CN114786712A - 用于治疗高胱氨酸尿症的酶疗法的PEG化胱硫醚β合成酶 - Google Patents

用于治疗高胱氨酸尿症的酶疗法的PEG化胱硫醚β合成酶 Download PDF

Info

Publication number
CN114786712A
CN114786712A CN202080060487.6A CN202080060487A CN114786712A CN 114786712 A CN114786712 A CN 114786712A CN 202080060487 A CN202080060487 A CN 202080060487A CN 114786712 A CN114786712 A CN 114786712A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hcy
patients
see
levels
entirety
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080060487.6A
Other languages
English (en)
Inventor
E·布布利尔
F·格拉文
M·塞洛斯-莫拉
T·马伊坦
J·P·克劳斯
R·万纳
O·考斯维克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Travier Therapy Switzerland Ltd
University of Colorado
Original Assignee
Travier Therapy Switzerland Ltd
University of Colorado
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Travier Therapy Switzerland Ltd, University of Colorado filed Critical Travier Therapy Switzerland Ltd
Publication of CN114786712A publication Critical patent/CN114786712A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/51—Lyases (4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/08—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for nausea, cinetosis or vertigo; Antiemetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01022—Cystathionine beta-synthase (4.2.1.22)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本公开提供一种药品的制剂，所述药品包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的PEG化CBS蛋白质。提供用于治疗有需要的受试者的高胱氨酸尿症的剂量和给药方案。另外，还提供用于在有需要的受试者中降低高半胱氨酸(Hcy)水平或增加半胱氨酸(Cys)和/或胱硫醚(Cth)水平的剂量和给药方案。

Description

用于治疗高胱氨酸尿症的酶疗法的PEG化胱硫醚β合成酶
对相关申请的交叉参考
本申请主张2019年6月26日申请的标题为用于治疗高胱氨酸尿症的酶替代疗法的药品(Drug Product For Enzyme Replacement Therapy for Treatment ofHomocystinuria)的62/866,810和2020年3月2日申请的标题为用于治疗高胱氨酸尿症的酶疗法的药品(Drug Product For Enzyme Therapy for Treatment ofHomocystinuria)的62/983,860的优先权，所述申请中的每一者的内容以全文引用的方式并入本文中。
对序列表的参考
本申请与电子格式的序列表一起提交。标题为2089_1005PCT_SL.txt的序列表文件创建于2020年6月26日，且大小为18,401字节。序列表的电子格式中的信息以全文引用的方式并入本文中。
发明领域
本公开涉及用于使用本文中所描述的药品治疗高胱氨酸尿症的酶疗法的组合物和方法。
背景技术
胱硫醚β-合成酶缺陷型高胱氨酸尿症(CBSDH)，也称为经典高胱氨酸尿症(HCU)或HCU 1型，是一种影响儿童和成人的孤儿病。CBSDH是一种罕见的常染色体隐性代谢病状，其特征是由于胱硫醚β-合成酶(CBS)酶的活性降低或缺失，导致尿液、组织和血浆中的化合物高半胱氨酸(Hcy)过量(参见Kraus等人,载于:Carmel R,Jacobsen DW编.《健康与疾病中的高半胱氨酸(Homocysteine in Health and Disease)》.英国剑桥(Cambridge,UnitedKingdom)：剑桥大学出版社(Cambridge University Press)；2001:223-243；Sacharow等人,《胱硫醚β-合成酶缺陷所导致的高胱氨酸尿症(Homocystinuria Caused byCystathionine Beta-Synthase Deficiency)》.载于:Adam MP,Ardinger HH,Pagon RA,Wallace SE,Bean LJH,Mefford HC等人编.基因评述TM[网络](GeneReviewsTM[Internet]).西雅图(华盛顿)(Seattle(WA)):华盛顿大学(University ofWashington),西雅图(Seattle),2017；所述文献中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
CBSDH的诊断可以通过如Sacharow等人所述的CBS基因的分子遗传学测试来确认。CBS是硫氨基酸甲硫氨酸(Met)代谢中的一种酶，甲硫氨酸存在于饮食中的蛋白质中(参见Maclean等人.《生物化学杂志(J Biol Chem)》.2012；287(38):31994-32005，其以全文引用之方式并入本文中)。因此，CBSDH还可以通过测量血浆中总甲硫氨酸浓度的显著增加来诊断。这些升高的氨基酸发现可以通过检测CBS酶活性降低或通过检测编码胱硫醚β-合成酶的基因中的双等位基因致病变异来证实(参见Picker等人,《胱硫醚β-合成酶缺陷所导致的高胱氨酸尿症(Homocystinuria Caused by Cystathionine Beta-SynthaseDeficiency)》.2004年1月15日[2014年11月13日更新].载于:Pagon RA,Adam MP,ArdingerHH等人编.基因评述TM[网络].西雅图(华盛顿):华盛顿大学,西雅图；1993-2016,可获自:ncbi.nlm.nih.gov，其以全文引用的方式并入本文中)。CBS缺陷还引起胱硫醚(Cth)和半胱氨酸(Cys)水平降低(参见Veeranki等人.《国际分子科学杂志(Int J Mol Sci)》.2013年7月18日；14(7):15074-91，其以全文引用的方式并入本文中)。
可基于以下怀疑CBSDH(Picker等人.2014)：1)临床发现，包括晶体异位(晶状体在眼睛中移位)和/或严重近视、无力体型(高且瘦长)、骨骼畸形、早发型骨质疏松症、和/或血栓栓塞事件、不明原因发育迟缓/智力障碍；2)针对高甲硫氨酸血症或具体地对于CBS缺陷症家族史阳性进行新生儿筛查可能导致症状前患者鉴别(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志(J Inherit Metab Dis)》1998；21:738-47，其以全文引用的方式并入本文中)；和3)家族病史。在患者当中所有这些临床病征和症状发作的年龄方面存在相当大的可变性。当前筛查方法通常无法检测具有较不严重的CBS缺陷症的新生儿，并且仅检测具有较严重CBSDH的少数患者(参见Huemer等人.《遗传代谢疾病杂志》2015年11月；38(6):1007-19；Yap,孤儿病百科全书[在线连载](Orphanet Encyclopedia[online serial]).2005,第1-13页；Schiff等人.《小儿神经病学(Neuropediatrics)》.2012年12月；43(6):295-304；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。其为最常见的硫代谢遗传性病症，其中经估计的流行率在世界范围内为1:200,000至1:335,000。在硫代谢途径中，必需氨基酸L-甲硫氨酸经代谢成Hcy，之后进行两步转硫化，首先变为Cth并且最后变为Cys。发现CBS主要在肝脏和肾脏中，其催化Hcy变为Cth。过量Hcy可以通过甜菜碱-Hcy5-甲基转移酶再甲基化为甲硫氨酸，同样升高血浆Met的水平。
尽管一些患者在出生之后不久诊断患有所述疾病，但通常CBSDH的诊断在已出现经典临床症状之后稍后的年岁中发生(参见Huemer等人.《遗传代谢疾病杂志》.2015年11月,38(6):1007-19；Yap,孤儿病百科全书[在线连载].2005,第1-13页；其两者以全文引用的方式并入本文中)。CBSDH的特征在于发育迟缓/智力障碍、晶体异位和/或严重近视、骨骼畸形(肢体过高且过长)和血栓栓塞。在患者当中所有这些临床病征方面存在相当大的可变性。
正常总高半胱氨酸(tHcy)水平随着年龄、性别和营养状态而变化，但通常在4.5与11μmol/L之间的范围(参见奎斯特诊断公司参考范围(Quest Diagnostics ReferenceRange)；questdiagnostics.com，其以全文引用的方式并入本文中)。男性往往会比女性具有稍微更高(高1至2μmol/L)的tHcy水平，并且随着患者年龄从儿童到80岁，观察到平均值的大致加倍(参见Refsum等人.《临床化学(Clin Chem)》2004；50:3-32，其以全文引用的方式并入本文中)。在补充叶酸的人群中，tHcy水平的上限(97.5％)在<65岁的成人中为大致12μmol/L，并且在大于65岁的成人中为16μmol/L。许多CBSDH患者以大于100μmol/L的总tHcy水平呈现有严重高同型半胱氨酸血症，而其它患者展现在轻度到若干倍正常值范围内的升高(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。已观察到tHcy水平与疾病的严重程度高度相关(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-747，其以全文引用的方式并入本文中)。
CBSDH的特征在于眼睛(晶体异位和/或严重近视)、骨胳系统(过高、过长肢体、脊柱侧凸和漏斗胸)、血管系统(血栓栓塞)和中枢神经系统(CNS)(发育迟缓/智力障碍)的病状。在患者中存在这些临床病征的可变表达，其中可能涉及所有系统或少至一个系统。一些患者患有严重的儿童发作多系统疾病，而具有较不严重疾病呈现的患者可能进入成年仍无症状。在没有治疗的情况下，更严重患者的预期寿命显著降低(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。
研究已展示，CBSDH患者中的Hcy水平的降低与临床症状的较不严重表现相关(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-747，其以全文引用的方式并入本文中)。已广泛描述了Hcy水平引起对这些系统的损坏的途径(例如Ajith等人.《临床化学学报(ClinChimActa)》2015；450:316-321；Sato等人.《骨骼(Bone)》2005；36:721-726；Behera等人.《细胞生理学期刊(J Cell Physiol)》2016，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)且已产生研究以还研究一般人群中Hcy的作用。
当前，少数疗法可供用于管理CBSDH。当前疗法通过以下中的一或多者的组合来靶向硫代谢途径：1)改变饮食以减少蛋白质和/或Met摄入；2)补充以下中的一些或全部：叶酸、维生素B12、维生素B6；以及3)补充甲基供体甜菜碱以增强累积Hcy到Met的酶再甲基化。尽管未关于CBSDH患者的生活质量(QoL)公布研究，但已观察到患者和其照护者因遵循且管理高度受限且社交隔离饮食遭受心理社会效应，且对于疾病的长期医疗后果极其焦虑。许多患者报告，渴望能够在不损害其长期前景的情况下放松其饮食。
因此，与当前疗法相比，本领域中长期以来需要一种对患者具有更大功效和更少副作用的治疗CBSDH的方法。
发明内容
本公开的各种实施方式提供一种药物物质，其包含：(a)分离的胱硫醚β-合成酶(CBS)蛋白质，其包含SEQ ID NO:1；和(b)PEG分子，其共价结合于CBS蛋白质。在本文所描述的药物物质的某些实施方式中，PEG分子为ME-200GS。
本公开的各种实施方式提供一种药物组合物，其包含药物物质和药学上可接受的佐剂、稀释剂或载剂。
在某些实施方式中，制剂是冻干的。本公开的各种实施方式提供一种冻干制剂，其在复原后，复原液体制剂包含于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中浓度为约20-30mg/ml或约25mg/ml的即用药品；约11.4mM磷酸氢二钠；约137mM氯化钠；约2.70mM氯化钾；以及约1.98mM二磷酸氢钾。本文中的即用药品为包含治疗有效量的药品(例如一单位剂量的药物组合物)的液体药物制剂，所述药物组合物包括具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的PEG化人类截短CBS蛋白质的药物物质(例如20NHS PEG-CBS)。即用药品可以提供于小瓶或类似容器中以便于向受试者施用。
本公开的各种实施方式提供一种冻干制剂，其在复原后，复原液体制剂包含20-30mg或约25mg的药物物质；1mL水；2mg磷酸氢二钠(二水合物)；8mg氯化钠；0.2mg氯化钾；以及0.3mg二磷酸氢钾。或者，冻干制剂可经复原以包含药物物质、缓冲液和赋形剂。在某些实施方式中，缓冲液为15mM磷酸钾。在某些实施方式中，赋形剂为8％(w/v)海藻糖。
本公开的各种实施方式提供一种治疗受试者的高胱氨酸尿症的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的药物组合物的制剂。
在某些实施方式中，治疗有效量为选自约0.25mg/kg至约10mg/kg范围的剂量。例如，剂量为约0.33mg/kg、约0.66mg/kg、约1.0mg/kg或约1.5mg/kg。或者，剂量为约2mg/kg、约7mg/kg和约10mg/kg。例如，剂量可为约0.5mg/kg。或者，治疗有效量为选自以下范围的剂量：约5.0mg/kg至约50mg/kg和约10.0mg/kg至约25mg/kg。例如，剂量选自下组：约0.25mg/kg、约0.33mg/kg、约0.66mg/kg、约1.00mg/kg、约1.50mg/kg、约2.00mg/kg、约3.00mg/kg、约4.00mg/kg、约5.00mg/kg、约6.00mg/kg、约7.00mg/kg、约8.00mg/kg、约9.00mg/kg、约10.0mg/kg、约11.0mg/kg、约12.0mg/kg、约13.0mg/kg、约14.0mg/kg、约15.0mg/kg、约16.0mg/kg、约17.0mg/kg、约18.0mg/kg、约19.0mg/kg、约20.0mg/kg、约21.0mg/kg、约22.0mg/kg、约23.0mg/kg、约24.0mg/kg、约25.0mg/kg、约26.0mg/kg、约27.0mg/kg、约28.0mg/kg、约29.0mg/kg、约30.0mg/kg、约31.0mg/kg、约32.0mg/kg、约33.0mg/kg、约34.0mg/kg、约35.0mg/kg、约36.0mg/kg、约37.0mg/kg、约38.0mg/kg、约39.0mg/kg、约40.0mg/kg、约41.0mg/kg、约42.0mg/kg、约43.0mg/kg、约44.0mg/kg、约45.0mg/kg、约46.0mg/kg、约47.0mg/kg、约48.0mg/kg、约49.0mg/kg和约50.0mg/kg。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括向所述受试者施用选自下组中的至少一种：吡哆醇、维生素B6和甜菜碱。在某些实施方式中，受试者采用甲硫氨酸(Met)受限饮食。在某些实施方式中，所述方法进一步包括施用抗血小板剂。在某些实施方式中，抗血小板剂是华法林血液稀释剂或抗凝血剂。在某些实施方式中，施用步骤约每3天进行一次。在某些实施方式中，施用步骤约每天进行一次。在某些实施方式中，施用步骤约每周进行一次。在某些实施方式中，施用步骤重复约6周。在某些实施方式中，施用步骤重复约3个月。在某些实施方式中，施用步骤重复约6个月。在某些实施方式中，施用步骤重复超过6个月。在某些实施方式中，施用步骤重复持续所述受试者的剩余寿命。
本公开的各种实施方式提供一种降低受试者的高半胱氨酸(Hcy)水平的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的药物组合物的制剂。
在某些实施方式中，在施用步骤之后的Hcy水平小于约80μM。在某些实施方式中，在施用步骤之后的Hcy水平降低至多10％。在某些实施方式中，在施用步骤之后的Hcy水平降低至多20％。在某些实施方式中，在施用步骤之后的Hcy水平降低至多30％。在某些实施方式中，在施用步骤之后的Hcy水平降低至多40％。在某些实施方式中，在施用步骤之后的Hcy水平降低至多50％。在某些实施方式中，在施用步骤之后的Hcy水平降低至多60％。在某些实施方式中，在施用步骤之后的Hcy水平降低至多70％。在某些实施方式中，在施用步骤之后的Hcy水平降低至多80％。在某些实施方式中，在施用步骤之后的Hcy水平降低至多90％。在某些实施方式中，在施用步骤之后的Hcy水平在约10μM至约20μM的范围内。在某些实施方式中，在施用步骤之后的Hcy水平小于10μM。在某些实施方式中，在施用步骤之后的Hcy水平为约55μM。
在某些实施方式中，治疗有效量为选自约0.25mg/kg至约10mg/kg范围的剂量。例如，剂量可为约0.33mg/kg、约0.66mg/kg、约1.0mg/kg、约1.50mg/kg、约2.0mg/kg、约7.0mg/kg或约10mg/kg。在某些实施方式中，剂量小于10mg/kg。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括向所述受试者施用选自下组中的至少一种：吡哆醇、维生素B6和甜菜碱。在某些实施方式中，受试者采用甲硫氨酸(Met)受限饮食。在某些实施方式中，所述方法进一步包括施用抗血小板剂。在某些实施方式中，抗血小板剂是华法林血液稀释剂或抗凝血剂。在某些实施方式中，施用步骤约每3天进行一次。在某些实施方式中，施用步骤约每天进行一次。在某些实施方式中，施用步骤约每周进行一次。在某些实施方式中，施用步骤重复约6周。在某些实施方式中，施用步骤重复约3个月。在某些实施方式中，施用步骤重复约6个月。在某些实施方式中，施用步骤重复超过6个月。在一些实施方式中，施用步骤重复持续所述受试者的剩余寿命。
本公开的各种实施方式提供一种增加受试者的半胱氨酸(Cys)水平的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的药物组合物的制剂。
本公开的各种实施方式提供一种增加受试者的胱硫醚(Cth)水平的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的药物组合物的制剂。
本公开的各种实施方式提供一种治疗、缓解或预防与受试者的眼系统、骨胳系统、血管系统和/或中枢神经系统相关的负面临床结果的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的药物组合物的制剂。
附图说明
根据以下对如附图中展示的本公开特定实施方式的描述，前述和其它目标、特征和优点将显而易见。图式未必是按比例的；实际上重点在于说明本公开的各种实施方式的原理。
图1提供本文所描述的某些实施方式中利用的PEG化过程的流程图。
图2为在三天测试时段期间针对每一试验的迷箱测试中的进入条件的简图。
图3展示高胱氨酸尿症的小鼠模型中的临床前研究结果，所述小鼠模型在不同饮食(标准甲硫氨酸饮食(“STD”)、高甲硫氨酸饮食(“HMD”)和/或低或受限性甲硫氨酸饮食(“MRD”))的背景上采用利用20NHS PEG-CBS(在图中称为“PEG CBS C15S”)的长期连续治疗。
具体实施方式
I.引言
胱硫醚β合成酶缺陷型高胱氨酸尿症(CBSDH)的特征在于增加水平的血浆高半胱氨酸(Hcy)，以及高水平的Met和降低浓度的半胱氨酸(Cys)(参见Yap S.《由于胱硫醚β-合成酶缺陷症引起的高胱氨酸尿症(Homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency)》.孤儿病百科全书[在线连载]2005；Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74；NORD,Kraus JP.《由于胱硫醚β-合成酶缺陷症引起的高胱氨酸尿症》.NORD[在线连载]2017；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。到目前为止，已经识别与CBSDH相关的CBS基因的超过180种不同突变(参见人类基因组突变数据库(HumanGenome Mutation Database).2017.参考类型：在线来源.可获自hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php，其以全文引用的方式并入本文中)。高半胱氨酸(Hcy)为天然存在的氨基酸，其与丝氨酸一起充当CBS酶的底物。CBS通过在转甲基化、转硫化和再甲基化途径的相交点处操作而控制硫从甲硫氨酸(Met)到半胱氨酸(Cys)的单向流动(参见Maclean等人.《生物化学杂志(J Biol Chem)》.2012；287(38):31994-32005，其以全文引用的方式并入本文中)。天然CBS通过变构活化剂S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的结合被活化并且催化β-置换反应，其中丝氨酸以吡哆醛-5'-磷酸盐(吡哆醇或维生素B6)依赖性方式与Hcy缩合以形成胱硫醚(Cth)。在CBS下游操作的半胱氨酸γ-裂解酶(CGL)使用Cth作为底物产生Cys。因此，CBS的恰当功能对于调节Hcy、Met和Cys代谢至关重要。
CBSDH病征和症状的严重程度和呈现在患者之间大幅变化(参见Karaca等人.《基因(Gene)》2014；534:197-203；Trondle等人.《奥地利医学学报(Acta MedAustriaca)》2001；28:145-151；Kluijtmans等人.《美国人类遗传学杂志(Am J Hum Genet)》1999；65:59-67；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。许多患者以大于100μmol/L的总高半胱氨酸(tHcy)水平呈现有严重高同型半胱氨酸血症，而其它患者展现在轻度到若干倍正常值范围内的tHcy升高(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。显著升高的tHcy水平通常与更严重的呈现相关，而较低水平通常与疾病的更温和形式相关。正常tHcy水平随着年龄和营养状态而变化，但通常在10与15μmol/L之间的范围内变化。
通常根据受感染个体是否对总高半胱氨酸(tHcy)起反应-减少用吡哆醇(维生素B6)(正常CBS功能所需的CBS酶辅因子)的治疗而分类(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Abbott等人.《美国人类遗传学杂志》1987；26:959-969；其以全文引用的方式并入本文中)。一般来说，对吡哆醇起反应的患者具有较低的tHcy水平，引起较温和形式的病症。这些患者可以在稍后的年岁中仅呈现有一种或数种CBSDH症状，并且许多仍然未被诊断。因此，认为对吡哆醇高度反应的患者在大多数研究中代表不足。
回顾性研究展示，具有最高tHcy水平的患者(经治疗或未经治疗)呈现有较严重症状且在较早的年岁中呈现(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-747；Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其两者均以全文引用的方式并入本文中)。具有升高tHcy水平的未经治疗的个体通常呈现有发育迟缓、血栓栓塞、伴随光学晶状体后续错位的严重近视、骨质疏松型骨折、马方样体型(尤其长骨的伸长)和精神异常，包括学习障碍(参见Yap S.《由于胱硫醚β-合成酶缺陷症引起的高胱氨酸尿症》.孤儿病百科全书[在线连载]2005；Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74；NORD,Kraus JP.《由于胱硫醚β-合成酶缺陷症引起的高胱氨酸尿症》.NORD[在线连载]2017，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。一些具有升高tHcy水平的患者患有严重的儿童发作多系统疾病。在没有治疗的情况下，更严重患者的预期寿命显著降低(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。
正常人类血浆含有小于16mM的以tHcy形式测量并且由以下组成的源自Hcy的化合物：游离硫醇高半胱氨酸(Hcy-SH或fHcy)、二硫化物(如高半胱氨酸-半胱氨酸和高半胱氨酸)和结合蛋白质的高半胱氨酸(参见Ueland；《Nord医学(Nord Med)》1989；104:293-298；Mudd等人.《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》1995；333:325；Mudd等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学(Arterioscler Thromb Vasc Biol)》2000；20:1704-1706；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。硫氢基形式(高半胱氨酸；Hcy)与二硫化物形式(高半胱氨酸)之间的区别(参见Yap S.《由于胱硫醚β-合成酶缺陷症引起的高胱氨酸尿症》.孤儿病百科全书[在线连载]，其以全文引用的方式并入本文中)为重要的，因为许多病理生理学效应取决于Hcy中硫氢基的存在(参见Yap S.《由于胱硫醚β-合成酶缺陷症引起的高胱氨酸尿症》.孤儿病百科全书[在线连载]2005；Ueland等人.《Nord医学》1989；104:293-298；Mudd等人.《新英格兰医学杂志》1995；333:325；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
CBS主要在肝脏、胰脏、肾脏和脑部中表达(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。催化结构域结合吡哆醛5′-磷酸盐(辅因子也称为吡哆醇或维生素B6)并且调节结构域结合SAM(变构活化剂)。
不足水平的CBS酶活性阻断第一步骤的转硫化途径，引起Hcy累积、升高的SAH和Met水平以及降低的Cth和Cys水平。由于本文中综述的这些失调Met代谢物的临床证据表明升高的Hcy(最通常临床上测量为血浆tHcy)与CBSDH的病理生理学密切相关。
高于正常Hcy水平修饰蛋白质上的硫氢基，从而阻止正确的蛋白质交联并且导致多个身体系统中的结构异常。升高的Hcy水平还削弱细胞内信号传导，从而引起内皮功能异常，并且最终引起血栓栓塞和血管疾病。在CBSDH中，Hcy的累积导致眼部、骨骼、血管和心理表现。
CBSDH的诊断有时通过CBS基因的分子遗传性测试确认(参见Sacharow等人.《胱硫醚β-合成酶缺陷所导致的高胱氨酸尿症》.载于:Adam MP,Ardinger HH,Pagon RA,WallaceSE,Bean LJH,Mefford HC等人编.基因评述TM[网络].西雅图(华盛顿):华盛顿大学,西雅图；1993-2017，其以全文引用的方式并入本文中)。当前筛查方法通常无法检测具有较不严重的CBS缺陷症的新生儿，并且仅检测到具有较严重CBSDH的少数患者(参见Huemer等人.《遗传代谢疾病杂志》.2015年11月；38(6):1007-19；Yap,孤儿病百科全书[在线连载].2005,第1-13页；Schiff等人.《儿童神经病学》.2012年12月；43(6):295-304)。
测定临床样品中Hcy水平的首选测量为tHcy，其包括游离Hcy以及结合到蛋白质或呈二硫化物形式的Hcy。正常tHcy水平随着年龄、性别和营养状态而变化，但通常在4.5与11μM之间的范围(QUEST DIAGNOSTICSTM参考范围)。许多CBSDH患者以大于100μM的总tHcy水平呈现有严重高同型胱氨酸尿症，而其它患者展现在轻度到若干倍正常值范围内的升高(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》.2017年1月；40(1):49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。tHcy水平与疾病的严重程度高度相关(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-47)。
研究已展示，CBSDH患者中的Hcy水平的降低与临床症状的较不严重表现相关(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-47；Yap等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》.2001Dec；21(12):2080-5；其以引用的方式并入本文中)。已广泛描述高半胱氨酸水平引起对这些系统的损坏的途径(参见Ajith等人.《临床化学学报(Clin Chim Acta)》2015；450:316-321；Behera等人.《细胞生理学杂志(J Cell Physiol)》99999:1-6,2016；Saha等人.FASEB J 2016；30:441-456；其以全文引用的方式并入本文中)且已引起研究从而研究一般人群中Hcy的作用，其已暴露疾病中Hcy的显著病原性作用。
用本文所描述的药品治疗的一个目标是增加循环中的CBS酶活性，从而引起改良的代谢控制，由此改善疾病的临床表现并且减缓或阻止进一步恶化。高分子量化合物(如酶)具有有限的组织穿透能力并且因此主要存在于血浆中。这些蛋白质通常在循环中维持短时间段，因为其通过数种机制从血流中被去除(参见Vugmeyster等人.《世界生物化学杂志(World J Biol Chem)》.2012；3(4):73-92，其以全文引用的方式并入本文中)。理想地，所施用的CBS将维持血浆中的高活性持续足够时间以对硫氨基酸代谢具有稳定作用。这一目标可以通过PEG化、将PEG部分添加到蛋白质表面上来实现。蛋白质的PEG化是已变得广泛接受且已展示使蛋白水解、免疫反应和抗原性最小化，同时增加蛋白质稳定性和大小且减少肾排泄的策略(参见Kang等人.2009；14(2):363-380，其以全文引用的方式并入本文中)。本文所描述的药品为PEG化htCBS C15S酶，其被配制用于向受试者施用并且被设计用于长期全身暴露。
A.高胱氨酸尿症的临床表现
存在显著证据指示，在CBSDH患者中通常受影响的四个系统(眼部、骨骼、心血管和神经)中有升高的tHcy水平和负面临床结果的病因效应。这些数据进一步通过在一般人群中的研究补充，所述研究表明轻度升高水平的tHcy与阴性结果之间的强关系。
1.眼睛
影响眼睛的异常可为CBSDH的早期临床病症。许多个体出现眼睛的晶状体远离眼球中心的位移(晶体异位)。受影响的个体还通常出现严重近视(短视或近视)和虹膜震颤(眼睛有色部分的振颤)。晶体异位和近视通常在第一年之后出现，且在未治疗个体中，在十岁之前出现(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其以全文引用的方式并入本文中)。较不频繁发生的其它眼睛异常包括白内障、视神经退化和青光眼。一些个体可具有视网膜脱离，其可引起视力模糊或视域中的“飞蚊症”的出现(参见Burke等人.Br JOphthalmol,1989；73(6):427-31，其以全文引用的方式并入本文中)。
升高的Hcy水平是在患有CBSDH的患者中和在一般人群中的眼部并发症，尤其晶状体错位的强和独立的风险因素(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Ajith等人.《临床化学学报》2015；450:316-321；Mulvihill等人.JAAPOS 2001；5:311-315；其以全文引用的方式并入本文中)。即使在处方药理学和饮食干预下，大部分CBSDH患者最终呈现有眼部并发症。已观察到较低的Hcy水平延缓且可能防止CBSDH患者中的晶状体错位(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-47，其以全文引用的方式并入本文中)。
2.中枢神经系统
发育迟缓和学习问题(如智力迟钝)还可为在一岁到三岁发生的CBSDH的早期病征(参见遗传学筛选、技术和研究(STAR-G)项目(Screening,Technology and Research inGenetics Project).2016.高胱氨酸尿症.可获自newbornscreening.info；美国国家卫生研究院(NIH),美国国家医学图书馆(US National Library ofMedicine),遗传学家庭参考(Genetics Home Reference).高胱氨酸尿症.2016.ghr.nlm.nih.gov；其以全文引用的方式并入本文中)。已经报告患有CBSDH的个体中的智商(IQ)在10到138范围内。与较不严重受影响的患者(具有79的平均IQ)相比，具有最高tHcy水平的患者更有可能具有较低IQ(若未经治疗则具有57的平均IQ)(参见Sacharow等人,《胱硫醚β-合成酶缺陷症所导致的高胱氨酸尿症》.载于:Adam MP,Ardinger HH,Pagon RA,Wallace SE,Bean LJH,Mefford HC等人编.基因评述TM[网络].西雅图(华盛顿):华盛顿大学,西雅图；1993-2017，其以全文引用的方式并入本文中)。
癫痫发作发生于约20％的具有CBSDH的未经治疗个体中(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其以全文引用的方式并入本文中)。许多个体具有精神问题，包括人格障碍、焦虑症、抑郁症、强迫行为和精神病性发作(参见Sacharow等人.2017)。还可发生如肌张力障碍的锥体束外病征(参见遗传学筛选、技术和研究(STAR-G)项目.2016.高胱氨酸尿症.可获自newbornscreening.info，其以全文引用的方式并入本文中)。
研究已展示由低Met饮食、叶酸/B维生素补充和/或吡哆醇和甜菜碱疗法诱导的Hcy水平的早期降低可延缓且有时阻止或逆转各种神经病症的进展且允许患有CBSDH的患者中的正常IQ发展(参见El Bashir等人.《JIMD报告》2015；21:89-95；Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》2001；24:437-447；其以全文引用的方式并入本文中)。升高水平的Hcy与中枢神经系统(CNS)症状(包括智力迟钝、神经退行性疾病、癫痫发作、肌张力障碍、精神病、认知损害、痴呆和抑郁症)之间的相关性在CBSDH患者和一般人群中充分证实(参见Abbott等人.《美国人类遗传学杂志(Am J Med Genet)》1987；26:959-969；Schimke等人.JAMA 1965；193:711-719；Herrmann等人.《临床化学和检验医学(Clin Chem Lab Med)》2011；49:435-441；其以全文引用的方式并入本文中)。
3.骨骼系统
患有CBSDH的个体经常出现多种骨骼畸形。受影响的个体通常高且细长，具有“马方样”体型，其包括长骨的稀疏和伸长(细长指)、向内弯曲使得其在腿部伸直时接触的膝部(“膝外翻”或膝外翻(genu valgum))、高拱脚(弓形足)、脊柱的异常侧向弯曲(脊柱侧凸)、异常突出的胸部(鸡胸)或异常凹陷的胸部(漏斗胸)。截至青少年时期，50％个体展示骨质疏松症的病征(参见遗传学筛选、技术和研究(STAR-G)项目.2016.高胱氨酸尿症.可获自newbornscreening.info，其以全文引用的方式并入本文中)。CBSDH与骨质疏松性骨折的风险增加相关联，所述骨质疏松性骨折部分可归因于低骨矿物质密度(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Weber等人.《分子遗传学和新陈代谢(Mol Genet Metab)》2016；117:351-354；其以全文引用的方式并入本文中)。
在一项对25名患有CBSDH的爱尔兰患者随访25年的研究中，发现与非顺应性患者相比，骨骼异常的风险在具有良好顺应性的患者中在减少Hcy治疗情况下显著较低(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-47，其以全文引用的方式并入本文中)。
4.心血管系统
在1985年，在一项因纯合CBSDH而导致Hcy水平中度到重度升高的患者中的流行病研究中，首次展现CBSDH与血管疾病之间的关系(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其以全文引用的方式并入本文中)。血栓栓塞为最严重的通常危及生命的CBSDH的并发症，且可能影响任何血管。这在患有CBSDH的患者中为发病和早期死亡的主要原因(参见Yap等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》.2001年12月；21(12):2080-5，其以全文引用的方式并入本文中)。
血栓栓塞事件的风险截至16岁为约25％并且截至29岁为50％。若干报告描述了降低tHcy水平的治疗如何在CBSDH患者中显著地减少血管事件的发病率、主要发病原因(参见Wilcken等人.《遗传代谢疾病杂志》1997；20:295-300；Yap等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》.2001年12月；21(12):2080-5，其以全文引用的方式并入本文中)。此后，许多其它研究证实了在CBSDH患者中血管事件(尤其静脉血栓形成)的增加的风险(参见Kelly等人.《神经病学(Neurology)》2003；60:275-279；Magner等人.《遗传代谢疾病杂志(JInherit Metab Dis)》2011；34:33-37；其以全文引用的方式并入本文中)。
5.其它表现
尽管较不常见，但在患有CBSDH的患者中已经报告若干其它发现，包括极细腻脆弱的皮肤、脆性毛发、皮肤变色(色素沉着不足)和脸颊上的皮疹(颧颊潮红)。一些个体可能会出现肝脏的脂肪变化，部分肠子通过腹壁中的撕裂处突出(腹股沟疝)或胰脏发炎。还已在患有CBSDH的个体中报告脊柱的异常前至后弯曲(脊柱后凸)和肺萎陷(自发性气胸)(参见Yap；孤儿病百科全书[在线连载].2005,第1-13页，其以全文引用的方式并入本文中)。
总而言之，尽管未能将血浆Hcy浓度降低到低于推荐水平且导致增加的焦虑和减少的骨骼矿物化，但单独MRD在校正HCU的多个症状方面有效。另一方面，如本文所描述，用20NHS PEG-CBS进行的酶疗法降低血浆Hcy浓度低于100μM的建议阈值并且校正HCU的所有监测到的症状。此外，20NHS PEG-CBS在Met限制下保留其功效，产生完全归一化的血浆生物化学特征曲线。通过将这些数据外推到人类患者，我们的结果确立20NHS PEG-CBS作为单一终身疗法，可有效地预防和校正HCU的临床症状。此外，用20NHS PEG-CBS的治疗应允许消除Met/饮食限制，并且因此，又基本上改进HCU患者和其家族的生活质量。
II.组合物
A.天然人类CBS酶
CBS完全天然酶为具有四种相同单体的四聚物，其中各单体(63kDa大小)经组织成三个功能结构域。第一为结合血红素的具有约70个氨基酸的N端区，并且被认为在氧化还原感应和/或酶折叠中起作用。第二为含有催化核心且展示II型家族PLP(吡哆醛-5'-磷酸盐)依赖性酶的折叠的中心结构域。辅酶PLP深埋在N端结构域与C端结构域之间的间隙中。第三区为C端调节结构域，其由串联CBS基元对组成，所述结构域在结合至S-腺苷甲硫氨酸(SAM)时活化酶。调节区的去除产生具有组成性活性的酶(参见Miles等人.《生物化学杂志》.2004年7月16日；279(29):29871-4，其以全文引用的方式并入本文中)。
吡哆醛-5'-磷酸盐(PLP)依赖性酶折叠含有血红素基团。其催化PLP依赖性β-置换反应，其中其使L-高半胱氨酸与L-丝氨酸缩合以形成L-胱硫醚。其通过将S-腺苷-L-甲硫氨酸(Ado-Met)结合到C端调节结构域来别构调节，引起这些结构域的构象重排和自抑制阻断的释放。CBS活化还可以通过完全去除C端调节结构域，从而产生具有组成性活性的二聚形式的酶来实现(参见Miles等人.《生物化学杂志》.2004年7月16日；279(29):29871-4；Ereno-Orbea等人.《美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad Sci USA)》111(37),E3845-3852(2014)；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
与本序列表中SEQ ID NO:2的氨基酸序列和WO 2017/083327(其以全文引用的方式并入本文中)的SEQ ID NO:2相比，本文所描述的药品中的活性物质为在蛋白质的氨基酸位置15处具有半胱氨酸到丝氨酸取代的重组人类截短CBS蛋白质(htCBS C15S)，其表示已经通过添加聚乙二醇(PEG)改性的天然CBS蛋白质。酶也称为htCBS C15S。在某些实施方式中，药物物质htCBS C15S具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
这种形式的酶具有较高的凝聚倾向，这对人类CBS(hCBS)的制造和生产造成主要的约束。PEG化htCBS C15S(包括如本文所定义的“20NHS PEG-CBS”)已经工程改造以形成较不容易发生凝聚的二聚物而非四聚物。通过降解、通过蛋白水解和各种清除机制从循环去除高分子量化合物(如酶)(参见Vugmeyster等人.《世界生物化学杂志》.2012；3(4):73-92，其以全文引用的方式并入本文中)。已知PEG化将蛋白水解和免疫原性降到最低，同时增加蛋白质稳定性并且减少肾排泄(参见Kang等人.2009；14(2):363-380，其以全文引用的方式并入本文中)。这些结构修饰使得本文所描述的包含PEG化htCBS C15S的药品成为比天然hCBS作为CBSDH的酶疗法(ET)更适合的候选物。
天然CBS为细胞内酶，并且已知没有将酶从细胞外环境吸收到其主要细胞内作用部位的机制存在，而PEG化htCBS C15S在细胞外作用。不同于天然内源性CBS，PEG化htCBSC15S通过直接在循环中并且间接在组织中操作来校正代谢异常，并且在不需要SAM用于活化的情况下也如此。天然hCBS酶在S-腺苷甲硫氨酸(SAM)与其C端调节结构域结合后在细胞中活化。然而，患者和健康个体中的循环中的SAM水平远低于CBS活化所需的水平(参见Stabler等人.《代谢(Metabolism)》,2002.51(8):第981-8页，其以全文引用的方式并入本文中)。因此，将天然CBS施用到循环中将无效，因为CBS将不会变得活化。尽管PEG化htCBSC15S保持在循环中且不进入细胞，但PEG化htCBS C15S已经工程改造以通过去除CBS C端调节结构域而绕过对SAM活化的需求，使得所述酶具有组成性活性。
B.酶疗法(ET)
PEG化htCBS C15S为在位置15处具有半胱氨酸到丝氨酸取代的PEG化截短hCBS，用于治疗CBSDH的ET。这一修饰优化酶以形成二聚物而非四聚物并且具有组成性活性。
PEG化htCBS C15S补充CBS活性缺乏，从而在患有CBSDH的患者中降低高半胱氨酸(Hcy)和甲硫氨酸(Met)的血浆、尿液和组织水平，增加胱硫醚(Cth)水平和使半胱氨酸(Cys)水平正常化。总Hcy(tHcy)水平的降低为当前治疗目标(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志(J Inherit Metab Dis)》.2017年1月；40(1):49-74，其以全文引用的方式并入本文中)并且与临床(眼部、骨骼、血管和神经)结果的改善强烈相关(Yap；孤儿病百科全书[在线连载].2005,第1-13页，其以全文引用的方式并入本文中)。
PEG化htCBS C15S为原生人类CBS酶的重组形式，其在大肠杆菌细菌中产生。对原生人类CBS的DNA序列(本发明序列表中的SEQ ID NO:3和WO 2017/083327的SEQ ID NO:1，其以全文引用的方式并入本文中)进行遗传修饰以去除C端调节区(氨基酸414-551)(本发明序列表中的SEQ ID NO:4和WO 2017/083327的SEQ ID NO:3)，从而形成人类截短的CBS。进一步对人类截短CBS的DNA序列进行修饰以在DNA编码区的位置43处引入T→A的点突变，从而在经翻译蛋白质的位置15处产生半胱氨酸到丝氨酸取代，产生人类截短CBS C15S(htCBS C15S)(本发明序列表中的SEQ ID NO:5和WO 2017/083327的SEQ ID NO:13)。与天然hCBS相比，此变化减少凝聚并且允许批次与批次之间的一致性。
在表达期间在大肠杆菌细菌中进一步修饰酶，引起第一Met从如SEQ ID NO:1中所示的蛋白质中去除。在其纯化之后，htCBS C15S酶通过用N-羟基丁二酰亚胺酯官能化的20kDa PEG部分进行PEG化进一步修饰，所述PEG部分与蛋白质表面上的伯胺反应。将大致平均的5.1个PEG分子连接到酶的每个单体单元，产生平均分子量为290kDa的非均质二聚产物。
C.htCBS C15S的PEG化以产生20NHS PEG-CBS
本文中使用ME-200GS(也称为甲氧基-PEG-CO(CH2)3COO-NHS)以使htCBS C15SPEG化：
Figure BDA0003521194860000161
ME-200GS具有20kDa的分子量并且化学名称为α-丁二酰亚胺基氧基戊二酰基-ω-甲氧基，聚氧乙烯。ME-200GS在htCBS C15S的表面上靶向游离胺。酰胺键在htCBS C15S上形成于PEG与赖氨酸残基之间。所产生的分子在整个公开中被称作“20NHS PEG-CBS”，并且是经PEG化的人类胱硫醚β-合成酶分子，所述分子被截短并且具有C15S突变，如SEQ ID NO:1中所提供。
具有100kDa的分子量截止值和15次体积交换的切向流过滤(TFF)用于耗尽游离PEG和其它PEG化杂质并且随后用于针对PBS缓冲液的制剂。预期PEG化期间从PEG释放的包括铵离子等、咪唑、Triton X-100和NHS基团的所有过程相关物质在2次循环的大截止TFF透滤步骤之后处于痕量水平。
根据图1中所提供的工艺流程图，由NOF公司在cGMP条件下制造PEG ME-200GS。用于制造ME-200GS产品的所有原料具有合成或无机性质。可潜在地存在于PEG ME-200GS原料中的杂质为小分子。
D.翻译后修饰
翻译后修饰可需要额外生物工艺步骤来分离经修饰和未经修饰的多肽，从而增加成本且降低生物制剂产生的效率。因此，在一些实施方式中，通过调节编码影响翻译后修饰的蛋白质的目标基因的表达，来增强细胞中的多肽药剂的产生。在其它实施方式中，通过调节编码影响第一翻译后修饰的蛋白质的第一目标基因的表达并且调节编码影响第二翻译后修饰的蛋白质的第二目标基因的表达，来增强生物制剂产生。
另外，在原核或真核细胞中表达的蛋白质可经历若干翻译后修饰，其可削弱生物产品的产生和/或结构、生物活性、稳定性、均质性和/或其它特性。这些修饰中的许多在细胞生长和多肽表达期间自发地发生，且可在给定多肽的若干位点(包括肽主链、氨基酸侧链和氨基和/或羧基末端)处发生。另外，给定多肽可包含若干不同类型的修饰。举例来说，细菌细胞(如大肠杆菌)中表达的蛋白质可以经受乙酰化、组蛋白剪切、羧基化和/或脱酰胺化(参见Yang等人,PNAS 111(52)E5633-E5642(2014)，其以全文引用的方式并入本文中)。举例来说，在禽类和哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中表达的蛋白质可以经受乙酰化、羧基化、γ-羧基化、组蛋白剪切、脱酰胺化、N端谷氨酰胺环化和脱酰胺化以及天冬酰胺脱酰胺化。
在一些实施方式中，通过调节编码参与蛋白质脱酰胺化的蛋白质的目标基因的表达来增强蛋白质产生。蛋白质可以经由若干途径脱去酰氨基，所述途径包括N端谷氨酰胺的环化和脱酰胺化和天冬酰胺的脱酰胺化。因此，在一个实施方式中，参与蛋白质脱酰胺化的蛋白质为N端天冬酰胺酰胺水解酶。蛋白质脱酰胺化可导致更改的结构特性、降低的效力、降低的生物活性、降低的功效、增加的免疫原性和/或其它非所要特性，且可通过若干方法测量，所述方法包括但不限于基于电荷，通过例如离子交换色谱、HPLC、等电聚焦、毛细管电泳、非变性凝胶电泳、反相色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、质谱或使用L-异天门冬氨酰基甲基转移酶进行蛋白质分离。
在一些实施方式中，影响蛋白质分泌的蛋白质为选自下组的分子伴随蛋白：Hsp40、HSP47(也称为丝氨酸蛋白肽酶抑制剂，进化枝H；热休克蛋白47)、HSP60、Hsp70、HSP90、HSP100、蛋白质二硫化物异构酶、肽基脯氨酰基异构酶、钙连蛋白、Erp57(蛋白质二硫化物异构酶家族A，成员3)和BAG 1。在一些实施方式中，影响蛋白质分泌的蛋白质选自下组：γ-分泌酶、p115、信号识别粒子(SRP)蛋白质、分泌素和激酶(例如，MEK)。
经考虑可以通过系统地添加或去除核苷酸来产生更长或更短的序列并且测试那些通过从所述点向上或向下移动目标RNA的更长或更短大小的窗口而生成的序列，来实现进一步优化。将此产生新候选目标的方法与测试基于这些目标序列的RNA效应分子在如本领域中已知的或如本文所描述的抑制分析中的有效性结合起来，可导致抑制效率的进一步提高。另外，此类优化序列可通过例如引入如本文中所描述或如本领域中已知的经修饰核苷酸、悬垂物的添加或变化或如本领域中已知和/或本文中所论述的其它修饰来调节，以进一步优化分子(例如增加血清稳定性或循环半衰期、增加热稳定性、增强跨膜传递、靶向特定位置或细胞类型、增加与沉默途径酶的相互作用、增加从内体的释放等)作为表达抑制剂。
E.稳定性
药物物质或药品在多种温度和存储条件下稳定。在一些实施方式中，药物物质或药品在-65℃和-20℃下存储时为稳定的。或者，药物物质或药品在约2℃到约8℃范围内的温度下存储时可为稳定的。或者，药物物质或药品在25℃±2℃范围内的温度下存储时可为稳定的。举例来说，药物物质或药品在20℃与25℃之间保持稳定。在某些实施方式中，药物物质或药品在还原条件下稳定。在某些实施方式中，药物物质或药品在非还原性条件下为稳定的。在一些实施方式中，药物物质或药品保持稳定至少2天、至少7天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月或至少12个月。举例来说，药物物质或药品在存储期间保持稳定约2天。举例来说，药物物质或药品在存储期间保持稳定约7天。举例来说，药物物质或药品在存储期间保持稳定约1个月。举例来说，药物物质或药品在存储期间保持稳定约2个月。举例来说，药物物质或药品在存储期间保持稳定约3个月。举例来说，药物物质或药品在存储期间保持稳定约6个月。举例来说，药物物质或药品在存储期间保持稳定约12个月。举例来说，药物物质或药品在存储期间保持稳定约18个月。
在一些实施方式中，药物物质或药品保持稳定以在-65℃下存储至多18个月。在一些实施方式中，药物物质或药品保持稳定以在约2℃与约8℃之间存储至多3个月。在一些实施方式中，药物物质或药品保持稳定以在25℃±2℃下存储至多1个月。
在一些实施方式中，药物物质或药品保持稳定持续至少3个冻融循环。在一些实施方式中，药物物质或药品保持稳定持续至多6个冻融循环。举例来说，药物物质或药品保持稳定持续5个冻融循环。在某些实施方式中，药品在从注射器喷出之后为稳定的。
III.药物组合物
本文所描述的包含PEG化htCBS C15S的药品旨在恢复代谢控制并且通过降低高半胱氨酸水平并且使患有CBSDH的患者中的半胱氨酸水平正常化来改善疾病的临床表现。htCBS C15S通过使用大肠杆菌BL21(DE3)的重组技术制造，并且被配制为磷酸盐缓冲盐水中的无菌药品。药品旨在通过皮下(SC)注射施用。
循环中PEG化htCBS C15S活性改良或甚至还完全使组织中的代谢物分布正常化(参见WO 2017/083327，其以全文引用的方式并入本文中)。因此，药品不一定需要递送到其天然细胞内环境中。
药品减少CBSDH患者的循环、尿液和组织中的毒性Hcy的积聚；使循环和组织中的Cys水平正常化；增加循环和组织中的Cth水平；和/或阻止、延迟和/或逆转CBSDH表现的发作。药品实现这些益处中的至少一个，同时允许患者享受正常饮食。实际上，即使在常规饮食(例如4.0g/kg MET)下，也已观察到增加的Cth活性为药品活性增加和/或肾排除减少的证据。
20NHS PEG-CBS药物物质以20-30mg/mL之间或约25mg/mL的浓度配制于含有磷酸氢二钠(二水合物)(11.4mM)、氯化钠(137mM)、氯化钾(2.7mM)和二磷酸氢钾(1.98mM)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，用水制备用于注射(WFI)。药物物质可自由溶于水溶液中。
根据SEC/UV/MS由同位素平均分子量计算的药物物质的分子量对于单体为45.290kDa，并且对于二聚体为90.58kDa。
所有批次为几乎不含可见粒子且颜色为深红色的澄清液体。另外，在还原和非还原条件两者下进行的SDS-PAGE和所提供的蛋白质印迹结果对于各批次彼此一致。使用这些方法中的每一种证实PEG化变异体的独特、均一和恒定模式。合并用药，包括抗凝血剂、维生素和矿物质补充、甜菜碱、抗抑郁剂，也可以与本文所描述的药品组合以增强药物组合物的功效。
IV.制剂
对于上文提及的治疗用途，所施用的剂量将随着所使用的化合物、施用模式、所需治疗和所指示的病症而变化。举例来说，如果吸入，那么本公开化合物的每日剂量可以在0.05微克/千克体重(μg/kg)到100微克/千克体重(μg/kg)范围内。或者，如果经口施用化合物，那么本公开化合物的每日剂量可以在0.01微克/千克体重(μg/kg)到100毫克/千克体重(mg/kg)范围内。
PEG化以形成本文所描述的药物物质的具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的蛋白质可以其自身使用，但将通常以与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载剂结合的药物组合物的形式施用。因此，本公开进一步提供一种药物组合物，其包含本文所描述的与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载剂结合的药物物质。
可用于本公开药物组合物中的药学上可接受的佐剂、稀释剂或载剂为药物制剂领域中常规采用的佐剂、稀释剂或载剂，并且包括但不限于糖、糖醇、淀粉、离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人类血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘油、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸、水、盐或电解质的偏甘油酯混合物，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素类物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂(羊毛脂(lanolin))。
本公开的药物组合物可经口、肠胃外、通过吸入喷雾、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或经由植入式贮器施用。在一个实施方式中，药物组合物可以经口施用。在一个实施方式中，药物组合物可经皮下施用。本公开的药物组合物可含有任何常规无毒的药学上可接受的佐剂、稀释剂或载剂。如本文所使用的术语肠胃外包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内以及颅内注射或输注技术。
药物组合物可以呈无菌可注射制剂形式，例如呈一种无菌可注射水性或油性悬浮液形式。悬浮液可以根据本领域中已知的技术，使用合适的分散剂或湿润剂(例如，Tween80)和悬浮剂进行配制。无菌可注射制剂还可以是非毒性的肠胃外可接受的佐剂、稀释剂或载剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的佐剂、稀释剂和载剂为甘露醇、水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等张氯化钠溶液。另外，无菌不挥发性油常规地用作溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成单甘油酯或二甘油酯。如油酸等脂肪酸及其甘油酯衍生物可用于制备可注射物，天然的药学上可接受的油类(如橄榄油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙烯化的形式)也是如此。这些油溶液或悬浮液也可以含有长链醇稀释剂或分散剂。
本公开的药物组合物可以以任何口服可接受的剂型口服施用，包括但不限于胶囊、片剂、散剂、颗粒和水悬浮液和溶液。这些剂型根据药物制剂领域中众所周知的技术制备。在口服使用的片剂的情况下，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。典型地还添加如硬脂酸镁的润滑剂。对于以胶囊形式口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当经口施用水性悬浮液时，活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。必要时，可添加某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。
对于经直肠施用，本公开的药物组合物还可以栓剂形式配制。这些组合物可以通过将活性成分与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下是固体而在直肠温度下为液体，并且因此将在直肠中融化以释放活性成分。此类材料包含但不限于可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
本公开的药物组合物可以通过鼻气溶胶或吸入来施用。此类组合物是根据药物制剂领域中所熟知的技术制备，并且可以采用苯甲醇或其它适合的防腐剂、增强生物可用性的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其它本领域中已知的增溶剂或分散剂，制备为于生理盐水中的溶液。
本文中的药物组合物可以呈待通过如WO 2015/153102、WO 2016/183482和WO2018/009838中所示的循环系统施用的形式，所述文献各自以全文引用的方式并入本文中。CBS蛋白质可以由由去核造血细胞(EHC)表达的重组核酸编码，所述去核造血细胞包括红系细胞或似血栓细胞。举例来说，红系细胞是红血球、红细胞或网织红细胞。举例来说，似血栓细胞为血小板。在某些实施方式中，经编码CBS蛋白质与经翻译膜锚定多肽融合。在某些实施方式中，CBS蛋白质定位于EHC的表面上。CBS蛋白质可以裂解以用于细胞外空间中的酶的活化。或者，内部定位CBS蛋白质可以通过EHC裂解而释放到细胞外空间中。或者，CBS蛋白质的酶目标可进入EHC且接着在更改之后经由膜退出。在某些实施方式中，CBS蛋白质具有本序列表中的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列或WO 2017/083327(其以全文引用的方式并入本文中)的SEQ ID NO:2、3或13。
取决于施用模式，药物组合物将包含0.05w％到99w％(重量百分比)、更确切地说0.05w％到80w％、再更确切地说0.10w％到70w％、并且甚至更确切地说0.10w％到50w％的活性成分，所有重量百分比均以总组合物计。
适合的药物制剂的选择和制备的常规程序描述于例如“制药-剂型设计的科学(Pharmaceuticals-The Science of Dosage Form Designs)”,M.E.Aulton,ChurchillLivingstone,1988中，其以全文引用的方式并入本文中。
通过透滤将磷酸氢二钠(二水合物)、氯化钠、氯化钾和二磷酸氢钾的缓冲溶液引入到药物物质中。
以20-30mg/mL或约25mg/mL的目标浓度将药品配制于PBS(pH＝7.4±0.2)中。PBS缓冲液含有磷酸氢二钠(二水合物)(11.4mM)、氯化钠(137mM)、氯化钾(2.7mM)和二磷酸氢钾(1.98mM)。表1提供制剂细节。
表1.药品配方
组分 量/批次(g)
药物物质 25mg/mL(范围20-30mg/mL)
注射用水(WFI) 对于体积足够的数量
磷酸氢二钠(二水合物) 11.4mM
氯化钠 137mM
氯化钾 2.7mM
二磷酸氢钾 1.98mM
表2提供本文所描述的药品的示例单位剂量组成。
表2.单位剂量的药品
组分 单次剂量的量(1mL/小瓶) 功能
药物物质 25mg 活性成分；酶
注射用水(WFI) 1mL 溶剂
磷酸氢二钠(二水合物) 2.0mg 缓冲液组分
氯化钠 8.0mg 赋形剂
氯化钾 0.2mg 赋形剂
二磷酸氢钾 0.3mg 缓冲液组分
在某些实施方式中，药品经配制用于在受试者中暴露约50mU/μL。冻干制剂可用于在复原后施用至人类。
A.冻干
药物组合物可以呈冻干制剂形式。在一些实施方式中，冻干制剂包含药物物质、缓冲液和赋形剂。在某些实施方式中，在适合的复原缓冲液、水或任何其它药学上可接受的佐剂、稀释剂或载剂中复原冻干制剂之后，药物物质的浓度在约20-30mg/ml之间。在一些实施方式中，药物物质的浓度为约20mg/ml、约21mg/ml、约22mg/ml、约23mg/ml、约24mg/ml、约25mg/ml、约26mg/ml、约27mg/ml、约28mg/ml、约29mg/ml或约30mg/ml。在一些实施方式中，药物物质的浓度为约25.4mg/ml。在某些实施方式中，在适合的复原缓冲液、水或任何其它药学上可接受的佐剂、稀释剂或载剂中复原冻干制剂之后，缓冲液为15mM浓度的磷酸钾。在某些实施方式中，赋形剂为8％(w/v)浓度的海藻糖。在一些实施方式中，制剂包含蔗糖，使得在冻干制剂在适合的复原缓冲液、水或药学上可接受的佐剂、稀释剂或载剂中复原后，蔗糖的浓度为5％。在一些实施方式中，通过冷冻干燥显微法测定的塌陷起始温度(Tc起始)为-21℃。在一些实施方式中，制剂的pH为7.5。
在一些实施方式中，冻干工艺可以在不熔融结晶饼结构的情况下在48小时或更短时间内进行。冻干工艺可以经优化以调节以下参数或特性中的一或多者，如但不限于(i)减少的冻干制剂的复原时间(例如小于1分钟)，(ii)减小的粘度以允许更浓缩的药品，(iii)并入等渗缓冲液以使对患者的疼痛减至最少，和/或(iv)减小的去PEG化。
冻干制剂可使用以下方案制备。在制剂制备之前三天，将20-30mg/ml或约25mg/ml的药物物质(在-80℃下存储)在2到8℃下于冰箱中解冻72小时。解冻后，通过平缓涡旋使药物物质均质化。在受控条件下在2-8℃下进行透析24小时。使用具有20kDa截止值的透析盒，且每次以大于或等于1:50的体积比更换缓冲液三次。在总透析时间的3和6小时之后更换缓冲液。执行最后一个透析步骤过夜。在透析之后，从透析盒回收制剂并且通过使用0.22μm聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤器过滤。在过滤之后，在层流气流条件下用1.0ml的填充体积填充小瓶。
冻干在Epsilon 2-12D中试规模的冷冻干燥器(Martin Christ，德国奥斯特罗德(Osterode,Germany))中进行。腔室压力由电容计控制且由真空泵和受控氮剂量调节。
在将小瓶平衡到5℃之后，将小瓶冷冻到-45℃并且在-45℃下平衡另外5小时。在初次干燥中将搁板温度设定到-15℃持续31小时。二次干燥在40℃的搁板温度下进行2.5小时。在冻干工艺结束时，用氮气将腔室充气到800mbar，并且通过提升搁板将小瓶塞住。在加塞之后，用氮气将腔室充气到大气压。表3展示在优化循环之后的冻干工艺参数。
表3.冻干工艺参数
Figure BDA0003521194860000231
在冷冻干燥工艺期间，监测产物温度、搁板温度、冷凝器温度和腔室压力(电容和皮氏计(Pirani gauge))。产物温度由Pt100传感器(OMEGATM)监测。
V.疾病、病症或病状的治疗
患有CBSDH的个体通常在出生时无症状，且除非其被治疗，否则随时间推移在这些个体中呈现症状，一些早在婴儿期中呈现，许多在儿童期中呈现，且因为这是谱系疾病，所以在一些患者中症状仅在成人期中呈现(参见Yap,2005；Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Morris等人.《胱硫醚β合酶缺陷症的诊断和管理指南(Guidelines for thediagnosis and management ofcystathionine beta-synthase deficiency)》.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74；Mudd等人.载于：Scriver CL,BeaudetAL,SlyWS,Valle D编.《遗传性疾病的代谢和分子基础(The Metabolic and Molecular Basis ofInheritedDiseases)》.第7版.纽约(New York):麦格劳·希尔(McGraw Hill)；2001；1279-1327，其各者以全文引用的方式并入本文中)。通常涉及四个主要器官系统，眼部、骨骼和血管系统以及CNS。还可涉及其它器官，如肝脏、胰脏、胃肠道和皮肤，包括毛囊(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74；Muacevic-Katanec等人.CollAntropol 2011；35:181-185；Suri等人.《神经科学杂志(JNeurol Sci)》2014；347:305-309，其各者以全文引用的方式并入本文中)。
累积的数据展示，Hcy水平的降低可充当在CBSDH中成功施用酶疗法(ET)的指标。其符合NIH-FDABiomarker Working Group对于“药效动力学/反应生物标记物，其水平反应于暴露于医疗产品……改变”的定义(参见FDA-NIH Biomarker Working Group.生物标记物，终点S和其它工具(BEST)资源[因特网].银泉(Silver Spring)(马里兰州(MD)):食品和药物管理局(Food and Drug Administration)(美国)；2016-.合理可能的替代终点(Reasonably Likely Surrogate Endpoint).2017年9月25日.由美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)(美国),贝塞斯达(Bethesda(马里兰州)共发布.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK326791/,其以全文引用的方式并入本文中)，且甚至符合对于在用于CBSDH的ET的情况下与药物作用机制紧密相关的标记物的定义。因此，血液或血浆Hcy不仅是药效动力学研究的有用标记物，而且先前还已经被认可为用于高胱氨酸尿症(HCU)的“合理可能的替代终点”。
在患有CBSDH的婴儿和儿童中，最重要的事是为了防止与CBSDH相关的并发症并且确保正常智力的恰当生长和发展(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志(J Inherit MetabDis)》2017；40:49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。在稍后的年岁中被诊断的患者中，治疗的目标应该是预防危及生命的血栓栓塞并且使已经确立的并发症的进展降到最低。为了解决这些目标，必须改进与CBSDH相关的生物化学异常，并且如果可能，使其正常化(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。
根据2016年CBSDH诊断和管理指南，应将Hcy水平维持为尽可能接近正常值(处于或低于10至15μmol/L)。在给定可用治疗的情况下，这在患有CBSDH的患者中通常是不可能的，并且因此表明理想目标在患有吡哆醇反应性CBSDH患者中低于50μmol/L并且在非吡哆醇反应性患者中低于100μmol/L(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。如先前所提到，非吡哆醇反应性患者往往会具有比吡哆醇反应性患者更高的Hcy水平。尽管针对患有相同疾病的患者建议两个目标，但这些目标设计为可实现的，而非优化的，以便使并发症降到最低。
总的来说，管理CBSDH所需的长期治疗的有效性，尤其因为其最频繁地取决于饮食限制和补充，所以其经受较差或不一致终身顺应性的影响。针对CBSDH的ET将避免这些缺陷中的许多。通过经由不需要严重Met限制或Cys补充的机制补偿CBSDH中的代谢缺陷，将预期ET实现更一致的Hcy降低，而不会引起严重的升高Met水平，并且还允许饮食的自由化或正常化。
目前对于校正病状的基础遗传起因的CBSDH不存在治愈，但一般公认的治疗目标是尽可能地降低tHcy水平(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》.2017年1月；40(1):49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。因此，当前疗法旨在校正生物化学异常，从而降低疾病的不良临床表现的风险。通过目前可用于患有CBSDH的患者的治疗，使Hcy水平几乎完全正常化。
需要策略的组合来在大多数患者中实现治疗目标。这些治疗策略包含：1)通过向易受吡哆醇影响的患者施用药理学剂量的吡哆醇(维生素B6，一种针对CBS的辅因子，以及叶酸)来增加残余CBS活性(参见Yap等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学(Arterioscler Thromb Vasc Biol)》.2001年12月；21(12):2080-5，其以全文引用的方式并入本文中)；2)通过重度饮食/蛋白质限制降低甲硫氨酸负荷，同时用超出代谢阻碍的产品补充饮食，和3)增强替代性代谢途径以抵消CBS缺陷症的影响，例如施用甜菜碱(甲基供体)以增强Hcy到Met的再甲基化。在某些实施方式中，提供叶酸补充和(如果需要)维生素B12补充剂(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》.2017年1月；40(1):49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。
A.用于CBSDH的当前疗法
在一些实施方式中，患有CBSDH的患者应接受足够叶酸补充和(如果需要)维生素B12补充剂(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。另外，患者应用吡哆醇疗法(如果有反应)、Met受限、Cys补充饮食和/或甜菜碱疗法治疗。需要策略的组合来在大多数患者中实现治疗目标。
最常见处方治疗为饮食与甜菜碱的组合，随后为单独甜菜碱和单独饮食(参见Adam等人.《分子遗传学和新陈代谢(Mol Genet Metab)》2013；110:454-459，其以全文引用的方式并入本文中)。当患者年龄超过16岁时，其最通常被开处仅无饮食情况下的甜菜碱，这是因为认识到成年患者对Met受限饮食的顺应性差。然而，成人中对甜菜碱的顺应性也较差。中值蛋白质摄入在患者中广泛变化且随年龄显著增加。
与这些发现一致，最近报告陈述24名患者中的仅四名成人患者在被开处具有特异性CBSDH-适当氨基酸补充的低蛋白质饮食后进行此治疗(参见Lorenzini等人.《遗传代谢疾病杂志》.2017年10月4日，其以全文引用的方式并入本文中)。多个CBSDH专家已描述在美国类似的广泛变化性(孤立病科技及科学咨询委员会(Orphan TechnologyScientificAdvice Board)包含为US CBSDH专家的医生)。比较来自未经治疗患者对比经治疗患者(分别为25和93名患者)的tHcy值的研究得出结论，这两组之间不存在显著差异(tHcy范围分别为15.7到281.4和4.8到312μmol/L；中值分别为125.0和119.0μmol/L)，但该研究没有提供关于患者治疗方案的细节(参见Stabler等人.《JIMD报告》2013；11:149-163，其以全文引用的方式并入本文中)。这些结果表明所有或以下结论的组合：患者具有疾病的不均一呈现，标准治疗无效和/或治疗的顺应性较差。
1.吡哆醇
在诊断后，测试患者对吡哆醇(一种CBS的辅因子)的反应性。施用药理学剂量的吡哆醇(维生素B6)在已展示具有吡哆醇反应性的个体中增加CBS的残余活性。虽然作为欧洲高胱氨酸尿症和甲基化缺陷网络和登记处(European network and registry forhomocystinuria and methylation defects,EHOD)的一部分而编写的2016年指南将吡哆醇反应性因部位广泛变化进行定义，定义吡哆醇反应性为在吡哆醇暴露6周内tHcy水平降低20％。具有重度升高tHcy水平的患者和具有轻度或中度升高tHcy水平的患者都可以被定义为响应性，尽管呈现极不同tHcy水平。此外，不同治疗中心以不同方式定义吡哆醇反应性，并且因此按tHcy水平而非按其吡哆醇反应性对患者分类更适当且严格。一般来说，对吡哆醇起反应的患者具有一些残余CBS活性并且因此具有较低tHcy水平，产生较不严重的呈现。
吡哆醇一般被视为在患有CBSDH的患者中安全(参见Yap；孤儿病百科全书[在线连载].2005,第1-13页，其以全文引用的方式并入本文中)。其最常报告的不良影响包括在用定义为大于900mg/天的高剂量治疗的患者中的周边神经病变(参见Schaumburg等人.《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》1983；309:445-448；Ludolph等人.《欧洲儿科杂志(Eur JPediatr)》1993；152:271；其以全文引用的方式并入本文中)，接受500mg/天的吡哆醇的新生儿中的呼吸暂停和无反应性(Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其以全文引用的方式并入本文中)和横纹肌溶解(参见Shoji等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:439-440，其以全文引用的方式并入本文中)。
虽然广泛使用吡哆醇治疗，但其提供tHcy水平的适度降低，且被定义为具有反应性的大多数患者基于单独吡哆醇不能够显著降低，更不用说正常化tHcy水平，因为其起始水平高于正常值许多倍(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》.2017年1月；40(1):49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。除长期吡哆醇治疗以外，推荐吡哆醇反应性患者CBSDH患者还接受叶酸并且按需要接受维生素B12补充。
2.饮食限制
先前已经针对患有CBSDH的所有患者建议终身饮食限制(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》.2017年1月；40(1):49-74；Walter等人.《欧洲儿科杂志》.1998年4月；157增刊2:S71-6；其以全文引用的方式并入本文中)。所推荐的饮食极其有限并且旨在通过限制蛋白质含量来减少Met摄入。
对于CBSDH患者的本发明疗法的最基本组成部分为终身低蛋白质饮食，其包括补充有无Met-L-氨基酸的少至5g的天然蛋白质/天(www.hcunetworkamerica.org)，且在许多情况下，给予额外的Cys(Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-47；Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》.2017年1月；40(1):49-74；其以全文引用的方式并入本文中)以补充饮食。重度受限饮食由以下组成：低甲硫氨酸谷物类食物、低甲硫氨酸水果和蔬菜、低甲硫氨酸医疗食物、油和糖。应避免如肉、鸡、鱼、鸡蛋、牛奶、酸奶、奶酪、大豆产物、坚果、豆科植物和含有中等量Met的许多水果和蔬菜的食物。由于天然CBS为Met代谢、Met(许多食物中发现的必需氨基酸)摄入中的关键酶，导致tHcy的血浆浓度升高且下游代谢物Cth和Cys的浓度降低。
所制备食物、烘焙制品和经包装食物必须受到高度限制，因为其通常含有牛奶、鸡蛋或面粉。每一CBSDH患者所需和耐受的蛋白质的量是不同的且有可能随时间变化。根据在频繁血液测试(用于高胱氨酸尿症的ASIEM低蛋白质手册)中监测的tHcy水平调节此量。大部分基于饮食治疗的患者还需要每日食用不适口的无Met合成氨基酸配制品以预防继发性营养不良和维持儿童适当生长和维持成人中的适当营养(参见Morris等人.,遗传代谢疾病杂志》.2017年1月；40(1):49-74；其以全文引用的方式并入本文中)。
尽管饮食改变与维生素补充的组合可在某种程度上在与高度受限饮食完全顺应的个体中降低tHcy水平，但大多数CBSDH患者的tHcy水平保持超过正常值的若干倍到数量级。对于大多数个体，实现对饮食改变的完全终身顺应性是非常有挑战的并且较差代谢控制的所得周期具有累积有害影响(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》.2017年1月；40(1):49-74；其以全文引用的方式并入本文中)。对饮食的顺应性通常较差，且在青春期和成人期期间通常进一步恶化(参见Walter等人.《欧洲儿科杂志》.1998年4月；157增刊2:S71-6；Schiff等人.《儿童神经病学(Neuropediatrics)》.2012年12月；43(6):295-304；Garland等人.《儿科与儿童健康(Paediatr Child Health)》.1999年11月；4(8):557-62；其以全文引用的方式并入本文中)。此外，食用高Met食物不会引发立即的负面物理反应，进一步加重困难与饮食顺应性(www.hcunetworkamerica.org)。Met限制在儿童中甚至更具有挑战性，因为需要确保足够的Met以促进生长和发育。基于饮食治疗的大多数患者还需要富含Cys的无Met-L-氨基酸补充剂以维持儿童中的恰当生长，并且在成人中维持恰当营养(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。
最近的一份报告称，在24名开具低蛋白饮食并补充特定CBSDH适当氨基酸的患者中，只有4名成年患者遵循此治疗方法(参见Lorenzini等人.《遗传代谢疾病杂志》.(2018)41:109-115，其以全文引用的方式并入本文中)。多位CBSDH专家在美国描述类似的广泛差异性。
3.甜菜碱补充
与主要基于饮食的疗法相关的问题使得必须使用其它方法用于降低Hcy，最显著地以每天至少两次施用的甜菜碱(N,N,N-三甲基甘氨酸，市售为CYSTADANETM)补充。甜菜碱作为单一疗法(Sakamoto等人.《国际儿科(Pediatr Int)》2003；45:333-338，其以全文引用的方式并入本文中)很少有效，并且通常用作吡哆醇的助剂和/或Met受限饮食(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》.2017年1月；40(1):49-74；其以全文引用的方式并入本文中)。
甜菜碱并不解决潜在CBS缺陷症，而是诱导替代性途径，引起Hcy回到Met的再甲基化并且通过校正CBS突变体的部分错误折叠(参见Kopecka等人.《遗传代谢疾病杂志》2011；34:39-48，其以全文引用的方式并入本文中)。在甜菜碱存在下，酶甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)使Hcy到Met再甲基化(Singh等人.《遗传学与医学(Genet Med)》2004；6:90-95，其以全文引用的方式并入本文中)，因此部分地降低Hcy水平同时增加已经高度升高的Met水平。不通过甜菜碱施用改善CBS下游的代谢，且可能需要Cys补充。此外，甜菜碱治疗在具有急性脑水肿的患者中(Devlin等人.《儿科杂志》2004,144:545-548；Yaghmai等人.《美国医学遗传学杂志(Am J Med Genet)》2002；108:57-63；其均以全文引用的方式并入本文中)及不具有急性脑水肿的患者中(Vatanavicharn等人.《遗传代谢疾病杂志》2008；31增刊3:477-481；Brenton等人.《幼儿神经病学杂志》2014；29:88-92；Sasai等人.《东北实验医学杂志(Tohoku J Exp Med)》2015；237:323-327；其均以全文引用的方式并入本文中)与脑白质异常-一种脑内血管损伤病征相关(Prins等人.《自然评论神经病学(Nat Rev Neurol)》2015；11:157-165，其以全文引用的方式并入本文中)。
甜菜碱可能为不适口的(Walter等人.《欧洲儿科杂志》.1998年4月；157增刊2:S71-6，其以全文引用的方式并入本文中)并且产生令人不愉快的鱼腥味体臭和/或气息(参见Manning等人.《JIMD报告》2012；5:71-75，其以全文引用的方式并入本文中)。这两种作用可能由于对高剂量(在成年和儿科患者中大于6g/天)的要求而加剧。因此，顺应性通常较差(参见Adam等人.《分子遗传学和新陈代谢(Mol Genet Metab)》.2013年12月；110(4):454-9；Walter等人.《欧洲儿科杂志》.1998年4月；157增刊2:S71-6；Sakamoto等人.《国际儿科》2003；45:333-338；其以全文引用的方式并入本文中)。
甜菜碱CYSTADANETM的药物制剂在2006年由FDA批准，并且指示降低包括CBS缺陷症、5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)缺陷症和钴胺素辅因子代谢(cbl)缺陷的高胱氨酸尿症病症中升高的血液Hcy(参见Recordati.CYSTADANETM产品信息(PI).2017.参考类型:在线资源，其以全文引用的方式并入本文中)。
迄今为止对CBSDH吡哆醇无反应患者的饮食习惯进行的最大调查表明，甜菜碱是一种常见的治疗选择，尤其在晚期诊断的患者、青少年和成年人中。认为在无饮食的情况下使用甜菜碱作为34％患者中的主要疗法归因于缺乏对饮食的顺应性，因为当在无饮食的情况下提供时不存在检查甜菜碱长期有效性的受控研究(参见Adam等人.《分子遗传学与新陈代谢》2013；110:454-459，其以全文引用的方式并入本文中)。实际上，CBSDH小鼠模型中的研究发现随时间推移，甜菜碱治疗显著降低tHcy的能力降低(参见Maclean KN.《胱硫醚b-合成酶缺陷型高胱氨酸尿症的甜菜碱治疗；是否有用且是否能够改善？(Betainetreatment of cystathionine b-synthase-deficient homocystinuria；does it workand can it be improved？)》德孚出版社(Dove press)2012；2:23-33，其以全文引用的方式并入本文中)。
4.抗血小板疗法
除降低Hcy疗法以外，具有不良控制的Hcy水平的患者和/或具有用于血栓形成的额外风险因素(例如莱顿(Leiden)因子V、先前血栓形成和妊娠)的患者可受益于用抗血小板剂(例如阿司匹林(aspirin)、双嘧达莫(dipyridamole)或氯吡格雷(clopidogrel))进行治疗(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》.2017年1月；40(1):49-74；其以全文引用的方式并入本文中)。COUMADINTM血液稀释剂还可以用于具有先前静脉血栓形成的患者。然而，抗凝血剂与脑出血的风险增加相关，并且应在个别患者基础上确定其用途(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》.2017年1月；40(1):49-74；其以全文引用的方式并入本文中)。
5.当前疗法下的临床结果
CBSDH的表现继续进行，其中经典临床症状达到不同程度的残疾和对受感染个体的生活质量的影响。不管发作的个体年龄，在任何年龄下生物化学控制的损失都与可能危及生命的严重并发症的发展相关联(参见Walter等人.《欧洲儿科杂志》.1998年4月；157增刊2:S71-6，其以全文引用的方式并入本文中)。
治疗必须在整个寿命中持续，因为不良代谢控制的时段具有累积有害影响，这可能导致严重的并发症和过早死亡(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》.2017年1月；40(1):49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。
在没有治疗的情况下，吡哆醇无反应性CBSDH的预后较差，且患者的预期寿命显著降低。由于疾病首先描述于1962年(参见Carson等人.《儿童疾病档案(Arch Dis Child)》.1969年6月；44(235):387-92；Gerritsen等人.《生物化学与生物物理学研究通讯(BiochemBiophys Res Commun)》.1962年12月19；9:493-6；其以全文引用的方式并入本文中)中，所以尚未进行对于CBSDH的饮食或其它疗法的随机受控试验。然而，已经公布了若干观测研究。
记录629名未经治疗的CBS患者的天然病史的国际研究展示并发症随着年龄增加的风险(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其以全文引用的方式并入本文中)。观察到治疗(吡哆醇，Met受限饮食)降低血浆tHcy水平并且显著降低血栓栓塞事件和晶状体错位的风险，但观察到对受限饮食的顺应性较差。
Yap等人(《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》.2001年12月；21(12):2080-5)在158名经治疗的患者中进行国际多中心研究。当相比于来自Mudd等人(《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其以全文引用的方式并入本文中)的历史对照数据时，这一治疗组的心血管事件的发生率显著降低。此显而易见的益处与所治疗患者中的较低(但未正常化)tHcy血浆水平相关。应注意，与所需方案的一致顺应性是极困难的。
总的来说，虽然若干CBSDH治疗策略是可用的，但其不能够将大多数患者恢复到接近正常的tHcy水平。此外，其长期有效性受较差或不一致终身顺应性的影响。因此，在CBSDH患者中难以维持一致的Hcy降低。用本文所描述的药品进行治疗旨在避免这些缺陷中的许多。通过经由不需要严重Met限制或Cys补充的机制补偿CBSDH中的代谢缺陷，预期酶疗法(ET)疗法实现更一致的Hcy降低，同时不会引起危险升高的Met水平。
VI.给药和施用
在某些实施方式中，可以通过皮下(SC)、静脉内(IV)或腹膜内(IP)注射向受试者施用药品。在一个实施方式中，药品可以向受试者施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。在另一个实施方式中，将药品施用超过20次。在另一个实施方式中，将药品施用超过100次。或者，药品可以施用持续受试者的剩余寿命。
在某些实施方式中，可每12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、每日、2天、3天、4天、5天、6天、每周、2周、3周和每月重复施用药品。在某些实施方式中，药品的施用每3天一次、每2天一次或每天一次进行。
在某些实施方式中，药品的施用可为间隔开若干分钟、小时、天或周的一系列剂量。举例来说，一系列剂量数可以是1、2、3、4、5或6。作为非限制性实施例，向受试者施用间隔24小时的3次剂量。作为另一非限制性实施例，向受试者施用间隔12小时的5次剂量。受试者可以是人类。
在某些实施方式中，药品的施用可遵循一系列剂量的给药时程，所述给药时程具有第一系列剂量与第二系列剂量之间的间隙。剂量之间的间隙可以是2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、每天、2天、3天、4天、5天、6天、周、2周、3周、每月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月或18个月。一系列剂量数可以是2、3、4、5或6。作为非限制性实施例，可以向受试者施用第一系列的5个剂量，间隔12小时，且接着在第一剂量的14天后，向受试者施用第二系列的5个剂量，间隔12小时。作为另一非限制性实施例，在8周时间段内向受试者施用两个系列的剂量，其中第一系列为一个剂量，一周两次持续两周，并且第二系列的剂量为一周三次持续6周。
在某些实施方式中，药品可在已向受试者施用甜菜碱之后施用至少一次。甜菜碱施用、药品施用之间的时间可以是1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、周、2周、3周、每月、2个月、每季、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月或18个月。作为非限制性实施例，药品可以在向受试者施用甜菜碱之后14天施用。作为另一非限制性实施例，在向受试者施用甜菜碱之后可以向受试者施用两次剂量的药品。作为另一个非限制性实施例，药品可以在甜菜碱施用之后14或15天施用。
在某些实施方式中，药品可以与甜菜碱组合向受试者施用。组合可以施用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15次。在某些实施方式中，药品可以与甜菜碱组合施用超过15次。可以向患者施用的额外组合疗法包括药品和至少一种治疗以降低tHcy水平，如极低蛋白质/Met饮食和/或维生素/补充剂。
在一个实施方式中，向受试者施用的药品的剂量可以在约0.25mg/kg与约10mg/kg之间。举例来说，剂量为约0.33mg/kg、约0.66mg/kg、1.0mg/kg或1.5mg/kg中的一者。或者，剂量为约2mg/kg、约7mg/kg以及约10mg/kg。举例来说，剂量可以是约0.5mg/kg。或者，治疗有效量为选自约5.0mg/kg到约50mg/kg和约10.0mg/kg到约25mg/kg范围的剂量。举例来说，剂量选自下组：约0.25mg/kg、约0.33mg/kg、约0.66mg/kg、约1.00mg/kg、约1.10mg/kg、约1.20mg/kg、约1.30mg/kg、约1.40mg/kg、约1.50mg/kg、约1.60mg/kg、约1.70mg/kg、约1.80mg/kg、约1.90mg/kg、约2.00mg/kg、约3.00mg/kg、约4.00mg/kg、约5.00mg/kg、约6.00mg/kg、约7.00mg/kg、约8.00mg/kg、约9.00mg/kg、约10.0mg/kg、约11.0mg/kg、约12.0mg/kg、约13.0mg/kg、约14.0mg/kg、约15.0mg/kg、约16.0mg/kg、约17.0mg/kg、约18.0mg/kg、约19.0mg/kg、约20.0mg/kg、约21.0mg/kg、约22.0mg/kg、约23.0mg/kg、约24.0mg/kg、约25.0mg/kg、约26.0mg/kg、约27.0mg/kg、约28.0mg/kg、约29.0mg/kg、约30.0mg/kg、约31.0mg/kg、约32.0mg/kg、约33.0mg/kg、约34.0mg/kg、约35.0mg/kg、约36.0mg/kg、约37.0mg/kg、约38.0mg/kg、约39.0mg/kg、约40.0mg/kg、约41.0mg/kg、约42.0mg/kg、约43.0mg/kg、约44.0mg/kg、约45.0mg/kg、约46.0mg/kg、约47.0mg/kg、约48.0mg/kg、约49.0mg/kg和约50.0mg/kg。
在某些实施方式中，基于甲硫氨酸受限饮食向受试者施用药品。或者，不基于甲硫氨酸受限饮食而向受试者施用药品。
在某些实施方式中，药品可与用于治疗CBSDH的另一治疗剂共施用。如本文所用，“共施用”意指施用两种或更多种组分。用于共施用的这些组分包括但不限于甜菜碱或维生素B6。共施用是指同时施用两种或更多种组分或以施用之间的时移施用两种或更多种组分，时移如1秒、5秒、10秒、15秒、30秒、45秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟、30分钟、31分钟、32分钟、33分钟、34分钟、35分钟、36分钟、37分钟、38分钟、39分钟、40分钟、41分钟、42分钟、43分钟、44分钟、45分钟、46分钟、47分钟、48分钟、49分钟、50分钟、51分钟、52分钟、53分钟、54分钟、55分钟、56分钟、57分钟、58分钟、59分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、1.5天、2天或3天。在某些实施方式中，施用两种或更多种组分之间的时移大于3天。
在某些实施方式中，药品可以用作肠胃外药剂，以在初始给药间隔中每周一次经由皮下(SC)注射长期向患者施用。举例来说，每周给药药物持续6个剂量。在某些实施方式中，受试者可以在18到65岁的年龄范围内。在某些实施方式中，可以类似地治疗年龄为16岁的受试者。
在某些实施方式中，施用在1天、2天、3天、4天、5天或6天时程内进行。在某些实施方式中，施用在1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、25周、26周、27周、28周、29周、30周、31周、32周、33周、34周、35周、36周、37周、38周、39周、40周、41周、42周、43周、44周、45周、46周、47周、48周、49周、50周、51周或52周的时程中进行。
在某些实施方式中，药品作为与吡哆醇(也称为维生素B6)的组合疗法和/或抗血小板疗法施用。
VII.患者分层法
在某些实施方式中，有资格使用本文所描述的药品进行的有效酶疗法的个体包括基于通过CBS基因的突变分析的遗传CBS缺陷型高胱氨酸尿症的证实作出CBSDH诊断和具有大于或等于80μM的tHcy的血浆水平的患者。
A.临床呈现
根据CBSDH诊断和管理的指导原则，在呈现重度或快速进展心肌病、晶状体错位和/或发育延迟的儿童中，应怀疑所述疾病。(参见Morris等人.“胱硫醚β-合成酶缺陷症诊断和管理的指导原则(Guidelines for the diagnosis and management ofcystathionine beta-synthase deficiency)”.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。在呈现血栓栓塞和/或晶状体错位但无其它症状的成人中以及在患有多系统疾病(包括眼部、结缔组织、神经精神和血管并发症)的成人中也有必要进行测试(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Morris等人.“胱硫醚β-合成酶缺陷症诊断和管理的指导原则”.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74；Kelly等人.《神经病学》2003；60:275-279,其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
B.生化分析
在用还原剂处理血浆之后，使用所有游离和结合的高半胱氨酸物质的总和测定血浆tHcy的水平。在具有稳定饮食习惯的健康个体中，tHcy水平随时间推移保持相对恒定(参见Refsum等人.《临床化学(Clin Chem)》2004；50:3-32；McKinley等人.《临床化学》2001；47:1430-1436；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。然而，食用富含蛋白质的膳食可在数小时的时间段内将tHcy水平增加约10％(参见Verhoef等人.《美国临床营养学杂志(Am J ClinNutr)》2005；82:553-558，其以全文引用的方式并入本文中)。在患有高同型半胱氨酸血症(tHcy>40μmol/L)的个体中的研究发现，个体内tHcy水平在4到8个月的时间段内变化至多25％。然而，不提供关于饮食、分析方法和取样时间的可变性的信息，妨碍解释数据的能力(参见Refsum H,SmithAD,Ueland PM等人.“关于高半胱氨酸测定的事实和建议：专家意见(Facts and recommendations about total homocysteinedeterminations:an expert opinion)”.《临床化学》2004；50:3-32，其以全文引用的方式并入本文中)。
在无叶酸补充的人群中，相应的参考上限分别为约15和20μmol/L。为了支持新生儿中CBS的诊断，预期血浆中的tHcy在50到大于100μmol/L之间，并且预期血浆中的Met在200到1500μmol/L之间(即，3-23mg/dL)(参见Sacharow等人.“胱硫醚β-合成酶缺陷症所导致的高胱氨酸尿症(Homocystinuria Caused by Cystathionine Beta-SynthaseDeficiency)”.《基因评述(GeneReviews)》2017，其以全文引用的方式并入本文中)。为了支持未经治疗的年长个体中的CBS诊断，预期血浆中的tHcy大于100μmol/L，并且预期血浆中的Met大于50μmol/L(即，大于0.7mg/dL)。预期对照新生儿或年长个体在血浆中的tHcy小于15μmol/L并且Met在10到40μmol/L之间(0.2-0.6mg/dL)。
高到高标准Met水平(参考范围通常分别为40到45和12到15μmol/L)与低到低标准Cth水平(参考范围分别为0.05到0.08和0.35到0.5μmol/L)的组合可适用于区分CBSDH与由Hcy再甲基化的遗传和营养病症引起的HCU(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74；Stabler等人.《JIMD报告》2013；11:149-163；Bartl等人.《临床化学学报》2014；437:211-217，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。另一有用测试使用放射性或氘标记的底物测定经培养成纤维细胞中来自Hcy和丝氨酸的Cth生产(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74；Kraus JP.《酶学方法(Methods Enzymol)》1987；143:388-394；Smith等人.《色谱杂志B：生物医学和生命科学中的分析技术(J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci)》2012；911:186-191，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。然而，酶分析无法始终区分吡哆醇反应性和非反应性个体，且酶活性在温和情况下可为正常的(参见Alcaide等人.《临床化学学报》2015；438:261-265，其以全文引用的方式并入本文中)。最近，测量从器官释放到血浆中的CBS的活性的快速稳定同位素分析在吡哆醇非反应性患者中展示100％灵敏度，但在吡哆醇反应者中仅展示86％灵敏度(参见Alcaide等人.《临床化学学报》2015；438:261-265；Krijt等人.J《遗传代谢疾病杂志》2011；34:49-55，其两者均以全文引用的方式并入本文中)。
C.分子诊断
分子遗传学测试-CBSDH黄金标准诊断测试-可通过单基因测试或使用多基因组进行(参见Yap S.《由于胱硫醚β-合成酶缺陷症引起的高胱氨酸尿症》.孤儿病百科全书[在线连载]2005；Sacharow SJ,Picker JD,Levy HL.“由胱硫醚β-合成酶缺陷症导致的高胱氨酸尿症”.《基因评述》2017；Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74；Katsanis等人.《自然综述：遗传学(Nat Rev Genet)》2013；14:415-426；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。应使用靶向单基因测试筛选具有特定CBS突变高风险的个体。然而，这仅仅适用于选择具有共同CBS突变的人群(例如，来自Qatar的93％的具有CBSDH的个体携带p.Arg336Cys；c.1006C>T突变)和来自具有已知病原性变异体的家庭的个体。在其它患者中，可以测序CBS基因，并且仅在发现一种或无病原性变异体的情况下进行基因靶向删除/复制分析。或者，可以使用多个基因组进行多个基因的同时分子测试。所使用的方法可以包括序列分析、缺失/复制分析和其它非测序类测试(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。一般来说，保留针对具有有限数目个流行突变的高风险人群的分子遗传学测试(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74；Huemer等人.《遗传代谢疾病杂志》2015；38:1007-101，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
D.吡哆醇反应性测试
吡哆醇反应性测试用于临床中以确定是否应对患有CBSDH的患者开处吡哆醇补充。因为不同治疗中心已以不同方式定义吡哆醇反应性(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74，其以全文引用的方式并入本文中)，因此按tHcy水平而非按其吡哆醇反应性对患者进行分类更为严格。吡哆醇反应性不是代谢控制的度量，而是仍然存在一些残余CBS活性的指示。
E.新生儿筛查(NBS)
一般来说，通过分析干血斑点以确定Met水平来进行针对CBSDH缺陷症的NBS测试。或者，针对NBS在干血斑点中评估tHcy水平而非Met可在全世界的几个中心获得。其用作二级测试以减少具有高Met水平的个体中的NBS的假阴性率(参见Turgeon等人.《临床化学》2010；56:1686-1695，其以全文引用的方式并入本文中)并且不用于改进灵敏度或减少假阴性率。
VIII.表型结果
回顾性研究展示tHcy水平与结果之间的比例关系。具有最高tHcy水平(治疗或未经治疗)的患者在较早的年岁中呈现较多严重症状，而具有较低tHcy水平的患者呈现较少症状且进展较不快速(参见Yap S.《由于胱硫醚β-合成酶缺陷症引起的高胱氨酸尿症》.孤儿病百科全书[在线连载]2005；Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。具有升高tHcy水平的个体通常呈现有发育迟缓、血栓栓塞、伴随光学晶状体后续错位的严重近视、骨质疏松型骨折、马方样体型(尤其长骨的伸长)和/或精神异常，如学习障碍(参见Yap S.《由于胱硫醚β-合成酶缺陷症引起的高胱氨酸尿症》.孤儿病百科全书[在线连载]2005；Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74；NORD,Kraus JP.《由于胱硫醚β-合成酶缺陷症引起的高胱氨酸尿症》.NORD[在线连载]2017，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。反映CBS缺陷症的谱系，一些患者具有重度儿童发作多系统性疾病，而具有较少重度升高Hcy的患者可保持直至成人期未诊断(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。在具有重度升高Hcy水平的患者中，预期寿命显著降低，但即使具有适度升高tHcy水平的患者也会出现多个负面临床结果。
已观察到显著证据，指示在CBSDH患者中通常受影响的四个系统(眼部、骨骼、心血管和神经)中有升高的tHcy水平和负面临床结果的病因效应。在眼部系统中，经常观测到的表型结果包括：晶状体异位、虹膜震颤、近视，并且较不频繁观察到的表型结果包括：青光眼、视神经萎缩、视网膜变性、视网膜脱落、白内障和角膜异常。在骨骼系统中，经常观察到的表型结果包括：骨质疏松症、椎骨双凹、脊柱侧凸、长骨的长度增加、干骺端的不规则加宽、干骺端骨针、骨骺的异常大小/形状、生长停滞线、弓形足和高腭穹，且较不频繁观察到的表型结果包括：蜘蛛脚样指、扩张的腕骨、异常骨龄、鸡胸/漏斗胸、膝外翻、脊柱后凸和短第四掌骨。在血管系统中，经常观察到的表型结果包括：血管阻塞、颧颊潮红和网状青斑症。在中枢神经系统中，经常观察到的表型结果包括：智力迟钝、精神干扰和锥体束外病征，且较不频繁观察到的表现型结果包括：癫痫发作和异常脑电图。在额外的身体系统中，经常观察到以下表型结果：白皙、脆性毛发、薄皮肤、肝脏中的脂肪变化、腹股沟疝、肌病、内分泌异常、凝血因子减少和自发性肠穿孔。
已在轻度升高tHcy水平和负面结果之间观察到强关系，但数据还已指示降低tHcy水平积极地影响临床表现。关于CBSDH的文献因所述疾病的罕见性和随后的小规模研究而受到影响，但因Hcy水平重度升高的人群的临床结果被放大而受益。相反，在更广泛的人群中进行的研究得益于大样本量，但tHcy水平的升高较小。综上所述，这些研究一致表明，tHcy水平的升高强烈地预示负面临床结果，且通过药物干预来降低这些水平是有益的。
用本文所描述的药品治疗CBSDH的潜在结果是将血浆tHcy浓度降低到最低可能水平，同时维持更宽松的饮食，包括比在用于CBSDH的其它疗法中所提供的更高浓度的Met和其它必需氨基酸。在患有CBSDH的婴儿和儿童中，最重要的事是为了防止与CBSDH相关的并发症并且确保正常智力的恰当生长和发展(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》.2017年1月；40(1):49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。在稍后的年岁中被诊断的患者中，最重要的事可以是预防危及生命的血栓栓塞并且使已经确立的并发症的进展降到最低。为了解决这些目标，可改进与CBSDH相关的生物化学异常，并且如果可能，使其正常化(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》.2017年1月；40(1):49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。比较8个欧洲国家中横跨29个中心患有CBSDH的患者的饮食管理实践的调查发现，在治疗中心中几乎没有关于血浆tHcy水平的目标范围的共识，其中在29个中心中，中值推荐目标小于55μM且处于小于20到100μM的范围内。(参见Adam等人.《分子遗传学与新陈代谢》.2013年12月；110(4):454-9，其以全文引用的方式并入本文中)。
本文中选择大于或等于80μM的tHcy水平截止值作为治疗资格，以为了避免排除先前血浆tHcy水平为约100μM的患者，鉴于相隔若干月测试的血浆tHcy水平的人体内变异率为25％(参见Refsum等人.《临床化学》2004；50:3-32；Guttormsen等人.,《临床研究杂志(JClin Invest)》.1996,98(9):2174-83；其中的各者以全文引用的方式并入本文中)以提供足够高水平以检测少量患者的临床上显著降低。在相隔若干月测试的血浆tHcy水平方面25％的人体内变异率(参见Refsum等人.《临床化学》2004；50:3-32；Guttormsen等.,《临床研究杂志》.1996,98(9):2174-83；其中的各者以全文引用的方式并入本文中)可部分归因于随时间推移CBSDH患者的饮食、药物治疗或补充剂的改变。
如果未经治疗，那么对吡哆醇无反应的CBSDH患者的预后是暗淡的(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。1985年，通过治疗前的时间-事件分析记录629名患者的CBSDH自然病史的国际回顾性研究展示，70％的患者在10岁前出现晶状体错位，85％在12岁前出现症状(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Mudd等人,Skovby F.“转硫障碍(Disorders oftranssulfuration)”.载于:Scriver CL,BeaudetAL,SlyWS,Valle D编.《遗传性疾病的代谢和分子基础(The Metabolic and Molecular Basis ofInherited Diseases)》.第7版.纽约:麦格劳·希尔；2001；1279-1327，其两者均以全文引用的方式并入本文中)。总的来说，50％的受影响个体在15岁时有放射学检测到的脊柱骨质疏松症，并且23％的吡哆醇无反应性患者(4％的反应性患者)在30岁时死亡(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其以全文引用的方式并入本文中)。
整体上看，可用证据指示当前治疗CBSDH的方法(包括限制性饮食和饮食补充剂的使用)在大多数患者中对暂停疾病进展的进程中无效。因此，有大体上未满足的医疗需要以识别将改进或正常化CBSDH的代谢异常和减缓或停止疾病的临床表现的进程的耐受良好疗法。
已观察到与CBSDH相关的增加的Hcy水平与关键临床结果之间的病因效应，包括眼部并发症(尤其晶状体错位)、骨架结果(尤其骨质疏松症)、血管事件(尤其中风和小血管疾病)和各种CNS结果(尤其认知功能)。升高tHcy水平与负面临床结果之间的关系以及相反地，按降低的Hcy水平和改良的临床结果计，通过总体人群中的多个研究进一步加强。总的来说，这些临床发现强调对早期CBSDH诊断和及时治疗的需要，以将Hcy水平降低到尽可能接近正常值。
尽管未关于CBSDH患者的生活质量(QoL)公布研究，但未公布的报告指示患者和其照护者因遵循且管理高度受限且社交隔离饮食遭受心理社会效应，且对于疾病的长期医疗后果极其焦虑。不出人意料地，患者渴望能够在不损害其长期前景的情况下放松其饮食。
患有CBSDH的患者中的tHcy水平与关键临床结果之间的强关系展示tHcy水平的变化为用于CBSDH中临床端点的组合的可靠替代标记物。因此，tHcy水平的改变适用于(i)监测临床中的患者进展和(ii)预测临床试验中的新治疗的临床益处和(ii)预测疗法的功效。
举例来说，与向受试者施用药品之前相比，药品使受试者的股动脉柔性正常化或增加。举例来说，I278T小鼠与野生型小鼠相比具有显著更低的股动脉柔性。与用药品处理的小鼠和未处理的小鼠中的常规饮食相比，Met受限饮食可实际上在I278T小鼠中产生较小股动脉直径。
先前在疾病的3个鼠类模型中进行的研究已证实htCBS C15S在全身性施用之后有效，如WO 2017/083327中所描述，其以全文引用的方式并入本文中。这些研究展示组织(如脑部)中的细胞外Hcy血浆和细胞内Hcy水平的至多90％减少。观察到施用药品以引起浓度梯度，其中Hcy从细胞内空间中的较高浓度流到细胞外空间中的较低浓度，在细胞外空间中，药品可进一步处理Hcy。细胞外PEG化htCBS C15S充当Hcy“槽”。综上所述，药品在CBSDH的动物模型中恢复控制Met代谢途径。
这些研究还展示在CBSDH鼠类模型中PEG化htCBS C15S的皮下给药校正代谢物水平，包括Cth水平的升高和Cys水平的正常化。此外，PEG化htCBS C15S积极地影响小鼠中疾病的表型表达，包括面部脱发、肝组织学、骨质疏松症、身体组成、糖尿病性视网膜病变(可能继发于肾病)和由于视网膜血管阻塞或非动脉性缺血性视神经病变引起的黄斑性和视神经萎缩、细胞因子和脂质水平。PEG化htCBS C15S还使CBS基因敲除(KO)小鼠免于早期死亡(参见Looker等人.《糖尿病学(Diabetologia)》2003；46:766-772；Pusparajah等人.《生理学前沿(Front Physiol)》2016；7:200；Gerth等人.J AAPOS2008；12:591-596；Stanger等人.《临床化学和检验医学(Clin Chem Lab Med)》2005；43:1020-1025；Cahill等人.《美国眼科杂志(Am J Ophthalmol)》2003；136:1136-1150；Minniti等人.《欧洲眼科学杂志(EurJ Ophthalmol)》2014；24:735-743；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。还观察到PEG化htCBS C15S良好耐受，其中在疾病动物模型中在长期给药情况下未注意到毒理学效应。
PEG化htCBS C15S作用于细胞外空间，且预期降低tHcy血浆浓度，而不考虑患者的遗传学、并行疗法或基线tHcy水平。因此，研究的合格人群应包括吡哆醇反应性和非反应性患者两者。
在健康个体中，tHcy水平在大致5到15μM范围内(OECD环境健康和安全出版物(OECD Environmental Health and Safety Publications).关于良好实验室规范原则和顺应性监测的系列(Series on Principles ofGood Laboratory Practice andCompliance Monitoring).第1号ENV/MC/CHEM(98)17“良好实验室规范原则(Principlesof Good Laboratory Practice)”(如1997年所修订)，其以全文引用的方式并入本文中)，其中98％呈二硫化物形式或与蛋白质结合。以非结合、游离、减少的氨基硫醇存在的仅2％tHcy可充当酶的底物(参见EMA：生物分析方法验证指南，EMEA/CHMP/EWP/192217/2009，ev.1，2011年7月21日；ATL-15-1419Atlanbio研究报告“LC-MS/MS测定研究529736期间收集的猴子血浆样品中胱硫醚-D4作为胱硫醚β-合成酶活性的产物”；其两者均以全文引用的方式并入本文中)。另一方面，CBSDH患者不仅呈现可能达到400μM或更高的血浆水平，而且还呈现为平衡的急剧改变，其中游离高半胱氨酸达到tHcy值的10-25％。
在小鼠模型中，PEG化htCBS C15S的施用引起tHcy水平的至多90％降低。因此，酶可用的游离高半胱氨酸的初始水平(总计的10％-25％)无法单独地解释所记录的tHcy水平的显著降低，并且必须有额外池供酶使用。举例来说，当游离Hcy由于PEG htCBS活性而变得稀少，在血浆中游离Hcy与Hcy加合物(呈蛋白结合Hcy或二硫化物形式)之间的平衡改变以促进游离Hcy的产生，其可进一步由酶处理。
A.眼部并发症
在患有CBSDH的患者中和在一般人群中，升高的Hcy水平是眼部并发症，尤其晶状体错位的强而独立的风险因素。即使在处方药理学和饮食干预下，大部分CBSDH患者最终呈现有眼部并发症。已展示降低的Hcy水平延缓并且可能防止CBSDH患者中的晶状体错位(参见Yap S.由于胱硫醚β-合成酶缺陷症引起的高胱氨酸尿症》.孤儿病百科全书[在线连载]2005；Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Martinez-Gutierrez等人.《国际眼科学(Int Ophthalmol)》(2011)31:227-232；Ajith等人.《临床化学学报》2015；450:316-321；Mulvihill等人.J AAPOS 2001；5:311-315；Marti-Carvajal等人.《Cochrane系统评价数据库(Cochrane Database Syst Rev)》2015；1:CD006612；Sweetser等人.《新英格兰医学杂志》2016,375:1879-1890；Sadiq等人.《眼科学研讨会(Semin Ophthalmol)》2013；28:313-320；Wright等人.“高半胱氨酸、叶酸和眼睛(Homocysteine,folates,andthe eye)”.《眼(Eye)》(伦敦(Lond))2008；22:989-993；Lieberman等人.《美国眼科杂志》1966,61:252-255；Harrison等人.《眼科学(Ophthalmology)》1998,105:1886-1890；Ramsey等人.《美国眼科杂志》1972；74:377-385；Couser等人《眼科遗传学(Ophthalmic Genet)》2017,38:91-94；Ghorbanihaghjo等人.《分子视觉(Mol Vis)》2008,14:1692-1697；Javadzadeh等人.《分子视觉》2010；16:2578-2584；Seddon等人.《美国眼科杂志》2006；141:201-203；Coral等人.《眼》(伦敦)2006；20:203-207；Axer-Siegel等人.《美国眼科杂志》2004,137:84-89；Heuberger等人.《美国临床营养学杂志》2002；76:897-902；Huang等人.《科学报告(SciRep)》2015；5:10585；Sen等人.《印度临床生物化学杂志(Indian J Clin Biochem)》2008；23:255-257；Yousefi等人.《蛋白质和肽字母(Protein Pept Lett)》2013；20:932-941；Gerth等人.JAAPOS 2008；12:591-596；Stanger等人.《临床化学和检验医学》2005,43:1020-1025；Cahill等人.《美国眼科杂志》2003,136:1136-1150；Minniti等人.《欧洲眼科学杂志》2014,24:735-743；Turkcu等人.《医学(Medicina)》(考纳斯(Kaunas))2013,49:214-218；Vessani等人.《美国眼科杂志》2003；136:41-46；Leibovitch等人.《青光眼杂志(JGlaucoma)》2003,12:36-39；Leibovitzh等人.《医学(Medicine)》(巴尔的摩(Baltimore))2016；95:e4858；Micheal等人.《分子视觉》2009；15:2268-2278；Clement等人.《青光眼杂志》2009；18:73-78；Cumurcu等人.《BMC眼科学(BMC Ophthalmol)》2006；6:6；Bleich等人.《神经传导杂志(JNeural Transm)》(维也纳(Vienna))2002；109:1499-1504；Lee等人.《当前眼科研究(Curr Eye Res)》2017；1-6；Wang等人.《美国眼科杂志》2004；137:401-406；Ganapathy等人.《眼科研究与视力学(Invest Ophthalmol Vis Sci)》2009；50:4460-4470，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。即使在处方药理学和饮食干预下，大部分CBSDH患者最终呈现有眼部并发症。已展示较低的Hcy水平延缓且可能防止CBSDH患者中的晶状体错位(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-747，其以全文引用的方式并入本文中)。
晶体异位(晶状体错位)是CBSDH最一致地呈现和最早表现的其中一个(参见Mulvihill等人.JAAPOS 2001；5:311-315，其以全文引用的方式并入本文中)。这通常在两岁之后发生，并且截至六岁存在于约50％未治疗的吡哆醇非反应性患者中以及截至10岁存在于50％未治疗的吡哆醇反应性患者中(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其以全文引用的方式并入本文中)。错位可以是部分的(半脱位)或完整的，并且尽管其可以在器官下方或经鼻发生，但其通常是双侧的(参见Mulvihill等人.JAAPOS2001；5:311-315；Sweetser等人.《新英格兰医学杂志》2016；375:1879-1890，其两者以全文引用的方式并入本文中)。
晶状体错位常常在快速进行性近视的时段之后，其可引起显著散光、单眼复视和降低的最佳校正视力(参见Sadiq等人.《眼科学研讨会》2013；28:313-320，其以全文引用的方式并入本文中)。总的来说，认为近视(大于1屈光度[D])影响约85％的CBSDH患者，其中极高近视(大于5D)影响50％到76％的患者。虹膜震颤(在移动眼球之后的虹膜的振颤)影响约56％的患者，且球形晶状体(容易半脱位的小球面透镜)影响50％的患者(参见Yap S.《由于胱硫醚β-合成酶缺陷症引起的高胱氨酸尿症》.孤儿病百科全书[在线连载]2005；Mulvihill等人.JAAPOS 2001；5:311-315，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。与CBSDH相关的其它并发症包括白内障形成、慢性玻璃体炎(玻璃体液发炎)和脉络膜视网膜发炎、具有急性和/或慢性闭角型青光眼的瞳孔阻滞和(在儿童中)弱视(弱视眼)(参见Sadiq等人.《眼科学研讨会》2013；28:313-320，其以全文引用的方式并入本文中)。
来自在具有CBSDH的24岁以下的25名患者的长期回顾性研究的证据表明，在tHcy水平从早期年龄不断地降低的患者中可以预防或至少显著地减少和延迟晶状体错位(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-747，其以全文引用的方式并入本文中)。早期降低Hcy治疗还与总体眼部并发症(包括恶化近视)的降低的风险相关。支持性证据来源于32名患有CBSDH的患者和25名同胞对照的案例-对照研究，其中与稍后的年岁中经治疗或不完全顺应治疗的患者相比，早期降低Hcy治疗与显著减少眼部并发症相关(参见El Bashir等人.《JIMD报告》2015；21:89-95，其以全文引用的方式并入本文中)。
到目前为止对具有钴胺素C缺陷症(其类似地通过较高tHcy水平表征)的25名患者的眼部结果的最大和最长的纵向研究，发现黄斑变性、视神经苍白、眼球震颤、斜肌和血管变化全部存在于大多数患者中。
CBSDH患者和一般人群中的大量研究证实了较高Hcy水平与多种眼部病症之间的关系(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Ajith,《临床化学学报》2015；450:316-321；Mulvihill等人.J AAPOS 2001；5:311-315；Wright等人.《眼》(伦敦)2008；22:989-993，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)，包括近视和晶状体错位(参见Yap S.《由于胱硫醚β-合成酶缺陷症引起的高胱氨酸尿症》.孤儿病百科全书[在线连载]2005；Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Martinez-Gutierrez等人.《国际眼科学》2011；31:227-232；Suri等人.《神经科学杂志》2014；347:305-309；Mulvihill等人.JAAPOS 2001；5:311-315；Lieberman等人.《美国眼科杂志》1966；61:252-255；Harrison等人.《眼科学》1998；105:1886-1890；Ramsey等人.《美国眼科杂志》1972；74:377-385；Couser等人.《眼科遗传学》2017；38:91-94；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)，虹膜震颤(参见Mulvihill等人.JAAPOS 2001；5:311-315，其以全文引用的方式并入本文中)，视网膜动脉硬化(参见Ghorbanihaghjo等人.《分子视觉》2008；14:1692-1697，其以全文引用的方式并入本文中)，年龄相关黄斑变性(参见Javadzadeh等人.《分子视觉》2010；16:2578-2584；Seddon等人.《美国眼科杂志》2006；141:201-203；Coral等人.《眼》(伦敦)2006；20:203-207；Axer-Siegel等人.《美国眼科杂志》2004；137:84-89，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)，年龄相关黄斑病变(AMD)(参见Heuberger等人.《美国临床营养学杂志》2002；76:897-902；Huang等人.《科学报告》2015；5:10585，其两者以全文引用的方式并入本文中)，白内障(参见Sen等人.《印度临床生物化学杂志》2008；23:255-257；Yousefi等人.《蛋白质和肽字母》2013；20:932-941，其两者以全文引用的方式并入本文中)，糖尿病视网膜病变(可能继发于肾病)(参见Looker等人.《糖尿病学(Diabetologia)》2003；46:766-772；Pusparajah等人.《生理学前沿》2016；7:200，其两者以全文引用的方式并入本文中)和由于视网膜血管阻塞或非动脉性缺血性视神经病变引起的黄斑性和视神经萎缩(参见Gerth等人.JAAPOS 2008；12:591-596；Stanger等人.《临床化学和检验医学》2005；43:1020-1025；Cahill等人.《美国眼科杂志》2003；136:1136-1150；Minniti等人.《欧洲眼科学杂志》2014；24:735-743；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
629名患有CBSDH的患者的回顾性研究发现，晶状体错位通常在两岁之后出现，并且截至六岁存在于约50％的未经治疗的吡哆醇无反应性患者中，并且截至10岁存在于50％的未经治疗的吡哆醇反应性患者中(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其以全文引用的方式并入本文中)。到目前为止对具有钴胺素C缺陷症(其类似地通过较高tHcy水平表征)的25名患者的眼部结果的最大和最长的纵向研究，发现黄斑变性、视神经苍白、眼球震颤、斜肌和血管变化全部存在于大多数患者中(参见Brooks等人.《眼科学》.2016年3月；123(3):571-82，其以全文引用的方式并入本文中)。
CBSDH患者和一般人群中的大量研究证实了较高Hcy水平与多种眼部病症之间的关系(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Ajith TA,Ranimenon.《临床化学学报》2015；450:316-321；Mulvihill等人.JAAPOS 2001；5:311-315；Wright等人.《眼》(伦敦)2008；22:989-993；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)，包括近视和晶状体错位(参见Yap S.《由于胱硫醚β-合成酶缺陷症引起的高胱氨酸尿症》.孤儿病百科全书[在线连载]2005；Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Martinez-Gutierrez等人.《国际眼科学》2011；31:227-232；Mulvihill等人.JAAPOS 2001；5:311-315；Sadiq等人.《眼科学研讨会》2013；28:313-320；Lieberman等人.《美国眼科杂志》1966；61:252-255；Harrison等人.《眼科学》1998；105:1886-1890；Ramsey等人.《美国眼科杂志》1972；74:377-385；Couser等人.《眼科遗传学》2017；38:91-94，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)，虹膜震颤(参见Mulvihill等人.J AAPOS2001；5:311-315，其以全文引用的方式并入本文中)，视网膜动脉硬化(参见Ghorbanihaghjo等人.《分子视觉》2008；14:1692-1697，其以全文引用的方式并入本文中)，年龄相关黄斑变性(参见Javadzadeh等人.《分子视觉》2010；16:2578-2584；Seddon等人.《美国眼科杂志》2006；141:201-203；Coral等人.《眼》(伦敦)2006；20:203-207；Axer-Siegel等人.《美国眼科杂志》2004；137:84-89；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)，年龄相关黄斑病变(AMD)(参见Heuberger等人.《美国临床营养学杂志》2002；76:897-902；Huang等人.《科学报告》2015；5:10585，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)，白内障(参见Sen等人.《印度临床生物化学杂志》2008；23:255-257；Yousefi等人.《蛋白质和肽字母》2013；20:932-941，其两者以全文引用的方式并入本文中)，糖尿病视网膜病变(可能继发于肾病)(参见Looker等人.《糖尿病学》2003；46:766-772；Pusparajah等人.《生理学前沿》2016；7:200，其两者以全文引用的方式并入本文中)和由于视网膜血管阻塞或非动脉性缺血性视神经病变引起的黄斑性和视神经萎缩(参见Gerth等人.J AAPOS 2008；12:591-596；Stanger等人.《临床化学和检验医学》2005；43:1020-1025；Cahill等人.《美国眼科杂志》2003；136:1136-1150；Minniti等人.《欧洲眼科学杂志》2014；24:735-743；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
研究Hcy水平与青光眼之间的相关性的研究提供不一致结果。一些展示Hcy水平与正常眼压性青光眼、假性表皮脱落性青光眼(PEXG)与原发性开角型青光眼(POAG)之间的正关系，而其它并未显示(参见Lieberman等人.《美国眼科杂志》1966；61:252-255；Turkcu等人.《医学》(考纳斯)2013；49:214-218；Vessani等人.《美国眼科杂志》2003；136:41-46；Leibovitch等人.《青光眼杂志》2003；12:36-39；Leibovitzh等人.“男性和女性中高半胱氨酸和眼内压之间的关系：一项基于人口的研究(Relationship between homocysteine andintraocular pressure in men and women:Apopulation-based study)”.《医学》(巴尔的摩)2016；95:e4858；Micheal等人.《分子视觉》2009；15:2268-2278；Clement等人.《青光眼杂志》2009；18:73-78；Cumurcu等人.《BMC眼科学》2006；6:6；Bleich等人.《神经传导杂志》(维也纳)2002；109:1499-1504；Lee等人.《当前眼科研究》2017；1-6；Wang等人.《美国眼科杂志》2004；137:401-406；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。然而，视网膜神经节细胞(RGC)的丧失-患有青光眼的个体中的常见观测结果-展示于患有由CBS基因缺失引起的内源性升高Hcy水平的小鼠中，表明青光眼与CBSDH患者中的升高tHcy水平之间的可能联系。(参见Ganapathy等人.《眼科研究与视力学》2009；50:4460-4470，其以全文引用的方式并入本文中)。
1.机制
已经提出许多机制来解释升高的Hcy水平对眼部健康的影响(参见Ajith TA,Ranimenon；《临床化学学报》2015；450:316-321，其以全文引用的方式并入本文中)。解释升高tHcy的作用的机制包括血管内皮功能减弱、视网膜神经节细胞的细胞凋亡、细胞外基质改变、赖氨酰氧化酶活性和氧化应激降低以及Hcy的直接细胞毒性和促炎性作用，其似乎促成晶状体混浊化和视神经损伤。
潜在机制还包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的活化，引起钙的细胞流入和增加的活性氧物质(ROS)产生，这两者都促成白内障形成。这些变化以及Hcy的直接细胞毒性作用可引起内皮损伤，其起始RGC的血栓形成和细胞凋亡，从而引起视网膜病变和青光眼。还已展示升高的Hcy水平增加不对称二甲基精氨酸(AMDA)的水平并且阻断一氧化氮合成酶(NOS)活性，从而通过降低一氧化氮(NO)水平引起血管收缩和视神经萎缩。最后，在血管壁上的均半胱氨酰化蛋白质的累积可以触发抗Hcy抗体产生和发炎反应，从而产生吞噬作用、氧化应激、RGC的细胞凋亡和细胞外基质(ECM)更改。这类变化一起损坏血管、晶状体蛋白质和视神经，最终引起视觉功能障碍。
在CBSDH患者中，晶状体错位被视为主要由纤维小带(尤其富含Cys的多结构域ECM蛋白质，如原纤蛋白1)的退行性变化引起(参见Sadiq等人.《眼科学研讨会》2013；28:313-320；Hubmacher等人.《生物化学》2011；50:5322-5332；Hubmacher等人.《生物化学杂志》2005；280:34946-34955；Hubmacher等人.《生物化学杂志》2010；285:1188-1198；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
在健康个体中，原纤蛋白-1内大量的结构域内二硫键的形成能够实现精确蛋白质折叠，对于结构完整性和功能来说是必不可少的。原纤蛋白-1股接着可形成股间二硫键，产生称为微纤维的高分子量多蛋白质组合件的组装(参见Kinsey等人.《细胞科学杂志(JCell Sci)》2008；121:2696-2704；Hubmacher等人.《美国国家科学院院刊》2008；105:6548-6553，其两者均以全文引用的方式并入本文中)。
此过程高度依赖于原纤蛋白-1与纤维结合蛋白之间的相互作用(参见Hubmacher等人.《生物化学》2011；50:5322-5332，其以全文引用的方式并入本文中)。微纤维形成用于沉积弹性蛋白原的骨架，一种形成弹性纤维的必要步骤，如发现于皮肤、肺、血管/动脉、韧带和眼睛中的那些弹性纤维(参见Hubmacher等人.《生物化学杂志》2010；285:1188-1198，其以全文引用的方式并入本文中)。原纤蛋白-1的重要性由患有马方综合症的患者示出，所述马方综合症为由原纤蛋白-1基因中的突变引起的病状，其中结缔组织功能障碍与症状如晶状体错位、器官脱垂、骨质疏松和关节活动过度相关(参见Suk等人.《生物化学杂志》2004；279:51258-51265；Collod-Beroud等人.《人类突变(Hum Mutat)》2003；22:199-208，其两者均以全文引用的方式并入本文中)。
体外研究展示向原纤蛋白-1添加Hcy破坏二硫键形成，其继而导致异常蛋白质折叠，增加对蛋白水解降解的敏感性和ECM和弹性纤维的异常形成(参见Hubmacher等人.《生物化学杂志》2010；285:1188-1198；Whiteman等人.《抗氧化剂与氧化还原信号(AntioxidRedox Signal)》2006；8:338-346，其两者均以全文引用的方式并入本文中)。对人类皮肤成纤维细胞添加Hcy还与次最优结合到原纤蛋白-1的纤维结合蛋白的减少形成相关联，由此防止微纤维形成(参见Hubmacher等人.《生物化学》2011；50:5322-5332；Hubmacher等人.《生物化学杂志》2010；285:1188-1198，其两者均以全文引用的方式并入本文中)。
除晶状体错位之外，患有CBSDH的患者中的小带纤维的退化还可导致增加的晶状体曲度、晶状体性近视、散光、视网膜脱落、斜视、白内障和虹膜震颤(参见Sadiq等人.《眼科学研讨会》2013；28:313-320，其以全文引用的方式并入本文中)。如果未经治疗，那么晶状体的前部错位可引起急性瞳孔阻滞性青光眼。在极端情况下，完全晶状体错位与增加的眼轴向长度相关联，可能是对模糊视觉的补偿反应(参见Mulvihill等人.JAAPOS 2001；5:311-315，其以全文引用的方式并入本文中)。
对通过国家NBS程序或通过临床呈现在1971年与1996年之间的爱尔兰中检测到的25个CBSDH病例进行回顾性研究，以检查降低Hcy疗法对临床结果的影响(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-747，其以全文引用的方式并入本文中)。大部分病例(24/25)为吡哆醇无反应性。因此，如果需要，大多数患者的治疗由无Met、Cys补充饮食及维生素B12和叶酸补充剂组成。患者在6周龄前开始治疗，并与在诊断后开始治疗的不同组别和一名从未治疗的对照患者进行比较。在6周龄之前经治疗的组别中，平均随访时间段为14.3岁(范围为2.5至23.4)，且对于其它患者则为14.7岁(范围为11.7至18.8)，产生总共365.7个患者年(patient-year)治疗。在通过NBS检测到的21名患者中，18名在治疗期间保持无并发症。在这些个体中，15/18具有20:20幻象且3/18在前两年期间具有增加的近视。
与Mudd等人的发现一致(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其以全文引用的方式并入本文中)，晚期诊断的个体中的晶状体错位在大约两岁时发生。在对疗法具有良好顺应性的早期治疗的个体中的任一个中未报告晶状体错位。‘早期治疗患者’中的三个(具有最高fHcy水平的那些患者)在无晶状体错位的情况下具有恶化近视，这最可能是因为此小群组患者中的相对较高的fHcy水平。这使得作者表明，渐进性近视可能是在晶状体错位之前不良饮食顺应性的第一病征，尽管患者主张相反。这些患者的恶化性近视突出显示这些患者的中性与阴性临床结果之间的平衡有多么不稳定。晚期检测到的患者都出现晶状体异位。这表明治疗可能延缓晶状体错位的开始而不是防止晶状体错位。
具有近视的患者中的生存期中值血浆fHcy水平比无近视的患者高(分别为18、18和48μmol/L对比11μmol/L)。在由NBS识别的在诊断后开始治疗的组中出现并发症的三个患者中，所有患者都不顺应其饮食。总的来说，6/24患者具有晶状体错位；其中两个患者具有早期诊断但不顺应其饮食，且四个患者具有晚期诊断，包括一个从未治疗的患者。与Mudd等人的发现一致(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其以全文引用的方式并入本文中)，晚期诊断个体(即在2岁之后呈现有并发症的患者)中的晶状体错位在约两岁时出现。在研究公布时，未由任何对治疗具有良好顺应性的早期治疗个体报告晶状体错位。
顺应性患者将其fHcy水平维持到tHcy等同水平，在很大程度上低于120μmol/L。然而，所有患者在公开时在24岁以内，且许多仍是儿科患者。已展示与蛋白质限制饮食的顺应性从青春期直至成人期快速降低。上文所描述的脆弱平衡表明由这些患者实现的tHcy水平的适度降低可以延缓症状的发作而非预防随这些患者年龄出现的症状。
这些结果(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-747；Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)由来自在Qatar中进行的类似案例对照研究的那些结果支持，所述研究报告在32个CBSDH病例和25名同胞对照中的结果，包括视觉障碍(参见El Bashir等人.《JIMD报告》2015；21:89-95，其以全文引用的方式并入本文中)。受试者的平均年龄是11.2岁(范围为0.6到29)并且56％是男性。总的来说，9/32名病例(28％)由NBS诊断并且在出生第一个月时治疗。其余在14与240个月龄之间被诊断。与临床上诊断的那些相比，通过NBS诊断的那些中的tHcy和Met水平显著较低。这可能归因于在生命早期与饮食和药物的更好顺应性。由NBS识别的9个病例中无一者在研究公布时具有视觉问题，与晚期诊断组(组之间p<0.001)相比，有18名(78％)。然而，类似于上文所描述的25名患者的爱尔兰研究，本研究中的患者在0.6到29岁的范围内，并且长期并发症也尚未得知。
对来自Yap和Naughten的数据(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-747，其以全文引用的方式并入本文中)与由Mudd等人产生的卡普兰-迈耶曲线的比较展示，具有晶状体错位和骨质疏松症的治疗顺应性‘早期治疗’患者的比例显著低于对于患有CBSDH的未经治疗患者所预期(p≤0.001)。
因此，增加的Hcy水平被视为在患有CBSDH的患者中和在一般人群中的眼部并发症，尤其晶状体错位的强且独立的风险因素(例如，如Yap等人.和Mudd等人.中所展示)。这突显了对于早期CBSDH诊断和治疗以及患者的治疗顺应性的需要。
B.骨骼并发症
CBSDH与骨质疏松性骨折的风险增加相关联，所述骨质疏松性骨折部分可归因于低骨矿物质密度(参见Mudd等人.和Weber等人.《分子遗传学和新陈代谢》2016；117:351-354；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
来自19名超过8岁的CBSDH患者的数据的回顾性病例回顾发现，低骨矿物质密度(BMD)在儿科和成人CBSDH患者之间是常见的(参见Weber等人.)。此研究表明，在儿童和青春期期间，即骨骼生长的关键时间段，CBSDH中的骨量增加是不足的，并可能对达到骨量峰值产生不利影响。此研究还突显，在儿童中，即使是仅比正常范围高出5倍的tHcy水平的中度升高的顺应饮食的患者，也已经受到不良骨骼临床后果的影响。
根据Mudd等人，80％的患有CBSDH的患者在30岁之前出现骨质疏松症。此外，较高的Hcy水平与骨质疏松性骨折的风险增加有关，甚至在不患有CBSDH的患者中也是如此(参见Sato等人.《骨(Bone)》2005,36:721-726；van Meurs等人.《新英格兰医学杂志》2004；350:2033-2041；McLean等人.《新英格兰医学杂志》2004；350:2042-2049；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
来自在2002年与2010年之间经历临床DXA骨密度测定的19名受试者(9名男性年龄为3.5到49.2岁)的数据的回顾性病例回顾发现，在儿科和成人CBSDH患者中，低BMD是常见的(参见Weber等人.《分子遗传学和新陈代谢》2016；117:351-354，其以全文引用的方式并入本文中)。在第一DXA扫描时，平均腰椎(LS)BMD Z评分为-1.2±1.3，且总髋BMD Z评分为-0.89±0.4；两者都显著低于0(一般人群中的预期平均Z评分)，其中分别p＝0.002和0.02。诊断时的LS BMD Z评分在年龄<21岁的患者中为-1.26±1.4并且在成人中为-1.06±1.1。总的来说，38％患者针对年龄而言具有低BMD(如由Z评分≤-2定义)。tHcy和Met水平在多个线性回归模型中都与LS BMD Z评分正相关(参见Weber等人.《分子遗传学和新陈代谢》2016；117:351-354，其以全文引用的方式并入本文中)。这些19名个体的平均tHcy水平仅是59.2μmol/L，并且19名患者的大部分是小儿。此研究表明，在儿童和青春期期间，即骨骼生长的关键时间段，CBSDH中的骨量增加是不足的，并可能对达到骨量峰值产生不利影响。此研究还突显，在儿童中，中度升高的tHcy水平仅比正常范围高出5倍的顺应饮食的患者，已经受到不良骨骼临床后果的影响。
先前研究已展现老龄人群中的Hcy水平与骨折风险之间的明显关系(参见Sato等人.《骨》2005,36:721-726；van Meurs等人.《新英格兰医学杂志》2004；350:2033-2041；McLean等人.《新英格兰医学杂志》2004；350:2042-2049；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。来自两项基于人群的前瞻性研究，包括2406名年龄≥55岁的受试者的结果展示，tHcy水平每增加一个SD，年龄和性别调整后的骨折风险就会增加30％(参见van Meurs等人.《新英格兰医学杂志》2004；350:2033-2041；其以全文引用的方式并入本文中)。高半胱氨酸水平在特定年龄的最高四分位数与骨折风险增加1.9倍有关。高半胱氨酸水平和骨折风险之间的关联似乎与骨矿物质密度和其它潜在的骨折风险因素无关。高半胱氨酸水平的增加是一般人群中年长男性和女性骨质疏松性骨折的强大且独立的风险因素，其量值类似于对于骨折和心血管疾病来说已确定的风险因素(参见van Meurs等人.《新英格兰医学杂志》2004；350:2033-2041；其以全文引用的方式并入本文中)。此外，一项对825名男性和1174名女性的美国前瞻性研究(HOPE-2试验子研究)发现，与最低四分位数的血清tHcy水平相比，最高四分位数的血清tHcy水平在女性当中与髋部骨折的风险增加1.9倍相关，并且在男性当中与风险增加四倍相关(参见Sawka等人.《内科医学档案(Arch Intern Med)》.2007年10月22日；167(19):2136-9，其以全文引用的方式并入本文中)。tHcy水平与骨折风险之间的相关性独立于BMD和骨折的其它潜在风险因素(参见van Meurs等人.《新英格兰医学杂志》2004；350:2033-2041；McLean等人.《新英格兰医学杂志》2004,350:2042-2049；Sawka等人.《内科医学档案》.2007年10月22日；167(19):2136-9；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
与这些结果一致，在433名年龄大于65岁的中风患者中的研究发现，每1000人-年髋部骨折的年龄调整发病率几乎呈线性增长，从Hcy水平最低四分位数的2.89到最高四分位数的27.87(参见Sato等人.《骨》2005；36:721-726，其以全文引用的方式并入本文中)。这些结果一起表明增加的Hcy水平是年长男性和女性的骨质疏松性骨折的强且独立的风险因素。
骨骼异常在出生时不存在且在婴儿和极年轻的儿童中是不寻常的(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其以全文引用的方式并入本文中)。骨骼受累的第一病征通常为膝外翻和弓形足，其中长骨的伸长-马方综合症的典型特征-通常在接近青春期时出现(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74；其以全文引用的方式并入本文中)。骨质疏松症，尤其是椎骨和长骨，在CBSDH患者中是常见的，且可导致脊柱侧凸/脊柱后凸和/或椎骨塌陷(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Weber等人.《分子遗传学和新陈代谢》2016；117:351-354；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。其它骨架表现可以包括由突出的上牙和高腭和前胸壁变形(如漏斗胸或鸡胸)引起的马方综合征面部特征(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74；Sweetser等人.《新英格兰医学杂志》2016；375:1879-1890；Brenton等人.《骨与关节外科杂志(J Bone Joint Surg Br)》1972；54:277-298；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。由于马方综合症与CBSDH之间的这些共有骨骼特征，CBSDH患者有时被错误地表征为马方患者。
一项对25名患有CBSDH的爱尔兰患者随访25年的研究发现，与非顺应性患者或晚期诊断的患者相比，在通过新生儿筛查识别的、具有良好降低Hcy治疗顺应性(饮食、维生素和/或甜菜碱)的患者中，骨质疏松症的风险显著较低(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-747)。对于这些结果的支持性证据来自五个具有良好长期代谢控制的CBSDH患者中的韩国小型研究。在此研究中，接受早期降低Hcy疗法的患者与经稍晚诊断的患者相比具有较少骨骼异常(参见Lim等人.《国际骨质疏松(Osteoporos Int)》2013,24:2535-2538，其以全文引用的方式并入本文中)。最后，在使用用于CBSDH的鼠类模型的研究中，通过用CBS ET处理的tHcy水平的正常化与骨质疏松症预防相关(参见Majtan等人.《酶替代物防止鼠类高胱氨酸尿症中的新生儿死亡、肝损伤和骨质疏松症(Enzyme replacementprevents neonatal death,liver damage,and osteoporosis in murinehomocystinuria)》,FASEB J 2017，其以全文引用的方式并入本文中)。
在患有CBSDH的患者中引起低BMD和骨骼脆弱性的精确机制未完全理解(参见Weber等人.《分子遗传学和新陈代谢》2016；117:351-354；Lim JS,Lee DH.“具有CBS缺陷症引起控制良好的高胱氨酸尿症的儿童的骨矿物质密度和身体组成的变化(Changes inbone mineral density and body composition of children with well-controlledhomocystinuria causedby CBS deficiency)”.《国际骨质疏松》2013；24:2535-2538，其两者均以全文引用的方式并入本文中)。然而，患有CBSDH的患者中的许多结缔组织病症类似于马方综合症(由原纤蛋白-1基因中的突变引起的结缔组织病症且特征在于包括长骨伸长和骨质疏松性骨折的特征)中所见的那些(参见Hubmacher等人.《生物化学》2011；50:5322-5332；Hubmacher等人.《生物化学杂志》2010；285:1188-1198，其两者均以全文引用的方式并入本文中)。认为升高的Hcy水平经由两种不同途径导致骨骼脆弱性和骨折(参见Behera等人.《细胞生理学杂志(J Cell Physiol)》2016，其以全文引用的方式并入本文中)。第一途径经由受损的原纤蛋白组合件引起儿童和青春期期间的骨量增加减少。第二种途径导致骨骼重塑受损，经由减少的胶原蛋白交联形成导致骨骼脆性(参见Behera等人.《细胞生理学杂志》2016；Kang等人.《临床研究杂志》1973；52:2571-2578，其两者以全文引用的方式并入本文中)。这些数据一起表明，在儿童和青春期期间，即骨骼生长的关键时间段，患有CBSDH的患者中的骨量增加是不足的，并且此对达到骨量峰值产生不利影响。
此外，在老年人群中，在Hcy水平与骨折风险之间存在强关系(参见Sato等人.《骨》2005；36:721-726；van Meurs等人.《新英格兰医学杂志》2004；350:2033-2041；McLean等人.《新英格兰医学杂志》2004；350:2042-2049；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。来自两项基于人群的国际前瞻性研究，包括2,406名年龄大于或等于55岁的受试者的结果展示，高半胱氨酸水平在特定年龄的最高四分位数与骨折风险增加1.9倍有关(参见van Meurs等人.《新英格兰医学杂志》2004；350:2033-2041，其以全文引用的方式并入本文中)。增加的高半胱氨酸水平是一般人群中的年长男性和女性的骨质疏松性骨折的强且独立的风险因素，其量值类似于对于骨折(低骨矿物质密度、认知障碍近期下降)和心血管疾病来说确立的风险因素(参见van Meurs等人.《新英格兰医学杂志》2004；350:2033-2041，其以全文引用的方式并入本文中)。此外，一项对1,999名受试者的美国前瞻性研究(HOPE-2试验子研究)发现，与最低四分位数的血清tHcy水平相比，最高四分位数的血清tHcy水平在女性当中与髋部骨折的风险增加1.9倍相关，并且在男性当中与风险增加四倍相关(参见Sawka等人.《内科医学档案》.2007年10月22日；167(19):2136-9，其以全文引用的方式并入本文中)。tHcy水平与骨折风险之间的相关性独立于BMD和骨折的其它潜在风险因素(参见van Meurs等人.《新英格兰医学杂志》2004；350:2033-2041；McLean等人.《新英格兰医学杂志》2004；350:2042-2049；Sawka等人.《内科医学档案》.2007年10月22日；167(19):2136-9，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。与这些结果一致，在433名年龄>65岁的中风患者中的研究发现，每1000人-年髋部骨折的年龄调整发病率几乎呈线性增长，从Hcy水平最低四分位数的2.89到最高四分位数的27.87(参见Sato等人.《骨》2005；36:721-726，其以全文引用的方式并入本文中)。这些结果一起表明增加的Hcy水平是年长男性和女性的骨质疏松性骨折的强且独立的风险因素。
在患有CBSDH的患者中引起低BMD和骨骼脆弱性的精确机制未完全理解(参见Weber等人.《分子遗传学和新陈代谢》2016；117:351-354；Lim JS,Lee DH.“具有CBS缺陷症引起控制良好的高胱氨酸尿症的儿童的骨矿物质密度和身体组成的变化”.《国际骨质疏松》2013；24:2535-2538，其两者以全文引用的方式并入本文中)。然而，患有CBSDH的患者中的许多结缔组织病症类似于马方综合症(由原纤蛋白-1基因中的突变引起的结缔组织病症且特征在于包括长骨伸长和骨质疏松型骨折的特征)中所见的那些(参见Brenton等人.《骨与关节外科杂志》1972；54:277-298；Hubmacher等人.《生物化学》2011；50:5322-5332；Hubmacher等人.《生物化学杂志》2010；285:1188-1198，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
在健康个体中，原纤蛋白-1连同胶原蛋白和弹性蛋白聚合物一起组装以形成ECM，即用于骨形成、稳态和修复的架构骨架(参见Olivieri等人.《纤维生成组织修复(Fibrogenesis Tissue Repair)》2010；3:24，其以全文引用的方式并入本文中)。研究展示，较高的tHcy水平可引起原纤蛋白-1片段的结构修饰，其阻止多聚化并且导致原纤蛋白-1降解(参见Hubmacher等人.《生物化学杂志》2005；280:34946-34955；Hubmacher等人.《生物化学杂志》2010；285:1188-1198，其两者以全文引用的方式并入本文中)。此过程通过纤维结合蛋白的均半胱氨酰化来进一步减弱，这防止对于原纤蛋白-1多聚化所需的纤维结合蛋白-原纤蛋白复合物的形成(参见Hubmacher等人.《生物化学》2011；50:5322-5332，其以全文引用的方式并入本文中)。此类发现表明升高的Hcy水平对ECM形成具有不利影响。
在健康个体中，经由转化生长因子-β(TGF-β)和骨形态发生蛋白质(BMP)的存储和活化，原纤蛋白组合件(即微纤维)在骨矿化中起重要作用。(参见Nistala等人.《纽约科学院年报(AnnNYAcad Sci)》2010；1192:253-256；Nistala等人.《生物化学杂志》2010；285:34126-34133，其两者以全文引用的方式并入本文中)。TGF-β和BMP的减弱活化可潜在地促成在马方综合症和CBSDH两者中观察到的骨骼表型，且还可降低骨矿物质含量，如在轻度形式的CBSDH中观察到的(参见Herrmann等人.《临床化学》2005；51:2348-2353，其以全文引用的方式并入本文中)。此外，存在体内和体外证据，表明Hcy可经由减少的胶原蛋白交联形成而减弱骨强度(参见Kang等人.《临床研究杂志》1973；52:2571-2578，其以全文引用的方式并入本文中)。这些数据一起表明，在儿童和青春期期间，即骨骼生长的关键时间段，患有CBSDH的患者中的骨量增加是不足的，并且此对达到骨量峰值可产生不利影响。
除了其对骨沉积的作用之外，升高的Hcy水平通过增加破骨细胞(OC)活性和减小成骨细胞(OB)活性而增加骨重塑的速率(参见Behera等人.《细胞生理学杂志》2016；Herrmann等人.《临床化学》2005；51:2348-2353；Vacek等人.《临床化学和检验医学》2013；51:579-590；Vijayan等人.《内分泌学杂志(J Endocrinol)》2017；233:243-255，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。OB与OC活性之间的不平衡可导致脆性骨和骨折的发生率增加。认为引起Hcy介导的OB活性降低的机制包括减少的骨血流量(减少的NO可用性的结果)(参见Tyagi等人.《血管健康与风险管理(Vasc Health RiskManag)》2011；7:31-35，其以全文引用的方式并入本文中)和OB细胞凋亡的增加速率(图2和表14)(参见Behera等人.《细胞生理学杂志》2016；Kim等人.《骨》2006；39:582-590，其两者以全文引用的方式并入本文中)。认为产生增强的OC活性的机制包括增加的细胞内ROS水平，其经由增加的基质金属蛋白酶(MMP)活性(参见Vacek等人.《临床化学和检验医学》2013；51:579-590，其以全文引用的方式并入本文中)和抑制OC细胞凋亡(参见Behera等人.《细胞生理学杂志》2016；Herrmann等人.《临床化学》2005；51:2348-2353；Koh等人.《骨与矿物研究杂志(J BoneMiner Res)》2006；21:1003-101，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)来增强OC分化和OC活性两者。实际上，馈入高Hcy饮食的CD1小鼠的最近研究展示短期(7天)Hcy施用与组织矿物质密度(TMD)损失和增加的OC数相关，而长期Hcy施用(30天)引起OC重新编程、细胞凋亡和矿化，其恢复TMD但受损组织生物力学特性(参见Vijayan等人.《内分泌学杂志》2017；233:243-255，其以全文引用的方式并入本文中)。
因此，升高的Hcy水平可以经由两种不同途径导致骨骼脆弱性和骨折(参见Behera等人.《细胞生理学杂志》2016，其以全文引用的方式并入本文中)。第一途径经由ECM的形成受损和与TGF-β和BMP相关的原纤蛋白-1的抑制活化导致儿童和青春期期间的骨量的增加减少。第二途径经由增加的OC和减少的OB活性导致减弱的骨重塑，产生脆性骨。
升高的Hcy水平与骨微环境中的氧化应激增加有关。增加的ROS诱导成骨细胞凋亡，从而减少成骨细胞发生。氧化应激的此增加进一步经由产生过氧化物阴离子而减少NO可用性，这也可能减少骨血流和血管生成。由此过程产生的ROS通过单核细胞融合活化破骨细胞发生，进一步促成BMD的损失，从而导致骨质疏松。
最近在新生的CBS基因敲除(KO)小鼠(在无Met限制的情况下基于标准啮齿动物食物维持)中进行的一项研究发现，使用重组PEG化人类截短的CBS(PEG-CBS)皮下施用CBS ET5个月，防止了这些动物的骨矿物质密度下降，并且还可以使后来接受治疗的动物中的这些值正常化(参见Majtan等人.《酶替代物防止鼠类高胱氨酸尿症中的新生儿死亡、肝损伤和骨质疏松症》.FASEB J 2017，其以全文引用的方式并入本文中)。在此研究中，防止表征KO模型和CBSDH患者两者的身体组成的变化。在血浆和组织两者中，tHcy和Cys水平正常化，Cth水平增加且SAM/SAH比率改进。
对于降低Hcy对骨骼结果的影响的支持性证据来源于25名患有CBSDH的爱尔兰患者的25年调查(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-747，其以全文引用的方式并入本文中)。在此研究中，骨质疏松症(通过放射学检查而非DXA诊断)存在于由NBS识别的三个治疗非顺应性患者中的一者中，且存在于具有晚期诊断(在两岁时)的四个患者中的一者中。在18名已顺应早期治疗(从6周龄开始)的患者中，没有人展示骨质疏松症的病征。
在韩国在五名CBSDH患者(3名男孩及3名女孩)中进行小型研究，所有患者在幼年(NBS期间有3名及7岁时有2名)时被诊断，具有3.4年的良好代谢控制(参见Lim等人.《国际骨质疏松》2013；24:2535-2538，其以全文引用的方式并入本文中)。诊断时的平均血浆tHcy水平为34.3±52.6(13至78.6)μmol/L。血浆Met为716±1347.6(24.3至1566)μmol/L并且治疗包含具有吡哆醇、甜菜碱和叶酸补充的低Met饮食。对于所有患者的身体组成测量值和BMD在韩国人群的正常范围内，并且随时间推移在骨骼形态中未观察到显著变化。三个患者(60％)具有T-L脊柱的轻度脊柱侧凸(柯布(Cobb)角7.3°、7.6°和10.3°)，且三个患者报告骨折四次。其中，两个由运动损伤引起，且一个由交通事故引起。通过射线照相检测腰椎的轻度压缩骨折的两个病例，并且记录严重背部疼痛的病史。接受早期诊断的患者与具有稍晚诊断的患者相比展示出更少的骨骼异常。然而，此研究展示即使接受NBS早期诊断、顺应饮食治疗并且仅具有轻微到中度升高tHcy水平的患者，作为儿童时也已经显示骨骼异常和多次骨折。
这些发现一起表明早期降低Hcy治疗对患有CBSDH的患者的骨骼结果的有益作用。应注意，在治疗顺应性患者中，tHcy水平降低但未正常化，并且尽管这些患者中存在较少骨骼异常，但在这个主要是年轻的患者群组中注意到了显著负面临床后果(骨质疏松症和骨折)。
C.血管并发症
在1985年，在患有因纯合CBSDH所致的中等到重度升高Hcy水平的患者中，在流行病学研究中，首次证实CBSDH与血管疾病之间的关系。(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其以全文引用的方式并入本文中)。
血栓栓塞为CBSDH患者的发病和过早死亡的主要起因(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Karaca等人.《基因(Gene)》2014；534:197-203；Yap S.《遗传代谢疾病杂志》2003；26:259-265，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。具有未经治疗CBSDH的患者中的血栓栓塞事件的总速率为约10％/年(参见Cattaneo M.《血栓形成和止血研讨会(Semin Thromb Hemost)》2006；32:716-723，其以全文引用的方式并入本文中)，其中在手术之后和在妊娠期间或紧接在妊娠之后风险增加(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Novy等人.《血栓形成和止血(Thromb Haemost)》2010；103:871-873，其两者以全文引用的方式并入本文中)。血栓栓塞可影响任何血管，但静脉血栓形成(尤其CSVT)比患有CBSDH的患者中的动脉血栓形成更常见(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Karaca等人.《基因》2014；534:197-203；Eslamiyeh等人.《伊朗儿童神经病学杂志(Iran J Child Neurol)》2015；9:53-57；Saboul等人.《儿童神经病学杂志(JChildNeurol)》2015；30:107-112，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。已经在婴儿中描述脑血管事故，尤其CSVT(参见Mahale等人.《儿科神经科学杂志(J PediatrNeurosci)》.2017年4月-6月；12(2):206-207，其以全文引用的方式并入本文中)，但更通常呈现于年轻的成人中(参见Yap等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》2001；21:2080-2085，其以全文引用的方式并入本文中)。
血栓栓塞事件的风险截至16岁为约25％并且截至29岁为50％。在1999年，Hankey等人报告HCU的所有三个遗传起因(CBSDH、MTHFR缺陷症和维生素B12缺陷症)都与过早心血管(CV)疾病的高风险相关，从而影响截至30岁的所有纯合体的一半(参见Hankey等人.《柳叶刀(Lancet)》1999；354:407-413，其以全文引用的方式并入本文中)。所有三种病症所常见的唯一生物化学变化是血清Hcy水平升高(通常大于100μmol/L)(参见Faeh等人.《瑞士医学周刊(Swiss MedWkly)》2006；136:745-756，其以全文引用的方式并入本文中)。若干报告描述了降低tHcy水平的治疗如何在CBSDH患者中显著地减少血管事件的发生率、主要发病原因(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》2001；24:437-447；Wilcken DE,Wilcken B.《高胱氨酸尿症中血管疾病的天然病史和治疗作用(The natural history ofvascular diseasein homocystinuria and the effects oftreatment)》.《遗传代谢疾病杂志》1997；20:295-300，其两者以全文引用的方式并入本文中)。此后，许多其它研究证实了在CBSDH患者中血管事件(尤其静脉血栓形成)的增加的风险。(参见Karaca等人.《基因》2014；534:197-203；Kelly等人.《神经病学》2003；60:275-279；Lussana等人.《血栓形成研究(ThrombRes)》2013；132:681-684；Magner等人.《遗传代谢疾病杂志》2011；34:33-37，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
升高的血浆tHcy水平是患有冠状动脉疾病的患者中在患有和不患有CBSDH情况下的血管疾病的风险因素，以及死亡率的强预测因子。(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Karaca等人.《基因》2014；534:197-203；Kelly等人.《神经病学》2003；60:275-279；Faeh等人.《瑞士医学周刊》2006；136:745-756；Boushey等人.《JAMA》1995；274:1049-1057；Clarke R等人.《JAMA》2002；288:2015-2022；Hankey等人.《柳叶刀》1999；354:407-413；Khan等人.《中风(Stroke)》2008；39:2943-2949；Graham等人.“欧洲协同行动项目(The European ConcertedAction Project)”.《JAMA》1997；277:1775-1781；Clarke等人.《新英格兰医学杂志》1991；324:1149-1155；Clarke等人.《爱尔兰医学科学杂志(Ir JMed Sci)》1992；161:61-65；Woodward等人.《凝血和纤维蛋白溶解症(Blood CoagulFibrinolysis)》2006；17:1-5；Refsum等人.《年度医学评论(Annu Rev Med)》1998；49:31-62；Yoo等人.《中风》1998；29:2478-2483；Selhub等人.《新英格兰医学杂志》1995；332:286-291；Wald等人.《BMJ》2002；325:1202；Bautista等人.《临床流行病学杂志(J ClinEpidemiol)》2002；55:882-887；Brattstrom等人.《动脉粥样硬化(Atherosclerosis)》1990；81:51-60；Lussana等人.《血栓形成研究》2013；132:681-684；Casas等人.《柳叶刀》2005；365:224-232；McCully KS.《美国病理学杂志(Am J Pathol)》1969；56:111-128；Magner等人.《遗传代谢疾病杂志》2011；34:33-37；Wilcken等人.《临床研究杂志》1976；57:1079-1082；Nygard等人.《新英格兰医学杂志》1997；337:230-236；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。尽管存在tHcy水平与CV风险之间的关系的证据(参见Boushey等人.《JAMA》1995；274:1049-1057，其以全文引用的方式并入本文中)，tHcy与中风/周边动脉疾病之间的关系显著更强(参见Clarke等人.《JAMA》2002；288:2015-2022；Khan等人.《中风》2008；39:2943-2949；Wald等人.《BMJ》2002；325:1202；Casas等人.《柳叶刀》2005；365:224-232；Brattstrom等人.《止血(Haemostasis)》1989；19增刊1:35-44；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。尽管一般人群中的大型研究(NORVIT、HOPE-2、VITATOPS)最初得出结论，降低的Hcy水平对主要血管事件和复发性心血管疾病具有微小作用，但数据的进一步更具体的分析已清楚地展示tHcy降低对于中风的临床益处。
存在相当大的证据表明，降低Hcy减少具有轻度升高tHcy水平的总人群中的中风风险(参见Saposnik等人.《中风》2009；40:1365-1372；Huo等人.《JAMA》2015；313:1325-1335；Lonn等人.《新英格兰医学杂志》2006；354:1567-1577；Hankey等人.《柳叶刀神经病学(Lancet Neurol)》2012；11:512-520；Spence JD,《柳叶刀神经病学》.2007年9月；6(9):830-8，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。在5,552名患者的HOPE-2研究中(参见Saposnik等人.《中风》2009；40:1365-1372，其以全文引用的方式并入本文中)，tHcy水平(3mmol/L相对于安慰剂)的微小降低导致中风发生率的显著降低(27％的相对风险降低，1.3％绝对风险降低)，表明甚至较小的tHcy水平降低可能是有益的。在基线Hcy处于第三四分位数的具有4.3％绝对风险降低的患者中，此作用最明显。尽管Hcy降低是否影响轻度升高的tHcy和不患有CBSDH的患者中的整体CV结果是不明确的(参见Marti-Carvajal等人.《Cochrane系统评价数据库》2015；1:CD006612，其以全文引用的方式并入本文中)，其血管益处已在患有CBSDH的患者中一致地证实。(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-747；Eslamiyeh等人.《伊朗儿童神经病学杂志》2015；9:53-57；Saboul等人.《儿童神经病学杂志》2015；30:107-112；Yap等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》2001；21:2080-2085；Woods等人.《BMJ病例报告(BMJ Case Rep)》2017；Wilcken等人.《遗传代谢疾病杂志》1997；20:295-300；Yap等人.《血栓形成和止血研讨会》2000；26:335-340；Ruhoy等人.《小儿神经科(PediatrNeurol)》2014；50:108-111，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
1.机制
许多研究已展示，较高Hcy水平有助于通过氧化应激有关机制出现动脉粥样硬化或血栓形成(参见Faverzani等人.《细胞和分子神经生物学(Cell Mol Neurobiol)》2017；Nowak等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》2017；37:e41-e52；Vanzin等人.《分子遗传学和新陈代谢》2011；104:112-117；Vanzin等人.《基因》2014；539:270-274；Vanzin等人.《细胞和分子神经生物学》2015；35:899-911；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)，包括经由NF-κB的发炎和免疫活化(参见Rodriguez-Ayala等人.《动脉粥样硬化(Atherosclerosis)》2005；180:333-340；van Guldener等人.《当前高血压报告(CurrHypertens Rep)》2003；5:26-31，其两者以全文引用的方式并入本文中)。相信引起血栓形成的内侧损伤由以下引起：Hcy介导的内皮功能不全(参见Jiang等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》2005；25:2515-2521；Hossain等人.《生物化学杂志》2003；278:30317-30327；Cai等人.《血液(Blood)》2000；96:2140-2148；Zhang等人.《生物化学杂志》2001；276:35867-35874；Papapetropoulos等人.《美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad Sci USA)》2009；106:21972-21977；Szabo等人.《英国药理学杂志(Br J Pharmacol)》2011；164:853-865；Chiku等人.《生物化学杂志》2009；284:11601-11612；Wang等人.《抗氧化剂与氧化还原信号(AntioxidRedox Signal)》2010；12:1065-1077；Saha等人.《FASEB J》2016；30:441-456；Ebbing等人.《JAMA》2008；300:795-804；Bonaa等人.《新英格兰医学杂志》2006；354:1578-1588；Marti-Carvajal等人.《Cochrane系统评价数据库》2015；1:CD006612；Celermajerl等人.《美国心脏病学院杂志(JAm Coll Cardiol)》1993；22:854-858；Rubba等人.《代谢(Metabolism)》1990；39:1191-1195；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)，增强的凝血路径(参见Spence JD.《国际中风杂志(Int JStroke)》.2016年10月；11(7):744-7；Fryer等人.《动脉硬化与血栓形成(Arterioscler Thromb)》1993；13:1327-1333；Lentz等人.《临床研究杂志》1991；88:1906-1914；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)和增加的血管扩张。此类促血栓形成机制类似于马方患者中所观察到的那些机制(参见Kelly等人.《神经学(Neurology)》2003；60:275-279；Tripathi P.《国际心血管论坛杂志(International Cardiovascular Forum J)》2016；6:13；van Guldener等人.《当前高血压报告(Curr Hypertens Rep)》2003；5:26-31；Hackam等人.《JAMA》2003；290:932-940；Baumbach等人.《循环研究(Circ Res)》2002；91:931-937；Evangelisti等人.《国际心脏病学杂志(Int J Cardiol)》2009；134:251-254；de Valk等人.《中风》1996；27:1134-1136，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
源自27种研究(多于4,000名患者)的数据的元分析的tHcy水平与CV风险之间的病因关系展示CV、脑血管和外周血管的动脉粥样硬化的分级风险，使得Hcy的5μm增加赋予女性80％增加的风险，且赋予男性60％增加的风险(参见Boushey等人.《JAMA》1995；274:1049-1057，其以全文引用的方式并入本文中)。来自涉及5073例缺血性心脏病(IHD)事件和1113例中风的30种前瞻性或回顾性研究的数据的元分析发现，低于常见(针对回归稀释偏倚校正)Hcy水平(大致3μmol/L)25％与低11％(比值比(OR)，0.89；95％CI，0.83到0.96)的IHD风险和低19％(OR，0.81；95％CI，0.69到0.95)的中风风险相关(参见Clarke R等人.《JAMA》2002；288:2015-2022，其以全文引用的方式并入本文中)。
一项对患有和不患有预先存在的血管疾病的患者的研究表明，在负载Met后，1/21名患有MI的受试者(5％)、14/37名患有主动脉-髂动脉疾病的受试者(38％)和17/53名患有脑血管疾病的受试者(32％)的血浆Hcy增加(超过可比的健康对照受试者中的最高值)。这表明Hcy水平与周边动脉疾病(PAD)及中风之间的联系显著大于Hcy水平与MI之间的联系(参见Brattstrom等人.《止血》1989；19增刊1:35-44，其以全文引用的方式并入本文中)。在457名中风患者和179名来自同一社区的对照受试者的英国群组中进行的一项前瞻性研究中，描述了Hcy水平和中风之间的独立、分级联系。(参见Khan等人.《中风》2008；39:2943-2949)。在患有小血管疾病(SVD)的患者中看到最高Hcy水平(16.2对比无中风的对照受试者中的11.8μmol/L，在调整年龄、性别、血管风险因素、维生素水平和肾功能后p<0.001)。在SVD病例中，在患有腔隙性脑梗死及融合性脑白质疏松症的个体中观察到最高Hcy水平。此外，Hcy水平与脑白质疏松症严重程度之间存在相关性(r＝-0.225；p<0.001)。
这些发现进一步由孟德尔(Mendelian)随机分组研究支持，表明调节Hcy代谢的MTHFR多态性和中风风险之间的遗传相关性(参见Casas等人.《柳叶刀》2005；365:224-232，其以全文引用的方式并入本文中)。对所有关于Hcy水平和MTHFR TT和CC多态性对中风风险的关联的相关研究进行文献检索，发现了111项研究，包括15,635名不具有心血管疾病(CVD)的个体。TT与CC纯合体之间的Hcy水平的加权平均差异为1.93μmol/L(95％CI 1.38到2.47)。基于来自对前瞻性研究的先前元分析的结果，在所述研究中，血浆Hcy水平增加5μmol/L对应的中风OR为1.59(1.29至1.96)，具有TT基因型的健康个体中Hcy水平增加1.93μmol/L将导致中风的预期OR为1.20(1.10至1.31)(参见Wald等人.《BMJ》2002；325:1202，其以全文引用的方式并入本文中)。与此结果一致，对于TT对比CC纯合体，Khan等人报告对于中风的1.26(1.14到1.40)OR(p＝0.29)，无关于年龄组、种族或地理位置。这些结果一起表明，在一般人群中，升高Hcy水平在中风发病机制中起着致病作用。
在患有杂合CBSDH的患者中，血清Hcy的适度增加是否因血管疾病而典型，已在比在一般人群中进行的研究小得多的研究中进行了考察。根据Mudd等人，由于杂合CBSDH而具有轻度升高tHcy水平(截至年龄50岁<5％)的患者的血管事件风险类似于一般人群中的血管事件风险。(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1981；33:883-893，其以全文引用的方式并入本文中)。与此一致，在患有纯合和杂合CBSDH的个体中的超声研究发现在年龄为四年时纯合儿童的全身性动脉中的内皮功能减弱，而内皮功能在杂合成人中很大程度上不受影响。(参见Celermajer等人.《美国心脏病学院杂志(JAm Coll Cardiol)》1993；22:854-858，其以全文引用的方式并入本文中)。
尽管类似研究展现纯合体和杂合体两者中过早动脉疾病的病征，但具有纯合病症的个体在年轻得多的年龄(19岁对比45岁)时出现病征并且疾病严重程度显著更大(参见Rubba等人.《代谢》1990；39:1191-1195，其以全文引用的方式并入本文中)。
总的来说，CBSDH患者中的观察结果与来自先前研究的那些结果一致，其中血管风险随着Hcy水平增加而增加(参见Boushey等人.《JAMA》1995；274:1049-1057；Clarke等人.《JAMA》2002；288:2015-2022；Khan等人.《中风》2008；39:2943-2949；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
这些结果表明升高的Hcy水平为CV疾病的风险因素。此外，已展示降低Hcy水平显著降低一般人群和患有CBSDH的患者中的中风风险。
研究已展示由CBSDH引起的较高Hcy水平可潜在地促成经由各种机制的动脉粥样硬化和/或血栓形成的发展。这些包括分子事件，如诱导氧化应激和其下游作用，如活化NF-κB(活化B细胞的核因子κ-光链增强剂)、调控促炎性的转录因子和其它损伤相关基因。调节血管壁的生理-化学特性的各种Hcy介导的作用，如引起内皮功能异常或动脉僵硬的那些，可促成高血压、血栓形成或其它血管异常的发展。最后，存在证据表明通过Hcy直接诱导凝血途径，一种引起血栓形成的更直接路径(参见Faverzani等人.《细胞和分子神经生物学》2017；Hainsworth等人.《生物化学与生物物理学学报》2016；1862:1008-1017；Ganguly等人.《营养杂志(Nutr J)》2015；14:6；Tripathi P.“高半胱氨酸在心血管疾病中的分子和生物化学方面(Molecular and biochemical aspects of homocysteine incardiovascular diseases)”.《国际心血管论坛杂志(International CardiovascularForum J)》2016；6:13；Fryer等人.《动脉硬化与血栓形成(Arterioscler Thromb)》1993；13:1327-1333；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。在动脉粥样硬化的分子和生物化学机制的简要描述之后，以下子部分将评述在具有较高tHcy水平的个体(包括患有CBSDH的个体)中产生血管疾病的潜在机制。
2.动脉粥样硬化
在引起血栓形成并且因此引起血管阻塞的最充分研究的病状中，为动脉粥样硬化，一种影响冠状动脉、脑循环和外周循环的进行性发炎疾病(参见Libby等人.《循环》2005；111:3481-3488，其以全文引用的方式并入本文中)。在其早期，血管损伤导致内皮细胞(EC)活化，单核细胞募集到内膜中和巨噬细胞活化。形成发炎动脉粥样硬化损伤(脂纹)，其包含单核细胞衍生的满载脂质巨噬细胞(泡沫细胞)和T淋巴细胞。渐进性脂质累积形成由纤维帽包围的脂质核心。在后期期间，活化巨噬细胞分泌减弱纤维帽的酶，引起斑块破裂、出血或血栓形成和缺血性发作/急性冠脉综合征。斑块破裂使组织因子暴露于动脉内腔内的血液，允许其与凝血因子VII/VIIa形成复合物。此过程引发凝血瀑布(coagulationcascade)，引起血栓形成。断裂的斑块可引起壁血栓形成或闭塞性血栓形成，分别引起部分或完全堵塞。壁血栓形成造成缺血性症状，如不稳定心绞痛，而闭塞性血栓形成导致急性冠状动脉事件，如MI和中风。细胞因子参与动脉粥样硬化的所有阶段并且对其发病机理具有深远影响(参见Ramji等人.《细胞因子和生长因子综述(Cytokine Growth Factor Rev)》2015；26:673-685，其以全文引用的方式并入本文中)。除继发于动脉粥样硬化以外，还可以在不存在斑块形成的情况下活化血栓形成，例如，作为心房颤动或通过直接活化凝血瀑布的结果。
3.氧化应激
在具有较高Hcy水平的患者中的研究展示，经治疗的患者和尤其未经治疗的患者容易发生氧化应激，如由各种组织中反映脂质、蛋白质和DNA氧化损伤的更改的生物标记物所证明(参见Vanzin等人.《分子遗传学和新陈代谢》2011；104:112-117；Vanzin等人.《基因》2014；539:270-274；Vanzin等人.《细胞和分子神经生物学》2015；35:899-911，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。被定义为氧化还原内稳定中不平衡的氧化应激在如动脉粥样硬化和其相关血栓形成的此类血管病变中起关键作用，其中涉及低密度脂蛋白的氧化改性、内皮活化和血管发炎反应的起始(参见Nowak等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》2017；37:e41-e52，其以全文引用的方式并入本文中)。氧化应激可以由ROS(例如过氧化物(O2-)和羟基(HO-)基团和过氧化氢(H2O2))的水平增加和/或由组织抗氧化剂(例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化酶)的水平降低引起(参见Faverzani等人.《细胞和分子神经生物学》2017；Nowak等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》2017；37:e41-e52，其两者以全文引用的方式并入本文中)。在健康个体中，ROS产生为正常氧化代谢的副产物。然而，另外，ROS产生由此类CV风险因素触发，如香烟烟雾、酒精消耗、高胆固醇血症、高血压、糖尿病和升高Hcy水平。
一些先前论述，在分子水平下，存在许多方式：Hcy可引起增加的氧化应激。举例来说，在血管壁中的免疫原性均半胱氨酰化蛋白质的累积可能促成发炎，并且因此，促成由活化的吞噬细胞产生ROS(O2-)。另一个潜在机制为NMDA受体的Hcy诱导的活化，触发引起ROS产生的信号传导途径。在心脏微血管EC中，Hcy诱导NADPH氧化酶、尤其在活化细胞中产生高水平O2-的细胞表面酶的水平增加。最近研究(参见Chen等人.《科学报告》.2017年7月31日；7(1):6932，其以全文引用的方式并入本文中)表明，在缺血性大鼠脑部中，Hcy诱导线粒体功能障碍，预期结果为增加ROS产生。还认为Hcy降低有益血管舒张剂NO的生物可用性。O2-与NO反应产生反应性氮物质过氧亚硝酸盐，并且实际上，还已报告Hcy诱导的酪氨酸硝化(一种过氧亚硝酸盐诱导的蛋白质损伤的指标)的增加。(参见Tyagi等人.《血管健康与风险管理(Vasc Health RiskManag)》2011；7:31-35，其以全文引用的方式并入本文中)。更广泛地，预期涉及Hcy的硫醇-硫醇相互作用将干扰细胞氧化还原状态，例如潜在地降低减少的谷胱甘肽的可用性并且甚至损害蛋白质组装和折叠。
在治疗之前和治疗之后CBSDH患者的研究中，用吡哆醇、叶酸、甜菜碱和维生素B12补充剂进行治疗减弱患者中的脂质氧化损伤，但不改变硫氢基含量或总抗氧化状态(组织抗氧化能力的两种指标)。但是，硫氢基含量与Hcy水平之间存在显著的负相关性，并且脂质过氧化产物丙二醛水平与Hcy水平之间存在正相关性。这表明在CBSDH中观察到的氧化性损伤中的Hcy的潜在机制性作用(参见Vanzin等人.《分子遗传学和新陈代谢》2011；104:112-117，其以全文引用的方式并入本文中)。在未经治疗和经治疗的CBSDH患者的血浆中观察到改变的脂质分布，尤其降低水平的高密度脂蛋白和增浓的促炎性脂质物质。(参见Vanzin等人.《细胞和分子神经生物学》2015；35:899-911，其以全文引用的方式并入本文中)。在另一研究中，与健康个体相比，在CBSDH患者中报告的DNA损伤显著更多(参见Vanzin等人.《基因》2014；539:270-274，其以全文引用的方式并入本文中)。这些发现共同暗示了血管损伤的发病机理中的氧化应激与升高的Hcy水平相关。在Met水平与任何氧化应激相关参数之间未发现相关性，表明Met和其衍生物几乎不促成CBSDH中的氧化损伤(参见Vanzin等人.《分子遗传学和新陈代谢》2011；104:112-117，其以全文引用的方式并入本文中)。
在过多的其它分子效应中，氧化应激与NF-κB的活化相关，NF-κB即一组调控促炎性基因的表达的转录因子，如细胞因子，已知参与动脉粥样硬化和血栓形成的起始和进展(参见Rodriguez-Ayala等人.《动脉粥样硬化》2005；180:333-340，其以全文引用的方式并入本文中)。体外研究展示经由ROS产生用Hcy活化的NF-kβ治疗EC(参见van Guldener等人.《当前高血压报告》2003；5:26-31，其以全文引用的方式并入本文中)。除调节基因表达以外，通过氧化应激对细胞大分子进行化学修饰可以直接影响血管的结构和功能并且具有其它局部或全身性作用，如在章节的其余部分中所论述。
4.血管壁的变化
内皮功能障碍一般定义为调节血管收缩性和松弛性的内皮相关因子之间的不平衡。在这些因子中，NO或“内皮细胞衍生的松弛因子”为最熟知的，而硫化氢(H2S)为最近更描述的另一因子(参见Jiang等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》2005；25:2515-2521，其以全文引用的方式并入本文中)。数种体外研究检查了Hcy对内皮功能的影响，尽管使用极高水平的Hcy(参见Jiang等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》2005；25:2515-2521；Hossain等人.《生物化学杂志》2003；278:30317-30327；Cai等人.《血液》2000；96:2140-2148；Zhang等人.《生物化学杂志》2001；276:35867-35874；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。一种此类研究报告用Hcy治疗的人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的未折叠蛋白质反应和程序性细胞死亡，但Hcy浓度比在具有重度升高Hcy水平的患者中所观察到的Hcy浓度高了数倍(参见Zhang等人.《生物化学杂志》2001；276:35867-35874，其以全文引用的方式并入本文中)。在其它报告中，Cthγ-裂解酶(CGL)(参与Cth代谢的酶)在具有升高Hcy水平的患者中产生过量H2S(参见Papapetropoulos等人.《美国国家科学院院刊》2009；106:21972-21977；Szabo C等人.《英国药理学杂志》2011；164:853-865；Chiku等人.《生物化学杂志》2009；284:11601-11612,其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。此观察结果是重要的，因为报告了增加的H2S水平显著增加侧枝血管生长、毛细管密度和区域组织血流量(参见Wang等人.《抗氧化剂与氧化还原信号》2010；12:1065-1077，其以全文引用的方式并入本文中)。然而，较高Hcy水平(0.002到2mM)不显著影响体外EC增殖或磷酸化-eNOS水平(参见Saha等人.“胱硫醚β合成酶经由蛋白质S-硫水合作用调节内皮功能(Cystathionine beta-synthase regulates endothelial function viaprotein S-sulfhydration)”.《FASEB J》2016；30:441-456，其以全文引用的方式并入本文中)。总的来说，这些结果表明内皮功能异常中Hcy的可能作用，但由于体外测试的较高Hcy水平，仍不清楚Hcy是否在体内直接影响EC。
在最近药理学和遗传研究中，EC中CBS功能的损失与细胞H2S的50％减少和谷胱甘肽的400％减少，及细胞ROS水平的伴随增加相关(参见Saha等人.《FASEB J》2016；30:441-456，其以全文引用的方式并入本文中)。在EC中沉默CBS损害对血管内皮生长因子(VEGF)的表型和信号传导反应，并且此作用通过血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)和神经纤毛蛋白-1(NRP-1)(调节内皮功能如血管生成的主要受体)的转录减少而加剧。VEGFR-2和NRP-1的转录下调通过转录因子特异性蛋白质1(Sp1)(一种H2S的硫水合目标)的稳定性降低介导。在沉默CBS的EC中，补充H2S而非谷胱甘肽恢复Sp1水平和Sp1与VEGFR-2启动子的结合，以及增加VEGFR-2和NRP-1表达和VEGF依赖性细胞增殖和迁移。这表明CBS介导的蛋白S-硫水合对于维持血管健康和功能是重要的，支持患有CBSDH的患者展现内皮功能异常的先前观察结果(参见Celermajer等人.《美国心脏病学院杂志》1993；22:854-858；Rubba等人.《代谢》1990；39:1191-1195，其两者以全文引用的方式并入本文中)并且提出以下可能性：除了在由其它原因导致Hcy水平升高的个体中所观察到的血管损伤类型之外，CBSDH患者还罹患额外和独特类型的血管损伤。
调节异常的内皮功能或对血管收缩性的其它影响可导致血压(BP)异常。血浆Hcy水平与BP有直接联系并且使用叶酸降低的Hcy与降低的BP相关(参见Tripathi P.“高半胱氨酸在心血管疾病中的分子和生物化学方面”.《国际心血管论坛杂志》2016；6:13；Hackam等人.《JAMA》2003；290:932-940，其两者以全文引用的方式并入本文中)。虽然产生这些效果的机制不明确，但与舒张BP相比，Hcy水平与收缩更强烈相关。这表明升高的Hcy水平增加动脉僵硬。动脉僵硬的程度主要由平滑肌细胞(SMC)的数目和功能、ECM中的胶原蛋白:弹性蛋白比率、胶原蛋白和内皮功能的质量确定。(参见Tripathi P.“高半胱氨酸在心血管疾病中的分子和生物化学方面”.《国际心血管论坛杂志》2016；6:13，其以全文引用的方式并入本文中)。
潜在地，高水平的Hcy与动脉僵硬增加有关，这是因为SMC增殖、胶原蛋白产生和弹性蛋白纤维形成增加(参见van Guldener等人.《当前高血压报告》2003；5:26-31，其以全文引用的方式并入本文中)。然而，还有可能的是Hcy通过损害胶原蛋白交联来减少动脉僵硬。在小型猪中进行的研究中，饮食诱导的Hcy升高引起伴有高脉动动脉的“巨动脉综合征”、收缩(但非舒张)高血压和伴有主动脉扩张的导管动脉的扩展反应性充血(参见van Guldener等人.“高半胱氨酸与血压(Homocysteine and bloodpressure)”.《当前高血压报告》2003；5:26-31，其以全文引用的方式并入本文中)。动脉壁弹性薄层也存在破裂，与主动脉僵硬相关。
与这些发现一致，在患有和不患有CBSDH的小鼠中进行的研究发现，与馈入对照饮食的CBS+/+(324±18mm2)小鼠(p<0.05)相比，血管壁的横截面积在馈入对照饮食(437±22mM2)的CBS+/-小鼠和馈入高Met饮食的CBS+/+(442±36mm2)和CBS+/-(471±46mm2)小鼠中显著更大。(参见Baumbach等人.“胱硫醚β合成酶缺陷型小鼠中脑小动脉的结构(Structure ofcerebral arterioles in cystathionine beta-synthase-deficientmice)”.《循环研究》2002；91:931-937，其以全文引用的方式并入本文中)。
在最大血管扩张期间，基于对照饮食的CBS+/-小鼠和基于高Met饮食的CBS+/+和CBS+/-小鼠的脑微动脉中的应力-应变曲线移位到基于对照饮食的CBS+/+小鼠的曲线右侧。这指示脑微动脉可扩张性在具有升高血浆tHcy水平的小鼠中较大。这些结果表明，升高的Hcy水平诱导脑血管肥大和改变的脑血管机制，这两种作用都潜在地促成例如中风的血栓形成的发病率增加，甚至在不存在动脉粥样硬化的情况下也是如此(参见Baumbach等人.《循环研究》2002；91:931-937，其以全文引用的方式并入本文中)。
对于升高Hcy对血管扩张的影响的进一步支持来源于CBSDH和tHcy水平在193.6到342μmol/L范围内的5名意大利患者中的研究(参见Evangelisti等人.《国际心脏病学杂志》2009；134:251-254，其以全文引用的方式并入本文中)。患者展示轻度心脏瓣膜脱垂和/或返流和结缔组织表现的病征。
5.血栓形成
升高的Hcy水平与深静脉血栓形成、脑窦血栓形成和视网膜静脉血栓形成的较高风险相关(参见Spence JD.《柳叶刀神经病学》.2007年9月；6(9):830-8，其以全文引用的方式并入本文中)，尽管多个研究未能发现与MI的风险的相关性。与这些结果一致，额外但小型研究表明CBSDH与血栓形成相关，但不一定与动脉粥样硬化相关。患有家族性高胆固醇血症(FH)和CBSDH的患者的血管成像展示，尽管FH患者展现颈动脉的弥漫性和局灶性增厚以及导致血流减少的内皮功能异常，但CBSDH患者很少在其颈动脉中具有斑块且关于中脑动脉中的内中膜厚度(IMT)和血流速度两者均类似于健康对照受试者(参见Rubba等人.《中风》1994；25:943-950，其以全文引用的方式并入本文中)。本研究表明，典型动脉粥样硬化病变可能不需要先于CBSDH中的血栓性事件，并且导致血栓形成的内侧损伤也可能由动脉扩张引起。
对此观察结果的支持来源于比较13名患有酶促证实杂合CBSDH的患者的颈动脉和股动脉粥样硬化(由IMT和踝臂指数确定)的流行率与具有正常Met负载测试结果的12名健康受试者中的流行率的研究(参见de Valk等人.《中风》1996；27:1134-1136，其以全文引用的方式并入本文中)。在五个动脉区段中的每一者的平均IMT值、IMT频率分布或IMT方面，在群组之间未观察到显著差异。这些结果可能通过以下事实解释：杂合个体太年轻(全部<50岁)而不能出现结构血管变化。然而，这些数据还表明，至少在较年轻的患者中，升高的Hcy水平可能主要影响凝血瀑布。实际上，三个不相关CBSDH患者的病例报告发现，一名患者由于腔内血栓形成而经历中风，且另一名患者经历心脏或动脉血栓栓塞，也没有颅颈动脉粥样硬化的证据(参见Kelly等人.《神经病学》2003；60:275-279，其以全文引用的方式并入本文中)。
与这些观察结果一致，向HUVEC和CV1 EC添加Hcy不可逆地使抗凝血剂、蛋白质C和血栓调节蛋白失活(参见Lentz等人.《临床研究杂志》1991；88:1906-1914，其以全文引用的方式并入本文中)。此外，向经培养的人类EC添加Hcy以时间依赖性方式和浓度依赖性方式增加促凝血剂组织因子活性(参见Fryer等人.《动脉硬化与血栓形成》1993；13:1327-1333，其以全文引用的方式并入本文中)。
在两个研究中，Hcy经由涉及其游离硫醇基的机制使凝血路径增强。这些数据共同支持以下假设：血管凝血机制中的扰动促成患有CBSDH的患者中的血管风险增加，且这可在Hcy对动脉粥样硬化的影响变得显而易见之前而在CBSDH患者中发挥较早作用。
降低血浆Hcy水平减少CBSDH患者中和一般人群中的血管并发症(尤其中风)的风险
最近的分析已发现一般人群中在升高的tHcy与中风风险之间的强联系(参见Saposnik等人.《中风》2009；40:1365-1372；Spence JD.“降低高半胱氨酸用于预防中风：揭开证据的复杂性(Homocysteine lowering for stroke prevention:Unravelling thecomplexity ofthe evidence)”.《国际中风杂志》.2016年10月；11(7):744-7；Hankey等人.《柳叶刀神经病学》2012；11:512-520，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
在过去，降低Hcy的干预措施在Hcy水平升高的患者中的益处似乎是混合的，其中一些研究展示血管风险降低(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-747；Yap等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》2001；21:2080-2085；Wilcken等人.《遗传代谢疾病杂志》1997；20:295-300；Yap等人.《血栓形成和止血研讨会》2000；26:335-340；Saposnik等人.《中风》2009；40:1365-1372；Huo等人.《JAMA》2015；313:1325-1335；Hankey等人.《柳叶刀神经病学》2012；11:512-520，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)且其它未展示益处(参见Marti-Carvajal等人.《Cochrane系统评价数据库》2015；1:CD006612；Ebbing等人.《JAMA》2008；300:795-804；Bonaa等人.《新英格兰医学杂志》2006；354:1578-1588；Liem等人.《心脏(Heart)》2005；91:1213-1214；Toole等人.《JAMA》2004；291:565-575；维生素预防中风(VITATOPS)试验(一项随机、双盲、平行、安慰剂对照试验)中具有近期短暂性缺血性发作或中风的患者中的B维生素(参见《柳叶刀神经病学》2010；9:855-865；Albert等人.《JAMA》2008；299:2027-2036，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。这些试验中的许多试验测试了维生素干预，主要是B维生素(B6和B12)和叶酸补充，以用于降低Hcy。因此，研究结果受混杂因素的影响，如受试者是否生活在实行叶酸强化的区域，是否有肾功能障碍而使其更容易受钴胺素毒性影响，是否有与吸收不良有关的维生素B12缺陷症(这在老年人中相对常见)，或者是否正在服用抗血小板药物。这些最近的分析考虑了这些混杂因素，并且推断当考虑此类关键变量时，升高的tHcy增加了一般人群中的中风风险(参见Mudd等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》2000；20:1704-1706；Spence JD.《国际中风杂志》.2016Oct；11(7):744-7；Spence JD,《临床化学和检验医学》.2013年3月1日；51(3):633-7，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
降低Hcy的疗法降低中风的风险，甚至在不患有CBSDH的个体中也是如此。在HOPE-2(心脏结果预防评估2)试验中，将5,522名年龄≥55岁的具有血管疾病或糖尿病病史和至少一种额外CV风险因素的成人随机分组到维生素补充(叶酸、维生素B6和维生素B12)或安慰剂持续5年(参见Saposnik等人.《中风》2009；40:1365-1372，其以全文引用的方式并入本文中)。两组中的平均基线Hcy浓度为11.5μmol/L，并且在基线时服用含有>0.2mg叶酸的每日维生素补充剂的患者从研究排除。总的来说，降低Hcy(平均3.0μmol/L相对于安慰剂)与中风(HR，0.75；95％CI，0.59到0.97)的显著27％相对风险减少(1.3％绝对减少)和缺血性中风(HR，0.81；95％CI，0.60到1.09)和出血性中风(HR，0.80；95％CI，0.32到2.02)的不显著减少相关联。在亚群分析中，在基线Hcy水平处于最高四分位数的患者当中，中风的相对风险降低得最多(4.3％绝对风险降低)。治疗益处在年龄<69岁的患者中最大，即来自不具有叶酸食物强化的区域的患者以及入选时未接受抗血小板或降脂质药物的患者。因此，HOPE-2试验报告在接受B维生素的个体中的中风发生率相对于接受安慰剂的个体(风险比(HR)0.75；95％CI，0.59到0.97)降低，而MI的风险在两个治疗组(RR 0.98；95％CI，0.85到1.14)中类似。(参见Saposnik等人.《中风》2009；40:1365-1372；Lonn E,YusufS,Arnold MJ等人.“用叶酸和B维生素在血管疾病中降低高半胱氨酸(Homocysteine lowering with folicacid and B vitamins in vascular disease)”.《新英格兰医学杂志》2006；354:1567-1577,其两者以全文引用的方式并入本文中)。
与来自HOPE-2试验的结果一致，VITATOPS试验的子分析，其中具有近期中风或短暂性缺血性发作的8,164名患者被随机分组到用B维生素或安慰剂的双盲治疗持续中值3.4年，发现在基线时不服用抗血小板疗法的患者中，B维生素显著减少主要复合结果(中风、MI或因血管原因引起的死亡)(17％相对于安慰剂的21％；HR 0.76,0.60到0.96)。在接受抗血小板疗法的个体中未观察到B维生素的显著作用(参见Hankey等人.“抗血小板疗法和B维生素在先前中风或短暂性缺血性发作患者中的影响：随机分组安慰剂对照试验VITATOPS的事后亚分析(Antiplatelet therapy and the effects ofB vitamins in patients withprevious stroke or transient ischemic attack:a post-hoc sub-analysis ofVITATOPS,arandomized,placebo-controlled trial)”.《柳叶刀神经病学》2012；11:512-520，其以全文引用的方式并入本文中)。在这一研究中，tHcy水平在维生素疗法之后从基线时的12.4到13.7μmol/L显著降低到9.9到10.5μmol/L，无关于患者是否接受抗血小板疗法(对于两个治疗组，p<0.0001)。(参见Hankey等人.《柳叶刀神经病学》2012；11:512-520，其以全文引用的方式并入本文中)。
发炎级联被认为促成缺血性中风发病机理。来自3,224名参与者中的弗雷明汉子代研究(Framingham Offspring Study)的报告(参见Shoamanesh等人.《神经病学》.2016年9月；87(12):1206-11，其以全文引用的方式并入本文中)发现，tHcy和三种其它发炎标记物的升高水平与缺血性中风的风险强烈相关，并且提高了弗雷明汉中风风险概况评分的预测能力。
对来自VISP和VITATOPS研究的数据的元分析发现，先前未暴露于高剂量氰钴胺素的具有正常肾功能的患者显著受益于维生素疗法，所述维生素疗法包括高剂量氰钴胺素(0.78，0.67到0.90；相互作用p＝0.03)，而包括高剂量氰钴胺素(一种形式的维生素B)的维生素疗法对肾功能损害的个体的中风风险没有影响(RR 1.04，95％CI 0.84到1.27)(参见Spence JD.《柳叶刀神经病学》.2007年9月；6(9):830-8，其以全文引用的方式并入本文中)。这些结果表明，在肾功能显著减弱的患者中，氰钴胺素有潜在的混杂作用，已知氰钴胺素具有与氰化物累积有关的肾毒性。(参见Spence JD,《临床化学和检验医学》.2013年3月1日；51(3):633-7，其以全文引用的方式并入本文中)。与此一致，在DIVINe试验(在肾病中用维生素进行糖尿病干预)中，高剂量B维生素，包括1000μg的氰钴胺，是有害的，从而加剧eGFR下降(参见Spence JD.《国际中风杂志》.2016年10月；11(7):744-7；House等人.《JAMA》2010；303:1603–1609，其两者以全文引用的方式并入本文中)。共同地，此类发现支持使用不含氰化物的B维生素(如甲基钴胺素)代替氰钴胺素，以降低在高中风风险的个体中的Hcy水平，尤其是具有肾功能不全的个体中的Hcy水平。
在先前的试验中，CSPPT(中国中风一级预防试验)的结果进一步表明，氰钴胺素和氰化物毒性是在肾损伤存在下的混杂因素(参见Huo等人.《JAMA》.2015年4月7日；313(13):1325-35，其以全文引用的方式并入本文中)。在CSPPT中在肾损伤情况下表现出的治疗益处与在DIVINe、VISP和VITOPS试验中观察到的缺乏益处相反，可能是由于后者试验中的氰钴胺素治疗。
因为在中国，叶酸强化尚未实施，所以可在此处在大量人群中研究叶酸补充对降低tHcy水平的作用。CSPPT是一项随机双盲试验，在20,702名具有高血压但无中风或MI病史的成人中进行，展现叶酸显著降低首次中风(2.7％相对于无叶酸的3.4％，HR 0.79；95％CI0.68到0.93)、首次缺血性中风(2.2％相对于无叶酸的2.8％，HR 0.76；95％CI 0.64到0.91)和复合CV事件(CV死亡、MI和中风；3.1％相对于无叶酸的3.9％，HR 0.80；95％CI0.69到0.92)的风险。相比之下，两组之间在出血性中风、全因死亡或AE频率的风险方面没有显著差异。在CSPPT的研究中(参见Xu等人.《美国医学会内科杂志(JAMA Intern Med)》.2016年10月1日；176(10):1443-1450，其以全文引用的方式并入本文中)，具有或不具有肾损伤(eGFR低于60mL/min/1.73m2)的两个受试者受益于叶酸，并且此外子研究证实用叶酸处理的组的血清Hcy下降比不接受叶酸的组的血清Hcy下降大得多(分别为1.9相对于0.2μmol/L，p<0.001)。
一项2017年Cochrane审查(参见Martí-Carvajal等人.《Cochrane系统评价数据库》.2017年8月17日；8:CD006612，其以全文引用的方式并入本文中)，分析涉及74,422名参与者的15个随机受控试验，报告Hcy降低与B维生素对中风的影响有小的差异，但对MI、由任何原因引起的死亡或AE无影响。与安慰剂/标准护理相比，降低Hcy的干预措施与非致命性或致命性中风的发生率下降有关(4.33％相对于对照的5.1％；RR 0.90，95％CI 0.82到0.99)，但对一般人群的非致命或致命性MI的发生率(7.1％相对于安慰剂的6.0％；相对风险(RR)1.02，95％CI 0.95到1.10)或由任何原因引起的死亡(11.7％相对于安慰剂的12.3％；RR 1.01，95％CI 0.96到1.06)没有影响。此审查为三个较早版本(2009年、2013年和2015年)的更新，其先前已得出结论，不存在证据支持降低Hcy的干预措施对CV事件的影响，但2015年评述已指示中风的发病率降低的非显著趋势(参见Marti-Carvajal《Cochrane系统评价数据库》2015；1:CD006612，其以全文引用的方式并入本文中)。随着其它试验变得可用，关于降低Hcy的干预措施对中风的证据力度变得更大。
包括于审查中的研究使用维生素补充作为降低Hcy疗法的各种方案(参见Martí-Carvajal等人.《Cochrane系统评价数据库》.2017年8月17日；8:CD006612，其以全文引用的方式并入本文中)。2017年审查将三个新试验添加到2015年审查中的那些新试验。总的来说，10次试验使用吡哆醇加维生素B9(叶酸)和B12，五次试验仅使用维生素B9，且10次中的1次使用5-甲基四氢叶酸代替叶酸。一些试验包括伴随药物(在对照组和维生素治疗组两者中)、降低脂质的7次试验以及抗高血压药剂的一次试验。总的来说，降低Hcy的治疗产生平均tHcy水平的相对较小降低。此外，在叶酸强化人群中进行三次研究，并且在混合人群中进行两次研究(一些受试者接受强化饮食，并且其它受试者未接受)，其可能已遮蔽降低Hcy的影响。考虑到可能影响此类研究的混杂因素，并不出人意料的是，较早审查并未识别维生素治疗方案的任何显著CV作用，且在最新审查中报告仅对中风的适度影响。还值得注意的是，在Cochrane审查中所包括的研究中未检测到升高Hcy水平的许多潜在起因(参见Marti-Carvajal等人.《Cochrane系统评价数据库》2015；1:CD006612，其以全文引用的方式并入本文中)。可能存在影响患有CBSDH的患者和与一般人群相比处于较年轻年龄的患者中的血管风险的病理生理学的额外因素。值得注意的是，Hcy水平的甚至适度降低与中风风险的降低显著相关。
由若干这些分析引起的有趣问题是一些研究指示Hcy水平对中风而非对MI的影响的原因。与此问题相关的是，Spence(参见Spence JD.《柳叶刀神经病学》.2007Sep；6(9):830-8，其以全文引用的方式并入本文中)指出MI与脑梗塞之间的关键差异，其中脑梗塞紧密地与血栓形成/栓塞事件相关，但在几乎所有MI事件中，原位血栓形成继发于冠状动脉中的斑块破裂。因此，Spence得出结论，相当大比例的中风与可与升高tHcy相关联的血栓性过程有关。
升高tHcy水平不仅在心源性中风方面也可能是重要的，而且在动脉栓塞和腔隙性梗死方面可能是重要的。患有用抗凝血剂疗法治疗的心房颤动的老年患者中的研究发现高水平的tHcy(>第90百分位)与缺血性并发症的4.7倍增加相关(参见Poli等人.《美国心脏病学院杂志》2009；54:999-1002，其以全文引用的方式并入本文中)。在患有隐源性缺血性中风的患者中的另一研究发现，具有卵圆孔未闭(脑梗死的风险因素)的患者的血浆tHcy水平显著高于不具有所述症状的患者(分别为8.9±3相对于7.9±2.6μmol/L；p＝0.021)(参见Ozdemir等人.《神经科学杂志》2008；275:121-127，其以全文引用的方式并入本文中)。在检查此类发现时，Spence(参见Spence JD.“降低高半胱氨酸用于预防中风：揭开证据的复杂性”.《国际中风杂志》.2016年10月；11(7):744-7，其以全文引用的方式并入本文中)表明，Hcy主要影响红色血栓的形成(一种截留有红血球的纤维蛋白聚合物网状物，其在瘀血的情况下形成)，但腔隙性梗死和颈动脉斑块也与tHcy显著相关，因为基于经颅多普勒具有微栓子的患者中的tHcy水平也显著较高(16.2mmol/L相对于10.1mmol/L)，且大多数此类微栓子被认为是血小板聚集体，通过双重抗血小板治疗而减少(参见Spence JD.“降低高半胱氨酸用于预防中风：揭开证据的复杂性”.《国际中风杂志》.2016年10月；11(7):744-7，其以全文引用的方式并入本文中)。
在针对总计539个患者年用吡哆醇、叶酸和羟钴胺素治疗的32名CBSDH患者(年龄在9岁与66岁之间)中进行的研究，在治疗期间报告两种血管事件(一种为致命肺栓塞并且一种为MI)。(参见Wilcken等人.《遗传代谢疾病杂志》1997；20:295-300，其以全文引用的方式并入本文中)。根据Mudd等人.的流行病学研究，将在无治疗的情况下在相同时间段内预期21种事件(RR 0.09(95％CI 0.02到0.38)；p＝0.0001)。在来自三个国家的年龄在2.5岁与70岁之间的84名患者中进行的第二研究，报告在1314个患者年治疗期间静脉栓塞(VE)的五种情况，一种肺栓塞、两种MI和两种腹部动脉瘤(参见Yap等人.《血栓形成和止血研讨会》2000；26:335-340，其以全文引用的方式并入本文中)。根据Mudd等人.，(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其以全文引用的方式并入本文中)在未治疗患者中预期VE的53种情况(RR 0.091(95％CI 0.043到0.190)；p<0.001)。
这些结果的支持性证据来源于158名患有CBSDH的患者的大型国际多中心观察研究(参见Yap等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》2001；21:2080-2085，其以全文引用的方式并入本文中)，患者大部分在10到30岁范围内。在此研究中，在12个治疗个体当中观察到17种血管事件，三种肺栓塞情况、两种MI、五种深静脉血栓形成情况、三种脑血管事故、一种短暂性缺血性发作、一种矢状窦血栓形成和两种腹部主动脉动脉瘤。在没有治疗的情况下，将在类似人群中预期112种血管事件(RR 0.09(95％CI 0.036到0.228)；p<0.0001)。此研究还突出了与一般人群相比，甚至经治疗的和充分追踪的幼龄成年CBSDH患者遭受较差临床结果影响的程度。
升高的血浆tHcy水平是患有CAD的患者中在患有和不患有CBSD情况下的血管疾病的风险因素，以及死亡率的强预测因子(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Karaca等人.《基因》2014；534:197-203；Kelly等人.《神经病学》2003；60:275-279；Faeh等人.《瑞士医学周刊》2006；136:745-756；Boushey等人.《JAMA》1995；274:1049-1057；Clarke等人.《JAMA》2002；288:2015-2022；Hankey等人.《柳叶刀》1999；354:407-413；Khan等人.《中风》2008；39:2943-2949；Graham等人.《JAMA》1997；277:1775-1781；Clarke等人.《新英格兰医学杂志》1991；324:1149-1155；Clarke等人.《爱尔兰医学科学杂志》1992；161:61-65；Woodward等人.《凝血和纤维蛋白溶解症》2006；17:1-5；Refsum等人.《年度医学评论》1998；49:31-62；Yoo等人.《中风》1998；29:2478-2483；Selsun等人.《新英格兰医学杂志》1995；332:286-291；Wald等人.《BMJ》2002；325:1202；Bautista等人.《临床流行病学杂志》2002；55:882-887；Brattstrom等人.《动脉粥样硬化》1990；81:51-60；Lussana等人.《血栓形成研究》2013；132:681-684；Casas等人.《柳叶刀》2005；365:224-232；McCully KS.《美国病理学杂志》1969；56:111-128；Magner等人.《遗传代谢疾病杂志》2011；34:33-37；Wilcken等人.《临床研究杂志》1976；57:1079-1082；Nygard等人.《新英格兰医学杂志》1997；337:230-236，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
在tHcy水平与CV风险之间的因果关系的证据中(参见Boushey等人.《JAMA》1995；274:1049-1057，其以全文引用的方式并入本文中)，在tHcy与中风或PAD之间展现最强关系，(参见Clarke等人.《JAMA》2002；288:2015-2022；Khan等人.《中风》2008；39:2943-2949；Wald等人.《BMJ》2002；325:1202；Casas等人.《柳叶刀》2005；365:224-232；Brattstrom等人.《止血》1989；19增刊1:35-44，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)包括在具有纯合和杂合CBS突变两者的患者中(参见Rubba等人.《代谢》1990；39:1191-1195，其以全文引用的方式并入本文中)。
潜在地将升高Hcy与血管损伤连接的机制变化并且复杂化。数种研究涉及氧化应激(参见Faverzani等人.《细胞和分子神经生物学》2017；Nowak等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》2017；37:e41-e52；Vanzin等人.《分子遗传学和新陈代谢》2011；104:112-117；Vanzin等人.《基因》2014；539:270-274；Vanzin等人.“脂质(Lipid)”,《细胞和分子神经生物学》2015；35:899-911，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)，包括通过经由NF-κB的发炎/免疫活化的氧化应激(参见Rodriguez-Ayala等人.《动脉粥样硬化》2005；180:333-340；van Guldener等人.《当前高血压报告》2003；5:26-31，其两者以全文引用的方式并入本文中)。虽然此类发炎过程的特征为动脉粥样硬化，但典型动脉粥样硬化病变不需要先于患有CBSDH的患者中的血栓性事件(参见Rubba等人.《中风》1994；25:943-950；deValk等人.《中风》1996；27:1134-1136，其两者以全文引用的方式并入本文中)。实际上，相信引起血栓形成的内侧损伤由以下引起：Hcy介导的内皮功能异常(参见Marti-Carvajal等人.《Cochrane系统评价数据库》2015；1:CD006612；Celermajer等人.《美国心脏病学院杂志》1993；22:854-858；Rubba等人.《代谢》1990；39:1191-1195；Jiang等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》2005；25:2515-2521；Hossain等人.《生物化学杂志》2003；278:30317-30327；Cai等人.《血液》2000；96:2140-2148；Zhang等人.《生物化学杂志》2001；276:35867-35874；Papapetropoulos等人.《美国国家科学院院刊》2009；106:21972-21977；Szabo等人.《英国药理学杂志》2011；164:853-865；Chiku等人.《生物化学杂志》2009；284:11601-11612；Wang等人.《抗氧化剂与氧化还原信号》2010；12:1065-1077；Saha S,等人.《FASEBJ》2016；30:441-456；Ebbing等人.《JAMA》2008；300:795-804；Bonaa等人.《新英格兰医学杂志》2006；354:1578-1588，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)，增强的凝血路径(参见Spence JD.《国际中风杂志》.2016年10月；11(7):744-7；Fryer等人.《动脉硬化与血栓形成》1993；13:1327-1333；Lentz等人.《临床研究杂志》1991；88:1906-1914，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)和增加的血管扩张，类似于马方患者中涉及的血栓性过程(参见Kelly等人.《神经病学》2003；60:275-279；Tripathi P.“高半胱氨酸在心血管疾病中的分子和生物化学方面”.《国际心血管论坛杂志》2016；6:13；van Guldener等人.《当前高血压报告》2003；5:26-31；Hackam等人.《JAMA》2003；290:932-940；Baumbach等人.《循环研究》2002；91:931-937；Evangelisti等人.《国际心脏病学杂志》2009；134:251-254；deValk等人.《中风》1996；27:1134-1136，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。与患有CBSDH的患者中的内皮功能异常观察结果一致，药理学和遗传研究暗示CBS介导的蛋白质S硫水合与维持血管健康和功能方面有关(参见Celermajer等人.《美国心脏病学院杂志》1993；22:854-858；Rubba等人.《代谢》1990；39:1191-1195，其两者以全文引用的方式并入本文中)。因此，有可能CBSDH患者中的血管损伤机制比患有CV疾病的一般人群中的血管损伤的机制变化更多。
存在相当大的证据表明，降低Hcy相对于患有和不患有CBSDH的个体中的中风风险有益。(参见Saposnik等人.《中风》2009；40:1365-1372；Huo等人.《JAMA》2015；313:1325-1335；Lonn等人.《新英格兰医学杂志》2006；354:1567-1577；Hankey等人.《柳叶刀神经病学》2012；11:512-520；Spence JD.《柳叶刀神经病学》.2007年9月；6(9):830-8；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。尽管在一般人群中进行的研究中，平均基线Hcy水平相对较低，但中风发生率的降低与降低Hcy的干预措施显著相关，指向tHcy水平甚至较小降低的益处。
相关试验的更新的审查支持降低Hcy的治疗在中风中的有益作用(参见Martí-Carvajal等人.《Cochrane系统评价数据库》.2017年8月17日；8:CD006612，其以全文引用的方式并入本文中)。混杂因素，如是否存在叶酸强化、维生素B12缺陷症或肾功能不全是否使患者容易遭受高剂量氰钴胺素的影响或受试者是否服用抗血小板药，具有模糊的试验结果。最近的分析表明，当考虑此类因素时，一般人群中的tHcy与中风风险之间的联系较强(参见Spence JD,《临床化学和检验医学》.2013年3月1日；51(3):633-7，其以全文引用的方式并入本文中)。然而，重要的是，在患有比一般人群高得多的tHcy水平的CBSDH的患者中，已一致地证实了降低Hcy的血管益处(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》1998；21:738-747；Eslamiyeh等人.《伊朗儿童神经病学杂志》2015；9:53-57；Saboul等人.《儿童神经病学杂志》2015；30:107-112；Yap等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》2001；21:2080-2085；Woods等人.《BMJ案例报告》2017；2017；Wilcken等人.《遗传代谢疾病杂志》1997；20:295-300；Yap等人.《血栓形成和止血研讨会》2000；26:335-340；Ruhoy等人.《小儿神经科》2014；50:108-111，中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
这些发现表明，在患有和不患有CBSDH的患者中，较高的Hcy水平是CV疾病(尤其中风)的风险因素，并且CV或脑血管风险可以通过长期Hcy降低疗法而降低。
血栓栓塞为CBSDH患者的发病和过早死亡的主要起因(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Karaca等人.《基因》2014；534:197-203；Yap S.《遗传代谢疾病杂志》2003；26:259-265，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。具有未经治疗CBSDH的患者中的血栓栓塞事件的总速率为约10％/年(参见Cattaneo M.《血栓形成和止血研讨会》2006；32:716-723，其以全文引用的方式并入本文中)，其中在手术之后和在妊娠期间或紧接在妊娠之后风险增加(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Novy等人.《血栓形成和止血》2010；103:871-873，其两者以全文引用的方式并入本文中)。血栓栓塞可影响任何血管，但静脉血栓形成(尤其脑窦静脉血栓形成(CSVT))比患有CBSDH的患者中的动脉血栓形成更常见(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31；Karaca等人.《基因》2014；534:197-203；Eslamiyeh等人.《伊朗儿童神经病学杂志》2015；9:53-57；Saboul等人.《儿童神经病学杂志》2015；30:107-112，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
629名未经治疗的CBSDH患者中的研究展示，在所观察到的253种血管事件(出现于158名患者中)中，81种(32％)是脑血管事故，130种(51％)是受影响的外周静脉(具有导致肺栓塞的32种)，10种(4％)引起心肌梗塞(MI)，28种(11％)为受影响的外周动脉并且四种(2％)未分入这些类别中的任一者。(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其以全文引用的方式并入本文中)。脑血管事故，尤其CSVT已经在婴儿中描述(参见Mahale等人.《儿科神经科学杂志》.2017年4月-6月；12(2):206-207，其以全文引用的方式并入本文中)，但更典型地呈现于年轻的成人中(参见Yap等人.《动脉硬化、血栓形成与血管生物学》2001；21:2080-2085，其以全文引用的方式并入本文中)。据报告脑血管事件仅或多或少地与患者的吡哆醇反应类别有关。
血管事件的风险在年龄<20岁的患者中为大致30％，截至30岁上升到50％。然而，症状可在任何年龄时出现且严重血栓形成已在年龄为6个月的婴儿中描述(参见Cardo等人.《发育医学和儿童神经病学(Dev Med ChildNeurol)》1999；41:132-135，其以全文引用的方式并入本文中)。在10岁之后，每25年预期一种血管事件。一般来说，儿童中的CBSDH的第一病征是智力迟钝，在出生的第一或第二年期间呈现为发育延缓和/或晶状体错位/高近视。相比之下，成人更有可能呈现有血管事件。
D.饮食对表型结果的作用
在一些实施方式中，I278T小鼠(HCU的小鼠模型)用于评估用20NHS PEG-CBS针对HCU的酶疗法对与人类患者相关的临床终点的长期影响。20NHS PEG-CBS在正常甲硫氨酸摄入(REG)和Met受限饮食(MRD)的背景下以及在单独MRD情况下的功效。用20NHS PEG-CBS治疗可引起血浆高半胱氨酸浓度的90％降低和校正与HCU相关的学习/认知、内皮功能异常、止血、骨矿化和身体组成表型。在某些实施方式中，在MRD背景下用20NHS PEG-CBS进行治疗使血浆Hcy正常化。已观察到单独MRD将血浆Hcy降低67％并且校正I278T小鼠中的HCU表型。然而，MRD增加I278T小鼠和野生型对照中的焦虑症和降低的骨矿物质含量。因此，20NHSPEG-CBS对于治疗具有REG或Met受限饮食背景的受试者中的HCU极有效。实际上，与Met受限饮食相比，基于正常Met摄入背景的在20NHS PEG-CBS情况下的ET表现同等或产生较好结果。
E.神经并发症
研究已表明，通过低Met饮食、叶酸/B维生素补充和/或吡哆醇和甜菜碱治疗诱导的Hcy水平的早期降低，可以预防且有时可以逆转各种神经疾病的进展，并允许患有CBSDH的患者中的正常IQ发育(参见El Bashir等人.《JIMD报告》2015；21:89-95；Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》2001；24:437-447；MechAW,FarahA.“对于MTHFR C677T或A1298C多态性呈阳性的MDD患者在使用减少B维生素的治疗期间的临床反应与高半胱氨酸减少的相关性：一项随机、双盲、安慰剂对照的研究(Correlation of clinical response with homocysteinereduction during therapy with reduced B vitamins in patients with MDD who arepositive for MTHFR C677T or A1298C polymorphism:a randomized,double-blind,placebo-controlled study)”.《临床精神病学杂志(J Clin Psychiatry)》2016；77:668-671；Grobe H.《欧洲儿科杂志》1980；135:199-203；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。进一步证据提供于患有CBSDH的患者中的病例研究中，其中Hcy水平的显著降低、甚至正常化引起CNS结果的完全或部分校正(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》2001；24:437-447；Brenton等人.《儿童神经病学杂志》2014；29:88-92；Rezazadeh等人.《儿童神经科公开(ChildNeurol Open)》2014；1:2329048X14545870；Kaeser等人.《神经病学、神经外科和精神病学杂志(JNeurol Neurosurg Psychiatry)》1969；32:88-93；Colafrancesco等人.《欧洲儿科杂志》2015；174:1263-1266；Yokoi等人.《国际儿科》2008；50:694-695；Li等人.《病理学》1999；31:221-224，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
在CBSDH患者和一般人群中充分证实了升高水平的Hcy与CNS症状(包括智力迟钝、神经退化性疾病、癫痫发作、肌张力障碍、精神病、认知障碍、痴呆和抑郁症)之间的相关性(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74；Abbott等人.《美国医学遗传学杂志》1987；26:959-969；Mudd等人.“转硫障碍”.载于：Scriver CL,BeaudetAL,Sly WS,ValleD编.《遗传性疾病的代谢和分子基础》.第7版.纽约:麦格劳·希尔；2001；1279-1327；Hidalgo等人.《欧洲儿童与青少年精神病学(Eur Child Adolesc Psychiatry)》2014；23:235-238；Smith等人.《公共科学图书馆：综合(PLoS One)》2010；5:e12244；Seshadri等人.《新英格兰医学杂志》2002；346:476-483；Bottiglieri等人.《神经病学，神经外科和精神病学杂志》2000；69:228-232；Bjelland等人.《普通精神病学档案(Arch Gen Psychiatry)》2003；60:618-626；Tolmunen等人.《美国临床营养学杂志》2004；80:1574-1578；Kaeser等人.《神经病学，神经外科和精神病学杂志》1969；32:88-93；Golimbet等人.《精神病学研究(Psychiatry Res)》2009；170:168-171；Clarke等人.《神经学档案(Arch Neurol)》1998；55:1449-1455；Permoda-Osip等人.《神经心理学生物学(Neuropsychobiology)》2014；69:107-111；Oliveira等人.《BMJ案例报告》2016；2016；Troen等人.《美国国家科学院院刊》2008；105:12474-12479；Sudduth等人.《脑血流和脑代谢(J Cereb Blood Flow Metab)》2013；33:708-715；Hainsworth等人.《生物化学与生物物理学学报》2016；1862:1008-1017；Herrmann等人.《临床化学和检验医学》2011；49:435-441；Kim等人.《营养学杂志(JNutr)》2007；137:2093-2097；Selhub等人.《美国临床营养学杂志》2000；71:614S-620S；McCaddon等人.《痴呆与老年认知障碍(Dement Geriatr Cogn Disord)》2001；12:309-313；Smallwood等人.《神经病理学和应用神经生物学(NeuropatholAppl Neurobiol)》2012；38:337-343；Beydoun等人.《BMC公共卫生(BMC Public Health)》2014；14:643；Gortz等人.《神经科学杂志》2004；218:109-114；健康质量组织(Health Quality O).维生素B12和认知功能：基于证据的分析(Vitamin B12 and cognitive function:an evidence-basedanalysis).安大略省卫生技术评估系列(Ont.Health Technol.Assess.Ser).13(23),1e45.2013.参考类型:在线资源；Salagre等人.《欧洲神经病学(Eur Psychiatry)》2017；43:81-91，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。认为在具有升高Hcy水平的个体中引起CNS病症的机制涉及tHcy介导的神经元损伤(参见Mudd等人.“转硫障碍”.载于：Scriver CL,BeaudetAL,SlyWS,Valle D编.《遗传性疾病的代谢和分子基础》.第7版.纽约:麦格劳·希尔；2001；1279-1327；Hainsworth等人.《生物化学与生物物理学学报》2016；1862:1008-1017；Stefanello等人.《代谢性脑病(Metab Brain Dis)》2007；22:172-182；Toborek等人.《动脉粥样硬化》1995；115:217-224，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)，由Hcy介导的氧化应激引起的血管内皮损伤(参见Vivitsky等人.《美国生理学杂志-调节、综合和比较生理学(Am J Physiol Regul IntegrComp Physiol)》2004；287:R39-R46，其以全文引用的方式并入本文中)，神经元损失(参见Yeganeh等人.《分子神经科学杂志(J Mol Neurosci)》2013；50:551-557；Heider等人.《神经传递杂志增刊(JNeuralTransm Suppl)》2004；1-13，其两者以全文引用的方式并入本文中)和减弱的神经网络活性(参见Gortz等人.《神经科学杂志》2004；218:109-114，其以全文引用的方式并入本文中)。抑郁和抽搐被认为至少部分由脑腺苷水平中的Hcy介导的降低及去甲肾上腺素和多巴胺水平的后续降低引起(参见Mech等人.《临床精神病学杂志》2016；77:668-671；Domagala等人.《血栓形成研究》1997；87:411-416；Vivitsky等人.《美国生理学杂志-调节、综合和比较生理学》2004；287:R39-R46；Folstein等人.《美国神经病学杂志(Am J Psychiatry)》2007；164:861-867，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
这些发现表明患有CBSDH的患者中Hcy水平与CNS病症的风险增加之间的强相关性。早期降低Hcy的疗法对于患有早发型CBSDH的儿童的正常发育和对于在稍后的年岁中经诊断患有CBSDH的患者中的CNS病症的校正或改善至关重要。
63名CBSDH患者中的研究发现51％具有精神病症，包括焦虑症和间歇性抑郁症(10％)、慢性行为障碍(例如攻击和药物或酒精滥用)(17％)、慢性强迫症(5％)和人格障碍(19％)(参见Abbott等人.《美国医学遗传学杂志》1987；26:959-969，其以全文引用的方式并入本文中)。精神病可以是青春期的呈现病征(参见Hidalgo等人.《欧洲儿童与青少年精神病学(Eur ChildAdolesc Psychiatry)》2014；23:235-238，其以全文引用的方式并入本文中)。
如果未经治疗，那么约90％的吡哆醇非反应性患者具有学习障碍(参见Mudd等人.《美国人类遗传学杂志》1985；37:1-31，其以全文引用的方式并入本文中)，其中IQ通常在10到138范围内，与未经治疗的吡哆醇反应性患者中的79和经治疗的具有良好顺应性的吡哆醇反应性患者中的105相比，吡哆醇非反应性个体中的平均值为57(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》2001；24:437-447，其以全文引用的方式并入本文中)。癫痫发作影响20％的截至12岁的非反应性患者，并且报告若干病例具有与基底神经节梗塞不相关的运动障碍，包括多肌阵挛、肌张力障碍和帕金森病(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74；Rezazadeh等人.《儿童神经科公开(Child Neurol Open)》2014；1:2329048X14545870，其两者以全文引用的方式并入本文中)。
CBSDH与神经精神性症状之间的相关性在1965年由Schimke等人首次描述(参见Schimke等人.《JAMA》1965；193:711-719，其以全文引用的方式并入本文中)。所述相关性稍后由在超过50％的CBS缺陷型患者中报告精神病理学的研究支持(参见Abbott等人.《美国医学遗传学杂志》1987；26:959-969，其以全文引用的方式并入本文中)。此后，许多流行病学研究展示血浆tHcy的甚至轻微增加与CNS病症(包括智力迟钝和神经退化性疾病)的风险之间的正剂量依赖性关系(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74；Seshadri等人.《新英格兰医学杂志》2002；346:476-483；Clarke等人.《神经学档案》1998；55:1449-1455；Hainsworth等人.《生物化学与生物物理学学报》2016；1862:1008-1017；Herrmann等人.《临床化学和检验医学》2011；49:435-441；Kim J等人.《营养学杂志》2007；137:2093-2097；Selhub等人.《美国临床营养学杂志》2000；71:614S-620S；McCaddon等人.《痴呆与老年认知障碍》2001；12:309-313；Smallwood等人.《神经病理学和应用神经生物学》2012；38:337-343；Beydoun等人.《BMC公共卫生》2014；14:643；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中》。一般来说，具有重度升高Hcy水平(50到200μM/L)的患者倾向于呈现急性神经元功能障碍，包括癫痫发作和精神病，而更中度的Hcy水平(15到50μM/L)与认知障碍和痴呆相关(参见Mudd等人.“转硫障碍”.载于：Scriver CL,BeaudetAL,Sly WS,Valle D编.《遗传性疾病的代谢和分子基础》.第7版.纽约:麦格劳·希尔；2001；1279-1327；Gortz等人.《神经科学杂志》2004；218:109-114，其两者以全文引用的方式并入本文中)。
升高的Hcy水平被广泛公认为对于以下的稳固且独立的风险因素：认知损伤(参见Smith等人.《公共科学图书馆：综合》2010；5:e12244；Seshadri等人.《新英格兰医学杂志》2002；346:476-483，其两者以全文引用的方式并入本文中)，痴呆的发作(参见健康质量组织.维生素B12和认知功能：基于证据的分析.安大略省卫生技术评估系列.13(23),1e45.2013.参考类型:在线资源，其以全文引用的方式并入本文中)和阿尔茨海默氏病(参见Seshadri等人.《新英格兰医学杂志》2002；346:476-483，其以全文引用的方式并入本文中)。另外，展示增加的Hcy水平(>15μmol/L)存在于至多90％患有抑郁症的患者中(参见Bottiglieri等人.《神经病学，神经外科和精神病学杂志》2000；69:228-232；Bjelland等人.《普通精神病学档案》2003；60:618-626，其两者以全文引用的方式并入本文中)，其中tHcy水平呈上三分位数的男性患抑郁症的可能性比tHcy水平呈最低三分位数的男性高出两倍多(参见Tolmunen等人.《美国临床营养学杂志》2004；80:1574-1578，其以全文引用的方式并入本文中)。升高的Hcy水平通常报告于精神分裂症、多发性硬化症、帕金森氏症、纤维肌痛/慢性疲劳综合症(参见Kaeser等人.《神经病学，神经外科和精神病学杂志》1969；32:88-93；Golimbet等人.《精神病学研究》2009；170:168-171；Clarke等人.《神经学档案(Arch Neurol)》1998；55:1449-1455；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)和不具有脑血管疾病的复发性肌张力障碍的病例中(参见Sinclair等人.《运动障碍(MovDisord)》2006；21:1780-1782，其以全文引用的方式并入本文中)。描述CBS基因的T833C多态性与躁郁症之间的可能的相关性(参见Permoda-Osip等人.《神经心理学生物学》2014；69:107-111，其以全文引用的方式并入本文中)并且最近的元分析指示在患有双极疾病的个体中在升高的Hcy水平与躁狂症/缓解期(euthymia)之间的关系(参见Salagre等人.《欧洲神经病学》2017；43:81-91，其以全文引用的方式并入本文中)。与CBSDH相关的外周神经病变的第一已知病例最近在患有CBSDH的18岁男性中描述(参见Oliveira等人.《BMJ案例报告》2016；2016，其以全文引用的方式并入本文中)，并且在具有先前未诊断的CBSDH的17岁中描述了精神病的致死病例(参见Hidalgo等人.《欧洲儿童与青少年精神病学》2014；23:235-238，其以全文引用的方式并入本文中)。
Hcy水平与痴呆之间的关系的直接证据来源于其中Hcy施用与脑部损伤的发展相关的动物研究(参见Troen等人.《美国国家科学院院刊》2008；105:12474-12479；Sudduth等人.《脑血流和脑代谢》2013；33:708-715，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。在第一次此类研究中，具有升高Hcy水平(由维生素B缺陷型饮食诱导)的雄性C57BL6/J小鼠具有显著减弱的空间学习和记忆，具有相当稀疏的海马微脉管而无伴随的神经胶质过多症或神经退化(参见Troen等人.《美国国家科学院院刊》2008；105:12474-12479，其以全文引用的方式并入本文中)。总海马毛细管长度与莫里斯水迷宫逃逸潜伏期((r＝-0.757，p<0.001)并且与血浆tHcy(r＝-0.631，p<0.007)呈反相关。馈入富含Met饮食的小鼠展示类似但不显著的作用。这些发现表明，在不存在神经退化情况下或在神经退化之前，升高的Hcy水平与引起认知功能障碍的脑部微血管稀疏相关。这可以解释在人类中在升高的Hcy水平与认知衰退之间的联系。
在第二研究中，给健康小鼠喂食叶酸、维生素B6和B12方面缺乏的饮食并且补充有Met以诱导适度升高的Hcy水平(血浆tHcy 82.93±3.56μmol/L)。这些小鼠具有空间记忆缺陷，如用两天放射臂水迷宫评估(参见Sudduth等人.《脑血流和脑代谢》2013；33:708-715，其以全文引用的方式并入本文中)。MRI和组织检查揭露显著微出血速率。还观察到神经炎症和MMP2和MMP9(这两种酶都涉及脑出血的发病机理)的增加的表达和活性。这表明在升高Hcy水平与血管性痴呆之间的联系，如在阿尔茨式海默病中。
在人类中，白质(血管损伤的病征)的变化常常与升高的Hcy水平相关联，在具有(参见El Bashir等人.《JIMD报告》2015；21:89-95；Vatanavicharn等人.《遗传代谢疾病杂志》2008；31增刊3:477-481；Brenton等人.《儿童神经病学杂志》2014；29:88-92；Ruhoy等人.《小儿神经科》2014；50:108-111；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)和不具有(参见Hogervorst等人.《神经学档案》2002；59:787-793；Kloppenborg等人.《神经学》2014；82:777-783；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)CBSDH的个体中。然而，这些改变不总是与中风的证据相关联。另外，CBSDH患者中的脑部成像研究通常展示萎缩或静脉堵塞的病征(参见Vatanavicharn等人.《遗传代谢疾病杂志》2008；31增刊3:477-481，其以全文引用的方式并入本文中)。
扫描揭露皮层下白质的弥漫性对称异常增加信号，并且在较小程度上，脑部半球中的更深白质，主要是顶-枕区域。
1.机制
升高的Hcy水平影响神经健康的精确机制是未知的。数种动物研究展示升高的tHcy水平与神经毒性以及伴随神经与精神障碍之间的相关性。
早期研究展示在运动皮层中具有钴诱导的病变的大鼠中的极高腹膜内剂量的Hcy诱导的泛发性痉挛性癫痫持续状态(参见Mudd等人.“转硫障碍”.载于：Scriver CL,Beaudet AL,Sly WS,Valle D编.《遗传性疾病的代谢和分子基础》.第7版.纽约:麦格劳·希尔；2001；1279-1327，其以全文引用的方式并入本文中)。癫痫发作通过添加Met和维生素B来增强，且存在阻断突触后g-氨基丁酸受体的吡哆醛5'-磷酸盐和Hcy的协同作用的一些证据。此外，啮齿动物新皮层组织的Hcy治疗导致腺苷以AdoHcy形式捕获(参见Heinecke等人.《生物化学杂志》1987；262:10098-10103，其以全文引用的方式并入本文中)。作者陈述，腺苷主要是脑部动作中的抑制剂并且痉挛性病状和与高水平的Hcy相关的精神变化可以通过降低的脑部腺苷水平介导。
Hcy与脑部的神经毒性和形态变化两者相关(参见Hainsworth等人.《生物化学与生物物理学学报》2016；1862:1008-1017，其以全文引用的方式并入本文中)。举例来说，大鼠和兔中的研究展示神经元损伤由Hcy介导的硫代丁酸反应性物质(TBARS)(氧化应激指标)的增加引起(参见Stefanello等人.《代谢性脑病》2007；22:172-182；Toborek等人.《动脉粥样硬化》1995；115:217-224，其两者以全文引用的方式并入本文中)。在经口施用的Met负载之后，在人类中也观察到类似的血浆TBARS增加(参见Domagala等人.《血栓形成研究》1997；87:411-416，其以全文引用的方式并入本文中)。此外，对于升高Hcy水平的鼠类模型中的研究表明，由氧化应激引起的细胞损伤可在患有CBSDH的患者中增强，因为降低的Cys水平产生较低水平的神经元谷胱甘肽(由谷氨酸、Cys和甘氨酸合成的重要抗氧化剂)(参见Vivitsky等人.《美国生理学杂志-调节、综合和比较生理学》2004；287:R39-R46，其以全文引用的方式并入本文中)。
向大鼠脑部的左心室中进行体内Hcy注射产生剂量依赖性神经元损失(参见Yeganeh等人.《分子神经科学杂志》2013；50:551-557，其以全文引用的方式并入本文中)并且培育具有Hcy的大鼠中脑盖神经元会导致多巴胺能神经突的减少和缩短(参见Heider等人.《神经传递杂志增刊》2004；1-13，其以全文引用的方式并入本文中)。在两个研究中，通过共同施用Hcy与NMDA和代谢型谷氨酸受体的拮抗剂来使Hcy的影响钝化，表明针对Hcy诱导神经元损伤的谷氨酸受体介导的途径。针对此途径的进一步证据来源于以下研究，其中Hcy施用导致大鼠脑部突触体的剂量依赖性脂质过氧化(参见Jara-Prado等人.《神经毒性研究(Neurotox Res)》2003；5:237-243，其以全文引用的方式并入本文中)。同样，通过施用NMDA受体拮抗剂来抑制作用。
在自发活性的胚胎大鼠皮层神经元中的研究展示，高于重度升高Hcy的范围的Hcy水平引起神经网络活性的剂量依赖性抑制(参见Gortz等人.《神经科学杂志》2004；218:109-114，其以全文引用的方式并入本文中)。在此研究中所观察到的影响在临床上不相关，因为此类放大的Hcy水平从未在患有CBSDH的患者中达到。然而，高半胱氨酸亚磺酸和高氧化半胱氨酸(通常在具有升高Hcy水平的患者中发现的氧化形式的Hcy)中的适度升高具有类似作用。在每一种情况下，由2-氨基-5-膦酰基戊酸抑制对神经网络的损伤，再次暗示NMDA受体作为此Hcy诱导的神经元功能障碍的介体。这些结果表明与升高Hcy水平相关的神经元功能障碍很可能由Hcy的氧化形式而非由Hcy自身引起。
患有马方综合症和其它结缔组织病症的患者中不存在智力迟钝、抽搐和其它CNS病症表明，CBSDH患者中的神经病症不由原纤蛋白或胶原蛋白中的缺陷引起(参见Mudd等人.“转硫障碍”.载于：Scriver CL,BeaudetAL,Sly WS,Valle D编.《遗传性疾病的代谢和分子基础》.第7版.纽约:麦格劳·希尔；2001；1279-1327，其以全文引用的方式并入本文中)。在患有未经治疗的CBSDH的患者中，SAM的水平升高以及SAH的水平降低抑制髓鞘合成所需的转甲基化反应，产生另外的神经损伤(参见Mudd等人.“转硫障碍”.载于：ScriverCL,BeaudetAL,Sly WS,Valle D编.《遗传性疾病的代谢和分子基础》.第7版.纽约:麦格劳·希尔；2001；1279-1327，其以全文引用的方式并入本文中)。由于再甲基化速率增加，还可能由患有CBSDH的患者中的低丝氨酸水平引起减少的髓鞘合成(参见Orendac等人.《遗传代谢疾病杂志》2003；26:761-773，其以全文引用的方式并入本文中)。最后，Hcy代谢通过提供用于产生去甲肾上腺素和多巴胺的甲基而在单胺的合成中起关键作用(参见Mech等人.《临床精神病学杂志》2016；77:668-671；Folstein等人.《美国神经病学杂志》2007；164:861-867，其两者以全文引用的方式并入本文中)。实际上，“关于抑郁症的高半胱氨酸假设”(参见Folstein等人.《美国神经病学杂志》2007；164:861-867，其以全文引用的方式并入本文中)表述，由升高Hcy水平导致的低水平去甲肾上腺素和多巴胺是抑郁症的主要原因。
大鼠脑部活检体的电子显微术展示持续8周馈入高Hcy饮食的动物中的脑血管结构变化。这些变化与高血浆tHcy水平相关联(参见Lee等人.《营养学杂志》2005；135:544-548，其以全文引用的方式并入本文中)。再持续8周食用饮食叶酸将血浆tHcy降低到正常水平，且显著地降低损伤的血管的发生率。这表明使用叶酸补充降低Hcy可能减少对以实验方式诱导的升高Hcy水平的血管内皮的不利影响。
经设计以评估以减少的B维生素作为单一疗法在患有重度抑郁症(MDD)和CBSDH(归因于至少一种MTHFR多态性)的成人(N＝330)中的功效和安全性的研究发现，用减少的B维生素的组合进行治疗在131名经治疗的患者中显著降低tHcy水平(82.4％)(此子组中的平均降低为25％；p<0.001)，而安慰剂治疗的患者展现tHcy水平的较小升高(参见Mech等人.《临床精神病学杂志》2016；77:668-671，其以全文引用的方式并入本文中)。平均地，所治疗的患者截至第8周具有基于蒙哥马利奥斯伯格抑郁症评分量表(Montgomery Asberg-Depression Rating Scale；MADRS)的12分降低，并且实现42％的完全缓解(p<0.001)。进一步临床改良与大部分反应者中的tHcy水平的显著降低相关。尽管此研究未在患有CBSDH的患者中进行，但其对于患有抑郁症的个体中的Hcy降低展示明显益处，支持‘抑郁症的Hcy假设’(参见Folstein等人.《美国神经病学杂志》2007；164:861-867，其以全文引用的方式并入本文中)。
在12名晚期诊断的患者的研究中首次证实患有与CBSDH相关的精神症状的个体中的降低Hcy疗法的益处(参见Grobe H.《欧洲儿科杂志》1980；135:199-203，其以全文引用的方式并入本文中)。这些患者中的三个从未有效地治疗，并且具有严重的心理病症，具有过早死亡。剩余的8名患者在1岁到26岁(平均13岁)范围内并且都具有精神症状，包括易怒、ADHD、冷漠和精神病。对于2到9岁用吡哆醇或用含有补充性L-胱氨酸的低Met饮食进行治疗与行为和智力发展的惊人改善相关，与生物化学正常化相关。作者强调需要治疗所有患者，而不管诊断年龄和先前治疗，这是因为其研究中所观察到的CBSDH相关后遗症的可逆性和改善。
来自爱尔兰筛选程序的更近期数据用于比较23个患有CBSDH的吡哆醇非反应性个体(339个患者年治疗)的智力能力与10个未受感染的同胞对照的智力能力(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》2001；24:437-447，其以全文引用的方式并入本文中)。在所识别的23名患者中，19名通过NBS诊断患有CBSDH并且在生命早期(在出生6周内)治疗，两名被晚期检测到(年龄2.2岁和2.9岁)并且两名在评估时尚未经治疗。视需要，所有患者都用无Met、半胱氨酸补充的合成氨基酸混合物及维生素B12和叶酸补充剂治疗。在过去5年中，甜菜碱用作佐剂以在早期治疗的饮食顺应性差的患者和所有晚期检测到CBSDH的患者中进行治疗。
总的来说，早期治疗组中19名患者中的13名患者(平均年龄为14.4岁；范围为4.4到24.9)顺应治疗(由生存期血浆fHcy中值<11μmol/L定义)且不具有并发症，而具有较差顺应性的剩余6名(平均年龄为19.9岁；范围为13.8到25.5)出现并发症。与较差顺应性的组中的80.8(范围为40到103)相比，顺应性组中的平均全量表IQ(FIQ)为105.8(范围为84到120)。平均年龄为19.4岁(范围为9.7到32.9)岁的对照组(n＝10)的平均FIQ为102(范围为76到116)。年龄为18.9和18.8岁的两名晚期检测患者的FIQ分别为80和102，而年龄为22.4和11.7岁的两名未治疗患者的FIQ分别为52和53。除FIQ方面以外，顺应性的、经早期治疗的个体与其不受影响的同胞(对照)之间无显著差异，所述FIQ在受影响的同胞中显著较高(p＝0.0397)。尽管数值相对较少，但这些结果表明用良好生物化学对照进行早期治疗阻止智力迟钝。
在一项病例对照研究中也获得了类似的结果，所述研究报告卡塔尔(Qatar)中32例CBSDH和25例同胞对照中的神经发育、教育和认知结果(参见El Bashir等人.《JIMD报告》2015；21:89-95，其以全文引用的方式并入本文中)。此研究中受试者的平均年龄是11.2岁(范围为0.6到29)并且56％是男性。与不受感染的同胞相比，受感染的个体具有较低总IQ(尤其就短期记忆、定量推理和视觉-空间域而言)，且大量青少年和成人病例具有医学并存病以及行为和情绪问题。其中，9个CBSDH病例(28％)由NBS诊断并且在出生第一个月时治疗。其余在14与240个月龄之间被诊断。与在临床上诊断的那些相比，在通过NBS诊断的那些中，治疗时tHcy和Met水平显著更好，可能因为在生命早期具有与饮食和药物的更好的顺应性。在早期诊断的患者与临床诊断的患者之间观察到IQ的显著差异。尽管在语言领域、在特殊学校就读和在课堂上获得额外支持方面，各组之间的差异不具有统计显著性，但‘临床检测’组显然有更多所报告的困难。
尽管此处研究的患者的数目较小，但在出生经诊断的儿童与作为幼童经诊断的儿童之间看到显著差异。临床诊断组的115μmol/L平均tHcy水平与不良临床结果和极低IQ相关。
降低Hcy的治疗对CBSDH患者的精神病理学的益处的进一步证据来源于对来自波士顿儿童医院(Boston Children's Hospital)自1963年以来所有HCU患者的数据的回顾病历纪录审核(M.Almuqbil等人的未公布数据名称(courtesy))。总的来说，识别19名患有HCU的患者，其中3名被排除在分析之外，因为除了CBSDH之外，可能还混杂存在甲基丙二酸血症(也与心理缺陷有关)。在剩余的16名患者中，7名(6名患有CBSDH且一名患有钴胺素(Cbl)缺陷症)对早期治疗具有良好顺应性(四名基于单独饮食，两名使用饮食加甜菜碱且一名使用Cbl)。这些患者中的六名没有除轻度认知缺陷以外的显而易见的精神症状。相比之下，9名患者(7名具有吡哆醇非反应性CBSDH且2名具有CblG缺陷症)对治疗具有较差或可变的顺应性(两名基于甜菜碱和饮食，一名基于单独饮食，三名基于B维生素，且两名使用叶酸和甜菜碱)。所有7名患有CBSDH和具有较差顺应性的患者都具有精神问题，包括抑郁症(n＝4)、偏执体验(n＝2)、偏执狂和妄想性精神病(n＝1)、焦虑症和情绪调节异常(n＝1)以及随着良好代谢控制而改善的ADHD(n＝1)。两个CblG病例显著焦虑或不安。年龄、性别和认知水平并不表现为在精神病上受影响的个体与不受影响的个体之间显著区分。这些结果表明良好代谢控制(Hcy和/或Met降低)有可能延迟，并且可能阻止CBSDH患者中的精神和行为病状的发作。然而，研究未确定受不良控制的CBSDH是否导致精神病理学，或与精神病理学的伴随疾病自身是否妨碍与治疗结果的良好顺应性。
在患有和不患有CBSDH的个体中充分证实了升高水平的Hcy与CNS症状(包括智力迟钝、神经退化性疾病、癫痫发作、肌张力障碍、精神病、认知障碍、痴呆和抑郁症)之间的相关性。(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》2017；40:49-74；Abbott等人.《美国医学遗传学杂志》1987；26:959-969；Mudd等人.“转硫障碍”.载于：Scriver CL,Beaudet AL,Sly WS,Valle D编.《遗传性疾病的代谢和分子基础》.第7版.纽约:麦格劳·希尔；2001；1279-1327；Hidalgo等人.《欧洲儿童与青少年精神病学》2014；23:235-238；Schimke等人.《JAMA》1965；193:711-719；Smith等人.《公共科学图书馆：综合》2010；5:e12244；Seshadri等人.《新英格兰医学杂志》2002；346:476-483；Bottiglieri等人.《神经病学，神经外科和精神病学杂志》2000；69:228-232；Bjelland等人.《普通精神病学档案》2003；60:618-626；Tolmunen等人.《美国临床营养学杂志》2004；80:1574-1578；Kaeser等人.《神经病学，神经外科和精神病学杂志》1969；32:88-93；Golimbet等人.《精神病学研究》2009；170:168-171；Clarke等人.《神经学档案》1998；55:1449-1455；Sinclair等人.《运动障碍》2006；21:1780-1782；Permoda-Osip等人.《神经心理学生物学》2014；69:107-111；Oliveira等人.《BMJ案例报告》2016；2016；Troen等人.《美国国家科学院院刊》2008；105:12474-12479；Sudduth等人.《脑血流和脑代谢》2013；33:708-715；Hainsworth等人.《生物化学与生物物理学学报》2016；1862:1008-1017；Herrmann等人.《临床化学和检验医学》2011；49:435-441；Kim等人.《营养学杂志》2007；137:2093-2097；Selhub等人.《美国临床营养学杂志》2000；71:614S-620S；McCaddon等人.《痴呆与老年认知障碍》2001；12:309-313；Smallwood等人.《神经病理学和应用神经生物学》2012；38:337-343；Beydoun等人.《BMC公共卫生》2014；14:643；Gortz等人.《神经科学杂志》2004；218:109-114；健康质量组织.维生素B12和认知功能：基于证据的分析.安大略省卫生技术评估系列.13(23),1e45.2013.参考类型:在线资源；Salagre等人.《欧洲神经病学》2017；43:81-91，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。认为在具有升高Hcy水平的个体中引起CNS病症的机制涉及tHcy介导的神经元损伤(参见Mudd等人.“转硫障碍”.载于：Scriver CL,BeaudetAL,Sly WS,Valle D编.《遗传性疾病的代谢和分子基础》.第7版.纽约:麦格劳·希尔；2001；1279-1327；Hainsworth等人.《生物化学与生物物理学学报》2016；1862:1008-1017；Stefanello等人.《代谢性脑病》2007；22:172-182；Toborek等人.《动脉粥样硬化》1995；115:217-224，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)，由Hcy介导的氧化应激引起的血管内皮损伤(参见Vivitsky等人.《美国生理学杂志-调节、综合和比较生理学》2004；287:R39-R46，其以全文引用的方式并入本文中)，神经元损失(参见Yeganeh等人.《分子神经科学杂志》2013；50:551-557；Heider等人.《神经传递杂志增刊》2004；1-13，其两者以全文引用的方式并入本文中)和减弱的神经网络活性(参见Gortz等人.《神经科学杂志》2004；218:109-114，其以全文引用的方式并入本文中)。抑郁和抽搐被认为至少部分由脑腺苷水平中的Hcy介导的降低及去甲肾上腺素和多巴胺水平的后续降低引起(参见Mech等人.《临床精神病学杂志》2016；77:668-671；Domagala等人.《血栓形成研究》1997；87:411-416；Vivitsky等人.《美国生理学杂志-调节、综合和比较生理学》2004；287:R39-R46；Folstein等人.《美国神经病学杂志》2007；164:861-867；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
许多研究，在CBSDH的动物模型(参见Lee等人.《营养学杂志》2005；135:544-548，其以全文引用的方式并入本文中)和患有CBSDH的患者中(参见El Bashir等人.《JIMD报告》2015；21:89-95；Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》2001；24:437-447；Mech等人.《临床精神病学杂志》2016；77:668-671；Grobe H.《欧洲儿科杂志》1980；135:199-203，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)，已展示由低Met饮食、叶酸/B维生素补充和/或吡哆醇/甜菜碱疗法诱导的Hcy水平的早期降低可预防且有时逆转各种神经病症的进展。进一步证据由患有CBSDH的患者中的一系列6个病例研究提供，其中Hcy水平的显著降低、甚至正常化引起CNS结果的完全或部分校正(参见Yap等人.《遗传代谢疾病杂志》2001；24:437-447；Brenton等人.《儿童神经病学杂志》2014；29:88-92；Rezazadeh等人.《儿童神经科公开》2014；1:2329048X14545870；Kaeser等人.《神经病学，神经外科和精神病学杂志》1969；32:88-93；Colafrancesco等人.《欧洲儿科杂志》2015；174:1263-1266；Yokoi等人.《国际儿科》2008；50:694-695；Li等人.《病理学(Pathology)》1999；31:221-224，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
这些发现表明CBSDH患者中和一般人群中Hcy水平与CNS病症的风险增加之间的强相关性。早期降低Hcy的疗法对于患有早发型CBSDH的儿童的正常发育和对于在稍后的年岁中经诊断患有CBSDH的患者中的CNS病症的校正或改善至关重要。
IX.定义
如在本说明书中所使用的，除非上下文中另外明确规定，否则单数形式“一种/一个(a/an)”以及“所述(the)”包括多个指代物。
在提供一系列值的情况下，旨在所述范围的上限与下限之间的每个中间值以及所述规定的范围中的任何其它规定的或中间值涵盖于本公开内且具体地公开于本公开内。举例来说，如果陈述范围1μm至8μm，则希望也明确公开2μm、3μm、4μm、5μm、6μm及7μm，以及大于或等于1μm的值的范围和小于或等于8μm的值的范围。
如本文所用，“共同施用(co-administered)”或“共施用(co-administration)”意指施用两种或更多种治疗性组分，包括药物组合物。
如本文所用，“药品”是指药物组合物的剂型，所述药物组合物包括具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的PEG化人类截短的CBS蛋白质(例如20NHS PEG-CBS)的药物物质。
如本文所用，“药物物质”是指具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的PEG化CBS蛋白质(例如20NHS PEG-CBS)。
如本文所用，“负面临床结果”是指由疾病、病症或病状引起的非所要表型结果。
如本文所用，“重组”，在提及例如细胞、核酸、多肽、表达盒或载体使用时，是指材料或与所述材料的自然或天然形式相对应的材料，其已通过引入新的分子或改变现有的分子而经修饰，或与之相同但由合成材料生产或衍生。举例来说，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式(即，“外源性核酸”)内未发现的基因或表达在不同水平(通常低表达或根本不表达)以其它方式表达的天然基因。
重组技术可以包括例如使用重组核酸(如编码蛋白质或反义序列的cDNA)插入到表达系统(如表达载体)中；将所得构建体引入到细胞中，并且适当时，细胞表达核酸和蛋白质。重组技术还涵盖将核酸与来自不同来源的编码序列或启动子序列接合到一个表达盒或载体中以用于表达融合蛋白、蛋白质的组成型表达或蛋白质的诱导型表达。
如本文所使用，术语“受试者”、“个体”或“患者”在本文中可互换地使用并且指脊椎动物，优选哺乳动物。哺乳动物包括(但不限于)人类。
如本文所使用，“相关”是指与疾病、病状或表型的发展或表现一致。关联可归因于(但不限于)负责管家功能的基因，其改变可为多种疾病和病状提供基础，作为涉及特定疾病、病状或表型的途径的一部分的那些基因以及间接促成疾病、病状或表型的表现的那些基因。
如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载剂”是指可任选地包括于本公开的组合物中并且对患者不造成显著不利毒理学作用的赋形剂。确切地说，在本发明实施例中，这是指可以与活性化合物(此处为PEG化htCBS或“20NHS PEG-CBS”)组合服用到哺乳动物受试者身体而对受试者无显著不利毒理学作用的赋形剂。
如本文所用，术语“佐剂”、“稀释剂”或“载剂”意指其本身不是治疗剂的用作用于递送治疗剂和适用于向受试者(例如哺乳动物)施用或添加到药物组合物中的载剂的任何物质，以改善其处理或存储性质，或允许或促进组合物的剂量单位形成为适合口服施用的离散的制品，如胶囊或片剂。术语“佐剂”、“稀释剂”或“载剂”涵盖“赋形剂”，包括“药学上可接受的赋形剂”、“载剂”、“溶剂”等，如本文中所使用的那些术语。赋形剂和载剂包括本领域中已知的任何此类物质，例如无毒性的且不以有害方式与组合物的其它组分相互作用的任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂等。施用可以意味着经口施用、吸入、肠内施用、通过静脉内注射馈入或接种。赋形剂可以包括标准药物赋形剂并且还可以包括可以用于制备用于人类和/或动物食用的食品和饮品、饲料或铒料制剂或其它食品的任何组分。
如本文所用，“药物”或“药理学活性剂”或任何其它类似术语意指任何化学或生物物质或化合物，包括肽，适用于通过本领域中先前已知的方法和/或通过本公开中教示的方法施用，所述化学或生物物质或化合物诱导所需生物或药理学作用，其可包括但不限于(1)对生物具有预防性作用且防止非所需生物作用，如防止感染，(2)缓解由疾病所引起的病状，举例来说，缓解由于疾病引起的疼痛或发炎，和/或(3)从生物缓解、减轻或完全排除疾病。作用可为局部的，例如提供局部麻醉剂作用，或其可为全身性的。本公开并不涉及新型渗透剂或新类别的活性剂。实际上，其限于先进技术中存在的或随后可能被确定为活性剂且适用于通过本公开进行递送的药剂或渗透剂的递送方式。
如本文所用，术语“约”，特别是关于给定数量，意指涵盖加上或减去5％的偏差。
如本文所用，如与本发明组合物有关的术语“药理学上有效量”或“治疗有效量”是指无毒但足够量的活性剂(或含有活性剂的组合物)，以在待治疗的受试者中的血流内或作用部位(例如细胞内)处提供所需水平，和/或提供所需生理、生物物理、生物化学、药理学或治疗性反应，如改善高胱氨酸尿症的表现。所需的精确量将在受试者之间变化，且将取决于多种因素，如活性剂、组合物的活性、所采用的递送装置、组合物的物理特征、预期患者使用(即，每天施用的剂量数)，以及患者考虑因素，如受试者的物种、年龄和一般状况、所治疗的病状的严重程度、受试者服用的额外药物、施用模式等。这些因素和考虑因素可由本领域的技术人员基于本文所提供的信息而容易地确定。可由本领域的一般技术人员基于本文所提供的信息使用常规实验确定任何个别情况下的适当“有效”量。
如本文所使用，术语“核酸”可以呈RNA形式或呈DNA形式，并且包括信使RNA、合成RNA和DNA、cDNA和基因组DNA。DNA可以是双股或单股，并且如果单股可以是编码股或非编码(反义互补)股。
如本文所用，“突变型”是经设计或工程改造以改变与糖基化、蛋白质稳定和/或配体结合相关的特性或功能的突变蛋白质。
如本文所使用，术语“天然”或“野生型”相对于给定细胞、多肽、核酸、性状或表型是指通常在自然界中发现的形式。
如本文所用，术语“蛋白质”、“多肽”、“寡肽”和“肽”具有其常规含义并且可互换地使用以表示通过酰胺键共价连接的至少两种氨基酸的聚合物，而无关于长度或翻译后修饰(例如糖基化、磷酸化、脂质化、肉豆蔻酰化、泛素化等)。此外，本文所描述的多肽不限于特定长度。这一定义中包括D-和L-氨基酸，以及D-和L-氨基酸的混合物。此术语也不指或排除多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域中已知的天然存在的和非天然存在的其它修饰。多肽可以是整个蛋白质或其子序列。多肽还可以指包含抗原决定基的氨基酸子序列，所述抗原决定基即基本上负责多肽的免疫原性特性并且能够引发免疫反应的抗原决定子。
如本文所用，“对应于…的位置”等是指核酸分子或蛋白质中相对于另一种参考核酸分子或蛋白质中的位置的所关注位置(即，碱基对或残基数)。对应位置可以通过比较和比对序列以使匹配核苷酸或残基的数目达到最大来确定，例如使得序列之间的一致性大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％。接着所关注位置被赋予参考核酸分子中所分配的数目。举例来说，如果在SEQ ID NO:X的核苷酸2073处发生基因-X中的特定多态性以识别另一等位基因或分离物中的对应核苷酸，那么序列经比对且接着识别与2073对齐的位置。因为各种等位基因可以具有不同长度，所以指定2073的位置可以不是核苷酸2073，而是处于“对应”于参考序列中位置的位置。
如本文所使用，术语“长期施用”是指在6周或更长的时间段内施用与PEG部分结合的CBS酶、htCBS或htCBS突变体(例如，具有C15S突变)。
如本文所使用，术语“连续施用”是指在整个研究过程中经由皮下注射或植入渗透泵，重复施用与PEG部分结合的CBS酶、htCBS或htCBS突变体(例如，具有C15S突变)。
本文描述经由酶疗法(ET)用本文所描述的药品治疗高胱氨酸尿症的方法，所述药品包括在氨基酸位置15处具有半胱氨酸到丝氨酸的突变的PEG化人类截短CBS蛋白质。
以下所附描述中阐述了本公开的一个或多个实施方式的细节。现描述优选的物质和方法，但在本公开的实践或测试中还可以使用与本文所描述的物质和方法类似或等效的任何物质和方法。根据描述，本公开的其它特征、目的和优点将变得显而易见。在描述中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式还包括复数形式。除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域中的普通技术人员通常所理解相同的含义。在冲突的情况下，以本说明书为准。
通过以下非限制性实施例进一步说明本公开。
实施例
实施例1.实验方案
A.发酵
将具有编码截短人类CBS的序列的表达载体转型到Bl-21(DE3)大肠杆菌细菌中，且将来自卡那霉素(kanamycin)抗性克隆的细菌在具有30μg/mL卡那霉素的5ml卢里亚-贝尔塔尼(Luria-Bertani；LB)培养基中，在37℃下在275rpm下的旋转振荡器上生长过夜。将1mL过夜培养物添加到具有30μg/mL卡那霉素的100mLTB培养液(Terrific Broth)培养基中并且生长过夜。接着将10ml预培养物添加到1升TB培养基中，所述TB培养基含有0.001％的硫胺-HCl pH 8.0、0.0025％的吡哆醇-HCl pH 8.0、0.3mMδ-ALApH 8.0、150μM氯化铁、30μg/mL卡那霉素。接着在30℃下在275rpm下的旋转振荡器上生长培养物直到OD600达到约0.6-0.7的值为止，并且通过添加1mM IPTG诱导蛋白质表达。继续发酵额外16小时。在4℃下通过以6000相对离心力(rcf)离心10分钟收集细胞，用冰冷0.9％NaCl洗涤，如上再离心，并且在-80℃下冷冻。接着将裂解缓冲液(20mM NaH2PO4，pH 7.2，40mM NaCl，0.1mM PLP)添加到细胞团块中并且将后者在Dounce均质器中均质化并且用溶菌酶(最终2mg/mL)处理，在摇动平台上在4℃下培育1小时，超声处理以降低粘度，并且在53,000rcf下离心。接着将包含可溶洗脱份的上清液存储于-80℃下。
优化和规模扩大计划经设计以建立用于CBS的高水平表达的发酵过程、培养基补充剂的量和添加特征，所述补充剂如5-氨基乙酰丙酸(ALA)、硫胺(维生素B1)、吡哆醇HCl和/或氯化铁、C源和其起始和进料条件、温度、pH以及诱导条件(诱导物浓度和诱导时间段长度)。
最高细胞密度和最佳表达水平在30℃下在24小时的诱导时间段期间在补充有总共0.05g/LB6和0.5g/LALA的最小盐培养基(C源：丙三醇)的情况下实现。
在发酵结束(EOF)时，实现600nm(OD600)下约110±10的细胞密度，其对应于约90±10g/L的湿重。如通过放射性和比色活性分析所测定，发酵过程的CBS滴度为约2.5-3.0gCBS/L。
B.纯化
假设将需要至少三个色谱步骤，来自细胞裂解物的经纯化的酶的总体酶活性回收目标为30％。以60mL捕获柱的规模评估开发的工艺。
1.捕获步骤
阴离子交换色谱(AEX)在生产重组CBS中用作第一捕获步骤。接着抛光洗脱液以通过在接近中性pH下在DEAE-琼脂糖树脂上捕获，之后以KH2PO4的线性梯度来进一步纯化。DEAE-琼脂糖为弱交换剂，这意味着系统的电荷取决于周围pH。因此，pH与树脂的动态结合能力(DBC)具有密切关系。将结合pH降低到6.4并不降低捕获步骤的性能。如果用于细胞浆料的稀释物使用5体积的破坏缓冲液用于溶解，那么装载时间为约30分钟。
进行10柱体积的洗涤，负载容量接近7g/L CBS的所确定的最大值(其等效于每L树脂约35g总蛋白质的DBC)。洗脱在16mS/cm的洗脱电导率条件下在120mM NaCl存在下进行。
观测到回收为约90％，只要细胞提取物在窄时间范围内装载即可。取决于细胞提取物内部的CBS滴度，通过此捕获步骤，达到约3.5的纯化系数。
2.固定化金属亲和色谱(IMAC)
IMAC(也称为Co2+固定化金属亲和色谱)与锌(Zn)离子一起使用结合选择性在CBS与宿主细胞蛋白质(HCP)之间进行正交分离。观察到约2.5的纯化系数。
洗脱步骤包括11mM咪唑与脱盐CBS洗脱份的组合。在洗脱缓冲液内部，氯化钠浓度从400mM(负载/洗涤)降低到50mM。在小规模的筛选中可以示出，电导率对洗脱行为本身有很大影响。举例来说，有可能仅通过纯水在无咪唑的情况下洗脱CBS。通过增加洗脱缓冲液内部氯化钠的量来增加CBS的稳定性。在150mM氯化钠下，洗脱行为仅稍微改变。
使用HEPES作为缓冲液系统，可测量12-15g/L的DBC。另外，样品的稳定性不仅在沉淀方面得到了增加，而且还降低了降解。通过添加EDTA，与目前使用的磷酸盐缓冲液系统相比，通过使用HEPES缓冲液中止降解。在扩大规模时，EDTA和硫酸铵在洗脱结束后立即添加，这应该抑制降解。另外，为了使培育时间在此状态下保持较短，以下抛光也尽可能快地进行。在3小时内将IMAC洗脱池装载到疏水性相互作用色谱(HIC)柱上用于抛光。
3.抛光步骤
CBS纯化系统的最终色谱步骤处的分离是基于疏水性相互作用。主要柱通过洗脱条件的差异从大部分HCP分离所关注的蛋白质CBS。大部分HCP与CBS相比更坚固地结合到HIC上，表明CBS的疏水性小于大部分剩余的HCP。
与IMAC相比，HIC具有低结合分离(小于10％)。超过90％的剩余HCP杂质通过洗脱步骤与HIC分离。HIC的CBS回收为约95％。DBC在约16g/L至约18g/L之间。此抛光步骤的性能是相当稳固的。洗脱步骤的pH在6与8之间。缓冲液系统(磷酸盐或20mM HEPES)不具有可测量的影响。
由于负载内部的低残余HCP含量，此抛光步骤的纯化系数为约1.1，这对于最终色谱步骤是典型的。所有进行的下游生产过程之间的最终CBS的纯度类似地高，这表明此抛光步骤补偿负载内部的不同程度的杂质。
可进行调适以便使工艺步骤适应现有设备且允许稍后按比例扩大到100L发酵体积以用于生产。为了确保可靠的产品质量，可将EDTA(例如10mM)添加到若干工艺步骤中，以防止由金属蛋白酶引起的产品降解。
C.PEG化
PEG化反应表现得如具有产物诱导抑制的二级反应。因为NHS-PEG处的水解无法作为抑制所述反应的原因，并且在4小时PEG化之后达到最终PEG化模式，所以观察到剩余(约50％)的NHS-PEG仍具有活性。有趣的是，将进一步的NHS-PEG添加到反应混合物中增加PEG化模式。在反应混合物内部，CBS浓度为8g/L，以获得所要PEG化模式，而在不存在DMSO的情况下不增加NHS-PEG与CBS比率。
D.数据和统计分析
表4提供用于本文中的实施例中的数据分析的关于软件、分析工具和算法的细节。
表4.程序和统计分析
色谱采集和色谱峰积分 ABSciexANALYST<sup>TM</sup>1.6软件
标准回归、浓度计算、数据管理 ThermoScientificWatsonLIMS<sup>TM</sup>
WatsonLIMS与数据系统之间的接口 文本文件
对于SS和WS控制的计算 微软Excel
回归模型 线性
加权因子 1/x2
浓度呈现 3个有效数字
浓度单位 μmol/L或μM的等效基质
所报告的概述统计 平均SD、DEV％、CV％
用于DEV％和CV％的小数点数 2
所有的色谱图都由分析员审查，以确保色谱峰形和峰积分令人满意。手动传输的数据针对作为研究原始数据一部分的源数据进行交叉检查。在分析之前，基于来自校准标准、QC和空白QC的结果，设定运行验收标准。数据以平均值±平均值的标准误差(SEM)呈现。
使用ANOVA之后使用杜凯氏多项比较试验(Tukey’s multiple comparison test)进行统计分析，以确定显著性。
E.基于经放射性标记的Ser的转化的CBS活性分析
CBS催化β置换反应，其中丝氨酸(Ser)以吡哆醛5'-磷酸盐(PLP)依赖性方式与Hcy缩合以形成Cth。CBS酶的活性使用14C标记的Ser作为底物通过放射性同位素分析来测定：
14C-L-Ser+L-Hcy→14C-L-Cth+H2O
将7μl(总共420ng)纯20NHS PEG-CBS于稀释缓冲液(含有1mM DTT、10μM PLP和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的pH 8.6下的0.1M Tris-HCl)或7μl血浆(D25和D27样品不需要稀释)中的等分试样添加到88μl反应混合物(含有10mM L-Ser、0.5mM PLP、0.5mg/ml BSA和0.3μCi L-[14C(U)]-Ser的pH 8.6下的0.1M Tris-HCl)。通过在水浴中培育5min将样品平衡到37℃。用5μl 0.2M Hcy(最终浓度10mM)引发反应并且在37℃下再培育30min。
使所得混合物的分析起始和取样交错，使得每一反应时间恰好为30min。下行纸色谱用于将放射性产物(Cth)与标记的底物(Ser)分离。为了停止反应，在冰浴中冷却分析混合物，并且将20μl等分试样用移液管吸取到3级CHR色谱纸(Whatman，通用电气医疗集团(GEHealthcare)，美国宾夕法尼亚州匹兹堡(Pittsburgh,PA,USA))上用于分离。用2-丙醇:甲酸:H2O(75:5.7:18.9v/v)洗脱情况下将在反应中形成的14C-Cth与14C-Ser分离过夜。含有Cth和Ser混合物的标准品与样品一起在色谱纸的每一侧上运行。将色谱纸干燥，并且用酸性茚三酮溶液对标准品泳道进行染色。将含有标记Cth的每一样品泳道的区域切除，浸没在5ml Opti-flour闪烁混合液(珀金埃尔默(PerkinElmer)，美国马萨诸塞州北比尔里卡(North Billerica,MA,USA))中，并且在Beckman LS-3801闪烁计数器中计数。不含酶的样品用作空白组以监测背景放射性并且从每个样品中的计数减去这一点。对于纯酶对照，CBS比活性值表示为每mg CBS(即，U/mg蛋白质)的酶单位(产生1μmol Cth/h的酶的量)。对于血浆样品，活性值表示为每μl血浆(即，mU/μl血浆)的毫单位(产生1nmol Cth/h的酶的量)。
将标称值为25mg/ml的这些储备溶液(24.8-26.7mg/ml，在磷酸盐缓冲盐水中，pH7.4(PBS))以等分试样在-80℃下存储。在每一处理日，通过将储备溶液稀释到PBS中达到1mg/ml的最终浓度来制备一次性使用的新鲜酶溶液，并且将这些以7.5mg/kg的剂量递送到小鼠。基于指定天数的重量计算所注射以施用目标剂量的体积。在注射完成后，舍弃那一天剩余的任何溶液。
F.蛋白质印迹法
将药品注射到四个I278T-/-小鼠中，且在第一次注射之后24小时和最后一次注射之后72小时收集血液以充当对照。通过蛋白质印迹法分析来自实施例5中的所有组别的D25和D27血浆样品以检测潜在体内去PEG化。将血浆样品(4μl/泳道)负载于梯度(4％-20％)MiniProtean TGX凝胶(拜耳雷德(Bio-Rad),美国加利福尼亚州赫拉克勒斯(Hercules,CA,USA))上，并且通过在变性、还原条件下电泳分离蛋白质。类似地处理分子量标记物(精确度加蛋白质双色标准品(Precision Plus Protein Dual Color Standard)，拜耳雷德)和来自各制剂的等分试样(每泳道150-500ng)，且连同血浆样品一起对其进行电泳。在电泳分离之后，将蛋白质带转移到PVDF膜(拜耳雷德)。将个别膜在4℃下在阻断溶液(含0.02％Tween20的PBS中5％非脂乳)中阻断过夜。接着洗涤膜并且与兔多克隆抗hCBS抗体(OrphanTechnologies UCD Kraus实验室批次号R2B2，阻断溶液中稀释5000倍的抗血清)一起培育1h。接着洗涤膜且与结合抗兔IgG的辣根过氧化酶(HRP)(杰克逊实验室(JacksonLaboratories)，美国缅因州巴尔港(Bar Harbor,ME,USA)，阻断溶液中稀释5,000倍)一起培育30分钟。在洗涤膜之后，通过与化学发光底物(SuperSignal West Pico，赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific),美国马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA,USA))一起培育5分钟，随后在透明蓝色X射线膜(CL-Xposure膜，赛默飞世尔科技)上进行信号捕获，使条带显现。使用平面扫描器(Perfection V550照片彩色扫描仪(Photo Color Scanner),爱普生(Epson)，美国加利福尼亚州加利福尼亚州(Long Beach,CA,USA))扫描显影的膜。
G.化学制品
除非另外说明，否则所有材料都购自西格玛(Sigma)或飞世尔科技(FisherScientific)。L-[U-14C]-丝氨酸获自珀金埃尔默生命科学(Perkin Elmer LifeSciences)。
H.血浆收集和分析
用于颌下出血的一次性使用的刺血针用于血液收集到具有肝素锂的BD微量采血PST管(美国BD公司(Becton,Dickinson and Company)，美国新泽西州(NJ,USA))中。接着以10,000×g使管离心5min，随后将血浆转移到1.5ml管并且在-80℃下存储。如其它地方所描述，血浆硫氨基酸代谢物通过稳定-同位素-稀释液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定。
I.动物研究
使用表达人类I278T突变型CBS转基因的小鼠(I278T CBS-/-(I278T-/-)小鼠)的CBS基因敲除品系进行研究。基于C57BL6背景的杂合转基因I278T小鼠的育种对由WarrenKruger博士(福克斯契斯癌症中心(Fox Chase Cancer Center)，美国宾夕法尼亚州费城(Philadelphia,PA,USA))提供。小鼠具有敲低的小鼠CBS基因并且还在金属硫蛋白启动子的控制下表达I278T人类CBS(参见Wang等人.(2005)《人类分子遗传学(Hum Mol Genet)》14,2201-2208，其以全文引用的方式并入本文中)。突变型酶具有约2％-3％的CBS WT活性，使得转基因表达挽救一般在CBS基因敲除纯合小鼠中观察到的新生儿致死现象(参见Watanabe等人.(1995)《美国国家科学院院刊(Proceedings ofthe NationalAcademy ofSciences USA)》92,1585-1589；Maclean等人.(2010)《分子遗传学与代谢(MolecularGenetics and Metabolism)》101,163-171；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。除非另外指示，否则动物以标准照射的挤压啮齿动物食物(Teklad 2920X，Envigo,美国印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis,IN,USA))维持。
为了产生CBS纯合转基因研究动物，将纯合或杂合雄性与杂合雌性一起培育，产生含有CBS纯合(-/-)幼畜的窝仔，以及其它基因型，所有都表达I278T转基因。为育种对和新生儿小鼠提供锌(在饮用水中的25mM硫酸锌)以诱导转基因表达。纯合品系(I278T-/-)(具有高胱氨酸尿症(HCU)表型)充当CBSDH的模型，而所获得的其它基因型不用于此研究(参见Wang等人.(2005)《人类分子遗传学》14,2201-2208，其以全文引用的方式并入本文中)。
本研究中使用的所有动物程序都通过科罗拉多大学-丹佛分校IACUC的审查和批准，所述研究遵守所有联邦、州和地方的法律、法规和政策。科罗拉多大学-丹佛分校为AAALAC认证(#00235)、公共卫生署保证(#A 3269-01)和USDA许可(#84-R-0059)的机构。在IACUC批准的方案#B-49414(03)1E下进行涉及小鼠的程序。
小鼠在我们的机构处进行繁殖和基因分型，如先前在以下中所描述：Wang等人.(2005)《人类分子遗传学》14,2201-2208，其以全文引用的方式并入本文中。育种对以挤压标准饮食2920X(Envigo，美国加利福尼亚州)和含有25mM ZnCl2的水维持以诱导转基因表达并且因此从新生儿死亡中挽救纯合I278T幼畜。在21日龄时断奶之后，将纯合I278T小鼠和其野生型同胞分配到八个组中的一个中。在24日龄时，将小鼠切换到具有正常(EnvigoTD.170063，4％Met；A组、B组、C组和D组)或有限甲硫氨酸含量(Envigo TD.110591，0.5％Met；E组、F组、G组和H组)的氨基酸限定饮食。除第24天时的新饮食以外，小鼠还一周3次(星期一、星期三、星期五)接受皮下注射的PBS媒剂(A组、C组、E组和G组)或10mg/kg 20NHSPEG-CBS(B组、D组、F组和H组)，直至22周龄。每周对小鼠称重，体重用于计算每周的20NHSPEG-CBS注射体积。
J.酶存储和制备
呈液体制剂的20NHS PEG-CBS用于在如本文所述的cGMP下进行的稳定性研究，并且从这一研究获得以下样品：低于-65℃存储的对照酶或“对照制剂”(T0-80C)和在加速稳定性条件下、在25℃下培育2天(T2D-25C)、1个月(T1M-25C)和6个月(T6M-25C)的酶样品。
实施例2.测量药品制剂中PEG化水平的降低
产生具有不同程度的去PEG化的药品制剂用于加速稳定性研究，其在用于药品的“良好制造实践”(GMP)条件下通过在25℃下培育药品两天、一个月或六个月来进行。将对照样品存储在推荐温度范围内，即低于-65℃。
通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)确认制剂之间的PEG化差异。区分十个高度PEG化和较少PEG化物质，以及无PEG化的CBS和在酶变性后释放的血红素辅因子(P10)。通过比较对应于可变地PEG化或完全去PEG化物质的峰的相对面积来确定每个样品中的去PEG化程度。RP-HPLC结果展示于表5中。“CBS”是原生(未经修饰的)酶，并且其余的峰是具有不同PEG化水平的制剂。
表5.峰面积
Figure BDA0003521194860000981
Figure BDA0003521194860000991
RP-HPLC分析指示，与对照样品相比，在25℃下培育1个月且甚至更久持续6个月的制剂中存在显著去PEG化。如表5中所示，这些样品展示对应于较少PEG化形式(例如P3)的较高比例的峰，而对于较多PEG化形式(如P6和P7)，峰的丰度同时较低。此外，对应于未修饰(或完全去PEG化)CBS的峰在培育六个月的制剂中最显著，然而，在25℃下培育2天的制剂中，可变PEG化物质的分布更类似于始终在小于或等于-65℃下存储的对照酶中的分布。
实施例3.PEG化水平降低的制剂在小鼠中的功效
为了评估药品和其去PEG化制剂当中的生物等效性，在I278T CBS-/-(I278T-/-)小鼠中分析功效，所述小鼠即再现CBSDH的生化后遗症的模型，生化后遗症即甲硫氨酸(Met)代谢物血浆水平的异常，包括高半胱氨酸(Hcy)的升高和半胱氨酸(Cys)的抑制。血浆氨基硫醇(总Cys和Hcy)和剩余氨基酸以及SAM和SAH通过如以下中所描述进行的LC-MS/MS测量：Arning等人.(2016)《分子生物学方法(Methods Mol Biol)》1378,255-262，其以全文引用的方式并入本文中。
I278T CBS-/-(I278T-/-)小鼠缺乏小鼠CBS基因并且表达携有CBSDH患者中最广泛发现的病原性突变的I278T突变型人类CBS基因。这些小鼠表达约2％-3％的野生型CBS活性并且具有高胱氨酸尿症(HCU)表型(参见Wang,等人.(2005)《人类分子遗传学》14,2201-2208，其以全文引用的方式并入本文中)。这包括Hcy、Met和S-腺苷高半胱氨酸(SAH)的血浆和组织水平的升高，以及血浆Cth和Cys水平的伴随降低。此小鼠品系最初从福克斯契斯癌症中心(美国宾夕法尼亚州费城)的Warren D.Kruger教授获得。
以标准(REG)饮食维持的雄性和雌性成年I278T-/-小鼠都用于测试功效。在研究起始时，将小鼠划分成四个组，对应于四种制剂。收集血液以用于给药之前至少一周的基线测量。使用经设计用于颌下取样到具有肝素锂和凝胶的血浆制备管中的一次性刺血针，从清醒的研究动物的颌下静脉收集血液(葛莱娜第一生化(Greiner Bio-One)，美国北卡罗来纳州门罗(Monroe,NC,USA)或来自其它供应商的等效物)。在以1,200×g离心10min之后，从血液样品收集血浆并且在1.5ml管中在-80℃下存储直到分析。
从第1天(D1)开始，小鼠每周(星期一、星期三和星期五)接受对应于其实验组的相应制剂的三次皮下(SC)注射，每一次都为7.5mg/kg。
处理持续24天。制剂注射天为D1、D3、D5、D8、D10、D12、D15、D17、D19、D22和D24。在注射后24小时以及在最后一次注射后72小时每周至少一次收集血液。除基线(D0)收集之外，在D2、D11、D18、D25和D27时进行血液取样。在收集之后立即从所有血液样品制备血浆，并且将其存储为冷冻等分试样直到分析。分析每一样品的等分试样的Met代谢物，同时还分析一些(D25和D27)的等分试样的CBS活性，如实施例4中所描述。所分析的Met代谢物为：Hcy、Cth、Cys、Met、Bet、二甲基甘氨酸(DMG)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和S-腺苷高半胱氨酸(SAH)。除非另外指示，否则将两种性别的结果汇集。
当通过皮下注射给出时，基于其提高所分析的Met代谢物的血浆水平的能力对制剂进行比较。另外，在同一小鼠中检查制剂的体内去PEG化。
除基线(D0)之外，在D2、D11、D18、D25和D27时进行血液取样。在收集之后立即从所有血液样品制备血浆，并且将其以等分试样冷冻存储直到分析。分析每一样品的等分试样的Met代谢物，同时还分析一些(D25和D27)的等分试样的CBS活性。还通过蛋白质印迹法分析所选择的等分试样(D2和D27)以评估体内20NHS PEG-CBS去PEG化。
在CBSDH患者中，Hcy以及通常Met的血浆和组织水平较高，而Cth和Cys的血浆和组织水平较低。基于标准饮食的I278T-/-小鼠在血浆中具有升高的Hcy和降低的Cys水平，因此再现了在CBSDH患者中观察到的代谢异常调节的关键方面(参见Wang等人.(2005)《人类分子遗传学》14,2201-2208，其以全文引用的方式并入本文中)。在此研究中所分析的代谢物当中，血浆Hcy为临床上最常监测到的标记物(参见Morris等人.(2017)《遗传代谢疾病杂志》40,49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。
血浆Hcy、Cys、Cth和Met水平(平均±SEM)在表6中示出。
表6.平均血浆代谢物水平
Figure BDA0003521194860001001
Figure BDA0003521194860001011
如表6中所示，不论制剂，I278T-/-小鼠中的血浆Hcy水平极高(D0时≥450μM)并且基本上在第一次注射的24小时内下降。在25℃下培育一个月的已经历相当大的去PEG化的制剂(T1M-25C)，展现与低于-65℃存储的对照制剂(T0-80C)及在25℃下培育2天的制剂(T2D-25C)等效的功效。总体影响的统计分析指示，基于Hcy水平，培育6个月的制剂(T6M-25C)比其它制剂显著更不有效(p<0.00501)。在D27时，Hcy水平保持低于其它两种制剂在D0时的水平(p<0.01)。相比之下，培育6个月的制剂(T6M-25C)仍有效但显著小于其它制剂(p<0.01)，与其它三组中的88-145μM相比，产生约200μM的血浆Hcy水平。在最后一次注射后72小时，使Hcy水平部分增加，但尚未恢复到未处理小鼠中的水平(对于对照制剂(T0-80C)和培育2天的制剂(T2D-25C)，在D27时对比在D0时的p<0.01，但对于培育1个月(T1M-25C)和6个月(T6M-25C)的制剂，差异不显著)。这些结果符合以下中的先前药效学研究：Majtan等人.《生命科学(Life Sci)》200,15-25(2018)，其以全文引用的方式并入本文中。
总体影响的统计分析指示培育6个月的制剂对Cys水平的影响显著低于其它制剂的影响(p<0.001)。通过所有制剂，除培育六个月的制剂(T6M-25C)之外，将CBSDH模型小鼠中抑制的血浆Cys水平正常化(约200-250μM)。较高Cys水平在注射时程结束之后72小时内恢复到基线。
尽管高度可变，但通过使用所有制剂处理的血浆Cth水平都升高了，这与所有制剂具有CBS催化活性的观察结果一致。因此，与其它三种制剂相比，培育6个月的制剂(T6M-25C)更有可能具有药代动力学的差异而非药效学的差异。
血浆Met水平未展示反应于处理的显著模式，这与先前的观测结果一致，即血浆Met水平主要反映CBSDH模型小鼠中的饮食Met摄入，无论是否有20NHS PEG-CBS处理，Majtan等人.《遗传代谢疾病杂志》41(增刊1),S56(2018)。统计分析指示在四个制剂当中Cth水平无显著差异。
除Hcy、Cys、Cth和Met以外，若干其它分析物还包括于代谢物组中，并且这些代谢物的水平在组别之间未展示显著差异。额外分析物展示于表7中。
表7.额外分析物的平均水平
Figure BDA0003521194860001021
Figure BDA0003521194860001031
如表7中所示(并且如表6中所提供)，T0-80C是指对照制剂，T2D-25C是指在-25℃下培育2天的制剂，T1M-25C是指在25℃下培育1个月的制剂，并且T6M-25C是指在25℃下培育6个月的制剂。RP-HPLC结果指示在25℃下体外培育1个月并且甚至更久在6个月时培育的20NHS PEG-CBS中已发生显著的去PEG化。然而，用所有四种制剂处理I278T-/-小鼠引起血浆Hcy水平的显著降低，但在最显著的去PEG化样品(在25℃下培育6个月的制剂)中，此降低显著较不明显(p<0.01)。类似地，所有制剂使血浆Cys水平提高，但同样，在25℃下培育6个月的制剂比其它制剂显著较不有效(p<0.001)。与基线水平(D0)相比，在处理时间段期间收集的所有样品展示升高(尽管可变)的Cth(由每一制剂从其底物Hcy形成的产物)血浆水平。这指示制剂都具有催化活性，这一发现与注射之前对制剂进行的比活性测量值一致。血浆Met水平并未受到处理的显著影响，这与我们先前的发现一致，即Met水平似乎主要受饮食摄入的影响，而不是受药品处理的影响，并且与以下事实一致：在整个研究中，所有小鼠均基于标准饮食。所有处理都导致升高的血浆CBS活性，但与其它组别中相比，在接受在25℃下培育6个月的制剂的小鼠中，活性显著较低(p<0.01)。因此，用大部分去PEG化制剂进行处理引起血浆中较低的酶活性，其在体内转化成较低功效，而其它两种25℃培育的制剂作为对照样品是有效的。值得注意地，培育一个月的与对照相比显著去PEG化的制剂展示与对照类似的功效。在培育2天、1个月或6个月之后观察到的去PEG化水平很可能仅在加速稳定性测试条件下实现且在临床环境中极不可能发生。
实施例4.具有降低PEG化水平的制剂的酶活性
在最后一次注射后24和72小时，测量血浆CBS活性，即在D25和D27时收集的血浆样品中制剂的催化活性。
使用Kayastha等人《分析生物化学(Anal Biochem)》193(2),200-203(1991)(其以全文引用的方式并入本文中)中描述的比色分析，稳定性研究结果指示在6个月培育时间段期间无CBS比活性(每批次的200±100U/mg蛋白质)损失，其中活性测量值对于对照、2天、1个月和6个月制剂分别为145、204、170和205U/mg蛋白质。
基于如实施例1中所描述的放射性标记的Ser的转化，还进行另一CBS活性分析。CBS活性的测量值展示于表8中。
表8.CBS活性
Figure BDA0003521194860001041
基于发现，体内去PEG化并不显著。此外，当体外加速直到并且包括所培育的制剂中的水平时，未观测到去PEG化影响CBS活性或体内功效。
与Met代谢物的提高一致，所有制剂都导致所有组的血浆CBS活性升高，尽管观察到培育6个月的制剂在D25时显著低于其它组(p<0.04)，但在D27时没有。再次，在培育1个月的制剂中的显著去PEG化并不影响体内实现的血浆CBS活性水平，结果与具有对照的那些结果相当。
当使用监测放射性Ser转化的相同方法分析时，对照、培育2天的制剂、培育1个月的制剂和培育6个月的制剂的比活性分别为2324.11、1714.19、1786.08和1318.76U/mg蛋白质。培育一个月的与对照相比显著去PEG化的制剂(T1M-25C)展示与对照类似的活性。
实施例5.体内去PEG化的蛋白质印迹分析
为了评估药品是否经历体内去PEG化，通过蛋白质印迹法分析用对照处理的来自CBSDH模型小鼠的血浆等分试样。在D2时，观察到血浆样品中的PEG化模式类似于注射之前的对照中的PEG化模式，没有检测到未PEG化酶，并且对于较高丰度的较少PEG化带没有显而易见的趋势。在D27时，在最终注射后72小时时收集，在所有小鼠中检测到的未PEG化酶的增加较小。然而，当与注射前材料相比较时PEG化模式的改变较小，并且不同带之间的比率在D27时与在D2时大致相同。类似地，体内去PEG化在其它制剂情况下最小，尽管在注射之前，通过RP-HPLC，培育1个月和6个月的制剂展示相当大水平的去PEG化酶，包括未修饰的CBS，尤其在培育6个月的制剂中。有可能这些大部分去PEG化形式在注射之后降解或更快速地清除，因此不存在于通过蛋白质印迹法分析的血浆样品中。其它三种制剂的类似分析还展示一旦其在体内注射后，去PEG化程度最低。
实施例6.比较用20NHS PEG-CBS与Met受限饮食进行长期处理的功效
硫氨基酸代谢的调节异常是具有疾病的人类患者和小鼠模型中的HCU表型的关键特征。代谢控制的持续改善或修复是成功处理的关键方面(参见Morris等人.(2017)《遗传代谢疾病杂志》40,49-74；Majtan等人.(2017)《FASEB J》31,5495-5506；Majtan等人.(2018)“酶替代疗法改善鼠类高胱氨酸尿症的多种症状(Enzyme Replacement TherapyAmeliorates Multiple Symptoms ofMurine Homocystinuria)”.《分子疗法：美国基因疗法协会杂志(Molecular therapy:the journal of the American Society of GeneTherapy)》.26,834-844；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。从4周龄开始，小鼠基于具有正常(REG)或受限(MRD)甲硫氨酸含量的饮食维持，并且每周三次接受皮下注射PBS媒剂或10mg/kg 20NHS PEG-CBS直到研究结束于22周龄。表9展示18周龄的小鼠中的血浆硫代谢物的水平。提供在总高半胱氨酸、总半胱氨酸、胱硫醚、甲硫氨酸和SAM/SAH比率的血浆浓度下的代表性简要描述。本文中的这一实施例和后续实施例中所描述和分析的研究组概述如下：
WT(REG+PBS)是指在接受PBS的皮下注射的基于正常饮食的野生型小鼠；
WT(REG+20NHS PEG-CBS)是指在接受20NHS PEG-CBS的皮下注射的基于正常饮食的野生型小鼠；
I278T(REG+PBS)是指在接受PBS的皮下注射的基于正常饮食的I278T小鼠；
I278T(REG+20NHS PEG-CBS)是指在接受20NHS PEG-CBS的皮下注射的基于正常饮食的I278T小鼠；
WT(MRD+PBS)是指在接受PBS的皮下注射的基于Met受限饮食的野生型小鼠；
WT(MRD+20NHS PEG-CBS)是指在接受20NHS PEG-CBS的皮下注射的基于Met受限饮食的野生型小鼠；
I278T(MRD+PBS)是指在接受PBS的皮下注射的基于Met受限饮食的I278T小鼠；以及
I278T(MRD+20NHS PEG-CBS)是指在接受20NHS PEG-CBS的皮下注射的基于Met受限饮食的I278T小鼠。
表9.血浆代谢产水平
Figure BDA0003521194860001061
如表9中所示，在WT小鼠中血浆Hcy水平处于正常健康范围(约16μM)，无关于饮食或处理。然而，在接受媒剂的基于REG饮食的I278T小鼠中，血浆Hcy水平与对照相比极大地升高(423μM，p<0.001)。基于MRD饮食，血浆Hcy水平基本上较低(140μM，即67％降低)，但与对照相比仍保持显著升高(p<0.001)。与媒剂注射的I278T小鼠相比，在基于REG饮食的I278T小鼠中20NHS PEG-CBS处理显著降低血浆Hcy水平到41μM(90％降低，p<0.001)，并且在基于MRD饮食的小鼠中以14μM完全正常化(p<0.001)。与对照相比，接受媒剂的基于REG饮食的I278T小鼠中的血浆Cys水平低几乎3倍(105对比295μM，p<0.001)，并且在所有其余组中处于正常范围内。与其作为由20NHS PEG-CBS催化的反应的产物的作用一致，血浆Cth水平在接受20NHS PEG-CBS处理的所有小鼠中与其媒剂注射的对应物相比升高。血浆Cth的升高分别取决于基于REG和MRD饮食的I278T小鼠中的限制性底物Hcy的浓度，达到76和18μM(p<0.001)。20NHS PEG-CBS甚至当底物浓度非常低(如由20NHS PEG-CBS处理的对照中的血浆Cth水平与接受媒剂的那些相比高约8倍所指示)时仍保持其功效。基于REG的所有组中的血浆Met水平高于基于MRD饮食的血浆Met水平。然而，基于MRD的I278T中的血浆Met水平类似于基于REG饮食的对照(51对比52μM，p＝不显著)并且通过20NHS PEG-CBS处理正常化(30μM，p<0.001)。与相应对照(基于REG和MRD饮食的WT中分别为3.29和3.84；p<0.001)相比，基于REG饮食(0.12)的I278T小鼠中反映甲基化能力的SAM与SAH的比率显著降低，并且基于MRD饮食(1.77)，所述比率部分升高。在20NHS PEG-CBS处理情况下，在基于REG(2.26，p<0.001)和MRD(4.01，p<0.001)的I278T小鼠中，SAM/SAH比率显著提高并且完全正常化。一般来说，本文中关于W18时间点所描述的组别之间的差异与在整个研究过程期间所观测到的差异一致。
CBS缺陷型HCU管理指南建议，在对吡哆醇完全有反应和无反应的患者中，血浆总Hcy浓度应分别保持在50和100μM以下(参见Morris等人.(2017)《遗传代谢疾病杂志》40,49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。在我们的研究中，I278T小鼠即使基于严重Met限制而维持，接受比针对小鼠标准推荐摄入少8倍的Met(MRD和REG饮食中的Met分别为0.5g/kg和4g/kg)，也无法实现这一目标水平。除在6周龄时获取的初始样品以外，在研究期间，基于MRD的I278T小鼠中的血浆Hcy水平在121-195μM之间波动。使用如Gupta等人.(2014)“基于低甲硫氨酸饮食成长的胱硫醚β-合成酶缺陷型小鼠(Cystathionine beta-synthase-deficient mice thrive on a low-methionine diet)”.《FASEB J》28,781-790(其以全文引用的方式并入本文中)中所示的相同小鼠模型，发现含有0.5g/kg Met的类似MRD饮食在34周龄I278T小鼠中将血清Hcy降低到81μM。差异可归因于小鼠的年龄和其基于饮食的维持的长度。相比之下，除了在22周龄时获取的最后一个样品之外，基于REG饮食且用20NHSPEG-CBS处理的I278T小鼠的血浆Hcy水平在26-41μM范围内变化。此外，向基于MRD饮食的I278T小鼠施用20NHS PEG-CBS使血浆Hcy完全正常化到15μM以下。此数据表明，不同于ET，甚至严重的Met限制无法在HCU小鼠中使血浆Hcy水平达至治疗目标。如果需要完全代谢正常化，那么将需要ET与一定水平的Met限制的组合来实现此目标。
这些结果证明，实现HCU表型的校正并不需要完全代谢正常化，且因此当涉及到小鼠中HCU表型的表现时，似乎存在阈值效应。实际上，血浆Hcy水平在170与300μM之间的具有HCU的较不严重小鼠模型具有不那么严重的表型(参见Gupta等人.(2009))。胱硫醚β-合成酶缺陷症的小鼠模型显示《高同型半胱氨酸血症》.FASEB J 23,883-893，其以全文引用的方式并入本文中)的显著阈值作用，或未展示HCU的临床症状(参见Majtan等人.(2018)《人类突变(Human mutation)》39,210-218，其以全文引用的方式并入本文中)。此阈值似乎适用于人类患者以及经治疗的HCU患者，尽管未能实现代谢正常化但展示血管事件的降低的风险和发病率(参见Wilcken等人.(1997)《遗传性代谢疾病杂志(Journal ofInheritedMetabolic Disease)》20,295-300；Yap等人.(2000)“具有由于胱硫醚β-合成酶缺陷症引起的患者中严重高同型半胱氨酸血症的血管并发症：降低高半胱氨酸疗法的作用(Vascularcomplications of severe hyperhomocysteinemia in patients with homocystinuriadue to cystathionine beta-synthase deficiency:effects ofhomocysteine-loweringtherapy)”.《血栓形成和止血研讨会(Seminars in thrombosis and hemostasis)》26,335-340；Yap等人.(2001)“经长期治疗的具有由于胱硫醚β-合成酶缺陷症引起的高胱氨酸尿症的患者中的血管结果：多中心观测研究(Vascular outcome in patients withhomocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency treatedchronically:a multicenter observational study)”.《动脉硬化，血栓形成和血管生物学(Arteriosclerosis,thrombosis,and vascular biology)》21,2080-2085；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
实施例7.血流介导的血管扩张(FMD)
I278T小鼠罹患内皮功能异常，并且血栓栓塞是HCU患者的发病和早期死亡的主要起因(参见Majtan等人.(2018)《人类突变》39,210-218，其以全文引用的方式并入本文中)。因为内皮功能异常的存在与心血管风险密切相关，所以在所研究的小鼠的股动脉中评估内皮依赖性血流介导的血管扩张(FMD)(数据未示出)。如以下所述进行内皮依赖性血流介导的血管扩张(参见Schuler等人.(2014)“小鼠中内皮依赖性血管扩张的测量值--简要报告(Measurement ofendothelium-dependent vasodilation in mice--briefreport)”.《动脉硬化，血栓形成和血管生物学》34,2651-2657，其以全文引用的方式并入本文中)。用异氟醚(3％诱导和1.5％维持)麻醉小鼠。通过使用也配备有EKG电极且使用经直肠温度计探针监测的加热检查台来将体温保持在37±1℃。将下肢刮毛并且用温热的超声凝胶覆盖。将超声探针附接到立体定位固持器，且与在上部内部大腿处可见的股静脉手动对准。装备有30-70MHz线性阵列微扫描换能器(Fujifilm VisualSonics，加拿大安大略省多伦多(Toronto,ON,Canada))的高频、高分辨率Vevo 2100成像平台用于对小鼠中的股动脉成像。将血管封堵器(Docx，美国加利福尼亚州尤凯亚(Ukiah,CA,USA))放在下肢周围以诱导远端后肢的闭塞作为缺血性触发事件。一旦获得血管壁的清晰图像且记录基线读数，实验通过使血管封堵器充气5分钟而开始。在后肢缺血之后，将套箍放气，并且以30秒间隔持续5分钟连续记录FA直径测量值。人工地离线测定所采集的图像中的股动脉直径。
为了确定长期施用药品对鼠类HCU的临床症状的影响，向基于Met受限饮食(MRD)的I278T小鼠(+/+和-/-)一周三次施用10mg/kg的媒剂(PBS)或20NHS PEG-CBS(药品)，直至22周龄。小鼠基于两种饮食中的一者：1)具有4.0g/kg Met的常规饮食(REG)，或2)具有0.5g/kg Met的Met受限饮食(MRD)。将小鼠划分成以下组别：A(+/+，REG，PBS)；B(+/+，REG，药品)；C(-/-，REG，PBS)；D(-/-，REG，药品)；E(+/+，MRD，PBS)；F(+/+，MRD，药品)；G(-/-，MRD，药品)；H(-/-，MRD，药品)。
观察到I278T小鼠展示与对照组(+/+)相比股动脉柔性(即动脉硬度)的显著丧失，其中药物处理使表型正常化。在基线T0处，观察到基于MRD的小鼠中的股动脉直径比基于REG饮食的小鼠中观察到的小。在记录基线值之后，在不具有血流情况下的5分钟堵塞诱发反应性充血，其特点是在恢复到基线前动脉直径的时间性增加。表10展示如在19周龄小鼠中评估的基于REG或MRD饮食的小鼠的股动脉直径。
表10.股动脉直径
Figure BDA0003521194860001091
Figure BDA0003521194860001101
如表10中所示，与对照(238和235μm，p<0.001)以及基于相同饮食但接受20NHSPEG-CBS处理(均为232μm，p<0.01)的I278T小鼠相比，如在5分钟局部缺血后60秒和90秒时间点(均为216μm)时股动脉的最大扩张显著更低所指示，接受媒剂的基于REG饮食的I278T小鼠明显展示内皮功能异常。接受媒剂的基于REG饮食的I278T小鼠与所有其它组相比展示显著减少的反应。相比之下，基于MRD饮食的小鼠都没有展示出减弱的内皮功能的任何病征，并且展现在具有且不具有20NHS PEG-CBS处理的情况下对局部缺血的正常血管反应。
观察到基于MRD的I278T小鼠的处理以将股动脉直径正常化到如与基于REG饮食的小鼠相同的水平。
实施例8.颈动脉化学损伤血栓形成模型(CITM)
如Marchi等人.(2012)《血栓形成与止血(Thrombosis and hemostasis)》108,516-526(其以全文引用的方式并入本文中)中所述进行测量颈动脉化学损伤血栓形成模型(CITM)。将小鼠通过腹膜内注射氯胺酮(诱导剂量为80-100mg/kg，接着10-20mg/kg/hr用于维持)和甲苯噻嗪(诱导剂量为8-16mg/kg，接着1-2mg/kg/hr用于维持)的组合来麻醉，并且使用加热垫将体温维持在36-38℃并且用经直肠温度计探针监测。使气管暴露并且插管，并且用空气和补充氧气使动物机械地换气。暴露颈总动脉，且用0.5PBS多普勒血流探针(Transonic Systems，美国纽约州伊萨卡岛(Ithaca,NY,USA))监测基线血流。对于动脉损伤，将浸泡在10％氯化铁溶液中的1×1mm Whatman滤纸放在颈动脉上持续1分钟。监测血管中的血液流动并且使用超声探针记录至多20分钟。堵塞时间(TTO)定义为FeCl3施用与缺乏血流1分钟之间的时间。将血液从下腔静脉抽取到用3.2％柠檬酸钠冲洗的注射器中，并且通过在5,000xg下离心10min而处理成贫血小板血浆。在程序结束时，将小鼠通过颈脱位，之后进行双侧胸腔切开术安乐死。表11展示来自颈动脉化学损伤血栓形成模型(CITM)的结果。在22周龄小鼠中测定在由10％FeCl3诱导的化学损伤之后在颈动脉中稳定堵塞的时间。基于REG饮食和接受媒剂的仅I278T小鼠展示堵塞时间显著增加，而MRD饮食和/或用20NHSPEG-CBS进行处理使这一参数正常化以控制水平。表11中的“CBS”表示20NHS PEG-CBS。
表11.堵塞时间
Figure BDA0003521194860001111
I278T小鼠展示实验性血栓形成的延迟，其通过任一处理正常化。为了评估I278T小鼠是否显示促血栓性表型，并且如果显示，评估饮食和酶疗法将如何影响所述小鼠，那么使用10％FeCl3诱导颈总动脉的实验性血栓形成。基于REG饮食的注射媒剂的I278T小鼠显示与其它组(10分钟59秒)的稳定堵塞基本上更长的时间，表明不同于HCU患者，I278T小鼠未显示促血栓性表型，并且此外，与对照(8分钟42秒，p<0.05)相比，在血栓形成方面展示显著延迟。有趣的是，用20NHS PEG-CBS(8分钟49秒)或用MRD饮食(7分钟34秒)处理I278T小鼠使堵塞时间正常化为对照中所见的值。
血栓栓塞为HCU的发病和死亡率的主要起因(参见Mudd等人.(2001)“转硫病症(Disorders oftranssulfuration)”.载于《遗传性疾病的代谢和分子基础(The Metabolicand Molecular Bases of Inherited Disease)》(Scriver,C.R.,Beaudet,A.L.,Sly,W.S.,Valle,D.,Childs,B.,Kinzler,K.和Vogelstein,B.编)第2007-2056页,纽约麦格劳-希尔(McGraw-Hill,New York)；Morris等人.(2017)《遗传代谢疾病杂志》40,49-74；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)，而接受安慰剂的基于REG饮食的I278T小鼠未能展现血栓形成的倾向，尽管有显著内皮功能异常。早期使用相同I278T小鼠模型(参见Dayal等人.(2012)《血液》119,3176-3183，其以全文引用的方式并入本文中)以及针对总CBS基因敲除小鼠(参见Maclean等人.(2010)《分子遗传学与代谢(Molecular Genetics andMetabolism)》101,163-171；其以全文引用的方式并入本文中)报告类似发现。
在基于MRD饮食的I278T小鼠或基于REG饮食但用20NHS PEG-CBS处理的I278T小鼠中，已将内皮功能异常和反常地堵塞延长时间正常化。这些结果表明，尽管I278T小鼠中缺乏高凝状态，但Met限制或20NHS PEG-CBS的施用可有效校正HCU的其它小鼠模型中和更重要的人类患者中观察到的病理性止血。
实施例9.行为测试
在所有行为研究中，关于小鼠的基因型、饮食和处理，实验者不知情。开场任务检查类似焦虑行为的方面(参见Prut等人.(2003)《欧洲药理学杂志(European journal ofpharmacology)》463,3-33，其以全文引用的方式并入本文中)。小鼠在一个开放的箱子(44×44×24cm)中自由探索，同时从上方跟踪用于10min试验。在开始试验之前，用动物追踪软件(Ethovision XT，诺达思(Noldus)，荷兰瓦赫宁根(Wageningen,Netherland))划定中心和周边。软件用于确定中心相较于周边花费的时间量以及行进的距离。
如先前在BenAbdallah等人.(2011)《实验神经病学(Experimental neurology)》227,42-52(其以全文引用的方式并入本文中)中所描述执行迷箱任务。给小鼠3min进入目标箱(15×28×28cm)。如果小鼠未进入目标箱，那么其由实验者鼓励且引导。遮盖的目标箱邻近于良好照亮的未被覆盖场所(58×28×28cm)。进入目标箱开始为门道(试验1)，接着变成下交叉道(试验2、3、4)，接着用锯屑填充下交叉道(试验5、6、7)，且接着用一小块长方形的纸板覆盖填充的下交叉道(试验8、9)。每只小鼠在3天的时间段内经历九种试验。第一天由试验1-3组成，第二天由试验4-6组成，且试验7-9在第三天进行。
为了测试高阶认知功能，进行解决问题的测试，其中需要小鼠在有限时间量内完成困难增加的逃逸任务。用PLEXIGLASTM白箱设计谜箱场所，所述白箱由黑色屏障划分成两个隔室，起始区和目标区。将小鼠引入最亮的照亮起始区中并且观察到其更喜欢较小的覆盖/黑暗目标区，其可通过狭窄下交叉道进入。测试由在三个连续天内分布的九个试验组成，在此期间训练小鼠以在下交叉道时克服障碍物以便进入目标区。障碍物为三种类型并且介于容易到中等和困难。表12为试验1-9(T1-T9)的概述。
表12.试验的概述
Figure BDA0003521194860001121
对I278T小鼠的任一处理改良其学习能力和认知，但Met限制增加焦虑。在HCU患者当中，发育延缓和各种精神症状是常见的。首先，进行开场测试以评估所研究的小鼠中的焦虑水平和自发活动。表13和表14展示开场测试的结果。表13展示每组小鼠的行进距离。
表13.行进的距离[厘米(cm)]
WT-REG WT-MRD I278T-REG I278T-MRD
3873 5839 3326 3506
4665 4420 3569 4854
4202 5906 3397 4927
3990 6367 3684 6484
6161 3443 2968 4511
3754 3243 3713 6169
4541 4920 2860 4400
3668 3348 2732 4210
4123 5442 2184 4293
4319 5534 7454 5148
3960 5839 5650 4896
3484 5747 2256 4585
4581 6029 3033 5398
3954 4699 3083 3100
3988 3676 3289 5876
2985 4584 9967 5630
3606 4229 3798 5362
3463 5140 5028 5791
4912 3951 7466
4667 5851 4750
4703 4405
4522
3816
3970
3155
5986
4390
表14展示针对每组小鼠在中心花费的时间。
表14.在中心所花费的时间[秒]
Figure BDA0003521194860001131
Figure BDA0003521194860001141
未观察到20NHS PEG-CBS处理对对照和I278T小鼠的焦虑水平或运动的显著影响。然而，与基于REG饮食的小鼠相比，基于MRD的小鼠，无论其基因型如何，在测试场所中行进的距离显著增加(P<0.01)，并且随着其在场所中心花费的时间较少(P<0.001)而更加焦虑。虽然小鼠性别和PBS媒剂或20NHS PEG-CBS注射对小鼠行为没有展示出任何显著的影响，但REG(填充符号)和MRD(敞开符号)饮食导致WT和I278T小鼠的运动和焦虑水平的变化。
其次，所研究小鼠的认知/执行功能是在谜箱测试中评估的(图2)，在所述谜箱中，小鼠必须到达一个黑暗的目标箱以逃避明亮照亮的场所。表15展示基于接受媒剂的任一饮食或20NHS PEG-CBS的WT和I278T小鼠中到达目标箱的时间。此顺序使得能够评估解决问题的能力(试验编号2、5和8)和学习/短期记忆(试验编号3、6和9)。另外，第二天的重复试验提供长期记忆的测量(试验编号4和7)。
表15.达到目标箱的时间
Figure BDA0003521194860001151
通过如表15中所指示的每个试验，进入目标箱变得更困难，其展示对于研究组中的小鼠到达目标盒的9次试验中的每一个所需的以秒为单位的时间。计算平均值和平均值标准差(SEM)，结果提供于表15(数据未展示)中。基于任一饮食的接受媒剂或20NHS PEG-CBS的对照小鼠表现类似，无认知损害病征。另一方面，与基于MRD饮食的I278T小鼠或对照相比(p<0.001)，基于REG饮食的I278T小鼠展示出显著较差的表现，表明认知损伤。在20NHSPEG-CBS处理的情况下，I278T小鼠以及对照小鼠基于两种饮食表现。
观察到基于REG饮食和PBS注射的I278T小鼠与基于MRD饮食和PBS注射的I278T小鼠和基于与药品一起注射的REG和MRD饮食的小鼠相比，认知减弱。所述结论由以下支持：当任务的困难增加(即，试验5-10)时，基于REG饮食与PBS注射的小鼠不能及时到达目标箱。在基于REG饮食或基于MRD饮食的小鼠之间未观察到到达目标箱的时间有显著差异，其中向两种组施用药品。
许多精神性和精神病性病状是HCU患者中常见的，如精神病、强迫症、抑郁症和行为/人格障碍(参见Abbott等人.(1987)《美国医学遗传学杂志(American JournalofMedical Genetics)》26,959-969，其以全文引用的方式并入本文中)。另外，患有HCU的个体具有许多发育和认知困难，其中大量病例具有学习障碍和较低IQ(参见El Bashir等人.《JIMD报告》21,89-95，其以全文引用的方式并入本文中)。我们小鼠的行为测试展示，与基于MRD维持或用20NHS PEG-CBS处理的对照和I278T小鼠相比，此表型实际上在基于REG饮食和接受媒剂维持时展示认知损害的I278T小鼠中复制(图2和表15)。据我们所知，这是第一个关于这种表型及其在任何CBS缺陷型HCU小鼠模型中成功校正的报告。此外，与基于REG饮食的小鼠相比，小鼠在基于MRD维持时展示出显著增加的活性和焦虑水平。
与基于MRD饮食的小鼠相比，接受媒剂的基于REG饮食的I278T小鼠显著地认知减弱，如由到达目标箱的较长时间所指示(表15)。然而，与基于MRD饮食的对照或I278T小鼠类似地表现基于REG饮食的注射有20NHS PEG-CBS的I278T(表15)。具有填充符号的实线和具有敞开符号的虚线分别表示基于REG和MRD饮食的小鼠。所有曲线图中的数据点表示平均值且误差条展示标准差(SD)。
这些行为性状很可能与HCU不相关，因为其影响小鼠，而无关于基因型和20NHSPEG-CBS处理。已展示，在前梨状皮质中感知到必需氨基酸剥夺，包括Met限制，并且随后的谷氨酸能信号传导影响小鼠行为(参见Anthony等人.(2013)“检测中枢神经系统中的氨基酸剥夺(Detection ofamino acid deprivation in the central nervous system)”.《临床营养和代谢护理的最新观点(Current opinion in clinical nutrition andmetabolic care)》16,96-101，其以全文引用的方式并入本文中)。谷氨酸盐是中枢神经系统中的主要兴奋性神经递质，其可以解释增加的运动、焦躁不安和焦虑水平。
实施例10.双能量X射线吸光测定法(DEXA)
使用GE Lunar PIXImus扫描仪(Lunar Corp.，美国威斯康星州麦迪逊(Madison,WI,USA))在麻醉小鼠中评估骨骼密度和身体组成(60mg/kg氯胺酮和15mg/kg甲苯噻嗪于腹膜内注射的PBS中的组合)。将小鼠放在托盘上，其腹部往下，并且从颈部往下扫描，不包括尾部。在扫描之后，将小鼠放回到其笼中以回收。
Met抑制减弱骨矿化和身体组成，而20NHS PEG-CBS处理基于REG饮食将I278T的表型正常化。在HCU患者中所观察到的临床症状当中，有瘦、低身体质量指数和骨质疏松症(参见Mudd等人.(2001)“转硫病症”.载于《遗传性疾病的代谢和分子基础》(Scriver,C.R.,Beaudet,A.L.,Sly,W.S.,Valle,D.,Childs,B.,Kinzler,K.和Vogelstein,B.编)第2007-2056页,纽约麦格劳-希尔，其以全文引用的方式并入本文中)。因此，使用DEXA研究小鼠评估其骨矿物质含量和身体组成。表16展示通过DEXA评估的骨矿化和身体组成的结果。当小鼠达到22周龄时进行DEXA扫描。表16包括骨矿物质含量、脂肪质量和瘦体重质量。
表16.DEXA结果
Figure BDA0003521194860001171
基于REG饮食，与对照相比，接受媒剂的I278T小鼠中的骨矿物质含量(BMC)显著较低(0.33相对于0.39g，p<0.001)，而用20NHS PEG-CBS的处理使其完全正常化(0.4相对于0.4g，p＝不显著)。基于MRD饮食，所有组展示等效BMC(0.34-0.36g)，其与基于REG饮食的对照(p<0.05)相比显著降低，并且与基于REG饮食的注射媒剂的I278T小鼠类似。基于REG饮食，接受媒剂的I278T小鼠比其它组中的那些小鼠显著更瘦，确切地说，含有较少的脂肪组织(2.63相对于4.24g，p<0.01)和瘦体重质量(13.81相对于16.97g，p<0.001)。用20NHSPEG-CBS的处理正常化基于REG饮食的I278T小鼠的身体组成。基于MRD饮食，脂肪质量的量在所有组中相当，并且类似于基于REG饮食的对照或20NHS PEG-CBS处理的I278T小鼠的脂肪质量的量。同样地，瘦体重质量的量在基于MRD饮食(14.71-16.02g)的所有组中类似，但与基于REG饮食的对照和20NHS PEG-CBS处理的I278T小鼠相比显著减少(p<0.05)。
骨骼异常和结缔组织缺陷为HCU患者中的最显著临床症状(参见Mudd等人.(2001)“转硫病症”.载于《遗传性疾病的代谢和分子基础》(Scriver,C.R.,Beaudet,A.L.,Sly,W.S.,Valle,D.,Childs,B.,Kinzler,K.和Vogelstein,B.编)第2007-2056页,纽约麦格劳-希尔，其以全文引用的方式并入本文中)。骨质疏松症，通常与脊柱侧凸相关，并且低身体质量指数是未治疗或晚期诊断患者中的典型发现，而不管疾病的严重程度(参见Mudd等人.(2001)“转硫病症”.载于《遗传性疾病的代谢和分子基础》(Scriver,C.R.,Beaudet,A.L.,Sly,W.S.,Valle,D.,Childs,B.,Kinzler,K.和Vogelstein,B.编)第2007-2056页,纽约麦格劳-希尔；Parrot等人.(2000)《遗传代谢疾病杂志》23,338-340；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。减少的骨矿化、低脂肪含量和低总重量发现于KO和I278T中(参见Majtan等人.(2017)《FASEB J》31,5495-5506；Gupta等人.(2009)《FASEB J》23,883-893；Majtan等人.(2018)“酶替代疗法改善鼠类高胱氨酸尿症的多种症状”.《分子疗法：美国基因疗法协会杂志》26,834-844；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)，而非HCU的HO小鼠模型(参见Majtan等人.(2018)《人类突变》39,210-218；其以全文引用的方式并入本文中)。如表16中所示，这些发现在接受媒剂的基于REG饮食的I278T小鼠中以及20NHS PEG-CBS在将此表型正常化时的功效得到支持。另一方面，与基于REG饮食的WT小鼠相比，严重Met限制引起基于MRD的所有小鼠中减少的骨矿化、较低量的瘦体重质量和标准到增加量的脂肪质量，而无关于基因型和处理。除脂肪质量之外，MRD基本上产生与基于REG饮食的接受媒剂的未经处理的I278T小鼠极类似的总体图片。先前，发现MRD饮食在包括骨矿化的I278T小鼠中的校正HCU表型方面极有效(参见Gupta等人.(2014)《FASEB J》28,781-790；Kruger等人.(2016)《纽约科学院年鉴(Annals ofthe New YorkAcademy ofSciences)》1363,80-90；其中的每一者以全文引用的方式并入本文中)。
实施例11.基于高Met饮食的HCU小鼠的死亡原因
基于小鼠的数据表明HCU患者中的严重Met限制可能产生非所需结果。在切换到高甲硫氨酸饮食(HMD)之后，观察到雌性HO小鼠(但非雄性HO小鼠)突然死亡，所述高甲硫氨酸饮食包括8.2g MET/kg饮食。为了分析死亡的起因，使成年雌性HO小鼠基于HMD，使青年I278T小鼠基于水中的HMD饮食、REG饮食(Met中的Met 4.0g/kg饮食)或REG+0.1/0.2/0.4％Met。每天监测小鼠，定期称重并且抽血。刚发现的尸体经历尸检和组织学分析。
将小鼠分类到6组(A-F)中。A组由基于HMD的7名雌性HO小鼠组成。B组由基于HMD的一个雄性I278T小鼠和一个雌性I278T小鼠组成。C组由基于REG饮食且补充有0.4％Met的一个雄性I278T小鼠和一个雌性I278T小鼠组成。D组由基于补充有0.2％Met的REG饮食的一个雄性I278T小鼠和两个雌性I278T小鼠组成。E组由基于REG饮食且补充有0.1％Met的一个雄性I278T小鼠和一个雌性I278T小鼠组成。F组由基于REG饮食的一个雌性I278T小鼠和两个雄性I278T小鼠组成。用于肉眼尸检的对照包括四个雌性HO小鼠；两个雄性和两个雌性成年I278T和WT、2个雌性青年I278T小鼠和三个雄性和三个雌性青年I278T和WT小鼠。所有尸检对照都基于标准(STD)饮食。
七个基于HMD的雌性HO小鼠中的三个在第11天与第18天之间死亡。这些小鼠不茁壮成长并且体重下降或体重增加完全停止。当基于HMD时，观察到Hcy和Met均基本上增加，同时始终维持Cys较低。初步组织学发现展示卵巢滤泡退化、伴有脂肪皂化的外分泌胰腺、液泡和心肌多焦点矿化、具有死神经元的髓质、具有T淋巴细胞的显著细胞凋亡的胸腺发育不良、肝脏脂肪变性、发炎和纤维化。
对于I278T小鼠，观察到血浆Hcy增加接受水中而非自其饮食补充的Met的小鼠。观察到血浆Met类似于Hcy增加，但取决于Met摄入，除了基于REG饮食的对照小鼠以外。I278T小鼠的初步组织学发现展示具有纤维化和发炎的外分泌胰腺、肝脏发炎、脂肪变性、变性的毛囊和肠上皮、具有T淋巴细胞的显著细胞凋亡的胸腺发育不良和十二指肠出血。
测量整个时程内的重量和代谢物水平。还执行肉眼尸检和光学组织学。
实施例12.非人类灵长类动物(NHP)中的毒性研究
持续26周在每3天皮下(SC)施用一次并且每日一次施用到NHP之后，测定本文所描述的药品的毒性。
根据以下研究设计，8只雄性和雌性食蟹猴的组接受媒剂对照(PBS)或药品(约0.4mL/kg的剂量体积)的皮下注射。在本研究中的最高剂量表示基于制剂中20NHS PEG-CBS的最大可实现浓度和可以通过皮下注射长期向猴安全施用的最大剂量体积的最大可行剂量。(参见Gad等人.《国际毒理学杂志(Int J Toxicol)》.2016年3月-4月；35(2):95-178，其以全文引用的方式并入本文中)。剂量范围跨越预期治疗剂量范围(0.5到7mg/kg)。最高剂量基于用于皮下注射的制剂的粘度、在猴中用于长期注射所推荐的体积以及在猴中与人类相比所计划的暴露时间的考虑因素。表17展示处理组1-6的细节。
表17.NHP中26周毒理学研究的研究设计
Figure BDA0003521194860001191
Figure BDA0003521194860001201
毒性的评估是基于死亡率；临床观测结果；体重和温度；血压；定性食物食用；眼科观测结果；身体、神经和呼吸道检查；ECG；以及临床和解剖病理。收集血液样品进行代谢物和活性、补体(CH50)、ADA和抗PEG抗体以及TK分析。
在给药阶段期间对于任何组都未观察到PR间隔、QRS持续时间、QT间隔、校正QT(QTc)间隔或心率的药品相关变化。在ECG的定性评估期间，没有节律异常或定性ECG变化归因于药品。
在任何经计划处死时未观察到对临床病变、器官重量、肉眼可见的发现的药品相关作用。所有动物存活到其经计划的处死。另外，针对所述剂量中的任一者未注意到药品相关临床观察结果；体重、体重增益或血压的改变；或神经行为观察结果、体温或呼吸的改变。
因此，鉴于20NHS PEG-CBS的安全性数据库的总计，未预期PEG相关的液泡化在人类研究中具有风险。食蟹猴中的重复剂量毒理学数据与在重复给药持续至多6个月之后CBSDH的各种小鼠模型中的安全性数据组合被视为适当的并且足以支持临床试验中的人类起始剂量和剂量递增。
在上文所描述的研究期间观察到皮下注射部位。在用以重复剂量的药品注射的NHP中观察到在一或多个皮下注射部位处的最小到微小血管周单核细胞浸润物。
实施例13.治疗人类中的高胱氨酸尿症
为了分析人类中的高胱氨酸尿症的治疗，将在具有经遗传确认的CBSDH的患者中进行两部分双盲随机的安慰剂对照研究。将在3:1比率的接受药品与安慰剂的患者中征选有资格的患者并且随机分组。群组将包括年龄在16与65岁之间的患者，包括具有CBSDH的遗传确认和大于或等于80μM的升高血浆tHcy水平的患者。根据2016年CBSDH诊断和管理指南，应将tHcy水平维持为尽可能接近正常值(处于或低于10至15μM)并且当然低于100μM(参见Morris等人.《遗传代谢疾病杂志》.2017年1月；40(1):49-74，其以全文引用的方式并入本文中)。大于或等于80μM的纳入准则允许纳入具有100μM典型水平的患者，同时确认日常和分析可变性。替代地，大于或等于30μM的tHcy水平可用于定义患有CBSDH的患者。
药品将以25±3mg/mL的药物物质的1mL无菌溶液供应，填充到2mL一次性使用瓶中。治疗将以前哨给药持续12周，并且分成给药时间段和研究药物(药品或安慰剂)清除时间段。
研究药物(药品或安慰剂)将经由皮下注射施用。如通过注射的管理员所确定，注射将在臂、腹部、大腿或臀部中进行。每个注射部位的最大体积为2mL或按照机构的标准程序。
计划经由三个连续群组依次评估三个剂量水平。每个剂量水平群组将包括四个受试者：三个受试者将随机分组以接受活性药物(20NHS PEG-CBS)，并且一个受试者将随机分组以接受安慰剂(3:1随机分组比：活性剂/安慰剂)。研究药物将每周皮下施用。每个群组将被施用以下剂量：
群组1：0.33mg/kg；
群组2：0.66mg/kg；和
群组3：1.0mg/kg。
给药时间段将由以下组成：6周剂量的研究药物，之后为6周时间段，在此期间不施用研究药物。使用以下方案的给药时间段延长的研究将进行长于12周。
在第1周第1天，每个受试者作为住院病人进入临床站点，至少停留24小时，在此期间，他/她接受给药前和给药后的安全监测(生命体征，12导联ECG)，进行血液取样用于安全实验室参数，进行血液取样用于药代动力学(PK)/药效学(PD)评估，以及抗体水平(仅给药前)，随后进行第一次研究药物施用。
还将在第2天开始进行用于PK/PD评估的血液取样，和生命体征、12导联ECG的后续安全性监测，和副作用(AE)或严重副作用(SAE)的评估，以及用于安全实验室参数的血液取样。在部位处施用研究药物之后，将抽取给药前(0小时)和给药2、4、8、12小时(第1天)和24小时(第2天，在释放前)的血液样品和手指针刺血点样品。将在现场根据DBS且基于PSD对血点进行探索性手指针刺tHcy评估。还将执行临床评估和其它安全评估。
在第3天，受试者将返回现场进行血液取样或PK/PD评估(48小时取样)，基于DBS和PSD进行探索性手指针刺tHcy评估，并对AE或SAE、生命体征、12导联ECG和用于安全实验室参数的血液取样进行后续安全监测。
在第4天、第5天、第6天和第7天，受试者经历由具备访问资格的健康护理专业人员进行的家庭访问评估，以用于后续对以下的安全性监测：任何AE或SAE、生命体征和用于安全实验室参数的血液取样以及PK/PD评估(在施用研究药物之后72小时[第4天]、96小时[第5天]、120小时[第6天]和144小时[第7天]。如果由任何安全信号/关注点指示，受试者将被指示参加不定期的现场访问，以进行全面评估。
在第2周到第5周期间，每个受试者将每周一次现场访问用于研究药物施用、安全性评估、免疫原性(仅第3周)、PK/PD血液取样和在第4次、第5次、第6次和第7次问诊时基于深部脑部刺激(DBS)和功率谱密度(PSD)的探索性手指针刺tHcy评估。
在研究药物给药时间段完成后，清除时间段将在第36天开始。将在此时间段期间进行安全监测以及连续PK/PD评估。每个受试者将每周一次经历访问健康护理专业人员的家庭访问，随后在6周清除结束时经历一次现场访问。这一时间段期间的评估包括监测安全性、生命体征和用于常规实验室测试的血液取样、PK、PD和免疫原性。在清除时间段的最后一次访问时在临床部位处进行根据DBS和基于PSD对血点的探索性手指针刺tHcy评估。
关于安全性，每周一次0.33mg/kg的起始剂量比NHP中的NOAEL低约30倍(即，每3天10mg/kg)。1.0mg/kg的计划最高剂量比NHP中的NOAEL低约10倍。因此，方案中的计划剂量范围提供较大安全度。
除安全性考虑之外，来自小鼠、大鼠和NHP的PK/PD数据的外推指示，计划剂量和间隔将实现CBSDH患者中的治疗相关血浆浓度。小鼠中的药理学研究指示在单次注射之后约50mU/μ的暴露有效。人类中的PK/PD外推指示，给药6周之后，每周两次0.33mg/kg或每周一次0.66mg/kg的剂量将达到此有效水平。人类中的外推/预测半衰期为175小时或7.3天。
实施例14.初步1/2期临床研究结果
进行中的1/2期研究的初步结果-检查年龄在12与65岁(包含端点)之间，记录有继发于总高半胱氨酸(tHcy)水平大于/等于80μM的CBS遗传缺陷症的HCU病史的患者-(如实施例13中详细描述)证实，在儿科和成人患者中，每周一次或两次施用1mg/kg剂量的20NHSPEG-CBS在暴露持续至多1年、至多6个月、至多45天、或至多1个月时间段情况下的功效。研究表明具有低安全性风险和低免疫原性的良好安全性概况。举例来说，大部分TEAE(治疗期间出现不良事件)是轻度的，少数是中度的。在患者中仅记录1次SAE(显著不良事件)；患者错过1个剂量的20NHS PEG-CBS并且恢复给药而无问题。
观察到轻度免疫原性。除1名患者以外，观察到的抗药物抗体(ADA)效价类似于给药前效价，其中最大效价为4,100。此外，所检测的抗体基于PK结果为非中和的。观察到的抗PEG效价类似于给药前效价，并且同样基于PK结果为非中和的。这些结果优于比较酶疗法，例如Palynziq，其展示截至3个月的1,000,000的ADA效价和截至1个月的约10,000的抗PEG效价。其它酶疗法常规观察的效价≥1,000。
初步结果证实，在4个非盲群组中的3个群组(4个群组中的1个群组接受安慰剂对照且无活性药品)中，在第1周和第6周(每周一次或两次，1mg/kg)自基线tHcy水平平均下降至多约50％。在第1周和第6周期间的每日取样在4个非盲群组中的3个群组(其中4个群组中的1个群组接受安慰剂对照且无活性药品)中展示从基线tHcy水平降低约40-60％。所观察到的峰值功效(在4个非盲群组中的1个群组中)引起2/3名患者中的tHcy水平从约100μM到约200μM的基线水平下降到约50μM。20NHS PEG-CBS水平与每个患者的tHcy下降紧密相关。更新模型预测每周两次剂量(1或1.5mg/kg)将超过所观察到的双峰功效并且实现tHcy的稳态水平。
结果证实，根据以上方法向受试者施用的20NHS PEG-CBS在血浆中具有活性并且稳定(不同于天然酶)，并且显著降低升高的tHcy水平(细胞内和血浆)，而无关于潜在的病变。
实施例15.20NHS PEG-CBS在高胱氨酸尿症的小鼠模型中允许饮食放松和停止甜 菜碱
高胱氨酸尿症的小鼠模型中的临床前研究展现，使用20NHS PEG-CBS的长期连续处理(例如，至多16周)显著降低和/或正常化tHcy水平，而无关于饮食。如图3中所示，基于标准甲硫氨酸饮食(“STD”)的HO小鼠甚至在施用甜菜碱的情况下具有升高的tHcy水平(例如，大于100μM)。甚至在停止甜菜碱之后，施用20NHS PEG-CBS也显著降低或正常化tHcy水平。
HO小鼠用于再现人类受试者中的高胱氨酸尿症的关键生物化学指标。除非另外指示，否则都使用雄性和雌性HO小鼠并且基于标准完全饮食(STD，Teklad完全饮食2920X，具有5.0g/kg Met和3.0g/kg胱氨酸)维持。将小鼠划分成三个组，A、B和C组。A组基于STD保持直至第10周。将B组和C组分别基于高Met饮食(HMD，富含Met的氨基酸限定饮食TD.01084，8.2g/kg Met和3.5g/kg胱氨酸)和Met受限饮食(MRD，Met缺陷型的氨基酸限定饮食TD.110591，0.5g/kg Met和3.5g/kg胱氨酸)直至第10周。三个组基于这些饮食维持在没有额外处理的情况下持续前2周。(在此时间段期间B组中的死亡需要选入额外小鼠以完成研究。)小鼠继续基于所述饮食，且还从第3周-第5周提供甜菜碱(饮用水中的2％w/v)。在第6周开始，继续基于所述饮食和甜菜碱的小鼠也用20NHS PEG-CBS(皮下7.5mg/kg，每周3次)处理。接着在第9周开始中断甜菜碱，同时继续20NHS PEG-CBS处理直到研究结束(第16周)。如下进行饮食切换：切换1号(第11周-第12周)，A、B和C组分别切换到HMD、MRD和STD；切换2号(第13周-第14周)，A、B和C组分别切换到MRD、STD和HMD；切换3号(第15周-第16周)，A、B和C组分别切换回到其原始饮食STD、HMD和MRD。在整个研究期间每周收集血液1-3次，并且分析代谢物(包括Hcy、Met和Cys)的血浆水平。使用经设计用于颌下取样到Capiject T-MLHG锂肝素管(Terumo Medical Corporation，美国新泽西州萨默塞特(Somerset,NJ,USA))中的一次性使用的刺血针，从清醒的研究动物的颌下静脉收集血液样品。在以1,200×g离心10min之后，从血液样品收集血浆并且在1.5ml管中在-80℃下存储。如Arning和Bottiglieri,《质谱法在生物分子分析中的临床应用(Clinical Applications of MassSpectrometry in BiomolecularAnalysis)》,U.Garg编辑.2016,施普林格(Springer):新泽西州斯考克斯市(Seacaucus,NJ).第255-262页(其内容以全文引用的方式并入本文中)中所描述，通过LC-MS/MS测量血浆氨基硫醇(总Cys和Hcy)和其余氨基酸以及SAM和SAH。应用因素方差分析，之后应用杜凯氏HSD事后测试。<0.05的p值被视为统计显著的。
如图3中所示，根据相应饮食中的Met水平，血浆Hcy水平显著地从基于STD的小鼠中的基线水平(约95-166μM)改变。因此，在切换到单独MRD之后，Hcy水平降低到约26-56μM，而HMD将Hcy水平增加到超过400μM。甜菜碱使基于MRD的小鼠中的Hcy水平正常化(≤16μM)，但在分别基于HMD和STD的小鼠中仅部分有效和无效。此观测结果支持用甜菜碱和Met限制的组合处理HCU的实践。在基于HMD或STD的仍接受甜菜碱的小鼠中，20NHS PEG-CBS的引入将Hcy水平显著地降低到约22-55μM。重要的是，当中断甜菜碱但继续20NHS PEG-CBS处理时，这些低Hcy水平保持稳定，且基于MRD的小鼠中的Hcy水平保持正常化。此外，甚至当基于MRD的小鼠切换到STD或HMD时，血浆Hcy还在饮食切换后保持在这些低稳定水平下。
在添加甜菜碱情况下，基于HMD的HO小鼠中的血浆Met水平增加约2倍，并且甚至更严重，至多7倍(数据未示出)。这连同Hcy升高，很可能促成B组的高死亡率，在雌性中加剧。在甜菜碱情况下在基于HMD的小鼠中观察到的极大升高的Met与以下事实一致：Met连同二甲基甘氨酸(DMG)为由甜菜碱-高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)催化的甜菜碱与Hcy之间的反应的产物。因此，B组中的DMG水平也最高，与此群组中的BHMT底物Hcy的增加的可用性一致。
当添加到甜菜碱中时，20NHS PEG-CBS处理在使B组的血浆Met水平降低到与A组和C组的那些值相当的值时高度有效。再次，甚至在甜菜碱停止和后续饮食切换之后，通过20NHS PEG-CBS处理维持这些低Met水平。另一有趣的观测结果为当20NHS PEG-CBS处理与甜菜碱一起施用时，B组中的DMG水平下降到约一半(数据未示出)。这表明20NHS PEG-CBS与甜菜碱有效地竞争以维持Hcy。
尽管HO小鼠中的血浆Cys水平为WT对照中的那些的约一半(约200μM)，但其在基于MRD的HO小鼠中充分正常化(约226-236μM)(数据未示出)。单独的甜菜碱并不改善群组中的任一个中的Cys水平，但添加20NHS PEG-CBS部分到完全正常化基于HMD(约152-219μM)和STD(约156-195μM)的小鼠中的Cys水平。尽管在整个研究中存在相当大的波动，但由20NHSPEG-CBS正常化的Cys水平似乎不受甜菜碱去除或后续饮食切换的影响。与其催化活性一致，20NHS PEG-CBS提高所有组中的Cth水平，确切地说，开始基于STD或HMD的组别表明Hcy与Cth水平之间的相关性，但具有许多波动(数据未图示)。
还监测S-腺苷甲硫氨酸(SAM)与S-腺苷高半胱氨酸(SAH)的比率(数据未示出)。与其它组相比，SAM/SAH比率在C组中的小鼠中显著更高，在20NHS PEG-CBS处理的情况下稍微降低。在A和B组中，20NHS PEG-CBS处理引起SAM/SAH比率的适度增加。在20NHS PEG-CBS处理期间，所有组中的SAM/SAH比率类似，尽管在饮食切换之前，在C组中略高。
总的来说，在甜菜碱存在下，20NHS PEG-CBS处理在馈入HMD的HO小鼠中基本上降低血浆Met水平并且在馈入HMD或STD的那些中降低Hcy水平。在基于MRD的HO小鼠中，单独的甜菜碱足以使血浆Hcy正常化。是20NHS PEG-CBS而非甜菜碱，在基于STD或HMD的小鼠中正常化Cys水平。在去除甜菜碱后，单独20NHS PEG-CBS足以维持这些代谢改善，即使当通过饮食切换改变Met摄入时也是如此。此观察结果连同DMG水平的改变，指示当与20NHS PEG-CBS共同施用时，甜菜碱补充并不提供额外优点。
实施例16.制备和分析冻干20NHS PEG-CBS制剂
测试20NHS PEG-CBS的不同制剂以便鉴别引起(i)冻干时间减少、(ii)复原时间减少、(iii)黏度降低和/或(iv)20NHS PEG-CBS的去PEG化降低的制剂。将20NHS PEG-CBS以25.4mg/ml于25mM磷酸钾、5％蔗糖(pH 7.5)中的浓度(如下文所描述)用于制备表18中所描述的制剂。
表18.冻干制剂
Figure BDA0003521194860001261
活性制剂在冻干(本文中称为“T-液体”)之前以及冻干(本文中称为稳定性研究的“T-冻干”和“T0”)之后分析。随后，将冻干材料在5℃、25℃/60％r.h.和40℃/75％r.h.下置于稳定性研究持续至多3个月(T3M)。还在一个月(T1M)时测试冻干制剂的稳定性。
A.样品制备
在制剂制备之前三天，从冰箱(-80℃)取出20NHS PEG-CBS(25.4mg/ml于25mM磷酸钾、5％蔗糖(pH 7.5)中)并且在5℃下的冰箱中解冻72小时。解冻之后，25.4mg/ml的于25mM磷酸钾、5％蔗糖(pH 7.5)中的20NHS PEG-CBS通过平缓涡旋均质化。通过使用20-kDa截止值透析盒，在5℃下在受控条件下透析24小时，且每次以≥1:45的体积比进行三次缓冲液交换(每次交换使用3,300ml缓冲液)来产生制剂。在3小时和6小时总透析时间之后交换缓冲液，进行最后一个透析步骤过夜。在透析之后，从透析盒去除制剂，之后分析pH、重量摩尔渗透浓度和蛋白质浓度。对于所有制剂，发现蛋白质浓度在20-30mg/ml的规格内。对于表18中所描述的制剂F3，将10％(w/v)聚山梨醇酯80(PS80)的储备溶液掺入到透析材料中以实现其0.01％(w/v)的最终浓度。
B.冻干
通过使用Epsilon 2-12D中试规模冷冻干燥器(RND-FD02，马丁克里斯特(MartinChrist)，德国(Germany))进行制剂的冷冻干燥。在初次干燥开始之前，将所有制剂合并于一个冷冻干燥器中。冷冻干燥过程期间的真空由电容计控制。优化冻干过程概述于表19中。在将瓶平衡到5℃之后，将瓶冷冻到-45℃并且在-45℃下再平衡5小时。在初次干燥中将搁板温度设定到-15℃持续31小时。二次干燥在40℃的搁板温度下进行2.5小时。在冻干过程结束时，用氮气将腔室充气到800mbar，并且通过提升搁板将小瓶塞住。在加塞之后，用氮气将腔室充气到大气压。
C.冻干制剂的复原
使用高度纯化水复原冻干产品。将复原体积以重量分析方式测定为冻干期间的重量损失。在已添加液体之后，将复原时间测量为实现冻干产品的完全复原的时间。主要关于发泡来判定复原行为。测定整个稳定性研究中的所有制剂的复原时间。总的来说，复原时间在54秒与4.75分钟之间。在制剂之间，除了制剂F5之外，未观察到复原时间之间的显著差异，其中需要更多时间来达到完全复原。此外，所有制剂展示中等到强水平的类似泡沫形成。
D.冻干制剂的分析
评估稳定性研究的T0时的冻干制剂的光学外观。考虑到的参数包括饼的密实度、与瓶壁的接触、饼的形状、颜色和总体外观。具有饼结构的所有制剂展示良好的外观，本质上为致密的和淡褐色的。此外，观察到结晶饼的略微垂直收缩。F1、F3和F6展示饼内的一些微小裂纹，而所有其它制剂的饼似乎未受损。总的来说，未观察到制剂之间的主要差异。对于任何所测试的存储条件，在稳定性研究的一个月之后饼的光学外观并不改变。在三个月时，对制剂的子集(F1、F3和F7)的光学外观的评估也未揭露光学外观的任何变化。
根据《欧洲药典(European Pharmacopoeia)》(第9版；专著2.9.20)，在2,000-3,750勒克斯下，在白色背景前轻轻地、手动地、径向地搅拌5秒，并在黑色背景前搅拌5秒，检查小瓶是否存在可见粒子。发现所有制剂不含可见蛋白质粒子并且通过强烈着色来表征。此外，将一些样品分类为粘稠溶液或展示截留气泡的倾向。
对于小样品体积，使用正常离子强度电极(InLabTM Micro Pro ISM))，用校准的pH计(SevenCompactTM SC S210-B，Mettler Toledo AG，瑞士苏黎士州(Schwerzenbach,Switzerland))测量制剂的pH值。在冻干之前以及在稳定性研究的整个过程中对于所有制剂进行pH分析。对于所有样品，测量pH 7.5±0.3的指定范围内的pH值。
使用Gonotec OSMOMAT 3000渗透计(Gonotec GmbH，德国)通过凝固点降低的方法测量样品的重量摩尔渗透浓度。将冻干制剂的重量摩尔渗透浓度与20NHS PEG-CBS(25.4mg/ml于25mM磷酸钾、5％蔗糖(pH 7.5)中)的重量摩尔渗透浓度相比较。在冻干之前和之后获得相当的重量摩尔渗透浓度值。
在冻干之前以及在整个稳定性研究中通过UV光谱法分析所有制剂中的蛋白质浓度。所有获得的蛋白质浓度都在20-30mg/ml的指定范围内。当比较冻干前和冻干后的蛋白质浓度时，对于所有制剂观察到≤5％的差异。因此，蛋白质浓度和重量摩尔渗透浓度两者的分析指示在冷冻干燥期间水损失的准确测定。
使用Kinexus ultraplus流变仪(马尔文仪器公司(Malvern Instruments),英国(UK))进行粘度测量。所测定的制剂的粘度在约18到27mPa*s的范围内(表25)。未观察到存储时间或温度对粘度的影响。然而，当比较制剂时，测量基本上不同的粘度。当比较粘度值与UV光谱法的结果时，溶液粘度与蛋白质浓度的相关性为显而易见的。
使用NEPHLA浊度计(Lange博士，德国)测量制剂的浊度。总的来说，在制备之后以及在稳定性研究的过程内对于所有制剂获得低浊度。未观察到制剂之间的显著差异。存储在2-8℃下的两个样品(F2和F4)展示比存储在25℃或40℃下的相应样品更高的浊度。这些增加的值很可能为测量假象。
呈液体的制剂的颜色还通过使用光谱色度计(LICO 690Professional，英国)评估。所有样品无关于时间点和制剂组成都被分类为最接近红色尺度内的R1。
通过使用微流成像(MFI)进行次可见粒子(约1-100μm)的量化和观测以及硅酮油液滴和蛋白质粒子的区分。测定通过MFI测定的≥2μm的粒子浓度。总的来说，针对所有制剂、存储条件和时间点，确定极低的粒子浓度。在稳定性研究的过程中未识别关于粒子含量的变化的明显趋势。
在制剂制备之后以及在冻干样品复原之后的所有稳定性时间点进行高性能尺寸排阻色谱(HP-SEC)。总的来说，所有样品在整个稳定性研究中展示高PEG-CBS含量并且非PEG化分子的含量未增加。
对于所有样品也进行反相高效液相色谱。在色谱图中识别十个可辨别的峰，且在滞留时间增加的情况下被命名为峰1至峰10。此处，可观察到峰6-9的相对面积的减小和峰1-4的相对面积的增加。
在真空下冷冻制剂的行为通过冷冻干燥显微法(FDSC 196，Resultec，德国)分析。在T-液体(冻干前制剂)下进行冷冻干燥显微法(FDM)测量，以便根据塌陷起始温度(Tc,on)调节冻干过程参数。所测定的Tc,on的值在-22℃到-14℃范围内。因此，在冻干操作的初次干燥期间，无制剂在高于-25℃的温度(对应于搁板的设定温度)下展示塌陷。
综上所述，在2-8℃、25℃和40℃下存储至多三个月之后，关于其复原时间、粘度以及稳定性筛选七个制剂。关于饼复原时间和样品粘度，既不在制剂之间也不在分析时间点之间都未看到相当大的差异。对于F5的产品饼，测量出与其它候选物相比的基本上更长的复原时间。在2-8℃或25℃下存储的所有样品展示总体良好的稳定性。然而，在40℃的存储条件下，揭露制剂之间的一些差异。举例来说，在存储一个月后，HP-SEC分析展示对于制剂F2、F4和F6的PEG-CBS的相对含量降低，以及峰1的相对含量增加。RP-HPLC分析展示峰6-9的相对面积的减少，伴随着制剂F2和F5的峰1-4的相对面积的增加。因此，在冷冻期间经历退火步骤的样品与在冷冻期间无退火步骤的样品相比总体上似乎较不稳定。
在所测试的制剂中，F1、F3和F7制剂在所有存储条件(其中一些例外)下展示极高稳定性。综合起来，制剂F1、F3和F7在其之间以及在所有分析时间点展示相当良好的结果。
实施例17.冻干过程参数的分析和优化
使用实施例16中所描述的由15mM磷酸钾、8％海藻糖(pH 7.5)组成的F1制剂来优化冻干过程。优化冻干的预期结果包括(i)减少无饼熔融物的冻干循环时间，(ii)减少复原时间和(iii)减少20NHS PEG-CBS的去PEG化。
在不同过程参数下在三个连续冻干循环的过程中进行冻干过程优化。确切地说，(i)初次干燥(PD)时间、(ii)PD温度和(iii)二次干燥(SD)时间在循环之间变化。循环1的目标为优化初次干燥参数，而循环2的焦点为二次干燥表征，且循环3旨在将过程时间减少到小于48小时。
在Epsilon 2-12D中试规模冷冻干燥器中进行三个连续冻干循环。腔室压力由电容计控制且由真空泵和受控氮剂量调节。
表19.优化冻干过程参数
Figure BDA0003521194860001301
通过本文所描述的分析方法评估从优化冻干过程获得的冻干制剂。
在干燥之后光学评估冻干饼。考虑到的参数包括饼的密实度、与瓶壁的接触、饼的形状、颜色和总体外观。冻干样品的分析揭露具有致密结构和淡褐色着色的良好外观。
通过使用库仑Karl Fischer titratorAqua 40.00(Analytik Jena GmbH)测定冻干饼的水含量。观察到所有样品的低残余水分含量。
对于冻干产品的玻璃化转变温度(Tg)、结晶和吸热熔融的测量，进行以MettlerToledo DSC1_943(Mettler Toledo，德国)的差示扫描量热法(DSC)。总的来说，结果在111℃与117℃之间的范围内，指示稳定的产物饼。在通过目视检查、浊度、UV光谱法、HP-SEC和RP-HPLC进行分析之前，复原冻干小瓶。水用于使小瓶复原。观察到的复原时间较短并且相当，范围为约1分钟到约1.5分钟。在复原后，冻干产物展示适度到强发泡。
根据《欧洲药典》(第9版；专著2.9.20)，在2,000-3,750勒克斯之间，在白色背景前轻轻地、手动地、径向地搅拌5秒，并在黑色背景前搅拌5秒，目视检查是否存在可见粒子。通过两个经训练的审查员独立地执行检查。在所分析的样品中的任一者中未检测到可见粒子，无关于过程条件。所有溶液呈现彩色和粘性。另外，在复原之后的一些情况下检测到气泡。
将在860nm下操作且在90°角下检测的NEPHLA浊度计(Lange博士，Düsseldorf，德国)用于浊度测量。在整个研究中对于所有样品都获得极低的浊度。修改优化循环的不同过程参数并不影响制剂的浊度。
通过使用C Technologies SoloVPE仪器进行UV光谱法。所有蛋白质浓度都在20-30mg/ml的规格内。对于大多数测量，与T-液体相比，在冻干和复原(T-冻干)之后观察到较高蛋白质浓度的轻微趋势。在所有三个循环的T-冻干样品的情况下的较高吸光度可能已由光散射产生，例如由目视检查中也观察到的气泡引起。
在整个研究中测定具有93与95％之间的高PEG-CBS含量的相当HP-SEC特征曲线。在任何样品中未检测到去PEG化CBS。因此，更改的冻干过程参数并不影响样品的PEG化，其也不导致产生可通过HP-SEC检测的新物种。与HP-SEC特征曲线一致，经改性冻干过程条件也未揭露对PEG化特征曲线的影响。
使用A280nm GPBT1198测定蛋白质浓度。经由RP-HPLC GPBT3078测定无PEG含量。在冻干之前和冻干之后、或在中心与边缘瓶样品之间未观察到样品的蛋白质浓度的不同变化。当比较冻干前和冻干后的样品时，未测定出无PEG含量和活性的相当大的变化。因此，优化冻干循环参数不会不利地影响所分析的产物质量属性。
综上所述，冻干过程通过调节冷冻、PD和SD参数而成功地优化。优化过程的特征在于大体上减小的运行时间≤48小时。所应用的固态或液态分析方法均未指示过程优化对产物质量的减损。此外，循环3内的边缘和中心瓶位置的比较展示，PD期间产物相对于批量产物温度不均匀性是稳固的。
实施例18.评估下游纯化过程参数
以大规模进行用于纯化酶胱硫醚-β-合成酶(CBS)的替代性下游过程，目标是改进现有工艺的产量和回收。通过以10L规模在基本培养基中分批进料发酵(高细胞密度发酵)产生生物质。在收获时，将生物质经由离心与培养基分离，再悬浮于裂解缓冲液中且经由高压均质化而破坏。在经由离心从细胞碎片分离细胞提取物之后，含有CBS的上清液通过深度过滤程序澄清，且接着用作后续色谱操作的起始材料，所述色谱操作包括(i)使用HiTrapDEAE Sepharose FF(GE)的阴离子交换色谱(AEX)作为捕获步骤(ii)使用螯合琼脂糖FF(GE)的固定金属亲和色谱(IMAC)(具有Zn2+带电介质)中间步骤，和(iii)使用丁基-S琼脂糖6FF(GE)的疏水相互作用色谱(HIC)作为抛光步骤。在通过经纯化CBS的切向流过滤(TFF)进行透滤之后，进行PEG化。对于制剂，PEG化CBS再次通过TFF透滤且浓缩。细胞裂解物的PEI沉淀(0.35％)、缓冲液系统从磷酸盐更换到HEPES和由TweenTM20替换Triton X-100用于替代性工艺。
A.发酵
对于纯化过程优化和规模扩大所需的生物质产生，在基本培养基中进行两次一致的10L分批进料发酵。对于全部规模放大操作，使用发酵器2中产生的生物质(收集体积9.2L；生物质：1791g)。
B.下游纯化过程的规模放大
纯化过程1包括以下步骤中的一或多个：(i)细胞采集(ii)细胞再悬浮(ⅲ)细胞破坏(iv)聚乙烯亚胺(PEI)沉淀(v)离心(vi)无菌过滤(vii)使用DEAE琼脂糖FF进行捕获，其中第三洗涤步骤用于从磷酸盐再缓冲到HEPES(viii)使用带有锌离子的螯合琼脂糖FF的中间步骤(ix)使用丁基-s-琼脂糖6FF的抛光步骤(x)TFF(xi)PEG化。
纯化过程2包括以下步骤中的一或多个：(i)细胞采集(ii)细胞再悬浮(ⅲ)细胞破坏(iv)离心(v)深度过滤(vi)无菌过滤(vii)使用DEAE琼脂糖FF进行捕获(viii)使用带有锌离子的螯合琼脂糖FF的中间步骤(ix)使用丁基-s-琼脂糖6FF的抛光步骤，其中第二洗液步骤包括从HEPES再缓冲到磷酸盐，且包括稀释步骤以避免CBS的沉淀(x)TFF(xi)PEG化。
C.捕获步骤
在经由高压均质化进行细胞破坏之后，进行PEI沉淀，之后进行无菌过滤。捕获步骤的总CBS回收为58.1％(5.4g CBS；2.5g/L CBS)。捕获洗脱池的总蛋白质含量为7.5g。确认纯化过程2a的CBS回收和产率(85.1％回收；5.4g CBS；2.6g/L CBS)并且高于纯化过程1(47.7％回收；5.3g CBS；1.03g/L CBS)。总的来说，柱上的PEI沉淀和再缓冲对产率没有明显的不良影响。
D.中间步骤
捕获洗脱池在4℃到8℃下存储过夜，且在过程第2天进一步在中间步骤中使用带有锌离子的螯合琼脂糖FF处理。
E.抛光步骤
用20mM HEPES缓冲液稀释中间洗脱池以获得约1.6g/L的CBS浓度。随后，添加10mMEDTA在4℃到8℃下存储过夜。在过程第3天，在负载抛光柱之前添加硫酸铵(1.4M最终浓度)。
在流通中，未测量到吸光度信号，即无蛋白质且无CBS清除。测定纯化过程中的洗脱曲线。
纯化过程产生92.9％或更大的CBS回收。由于中间洗脱池的预稀释，未观察到浓度效应以及CBS在抛光柱上的沉淀，这引起约8％的回收率增加。对于所测试的所有纯化过程，总CBS回收为38.7％或更大。洗脱池经由TFF(Vivaflow 200，50kDa，PES)针对PEG化缓冲液透滤且浓缩到40g/L CBS。在TFF滞留物的情况下，进行全面分析以便测定CBS质量。
F.PEG化
小体积(1mL)的TFF滞留物以小规模PEG化，并且通过SDS-PAGE、HPLC(SE-、RP-和AEX-)和IEF分析，并且与PEG-CBS参考标准相比较。用SE-HPLC监测PEG化动力学(在四到五小时后一次测量)并且测定相对滞留＝tR(PEG-CBS)/tR(CBS)×100％，其中tR为相应物种的滞留时间。如果相对滞留(以整数给出)大于85％，那么这表明可需要添加额外PEG。在4.3h之后的相对滞留时间为82.4％，即其低于85％的阈值。因此，不添加额外PEG。在24hPEG化之后，相对滞留时间为82.8％。
等效物和范围
本领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定根据本文所描述的本公开的特定实施方式的许多等效物。本公开的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所阐述的。
在权利要求书中，除非相反地指示或另外从上下文显而易见，否则如“一(a/an)”和“所述”的冠词可以意味着一或超过一。除非相反地指出或另外从上下文显而易见，否则在一群组中的一个或更多个成员之间包括“或”的权利要求或描述，视为满足给定产品或方法中存在、采用一个、一个以上或全部群组成员，或者一个、一个以上或全部群组成员与给定产品或方法有关。本公开包括群组中恰好一个成员存在、使用于给定产品或方法中或另外与给定产品或方法有关的实施方式。本公开包括一个以上或全部群组成员存在于、使用于给定产品或方法中或另外与给定产品或方法有关的实施方式。
还应注意，术语“包含”旨在开放式的，并且允许但不需要包括另外的元素或步骤。当本文使用术语“包含”时，因此也涵盖和公开术语“由……组成”。
在给出范围时，包括端点。此外，应理解除非另外指明或另外从上下文显而易见且为本领域的技术人员所理解，否则表达为范围的值可在本公开的不同实施方式中采用所述范围内的任何特定值或子范围，达到所述范围的下限单位的十分之一，除非上下文另外明确规定。
另外，应理解，属于现有技术内的本公开的任何具体实施方式可从权利要求中的任何一或多者明确排除。因为此类实施方式被视为对于本领域的普通技术人员是已知的，所以即使没有在此明确地提出这种排除，其也可以被排除。出于任何原因，本公开组合物的任何具体实施方式(例如，任何抗生素、治疗性或活性成分；任何生产方法；任何使用方法等)可从任何一个或多个权利要求排除，无论与现有技术的存在相关与否。
应理解，已使用的词语为描述的词语而非限制，且可在所附权利要求书的范围内作出改变而不在其更广泛方面脱离本公开的真实范围和精神。
尽管已经相对于几个所描述实施方式以一定长度和一定特定性描述了本公开，但是本公开并不旨在应当限于任何此类细节或实施方式或者任何特定实施方式，而是应当参考所附权利要求书进行解释，以便根据现有技术提供对这种权利要求书的尽可能广泛的解释并且因此有效地涵盖本公开的预期范围。
序列表
<110> 特拉维尔治疗瑞士有限公司
科罗拉多州立大学董事会法人团体
<120> 用于治疗高胱氨酸尿症的酶疗法的PEG化胱硫醚β合成酶
<130> 2089.1005PCT
<140> PCT/US2020/039870
<141> 2020-06-26
<150> 62/983,860
<151> 2020-03-02
<150> 62/866,810
<151> 2019-06-26
<160> 5
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 412
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Pro Ser Glu Thr Pro Gln Ala Glu Val Gly Pro Thr Gly Ser Pro His
1 5 10 15
Arg Ser Gly Pro His Ser Ala Lys Gly Ser Leu Glu Lys Gly Ser Pro
20 25 30
Glu Asp Lys Glu Ala Lys Glu Pro Leu Trp Ile Arg Pro Asp Ala Pro
35 40 45
Ser Arg Cys Thr Trp Gln Leu Gly Arg Pro Ala Ser Glu Ser Pro His
50 55 60
His His Thr Ala Pro Ala Lys Ser Pro Lys Ile Leu Pro Asp Ile Leu
65 70 75 80
Lys Lys Ile Gly Asp Thr Pro Met Val Arg Ile Asn Lys Ile Gly Lys
85 90 95
Lys Phe Gly Leu Lys Cys Glu Leu Leu Ala Lys Cys Glu Phe Phe Asn
100 105 110
Ala Gly Gly Ser Val Lys Asp Arg Ile Ser Leu Arg Met Ile Glu Asp
115 120 125
Ala Glu Arg Asp Gly Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ile Ile Glu Pro
130 135 140
Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile Gly Leu Ala Leu Ala Ala Ala Val Arg
145 150 155 160
Gly Tyr Arg Cys Ile Ile Val Met Pro Glu Lys Met Ser Ser Glu Lys
165 170 175
Val Asp Val Leu Arg Ala Leu Gly Ala Glu Ile Val Arg Thr Pro Thr
180 185 190
Asn Ala Arg Phe Asp Ser Pro Glu Ser His Val Gly Val Ala Trp Arg
195 200 205
Leu Lys Asn Glu Ile Pro Asn Ser His Ile Leu Asp Gln Tyr Arg Asn
210 215 220
Ala Ser Asn Pro Leu Ala His Tyr Asp Thr Thr Ala Asp Glu Ile Leu
225 230 235 240
Gln Gln Cys Asp Gly Lys Leu Asp Met Leu Val Ala Ser Val Gly Thr
245 250 255
Gly Gly Thr Ile Thr Gly Ile Ala Arg Lys Leu Lys Glu Lys Cys Pro
260 265 270
Gly Cys Arg Ile Ile Gly Val Asp Pro Glu Gly Ser Ile Leu Ala Glu
275 280 285
Pro Glu Glu Leu Asn Gln Thr Glu Gln Thr Thr Tyr Glu Val Glu Gly
290 295 300
Ile Gly Tyr Asp Phe Ile Pro Thr Val Leu Asp Arg Thr Val Val Asp
305 310 315 320
Lys Trp Phe Lys Ser Asn Asp Glu Glu Ala Phe Thr Phe Ala Arg Met
325 330 335
Leu Ile Ala Gln Glu Gly Leu Leu Cys Gly Gly Ser Ala Gly Ser Thr
340 345 350
Val Ala Val Ala Val Lys Ala Ala Gln Glu Leu Gln Glu Gly Gln Arg
355 360 365
Cys Val Val Ile Leu Pro Asp Ser Val Arg Asn Tyr Met Thr Lys Phe
370 375 380
Leu Ser Asp Arg Trp Met Leu Gln Lys Gly Phe Leu Lys Glu Glu Asp
385 390 395 400
Leu Thr Glu Lys Lys Pro Trp Trp Trp His Leu Arg
405 410
<210> 2
<211> 551
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Pro Ser Glu Thr Pro Gln Ala Glu Val Gly Pro Thr Gly Cys Pro
1 5 10 15
His Arg Ser Gly Pro His Ser Ala Lys Gly Ser Leu Glu Lys Gly Ser
20 25 30
Pro Glu Asp Lys Glu Ala Lys Glu Pro Leu Trp Ile Arg Pro Asp Ala
35 40 45
Pro Ser Arg Cys Thr Trp Gln Leu Gly Arg Pro Ala Ser Glu Ser Pro
50 55 60
His His His Thr Ala Pro Ala Lys Ser Pro Lys Ile Leu Pro Asp Ile
65 70 75 80
Leu Lys Lys Ile Gly Asp Thr Pro Met Val Arg Ile Asn Lys Ile Gly
85 90 95
Lys Lys Phe Gly Leu Lys Cys Glu Leu Leu Ala Lys Cys Glu Phe Phe
100 105 110
Asn Ala Gly Gly Ser Val Lys Asp Arg Ile Ser Leu Arg Met Ile Glu
115 120 125
Asp Ala Glu Arg Asp Gly Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ile Ile Glu
130 135 140
Pro Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile Gly Leu Ala Leu Ala Ala Ala Val
145 150 155 160
Arg Gly Tyr Arg Cys Ile Ile Val Met Pro Glu Lys Met Ser Ser Glu
165 170 175
Lys Val Asp Val Leu Arg Ala Leu Gly Ala Glu Ile Val Arg Thr Pro
180 185 190
Thr Asn Ala Arg Phe Asp Ser Pro Glu Ser His Val Gly Val Ala Trp
195 200 205
Arg Leu Lys Asn Glu Ile Pro Asn Ser His Ile Leu Asp Gln Tyr Arg
210 215 220
Asn Ala Ser Asn Pro Leu Ala His Tyr Asp Thr Thr Ala Asp Glu Ile
225 230 235 240
Leu Gln Gln Cys Asp Gly Lys Leu Asp Met Leu Val Ala Ser Val Gly
245 250 255
Thr Gly Gly Thr Ile Thr Gly Ile Ala Arg Lys Leu Lys Glu Lys Cys
260 265 270
Pro Gly Cys Arg Ile Ile Gly Val Asp Pro Glu Gly Ser Ile Leu Ala
275 280 285
Glu Pro Glu Glu Leu Asn Gln Thr Glu Gln Thr Thr Tyr Glu Val Glu
290 295 300
Gly Ile Gly Tyr Asp Phe Ile Pro Thr Val Leu Asp Arg Thr Val Val
305 310 315 320
Asp Lys Trp Phe Lys Ser Asn Asp Glu Glu Ala Phe Thr Phe Ala Arg
325 330 335
Met Leu Ile Ala Gln Glu Gly Leu Leu Cys Gly Gly Ser Ala Gly Ser
340 345 350
Thr Val Ala Val Ala Val Lys Ala Ala Gln Glu Leu Gln Glu Gly Gln
355 360 365
Arg Cys Val Val Ile Leu Pro Asp Ser Val Arg Asn Tyr Met Thr Lys
370 375 380
Phe Leu Ser Asp Arg Trp Met Leu Gln Lys Gly Phe Leu Lys Glu Glu
385 390 395 400
Asp Leu Thr Glu Lys Lys Pro Trp Trp Trp His Leu Arg Val Gln Glu
405 410 415
Leu Gly Leu Ser Ala Pro Leu Thr Val Leu Pro Thr Ile Thr Cys Gly
420 425 430
His Thr Ile Glu Ile Leu Arg Glu Lys Gly Phe Asp Gln Ala Pro Val
435 440 445
Val Asp Glu Ala Gly Val Ile Leu Gly Met Val Thr Leu Gly Asn Met
450 455 460
Leu Ser Ser Leu Leu Ala Gly Lys Val Gln Pro Ser Asp Gln Val Gly
465 470 475 480
Lys Val Ile Tyr Lys Gln Phe Lys Gln Ile Arg Leu Thr Asp Thr Leu
485 490 495
Gly Arg Leu Ser His Ile Leu Glu Met Asp His Phe Ala Leu Val Val
500 505 510
His Glu Gln Ile Gln Tyr His Ser Thr Gly Lys Ser Ser Gln Arg Gln
515 520 525
Met Val Phe Gly Val Val Thr Ala Ile Asp Leu Leu Asn Phe Val Ala
530 535 540
Ala Gln Glu Arg Asp Gln Lys
545 550
<210> 3
<211> 1656
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
atgccgtcag aaaccccgca ggcagaagtg ggtccgacgg gttgcccgca ccgtagcggt 60
ccgcattctg caaaaggcag tctggaaaaa ggttccccgg aagataaaga agccaaagaa 120
ccgctgtgga ttcgtccgga cgcaccgtca cgctgtacct ggcagctggg tcgtccggca 180
agcgaatctc cgcatcacca tacggctccg gcgaaaagtc cgaaaattct gccggatatc 240
ctgaagaaaa ttggtgacac cccgatggtt cgtatcaaca aaatcggcaa aaaattcggt 300
ctgaaatgcg aactgctggc taaatgtgaa tttttcaatg cgggcggttc cgtgaaagat 360
cgtatctcac tgcgcatgat tgaagatgct gaacgcgacg gcaccctgaa accgggtgat 420
acgattatcg aaccgacctc tggcaacacg ggtatcggtc tggcactggc ggcggcagtc 480
cgtggttatc gctgcattat cgtgatgccg gaaaaaatga gctctgaaaa agttgatgtc 540
ctgcgtgctc tgggcgcgga aattgttcgt accccgacga atgcccgctt cgacagtccg 600
gaatcccatg tgggtgttgc atggcgcctg aaaaacgaaa tcccgaattc gcacattctg 660
gatcagtatc gtaacgctag caatccgctg gcgcattacg ataccacggc cgacgaaatc 720
ctgcagcaat gtgatggcaa actggacatg ctggtcgctt ctgtgggtac cggcggtacc 780
attacgggca tcgcgcgtaa actgaaagaa aaatgcccgg gctgtcgcat tatcggtgtg 840
gatccggaag gcagtattct ggcggaaccg gaagaactga accagaccga acaaaccacg 900
tatgaagttg aaggcatcgg ttacgatttt attccgaccg tcctggatcg cacggtggtt 960
gacaaatggt tcaaaagcaa tgacgaagaa gcctttacct tcgcacgtat gctgatcgct 1020
caggaaggtc tgctgtgcgg tggttcagca ggttcgacgg tcgcagtggc agttaaagct 1080
gcgcaggaac tgcaagaagg tcaacgttgt gtcgtgattc tgccggattc tgttcgcaac 1140
tacatgacca aatttctgag tgaccgttgg atgctgcaaa aaggcttcct gaaagaagaa 1200
gatctgaccg agaaaaaacc gtggtggtgg cacctgcgcg tgcaggaact gggtctgtcc 1260
gcaccgctga ccgttctgcc gaccatcacg tgcggccata cgattgaaat cctgcgtgaa 1320
aaaggttttg atcaggcccc ggttgtcgac gaagcaggcg tgattctggg tatggttacc 1380
ctgggtaaca tgctgagttc cctgctggcg ggcaaagtgc aaccgagcga tcaggttggt 1440
aaagtcatct acaaacaatt caaacagatt cgtctgaccg atacgctggg ccgcctgtcg 1500
cacatcctgg aaatggacca tttcgcgctg gttgtgcacg aacagattca ataccatagc 1560
accggcaaat catcgcagcg ccaaatggtc tttggtgtcg tgacggccat tgatctgctg 1620
aatttcgtgg ccgcacaaga acgtgaccag aaataa 1656
<210> 4
<211> 413
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 4
Met Pro Ser Glu Thr Pro Gln Ala Glu Val Gly Pro Thr Gly Cys Pro
1 5 10 15
His Arg Ser Gly Pro His Ser Ala Lys Gly Ser Leu Glu Lys Gly Ser
20 25 30
Pro Glu Asp Lys Glu Ala Lys Glu Pro Leu Trp Ile Arg Pro Asp Ala
35 40 45
Pro Ser Arg Cys Thr Trp Gln Leu Gly Arg Pro Ala Ser Glu Ser Pro
50 55 60
His His His Thr Ala Pro Ala Lys Ser Pro Lys Ile Leu Pro Asp Ile
65 70 75 80
Leu Lys Lys Ile Gly Asp Thr Pro Met Val Arg Ile Asn Lys Ile Gly
85 90 95
Lys Lys Phe Gly Leu Lys Cys Glu Leu Leu Ala Lys Cys Glu Phe Phe
100 105 110
Asn Ala Gly Gly Ser Val Lys Asp Arg Ile Ser Leu Arg Met Ile Glu
115 120 125
Asp Ala Glu Arg Asp Gly Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ile Ile Glu
130 135 140
Pro Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile Gly Leu Ala Leu Ala Ala Ala Val
145 150 155 160
Arg Gly Tyr Arg Cys Ile Ile Val Met Pro Glu Lys Met Ser Ser Glu
165 170 175
Lys Val Asp Val Leu Arg Ala Leu Gly Ala Glu Ile Val Arg Thr Pro
180 185 190
Thr Asn Ala Arg Phe Asp Ser Pro Glu Ser His Val Gly Val Ala Trp
195 200 205
Arg Leu Lys Asn Glu Ile Pro Asn Ser His Ile Leu Asp Gln Tyr Arg
210 215 220
Asn Ala Ser Asn Pro Leu Ala His Tyr Asp Thr Thr Ala Asp Glu Ile
225 230 235 240
Leu Gln Gln Cys Asp Gly Lys Leu Asp Met Leu Val Ala Ser Val Gly
245 250 255
Thr Gly Gly Thr Ile Thr Gly Ile Ala Arg Lys Leu Lys Glu Lys Cys
260 265 270
Pro Gly Cys Arg Ile Ile Gly Val Asp Pro Glu Gly Ser Ile Leu Ala
275 280 285
Glu Pro Glu Glu Leu Asn Gln Thr Glu Gln Thr Thr Tyr Glu Val Glu
290 295 300
Gly Ile Gly Tyr Asp Phe Ile Pro Thr Val Leu Asp Arg Thr Val Val
305 310 315 320
Asp Lys Trp Phe Lys Ser Asn Asp Glu Glu Ala Phe Thr Phe Ala Arg
325 330 335
Met Leu Ile Ala Gln Glu Gly Leu Leu Cys Gly Gly Ser Ala Gly Ser
340 345 350
Thr Val Ala Val Ala Val Lys Ala Ala Gln Glu Leu Gln Glu Gly Gln
355 360 365
Arg Cys Val Val Ile Leu Pro Asp Ser Val Arg Asn Tyr Met Thr Lys
370 375 380
Phe Leu Ser Asp Arg Trp Met Leu Gln Lys Gly Phe Leu Lys Glu Glu
385 390 395 400
Asp Leu Thr Glu Lys Lys Pro Trp Trp Trp His Leu Arg
405 410
<210> 5
<211> 413
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成截短人类C15S突变型CBS多肽
<400> 5
Met Pro Ser Glu Thr Pro Gln Ala Glu Val Gly Pro Thr Gly Ser Pro
1 5 10 15
His Arg Ser Gly Pro His Ser Ala Lys Gly Ser Leu Glu Lys Gly Ser
20 25 30
Pro Glu Asp Lys Glu Ala Lys Glu Pro Leu Trp Ile Arg Pro Asp Ala
35 40 45
Pro Ser Arg Cys Thr Trp Gln Leu Gly Arg Pro Ala Ser Glu Ser Pro
50 55 60
His His His Thr Ala Pro Ala Lys Ser Pro Lys Ile Leu Pro Asp Ile
65 70 75 80
Leu Lys Lys Ile Gly Asp Thr Pro Met Val Arg Ile Asn Lys Ile Gly
85 90 95
Lys Lys Phe Gly Leu Lys Cys Glu Leu Leu Ala Lys Cys Glu Phe Phe
100 105 110
Asn Ala Gly Gly Ser Val Lys Asp Arg Ile Ser Leu Arg Met Ile Glu
115 120 125
Asp Ala Glu Arg Asp Gly Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ile Ile Glu
130 135 140
Pro Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile Gly Leu Ala Leu Ala Ala Ala Val
145 150 155 160
Arg Gly Tyr Arg Cys Ile Ile Val Met Pro Glu Lys Met Ser Ser Glu
165 170 175
Lys Val Asp Val Leu Arg Ala Leu Gly Ala Glu Ile Val Arg Thr Pro
180 185 190
Thr Asn Ala Arg Phe Asp Ser Pro Glu Ser His Val Gly Val Ala Trp
195 200 205
Arg Leu Lys Asn Glu Ile Pro Asn Ser His Ile Leu Asp Gln Tyr Arg
210 215 220
Asn Ala Ser Asn Pro Leu Ala His Tyr Asp Thr Thr Ala Asp Glu Ile
225 230 235 240
Leu Gln Gln Cys Asp Gly Lys Leu Asp Met Leu Val Ala Ser Val Gly
245 250 255
Thr Gly Gly Thr Ile Thr Gly Ile Ala Arg Lys Leu Lys Glu Lys Cys
260 265 270
Pro Gly Cys Arg Ile Ile Gly Val Asp Pro Glu Gly Ser Ile Leu Ala
275 280 285
Glu Pro Glu Glu Leu Asn Gln Thr Glu Gln Thr Thr Tyr Glu Val Glu
290 295 300
Gly Ile Gly Tyr Asp Phe Ile Pro Thr Val Leu Asp Arg Thr Val Val
305 310 315 320
Asp Lys Trp Phe Lys Ser Asn Asp Glu Glu Ala Phe Thr Phe Ala Arg
325 330 335
Met Leu Ile Ala Gln Glu Gly Leu Leu Cys Gly Gly Ser Ala Gly Ser
340 345 350
Thr Val Ala Val Ala Val Lys Ala Ala Gln Glu Leu Gln Glu Gly Gln
355 360 365
Arg Cys Val Val Ile Leu Pro Asp Ser Val Arg Asn Tyr Met Thr Lys
370 375 380
Phe Leu Ser Asp Arg Trp Met Leu Gln Lys Gly Phe Leu Lys Glu Glu
385 390 395 400
Asp Leu Thr Glu Lys Lys Pro Trp Trp Trp His Leu Arg
405 410

Claims (61)

1.一种药物物质，其包含：
(a)分离的胱硫醚β-合成酶(CBS)蛋白质，其包含SEQ ID NO:1；和
(b)PEG分子，其共价结合于所述CBS蛋白质。
2.根据权利要求1所述的药物物质，其中所述PEG分子是ME-200GS。
3.一种药物组合物，其包含：根据权利要求1和2中任一项所述的药物物质和药学上可接受的赋形剂、佐剂、稀释剂或载剂。
4.一种根据权利要求3所述的药物组合物的制剂，其中所述制剂是冻干的。
5.根据权利要求4所述的冻干制剂，其中在复原后，复原液体制剂包含：
(a)浓度为约20-30mg/ml的所述药物物质；
(b)约15mM的磷酸钾；和
(c)约8％(w/v)的海藻糖。
6.根据权利要求5所述的复原制剂，其中一单位剂量的所述制剂包含：
(a)约25mg的所述药物物质；和
(b)1mL的水。
7.一种治疗受试者的高胱氨酸尿症的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求4-6中任一项所述的药物组合物的制剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述治疗有效量为选自约0.25mg/kg至约10mg/kg范围的剂量。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述剂量为约0.33mg/kg。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述剂量为约0.66mg/kg。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述剂量为约1.0mg/kg。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述剂量为约1.5mg/kg。
13.根据权利要求7-12中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用选自下组中的至少一种：吡哆醇、维生素B6和甜菜碱。
14.根据权利要求7-13中任一项所述的方法，其中所述受试者采用甲硫氨酸(Met)受限饮食。
15.根据权利要求7-14中任一项所述的方法，其进一步包括施用抗血小板剂。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗血小板剂是华法林血液稀释剂或抗凝血剂。
17.根据权利要求7-16中任一项所述的方法，其中所述施用步骤约每3天进行一次。
18.根据权利要求7-16中任一项所述的方法，其中所述施用步骤约每天进行一次。
19.根据权利要求7-16中任一项所述的方法，其中所述施用步骤约每周进行一次。
20.根据权利要求7-19中任一项所述的方法，其中所述施用步骤重复约6周。
21.根据权利要求7-19中任一项所述的方法，其中所述施用步骤重复约3个月。
22.根据权利要求7-19中任一项所述的方法，其中所述施用步骤重复约6个月。
23.根据权利要求7-19中任一项所述的方法，其中所述施用步骤重复超过6个月。
24.根据权利要求7-19中任一项所述的方法，其中所述施用步骤重复持续所述受试者的剩余寿命。
25.一种降低受试者的高半胱氨酸(Hcy)水平的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求4-6中任一项所述的药物组合物的制剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中在所述施用步骤之后的所述Hcy水平小于约80μM。
27.根据权利要求25所述的方法，其中在所述施用步骤之后的所述Hcy水平降低至多10％。
28.根据权利要求25所述的方法，其中在所述施用步骤之后的所述Hcy水平降低至多20％。
29.根据权利要求25所述的方法，其中在所述施用步骤之后的所述Hcy水平降低至多30％。
30.根据权利要求25所述的方法，其中在所述施用步骤之后的所述Hcy水平降低至多40％。
31.根据权利要求25所述的方法，其中在所述施用步骤之后的所述Hcy水平降低至多50％。
32.根据权利要求25所述的方法，其中在所述施用步骤之后的所述Hcy水平降低至多60％。
33.根据权利要求25所述的方法，其中在所述施用步骤之后的所述Hcy水平降低至多70％。
34.根据权利要求25所述的方法，其中在所述施用步骤之后的所述Hcy水平降低至多80％。
35.根据权利要求25所述的方法，其中在所述施用步骤之后的所述Hcy水平降低至多90％。
36.根据权利要求25-35中任一项所述的方法，其中在所述施用步骤之后的所述Hcy水平在约10μM至约20μM的范围内。
37.根据权利要求25-35中任一项所述的方法，其中在所述施用步骤之后的所述Hcy水平小于10μM。
38.根据权利要求25-35中任一项所述的方法，其中在所述施用步骤之后的所述Hcy水平为约55μM。
39.根据权利要求25-38中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量为选自约0.25mg/kg至约10mg/kg范围的剂量。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述剂量为约0.33mg/kg。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述剂量为约0.66mg/kg。
42.根据权利要求39所述的方法，其中所述剂量为约1.0mg/kg。
43.根据权利要求39所述的方法，其中所述剂量为约1.5mg/kg。
44.根据权利要求39所述的方法，其中所述剂量为约7.0mg/kg。
45.根据权利要求39所述的方法，其中所述剂量为约10mg/kg。
46.根据权利要求39所述的方法，其中所述剂量小于10mg/kg。
47.根据权利要求25-46中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用选自下组中的至少一种：吡哆醇、维生素B6和甜菜碱。
48.根据权利要求25-47中任一项所述的方法，其中所述受试者采用甲硫氨酸(Met)受限饮食。
49.根据权利要求25-48中任一项所述的方法，其进一步包括施用抗血小板剂。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述抗血小板剂是华法林血液稀释剂或抗凝血剂。
51.根据权利要求25-50中任一项所述的方法，其中所述施用步骤约每3天进行一次。
52.根据权利要求25-50中任一项所述的方法，其中所述施用步骤约每天进行一次。
53.根据权利要求25-50中任一项所述的方法，其中所述施用步骤约每周进行一次。
54.根据权利要求25-50中任一项所述的方法，其中所述施用步骤重复约6周。
55.根据权利要求25-50中任一项所述的方法，其中所述施用步骤重复约3个月。
56.根据权利要求25-50中任一项所述的方法，其中所述施用步骤重复约6个月。
57.根据权利要求25-50中任一项所述的方法，其中所述施用步骤重复超过6个月。
58.根据权利要求25-50中任一项所述的方法，其中所述施用步骤重复持续所述受试者的剩余寿命。
59.一种增加受试者的半胱氨酸(Cys)水平的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求4-6中任一项所述的药物组合物的制剂。
60.一种增加受试者的胱硫醚(Cth)水平的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求4-6中任一项所述的药物组合物的制剂。
61.一种治疗、缓解或预防与受试者的眼系统、骨胳系统、血管系统和/或中枢神经系统相关的负面临床结果的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求4-6中任一项所述的药物组合物的制剂。
CN202080060487.6A 2019-06-26 2020-06-26 用于治疗高胱氨酸尿症的酶疗法的PEG化胱硫醚β合成酶 Pending CN114786712A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962866810P 2019-06-26 2019-06-26
US62/866,810 2019-06-26
US202062983860P 2020-03-02 2020-03-02
US62/983,860 2020-03-02
PCT/US2020/039870 WO2020264333A1 (en) 2019-06-26 2020-06-26 Pegylated cystathionine beta synthase for enzyme therapy for treatment of homocystinuria

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114786712A true CN114786712A (zh) 2022-07-22

Family

ID=71670437

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080060487.6A Pending CN114786712A (zh) 2019-06-26 2020-06-26 用于治疗高胱氨酸尿症的酶疗法的PEG化胱硫醚β合成酶

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20220265835A1 (zh)
EP (1) EP3990005A1 (zh)
JP (1) JP2022539077A (zh)
KR (1) KR20220044726A (zh)
CN (1) CN114786712A (zh)
AU (1) AU2020302079A1 (zh)
BR (1) BR112021026292A2 (zh)
CA (1) CA3145426A1 (zh)
CL (1) CL2021003474A1 (zh)
IL (1) IL289245A (zh)
MX (1) MX2021015966A (zh)
WO (1) WO2020264333A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116920125A (zh) * 2022-10-13 2023-10-24 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 Cbs基因在制备糖尿病视网膜病变治疗药物中的应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11324811B2 (en) 2017-04-17 2022-05-10 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Optimization of enzyme replacement therapy for treatment of homocystinuria
AU2020343314A1 (en) * 2019-09-03 2022-03-24 Travere Therapeutics Switzerland Gmbh Cystathionine beta-synthase enzyme therapy for treatment of elevated homocysteine levels

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102741288A (zh) * 2009-08-29 2012-10-17 雅培制药有限公司 治疗用dll4结合蛋白
EP2510100A1 (en) * 2009-12-09 2012-10-17 Curevac GmbH Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids
CN104540940A (zh) * 2012-03-26 2015-04-22 科罗拉多州大学评议会 胱硫醚β-合酶的纯化
CN105452457A (zh) * 2013-01-29 2016-03-30 科罗拉多州大学评议会 用于治疗高胱氨酸尿症的胱硫醚β-合酶
WO2017083327A1 (en) * 2015-11-09 2017-05-18 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for treatment of homocystinuria

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170005801A (ko) 2014-04-01 2017-01-16 루비우스 테라퓨틱스, 아이엔씨. 면역조절을 위한 방법 및 조성물
US20180135012A1 (en) 2015-05-13 2018-05-17 Rubius Therapeutics, Inc. Membrane-receiver complex therapeutics
EP3481943A1 (en) 2016-07-07 2019-05-15 Rubius Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to therapeutic cell systems expressing exogenous rna

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102741288A (zh) * 2009-08-29 2012-10-17 雅培制药有限公司 治疗用dll4结合蛋白
EP2510100A1 (en) * 2009-12-09 2012-10-17 Curevac GmbH Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids
CN104540940A (zh) * 2012-03-26 2015-04-22 科罗拉多州大学评议会 胱硫醚β-合酶的纯化
CN105452457A (zh) * 2013-01-29 2016-03-30 科罗拉多州大学评议会 用于治疗高胱氨酸尿症的胱硫醚β-合酶
WO2017083327A1 (en) * 2015-11-09 2017-05-18 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for treatment of homocystinuria

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TOMAS MAJTAN ET AL.: ""Engineering and Characterization of an Enzyme Replacement Therapy for Classical Homocystinuria"", 《BIOMACROMOLECULES》, vol. 18, 21 April 2017 (2017-04-21), pages 1747 - 1761 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116920125A (zh) * 2022-10-13 2023-10-24 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 Cbs基因在制备糖尿病视网膜病变治疗药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020264333A1 (en) 2020-12-30
MX2021015966A (es) 2022-04-06
CL2021003474A1 (es) 2022-09-02
US20220265835A1 (en) 2022-08-25
JP2022539077A (ja) 2022-09-07
AU2020302079A1 (en) 2022-02-17
BR112021026292A2 (pt) 2022-05-31
EP3990005A1 (en) 2022-05-04
CA3145426A1 (en) 2020-12-30
KR20220044726A (ko) 2022-04-11
IL289245A (en) 2022-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114786712A (zh) 用于治疗高胱氨酸尿症的酶疗法的PEG化胱硫醚β合成酶
JP5732603B2 (ja) 骨標的アルカリホスファターゼ、キット及びその使用方法
JP2022084654A (ja) アルカリホスファターゼによって筋力低下を治療すること
ES2950808T3 (es) Alfa-glucosidasa ácida humana recombinante
JP7482914B2 (ja) ホモシスチン尿症の治療する組成物および方法
US20190169593A1 (en) Products and methods for assessing and increasing klotho protein levels
Majtan et al. Behavior, body composition, and vascular phenotype of homocystinuric mice on methionine-restricted diet or enzyme replacement therapy
WO2020163480A1 (en) Recombinant human acid alpha-glucosidase and uses thereof
US20220290116A1 (en) Cystathionine beta-synthase enzyme therapy for treatment of elevated homocysteine levels
WO2021227417A1 (zh) 一种治疗脊髓性肌萎缩症的方法和药物
Ganesh et al. Ocular manifestations of inborn errors of metabolism
Greydanus et al. Concepts of metabolic disorders.
RU2787632C2 (ru) Бис-холина тетратиомолибдат для лечения болезни вильсона
KR20230145120A (ko) 알칼리성 포스파타제 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법
EA045409B1 (ru) Рекомбинантная человеческая кислая альфа-глюкозидаза
Fernández Pombo Natural course and comorbidities of lipodystrophy syndromes in Spain
BR122024007742A2 (pt) Uso de fosfatase alcalina recombinante no tratamento de ataques
Escolar et al. Treatment and Management

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination