乙酰唑胺，口服甘油或静脉注射甘露醇，或表面使用毛果芸香碱以及有时用噻吗洛尔处理。急性发作控制后，可通过手术消除解剖的问题。

继发性青光眼是由另一种眼病导致发展的。实例是，由于晶状体的肿胀，角结构中的新血管化(新血管的形成)，慢性炎或角结构的严重钝伤形成青光眼。晶状体诱导的继发性青光眼的治疗是手术摘除晶状体。大多数其他继发性青光眼像初期开角青光眼一样进行药物治疗。新血管化青光眼难以治疗，但可用激光光致凝固法治疗。

继续需要用于治疗与一些情况例如青光眼相关的视网膜神经节细胞损伤的方法和治疗组合物。这些方法和治疗组合物会理想地保护视网膜神经细胞和视神经不受进行性损伤，并且提高受损神经元的存活或再生，无严重副作用。

发明概述

本发明提供治疗视网膜神经节细胞损伤或变性的方法，通过施用治疗有效量的胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)蛋白产物进行治疗。根据本发明的一个特定方面，提供了通过施用治疗有效量的GDNF蛋白产物来治疗青光眼的方法。另一方面，提供了治疗视神经损伤或变性的方法，视神经损伤或变性是由于影响视神经头的情况例如青光眼、视神经乳头水肿、视神经乳头炎和局部缺血造成的。施用治疗有效量的GDNF蛋白产物可提高形成视神经的视网膜神经节细胞轴突的存活或再生。我们认为这种GDNF蛋白产物包括例如SEQ ID NO：1中氨基酸序列所限定的GDNF蛋白及其变体和衍生物。本发明以下述发现为基础：视网膜神经节细胞选择性吸收和逆行运输GDNF蛋白产物，并且GDNF在体外提高视网膜神经节细胞的存活，GDNF在体内能提高受损视网膜神经节细胞，即青光眼中主要的受损神经元群体的存活。

根据本发明，可以非肠道使用剂量约1μg/kg天～100mg/kg/天的GDNF蛋白产物，一般剂量为大约0.1mg/kg/天～25mg/kg/天，通常剂量为约5mg/kg/天～20mg/kg/天。我们也认为，依据每个病人的需要和施药途径，可以较低频率使用GDNF蛋白产物，例如每周一次或每周几次，而不是每天一次或几次。我们还认为，可以直接眼内施用GDNF蛋白产物。本领域技术人员可以理解这种眼内施药可以用较少量的GDNF蛋白产物，例如单次注射或多次注射中一次眼内剂量为约1μg/眼～1mg/眼。我们还认为，GDNF蛋白产物可与有效量的另一种青光眼治疗剂结合或联合使用。

本发明也提供了GDNF蛋白产物在生产治疗视网膜神经节细胞损伤或变性包括治疗青光眼的药物组合物的药剂中的用途。这些药物组合物包括表面敷用、口服或非肠道使用的GDNF蛋白产物制剂。本领域技术人员也可以理解，可以通过下面进一步描述的细胞治疗和基因治疗方法来完成施药过程。在考虑了下面描述现在优选的实施方案的发明详述后，发明的许多附加方面和优点对本领域技术人员是显而易见的。发明详述

本发明提供一种治疗视网膜神经节细胞损伤或变性的方法，通过施用治疗有效量的胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)蛋白产物进行治疗。根据本发明的一个方面，提供了通过施用治疗有效量的GDNF蛋白产物治疗青光眼引起的视网膜神经节细胞变性的方法，施药方法可以是药物组合物、GDNF表达细胞移植或GDNF基因治疗。可以用任何具生物活性的GDNF蛋白产物实施此发明，包括SEQ ID NO：1中列举的氨基酸序列所描述的GDNF蛋白，包括该蛋白的变体和衍生物。除口服、非肠道或表面使用GDNF蛋白产物外，还可以通过细胞治疗和基因治疗方法施药。

本发明是以初期的发现为根据，该发现是GDNF提高培养的视网膜神经节细胞存活，并且视网膜神经节细胞以受体特异性方式选择性吸收和逆行运输GDNF。随后确定GDNF在这些神经元的发育、存活和机能维持中起作用。此外，发明是以以下发现为根据，即GDNF蛋白产物增加受损视网膜神经节细胞的体内存活，这些细胞构成了青光眼中主要的受损神经元群体。推测外源GDNF蛋白产物的施用能保护视网膜神经节细胞免受创伤或由于神经营养因子缺乏造成的损伤，这种缺乏是由于从轴突到细胞体的因子运输中断造成的。预期这种治疗使视网膜神经节细胞忍受间歇的干扰并保持视神经的机能完整性，其干扰来自眼压、血管营养不良或可能造成青光眼或其他视神经疾病的情况。

根据本发明，可非肠道施用GDNF蛋白产物，剂量范围约为1μg/kg/天～100mg/kg/天，一般剂量约为0.1mg/kg/天～25mg/kg/天，通常剂量约为5mg/kg/天～20mg/kg/天。可以直接眼内施用GDNF蛋白产物。在这些情况中，可施用少量GDNF蛋白产物，例如单次注射或多次注射中剂量约为1μg/眼～1mg/眼。也可以在光感受器层和视网膜色素上皮层间的视网膜下空间内施用GDNF。我们还认为，GDNF蛋白产物可以与一定量的另一种治疗青光眼的治疗剂结合施用。第二种治疗剂包括，例如拟副交感神经药(毛果芸香碱和卡巴可)，β-肾上腺素抑制剂(噻吗洛尔)和拟交感神经药(肾上腺素)，间接的拟副交感神经药(二乙氧磷酰硫胆碱)以及碳酸酐酶抑制剂(乙酰唑胺和甲醋唑胺)。本发明也提供GDNF蛋白产物在制备用于治疗视网膜神经节细胞损伤或变性包括治疗青光眼的药剂中的用途。以下进一步描述了多种药物制剂和不同的输送技术。

如此处所用，术语“GDNF蛋白产物”包括纯化的天然、合成或重组的胶质细胞系衍生神经营养因子、有生物活性的GDNF变体(包括插入、替代和缺失变体)和其经化学修饰的衍生物。与含有SEQ ID NO：1所列氨基酸序列的人GDNF基本同源的GDNF也包括在内。GDNF蛋白产物有生物学活性的形式可以是同源双体或异源双体。

如此处所用，术语“有生物学活性”是指GDNF蛋白产物表现出与含有SEQ ID NO：1所列氨基酸序列的GDNF有相似的神经营养特性，但不是必须所有的特性均相同，也不是必须要达到相同的水平。对感兴趣的特殊的神经营养特性的选择取决于使用GDNF蛋白产物所起的作用。

如此处所用，术语“基本同源”是指与含有SEQ ID NO：1所列氨基酸序列的GDNF有一定程度的同源性，优选超过70％，最优选超过80％，甚至更优选超过90或95％。例如，大鼠和人此蛋白产物的同源程度约为93％，我们认为优选的哺乳动物GDNF含有类似的高度同源性。有两个序列作对比，在其中被比较的那段序列中相同的氨基酸残基对齐，这时可以在100个氨基酸的长度中引入4个间隙以帮助对齐，计算较小序列中相同氨基酸的百分数就作为此处所述的同源性的百分数(如Dayhoff在《蛋白质序列和结构图谱》v.5.p.124.国家生物化学研究基金会，Washington.D.C.(1972)所阐述的那样，其公开的内容在此引入以供参考)。基本同源还包括任何根据其能与SEQ ID NO：1GDNF的抗体发生交叉反应的特点而进行分离的GDNF蛋白产物或任何根据其基因能与SEQ ID NO：1 GDNF的基因或其片段杂交而进行分离的GDNF蛋白产物。

根据本发明的GDNF可以由本领域技术人员以任何熟悉的方式进行分离或制备。制备本发明所用的GDNF蛋白产物的典型方法在以下各专利中有所描述：1994年5月23日提交的美国专利申请No.08/182,183及其母申请；1992年9月17日提交的PCT申请No.PCT/US92/07888，出版物号为WO 93/06116(Lin et al，Syntex-SynergenNeuroscience Joint Venture)；欧洲专利申请No.92921022.7，出版物号为EP 610254；以及1995年9月28日提交的共享的共同未决的美国申请系列号08/535,681(“截短的胶质细胞系衍生神经营养因子”)，所有这些专利的公开内容在此引入以供参考。

自然存在的GDNF蛋白产物可以从哺乳动物神经细胞样品中分离，或者从一种分泌或表达GDNF的哺乳动物细胞系中分离。例如，WO 93/06116描述了从B49恶性胶质瘤细胞的无血清生长条件培养基中分离GDNF。本领域的技术人员也可以以任何熟知的方式化学合成GDNF蛋白产物。GDNF蛋白产物优选以重组技术进行制备，因为重组技术能够获得相对更多更纯的蛋白质。重组GDNF蛋白产物的形式包括蛋白的糖基化和非糖基化形式，以及在细菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞表达系统中表达的蛋白质。

通常，重组技术包括分离负责编码GDNF的基因，在适当的载体和细胞类型中克隆此基因，对此基因进行修饰，如果这对于编码想要的一种变体来说是必需的话，以及表达此基因以制备GDNF蛋白产物。作为一种选择，编码想要的GDNF蛋白产物的核苷酸序列也可以进行化学合成。我们认为GDNF蛋白产物可以利用因遗传密码简并或等位变体造成密码子使用不同的核苷酸序列进行表达。WO 93/06116描述了大鼠GDNF基因cDNA克隆的分离和测序，以及人GDNF基因基因组DNA克隆的分离，测序和表达。WO 93/06116也描述了GDNF蛋白产物表达所用的载体、宿主细胞和培养物生长条件。适合GDNF蛋白产物在E.coli中表达的其它载体在于1991年4月24日出版的欧洲专利申请No.EP 0 423 980(干细胞因子)中公开，公开的内容在此引入以供参考。编码成熟的人GDNF基因的DNA序列和GDNF的氨基酸序列列在WO 93/06116图19(SEQ ID NO：5)中。图19没有列出GDNF脯氨酸以前部分的所有编码序列，但在WO 93/06116的图22(SEQ IDNO：8)中列出了GDNF脯氨酸以前部分的前50个氨基酸。

自然存在的GDNF有生物学活性的形式是二硫键连接的二聚体。经细菌系统表达之后分离出来的物质基本无生物学活性，以单体的形式存在。要制备有生物学活性的二硫键连接的二聚体就必须进行再折叠。在WO 93/06116中描述了对表达于细菌系统的GDNF的再折叠和成熟过程。在WO 93/06116和1995年9月28日提交的共享的共同未决的美国申请系列号08/535,681中也描述了测定GDNF活性的标准体外实验，在此引入以供参考。A.GDNF变体

如此处所用，术语“GDNF变体”包括自然存在的GDNF其氨基酸序列的残基中有氨基酸缺失(“缺失变体”)、插入(“插入变体”)或替代(“替代变体”)的多肽。像这样的变体的制备可以通过把适当的核苷酸变化引入编码多肽的DNA中或通过体外化学合成想要的多肽的方法。本领域的技术人员可以理解，只要最后得到的分子有GDNF生物学活性，可以进行许多替代、插入和缺失的组合。

本领域的技术人员已经熟知对一个或多个挑选出来的氨基酸残基进行替代、插入或缺失的诱变技术(如美国专利号4,518,584，其公开的内容在此引入以供参考)。在构建变体时有两方面主要变动：突变点的位置和突变的性质。在设计GDNF变体的时候，突变点和突变性质的选择要根据要修饰的GDNF的某个或多个特性。对突变点的修饰可以单独进行，也可以依次进行，如(1)先选择保守性氨基酸替代，再根据所得的结果选择变化更大的替代；(2)去掉目的氨基酸残基；或者(3)紧邻氨基酸残基所在部位插入氨基酸残基。优选1～20个氨基酸的保守性变动。一旦想要的GDNF蛋白产物的氨基酸序列决定了，用于表达这个蛋白的核酸序列也就很容易决定了。N-末端和C-末端缺失变体也可通过蛋白水解酶制备。

对于GDNF缺失变体，缺失的范围通常在约1～30个残基，更常见约1～10个残基，典型的是约1～5个连续性残基。N-末端、C-末端和序列内的缺失均可考虑。为了修正GDNF的活性，可以在与其它的TGF-β超家族成员同源性较低的区域引入缺失。在与其它的TGF-β超家族成员基本同源的区域进行缺失突变更可能更显著地改变GDNF的生物学活性。对连续性缺失的数目要进行选择以维持GDNF蛋白产物受影响的功能区的三级结构，如半胱氨酸交联。缺失变体的范例还包括但不局限于下面的例子：截去GDNF  N-末端1-40个氨基酸的GDNF蛋白产物；缺失GDNF C-末端残基的变体；或兼而有之；如在1995年9月28日提交的共享的共同未决的美国申请系列号08/535,681所述，该专利申请在此引入以供参考。

对于GDNF插入变体，被插入的氨基酸序列一般包括N-和/或C-末端融合的氨基酸序列，长度从一个残基到包含一百或更多个残基的多肽，以及插入序列内的一个或多个氨基酸残基。内部插入的序列一般为约1-10个残基，更典型的是约1-5个残基，通常1-3个氨基酸残基。N-末端插入变体的范例包括含N-末端蛋氨酸残基的GDNF(GDNF在细菌重组细胞培养物中直接表达的人工产物)，它被称作[Met^-1]GDNF，和为了便于成熟的GDNF从重组宿主细胞中分泌出来而在GDNF的N-末端融合了异源性N-末端信号序列的融合产物。这样的信号序列通常从要用的宿主细胞种中获得，因而也与之同源。插入物还可以包括源自其它神经营养因子序列的氨基酸序列。根据本发明，优选的可使用的GDNF蛋白产物是重组人[Met^-1]GDNF。

GDNF替代变体至少有一个GDNF氨基酸序列的氨基酸残基被去掉，一个不同的残基插入到它的位置。这样的替代变体包括等位变体，它们的特征在于在种群中有自然存在的核苷酸序列的变化，此变化或许能或许不能引起氨基酸的变化。替代变体的范例(参见SEQ ID NO：50)在1995年9月28日提交的共享的共同未决的美国申请系列号08/535,681中被公开，在此引入以供参考。

GDNF氨基酸序列的特殊突变可以包括对糖基化位点(如丝氨酸、苏氨酸或天门冬酰胺)进行修饰。无糖基化或只有部分糖基化是在任何天门冬酰胺相关的糖基化识别位点或在因加上O键碳水化合物而被修饰的分子的任何位点发生氨基酸的替代或缺失造成的。天门冬酰胺相关的糖基化识别位点包括一个三肽序列，它被相应的细胞糖基化酶特异识别。这些三肽序列要么是Asn-Xaa-Thr，要么是Asn-Xaa-Ser，其中Xaa可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。许多发生在糖基化识别位点第1位或第3位氨基酸其中之一或两者兼有的氨基酸替代或缺失(和/或第2位氨基酸的缺失)均导致被修饰的三肽序列的非糖基化。因此，表达经改变的合适的核苷酸序列可制备出在那个位点不发生糖基化的变体。此外，GDNF氨基酸序列也可以进行修饰以加入糖基化位点。

找出用于诱变的GDNF氨基酸残基或区域的方法之一称为“丙氨酸校验诱变法”，如Cunningham和Wells所述(科学，244：1081-1085，1989)。在这个方法中，先找出一个氨基酸残基或一组目的残基(如带电荷的残基象Arg，Asp，His，Lys和Glu)，然后用一个中性的或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，目的是改变氨基酸与胞内或胞外周围水环境的相互作用。那些对这些替代表现出功能敏感性的功能区接着可以通过在替代位点引入新的或换成其它的残基而被进一步改进。这样，可以引入氨基酸序列变异的目的位点就被确定下来，然后在DNA序列上相应的目的密码子或区域进行丙氨酸校验或随机诱变，检查表达出来的GDNF变体，以找到预期的活性和活性水平的最佳组合。

替代诱变最感兴趣的位点包括侧链大小、电荷、和/或疏水性在来自不同种的蛋白中基本不同的氨基酸所在的位点。其它感兴趣的位点是在来自不同种的GDNF样蛋白中均一致的特殊残基所在位点。这些位置对蛋白的生物活性通常较为重要。开始时，这些位点以一种相对保守的方式被替代。表1在优选替代标题下列出了像这样的保守性替代。如果这样的替代导致了生物学活性的改变，那么更基本的改变(示范替代)就会被引入，和/或引入其它的插入或缺失，所得的产物要进行活性筛选。

                               表  1

                             氨基酸替代

初始残基                   优选替代                   示范替代

Ala(A)                        Val                     Val；Leu；Ile

Arg(R)                        Lys                     Lys；Gln；Asn

Asn(N)                        Gln                     Gln；His；Lys；Arg

Asp(D)                        Glu                     Glu

Cys(C)                        Ser                     Ser

Gln(Q)                        Asn                     Asn

Glu(E)                        Asp                     Asp

Gly(G)                        Pro                     Pro

His(H)                        Arg                     Asn；Gln；Lys；Arg

Ile(I)                        Leu                     Leu；Val；Met；Ala；Phe；

                                                      norleucine

Leu(L)                        Ile                     norleucine；Ile；Val；

                                                      Met；Ala；Phe

Lys(K)                        Arg                     Arg；Gln；Asn

Met(M)                        Leu                     Leu；Phe；Ile

Phe(F)                        Leu                     Leu；Val；Ile；Ala

Pro(P)                        Gly                     Gly

Ser(S)                        Thr                     Thr

Thr(T)                        Ser                     Ser

Trp(W)                        Tyr                     Tyr

Tyr(Y)                        Phe                     Trp；Phe；Thr；Ser

Val(V)                        Leu                     Ile；Leu；Met；Phe；Ala；

                                                      norleucine

对氨基酸序列的保守性修饰(和对编码核酸序列的相应修饰)预期能制备出与天然GDNF有相似功能和化学特性的GDNF蛋白产物。相反，通过选择在维持(a)替代区域多肽骨架的结构，如片层或以螺旋构象，(b)目的位点分子的电荷或疏水性，或(c)侧链大小方面所起作用明显不同的替代可以对GDNF蛋白产物的功能和/或化学特性进行基本修饰。根据共同的侧链特点将自然存在的残基分成下列各组：

1)疏水的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Lle；

2)中性亲水的：Cys，Ser，Thr；

3)酸性的：Asp，Glu；

4)碱性的：Asn，Gln，His，Lys，Arg；

5)影响链方向的残基：Gly，Pro；以及

6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。

非保守性替代可以包括用这些组中的一个成员代替另一个成员。像这样的替代残基可以引入GDNF蛋白与其它TGF-β超家族蛋白同源的区域或引入分子的非同源区域。B.GDNF衍生物

本领域技术人员根据此处公开的内容可以制备GDNF或GDNF变体化学修饰的衍生物。最适合形成衍生物的化学部分包括水溶性聚合物。水溶性聚合物之所以合乎需要，是因为它所连接的蛋白质不在水环境如生理环境中沉淀。此聚合物优选在制药方面适宜制备治疗性产品或组合物。本领域技术人员可以根据这样的考虑：象聚合物/蛋白质结合物是否可以用于治疗，如果可以，理想的剂量、循环时间、蛋白水解抗性以及其它的考虑等等来选择合乎需要的聚合物。这样衍生的效果可以通过以理想的方式(即通过渗透压，或较优选地通过注射或灌注，或更进一步进行配制以适合经口、经肺或经其它给药途径施用)使用衍生物并测定它的效果而确定。

合适的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二尪茂烷、聚1，3，6-三尪烷、乙烯/马来酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、葡聚糖或聚(正乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、氧化聚丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物，但不仅限于此。聚乙二醇丙醛因在水中稳定可能在制备时有优势。

聚合物可以是任何分子量，可以分支或不分支。对于聚乙二醇，优选的分子量范围在约2kDa～约100kDa，以便于操作和制备(术语“约”指的是制备聚乙二醇时，有的分子的分子量比所说的分子量要大，有的要小)。根据需要的医疗特性(如所需的持续释放的时间；对生物学活性的影响，如果有的话；操作的方便性；抗原性的强弱或是否缺乏抗原性以及其它已知的聚乙二醇对治疗性蛋白质或其变体的影响)也可以使用其它大小的分子。

如此连接的聚合物分子数目可以不同，本领域的技术人员能确定它对功能的影响。可以在单个位置进行衍生，也可以用相同或不同的化学部分(如聚合物，象不同分子量的聚乙二醇)在两个位置、三个位置、四个位置或某些位置的组合进行衍生。聚合物分子与蛋白质(或多肽)分子的比例可以改变，它们在反应混合物中的浓度也可以改变。通常，最佳比例(从反应效率方面来说就是没有多余的未反应的蛋白质或聚合物)要根据如下因素来确定，所述因素如需要衍生的程度(如单个位置、两个位置、三个位置等)、所选聚合物的分子量、聚合物有无分支和反应条件。

聚乙二醇分子(或其它的化学部分)在连接到蛋白质上去的时候要考虑到它们对蛋白质功能性或抗原性功能区的影响。有许多连接方法可以供本领域的技术人员使用。参见，如EP 0 401 384，其公开的内容在此引入以供参考(将PEG偶联至G-CSF上)；也可参见Malik等，实验血液学，20：1028-1035(1992)(报告用tresyl chlaride进行GM-CSF的聚乙二醇化)。举个例子，聚乙二醇可以通过一个活性基团，如一个自由氨基或羧基与氨基酸残基共价结合。活性基团是那些可以结合一个活化的聚乙二醇分子的基团。有自由氨基的氨基酸残基可以包括赖氨酸和N-末端氨基酸残基。有自由羧基的氨基酸残基可以包括天门冬氨酸、谷氨酸和C-末端氨基酸残基。巯基也可以作为一个连接聚乙二醇分子(或多个分子)的活性基团。出于治疗的目的，优选在氨基基团处进行连接，如在N-末端或赖氨酸基团处连接。如果要结合受体，则应避免在对于结合受体重要的位点进行连接。

有人或许特别想要一种N-末端化学修饰的蛋白。以聚乙二醇作为此组合物的一个例子进行说明，人们可以从许多聚乙二醇分子中进行挑选(通过分子量、分支情况等)，可以选择在反应混合物中聚乙二醇与蛋白(或多肽)分子的比例、要进行的聚乙二醇化反应的类型以及获得所选的N-末端被聚乙二醇化的蛋白的方法，以达到特定目的。获得N-末端聚乙二醇化制品(即若必要的话将这种部分与其它单位置聚乙二醇化的部分分开)的方法可为通过从一系列聚乙二醇化蛋白分子中纯化出该所需N-末端聚乙二醇化的蛋白。选择性N-末端化学修饰可通过还原性烷基化来完成，它是利用特定蛋白质中可供衍生的不同类型的伯氨基的不同反应活性(赖氨酸相对于N-末端)来完成的。在适当反应条件下，利用含羰基聚合物，可以在N-末端对该蛋白质实现基本上选择性的衍生。例如，在一定的pH值下，即可利用蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基和N-末端残基的α-氨基的pKa不同的pH值下进行反应，即可对蛋白质的N-末端选择性地实现聚乙二醇化。通过这样的选择性衍生，水溶性聚合物与蛋白的连接就可以被控制：与聚合物的结合主要发生在蛋白质的N-末端，其它活性基团，如赖氨酸侧链氨基基团不会发生明显的修饰。使用还原性烷基化，水溶性聚合物可以是属于上面所描述的类型，并且应该有与蛋白结合的单个活性醛基。聚乙二醇丙醛有单个的活性醛基，可以被使用。

本发明包括将原核细胞表达的GDNF或其变体连接到至少一个聚乙二醇分子上形成的衍生物的应用，以及通过酰基或烷基连接到一个或多个聚乙二醇分子上的GDNF或其变体的应用。

聚乙二醇化可以以任何本领域已知的聚乙二醇化反应进行。参见，如，Focus on Growth Factor 3(2)：4-10(1992)；EP 0 154 316，其公开的内容在此引入以供参考；EP 0 401 384；以及其它此处引用的与聚乙二醇化有关的出版物。通过与活性聚乙二醇分子(或类似的活性水溶性聚合物)发生酰化反应或烷基化反应就可以进行聚乙二醇化。

通过酰化作用的聚乙二醇化通常包括用聚乙二醇的活性酯衍生物与GDNF蛋白或其变体反应。任何已知的或随后发现的活性PEG分子都可以用来进行GDNF蛋白或其变体的聚乙二醇化。优选的活性PEG酯是N-羟基琥珀酰亚胺PEG酯。本文中“酰化”应理解为包括但不限于下列各类存在于治疗性蛋白质和象PEG这样的水溶性聚合物之间的连接键：酰胺键、氨基甲酸酯键、氨基甲酸乙酯键等等。参见Bioconjugate Chem.5：133-140(1994)。反应条件可以从任何在聚乙二醇化技术领域中已知的反应条件或随后发展的反应条件中进行选择，但应避免能使待修饰的蛋白或变体失活的温度、溶剂和pH值等条件。

通过酰化作用的聚乙二醇化通常产生多处聚乙二醇化的GDNF蛋白或变体。连接键优选酰胺键。所得的产物也优选基本上只有(如＞95％)单个位置、两个位置或三个位置的聚乙二醇化。但是，根据所用的特殊反应条件，可能会产生大量的聚乙二醇化程度较高的蛋白。如果需要的话，利用常规纯化技术，包括透析、盐析、超滤、离子交换色谱、凝胶过滤色谱和电泳等，可以从混合物，特别是未反应的物质中分离出加纯净的聚乙二醇化蛋白。

通过烷基化作用的聚乙二醇化通常包括在有还原剂存在时用末端带醛基的PEG衍生物与GDNF蛋白或变体发生反应。通过烷基化的聚乙二醇化也会产生多处聚乙二醇化的GDNF蛋白或变体。此外，人们可以控制反应条件以利于基本上只在GDNF蛋白或变体N-末端的α-氨基处发生聚乙二醇化(即单个位置聚乙二醇化的蛋白)。不管是单个位置聚乙二醇化还是多个位置聚乙二醇化，PEG基团优选以-CH₂-NH-基团与蛋白相连接。这种类型的连接键，特指-CH₂-基团，此处被称作“烷基”连接键。

通过还原性烷基化用以制备单个位置聚乙二醇化产物的衍生方法利用了可供衍生的不同类型的伯氨基(赖氨酸对N-末端)的不同反应活性。反应是在一定的pH值下，即可利用蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基和N-末端残基的α-氨基的pKa不同的pH值下进行的。通过这样的选择性衍生，含有醛基等反应基团的水溶性聚合物与蛋白的连接就可以被控制：与聚合物的结合主要发生在蛋白质的N-末端，其它活性基团，如赖氨酸侧链氨基基团不会发生明显的修饰。一个重要的方面是本发明包括使用单个聚合物/GDNF蛋白(或变体)的结合分子的基本均质制剂(意思是聚合物分子基本上(即＞95％)只连接到GDNF蛋白或变体的一个位置)。更特殊的是，如果用到聚乙二醇，本发明也包括使用聚乙二醇化的缺乏可能有抗原性的连接基团的蛋白或其变体，并且使聚乙二醇分子直接偶联到GDNF蛋白或其变体上。

因此，根据本发明而使用的GDNF蛋白产物可以包括聚乙二醇化的GDNF蛋白或变体，其中单个或多个PEG基团通过酰基或烷基被连接上去。如上面所讨论的那样，这样的产物可以是单个位置聚乙二醇化，也可以是多个位置聚乙二醇化(如包含2-6个，优选包含2-5个PEG基团)。通常，PEG连接到蛋白质氨基酸的α-或ε-氨基基团上，但是可以设想的是，PEG基团可以连接到与蛋白质相连的任何氨基基团上，它已充分活化，在适当的反应条件下就可与PEG基团相连。

在酰化和烷基化的方法中使用的聚合物分子均可以从上述的水溶性聚合物中进行挑选。所选的聚合物应该被修饰成只含一个活性基团，如用于酰化的活性酯基或用于烷基化的醛基，而优选的选择为使得在使用本发明的方法时聚合度可控。活性PEG醛的一个例子是聚乙二醇丙醛，它是水溶性的；或者是其单C₁-C₁₀烷氧基或C₁-C₁₀芳氧基衍生物(参见，美国专利5,252,714)。聚合物可以有分支，也可没有分支。对于酰化反应，所选的单个或多个聚合物应该有单个活性酯基。对于还原性烷基化反应，所选的单个或多个聚合物应该有一个活性醛基。通常，水溶性聚合物不从自然存在的糖基化残基中选择，因为一般来说通过哺乳动物重组表达系统这些残基可以更方便地制备。聚合物可以是任何分子量，可以分支或不分支。

此处使用的一种特别优选的水溶性聚合物是聚乙二醇。本文中所用“聚乙二醇”意谓包含任何形式的用于衍生其它蛋白的PEG，如单(C₁-C₁₀)烷氧基或芳氧基聚乙二醇。

通常，化学衍生可以在任何合适的使一种有生物学活性的物质与一种活化的聚合物分子发生反应的条件下进行。制备聚乙二醇化的GDNF蛋白或变体的方法通常包括下列几步：(a)在一定条件下使一种GDNF蛋白或变体与聚乙二醇(如PEG的活性酯或醛类衍生物)发生反应，由此蛋白与一个或多个PEG基团相连接；和(b)获取一种或多种反应产物。通常，烷基化反应的最佳反应条件将根据已知的参数和需要的结果具体情况具体对待。例如，PEG：蛋白的比值越大，多位置聚乙二醇化产物的百分比就越高。

用以制备基本均质的一系列单个聚合物/GDNF蛋白(或变体)结合分子的还原性烷基化反应通常包括下列步骤：(a)在还原性烷基化反应条件下，使一种GDNF蛋白或变体与一种活性PEG分子反应，反应在一定的pH值，即可对该GDNF蛋白或变体氨基末端的α-氨基基团进行选择性修饰的pH值下进行；和(b)获得一种或多种反应产物。

对于基本均质的一系列单个聚合物/GDNF蛋白(或变体)结合分子，还原性烷基化反应的条件是允许水溶性聚合物部分与GDNF蛋白或变体的N-末端发生选择性连接。这样的反应条件通常依赖氨酸氨基基团和N-末端的α-氨基基团之间pKa的不同而定(pKa是50％的氨基基团质子化，50％的未质子化时的pH值)。此pH值也影响所采用的聚合物和蛋白质的比值。通常，如果pH越低，就要求相对蛋白质而言聚合物的过量越多(即活性N-末端α-氨基越少，为达到最佳条件所需的聚合物就越多)。如果pH值较高，聚合物∶蛋白质的比值就不需要那么大(即活性基团更多，故所需聚合物分子较少)。本发明中pH值通常会在3-9范围之内，优选3-6。

另一个重要的考虑是聚合物的分子量，通常，聚合物的分子量越大，与蛋白相连的聚合物分子就越少。同样，当要使这些参数最优化时，就应该考虑聚合物的分支情况。通常，分子量越大(或分支越多)，聚合物∶蛋白的比值就越大。通常，为了此处所要进行的聚乙二醇化反应，优选的平均分子量是约2kDa～约100kDa。优选平均分子量为约5kDa～约50kDa，特别优选的是约12kDa～约25kDa。水溶性聚合物与GDNF蛋白质或变体的比值通常在1∶1～100∶1，优选(对多个位置聚乙二醇化来说)1∶1～20∶1和(对单个位置聚乙二醇化来说)1∶1～5∶1。

使用上述条件，还原性烷基化作用将产生聚合物对任何在氨基末端有α-氨基基团的GDNF蛋白或变体的选择性连接，并且产生一种基本均质的单个聚合物/GDNF蛋白(或变体)结合物的制品。术语“单个聚合物/GDNF蛋白(或变体)结合物”此处用来指一种组合物，它包含单一的聚合物分子连接到GDNF蛋白或GDNF蛋白变体的一个分子上。单个聚合物/GDNF蛋白(或变体)结合物优选在N-末端而不是在赖氨酸的侧氨基基团上有一个聚合物分子。该制品优选含单个聚合物/GDNF蛋白(或变体)结合物超过90％，更优选超过95％，并且剩余的能观察到的分子未发生反应(即缺少聚合物部分的蛋白质)。

至于此处的还原性烷基化作用，还原剂应该在水环境中稳定，优选只能还原在还原性烷基化反应过程一开始时形成的Schiff碱。优选的还原剂可以从氢硼化钠、氰氢硼化钠、二甲胺硼烷、三甲胺硼烷和吡啶硼烷中挑选。特别优选的还原剂是氰氢硼化钠。其它反应参数，如溶剂、反应时间、温度等以及产物纯化的方法，可以根据已出版的有关用水溶性聚合物衍生蛋白质的文献视具体情况而定(参见本文所引用的出版物)。C.GDNF蛋白产物药物组合物

GDNF蛋白产物药物组合物典型地包括一种治疗有效剂量的GDNF蛋白产物和一种或多种药用和生理上可接受的配制材料的混合物。合适的配制材料包括抗氧化剂、防腐剂、色素、香料、稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、膨化剂、缓冲剂、输送载剂、稀释剂、赋形剂和/或药物性佐剂，但不仅限于此。例如，合适的载剂可以是用以注射的水，生理盐水，或者人工合成CSF，还可能补充上其它的胃肠外给药的组合物中常见的材料。中性缓冲盐水或混合了血清白蛋白的盐水也是比较典型的载剂。

载剂中主要的溶剂本质上既可以是水性的，也可以是非水性的。此外，载剂中还可包括其它的可用于制药的赋形剂以调整或维持制剂的pH、渗透性、粘滞度、澄清度、颜色、无菌性、稳定性、溶解率或味道。同样，载剂中还可再包括其它的可用于制药的赋形剂以调整或维持GDNF蛋白产物释放的速度，或促进GDNF蛋白产物通过眼睛的各种膜而被吸收或促进它透过眼睛的各种膜。像这样的赋形剂通常和传统上是那些以单剂或多剂形式制成经胃肠外给药的制剂的物质。

一旦治疗性组合物被制成，它就可以作为溶液、悬液、凝胶、乳剂、固体、脱水或冻干的粉剂被贮存在无菌小瓶中。像这样的制剂既可以即用形式贮存，也可以给药前需重配的形式，如冻干粉贮存。

最佳药用制剂可以由本领域的技术人员考虑给药途径和需要的剂量等而决定。参见，如Remington制药科学，第18版(1990，Mack出版公司，Easten，PA 18042)，1435-1472页，其内容在此引入以供参考。这些制剂或许会影响GDNF蛋白、变体及衍生物的物理状态、稳定性、体内释放率和体内清除率。

其它有效的给药形式，如胃肠外缓释制剂、吸入雾剂或口内活性制剂均可以考虑。例如，以持续释放的制剂，GDNF蛋白产物可以结合或掺入到聚合物复合物(如聚乳酸、聚羟基乙酸等)或脂质体的微粒性制品中。Hylauronic acid也可以使用，这或许能延长在循环中持续的时间。GDNF蛋白产物药物组合物还可制成胃肠外给药如眼内灌注或注射的制剂，也可包括缓释或持续循环的制剂。像这样的胃肠外给药治疗性组合物典型的形式是无致热原、包含存在于药用载体中的GDNF蛋白产物、适于胃肠道外给药的水性溶液。一种优选的载剂是无菌蒸馏水。

我们也考虑了某些含GDNF蛋白产物的制剂要经口服给药。以这种方式使用的GDNF蛋白产物要用胶囊包裹，并且用或不用那些习惯上在合成固体制剂时使用的载体一起配制。胶囊可以设计成在胃肠道中当生物利用率最高而系统前降解最低的那一刻释放出制剂的有效成分。其它的赋形剂也可被包含在内以加速GDNF蛋白产物的吸收。稀释剂、香料、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、药片分散剂和粘合剂也可以使用。

局部眼用制品，包括用于眼部的溶液、悬液和软膏的配制，已为本领域的技术人员所熟知(参见Remington制药科学，第18版，86章，1581-1592页，Mark出版公司，1990)。其它的给药方式也可以用，包括眼房内注射(直接注射到前房或直接注射到玻璃体腔)、结膜下注射以及球后注射，制备以这样方式使用的眼用制品的方法和方式已经众所周知。

如本申请所用，“眼外”指的是眼睛表面和眼球与眼睑之间的(外面的)空间。眼外区的实例包括眼睑穹窿、结膜表面和角膜表面。这个部位在所有眼组织的外面，到达此部位不需要侵入性操作。眼外系统的实例包括嵌入物和“局部”应用的滴剂、凝胶或软膏，它们可以把治疗性物质送到这些区域。眼外装置通常很容易被去掉，甚至病人自己就可以。

下列专利公开了用以在眼外区使用药物的眼外系统。在美国专利号3,981,303、3,986,510和3,995,635中Higuchi等公开了一种包含药物的生物降解性眼用嵌入物。为了能在眼球的穹窿，即眼球和眼睑之间的眼外空间滞留，嵌入物被制成不同的形状。几种适合用来制作此装置的常见的生物相容性聚合物已被公开。这些聚合物包括藻酸锌、聚乳酸、聚乙烯醇、聚酸酐和聚羟基乙酸。这些专利也描述了减低药物渗透的膜包被装置和装有药物制剂的中空小室。

在美国专利号4,217,898中Theeuwes公开了用以进行控制性药物输送的微孔贮存器。这些装置被放在眼外眼穹窿中。感兴趣的聚合物系统包括聚氯乙烯-共聚聚乙酸乙烯酯共聚体。在美国专利号4,865,846和4,882,570中Kaufman公开了一种眼部药物输送系统，它包含至少一种针对结膜囊的可生物降解的材料或软膏载体。该专利公开了一些聚合物系统，如聚交酯、聚乙交酯、聚乙烯醇和交联的胶原，作为合适的输送系统。

在当前所述的GDNF蛋白产物治疗视网膜疾病或损伤的应用中，一种局部应用的眼用制剂包含一种能促进治疗药剂透入或运送到眼睛的媒剂也是很有好处的。这样的媒剂在本领域里已经知道。例如，Ke等在美国专利5,221,696中公开了能促进眼用制品透入角膜的材料的应用。

眼内系统是那些适合在眼睛本身各组织层之内、之间或周围的任何组织间隔中使用的系统。这些部位包括结膜下(在紧邻眼球的眼部粘膜之下)、眼球后(眼球的后面)和房室内(在眼球本身的房室内)。与眼外系统相反，要到达这些区域需要包括注射和植入在内的侵入性操作。

下列专利公开了眼内装置。在美国专利号4,853,224中Wong公开了用以导入眼内房室的微胶囊包裹的药物。在这个系统中使用的聚合物包括多聚酯和多聚醚。在美国专利号4,863,457中Lee公开了一种可生物降解的装置，为了治疗剂的持续性释放，它经外科手术植入眼内。这个装置被设计成用于结膜(眼球的粘膜)下外科手术植入。在美国专利号4,188,373中Krezancaki公开了一种能在人体温下胶化的药用载剂。此载剂是一种药物和树胶或纤维素来源的合成衍生物的水性悬液。在美国专利号4,474,751和4,474,752中Haslam等公开了一种在室温下是液态在体温下是胶体的聚合物-药物系统。适宜用于此系统的聚合物包括聚氧乙烯和聚氧丙烯。在美国专利5,384,333中Davis等公开了一种能提供长期药物释放的可生物降解可注射的药物输送聚合物。药物组合物由可生物降解的聚合物基质中的具药物活性的药剂组成，其中聚合物基质在温度是20°-37℃时是固态，在温度是38°～52℃时就具有流动性。药物输送聚合物并不只限于输送可溶性或液态药物制剂。比如，聚合物可以被用作一种基质以在注射部位固定和保留含有药物的微球、脂质体或其它结合了药物的微粒。

一种特别适于眼内注射的载剂是无菌蒸馏水，GDNF蛋白产物在其内被制成一种无菌等渗的溶液，并适当保存，另一种眼用制品可以包括GDNF蛋白产物与一种媒剂如可注射的微球或脂质体一起制成的制剂，其中媒剂使蛋白缓慢或持续性释放，这样蛋白就可以以储存注射的方式给药。其它合适的眼内导入GDNF蛋白产物的方式包括可植入的药物输送装置，其中含有GDNF蛋白产物。

本发明的眼用制品特别是局部制品可以包括其它的成分，如眼部可用的防腐剂、张力调节剂、共溶剂、致湿剂、复合剂、缓冲剂、抗微生物剂、抗氧化剂和表面活性剂，正如本领域中已众所周知的那样。比如，适宜的张力增强剂包括碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露醇、山梨醇等等。加入足量的张力增强剂是有好处的，这样要滴注入眼内的药品就会是低张或基本等张的。适宜的防腐剂包括氯化苯甲烃铵、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、洗必太、山梨酸等等，但不仅限于此。过氧化氢也可以用作防腐剂。适宜的共溶剂包括甘油、丙二醇和聚乙二醇，但不仅限于此。适宜的复合剂包括咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精。适宜的表面活性剂或致湿剂包括山梨聚糖酯、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80、缓血酸胺、卵磷脂、胆固醇、tyloxapol等等。但不限于此。缓冲液可以是传统的缓冲液如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或Tris-HCl。

制剂成分以眼外或眼内给药部位可以接受的浓度存在。如维持组合物的缓冲液是处于生理性pH值或稍低一点儿的pH值，典型地是处于pH值约5～约8。

其它的制剂成分可以包括能延长眼外给予的治疗剂在眼部的停留时间，以使局部接触最大化并促进吸收的材料。合适的材料包括能增加眼用制品粘滞度的聚合物或凝胶形成材料。在持续性释放液态眼用药物制剂中，作为一种眼部释放率控制剂，脱乙酰壳多糖是一种特别合适的材料(参见美国专利5,422,116，Yen等)。本发明的制剂是否适合眼用治疗剂在眼中有控制地释放(如持续性和长时间的释放)可通过本领域已知的各种操作如在Journal of Controlled Release 6：367-373，1987所描述的以及其变通方式来决定。

另一种眼用制品可包括有效量的GDNF蛋白产物与无毒的眼部可用的适于制成片剂的赋形剂的混合物。把片剂溶解于无菌水或其它合适的载剂中就可以制备单剂形式的眼用溶液。合适的赋形剂包括惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳酸或磷酸钙；或粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉，但不限于此。D.GDNF蛋白产物的给药/输送

GDNF蛋白产物可以通过皮下、肌内、静脉内、经肺、经皮、鞘内或大脑内途径胃肠外给药。对于治疗眼部情况，GDNF蛋白产物也可以经眼外或眼内给药，如上文所述那样，通过局部用药、嵌入、注射、植入、细胞治疗或基因治疗。例如，包含嵌入可生物降解的聚合物基质中的神经营养因子的缓释植入物就可以输送GDNF蛋白产物。GDNF蛋白产物还可以被化学修饰或被包装的形式大脑外给药，这样它就可以通过血脑屏障；或者它可以与一种或多种能促进GDNF蛋白产物穿过屏障的媒剂联合应用。同样地，GDNF蛋白产物可以眼内给药；或者它可以与一种或多种能促进GDNF蛋白产物穿过或运输过眼的各种膜的媒剂联合应用。给药频率取决于GDNF蛋白产物制品的药代动力参数和给药途径。

根据对体重、体表面积或器官大小的考虑，可计算出特殊的给药剂量。决定涉及上述每一种制剂的治疗所用的合适剂量所必需的进一步精确计算是本领域普通技术人员常规进行的，是在常规的任务范围之内，特别是根据此处公开的剂量信息和试验更易进行。通过使用已建立的确定所用剂量的测定方法结合适当的剂量-反应数据就可以确证合适的剂量。本领域的技术人员将会理解眼内给药制剂所用的剂量与系统注射或口内给药所用剂量相比将会是很微小的。

治疗上述情况的方法里所用的最终剂量范围将由主治医生在考虑各种影响药物作用的因素，如病人的年龄、身体条件、体重、性别、饮食、任何感染的严重程度，用药时间和其它临床因素之后再作决定。随着研究的进行，与治疗各种疾病和情况所用的合适的剂量水平相关的更多信息还会出现。

我们设想对于一次给定的治疗，连续给药或持续性输送GDNF是有好处的。尽管连续给药可通过机械方式如通过灌注泵来完成，我们认为其它连续性或接近连续性的给药方式也是行得通的。例如，化学衍化或胶囊包被会产生蛋白质的持续性释放形式，根据已经决定的剂量范围，它们可以以能预测的数量持续存在。因此，GDNF蛋白产物包括为实现像这样的持续给药而被衍化或另行配制的蛋白质。

GDNF蛋白产物细胞治疗，如眼内植入产生GDNF蛋白产物的细胞，也有所考虑。这个实施方案包括给病人植入能够合成和分泌生物活性形式的GDNF蛋白产物的细胞。像这样的产生GDNF蛋白产物的细胞可以是GDNF蛋白产物的自然产生细胞(B49恶性胶质瘤细胞的类似物)，也可以是重组的细胞，其产生GDNF蛋白产物的能力已经通过用位于可促进其表达和分泌的载体中，编码所需GDNF蛋白产物的基因转化细胞而被增强。为了使被给予外来物种的GDNF蛋白产物的病人可能发生的免疫反应最小化，优选GDNF蛋白产物的自然产生细胞是人类起源的，并且产生人GDNF蛋白产物。同样地，优选产生GDNF蛋白产物的重组细胞以包含编码人GDNF蛋白产物的基因的表达载体转化。植入的细胞可以用胶囊包裹起来以避免周围组织的浸润。人或非人动物细胞可以包入生物相容的、半透性的聚合物套或膜内被植入病人体内，这样能允许GDNF蛋白产物释放，但防止细胞被病人免疫系统或被其它来自周围组织的有害因子破坏。这样的一个植入物，举个例子，可以被贴附于巩膜上而直接向玻璃体液中产生和释放GDNF蛋白产物。

我们也认为病人自身的细胞可以离体转化以产生GDNF蛋白产物，并且不用胶囊包被可直接植入。例如，可以获得视网膜神经元，培养细胞并用适当的载体转化，然后回植入病人的视网膜，在那儿它们会产生和释放所需的GDNF蛋白或GDNF蛋白变体。

我们也考虑到通过核酸构建物或其它合适的运送载体的局部注射把编码GDNF蛋白产物的基因导入靶细胞中，就可以进行GDNF蛋白产物的体内基因治疗(Hefti，神经生物学杂志，25：1418-1435，1994)。如编码GDNF蛋白产物的核酸序列可被包含在腺病毒相关病毒载体或腺病毒载体中以运送到视网膜细胞中。其它的病毒载体包括逆转录病毒、单纯疱疹病毒和乳头瘤病毒载体，但不限于此。通过脂质体介导的转送、直接注射(裸露DNA)、受体介导的转送(配体-DNA复合体)、电穿孔、磷酸钙沉淀或微粒轰击(基因枪)(适合体内或离体进行)，也可以进行物理性转送。

用膜包裹活细胞的一套方法对本领域的普通技术人员来说是很熟悉的，并且不需过多的实验，就可完成对被包裹细胞的准备和在病人体内的植入。参见，如美国专利号4,892,538、5,011,472和5,106,627，每一个在此均特别引入以供参考。在Aebischer等的PCT申请WO91/10425中描述了一种包裹活细胞的系统，在此特别引入以供参考。也可参见Aebischer等的PCT申请WO 91/10470；Winn等，实验神经病学，113：322-329，1991；Aebischer等，实验神经病学，111：269-275，1991；Tresco等，ASAIO  38：17-23，1992；每一个均在此特别引入以供参考。许多其它的持续性或可控制性输送工具如脂质体载体、可生物降解的微粒或圆珠和沉积注射液的制作技术对本领域的技术人员来说也是熟知的。

应当指出的是此处所述的GDNF蛋白产物制剂在应用于人的同时也可用于兽医；术语“病人”不应以局限的方式解释。在兽医应用时，剂量范围应与上面所确立的一样。

在考虑了下面的说明性实施例后就会了解本发明其它的方面和优点。实施例1叙述在视网膜神经节细胞组织培养系统中使用GDNF蛋白产物的作用。实施例2叙述使用放射标记的GDNF蛋白产物检查能以受体介导方式结合、内化及逆行运输GDNF蛋白产物的潜在神经元群体。实施例3叙述在视网膜神经节细胞损伤模型中使用GDNF蛋白产物的作用。视网膜神经节细胞损伤研究的结果证明，GDNF蛋白产物对这种以前不知道对GDNF有反应的神经元群体具有神经营养活性。

                   实施例实施例1在体外GDNF蛋白产物促进视网膜神经节细胞的存活和发育

材料

下面的实施例中所用材料的来源如下：

细胞培养基

高葡萄糖Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM；#11965-092)，Ham’s F12培养基(F12；#11765-021)，不含碳酸氢钠的Leibovitz’sL15培养基(#41300-039)，B27培养基添加剂(#17504-010)，青霉素/链霉素(#15070-014)，L-谷氨酰胺(#25030-016)，Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(D-PBS；#14190-052)，钙盐和镁盐的Hank’s平衡盐溶液(HBSS；#24020-026)，H-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES；#15630-015)，小鼠层粘连蛋白(#23017-015)，牛血清白蛋白和第五组分(#110-18-017)均来自GIBCO/BRL，GrandIsland，NY。热灭活的马血清来自Hyclone，Logan，Utah。L-鸟氨酸氢溴化物(P-3655)，牛胰岛素(I-5500)，人转铁蛋白(T-2252)，丁二胺(P-6024)，黄体酮(P-6149)，硒酸钠(S-9133)，来自Sigma化学公司，Saint-Louis，MO。木瓜蛋白酶，脱氧核糖核酸酶I(DNAase)和卵白蛋白(木瓜蛋白酶分解系统)来自Worthington生物化学公司，Freehold，NJ。Falcon无菌96孔板(#3072)、组织培养塑料器皿和聚丙烯离心管来自Beckon-Dickinson，Oxnard，CA。NuncLab-Tek组织培养小室玻璃盖片(#136439)来自Baxter，Irvine，CA。Nitex 20μm尼龙筛(#460)来自Tetko，Elmsford，NY。4″解剖镊和4″解剖剪来自Roboz Surgical，Washington，DC。

抗体和相关试剂

抗小鼠Thy-1，2的小鼠/大鼠单克隆抗体来自Boehringer-Mannheim(Indianapolis，IN)。兔多克隆抗大鼠和抗小鼠IgG抗体、生物素化马抗小鼠IgG和过氧化物酶标记的亲合素/生物素复合体(ABCElite；试剂盒PK-6100)来自Vector实验室，Burlingame，CA。3′，3′-二氨基联苯胺来自Cappel实验室，West Chester，PA。在PBS中的Superblock封闭缓冲液(#37515)来自Pierce，Rockford，IL。TritonX-100(X100)，Nonidet P-40(N6507)和过氧化氢(30％，v/v；H 1009)来自Sigma。除非特别说明，所有其它试剂均来自SigmaChemical Company(Saint-Louis，MO)。

方法

培养基的配制

用DMEM和F12培养基1∶1的混合物配制成基本培养基，并补充B27培养基添加剂50倍浓缩贮存液。B27培养基添加剂包括生物素、L-肉硷、皮质酮、乙醇胺、D(+)-半乳糖、还原型谷胱甘肽、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、丁二胺、乙酸视黄酯、硒、T3(triodo-1-甲腺原氨酸)，DL-α-生育酚(维生素E)、DL-α-生育酚乙酸酯、牛血清白蛋白、过氧化氢酶、胰岛素、超氧化物歧化酶和转铁蛋白。加入终浓度约2mM的谷氨酰胺，约100 IU/l的青霉素和约100mg/l的链霉素。以约2.5％的终浓度加入热灭活的马血清，以约5g/l的终浓度加入D-葡萄糖，以约20mM的浓度加入HEPES缓冲剂，以约2.5mg/ml的终浓度加入牛胰岛素，以约0.1mg/ml的终浓度加入人转铁蛋白。混合后，调pH值至约7.3，培养基4℃保存。培养基要用前新鲜配制以减少实验间的差别。为减少蛋白吸附，自始至终要使用塑料移液管和容器。

GDNF蛋白产物溶液

用含5％牛血清白蛋白的D-PBS(用蒸馏水配制的磷酸盐缓冲液)配制1mg/ml纯化的重组人GDNF蛋白产物的溶液。溶液在-85℃分装保存。在96孔板中配制系列稀释液。在含培养基(90μl)的细胞培养物中加入10μl 10倍浓缩的GDNF蛋白产物。对照培养物中加入含5％白蛋白的D-PBS(10μl)。细胞铺板后一小时开始用GDNF蛋白产物处理，在某些情况下，每隔一天重复一次。

培养基质

为促进视网膜神经节细胞对基质的粘附和轴突的生长，培养板表面(培养基质)要根据下述步骤先后用多聚L-鸟氨酸和层粘连蛋白包被。室温下，用在0.1M硼酸(pH 8.4)中的0.1mg/ml多聚鸟氨酸无菌溶液完全覆盖培养板表面，持续至少一个小时，然后用无菌的Super-Q水冲洗。接下来吸干冲洗的水，加入溶于PBS的小鼠层粘连蛋白的1μg/ml溶液，37℃孵育2个小时。这些步骤要在用板之前进行，以保证结果的重复性。

大鼠视网膜神经节细胞培养物的制备

七日龄Sprague-Dawley幼鼠(获自Jackson Laboratories，BarHarbor，Maine)被断头处死，无菌分离眼睛，放入L15培养基中(不含碳酸氢钠)。每次实验最多取24只眼睛。将眼睛对切开，去掉晶体和玻璃体。小心剥离出视网膜神经层，去掉色素上皮，把它切成小块(约1平方毫米或更小)后放入冰冷的D-PBS中。收集细胞，然后转入10ml分解培养基中(HBSS中含120单位的木瓜蛋白酶和2000单位的DNAase)。细胞在转速约200rpm的旋转平台振荡器上以约37℃孵育45分钟。然后用火琢的Pasteur吸管研磨打散，过20μm Nitex尼龙筛以去掉未解离的组织，用一台IEC临床用离心机以200xg离心5分钟。所得的细胞沉淀用含卵白蛋白和约500单位DNAase的HBSS重悬，铺在4％卵白蛋白(在HBSS中)上面，以500xg离心约10分钟。最终的细胞沉淀用补加20％胎牛血清的DMEM/F12重悬，浓度为10⁷细胞/ml，视网膜神经节细胞根据以前描述的方法免疫淘筛进行纯化(Lehwalder et al.，J.Neuosci.Res.，24：329-337，1989)。

淘筛时，35-mm塑料组织培养皿用抗小鼠IgG抗体(用PBS 1∶100稀释)室温下预包被两小时，用含1％牛血清白蛋白的PBS洗三次，然后与抗Thy-1，2小鼠单克隆抗体(1∶100稀释)温育。用DMEM/F12洗培养皿三次，然后约1毫升视网膜神经节细胞悬液在预处理过的培养皿上于室温下温育1小时。用培养基反复洗涤除去未粘附的细胞而只有牢牢粘附的细胞留下。用乳胶刮刷收获粘附细胞并将其重悬于完全培养基(如上所述)中。细胞浓度调整为约11,000细胞/ml，将90μl细胞悬液以每6-mm孔约1,000细胞的密度接种至预先以多聚鸟苷酸和层粘连蛋白包被的96孔板上。细胞迅速粘附，平板效率约为50％。

视网膜神经节细胞的免疫组织化学

为了鉴定大鼠视网膜神经节细胞，使用了Louis等所述的间接免疫过氧化物酶法(J.Pharmacol.Exp.Therp.，262：1274-1283，1992；科学，252：689-692，1993)，并作了如下细微的改动。视网膜神经节细胞培养物在室温下用溶于D-PBS，pH 7.4的4％多聚甲醛固定约30分钟，然后用D-PBS洗三次(每个6-mm孔200μl)。已固定的培养物然后被孵育于在PBS中的Superblock封闭缓冲液，其中含1％Nondiet P-40以增加抗体的透入。接着在同一缓冲液中使用1∶100-1∶400稀释的抗Thy-1小鼠单克隆抗体(Boehringer-Mannheim)，培养物在旋转振荡器上37℃孵育1小时。在D-PBS洗三次之后，使用马抗小鼠生物素化IgG(Vectastain试剂盒，来自Vector Laboratories，Burlingame，CA)约1∶500稀释后检测与视网膜神经节细胞结合的抗体：这些第二抗体在37℃与细胞共育约1小时，然后用D-PBS洗细胞三次。第二抗体接着用1∶500稀释的亲合素-生物素-过氧化物酶复合物标记，细胞在37℃孵育约45分钟。D-PBS再洗3次之后，被标记的细胞培养物在含0.04％3′，3′-二氨基联苯胺四盐酸、0.06％NiCl₂和0.02％过氧化氢的0.1M Tris-HCl中反应5-20分钟。

检测视网膜神经节细胞存活

培养不同时间后(24小时，3天和6天)，大鼠视网膜神经节细胞如上所述固定、处理和进行针对Thy-1，2的免疫染色，然后用明视场显微镜(bright-light optics)放大200倍进行检测。计数一个6-mm孔中所有的Thy-1，2阳性神经元数目。活的视网膜神经节细胞的特征在于大(直径30-40μm)而形状规则的胞体，有大约三个长的神经突起，其中一个是轴突。表现出变性迹象如有不规则的空泡样核周体或碎片状突起的视网膜神经节细胞被排除在计数之外(不过大多数变性的视网膜神经节细胞会脱离培养基质)。细胞数目要么表示为细胞数/6-mm孔，要么表示为相对于对照细胞密度的倍数变化。

结果

纯化的大鼠视网膜神经节细胞培养物用来确定GDNF蛋白产物对存活和形态成熟的作用。通过在抗Thy 1，2抗体包被的塑料表面上进行免疫淘筛从七日龄大鼠视网膜中纯化视网膜神经节细胞。在大鼠视网膜中，已知Thy-1抗原位于视网膜神经节细胞上(Leifer等，实验神经学，113：386-390，1991)。通过在加入B27培养基添加剂，2.5％热灭活马血清、D-葡萄糖、HEPES、胰岛素和转铁蛋白的DMEM/F12中，按每6mm孔1000个细胞的密度，将所得的视网膜神经节细胞培养物纯化群接种到聚鸟氨酸-层粘连蛋白包被的微量板中，建立了视网膜神经节细胞的纯培养物。通过出现Thy 1，2免疫反应鉴定视网膜神经节细胞。这种方法产生相对低产量的视网膜神经节细胞(每个视网膜大约5000个细胞)，但纯度高(大约90％Thy-1，2-阳性细胞)。

大鼠视网膜神经节细胞培养物用来评价使用GDNF蛋白产物对存活和形态成熟的效果。用人重组GDNF蛋白产物(三倍连续稀释液，从10ng/ml到1pg/ml)处理视网膜神经节细胞培养物。培养细胞在体外24小时、3天和6天后固定，培养物用4％多聚甲醛固定并进行针对Thy 1，2的免疫染色。在未经GDNF蛋白处理的培养细胞中，培养24小时后接种的视网膜神经节细胞仅有32±4％(n＝6)存活。三天后最初接种的视网膜神经节细胞11±3％(n＝6)存活，六天后发现仅有3±2％(n＝3)存活。大肠杆菌表达的重组人GDNF蛋白产物处理培养物使24小时培养后存活的视网膜神经节细胞数目增加大约2.5倍(80±6，n＝6)。存在GDNF蛋白产物三天后，最初的视网膜神经节细胞大约50±5％(n＝5)存活(比对照组增加4.5倍)，六天后大约39±4％(n＝3)仍可以存活(比对照组增加9.6倍)。GDNF蛋白产物对视网膜神经节细胞存活的作用在体外三天后达到最大，浓度为大约300pg/ml，ED₅₀为约30pg/ml。

除了提高视网膜神经节细胞的存活，加入GDNF蛋白产物也可以刺激其形态发育。GDNF蛋白产物处理导致视网膜神经节细胞胞体增大以及神经突起伸长和分支。体外三天后，在GDNF处理的培养物中，许多视网膜神经节细胞产生长为500-1000μm的轴突，而对照培养物中所见的最长轴突长度小于300μm。实施例2视网膜神经节细胞中GDNF蛋白产物的逆行运输

在此实验中，向成年大鼠脑中注射¹²⁵I放射标记的GDNF蛋白产物，以鉴定能以受体介导方式结合、内化和逆行运输GDNF的潜在神经元群体。所测GDNF蛋白产物是重组人[Met^-1]GDNF，并根据WO93/06116实施例6B和6C的一般性描述在大肠杆菌中表达而产生。用乳过氧化物酶技术碘化纯化的[Met^-1]GDNF，并根据Yan等，神经生学杂志，24：1555-77，1993所述用G-25 Sephadex快速旋转柱分离¹²⁵I。成年Sprague-Dawley大鼠按照0.7ml/千克体重的剂量用43mg/ml氯胺酮盐酸化物，8.6mg/ml甲苯噻嗪和1.43mg/ml乙酰丙嗪混合剂麻醉。每组6只大鼠，用5μl Hamilton注射器定向地将PBS/BSA中的5μl ¹²⁵I-[Met^-1]GDNF(含总放射活性4～5×10⁶cpm)或具有111倍过量未标记[Met^-1]GDNF的5μl ¹²⁵I-[Met^-1]GDNF注射到右侧室。第二组6只大鼠中，向右纹状体中间注射具有或不具有111倍过量未标记[Met^-1]GDNF的1μl ¹²⁵I-[Met^-1]GDNF。在第三组6只大鼠中，向上丘注射具有或不具有111倍过量未标记[Met^-1]GDNF的1μl ¹²⁵I-[Met^-1]GDNF。所有注射的注射速率是每15秒0.lμl。

存活20～24小时后，处死动物，用0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.2中的4％多聚甲醛和1％戊二醛浸注，去除脑并冷冻保存。处死上丘注射的大鼠，去除眼并用相同固定剂浸注固定。用闪烁计数器计数眼的放射性。在滑动切片机上切出厚度为25μm的脑冰冷冠状面，用恒冷切片机切出10μm厚的眼切片。切片置于载玻片上并浸入Kodak NTB-3乳液。曝光时间为15～30天。然后显影，甲苯胺蓝复染并在显微镜下检查。

向中枢神经系统(CNS)的纹状体内注射或脑室内(ICV)注射后，在黑质和前盖区域的多巴胺能神经元中观察¹²⁵I-[Met^-1]GDNF的吸收和运输。ICV和纹状体内注射¹²⁵I-[Met^-1]GDNF对神经元的标记可完全被共同注射过量未标记的[Met^-1]GDNF所阻断。预期这些对GDNF有生物学反应的多巴胺能神经元表达能吸收和逆行运输的有功能的GDNF受体。因此用ICV和纹状体内注射¹²⁵I-[Met^-1]GDNF特异标记这些多巴胺能神经元可以作为一个良好的阳性对照。

此外，纹状体内注射和ICV注射后，在缝的中线核和背核中可观察到低水平的神经元标记。可以通过共同注射过量未标记[Met^-1]GDNF阻断标记[Met^-1]GDNF的吸收，表明吸收通过受体介导机制发生。在纹状体内或ICV注射后，在其他邻近缝核中的神经元或完整成年大鼠脑中的其他神经元群中未发现神经元的标记。

为了发现其他无脑系统通道但能吸收和逆行运输GDNF的神经元群，例如在眼中的神经元群，向上丘注射¹²⁵I-[Met^-1]GDNF。根据眼直接记数所观察的放射性选择性地积累在对侧眼而不是同侧眼。这种选择性可能是由于视网膜神经节细胞对对侧的交叉投射优于同侧。放射性累积可通过共同注射过量未标记[Met^-1]GDNF阻断。这些眼横向切片的放射自显影照片显示，放射性特异地与视网膜神经节细胞相关。结果显示¹²⁵I-[Met^-1]GDNF通过受体介导机制选择性地运输到对侧而不是同侧视网膜神经节细胞。实施例3通过施用GDNF蛋白产物提高视网膜神经节细胞存活

在此实验中，通过Mansour-Robaey等，Proc.Natl.Acad.Sci.91：1632-1636，1994描述的方法评估视神经轴突切开术动物模型中施用GDNF蛋白产物或载剂的作用。在此模型中，视神经轴突切开术造成成年大鼠中可重现的视网膜神经节细胞死亡。通过将浸过Gelfoam的Fluorogold用于成年雌性Sprague-Dawley大鼠左右上丘表面，预先标记视网膜神经节细胞。使用Fluorogold一周后(0天)，从眼上横切0.5mm右视神经(每次处理，n＝3～6)，左眼作为内参照，表示视网膜神经节细胞标记。

在0天或7天向右眼眼内注射，动物用1μl [Met^-1]GDNF(1mg/ml，在PBS中)处理或细胞色素C处理作为阴性对照。在视神经横切后7天或14天检查轴突切开术和药物处理的效果，见表2。表  2

     组别                 注射日             检查日

     1                    0                  7

     2                    0                  14

     3                    0，7               14

用4％多聚甲醛浸没固定眼1个小时。标记视网膜的定向。解剖视网膜，整个铺在载玻片上，在荧光显微镜下检查和照相。在图片中计数视网膜神经节细胞数目。可以观察到，有细胞色素C的轴突切开术或无细胞色素C的轴突切开术(阴性对照)使标记的视网膜神经节细胞数目在7天剧减，在14天进一步减少。0天[Met^-1]GDNF处理使在7天和14天的视网膜神经节细胞存留明显增加。在0天和7天的两次1μl[Met^-1]GDNF处理使在14天的视网膜神经节细胞存活进一步提高。这些结果表明视网膜神经节细胞对GDNF有反应并且GDNF蛋白产物处理增加受损视网膜神经节细胞的存活，视网膜神经节细胞为青光眼中主要的受损神经元群体。

可以预期，本领域的技术人员参照前述本发明的优选实施方案，在实践本发明时可进行多种改良和变动。因此，本发明的范围仅由所附权利要求书限定。

               序列表(1)一般信息：

(i)申请人：Yan，Qian

(ii)发明名称：用胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)蛋白

              产物治疗视网膜神经节细胞损伤的方法

(iii)序列数目：1

(iv)通讯地址：

   (A)联系人：AMGEN INC

   (B)街道：1840 DeHavilland Drive

   (C)城市：Thousand Oaks

   (D)州：California

   (E)国家：美国

   (F)邮政编码：91320

(v)计算机可读形式：

   (A)载体类型：软盘

   (B)计算机：IBM PC兼容

   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

   (D)软件：Patent Release#1.0，Version#1.25

(vi)当前申请资料：

   (A)申请号：

   (B)申请日：

   (C)分类：

(viii)律师/代理人信息：

   (A)姓名：Curry，Daniel R.

   (B)登记号：32,727

   (C)参考/摘要号：A-360

(ix)电讯信息：

   (A)电话：805-447-8102

   (B)传真：805-449-8011

   (C)电传：(2)SEQ ID NO：1信息：

(i)序列特征：

   (A)长度：134氨基酸残基

   (B)类型：氨基酸

   (D)拓扑结构：线性

(ix)特点：

   (A)名称/关键词：推断的成熟人GDNF氨基酸序列

(xi)序列表述：SEQ ID NO：1

Ser Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg

 1               5                   10                 155

Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg

            20                  25                  30

Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu10           35                  40                 45

Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile

     50                 55                  6015  Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp

 65                  70                  75                  80

Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys

                 85                  90                  9520

Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser

            100                 105                 110

Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala25          115                 120                 125

Lys Arg Cys Gly Cys Ile

    130

Claims (10)

1.胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)蛋白产物在生产治疗视网膜神经节细胞损伤或变性的药物组合物中的用途。

2.根据权利要求1的用途，其中视网膜神经节细胞损伤或变性与青光眼有关。

3.根据权利要求2的用途，其中药物组合物进一步包括另一种治疗青光眼的治疗剂。

4.胶质细胞系衍生神经营养因子蛋白产物在生产治疗形成视神经的视网膜神经节细胞轴突损伤或变性的药物组合物中的用途。

5.根据权利要求4的用途，其中视神经损伤或变性与影响视神经头的情况相关，所述情况选自青光眼、视神经乳头水肿、乳头炎和局部缺血。

6.根据权利要求1到5任一项的用途，其中药物组合物包括SEQ IDNO：1所示GDNF氨基酸序列或其变体或衍生物。

7.根据权利要求6的用途，其中药物组合物为[Met^-1]GDNF。

8.根据权利要求6的用途，其中衍生物包括水溶性聚合物。

9.根据权利要求1到5任一项的用途，其中药物组合物为持续释放的药物组合物。

10.根据权利要求1到5任一项的用途，其中组合物包括经修饰产生和分泌GDNF蛋白产物的细胞。