CN100396330C - 修复神经损伤及促进神经功能复元之组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于修复神经损伤及/或促进受损神经功能复元之纤维蛋白胶组合物，其包含有效量之神经生长因子及/或神经修复促进剂、纤维蛋白原、抑肽酶(aprotinin)及二价钙离子。本发明还涉及一种修复神经损伤及/或促进受损神经功能复元之方法，其包括将本发明之纤维蛋白胶组合物局部施用于受损之神经。

Description

修复神经损伤及促进神经功能复元之组合物及方法
技术领域
本发明涉及修复神经损伤及促进受损神经功能复元之组合物及方法。
背景技术
神经损伤通常是由外伤或缺血所造成，且十分难以修复。患有神经损伤之脊椎动物可能遭受运动缺陷、瘫痪、甚或死亡。
现已发展出许多修复神经损伤之策略，其中之一是使用神经营养因子。衍生自神经胶细胞株之神经营养因子(GDNF)是转化生长因子-β(TGF-β)超家族之一员，其被认为是最有效的神经营养因子，可促进多巴胺神经元及运动神经元，还有周边感觉及交感神经元之存活及轴突枝生。参见Science，260：1130-1132(1993)；Science，266：1062-1064(1994)；Nature，373：289-290(1995)；Nature，373：335-339(1995)；Nature，373：341-344(1995)；及Nature，373：344-346(1995)。
中脑动脉(MCA)闭塞不仅会造成大范围的梗塞，更会造成运动功能损伤。MCA区域内，如尾状核被壳(caudate putamen)及纹状体(striatum)之神经伤害将造成运动缺陷。参见Stroke，28：2060-2066(1997)。在局灶性脑缺血的早期，显示GDNF基因表现被暂时性诱发于同侧皮层及尾状核。参见Brain Res.，776：230-234。此外，已有调查在永久性MCA闭塞之大鼠中，GDNF对于梗塞大小、脑水肿、DNA片段化及半胱胺酸蛋白酶(caspase)免疫反应的改变之影响。参见Stroke，29：1417-1422(1998)。亦有报告指出在急性FCI伤害后之再灌注大鼠大脑中，将GDNF局部施用于缺血大脑之表面可显著降低梗塞大小及脑水肿。参见Neurosci.Lett.，231：37-40(1997)。
然而，局部施用GDNF对梗塞大小的降低显示为时间-依赖性之模式，且治疗时间窗较其它化学化合物如MK-801(一种N-甲基-D-天门冬胺酸酯(NMDA)受体拮抗剂)及α-苯基-第三丁基硝酮(PBN)(一种自由基清除剂)为短。参见Brain Res.，903：253-256(2001)。
直接施用GDNF对某些神经损伤无效，特别是慢性神经损伤。例如，已知GDNF对慢性FCI伤害无效。参见Hum.Gene Ther.，13：1047-1059(2002)。
据报GDNF可在一段长期作用时期内以生理相关量缓慢释放。参见Exp.Brain Res.，104：199-206(1995)；及Cell Transplant.，7：53-61(1998)。然而，缓慢释放GDNF并无法成功治疗慢性神经损伤或促进神经功能复元。
对于有效修复神经损伤及进一步促进受损神经功能复元之手段仍有所需求。
发明内容
本发明之目的为提供一种有效修复神经损伤及进一步促进受损神经功能复元之方法。
令人惊讶地发现，本发明之目的可通过一种纤维蛋白胶组合物而达到，该组合物包含有效量之神经生长因子及/或神经修复促进剂、纤维蛋白原、抑肽酶(aprotinin)及二价钙离子；其中该神经修复促进剂选自由类固醇、细胞素、化激素、蛋白酶、胞外基质分子、导引分子、抗血管生成因子、神经保护剂、Nogo基因多肽及专一性结合至该多肽之抗体所组成之群。
据此，就第一方面而言，本发明提供一种用于修复神经损伤之纤维蛋白胶组合物，其包含有效量之神经生长因子及/或神经修复促进剂、纤维蛋白原、抑肽酶及二价钙离子；其中该神经修复促进剂选自由类固醇、细胞素、化激素、蛋白酶、胞外基质分子、导引分子、抗血管生成因子、神经保护剂、Nogo基因多肽及专一性结合至该多肽之抗体所组成之群。
就另一方面而言，本发明是提供一种用于促进神经功能复元之纤维蛋白胶组合物，其包含有效量之神经生长因子及/或神经修复促进剂、纤维蛋白原、抑肽酶及二价钙离子；其中该神经修复促进剂选自由类固醇、细胞素、化激素、蛋白酶、胞外基质分子、导引分子、抗血管生成因子、神经保护剂、Nogo基因多肽及专一性结合至该多肽之抗体所组成之群。
就另外一方面而言，本发明提供一种修复神经损伤之方法，其包括将本发明之纤维蛋白胶组合物局部施用于受损之神经。
此外，本发明亦提供一种促进神经功能复元之方法，其包括将本发明之纤维蛋白胶组合物局部施用于受损之神经。
附图说明
图1为通过活性TTC染色评估经一小时MCA闭塞及四星期再灌注后之梗塞体积。GDNF-纤维蛋白胶组之梗塞体积与对照组及仅有GDNF组相比有显著的降低。各实验组由六只大鼠组成。结果以平均值±SEM表示。＊，当与对照组比较时P＜0.05。#，当与仅有GDNF组比较时P＜0.05。
图2为GDNF于转动棒试验之效果。花费于转动棒试验之时间(以秒表示)。经伪装手术而未缺血之动物相对于其它组在转动棒上显著维持较久。在局灶性脑缺血后第一、第二、第三及第四周末，GDNF-纤维蛋白胶组之大鼠维持在转动棒上的时间与对照组及仅有GDNF组相比有显著增加。各实验组由六只大鼠组成。结果以平均值±SEM表示。＊，当与对照组比较时P＜0.05。#，当与仅有GDNF组比较时P＜0.05。
图3为FCI伤害后第一、第二、第三及第四周末GDNF对大鼠(A)右前脚及(B)左前脚抓握力之效果。各实验组由六只大鼠组成。结果以平均值±SEM表示。＊，当与对照组比较时P＜0.05。#，当与仅有GDNF组比较时P＜0.05。
具体实施方式
本发明涉及一种用于修复神经损伤及/或促进受损神经功能复元之纤维蛋白胶组合物，其包含有效量之神经生长因子及/或神经修复促进剂、纤维蛋白原、抑肽酶及二价钙离子；其中该神经修复促进剂是选自由类固醇、细胞素、化激素、蛋白酶、胞外基质分子、导引分子、抗血管生成因子、神经保护剂、Nogo基因多肽及专一性结合至该多肽之抗体所组成之群。本发明还涉及一种修复神经损伤及/或促进受损神经功能复元之方法，其包括将本发明之纤维蛋白胶组合物局部施用于受损之神经。
本发明组合物中使用之神经生长因子选自但不限于衍生自神经胶细胞株之神经营养因子、转化生长因子-β、纤维母细胞生长因子、衍生自血小板之生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)、及神经营养素(neurotrophin)如神经生长因子(NGF)、衍生自大脑之神经营养因子(BDNF)、NT3、NT4及NT5。较佳者，该生长因子为纤维母细胞生长因子，包括酸性纤维母细胞生长因子(aFGF)及碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)。最佳者，该生长因子为衍生自神经胶细胞株之神经营养因子。
本文使用之“纤维蛋白胶”一词是指由纤维蛋白原及其它试剂形成的一种生物兼容性及生物可分解产物。
本文使用之“有效量”一词是指本发明纤维蛋白胶组合物中活性成分之量，当投予罹患神经损伤之对象时可达到所需之效果，亦即修复该对象之神经损伤及/或促进受损神经功能复元。该有效量可由所属技术领域的技术人员容易地决定。
依据本发明，本发明纤维蛋白胶组合物中神经生长因子之浓度较佳为介于该组合物之约1至1000μg/ml范围内，更佳为50μg/ml。
依据本发明，神经修复促进剂选自由下列所组成之群：类固醇，如甲基泼尼松；细胞素；化激素；蛋白酶，如金属蛋白酶；胞外基质分子，如层黏蛋白(laminin)或肌腱蛋白(tenascin)；导引分子，即吸引或排斥细胞迁移之分子，如netrin、semaphorin、神经细胞附着分子、钙黏蛋白(cadherin)、硫氧化还原蛋白(thioredoxin)过氧化酵素或Eph配位体；抗血管生成因子，如血管抑制素(angiostatin)、内皮抑制素(endostatin)、TNP-470或kringle 5；神经保护剂，如NMDA、非NMDA拮抗剂、钙通道阻断剂、一氧化氮合成酵素(NOS)、NOS抑制剂、过氧化亚硝酸盐清除剂或钠通道阻断剂；以及Nogo基因多肽及专一性结合至该多肽之抗体。
依据本发明，本发明纤维蛋白胶组合物中纤维蛋白原之浓度较佳为介于约10至1000mg/ml范围内，更佳为约100mg/ml。
依据本发明，本发明纤维蛋白胶组合物中抑肽酶之浓度较佳为介于该组合物之约10至500KIU/ml范围内，更佳为200KIU/ml。
依据本发明，二价钙离子可衍生自任何钙离子源，例如由氯化钙或碳酸钙提供。本发明纤维蛋白胶组合物中二价钙离子之浓度较佳为介于约1至100mM范围内，更佳为8mM。
本发明之纤维蛋白胶可方便地通过混合各成份而制备。例如，将神经生长因子及/或神经修复促进剂及纤维蛋白原与抑肽酶溶液混合，然后进一步将所得混合物与钙离子源混合。所得组合物在使用前可予以贮存。或者，该组合物亦可在使用前才制备。较佳者，纤维蛋白胶是在施用前才制备。
本发明之纤维蛋白胶组合物适用于修复所有种类的神经损伤及促进所以神经系统中受损神经之功能复元，包括中枢神经系统、周边神经系统、交感神经系统及副交感神经系统。较佳者，该神经为中枢神经系统之神经。在本发明之一实施方式中，该神经损伤是由局灶性脑缺血(FCI)所造成者。在另一实施方式中，该神经损伤是由慢性局灶性脑缺血所造成者。
本文使用之“修复神经损伤”一词是指罹患神经损伤个体之病理学状况方面获得改善，而“神经功能复元”一词是指受损神经之生理功能获得重建。例如，就FCI所造成之神经损伤而言，总梗塞体积及运动缺陷的降低就是受损神经获得修复及其功能获得重建的信号。在本发明之一动物模型中，运动缺陷的降低包括平衡、协调及抓握强度的改善。
本发明之纤维蛋白胶组合物可局部施用于受损之神经。该局部施用可于外科手术中实施。
本发明之方法可发挥修复慢性神经损伤及促进受损神经功能复元所需的长期效果。此外，仅需将本发明组合物局部施用于受损神经一次即可充分达到所需效果。
在不愿受限于理论的前提下，相信本发明纤维蛋白胶在修复神经损伤及/或促进神经功能复元上的效果并非归因于神经生长因子的缓慢释放，而是其它未知机制。
有鉴于其对受损神经的效果，本发明之组合物及/或方法可有效治疗神经损伤相关疾病，包括但不限于缺血性脑疾病。较佳者，该缺血性脑疾病包括中风、血栓及MCA之栓塞。
如以下实例所示，将本发明纤维蛋白胶组合物局部施用至MCA闭塞大鼠之缺血大脑，于慢性FCI伤害后第四周可显著降低梗塞体积，且亦显著改善运动功能，反观对照组，在慢性局灶性脑缺血后并未对大鼠产生神经保护的效果。该数据表示本发明纤维蛋白胶组合物对治疗MCA闭塞之脑缺血及促进运动功能复元十分有效。
给予下列实例之目的仅为举例说明，并无意限制本发明之范畴。
实例1：修复神经损伤及促进功能复元之方法
动物：本实例符合美国国家健康局所公布之“实验动物照顾及使用指南”(NIH出版编号85-23，1996年修订)。本研究使用重300至350克之雄性Long-Evans大鼠(国家实验动物繁殖及研究中心)。这些动物饲养于一间温度(24±1℃)及湿度(55±5％)受到控制的房间内，光暗周期为12∶12小时。它们可自由获取食物及饮水。
外科手术程序：本技术是将黄等人之方法(Huang SS，Tsai SK，Chih CL，Chiang LY，Hsieh HM，Teng CM，Tsai MC；六磺基丁基化C60对罹患局灶性脑缺血之大鼠之神经保护效果。Free Radic.Biol.Med.2001；30：643-649)加以修改而成。简言之，在准备手术时令各雄性Long-Evans大鼠吸入一氧化氮/氧/氟烷(69％∶30％∶1％)混合物而予以麻醉。手术期间体温以加热垫维持在37±0.5℃，该加热垫是以一肛温探测器作伺服控制。于尾部腹面动脉作插管，持续以StathamTM P23XL换能器监控心跳及平均动脉血压(MABP)并显示于Gould RS-3400生理纪录器(Gould
Figure C20051010913000081
Cleveland，OH，USA)上。使用血液气体分析仪(GEM-5300I.L.CO
Figure C20051010913000082
USA)作血液采样以测试血中之pH、PO2及PCO2。于单侧MCA闭塞之前、期间及其后进行测量。
于右脑皮层之MCA区域内制造局灶性缺血梗塞。以中线前颈部切开暴露出两条一般颈动脉。将该动物侧向放置，于右眼角及前耳廓之中间点作皮肤切开。将颞肌肉缩回，并于颧骨及鳞状骨交会点使用经生理盐水溶夜冷却之钻子(DremelTM Multipro+5395，Dremel com
Figure C20051010913000091
USA)作一小的(直径3mm)颅骨切除。使用解剖显微镜(OPMI-1，ZISSGermany)，以尖细镊子打开硬膜，以10-0单丝尼龙结捆绑右MCA。然后以微动脉夹使两条一般颈动脉闭塞一小时。移除夹子后，可目视到动脉中恢复血流。
实验分组：经FCI伤害后，大鼠以随机顺序分配至四个处理组之一(各n＝6)：(a)局部施用GDNF(RBI，Natick
Figure C20051010913000093
MA，USA)-纤维蛋白胶组：将GDNF(1μg)与纤维蛋白原加抑肽酶溶液混合；(b)仅局部施用GDNF组：将GDNF溶解于HBSS溶液；(c)对照组：添加HBSS溶液做成纤维蛋白胶；(d)伪装组：动物经过与前述相同之外科手术程序，但无MCA捆绑。
纤维蛋白胶(Beriplast PTM，Germany)用作CNS组织黏合剂，习惯上在使用前将纤维蛋白原(100mg/ml)与抑肽酶溶液(200KIU/ml)混合而制备。此溶液进一步在手术区域与氯化钙(8mM)混合以形成固定胶。局部施用至梗塞脑组织之最终体积为20μl。
渗透性施用GDNF之组别：将1μg GDNF(RBI，Natick
Figure C20051010913000094
MA，USA)溶解于HBSS溶液。(n＝6)。将大鼠植入导管供灌注药物。将大鼠予以麻醉，于大鼠右脑植入口径21之不锈钢套管。套管以快速定型牙医用压克力(Lang Dental
Figure C20051010913000095
Wheeling，IL，USA)定位，并以一铝质保护盖及钢钉固定于头骨。如所述般(仅稍作修改)将微型泵作s.c.植入。简言之，于大鼠耳后作一小切口，以止血钳将皮下空间扩大。将HBSS溶液或GDNF(1μg于HBSS溶液中)以().2-mm无菌注射过滤器(Sterile Acrodisc)过滤，然后填充于一渗透性微型泵(AlzetTM 2004，Alza
Figure C20051010913000096
Palo Alto，CA，USA)中。将该微型泵植入，并经由6-cm长之PE-60聚乙烯管直接连接至前述套管。灌注速率为每小时0.25μl，持续28天。背部切口以氰基丙烯酸酯胶闭合，并于聚乙烯管上铺以牙医用压克力。
梗塞体积分析：经局灶性脑缺血一小时及再灌注四星期后，将大鼠麻醉并以快速斩首方式杀死。移除大脑，目视检测MCA之解剖结构及出血或感染迹象，将之浸泡于冷生理盐水溶液内十分钟，并使用脑基质切片机(JACOBOWITZTM Systems，Zivic-Miller Laboratories INC
Figure C20051010913000101
Allison Park，USA)切成标准头颅切片(各2mm厚)。将切片置于活体染料2，3，5-三苯基四氮鎓氯化物(TTC，2％；Sigma，USA)中，于37℃下黑暗中经30分钟，接着置于10％福尔马林中，于室温下过夜。经由TTC染色，右脑半球及左脑半球以及梗塞组织的轮廓清晰可见(Chen ST，Hsu CY，HoganEL，Maricq H，Balentine JD；局灶性缺血性中风于大鼠之模型：可复制之广泛性皮层梗塞。Stroke.1986；17：738-743)。使用一图像分析器(彩色图像扫描仪，EPSONTM GT-9000)将该等轮廓描绘于各切片之后表面上，该图像分析器连结至一于个人计算机(AMDTM K6-23D 400)上执行之图像分析系统(AIS软件，Imaging research INC
Figure C20051010913000102
Canada)。梗塞面积的测量是将对侧之面积减去无损害侧脑半球之面积。梗塞体积的计算是将每片切片梗塞面积之总和乘以切片厚度。外科医师及图像分析器操作员均不知道各动物所接受的处理。
于GDNF-纤维蛋白胶组、仅有GDNF组及对照组之右MCA闭塞区域均得到了可复制之脑梗塞。在FCI伤害后第四周末，与对照组(124.0±20.0mm3)相比较，GDNF-纤维蛋白胶组之梗塞体积有显著降低(69.1±12.4mm3，P＜0.05)，但仅有GDNF组则无(108.0±12.1mm3)(图1)。
该结果指出，在FCI伤害后于梗塞之脑组织局部施用混合于纤维蛋白胶中之GDNF可显著降低44.3％及36％之总梗塞体积(分别与对照组及仅有GDNF组之总梗塞体积相比较)。
行为试验：行为测量是于局灶性FCI伤害后第一、第二、第三及第四周末时，进行转动棒试验及抓握力试验。
转动棒试验：
使用加速转动棒评估大鼠经缺血性伤害后之运动缺陷(Hamm RJ，Pike BR，O’Dell DM，Lyeth BG，Jenkins LW；转动棒试验：评估其在评估外伤性脑伤害后之运动缺陷方面的效果。J.Neurotrauma.1994；11：187-196)。将大鼠置于加速中之转动棒之轮辐处，并测量该动物维持于转动棒上的时间。速度是在五分钟时间内由4rev/min缓慢增加至40rev/min。各动物跌下轮辐之时间是以秒为单位纪录。各动物均接受三次连续试验。
各组之转动棒试验结果示于图2。在术前准备前，四组之动物待在转动棒上的时间并无显著差异。FCI伤害后第一周末时，大鼠待在转动棒上的平均期间在对照组、仅有GDNF组及GDNF-纤维蛋白胶组分别为基值的55.0％、50.3％及92.2％(P＜0.05vs.对照组及仅有GDNF组)，但FCI伤害后第四周末时则为基值的75.3％、67.3％及106.6％(P＜0.05vs.对照组及仅有GDNF组)。该结果显示经FCI伤害后，对照组及仅有GDNF组之大鼠待在转动棒上的时间显著短于GDNF-纤维蛋白胶组之动物。此结果指出于大脑受伤区域覆盖含GDNF之纤维蛋白胶可改善FCI伤害后大鼠之平衡感及协调性。
抓握力试验：
本抓握力试验是将Bertelli等人之方法(Bertelli JA，Mira JC；抓握力试验：一种用于客观量化评估大鼠周边神经再生之简易行为方法。J.Neurosci.Methods.1995；59：151-155)修改而成。为评估抓握强度，将一条金属丝棒连接至一个普通电子秤。两只前脚均予测试，暂时用胶带将不测试之前脚捆住，而欲测试之前脚则保持自由。由尾部抓起老鼠，令其以渐增之坚牢度抓握该棒直到松手，评分其抓握力。
四组之抓握力试验效果示于图3。在四组中，大鼠左前脚之平均抓握力在右MCA闭塞前并无显著差异，而大鼠右前脚之平均抓握力在右MCA闭塞前及闭塞后第一、第二、第三及第四周末时均无显著差异。
FCI伤害后第一周末时，抓握力之平均值在对照组、仅有GDNF组及GDNF-纤维蛋白胶组分别为基值的78.7％、71.7％及101.2％(P＜0.05vs.对照组及仅有GDNF组)，但FCI伤害后第四周末时则为基值的89.6％、97.6％及120.7％(P＜0.05vs.对照组)。
此结果显示局部施用GDNF-纤维蛋白胶与大鼠经FCI伤害后抓握强度之改善有关。
统计学：数据以平均值±平均值标准差(S.E.M.)表示。大鼠梗塞体积及行为缺陷分数差异之统计分析是以非配对之双尾t试验，及合并数据之变量双向分析(ANOVA)进行，俾评估对照组及处理组间之差异。P＜0.05之数值可视为在统计学上具有显著性。
虽然本发明之各种实施方式已经例示及说明，所属技术领域的技术人员可进行各种修改及改良。本发明并不限于所例示的特定形式，所有未偏离本发明思想及范围之修改均应包含于权利要求所定义的范围内。

Claims (3)

1.一种用于修复神经损伤及/或促进受损神经功能复元之纤维蛋白胶组合物，其特征是包含衍生自神经胶细胞株之神经营养因子、纤维蛋白原、抑肽酶及二价钙离子。
2.根据权利要求1所述之组合物，其特征是该二价钙离子是衍生自氯化钙或碳酸钙。
3.根据权利要求1所述之组合物，其特征是该神经损伤选自中风、血栓及中脑动脉栓塞。
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