CN116920125A - Cbs基因在制备糖尿病视网膜病变治疗药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了CBS基因在制备糖尿病视网膜病变治疗药物中的应用，本发明通过动物实验验证发现，所述CBS基因的过表达可显著延缓细胞衰老，维持细胞年轻状态，缓解血管糖基化，抑制血管内皮细胞和周细胞的凋亡，对糖尿病视网膜病变具有较好的治疗效果，为本领域关于糖尿病视网膜病变治疗的研究提供了新思路、新手段和技术支持，具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及CBS基因在制备糖尿病视网膜病变治疗药物中的应用。
背景技术
糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy，DR)是糖尿病性微血管病变中最严重的并发症之一，已成为当前全球重要的致盲眼病。DR的发病主要是微血管病变，表现为视网膜微动脉瘤的形成，视网膜出血、渗出、视网膜新生血管形成、玻璃体积血及玻璃体视网膜增殖，最终可导致患者视功能不可逆的丧失。新生血管的产生是增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative Diabetic Retinopathy，PDR)的标志，也是影响视力预后的重要原因。临床上主要通过全视网膜光凝术(panretinal photocoa gulation，PRP)及眼部注射干预血管新生相关分子(靶点)药物达到缓解DR病程的作用，但尚缺乏有效控制DR发生发展的治疗方法。既往的研究表明DR的发生和发展与高糖环境、组织缺氧、氧化应激损伤和慢性炎症过程诱发的相关信号通路、相关基因表达和调控功能异常有关，尽管相关研究学者在该领域进行了广泛的研究，但是关于其发病机制至今仍未完全明了。
胱硫醚-β-合成酶(Cystathionine-β-synthase，CBS)是同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)代谢过程中的关键酶之一，CBS由四个相同的亚基构成同源四聚体，是一种磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate，PLP)依赖性酶。在维生素B6的催化下，CBS能够催化丝氨酸与Hcy反应合成胱硫醚(Cystathionine，D-(P))。作为影响Hcy水平的一种关键酶，CBS在Hcy转变成胱硫醚的转硫酸路径中起着重要的作用，该酶在酶循环方法学中，常用于血液中同型半胱氨酸的检测。CBS的活性降低，会导致胱硫醚-β-合成酶缺乏症(Cystathionine-β-synthase deficiency，CBSD)，从而可引起高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia，HHcy)，进而导致众多器官和组织，包括眼、骨骼、血管、中枢神经系统等的损伤。迄今为止，尚未见CBS基因在制备糖尿病视网膜病变治疗药物中的应用的相关报道。
发明内容
为了弥补本领域存在的技术空白，本发明的目的在于提供CBS基因在制备糖尿病视网膜病变治疗药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一方面提供了CBS基因在制备血管生成性眼病治疗和/或预防药物中的应用。
进一步，所述CBS基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
优选地，所述CBS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
优选地，所述血管生成性眼病包括糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关的黄斑变性、视网膜静脉阻塞后的黄斑水肿、血管性视网膜病变、脉络膜新血管形成、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、角膜新血管形成；
更优选地，所述血管生成性眼病为糖尿病视网膜病变。
本文中所述的“治疗和/或预防”，是指预防、逆转、缓和、抑制该术语所适用的失调或病症或者这种失调或病症的一种或多种症状的进展，治疗疾病或病状包括改善特定疾病或病状的至少一种症状，即便基础病理生理学不受影响，例如，本文中所使用“治疗和/或预防血管生成性眼病”包括以下一种或多种：(1)预防血管生成性眼病的发生；(2)抑制血管生成性眼病的发展；(3)治愈血管生成性眼病；(4)缓解血管生成性眼病患者的相关症状；(5)减轻血管生成性眼病的严重程度；(6)防止血管生成性眼病的复发。
本发明的第二方面提供了一种重组病毒载体。
进一步，所述重组病毒载体包含CBS基因；
优选地，所述CBS基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
优选地，所述CBS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
优选地，所述重组病毒载体包括腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、辅助病毒依赖性腺病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、慢病毒载体、痘病毒载体、日本血凝病毒-脂质体(HVJ)复合物载体、Moloney鼠白血病病毒载体、基于HIV的病毒载体；
更优选地，所述重组病毒载体为腺相关病毒载体；
最优选地，所述腺相关病毒载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和/或其杂合体；
最优选地，所述重组病毒载体为重组AAV1载体；
最优选地，所述重组病毒载体为将表达CBS基因的质粒载体和AAV1共转染到细胞中后收获得到的感染性病毒颗粒AAV1-SFFV-CBS-T2A-mCherry；
最优选地，所述细胞为人胚肾细胞系；
最优选地，所述人胚肾细胞系包括293FT、293、293T、293A；
最优选地，所述人胚肾细胞系为293FT；
最优选地，所述表达CBS基因的质粒载体为pSFFV-CBS-T2A-mCherry质粒载体；
最优选地，所述pSFFV-CBS-T2A-mCherry质粒载体为将CBS基因序列插入pSFFV-T2A-mCherry质粒的pSFFV和T2A之间得到的。
进一步，本发明所述的AAV1是指血清型为1型的腺相关病毒，又称为AAV2/1，“AAV1”和“AAV2/1”两者在本发明中可以互换使用，其中，2为基因型，1为血清型。
本发明的第三方面提供了一种本发明第二方面所述的重组病毒载体的制备方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)pSFFV-CBS-T2A-mCherry质粒载体的构建；
(2)将步骤(1)中构建得到的pSFFV-CBS-T2A-mCherry质粒载体和AAV1共转染到细胞中后培养所述细胞；
(3)收集细胞上清获得感染性病毒颗粒，即为重组病毒载体AAV1-SFFV-CBS-T2A-mCherry；
优选地，步骤(1)中所述的pSFFV-CBS-T2A-mCherry质粒载体为将所述CBS基因序列插入pSFFV-T2A-mCherry质粒的pSFFV和T2A之间构建得到的；
优选地，步骤(2)中所述的细胞为人胚肾细胞系；
更优选地，所述人胚肾细胞系包括293FT、293、293T、293A；
最优选地，所述人胚肾细胞系为293FT；
优选地，步骤(2)中所述培养的条件为5％ CO2、37℃；
优选地，步骤(3)中所述收集细胞上清为从转染48h后开始收集。
本发明的第四方面提供了一种用于治疗和/或预防血管生成性眼病的基因治疗药物。
进一步，所述基因治疗药物包含本发明第二方面所述的重组病毒载体；
优选地，所述基因治疗药物的给药方式包括视网膜下注射重组病毒载体、玻璃体腔注射重组病毒载体；
更优选地，所述基因治疗药物的给药方式为玻璃体腔注射重组病毒载体；
优选地，所述血管生成性眼病包括糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关的黄斑变性、视网膜静脉阻塞后的黄斑水肿、血管性视网膜病变、脉络膜新血管形成、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、角膜新血管形成；
更优选地，所述血管生成性眼病为糖尿病视网膜病变。
本发明的第五方面提供了一种用于治疗和/或预防血管生成性眼病的药物组合物。
进一步，所述药物组合物包含本发明第四方面所述的基因治疗药物；
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料；
优选地，所述药物组合物还包含其他治疗剂；
更优选地，所述其他治疗剂包含降糖药物、抗凝药物、血管保护药物；
最优选地，所述降糖药物包括磺脲类药物、格列奈类药物、DPP-4抑制剂、双胍类药物、噻唑烷二酮类药物、α-糖苷酶抑制剂；
最优选地，所述抗凝药物包括阿司匹林、波立维、肝素类抗凝药物、华法林；
最优选地，所述血管保护药物包括降血脂类药物、抗血小板药物；
优选地，所述血管生成性眼病包括糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关的黄斑变性、视网膜静脉阻塞后的黄斑水肿、血管性视网膜病变、脉络膜新血管形成、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、角膜新血管形成；
更优选地，所述血管生成性眼病为糖尿病视网膜病变；
在本发明的具体实施方案中，所述其他治疗剂包括但不限于：任何目前已经公开的可用于治疗和/或预防血管生成性眼病的试剂、和/或任何目前已经公开的可用于辅助治疗和/或预防血管生成性眼病的试剂，上述试剂和本发明第四方面所述的基因治疗药物联合组成的药物组合物均在本发明的保护范围内，所述试剂和本发明第四方面所述的基因治疗药物联合使用时，可同时使用，也可先后使用(先使用所述试剂再使用本发明第四方面所述的基因治疗药物或先使用本发明第四方面所述的基因治疗药物再使用所述试剂)，此外，所述试剂和本发明第四方面所述的基因治疗药物联合使用时，其给药方式可以相同也可以不同，所述给药方式包括但不限于：玻璃体内、结膜下、视网膜下、眼内、口服、直肠、阴道、肠胃外、肺、鼻内、口腔、栓剂、气溶胶或其中任意几种给药方式结合。
本文中所述的“药学上可接受的载体和/或辅料”在Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物组合物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。优选地，所述药学上可接受的载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。优选地，所述药物组合物为药学上可接受的任意剂型，包括但不限于：片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、混悬剂、溶液剂中的至少一种。优选地，所述药物组合物的适合给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗有效的给药剂量。
本发明的第六方面提供了本发明第四方面所述的基因治疗药物在制备血管生成性眼病治疗和/或预防药物中的应用。
进一步，所述血管生成性眼病包括糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关的黄斑变性、视网膜静脉阻塞后的黄斑水肿、血管性视网膜病变、脉络膜新血管形成、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、角膜新血管形成；在本发明的具体实施方案中，所述血管生成性眼病是指与血管生成相关的眼部疾病，包括但不限于上述血管生成性眼病。
优选地，所述血管生成性眼病为糖尿病视网膜病变。
本发明的第七方面提供了本发明第五方面所述的药物组合物在制备血管生成性眼病治疗和/或预防药物中的应用。
进一步，所述血管生成性眼病包括糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关的黄斑变性、视网膜静脉阻塞后的黄斑水肿、血管性视网膜病变、脉络膜新血管形成、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、角膜新血管形成；
优选地，所述血管生成性眼病为糖尿病视网膜病变。
本发明的第八方面提供了CBS基因在制备细胞衰老抑制剂、血管糖基化抑制剂、血管内皮细胞凋亡抑制剂和/或周细胞凋亡抑制剂中的应用。
进一步，所述CBS基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
优选地，所述CBS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的第九方面提供了本发明第四方面所述的基因治疗药物在制备细胞衰老抑制剂、血管糖基化抑制剂、血管内皮细胞凋亡抑制剂和/或周细胞凋亡抑制剂中的应用。
本发明的第十方面提供了本发明第五方面所述的药物组合物在制备细胞衰老抑制剂、血管糖基化抑制剂、血管内皮细胞凋亡抑制剂和/或周细胞凋亡抑制剂中的应用。
在本发明的具体实施方案中，本发明通过实验验证发现，所述CBS基因的过表达可显著延缓细胞衰老，维持细胞年轻状态；所述CBS基因的过表达可显著缓解血管糖基化；可显著抑制血管内皮细胞和周细胞的凋亡；上述验证结果均表明了过表达CBS基因对糖尿病视网膜病变具有较好的治疗效果。
此外，本发明还提供了一种治疗和/或预防糖尿病视网膜病变的方法。
进一步，所述方法包括给有需要的受试者(例如糖尿病视网膜病变患者)施用有效量的本发明第二方面所述的重组病毒载体、本发明第四方面所述的基因治疗药物和/或本发明第五方面所述的药物组合物。
本文中所述的“有效量”，是指具有治疗效果的量或在治疗对象中产生治疗效果所需要的量。例如，药物治疗上或药学上有效量是指产生需要的治疗效果所需要的药物的量，治疗效果可以通过临床试验结果、模型动物研究和/或体外研究的结果来反映。药学上有效量取决于几个因素，包括但不限于治疗对象的特征因素(如身高、体重、性别、年龄和用药史)、罹患疾病的严重程度。
在本发明的具体实施方案中，本发明第二方面所述的重组病毒载体、本发明第四方面所述的基因治疗药物和/或本发明第五方面所述的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重程度，适当的剂量可由临床试验确定。待施用的有效量的本发明第二方面所述的重组病毒载体、本发明第四方面所述的基因治疗药物和/或本发明第五方面所述的药物组合物的精确量可由临床医师确定，其考虑患者(受试者)的年龄、体重、糖尿病的严重程度、视网膜病变的严重程度和病症的个体差异，可采用本领域技术人员公知的施用方式进行施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
在本发明的具体实施方案中，施用可以以任何方便的方式进行，包括例如通过静脉内、腹膜内、皮下、颅内、鞘内、动脉内(例如经由颈动脉)、肌内、鼻内、眼内、表面或皮内施用或脊髓或脑投递来实现本发明所述重组病毒载体、基因治疗药物或药物组合物的施用。气溶胶制剂如鼻喷雾制剂包含活性剂的纯化的水性或其它溶液及防腐剂和等渗剂。眼内施用时需要将此类制剂调节至与眼结膜相容的pH和等渗状态。其中，用于胃肠外施用的制备物包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯，如油酸乙酯。水性载体包括水、醇性/水性溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、或固定油。静脉内媒介物包含液体和营养补充物、电解质补充物，等等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体，等等。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：
本发明首次提供了CBS基因在制备糖尿病视网膜病变治疗药物中的应用，并提供了用于治疗和/或预防糖尿病视网膜病变的重组病毒载体、基因治疗药物和药物组合物，本发明通过动物实验验证发现，所述CBS基因的过表达可显著延缓细胞衰老，维持细胞年轻状态，缓解血管糖基化，抑制血管内皮细胞和周细胞的凋亡，对糖尿病视网膜病变具有较好的治疗效果，为本领域关于糖尿病视网膜病变治疗的研究提供了新思路、新手段和技术支持，具有良好的临床应用前景。此外，本发明通过对比实验证明了并不是采用任意一种类型的AAV腺相关病毒载体过表达CBS都能发挥较好的治疗效果，本发明所采用的AAV1取得了预料不到的技术效果。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为pSFFV-CBS-T2A-mCherry质粒的结构图。
图2为实验组和对照组的HUVEC细胞衰老细胞流式分析结果图，其中，对照组：未转入CBS基因的HUVEC细胞，CBS组：转入CBS基因的HUVEC细胞；图3为给药前模型组和实验组大鼠眼球荧光素造影结果图，其中，模型对照组：未给药的糖尿病视网膜血管病变大鼠，实验组：玻璃体腔注射AAV1-CBS的糖尿病视网膜血管病变大鼠；
图4为给药后3周时模型对照组和实验组ZDF大鼠眼球PAS染色结果图，其中，模型对照组：未给药的糖尿病视网膜血管病变大鼠，实验组：玻璃体腔注射AAV1-CBS的糖尿病视网膜血管病变大鼠；
图5为过表达CBS基因对高糖诱导的HUVEC细胞衰老情况的影响结果图；
图6为采用不同血清型的AAV腺相关病毒载体过表达CBS基因(AAV1-CBS、AAV-BI30-CBS)对高糖诱导的视网膜周细胞死亡情况的影响结果图；
图7为高糖、缺氧、感染AAV1-CBS的处理对HMC3细胞分泌VEGF-A的影响结果图，其中，所示有氧和缺氧两组中从左到右依次为αMEM、DMEM、DMEM+CBS对应的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1载体构建
1、实验材料及实验方法
(1)以pSFFV-OSK-T2A-mCherry质粒(购自于通用生物)为基因表达的骨架载体；
(2)pSFFV-CBS-T2A-mCherry载体构建：合成CBS编码cDNA序列，通过同源重组将其插入到pAAV-SFFV-OSK-T2A-mCherry载体(即上述pSFFV-OSK-T2A-mCherry质粒)中，替换掉OSK基因，转化进入stbl3感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序保证T2A-mCherry序列在插入后无突变。
(3)CBS的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，CBS的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
CBS的氨基酸序列：MPSETPQAEVGPTGCPHRSGPHSAKGSLEKGSPEDK EAKEPLWIRPDAPSRCTWQLGRPASESPHHHTAPAKSPKILPDILKKIGDTPMVRINKIGKKFGLKCELLAKCEFFNAGGSVKDRISLRMIEDAERDGTLKPGDTIIEPTSGNTGIGLALAAAVRGYRCIIVMPEKMSSEKVDVLRALGAEIVRTPTNARFDSPESHVGVAWRLKNEIPNSHILDQYRNASNPLAHYDTTADEILQQCDGKLDMLVASVGTGGTITGIARKLKEKCPGCRIIGVDPEGSILAEPEELNQTEQTTYEVEGIGYDFIPTVLDRTVVDKWFKSNDEEAFTFARMLIAQEGLLCGGSAGSTVAVAVKAAQELQEGQRCVVILPDSVRNYMTKFLSDRWMLQKGFLKEEDLTEKKPWWWHLRVQELGLSAPLTVLPTITCGHTIEILREKGFDQAPVVDEAGVILGMVTLGNMLSSLLAGKVQPSDQVGKVIYKQFKQIRLTDTLGRLSHILEMDHFALVVHEQIQYHSTGKSSQRQMVFGVVTAIDLLNFVAAQERDQK(SEQ ID NO:1)；
CBS的核苷酸序列：ATGCCTTCTGAGACCCCCCAGGCAGAAGTGGGGC CCACAGGCTGCCCCCACCGCTCAGGGCCACACTCGGCGAAGGGGAGCCTGGAGAAGGGGTCCCCAGAGGATAAGGAAGCCAAGGAGCCCCTGTGGATCCGGCCCGATGCTCCGAGCAGGTGCACCTGGCAGCTGGGCCGGCCTGCCTCCGAGTCCCCACATCACCACACTGCCCCGGCAAAATCTCCAAAAATCTTGCCAGATATTCTGAAGAAAATCGGGGACACCCCTATGGTCAGAATCAACAAGATTGGGAAGAAGTTCGGCCTGAAGTGTGAGCTCTTGGCCAAGTGTGAGTTCTTCAACGCGGGCGGGAGCGTGAAGGACCGCATCAGCCTGCGGATGATTGAGGATGCTGAGCGCGACGGGACGCTGAAGCCCGGGGACACGATTATCGAGCCGACATCCGGGAACACCGGGATCGGGCTGGCCCTGGCTGCGGCAGTGAGGGGCTATCGCTGCATCATCGTGATGCCAGAGAAGATGAGCTCCGAGAAGGTGGACGTGCTGCGGGCACTGGGGGCTGAGATTGTGAGGACGCCCACCAATGCCAGGTTCGACTCCCCGGAGTCACACGTGGGGGTGGCCTGGCGGCTGAAGAACGAAATCCCCAATTCTCACATCCTAGACCAGTACCGCAACGCCAGCAACCCCCTGGCTCACTACGACACCACCGCTGATGAGATCCTGCAGCAGTGTGATGGGAAGCTGGACATGCTGGTGGCTTCAGTGGGCACGGGCGGCACCATCACGGGCATTGCCAGGAAGCTGAAGGAGAAGTGTCCTGGATGCAGGATCATTGGGGTGGATCCCGAAGGGTCCATCCTCGCAGAGCCGGAGGAGCTGAACCAGACGGAGCAGACAACCTACGAGGTGGAAGGGATCGGCTACGACTTCATCCCCACGGTGCTGGACAGGACGGTGGTGGACAAGTGGTTCAAGAGCAACGATGAGGAGGCGTTCACCTTTGCCCGCATGCTGATCGCGCAAGAGGGGCTGCTGTGCGGTGGCAGTGCTGGCAGCACGGTGGCGGTGGCCGTGAAGGCCGCGCAGGAGCTGCAGGAGGGCCAGCGCTGCGTGGTCATTCTGCCCGACTCAGTGCGGAACTACATGACCAAGTTCCTGAGCGACAGGTGGATGCTGCAGAAGGGCTTTCTGAAGGAGGAGGACCTCACGGAGAAGAAGCCCTGGTGGTGGCACCTCCGTGTTCAGGAGCTGGGCCTGTCAGCCCCGCTGACCGTGCTCCCGACCATCACCTGTGGGCACACCATCGAGATCCTCCGGGAGAAGGGCTTCGACCAGGCGCCCGTGGTGGATGAGGCGGGGGTAATCCTGGGAATGGTGACGCTTGGGAACATGCTCTCGTCCCTGCTTGCCGGGAAGGTGCAGCCGTCAGACCAAGTTGGCAAAGTCATCTACAAGCAGTTCAAACAGATCCGCCTCACGGACACGCTGGGCAGGCTCTCGCACATCCTGGAGATGGACCACTTCGCCCTGGTGGTGCACGAGCAGATCCAGTACCACAGCACCGGGAAGTCCAGTCAGCGGCAGATGGTGTTCGGGGTGGTCACCGCCATTGACTTGCTGAACTTCGTGGCCGCCCAGGAGCGGGACCAGAAG(SEQ ID NO:2)。
2、实验结果
本发明采用上述方法成功构建得到pSFFV-CBS-T2A-mCherry载体，所述pSFFV-CBS-T2A-mCherry载体的结构示意图如图1所示。
实施例2腺相关病毒包装
1、腺相关病毒包装过程
(1)细胞接种：T175贴壁细胞培养瓶接种2×107个293FT细胞，加入30mL含10％FBS的DMEM培养基，37℃、5％ CO2培养箱中过夜培养，培养16-24h后进行转染。
(2)细胞转染：细胞生长的汇合度达到80％-90％时，准备转染。转染体系见下表1。A液和B液分别混合后，室温下静置5min。接着将B液逐滴加入A液中，边加边摇匀，室温22-26℃的条件下静置20min。逐滴加到培养皿中，轻轻摇匀，5％ CO2、37℃的培养箱中过夜培养。
表1转染体系
(3)转染换液：16-18h后，去掉含转染试剂的培养基，加入30mL含10％FBS的DMEM培养基，5％ CO2、37℃的条件下继续培养。
(4)病毒第一次收获：从转染开始算48h后，收获细胞上清，转移到50mL离心管中，上清用0.45μm滤膜过滤，4℃保存。细胞加入30mL含10％ FBS的DMEM培养基，5％ CO2、37℃条件下继续培养。
(5)病毒第二次收获：收获细胞上清，转移到50mL离心管中，上清用0.45μm滤膜过滤，4℃保存。细胞用10％消毒液(84消毒液)处理后丢弃。
(6)病毒浓缩：将收集到的腺相关病毒组分用0.45μm滤器过滤去除细菌污染，将过滤后组分与PEG8000按照体积比3:1混合，轻轻颠倒混匀。
(7)4℃孵育30min或过夜。
(8)4℃、1500g离心45min，离心后会在管底看到白色沉淀。
(9)小心吸去上清液，不能破坏白色沉淀。
(10)用适当体积腺相关病毒保存液重悬沉淀，对病毒进行qPCR检测以测定病毒滴度并将所获取的腺相关病毒分别分装、保存于-80℃。
2、病毒滴度测定
腺相关病毒进行qPCR检测以测定病毒滴度，具体测定方法如下：
(1)将待测定病毒的标准质粒10倍梯度稀释，选1011-107copies/μL作为实验标准曲线建立的标准品。
(2)按照Top Green qPCR SuperMix说明书及荧光定量PCR仪反应体系要求配置qPCR反应的试剂，所述反应体系见下表2。
表2反应体系
| 组分 | 体积 |
| Forward Primer(10μM) | 1μL |
| Reverse Primer(10μM) | 1μL |
| 2xTransStar Top/Tip Green qPCR SuperMix | 10μL |
| Nuclease-free Water | 7μL |
| DNA | 1μL |
| Total volume | 20μL |
所述正向引物序列为：5’-GGAGTTGTGGCCCGTTGT-3’(SEQ ID NO:3)；
所述反向引物序列为：5’-GAGCCCCTGTCCAGCAGC-3’(SEQ ID NO:4)。
(3)将反应混合液取19μL/孔(20μL体系)分装至8联管中，依次在孔中加入1μL/孔反应标准品及待检样品。
(4)将加入反应液的8联管瞬离，轻微震荡混匀，瞬离后放入96System仪中，设定反应程序运行，所述反应程序见下表3。
表3反应程序
(5)反应程序结束后，取出检测8联管丢弃，拷出数据进行保存分析。
3、实验结果
结果显示，将CBS转入腺相关病毒后，AAV1-SFFV-CBS-T2A-mCherry病毒滴度为1.195×1012pfu/mL。
实施例3 HUVEC细胞培养、病毒感染、衰老细胞活体标记及流式分析
1、实验材料
本实施例中涉及到的实验材料见下表4。
表4实验材料
| 名称 | 来源公司 | 货号 |
| 内皮细胞培养基 | ScienCell | BNCC342473 |
| 人脐带静脉内皮细胞HUVEC | ScienCell | #8000 |
| NeonTM转染系统起始套装 | Thermo Fisher | MPK5000S |
| DPBS(无钙镁) | Gibco | 2380005 |
| 0.25％胰酶 | Cytiva | J210027 |
| C12FDG活性染料 | Abcam | 138777-25-0 |
| DMSO | Sigma | D2650 |
| Bafilomycin A1 | Abcam | 88899-55-2 |
2、实验方法
(1)HUVEC细胞复苏
①从液氮罐中取出1支冻存管，立即在37℃水中不断摇晃，使冻结的细胞悬液彻底融化。
②冻存管中的细胞一旦彻底融化(液态)，立即将其从热水桶中取出，用75％的酒精彻底消毒冻存管表面，放入超净工作台内。冻存管即将融化时，将含有已预热至37℃内皮培养基的离心管经酒精消毒后，放置于超净工作台内。
③严格无菌操作条件下将冻存管中的细胞悬液取出，加入预热E8培养基15mL离心管内，轻轻吹打2-3次，1300rpm离心5min，离心结束后弃上清。
④加入内皮培养基，轻轻吹打2-3次，将细胞转移至细胞培养瓶中，加入培养液。将培养瓶放置于CO2培养箱中培养。
(2)HUVEC消化传代
①从培养箱取出待传代的孔板/培养瓶，吸弃上清，DPBS洗一次。
②加入胰蛋白酶，铺满瓶底后，吸弃胰蛋白酶，置于培养箱孵育4-5min，期间可镜下观察，细胞收缩变圆且分散开即可。
③轻轻拍打培养瓶/板，使细胞脱壁，然后用枪头轻轻吹打几次，最后加入内皮培养基终止消化，将细胞吹打脱落后转移至新培养瓶，加入内皮培养基，置于37℃、5％ CO2的培养箱培养。
④每三天进行一次换液操作，待细胞汇合度约为70％-80％时，进行传代。
(3)HUVEC细胞电转化
使用第6代HUVEC细胞，20万细胞1μg质粒；
电转条件：电压为1350v，脉冲时间为30ms，脉冲数为1；
电转后3天一换液，9天后进行衰老细胞统计。
(4)衰老细胞的活体标记及流式分析
用100μM Bafilomycin处理细胞1h，抑制溶酶体中β-半乳糖苷酶活性，再加β-半乳糖苷酶的活性荧光底物染料于SH-SY5Y培养基中，37℃培养2h，用DPBS洗两遍，用胰酶消化收集细胞，进行流式细胞分析。从平均荧光强度及染色降低细胞比例比较过表达基因对逆转衰老效果。
3、实验结果
结果显示，将CBS转入HUVEC后，未衰老细胞比例为33.59％(1-66.41％＝33.59％)，明显高于对照组(未转入CBS基因的HUVEC细胞)的5.99％(1-94.01％＝5.99％)(见图2)，这一结果表明了CBS基因的过表达可以延缓HUVEC细胞的衰老，维持细胞年轻状态。
实施例4AAV1-SFFV-CBS治疗糖尿病视网膜血管病变大鼠模型
1、实验材料
本实施例中涉及到的实验材料见下表5。
表5实验材料
2、实验方法
(1)糖尿病视网膜血管病变造模
高脂喂养ZDF大鼠2个月，每月测血糖一次，选两次血糖值均在17mg/L以上的大鼠进行荧光素造影观察，观察血管渗漏是否发生。选择发生渗漏的大鼠进行玻璃体腔注射AAV1-CBS(AAV1-SFFV-CBS-T2A-mCherry病毒)进行治疗。
(2)玻璃体腔注射治疗糖尿病视网膜血管病变
确认造模成功后，继续高脂喂养两周后吸取5μL滴度为109pfu/μL的AAV1-CBS(AAV1-SFFV-CBS-T2A-mCherry病毒)注射进入玻璃体腔，注意操作时不要碰到晶状体。注射后进行高脂维持喂养，3周后取视网膜进行PAS染色。
实验分组：模型对照组(5只)，实验组(5只)，其中，模型对照组是指未给药的糖尿病视网膜血管病变大鼠，实验组是指玻璃体腔注射AAV1-CBS(AAV1-SFFV-CBS-T2A-mCherry病毒)的糖尿病视网膜血管病变大鼠。
3、实验结果
结果显示，2个月造模后给药前视网膜血管的ZDF大鼠模型对照组右眼及实验组左眼经荧光素造影后呈明显渗漏；模型对照组大鼠右眼经PAS染色后发现血管糖基化严重，血管内皮细胞、周细胞核丢失；实验组大鼠左眼经AAV1-CBS(AAV1-SFFV-CBS-T2A-mCherry病毒)处理3周后，血管糖基化明显得到缓解，血管内皮细胞及周细胞核未丢失(见图3和图4)，上述结果表明了过表达CBS基因对糖尿病视网膜病变具有较好的治疗效果。
实施例5AAV1-SFFV-CBS对高糖诱导的血管衰老的影响
1、实验方法
本实施例中所述的高糖诱导的血管增生模型包括：人视网膜微血管内皮细胞hRMEC和人脐静脉内皮细胞HUVEC，检测的表型包括：血管生成实验、细胞增殖和克隆形成实验。
在高糖(ECM培养基，5.5mmol+22mmol葡萄糖)条件下培养第4代HUVEC 3天后，加入本发明实施例2中构建得到的AAV1-SFFV-CBS-T2A-mCherry病毒后培养3天，通过活体β-半乳糖苷酶染色法与流式细胞术分析衰老细胞的比例。详细实验方法如下：
(1)HUVEC细胞复苏
①从液氮罐中取出1支冻存管，立即在37℃水中不断摇晃，使冻结的细胞悬液彻底融化。
②冻存管中的细胞一旦彻底融化(液态)，立即将其从热水桶中取出，75％的酒精彻底消毒冻存管表面，放入超净工作台内。冻存管即将融化时，将含有已预热至37℃的内皮培养基的离心管经酒精消毒后，放置于超净工作台内。
③严格无菌操作条件下将冻存管中的细胞悬液取出，加入含有15mL预热的E8培养基的离心管内，轻轻吹打2-3次，1300rpm、5min离心，离心结束后弃上清。
④加入内皮培养基，轻轻吹打2-3次，将细胞转移至细胞培养瓶中，加入培养液。将培养瓶放置于CO2培养箱中进行培养。
(2)HUVEC消化传代
①从培养箱取出待传代的孔板/培养瓶，吸弃上清，DPBS洗一次。
②加胰蛋白酶，铺满瓶底后，吸弃胰蛋白酶，置于培养箱孵育4-5min，期间可镜下观察，细胞收缩变圆且分散开即可。
③轻轻拍打培养瓶/板，使细胞脱壁，然后用枪头轻轻吹打几次，最后加入内皮培养基以终止消化，将细胞吹打脱落后转移至新的培养瓶中，加入内皮培养基，置于37℃、5％CO2培养箱培养。
④每三天均进行一次换液操作，待细胞汇合度约70％-80％时，进行传代。
(3)高糖诱导内皮细胞衰老
具体实验分组和各组的培养条件见下表6。
表6实验分组及培养条件
其中，对照组、高糖处理组在37℃、5％ CO2培养箱中培养3天后换液继续培养3天，高糖处理+CBS病毒组在37℃、5％ CO2培养箱中培养3天后换液加入CBS病毒(实施例2中构建得到的AAV1-SFFV-CBS-T2A-mCherry病毒)，继续培养3天。
(4)衰老细胞的活体标记及流式分析
用100μM Bafilomycin处理细胞1h，抑制溶酶体中β-半乳糖苷酶活性，再加β-半乳糖苷酶的活性荧光底物染料于SH-SY5Y培养基中，37℃的条件下培养2h，用DPBS洗两遍，用胰酶消化收集细胞，进行流式细胞分析。从平均荧光强度及染色降低细胞比例比较过表达基因对逆转衰老的效果。
2、实验结果
结果显示，高糖处理下，HUVEC细胞显著衰老，但经AAV1-SFFV-CBS-T2A-mCherry病毒感染后(即图中所示AAV2/1-CBS-HG)，HUVEC细胞的衰老程度明显得到改善，以上实验结果进一步表明了过表达CBS基因对糖尿病视网膜病变具有治疗作用。
实施例6AAV1-SFFV-CBS对高糖诱导的周细胞的影响
1、实验方法
本实施例研究了AAV1-SFFV-CBS对高糖诱导的周细胞血管生成素Ang-2/Tie-2系统表达变化、凋亡的影响。
正常培养基、高糖培养(周细胞完全培养基17.5mmol+10mmol葡萄糖)培养小鼠视网膜微血管周细胞3天，高糖培养+AAV1-SFFV-CBS-T2A-mCherry病毒(实施例2中构建得到)感染小鼠视网膜微血管周细胞后培养3天，通过LDH法检测周细胞死亡释放的乳酸脱氢酶占细胞总乳酸脱氢酶的比例。
此外，采用实施例2中所述的构建方法将AAV2/1替换为AAV-BI30构建得到AAV-BI30-SFFV-CBS-T2A-mCherry病毒(AAV-BI30-CBS)，采用本实施例中所述同样的方法进行验证。其中，所述AAV-BI30购自于addgene公司，货号为183749。
(1)周细胞培养
具体实验分组和各组的培养条件见下表7。
表7实验分组及培养条件
所述对照组、高糖处理组、高糖处理+CBS病毒组分别在37℃、5％ CO2培养箱中培养3天。
(2)样品染色
①根据实验要求诱导细胞凋亡。检测样品中应包含未经处理的细胞样品，作为阴性对照。
此外，进行流式检测时需取实验组分别进行Annexin V-FITC和PI单染，用于调节补偿。收集细胞：收集1-5×105个细胞。
②用不含EDTA的胰酶消化细胞，1800rpm(300×g)、4℃离心5min，弃上清。
③洗涤细胞：用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在1800rpm(300×g)、4℃离心5min。
④细胞重悬：加入100μL 1×Binding Buffer，轻轻吹匀至单细胞悬液。
⑤细胞染色：加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI Staining Solution，轻轻吹匀；避光、室温(20-25℃)下孵育10min；加入400μL 1×Binding Buffer，轻轻混匀。染色后样品在1h内用流式细胞仪检测。
(3)LDH法测量细胞死亡
①T175培养的细胞用无钙镁的DPBS洗一遍，0.25％胰酶消化3-5min，加完全培养基终止消化，离心，计数，24孔板接种细胞(10万)，1:10万加入AAV病毒，每组重复3个孔，DMEM完全培养基培养2天。
②每孔取50μL上清后，每孔加入50μL裂解液后45min，取裂解细胞液稀释10倍测LDH结果×10作为LDH最大释放量，每份样品加入50μL CytoTox96试剂，室温下孵育30min。每孔(96孔板)加入50μL终止液，一小时内检测在490nm/492nm下的吸收值。
通过LDH吸收值与最大LDH释放的吸收值之比计算AAV对细胞的杀伤效果。
2、实验结果
结果显示，高糖处理下，视网膜周细胞释放的LDH量较正常培养基显著升高，视网膜周细胞死亡增多，在AAV1-CBS感染预处理后，LDH释放量恢复到正常值，而AAV-BI30-CBS则不能使高糖诱导的LDH恢复到正常，表明AAV1-CBS具有抑制视网膜周细胞凋亡的能力，而AAV-BI30-CBS没有(见图6)，可见并不是所有类型的AAV腺相关病毒载体都能发挥较好的治疗效果，本发明所采用的AAV1取得了预料不到的技术效果，以上实验结果进一步表明了过表达CBS基因对糖尿病视网膜病变具有治疗作用。
实施例7AAV1-SFFV-CBS对缺氧条件下小胶质细胞分泌VEGF-A的影响1、实验方法
用ELISA法测量小胶质细胞(HMC3)在缺氧条件下VEGF的分泌量。
(1)细胞培养
具体细胞培养条件见下表8。
表8细胞培养条件
| 培养基 | 氧气 | HUVEC成管能力衡量 |
| αMEM+10％FBS | 正常 | HUVEC |
| DMEM+10％FBS | 正常 | HUVEC |
| DMEM+10％FBS | 正常 | HUVEC+CBS |
| αMEM+10％FBS | 缺氧 | HUVEC |
| DMEM+10％FBS | 缺氧 | HUVEC |
| DMEM+10％FBS | 缺氧 | HUVEC+CBS |
HUVEC细胞传至第四代后，用DPBS洗一遍接种3-5万细胞到Matrigel包被的24孔板中培养，加入病毒/DPBS处理。
37℃、5％ CO2培养箱中6孔板10％ FBS DMEM培养基培养小胶质细胞2天，第3天更换为更换培养基放入缺氧/正常氧培养箱中培养24h，取培养基，13000rpm离心5min。取上清培养基测定VEGF的含量。
采用ELISA法测定内皮细胞及小胶质细胞分泌VEGF的量。
(2)VEGF测定的准备
①培养液应高速离心(13000rpm，5min)后取上清做检测。
②洗涤液配制：用蒸馏水1:20稀释(例：1mL浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水)。
③标准品配制：取8个1.5mL离心管，分别标注为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、blank，第一管S1中加入标准品/样品稀释液900μL，第二至第八管中分别加入标准品/样品稀释液200μL，在第一管中加入(20ng/mL)标准品溶液100μL置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出200μL，移至第二管，如此反复做对倍稀释，从第七管中吸出200μL弃去，第八管为空白对照。标准曲线浓度为：2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0pg/mL(标准品的用量及标准曲线范围也可根据实际需要进行配置)。
④生物素化抗体工作液配置：使用前20分钟，用生物素化抗体稀释液将100x生物素化抗体稀释成1×工作液，根据所需用量配置，当日使用，剩余弃之。
⑤TMB显色液的配置：使用前10分钟，将TMB显色液A液和B1：1混合，避光放置备用。
⑥如果检测的样本中靶蛋白浓度高于标准品最高值，建议重新检测，根据实际实验情况，进行适当倍数稀释。
(3)VEGF的检测
①加样：空白孔加入50μL标准品/样品稀释液，其余孔各加入标准品或待测样品50μL，将反应板混匀后置于37℃的条件下40min。
②洗板：用1×洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，每孔加入1×洗液350μL，每次震荡/浸泡1-2min，向滤纸上印干。
③空白孔加入100μL生物素化抗体稀释液，其余孔各加入1×的生物素化抗体工作液100μL，混匀后置于37℃的条件下30min。
④洗板：同上。
⑤每孔加入SABC复合物工作液100μL，混匀后置于37℃的条件下20min。
⑥洗板：同上。
⑦每孔加入提前配置好的TMB混合液100μL，混匀后置37℃暗处反应10-20min(具体显色时间根据显色结果而定)。
⑧每孔加入100μL终止液，混匀，30min内用酶标仪在450nm处测吸光度值。
2、实验结果
结果显示，缺氧的处理会使HMC3细胞分泌VEGF-A的表达量增加，与αMEM培养基相比，使用DMEM培养基培养HMC3细胞后VEGF-A表达量会更高，而感染AAV1-CBS后能够使VEGF-A的表达量降低(见图7)。其中，VEGF-A是一种血管内皮生长因子，糖尿病性视网膜病变患者中存在VEGF-A的过度表达，而AAV1-CBS能够降低VEGF-A的表达，因此，以上实验结果进一步表明了过表达CBS基因对糖尿病视网膜病变具有治疗作用。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.CBS基因在制备血管生成性眼病治疗和/或预防药物中的应用，其特征在于，所述CBS基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
优选地，所述CBS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
优选地，所述血管生成性眼病包括糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关的黄斑变性、视网膜静脉阻塞后的黄斑水肿、血管性视网膜病变、脉络膜新血管形成、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、角膜新血管形成；
更优选地，所述血管生成性眼病为糖尿病视网膜病变。
2.一种重组病毒载体，其特征在于，所述重组病毒载体包含CBS基因；
优选地，所述CBS基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
优选地，所述CBS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
优选地，所述重组病毒载体包括腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、辅助病毒依赖性腺病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、慢病毒载体、痘病毒载体、日本血凝病毒-脂质体(HVJ)复合物载体、Moloney鼠白血病病毒载体、基于HIV的病毒载体；
更优选地，所述重组病毒载体为腺相关病毒载体；
最优选地，所述腺相关病毒载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和/或其杂合体；
最优选地，所述重组病毒载体为重组AAV1载体；
最优选地，所述重组病毒载体为将表达CBS基因的质粒载体和AAV1共转染到细胞中后收获得到的感染性病毒颗粒AAV1-SFFV-CBS-T2A-mCherry；
最优选地，所述细胞为人胚肾细胞系；
最优选地，所述人胚肾细胞系包括293FT、293、293T、293A；
最优选地，所述人胚肾细胞系为293FT；
最优选地，所述表达CBS基因的质粒载体为pSFFV-CBS-T2A-mCherry质粒载体；
最优选地，所述pSFFV-CBS-T2A-mCherry质粒载体为将CBS基因序列插入pSFFV-T2A-mCherry质粒的pSFFV和T2A之间得到的。
3.一种权利要求2所述的重组病毒载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)pSFFV-CBS-T2A-mCherry质粒载体的构建；
(2)将步骤(1)中构建得到的pSFFV-CBS-T2A-mCherry质粒载体和AAV1共转染到细胞中后培养所述细胞；
(3)收集细胞上清获得感染性病毒颗粒，即为重组病毒载体AAV1-SFFV-CBS-T2A-mCherry；
优选地，步骤(1)中所述的pSFFV-CBS-T2A-mCherry质粒载体为将所述CBS基因序列插入pSFFV-T2A-mCherry质粒的pSFFV和T2A之间构建得到的；
优选地，步骤(2)中所述的细胞为人胚肾细胞系；
更优选地，所述人胚肾细胞系包括293FT、293、293T、293A；
最优选地，所述人胚肾细胞系为293FT；
优选地，步骤(2)中所述培养的条件为5％CO2、37℃；
优选地，步骤(3)中所述收集细胞上清为从转染48h后开始收集。
4.一种用于治疗和/或预防血管生成性眼病的基因治疗药物，其特征在于，所述基因治疗药物包含权利要求2所述的重组病毒载体；
优选地，所述基因治疗药物的给药方式包括视网膜下注射重组病毒载体、玻璃体腔注射重组病毒载体；
更优选地，所述基因治疗药物的给药方式为玻璃体腔注射重组病毒载体；
优选地，所述血管生成性眼病包括糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关的黄斑变性、视网膜静脉阻塞后的黄斑水肿、血管性视网膜病变、脉络膜新血管形成、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、角膜新血管形成；
更优选地，所述血管生成性眼病为糖尿病视网膜病变。
5.一种用于治疗和/或预防血管生成性眼病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求4所述的基因治疗药物；
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料；
优选地，所述药物组合物还包含其他治疗剂；
更优选地，所述其他治疗剂包含降糖药物、抗凝药物、血管保护药物；
最优选地，所述降糖药物包括磺脲类药物、格列奈类药物、DPP-4抑制剂、双胍类药物、噻唑烷二酮类药物、α-糖苷酶抑制剂；
最优选地，所述抗凝药物包括阿司匹林、波立维、肝素类抗凝药物、华法林；
最优选地，所述血管保护药物包括降血脂类药物、抗血小板药物；
优选地，所述血管生成性眼病包括糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关的黄斑变性、视网膜静脉阻塞后的黄斑水肿、血管性视网膜病变、脉络膜新血管形成、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、角膜新血管形成；
更优选地，所述血管生成性眼病为糖尿病视网膜病变。
6.权利要求4所述的基因治疗药物在制备血管生成性眼病治疗和/或预防药物中的应用，其特征在于，所述血管生成性眼病包括糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关的黄斑变性、视网膜静脉阻塞后的黄斑水肿、血管性视网膜病变、脉络膜新血管形成、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、角膜新血管形成；
优选地，所述血管生成性眼病为糖尿病视网膜病变。
7.权利要求5所述的药物组合物在制备血管生成性眼病治疗和/或预防药物中的应用，其特征在于，所述血管生成性眼病包括糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关的黄斑变性、视网膜静脉阻塞后的黄斑水肿、血管性视网膜病变、脉络膜新血管形成、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、角膜新血管形成；
优选地，所述血管生成性眼病为糖尿病视网膜病变。
8.CBS基因在制备细胞衰老抑制剂、血管糖基化抑制剂、血管内皮细胞凋亡抑制剂和/或周细胞凋亡抑制剂中的应用，其特征在于，所述CBS基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
优选地，所述CBS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
9.权利要求4所述的基因治疗药物在制备细胞衰老抑制剂、血管糖基化抑制剂、血管内皮细胞凋亡抑制剂和/或周细胞凋亡抑制剂中的应用。
10.权利要求5所述的药物组合物在制备细胞衰老抑制剂、血管糖基化抑制剂、血管内皮细胞凋亡抑制剂和/或周细胞凋亡抑制剂中的应用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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