CN111088264B - 携带c3基因表达框的腺相关病毒载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供重组腺相关病毒介导的青光眼治疗药物。重组腺相关病毒载体携带肉毒梭状芽孢杆菌C3基因表达框。体内实验表明，该重组腺相关病毒载体经前房注射能够高效地导入小梁网细胞中，持续稳定地表达产生C3蛋白，增加小梁通道的通透性，降低眼压，为青光眼的治疗提供了新的选择。

Description

携带C3基因表达框的腺相关病毒载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及携带肉毒梭状芽孢杆菌C3基因表达框的重组腺相关病毒载体及其在降低眼压治疗青光眼中的应用。

背景技术

青光眼以视神经萎缩和视野缺损为主要特征，是全世界第二大致盲性眼病，居不可逆致盲性眼病的首位（Mantravadi AV, Vadhar N. Primary care. 2015;42(3):437-449.）。青光眼的主要危险因素来自于眼压升高，即眼压超过了眼球内组织，尤其是视网膜视神经所能承受的限度，将带来视功能损害。从全球流行病学调查研究发现青光眼与年龄有相关性，75岁以上人群发病率在7%，40岁以上患病率在2.4%，致盲率约30%（Stevens GA,et al. Ophthalmology. 2013;120(12):2377-2384.）。预计到2020年，我国将有2100万的青光眼患者，产生近630万盲人及超过1000万的视觉残障人士，给患者家庭及社会带来沉重的负担。有研究表明眼压每升高1mmHg，青光眼发生风险上升12%。多数青光眼患者缺乏特异的症状，隐匿性极强，发现时视神经损害已经很严重；如果治疗不力，致盲率极高。

原发性青光眼包括原发性开角型青光眼（primary open-angle glaucoma，POAG）和原发性闭角型青光眼（primary angle-closure glaucoma，PAGG），是青光眼这个大群体的主体。其发病机制包括：机械学说、缺血学说、跨筛板压力差学说。机械学说强调视神经纤维直接受压、轴浆流中断；缺血学说则强调视神经供血不足，对眼压耐受性降低。2006年王宁利提出的跨筛板压力差学说（杨迪亚，王宁利. 中华眼科医学杂志（电子版）. 2016；01:1-6），该理论认为筛板前后眼内压与颅内压之间的压力差增大，导致了视神经的损害。视神经血管自动调节功能紊乱也是青光眼视神经损害的原因之一。正常眼压存在一定波动性，视神经血管根据眼压的高低，通过增加或减少自身张力以维持恒定的血液供应。当眼压升高时，血管不能自动调节，视神经血液供应可明显减少，造成病理性损害。

POAG主要是由于原因尚不清楚的小梁网病变导致房水排除阻力增加，眼压升高并超过了视神经所能耐受的水平而发生进行性、凹陷性视神经萎缩和特征性视野缺损的眼病。PAGG则是由于患者原有解剖结构异常如浅前房、窄房角，加上后来晶状体膨胀增厚，虹膜晶状体隔前移，引起瞳孔阻滞，房角关闭导致眼压升高的眼病。发生机制上PAGG可分为以下3型：瞳孔阻滞型、非瞳孔阻滞型及多种机制共存型（王宁利，等. 中华眼科杂志. 2000；01:42-47+81-82）。瞳孔阻滞型指周边虹膜膨隆导致房角关闭；多种机制共存指周边虹膜增厚或睫状体前位或瞳孔缘靠前等非瞳孔阻滞及瞳孔阻滞共同参与。

青光眼治疗主要目的是保护视神经，降低视神经损害的进展速度，同时改善视神经血液供应，维持现有视功能，保障患者的生活质量；主要手段是降低眼内压。降低眼内压主要方法有药物、激光和手术。通常首选药物治疗，但长期使用降眼压药物，使患者依从性差，降眼压效果不理想，有的患者使用降眼压药后未能达到目标眼压，并且药物中含有的防腐剂对眼表毒性损伤不易恢复。Herreras JM等研究报道抗青光眼药物对眼表损伤（Herreras JM, et al. Ophthalmology. 1992;99(7):1082-1088.）。基于药物治疗青光眼存在一些弊端，特别是由于青光眼的隐匿性极强，多数病例发现时已经入中晚期，单纯药物甚至联合激光治疗也很难达成目标眼压，手术治疗仍是当前常用的治疗选项。有研究表明早期进行青光眼手术成功率高于长期使用降眼压药物控制后再进行手术（Saini M, etal. Int J Ophthalmol. 2017; 10(6):931-938.），原因是药物中含有的防腐剂会加重手术的炎症反应，易使术后滤过疱瘢痕化，导致手术失败。

虽然手术治疗是降低青光眼眼压的常用治疗手段，但效果不甚理想。因此有必要研究新的青光眼治疗方法。基因治疗作为一种新的治疗手段，为青光眼的治疗提供了新的选择。尽管大多数青光眼的遗传基因尚不清楚，但通过基因治疗，将编码眼压降低和 / 或视神经保护基因转导入特定的细胞，表达产生相应的效应蛋白，改变细胞的生理状态和阻止发病。青光眼基因治疗的研究方向主要有以下几个，

一、改善房水循环

目前可用于处理眼前节组织降低眼压的药物必须每天用药，那么顺从性是个主要问题。基因治疗可以减轻这个问题。

1.1减少房水的生成房水的生成主要靠睫状突非色素上皮逆浓度梯度,将Na⁺ 泵入后房。睫状突非色素上皮细胞紧密连接，形成血-房水屏障，在Na⁺/K⁺ATP 酶的作用下，Na⁺由细胞主动分泌入后房,这是一个耗能过程，且与HCO₃ ^-和 Cl^-协同转运。而通过α2，β2肾上腺素能受体可调节腺苷酸环化酶的活性，继而影响Na⁺/K⁺ATP酶的活性（Sears ML, et al.Trans Am Ophthalmol Soc.1991;89:131- 152.）。目前许多药物都有抑制与房水生成相关的酶或离子泵的作用，如Na⁺/K⁺ATP酶对乌巴因(ouabain) 敏感，可被其抑制而减少房水的生成；目前应用较多的 β 2 受体阻滞剂，其作用机制就是抑制睫状体上皮的离子泵或酶的活性，引起第二信使的改变从而抑制房水的生成。以上研究结果提示，可以通过影响与房水生成相关的几个步骤减少房水的生成。根据房水的生成原理，目前至少可由以下几个途径通过基因敲除的方法减少房水的生成：⑴基因敲除与房水生成相关的酶或相关的离子通道；⑵基因敲除腺苷酸环化酶减少房水的生成；⑶基因敲除 G蛋白，减少房水的生成。

1.2 疏通房水流出通道增加房水的排出小梁网是房水排出的主要通道。小梁网细胞是疏通房水流出通道，降低眼压，治疗青光眼的主要靶细胞。不少研究表明病毒载体可将外源基因有效地导入小梁网细胞。将外源基因导入小梁网以治疗青光眼，Borras 等将外源基因导入小梁网细胞中，基因可表达7d(Borras T, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci.1998;39:1503)。Budenz等将含有lacZ基因的腺病毒载体注入前房和玻璃体内，结果发现小梁网细胞可表达持续14d（Budenz DL, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995;36:2211- 2215）。单链腺相关病毒载体对小梁网细胞转导效率偏低（Borrás T, et al. JGene Med. 2006;8(5):589-602.）。但双链腺相关病毒载体（self-complementary adeno-associated virus，scAAV）携带报告基因前房注射有效地转导猴小梁网细胞，持续稳定地表达报告基因长达1年以上，且安全性良好（BuieLK,etal.InvestOphthalmol Vis Sci.2010;51(1):236-48.）。慢病毒载体携带绿色荧光蛋白（GFP）经前房注射也可有效地转导小梁网细胞，且持续稳定地表达GFP蛋白，也未观察到明显的炎症（Loewen N, et al. InvestOphthalmol Vis Sci. 2002; 43:3686-3690.Loewen N, et al. Invest Ophthalmol VisSci. 2001; 42:S731.）。单纯疱疹病毒载体可稳定在小梁和/或其他眼组织表达目的基因，但可引起炎症反应(Liu X, et al. Exp Eye Res. 1999; 69:385-395.)。由于青光眼基因治疗通常需要转导基因在小梁网细胞中持续稳定表达，而且不引起明显的副作用，因此AAV载体和慢病毒载体日益成为基因治疗研究的首选病毒载体。

常用的治疗基因主要有以下3类，①细胞骨架调节蛋白：通过破坏细胞骨架结构，刺激房水流出增加；②Myocilin基因：高度表达野生型位点，竞争突变位点；③金属蛋白酶：细胞外基质重新塑型（Borras T, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002;43:2513-2518）。使用灌注眼培养系统，Borras 等将管蛋白( tubulin) 基因导入小梁网细胞中，可降低眼压(Borras T, et al. Gene Ther.1999; 6(4):515- 524)。来自肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)C3 基因能特异性作用于肌动蛋白细胞骨架和肌球蛋白稳定性的重要调节蛋白Rho GTP 酶（guanosine triphosphatases, Rho GTPases，Rho）(Hall A.Science. 1998; 279:509-514.)，使Rho 失活，从而增加房水的排出。其机理为C3通过ADP－核糖基转移作用修饰Rho，使其第41位氨基酸天冬酰胺核糖基化(Aktories K, etal. Curr Top Microbiol Immunol. 1992; 175:115-131.)。该区为 Rho 高度保守的效应分子结合区，被核糖基化修饰后功能丧失，从而导致肌动蛋白应力纤维和细胞连接的降解(Aktories K, et al. Curr Top Microbiol Immunol. 1992; 175:115-131. KreisbergJI, et al. Am J Physiol. 1997; 273:F283-288.)。Tan J等报道了利用慢病毒载体携带C3基因表达框转导大鼠后C3基因表达特征及其对大鼠眼压的降低效果（Tan J,etal.InvestOphthalmol Vis Sci. 2018;59(12):4937-4944.）。结果显示携带C3基因表达框慢病毒经前房注射能够有效地转导大鼠小梁网细胞，表达产生C3蛋白，并发挥作用，降低大鼠眼压，但持续时间较短（注射病毒42d后降眼压作用消失）。王宁利等在中国发明专利《一种外酶C3转移酶基因治疗药物及其制备方法和应用》（专利申请号：201710650662.7）详细报道了文献（Tan J,etal.InvestOphthalmol Vis Sci. 2018;59(12):4937-4944.）报道药物的设计和制备过程。慢病毒载体携带C3基因表达框。C3基因表达框由MCMV启动子（小鼠巨细胞病毒启动子）、未优化的肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)C3 基因编码序列组成。专利（专利申请号：201710650662.7）中报道携带C3基因表达框慢病毒的大鼠体内实验研究结果同文献（Tan J,etal.InvestOphthalmol Vis Sci. 2018;59(12):4937-4944.）报道一样。虽然慢病毒能够有效地转导大鼠小梁网细胞，表达产生C3蛋白，降低眼压，但持续时间较短，不超过42天。

二、视神经及视网膜神经节细胞的保护性治疗（Wu L, Chen XH. Int JOphthalmol.2004;4(3):496- 499）

青光眼导致的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）凋亡的激发因素主要有神经营养因子的剥夺和兴奋性毒素一氧化氮的毒性作用。高眼压或低血流灌注压导致缺血缺氧等，使RGC轴浆流中断，靶源性神经营养因子供应中断，同时兴奋性毒素大量产生，激活诱导凋亡的基因作用于细胞表面受体，启动RGC凋亡程序。已有研究表明重复眼内注射神经营养因子能暂时性拯救因轴突损伤导致的RGC死亡。采用基因疗法转染这些营养因子，能克服重复注射带来的并发症。

脑源性神经营养因子 (brain- derived neurotrophic factor, BDNF) 是一种重要的RGC存活因子。 Di Polo等通过玻璃体腔内BDNF表达的腺病毒载体能暂时性延缓视神经横断性损伤后RG（retinal ganglion，RG）死亡（Di Polo A, et al. Proc Natl AcadSci USA.1998;95:3978- 3983）。主要是腺病毒载体的转基因表达有效时间相对较短，而且其本身易引起炎症反应，不是理想的选择。腺相关病毒(AAV)载体能够在视网膜进行长期的转基因表达，引起的眼部炎症反应很轻微。Martin等通过采用532nm二极管激光处理大鼠小梁网引起中等程度的慢性眼压升高，只导致特异性的RGC丧失，而不损害其他视网膜层(Martin KR, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003;44:4357- 4365)。他们采用独创的AAV- BDNF结合土拨鼠肝炎逆转录调节元素(woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element, WPRE), 单次玻璃体腔内病毒注射2周内就很容易在大鼠RGC层神经元产生很高的转染效率。结果表明实验性青光眼4周后，玻璃体腔内注射AAV-BDNF-WPRE与单纯注射生理盐水或不含 BDNF 的对照病毒相比，能明显增加RGC的存活率(轴突计数) ，进一步支持神经营养疗法可作为青光眼降低眼压的补充治疗的潜在可行性。

Dingwell等证实碱性成纤维生长因子(basic fibroblastgrowth factor, bFGF)在 RGC 生长发育过程中是一种潜在的刺激因子(Dingwell KS, et al. J Neurobiol.2000;44(2):246- 259)。但也有研究发现在视神经颅内段轴性损伤后，采用眼内注射bFGF蛋白质未能显示RGC再生(Wang XF, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci , 2005;46(4):1508- 1515)。据推测，这是由于bFGF在体内的半衰期很短，在眼内持续时间有限。Sapieha等采用视神经微压榨伤(micro-crush lesion) 制作视神经损伤模型，用重组AAV将bFGF基因转入成年SD大鼠玻璃体腔，以利于bFGF的持久释放（Sapieha PS, et al. Mol CellNeurosci. 2003;24:656- 672）。与对照组的神经相比，bFGF基因转染后，视神经轴突从病变部位向后的数量要多10倍，这种上调反应与FGF受体表达相关。bFGF转基因表达只对受损的RGC起暂时性的保护作用，而且这种神经营养因子对轴突延伸并不能代表神经元存活数量的增加。

近年来，睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNDF) 被证明是能改善受损的 RGC 的存活与再生最有前途的神经营养因子之一。Van Adel等采用视神经横断性损伤作为在体模型，评价具有自我失活的复制缺陷的慢病毒相关的载体携带人类睫状神经营养因子表达框(SIN- PGK- CNFT) 对成年大鼠 RGC 轴突存活率的影响(van AdelBA, et al. Human Gene Therapy. 2003;14: 103-115)。他们采用单次玻璃体内注射含有编码的人CNTF(LV-CNTF)基因的慢病毒或含有编码细菌β-半乳糖酶(LV-LacZ)基因的慢病毒作为对照组，在大鼠视神经轴性损伤后14d与21d检测RGC的存活情况。结果表明，与对照组相比，用携带编码CNTF基因的lentiviral载体，能明显增强RGC的存活，而且效果比单纯玻璃体内注射重组人CNTF要好。

色素上皮源性因子(pigmentepithelium-derivedfactor,PEDF)，是一种50kDa蛋白质，由人胚胎视网膜色素上皮细胞分泌。已经证明PEDF是一种有希望的内源性新生血管形成抑制剂和神经保护蛋白质。Takita等采用前房内灌注生理盐水，将大鼠眼压升高至110mmHg，持续60min，制作压力诱导的视网膜缺血-再灌注模型(Takita H, et al. InvestOphthalmol Vis Sci ,2003;44:4497- 4504)。在模型制作前4d玻璃体腔内注射含有编码PEDF基因的腺病毒载体(AdPEDF.11)颗粒。结果表明，节细胞层细胞密度明显多于对照组(AdNull.11，不含编码PEDF基因的腺病毒)；但凋亡细胞数(TUNEL阳性细胞)明显少于对照组。提示腺病毒载体相关的眼内PEDF表达能明显增加视网膜缺血-再灌注(急性高眼压)损伤神经元的存活率，这种保护作用可能源于抑制缺血诱导的凋亡，并认为转基因方法能直接干扰因视网膜缺血所导致的细胞程序化死亡。

青光眼基因治疗最常见的负面反应表现在前房内出现的主要由单核细胞浸润组成的炎症反应。这种反应在灵长类比啮齿类更常见，至少发生在HSV载体中。在注射高浓度腺病毒载体时，兔眼和猴眼都可能出现严重的炎症反应，这可能与载体病毒诱导的炎症前细胞激酶的作用有关。而且，这种炎症反应是剂量依赖性的，但AAV和LV载体并不诱导炎症反应。

本发明拟在上述已有青光眼基因治疗工作的基础上，提出更为高效的青光眼基因治疗药物设计。基因治疗药物的设计基于降眼压治疗青光眼的策略。药物设计拟采用双链AAV2载体（self-complementaryadeno-aasociatedvirus，scAAV2）携带独特设计的C3基因表达框策略。通过前房水给药使设计的基因药物高效地转导小梁网细胞，表达产生C3蛋白，增加小梁网的通透性，提高房水流动性，从而达到降低眼压的目的。我们拟设计独特的C3基因表达框采用高效的启动子、对C3基因编码序列进行人源表达优化合成以及高效polyA加尾信号。这些设计保证了C3基因表达框导入小梁网细胞后的高效表达。而且我们采用双链AAV2载体携带独特设计的C3基因表达框。双链AAV2载体经前房注射后能够有效地转导小梁网细胞，保证了C3基因表达框高效地导入小梁网细胞。而且我们还采用高效的小梁网细胞特异的启动子调控C3基因的表达，有效地降低C3基因非特异性表达可能带来的副作用。然后，将设计好的药物在恒河猴中评价其有效性。具体的过程如本发明实施例所示。

腺相关病毒（Adeno-associatedvirus，AAV）因在腺病毒制品中发现而得名（Atchison RW, et al. Science. 1965;149:754-756. Hoggan MD, et al. Proc NatlSci USA.1966;55:1467-1474.）。AAV是微小病毒科(Parvovirus)成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNA(Rose JA, et al. Proc Natl Acad Sci USA.1969;64:863-869.)，其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒(Geoffroy MC, et al. Curr Gene Ther. 2005;5(3):265-271.)，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态(Chiorini JA, et al. Curr Top Microbiol Immunol.1996; 218:25-33.)，而不产生子代病毒。

最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV（AAV2）(Atchison RW, et al.Science.1965;149:754-756.)。AAV2基因组长约4.7kb，基因组两端为长度145bp的“反向末端重复序列”（inverted terminal repeat,ITR），呈回文-发卡结构(Lusby E, et al. JVirol. 1980; 34: 402-409.)。基因组中有两个大开放阅读框（ORF），分别编码rep和cap基因。AAV2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中(Samulski RJ, et al. Proc Natl AcadSci USA. 1982;79:2077-2081.Laughlin CA, et al. Gene.1983;23:65-73.)。

ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用(Xiao X, et al. J Virol.1997;71(2):941-948.)。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点（Rep binding site，RBS）和末端解链位点trs（terminal resolutionsite），能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口(Linden RM, et al. Proc Natl AcadSci USA. 1996; 93(15):7966-7972.)。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用(Ashktorab H, et al. J Virol.1989;63(7):3034-3039.)。

AAV2基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区(Srivastava A,et al. J Virol.1983;45(2):555-564.)。rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs（terminal resolution site）和GAGY重复基序（repeatmotif）特异性结合(Hüser D, et al. PLoS Pathog.2010;6(7):e1000985.)，启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序是AAV基因组复制的中心，因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同，但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子，分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40没有结合DNA的功能，而有ATP依赖的DNA解旋酶活性。cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中，VP3分子量最小，但数量最多，在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1:1:10。VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。

随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解，AAV病毒被改造成了一种高效的外源基因转移工具，即AAV载体。改造后的AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带转运的外源基因表达框，病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过外源质粒反式提供，降低了rep和cap基因包装入AAV载体可能带来的危害。加之，AAV病毒本身不具有致病性，使AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs（terminal resolution site）序列还能够使包装得到的重组AAV病毒载体携带基因组自我互补，形成双链，显著提高AAV载体的体内外转导效率（Wang Z, et al. Gene Ther.2003;10(26):2105-2111.McCarty DM, et al. Gene Ther.2003;10(26):2112-2118.）。包装得到的病毒成为scAAV（self-complementary AAV）病毒，即所谓的双链AAV病毒。不同于双侧ITR均未突变的ssAAV（single-stranded AAV），即传统的AAV病毒。scAAV病毒的包装容量更小，仅为ssAAV包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。AAV病毒血清型众多，不同的血清型具有不同的组织感染嗜性，因此应用AAV载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织(Wu Z, et al. Mol Ther. 2006;14(3):316-327.)。有些血清型AAV载体（如AAV2）经前房注射后能够有效地转导小梁网细胞（Buie LK, et al. InvestOphthalmol Vis Sci. 2010;51(1):236-48.）。此外，AAV载体的理化性质稳定，对酸碱和高温体现出较强的耐受性(Gruntman AM, et al. Hum Gene Ther Methods. 2015;26(2):71-76.)，容易开发出稳定性较高的生物制品。

AAV载体还具有相对成熟的包装系统，便于规模化生产。目前国内外常用的AAV载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒为辅助病毒系统、单纯疱疹病毒（Herpessimplex virus type1，HSV1）为辅助病毒的包装系统以及基于杆状病毒的包装系统。其中，三质粒转染包装系统因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的AAV载体包装系统，也是目前国际上主流的生产系统。略显不足的是，高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染系统在AAV载体大规模制备中的应用。Yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的AAV大规模包装系统（Yuan Z, et al. Hum Gene Ther. 2011; 22(5):613-624.），该系统生产效率高，但包装系统中腺病毒在最后AAV成品中的痕量存在，影响了AAV成品的安全性。HSV1作为辅助病毒的包装系统是另一类应用较为广泛的AAV载体包装系统。伍志坚和Conway等几乎同时在国际上提出了以HSV1为辅助病毒的AAV2载体包装策略（伍志坚，吴小兵等。科学通报，1999，44（5）：506-509。Conway JE, et al. Gene Ther. 1999; 6:986-993.）。随后Wustner等提出了以HSV1为辅助病毒的AAV5载体包装策略（Wustner JT, et al. Mol Ther. 2002;6(4):510-518.）。在此基础上，Booth等利用两个HSV1分别携带AAV的rep/cap基因和AAV的反向末端序列（Inverted terminal repeat，ITR）/外源基因表达框，然后两个重组HSV1病毒共同感染生产细胞，包装产生AAV病毒（Booth MJ, et al. Gene Ther. 2004;11:829-837.）。Thomas等进一步建立双HSV1病毒AAV生产的悬浮细胞系统（Thomas DL, et al.Gene Ther. 2009;20:861-870.），使更大规模的AAV病毒生产成为可能。另外，Urabe等利用三个杆状病毒分别携带AAV的结构、非结构和ITR/外源基因表达框，构建了AAV载体的杆状病毒包装系统。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性，随后减少了生产系统中所需杆状病毒的个数，逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两或一个杆状病毒（Chen H. MolTher. 2008;16(5):924-930. Galibert L, et al. J Invertebr Pathol. 2011;107Suppl:S80-93.）以及一个杆状病毒加一株诱导细胞株策略（Mietzsch M, et al. HumGene Ther. 2014;25:212-222. Mietzsch M, et al. Hum Gene Ther. 2015;26(10):688-697.）。每种包装系统都各具特点，可根据需要做出合适的选择。

由于上述特点，AAV载体逐渐成为一种广泛应用于基因治疗，特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具。截至2017年11月，世界上批准的机遇AAV载体的基因治疗临床试验方案有204项（http://www.abedia.com/wiley/vectors.php）。更为重要的是，基于AAV载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物Glybera已于2012年被欧洲药监局批准上市，成为西方世界批准的第一个基因治疗药物（Ylä-Herttuala S. Mol Ther. 2012;20(10):1831-1832.）；2017年12月19日美国FDA批准先天性黑曚症（RPE65基因突变引起）基因治疗药物Luxturna上市，成为美国第一个罕见病的基因治疗药物（https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm589467.htm）。血友病B（Kay MA, et al. Nat Genet.2000;24(3):257-261.）的AAV载体基因治疗药物均取得不错的临床试验效果，预期在不久的将来会上市销售，造福广大患者。

本发明中，我们选择AAV载体来携带C3基因表达框，主要是基于AAV载体的以下特点。其一，AAV载体仅保留野生型病毒中包装需要的两个ITR序列，不含有野生型病毒基因组中的蛋白编码基因（Salgenik M, et al. Microbiol Spectr.2015;3(4).），免疫原性低。其二，AAV通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带基因读框的持续稳定表达（ChenZY, et al. Mol Ther. 2001;3(3):403-410.），避免引导入基因随机整合而带来的安全性问题。其三，AAV载体通过前房注射能够高效地转导小梁网细胞（Buie LK, et al. InvestOphthalmol Vis Sci. 2010;51(1):236-48.），保证C3基因表达框能够在小梁网细胞中表达产生C3蛋白，改变小梁网细胞中的肌动蛋白结构，增加小梁网的通透性，有助于房水的排出，降低眼压，从而达到治疗青光眼的目的。

基于此，本发明提出了新型青光眼基因治疗药物设计。设计基因药物的结构为携带人工设计的C3基因表达框的重组腺相关病毒载体。基因药物经前房注射导入体内后，转导小梁网细胞，表达产生C3蛋白。选用的重组腺相关病毒载体为双链AAV2载体（self-complementaryadeno-associated virus type2, scAAV2）。scAAV2载体前房注射能够高效地转导小梁网细胞（Buie LK,et al.Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010;51(1):236-48.），将C3基因表达框导入小梁网细胞。而且scAAV2载体基因组能够自身互补形成双链，不需要经过单链AAV载体基因组互补链的合成即可开启基因表达，具有基因表达水平高、表达迅速等特点。

人工设计的C3基因表达框3种不同的启动子设计。3种不同的启动子分别是CAM启动子、CH3L1启动子和MGP启动子。CAM启动子由人巨细胞病毒的增强子、鸡beta-actin基础启动子和鼠细小病毒内含子组成，具有序列短小，表达强度高的特点。CH3L1启动子来源于人chitinase3-like1基因，在小梁网细胞中特异性高表达（Liton PB, et al. InvestOphthalmolVis Sci. 2005; 46:183-190.）。MGP启动子为人基质胶质蛋白（matrixGlaprotein，MGP）基因的启动子，一种序列短小的小梁网细胞特异性启动子（Gonzalez P, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004;45:1389-1395.）。

首先，用CAM启动子调控C3基因表达，制备得到scAAV2病毒。体外转导人小梁网细胞，有效地降解细胞内肌动蛋白结构，改变小梁网细胞形态。体内转导C57BL/6JJ小鼠和恒河猴，降低眼压，显示出青光眼治疗潜力。但由于scAAV2病毒也能感染角膜内皮细胞，CAM启动子不具有细胞表达特异性，感染角膜内皮细胞过表达C3蛋白，带来了角膜水肿副作用。为此，我们进一步用CH3L1启动子和MGP启动子来调控C3基因的表达。制备CAM启动子、CH3L1启动子和MGP启动子调控下的分泌型荧光素酶（Gaussialuciferase，Gluc）的scAAV2病毒。将3种病毒分别转导人小梁网细胞、人角膜内皮细胞、人Schlemm管细胞，比较细胞培养上清中Gluc表达活性，结果显示CH3L1启动子和MGP启动子特异性调控Gluc在人小梁网细胞中高表达。随后，我们制备了CH3L1启动子和MGP启动子调控的C3基因的scAAV2病毒。以CAM调控的C3基因的scAAV2病毒为对照，将CH3L1启动子和MGP启动子调控的C3基因的scAAV2病毒经前房注射恒河猴，结果显示3种病毒都能够有效地长时间地降低恒河猴眼压，且CH3L1启动子和MGP启动子调控的C3基因的scAAV2病毒未观察到角膜水肿等副反应。这些结果表明本发明设计的CAM启动子、CH3L1启动子和MGP启动子调控的C3基因表达框的scAAV2病毒具有治疗青光眼的潜力，特别是CH3L1启动子和MGP启动子调控的C3基因表达框的scAAV2病毒显示出眼压降低效果好、安全性高的特点，呈现出巨大的开发价值，为青光眼的基因治疗提供了新的选择。

发明内容

有鉴于此，本发明提供青光眼的基因治疗药物。本发明提出了青光眼基因治疗药物设计，用重组腺相关病毒载体携带人为设计的C3基因表达框。将该基因药物经前房导入眼球后，在小梁网细胞中表达产生C3蛋白，降低细胞中肌动蛋白的稳定性，改变细胞形态，增加小梁网通透性，有助于房水的排出，降低青光眼患者的眼压，从而达到治疗青光眼的目的。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了治疗青光眼的基因药物，其特征在于，该药物基于重组AAV载体，利用AAV载体通过前房注射能高效地把药物效应元件导入小梁网细胞的特点，实现药物效应元件高效表达产生治疗作用的C3蛋白。为了实现C3蛋白表达框的高效表达，根据不同AAV载体的转导特点，选用的AAV载体为双链AAV2载体，即基因组自身互补的2型AAV载体（self-complementary AAV type 2，scAAV2）。不同于单链AAV（single-stranded AAV type 2，ssAAV2）（AAV载体的常用形式），scAAV2进入细胞后基因组自身互补形成双链，不像ssAAV需要通过DNA修复机制合成互补链形成双链，显著提高了scAAV2病毒携带基因表达框进入细胞后的表达水平，且表达时间快。本发明实施例3中展示了scAAV2携带C3基因表达框（scAAV2-C3）体内外实验结果。scAAV2-C3病毒体外转导人小梁网细胞，有效地降解细胞内肌动蛋白结构，改变小梁网细胞形态。scAAV2-C3病毒体内转导C57BL/6JJ小鼠和恒河猴，降低眼压，显示出青光眼治疗潜力。在实施例4中，同scAAV2-C3病毒一样，scAAV2-CH3L1-C3和scAAV2-MGP-C3病毒也能够有效地降低恒河猴眼压，表现出青光眼治疗潜力。

本发明提供了治疗青光眼的基因药物，其特征还在于，该药物经前房注射后能够高效地在小梁网细胞中特异性地表达C3蛋白。scAAV2能够高效地转导小梁网细胞，但特异性不高。通过前房注射后，往往还能感染角膜内皮细胞。角膜内皮细胞过表达C3蛋白，会带来角膜水肿副作用（见实施例3）。在本发明中，我们进一步用小梁网细胞特异性启动子来控制C3基因表达，使scAAV2携带的C3基因表达框特异性地在小梁网细胞中表达。以分泌型荧光素酶（Gaussialuciferase，Gluc）为报告基因，体外实验证明CH3L1启动子和MGP启动子能够特异性地在小梁网细胞中表达，而不在角膜内皮细胞和Schlemm管细胞中表达，呈现出良好的细胞特异性（实施例4）。随后，用CH3L1启动子和MGP启动子调控C3基因的表达。以CAM启动子调控的C3基因的scAAV2病毒为对照，将CH3L1启动子和MGP启动子调控的C3基因的scAAV2病毒经前房注射恒河猴，结果显示3种病毒都能够有效地长时间地降低恒河猴眼压，且CH3L1启动子和MGP启动子调控的C3基因的scAAV2病毒未观察到角膜水肿等副反应（实施例4）。这些实验证明了，本发明设计的青光眼基因药物能够特异性地在小梁网细胞中表达C3蛋白，发挥作用，降低眼压，从而达到治疗青光眼的目的。

本发明提供了治疗青光眼的基因药物，其特征还在于，该药物基因表达框中的C3基因编码序列经过人源表达优化。C3基因来自于肉毒梭状芽孢杆菌。由于肉毒梭状芽胞杆菌密码子偏爱性同人密码子偏爱性差异，因此肉毒梭状芽胞杆菌的C3基因编码序列可能会在人体中表达水平偏低，不能够直接用于人体中C3蛋白的表达。故我们在C3基因表达框设计时对C3基因编码区进行了人源表达优化，有助于提高C3基因表达框转导入小梁网细胞后的表达水平。

本发明提供的治疗青光眼的基因药物，其特征还在于，经前房注射后能高效地转导小梁网细胞。眼压过高是青光眼的主要危险因素，改变小梁网细胞结构，增加小梁网的通透性，提升房水排出效率，降低眼压，是潜在的青光眼治疗方式之一。本发明提供的基因药物经前房注射能够高效地转导小梁网细胞，表达产生效应蛋白，发挥作用，从而达到治疗青光眼的目的。相比玻璃体腔注射、视网膜下腔注射等方式，前房注射具有操作简单、损伤小等特点，在临床应用中具有明显优势。

本发明提供的青光眼基因治疗药物，其特征还在于，经前房一次给药就能够长期持续地在恒河猴小梁网细胞中表达产生C3蛋白，降低眼压，从而达到治疗青光眼的目的。

为了进一步说明本发明专利的特征，我们进一步比较分析文献及专利报道慢病毒载体携带C3基因表达框用于治疗青光眼同本发明报道scAAV2携带C3基因表达框的异同点。

来自肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)C3 基因能特异性作用于肌动蛋白细胞骨架和肌球蛋白稳定性的重要调节蛋白Rho GTP 酶（guanosinetriphosphatases, Rho GTPases，Rho）(Hall A. Science. 1998; 279:509-514.)，使Rho失活，从而增加房水的排出。其机理为C3通过ADP－核糖基转移作用修饰Rho，使其第41位氨基酸天冬酰胺核糖基化(Aktories K, et al. Curr Top Microbiol Immunol. 1992;175:115-131.)。该区为 Rho 高度保守的效应分子结合区，被核糖基化修饰后功能丧失，从而导致肌动蛋白应力纤维和细胞连接的降解(Aktories K, et al. Curr Top MicrobiolImmunol. 1992; 175:115-131. Kreisberg JI, et al. Am J Physiol. 1997; 273:F283-288.)。Tan J等报道了利用慢病毒载体携带C3基因表达框转导大鼠后C3基因表达特征及其对大鼠眼压的降低效果（Tan J,etal.InvestOphthalmol Vis Sci. 2018;59(12):4937-4944.）。结果显示携带C3基因表达框慢病毒经前房注射能够有效地转导大鼠小梁网细胞，表达产生C3蛋白，并发挥作用，降低大鼠眼压，但持续时间较短（注射病毒42d后降眼压作用消失）。王宁利等在中国发明专利《一种外酶C3转移酶基因治疗药物及其制备方法和应用》（专利申请号：201710650662.7）详细报道了文献（Tan J,etal.InvestOphthalmolVis Sci. 2018;59(12):4937-4944.）报道药物的设计和制备过程。慢病毒载体携带C3基因表达框。C3基因表达框由MCMV启动子（小鼠巨细胞病毒启动子）、未优化的肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)C3 基因编码序列组成。专利（专利申请号：201710650662.7）中报道携带C3基因表达框慢病毒的大鼠体内实验研究结果同文献（Tan J,etal.InvestOphthalmol Vis Sci. 2018;59(12):4937-4944.）报道一样。虽然慢病毒能够有效地转导大鼠小梁网细胞，表达产生C3蛋白，降低眼压，但持续时间较短，不超过42天。

相比于携带C3基因表达框的慢病毒载体，本发明提供的含有C3基因表达框的scAAV2载体，具有以下特点：

特点一，两种设计使用了不同的病毒载体，本发明为2型双链AAV载体，而文献及专利报道为慢病毒载体。载体本身的特性差异表明了两种药物的差别。

特点二，两种设计的C3基因表达框中表达元件存在差异。慢病毒携带C3基因表达框的启动子为MCMV，一种来源于小鼠巨细胞病毒的启动子，表达水平高，但也存在在小梁网细胞中因启动子甲基化表达持续时间可能偏短的风险。而且MCMV启动子不具有细胞特异性，增加了非特异性表达带来的安全性风险。本发明提供的C3基因表达框的启动子分别为CAM、CH3L1和MGP。其中CAM含有鸡beta-actin基础启动子，能够在细胞中持续稳定地表达C3蛋白。CH3L1和MGP为小梁网细胞特异性启动子，能够特异性地在小梁网细胞中表达产生C3。实施例4中恒河猴动物实验结果证明了CH3L1和MGP启动子调控表达C3蛋白在青光眼治疗中的有效性和安全性。

特点三，C3基因编码序列的差异。慢病毒载体携带的C3基因编码序列直接来自于肉毒梭状芽胞杆菌基因组，未经人源表达优化。本发明中的C3基因编码序列以肉毒梭状芽胞杆菌基因组中C3基因编码区为基础，进行了人源表达优化，预期在人中的表达水平会更高。

特点四，注射病毒后眼压降低的持续时间不同。携带C3基因表达框的慢病毒载体经前房注射大鼠后，眼压降低持续时间不超42d。本发明中3种设计的青光眼基因药物经前房注射恒河猴后，眼压降低持续时间不少180d，持续时间更长。

本发明用到的重要原始实验材料如下所示：

pHelper质粒，来源于AAVHelperFreeSystem（AgilentTechnologies，美国），由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。该质粒包含三质粒共转染HEK293细胞制备重组AAV病毒所需要的腺病毒来源辅助功能基因E2A、E4和VARNA等。

pAAV-R2C2质粒，为AAVHelperFreeSystem（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒，由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。为了明确指示pAAV-RC质粒的功能，将pAAV-RC质粒重新命名为pAAV-R2C2质粒。pAAV-R2C2质粒包含完整的AAV2的rep和cap基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV2病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV2外壳蛋白。

C57BL/6JJ小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，用作动物实验的野生型对照和实验用动物。

恒河猴，学名Macacamulatta，购自海南金港生物技术股份有限公司，委托四川省人民医院实验动物研究所进行恒河猴饲养和实验评价工作。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1pAAV2neo载体结构示意图。本公司保存的两侧ITR均为145bp野生型ITR的AAV载体pAAV2neo（DongX, et al. PLoS ONE. 2010;5(10):e13479.）。ITR，invertedterminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。

图2pscAAV-CAM载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的ITR，抑制AAV包装过程中ITR序列的切割，提高包装得到病毒携带自身互补的双链基因组的概率。CAM，人工设计的启动子，由人巨细胞病毒增强子、鸡β-actin启动子和小鼠细小病毒内含子（minute virus of mice，mvm）拼接而成，序列信息见SEQ ID NO.1。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。

图3 pscAAV-CAM-C3载体结构示意图ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的ITR，抑制AAV包装过程中ITR序列的切割，提高包装得到病毒携带自身互补的双链基因组的概率。CAM，人工设计的启动子，由人巨细胞病毒增强子、鸡β-actin启动子和小鼠细小病毒内含子（minute virus of mice，mvm）拼接而成，序列信息见SEQ ID NO.1。C3，人源密码子表达优化合成的肉毒梭状芽孢杆菌C3基因的编码区序列，序列信息见SEQ ID NO.2。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。

图4 pscAAV-CAM-EGFP载体结构示意图ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的ITR，抑制AAV包装过程中ITR序列的切割，提高包装得到病毒携带自身互补的双链基因组的概率。CAM，人工设计的启动子，由人巨细胞病毒增强子、鸡β-actin启动子和小鼠细小病毒内含子（minute virus of mice，mvm）拼接而成，序列信息见SEQ ID NO.1。EGFP，增强型绿色荧光蛋白编码序列，序列信息见SEQ IDNO.3。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。

图5 pscAAV-CAM-Gluc载体结构示意图ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的ITR，抑制AAV包装过程中ITR序列的切割，提高包装得到病毒携带自身互补的双链基因组的概率。CAM，人工设计的启动子，由人巨细胞病毒增强子、鸡β-actin启动子和小鼠细小病毒内含子（minute virus of mice，mvm）拼接而成，序列信息见SEQ ID NO.1。Gluc，一种分泌型荧光素酶编码序列，来源于Gaussia，序列信息见SEQ ID NO.4。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。

图6 pscAAV-CH3L1-Gluc载体结构示意图ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的ITR，抑制AAV包装过程中ITR序列的切割，提高包装得到病毒携带自身互补的双链基因组的概率。CH3L1，人chitinase3-like1基因的启动子，序列信息见SEQ ID NO.5。Gluc，一种分泌型荧光素酶编码序列，来源于Gaussia，序列信息见SEQIDNO.4。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。

图7 pscAAV-CH3L1-C3载体结构示意图ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的ITR，抑制AAV包装过程中ITR序列的切割，提高包装得到病毒携带自身互补的双链基因组的概率。CH3L1，人chitinase3-like1基因的启动子，序列信息见SEQ ID NO.5。C3，人源密码子表达优化合成的肉毒梭状芽孢杆菌C3基因的编码区序列，序列信息见SEQ ID NO.2。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。

图8pscAAV-MGP-Gluc载体结构示意图ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的ITR，抑制AAV包装过程中ITR序列的切割，提高包装得到病毒携带自身互补的双链基因组的概率。MGP，人基质胶质蛋白（matrixGlaprotein，MGP）基因的启动子，序列信息见SEQ ID NO.6。Gluc，一种分泌型荧光素酶编码序列，来源于Gaussia，序列信息见SEQ ID NO.4。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。

图9 pscAAV-MGP-C3载体结构示意图ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的ITR，抑制AAV包装过程中ITR序列的切割，提高包装得到病毒携带自身互补的双链基因组的概率。MGP，人基质胶质蛋白（matrix Glaprotein，MGP）基因的启动子，序列信息见SEQ ID NO.6。C3，人源密码子表达优化合成的肉毒梭状芽孢杆菌C3基因的编码区序列，序列信息见SEQ ID NO.2。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。

图10AAV病毒转导HTM细胞后肌动蛋白组织结构变化。原代培养的人小梁网细胞（human trabecular meshwork cell，HTMC）以5×10⁵cells/孔的密度接种6孔板。培养过夜后，AAV病毒以1×10⁵vg/cell的剂量感染HTM细胞，scAAV2-EGFP和scAAV2-C3病毒分别各感染3个细胞培养孔。设置未感染病毒的空白细胞对照。病毒感染48h后，倒置光学显微镜（IX71，Olympus，Tokyo，Japan）下观察细胞形态变化。用罗丹明标记的鬼笔环肽（rhodamine-phalloidin）检测细胞中肌动蛋白，检测到的肌动蛋白在荧光显微镜下显示为红色。用DAPI检测细胞核，检测到的细胞核在荧光显微镜下显示为蓝色。荧光显微镜下观察细胞中肌动蛋白和细胞核情况。Mock，表示图中该标记下纵向细胞为不感染病毒的空白细胞；scAAV2-EGFP，表示图中该标记下纵向细胞为感染scAAV2-EGFP病毒细胞；scAAV2-C3，表示图中该标记下纵向细胞为感染scAAV2-C3病毒细胞。Bright，表示图中该标记下横向细胞为白光观察倒置显微镜检测结果；Actin，表示图中该标记下横向细胞为荧光显微镜检测的肌动蛋白和细胞核结果。图中黑色比例尺长度为100μm，白色比例尺长度为50μm。

图11注射病毒小鼠眼前节中绿色荧光表达检测结果scAAV2-EGFP病毒和scAAV2-C3病毒分别经颞侧前房以1×10⁹vg的剂量注射C57BL/6J小鼠，共注射3只小鼠。同一只实验小鼠，scAAV2-EGFP注射左眼，scAAV2-C3病毒注射右眼。注射病毒14d后，用小动物视网膜影像系统（Micron IV Retinal Imaging Microscope，Phoenix Research labs）观察小鼠眼前节中绿色荧光蛋白表达情况。scAAV2-EGFP，表示图中该标记下横向图片为注射scAAV2-EGFP病毒小鼠眼前节检测结果；scAAV2-C3，表示图中该标记下横向图片为注射scAAV2-C3病毒小鼠眼前节检测结果。Bright，表示图中该标记下纵向图片为白光下观察结果。EGFP，表示图中该标记下纵向图片为荧光显微镜检测绿色荧光蛋白结果。

图12鼻侧、颞侧和前侧观察注射病毒小鼠眼前节中绿色荧光蛋白表达结果scAAV2-EGFP病毒经颞侧前房以1×10⁹vg的剂量注射C57BL/6J小鼠。注射病毒14d后，用小动物视网膜影像系统（Micron IV Retinal Imaging Microscope，Phoenix Researchlabs），从颞侧、前侧和鼻侧等3个方向观察小鼠眼前节中绿色荧光蛋白表达情况。scAAV2-EGFP（OS），表示图中该标记下横向图片为左眼注射scAAV2-EGFP病毒小鼠眼前节检测结果。Bright，表示图中该标记下横向图片为白光下观察结果。EGFP，表示图中该标记下横向图片为荧光检测绿色荧光蛋白结果。Nasal，表示图中该标记下纵向图片为鼻侧方向观察小鼠眼前节中绿色荧光蛋白表达情况。Anterier，表示图中该标记下纵向图片为前侧方向观察小鼠眼前节中绿色荧光蛋白表达情况。Temporal，表示图中该标记下纵向图片为颞侧方向观察小鼠眼前节中绿色荧光蛋白表达情况。TM，表示小梁网。

图13注射病毒小鼠眼压变化结果 scAAV2-EGFP病毒和scAAV2-C3病毒分别经颞侧前房以1×10⁹vg的剂量注射C57BL/6J小鼠，共注射14只小鼠。同一只实验小鼠，scAAV2-EGFP病毒注射左眼，scAAV2-C3病毒注射右眼。其中一只小鼠右眼注射scAAV2-C3病毒失败。故scAAV2-EGFP病毒注射了14只小鼠的左眼，scAAV2-C3病毒注射了13只小鼠的右眼。同时设置8只未注射病毒对照小鼠。注射病毒7d后，用TonoLab回弹式眼压计检测小鼠眼球眼压。用T检验进行了注射不同病毒小鼠眼球眼压的统计学分析，P小于0.05具有统计学意义。scAAV2-EGFP表示注射scAAV2-EGFP病毒的小鼠眼球；scAAV2-C3表示注射scAAV2-C3病毒的小鼠眼球；Control表示未注射病毒的小鼠眼球。n表示注射病毒或未注射病毒的小鼠眼球数。***，P小于0.001。IOP，intraocular pressure，眼压。mmHg，眼压单位，毫米汞柱。

图14注射病毒猴子眼前节中绿色荧光蛋白表达检测结果 scAAV2-EGFP病毒和scAAV2-C3病毒分别经颞侧前房以2.5×10¹⁰vg的剂量注射恒河猴，共注射5只恒河猴，分别编号为346、352、368、285和309。同一只实验恒河猴，scAAV2-EGFP注射左眼，scAAV2-C3病毒注射右眼。注射scAAV2-EGFP病毒3d、35d和70d后，用小动物视网膜影像系统（Micron IVRetinal Imaging Microscope，Phoenix Researchlabs）观察恒河猴眼前节中绿色荧光蛋白表达情况。注射scAAV2-C3病毒70d后，用小动物视网膜影像系统（Micron IV RetinalImaging Microscope，Phoenix Researchlabs）观察恒河猴眼前节中绿色荧光蛋白表达情况。scAAV2-EGFP，表示图中该标记下横向图片为注射scAAV2-EGFP病毒恒河猴眼前节检测结果；scAAV2-C3，表示图中该标记下横向图片为注射scAAV2-C3病毒恒河猴眼前节检测结果。Day3，表示图中该标记下横向图片为注射病毒3天后的观察结果。Day35，表示图中该标记下横向图片为注射病毒35天后的观察结果。Day70，表示图中该标记下横向图片为注射病毒70天后的观察结果。346、352、368、285和309，表示恒河猴编号，每个编号下纵向图片为该编号恒河猴眼前节观察结果。Cornea EGFP，表示图中该标记下纵向图片为放大的角膜中EGFP表达检测结果。

图15眼前节颞侧观察注射病毒猴子角膜和虹膜中绿色荧光蛋白表达结果scAAV2-EGFP病毒经颞侧前房以2.5×10¹⁰vg的剂量注射恒河猴。注射scAAV2-EGFP病毒35d后，用小动物视网膜影像系统（Micron IV Retinal Imaging Microscope，PhoenixResearch labs）观察恒河猴眼前节中绿色荧光蛋白表达情况。Bright，表示图中该标记下横向图片为白光下观察结果。EGFP，表示图中该标记下横向图片为荧光检测绿色荧光蛋白结果。Cornea，表示图中该标记下纵向图片为角膜中EGFP表达检测结果。Iris，表示图中该标记下纵向图片为虹膜中EGFP表达检测结果。

图16注射病毒恒河猴眼压变化结果scAAV2-EGFP病毒和scAAV2-C3病毒分别经颞侧前房以2.5×10¹⁰vg的剂量注射恒河猴，共注射5只恒河猴。同一只实验恒河猴，scAAV2-EGFP病毒注射左眼，scAAV2-C3病毒注射右眼。注射病毒前以及注射病毒后不同时间点（注射病毒3d、7d、14d、21d、35d、49d、63d、77d、91d、105d、119d、133d、147d、161d和175d后），用TonoLab回弹式眼压计检测恒河猴眼球眼压。scAAV2-EGFP表示注射scAAV2-EGFP病毒的恒河猴眼球；scAAV2-C3表示注射scAAV2-C3病毒的恒河猴眼球。IOP，intraocular pressure，眼压。mmHg，眼压单位，毫米汞柱。

图17编号368恒河猴注射病毒后眼压变化结果scAAV2-EGFP病毒和scAAV2-C3病毒分别经颞侧前房以2.5×10¹⁰vg的剂量注射编号为368恒河猴。scAAV2-EGFP病毒注射左眼，scAAV2-C3病毒注射右眼。注射病毒前以及注射病毒后不同时间点（注射病毒3d、7d、14d、21d、35d、49d、63d、77d、91d、105d、119d、133d、147d、161d、175d和217d后），用TonoLab回弹式眼压计检测恒河猴眼球眼压。scAAV2-EGFP表示注射scAAV2-EGFP病毒的眼球；scAAV2-C3表示注射scAAV2-C3病毒的眼球。IOP，intraocular pressure，眼压。mmHg，眼压单位，毫米汞柱。

图18编号309恒河猴注射病毒后眼压变化结果scAAV2-EGFP病毒和scAAV2-C3病毒分别经颞侧前房以2.5×10¹⁰vg的剂量注射编号为309恒河猴。scAAV2-EGFP病毒注射左眼，scAAV2-C3病毒注射右眼。注射病毒前以及注射病毒后不同时间点（注射病毒3d、7d、14d、21d、35d、49d、63d、77d、91d、105d、119d、133d、147d、161d、175d和217d后），用TonoLab回弹式眼压计检测恒河猴眼球眼压。scAAV2-EGFP表示注射scAAV2-EGFP病毒的眼球；scAAV2-C3表示注射scAAV2-C3病毒的眼球。IOP，intraocular pressure，眼压。mmHg，眼压单位，毫米汞柱。

图19注射病毒后恒河猴小梁网结构变化scAAV2-EGFP病毒和scAAV2-C3病毒分别经颞侧前房以2.5×10¹⁰vg的剂量注射恒河猴。scAAV2-EGFP病毒注射左眼，scAAV2-C3病毒注射右眼。注射病毒175d后，处死恒河猴，取出眼球，4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋。切片，用苏木素/伊红染色后观察小梁网结构变化。scAAV2-EGFP表示注射scAAV2-EGFP病毒的眼球；scAAV2-C3表示注射scAAV2-C3病毒的眼球。SC，Schlemm管。

图20注射病毒后恒河猴角膜内皮细胞形态变化scAAV2-EGFP病毒和scAAV2-C3病毒分别经颞侧前房以2.5×10¹⁰vg的剂量注射恒河猴。scAAV2-EGFP病毒注射左眼，scAAV2-C3病毒注射右眼。注射病毒175d后，处死恒河猴，取出眼球，固定液（1.25％甲醛、2.5％戊二醛，0.03%三硝基酚，0.03%CaCl2配入0.05M的二甲基胂酸盐缓冲液中，pH7.3）中固定，包埋于环氧树脂中。切片，厚度为70埃。用醋酸盐铀及柠檬酸铅染色后，透射电镜下观察角膜内皮细胞形态。scAAV2-EGFP表示注射scAAV2-EGFP病毒的眼球；scAAV2-C3表示注射scAAV2-C3病毒的眼球。

图21不同启动子体外转导细胞表达特性比较结果原代培养的人小梁网细胞（human trabecular meshwork cell，HTMC）、人角膜内皮细胞（human cornea endothelialcell，HCEC）和Schlemm管细胞（SC）以1×10⁵cells/孔的密度接种24孔板，每种细胞各接种9孔细胞。培养过夜后，AAV病毒（scAAV2-CAM-Gluc、scAAV2-CH3L1-Gluc或scAAV2-MGP-Gluc）分别以1×10⁵vg/cell的剂量感染3种细胞，每种病毒每种细胞感染3个复孔。病毒感染48h后，取细胞培养上清，检测培养上清中Gluc活性。CAM，表示scAAV2-CAM-Gluc病毒；CH3L1，表示scAAV2-CH3L1-Gluc病毒；MGP，表示scAAV2-MGP-Gluc病毒。CEC，表示人角膜内皮细胞；TMC，表示人小梁网细胞；SC，表示人Schlemm管细胞。RLU，relative light unit，相对光强度单位。

图22启动子对恒河猴眼压降低效果研究scAAV2-EGFP病毒、scAAV2-C3病毒、scAAV2-CH3L1-C3病毒或scAAV2-MGP-C3病毒分别经颞侧前房以2.5×10¹⁰vg的剂量注射恒河猴，其中scAAV2-EGFP病毒注射9只恒河猴，scAAV2-C3病毒、scAAV2-CH3L1-C3病毒或scAAV2-MGP-C3病毒各注射3只恒河猴。scAAV2-EGFP病毒和scAAV2-C3病毒、scAAV2-CH3L1-C3病毒或scAAV2-MGP-C3病毒分别注射同一只恒河猴的左右眼，scAAV2-EGFP病毒注射左眼，scAAV2-C3病毒注射右眼。注射病毒前以及注射病毒后不同时间点（注射病毒3d、7d、14d、21d、28d、42d、56d、84d、112d、168d、224d后），用TonoLab回弹式眼压计检测恒河猴眼球眼压。scAAV2-EGFP表示注射scAAV2-EGFP病毒的眼球；scAAV2-C3表示注射scAAV2-C3病毒的眼球；scAAV2-CH3L1-C3表示注射scAAV2-CH3L1-C3病毒的眼球；scAAV2-MGP-C3表示注射scAAV2-MGP-C3病毒的眼球。IOP，intraocular pressure，眼压。mmHg，眼压单位，毫米汞柱。

具体实施方式

本发明公开了青光眼的基因治疗药物，包含药物的设计、小量制备及功能验证，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1质粒载体构建

构建本发明实施例中需要用到的AAV载体质粒（pscAAV-CAM-C3（图3）、pscAAV-CAM-EGFP（图4）、pscAAV-CAM-Gluc（图5）、pscAAV-CH3L1-Gluc（图6）、pscAAV-CH3L1-C3（图7）、pscAAV-MGP-Gluc（图8）、pscAAV-MGP-C3（图9）），用于包装制备获得需要的重组AAV病毒。这些质粒载体都是在pscAAV-CAM载体（图2）的基础上构建而来，pscAAV-CAM载体的前体质粒是公司保存的pAAV2neo（图1）。

（一）pscAAV-CAM载体构建

为了构建双链AAV载体，我们首先以pAAV2neo为基础，构建通用的pscAAV-CAM质粒。构建过程如下，以AAV2基因组（GenBank No.AF043303）中的3’端ITR序列为基础，根据文献报道删除ITR序列中的trs序列和D序列（Wang Z,et al. Gene Ther. 2003;10:2105-2111.），得到ΔITR序列（SEQ ID No.7）。为了便于克隆操作，将pAAV2neo载体中1392-2127bp之间序列（靠近BGH polyA的ITR和SwaI酶切位点之间序列）同ΔITR序列融合，得到融合序列ΔITR-BS（SEQ ID No.8）。在ΔITR-BS融合序列两端分别添加BamHI和SwaI酶切位点后，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57 simple载体，获得pUC57-ΔITR-BS。BamHI和SwaI双酶切分别消化pUC57-ΔITR-BS载体和pAAV2neo载体，回收ΔITR-BS片段以及切去ITR序列的pAAV2neo载体片段。将回收ΔITR-BS片段同切去ITR序列的pAAV2neo载体片段连接，转化E.coliJM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定获得pscAAV2neo载体。将人巨细胞病毒早期基因增强子序列、鸡β-actin启动子序列和小鼠细小病毒内含子序列拼接，得到CAM启动子序列，序列信息见SEQIDNo.1。在CAM启动子序列的两端分别添加XhoI和KpnI酶切位点。添加酶切位点后序列由金斯瑞生物科技有限公司合成，合成序列克隆入金斯瑞生物科技有限公司的pUC57 simple载体（金斯瑞生物科技，南京），得到pUC57-CAM。用XhoI和KpnI分别双酶切消化pUC57-CAM载体和pAAV2neo载体，回收CAM片段和切去CMV启动子的pscAAV2neo载体片段（约6.3kb），两片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有CAM启动子的AAV质粒载体pscAAV-CAM（图2）。

（二）pscAAV-CAM-C3、pscAAV-CAM-EGFP和pscAAV-CAM-Gluc载体构建

接下来，我们以构建获得的pscAAV-CAM（图2）为基础，构建pscAAV-CAM-C3（图3）、pscAAV-CAM-EGFP（图4）、pscAAV-CAM-Gluc（图5）载体。在NCBI蛋白数据库中（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）搜索得到肉毒梭状芽胞杆菌C3蛋白氨基酸序列信息（GenBank:CAA35828.1），详见SEQ ID NO.9。根据C3蛋白氨基酸序列（SEQ ID NO.9），经南京金斯瑞生物科技有限公司进行人源表达优化合成。在合成序列的5’端添加Kozak序列“5’gccacc3’”，3’端添加终止密码子“5’TGATAA3’”，并在Kozak序列的5’端添加KpnI酶切位点“5’GGTACC3’”，在终止密码子的3’端添加BglII酶切位点“5’AGATCT3’”。添加完Kozak序列、终止密码子序列和酶切位点序列的完整序列命名为C3-KB，序列信息详见SEQ IN NO.10，送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成序列克隆入pUC57 simple载体（金斯瑞生物科技，南京），得到pUC57-C3。用KpnI和BglII分别双酶切消化pUC57-C3-KB载体和pscAAV-CAM载体，回收C3-KB片段和线性化的pscAAV-CAM载体片段（约6.7kb），两片段连接后转化E.coliJM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有C3基因编码区的AAV质粒载体pscAAV-CAM-C3（图3）。

以pCMV-N-EGFP质粒(碧云天生物技术，中国)为模板，设计合成EGFP-F（SEQ IDNO.11）、EGFP-R(SEQ ID NO.12)两条引物，并在EGFP-F引物的5’端引入KpnI酶切位点，在EGFP-R引物的5’端引入BglII酶切位点。利用合成的EGFP-F和EGFP-R引物，以pCMV-N-EGFP质粒为模板，PCR扩增得到含有EGFP编码序列片段，长度约为0.7kb。用KpnI和BglII分别双酶切消化PCR扩增得到EGFP片段和pscAAV-CAM载体，回收EGFP片段和线性化的pscAAV-CAM载体片段（约6.7kb），两片段连接后转化E.coliJM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有EGFP基因编码区的AAV质粒载体pscAAV-CAM-EGFP（图4）。

5’ataggtaccgccaccatggtgagcaagggcgag3’EGFP-F（SEQ ID NO.11）

5’cgcagatctttacttgtacagctcgtc3’ EGFP-R (SEQ ID NO.12)

以pCMV-Gluc2质粒(NEB，美国)为模板，设计合成Gluc-F（SEQ ID NO.13）、Gluc-R(SEQ ID NO.14)两条引物，并在Gluc-F引物的5’端引入KpnI酶切位点，在Gluc-R引物的5’端引入BglII酶切位点。利用合成的Gluc-F和Gluc-R引物，以pCMV-Gluc2质粒为模板，PCR扩增得到含有Gluc编码序列片段，长度约为0.6kb。用KpnI和BglII分别双酶切消化PCR扩增得到Gluc片段和pscAAV-CAM载体，回收Gluc片段和线性化的pscAAV-CAM载体片段（约6.7kb），两片段连接后转化E.coliJM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有Gluc基因编码区的AAV质粒载体pscAAV-CAM-Gluc（图5）。

5’ataggtaccgccaccatgggagtcaaagttctg3’Gluc-F（SEQ ID NO.13）

5’cgcagatctttagtcaccaccggcccc3’ Gluc-R (SEQ ID NO.14)

（三）pscAAV-CH3L1-Gluc和pscAAV-CH3L1-C3载体构建

根据文献（IOVS. 2005;46(1):183-190.）选择小梁网细胞中特异性高表达的Ch3L1基因启动子作为候选启动子，参考序列（GenBank ID：NG_013056.1）确定启动子序列信息，具体见SEQ ID NO.5。在序列SEQ ID NO.5的5’端添加XhoI酶切位点“5’-ctcgag-3’”，在序列SEQ ID NO.5的3’末端加入mvm内含子序列。Mvm内含子序列为：5’ aggtaagttggcgccgtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattaccttttttacaggc3’。在Mvm内含子序列的3’末端添加KpnI酶切位点“5’-ggtacc-3’”。设计合成的序列命名为Ch3L1-XK，序列信息详见SEQ ID NO.15。将序列SEQ ID NO.15送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成序列克隆入pUC57 simple载体（金斯瑞生物科技，南京），得到pUC57-CH3L1。用XhoI和KpnI分别双酶切消化pUC57-CH3L1载体、pscAAV-CAM-Gluc载体和pscAAV-CAM-C3载体，回收CH3L1片段、切去CAM启动子的pscAAV-CAM-Gluc载体和pscAAV-CAM-C3载体，其中切去CAM启动子的pscAAV-CAM-Gluc载体大小约为6.7kb，切去CAM启动子的pscAAV-CAM-C3载体大小约为6.8kb。将CH3L1片段分别同切去CAM启动子的pscAAV-CAM-Gluc载体或切去CAM启动子的pscAAV-CAM-C3载体连接，连接产物转化E.coliJM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有Gluc基因编码区的AAV质粒载体pscAAV-CH3L1-Gluc（图6）和含有C3基因编码区的AAV质粒载体pscAAV-CH3L1-C3（图7）。

(四)pscAAV-MGP-Gluc和pscAAV-MGP-C3载体构建

根据文献（Gonzalez P, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004;45(5):1389-95.）选择小梁网细胞中特异性高表达的人基质胶质蛋白（matrix Gla protein，MGP）基因启动子作为候选启动子，参考序列（GenBank ID：AF067167）确定启动子序列信息，具体见SEQ ID NO.6。在序列SEQ ID NO.6的5’端添加XhoI酶切位点“5’-ctcgag-3’”，在序列SEQID NO.6的3’末端加入KpnI酶切位点“5’-ggtacc-3’”。设计合成的序列命名为MGP-XK，序列信息详见SEQ ID NO.16。将序列SEQ ID NO.16送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成序列克隆入pUC57 simple载体（金斯瑞生物科技，南京），得到pUC57-MGP。用XhoI和KpnI分别双酶切消化pUC57-MGP载体、pscAAV-CAM-Gluc载体和pscAAV-CAM-C3载体，回收MGP片段、切去CAM启动子的pscAAV-CAM-Gluc载体和pscAAV-CAM-C3载体，其中切去CAM启动子的pscAAV-CAM-Gluc载体大小约为6.7kb，切去CAM启动子的pscAAV-CAM-C3载体大小约为6.8kb。将MGP片段分别同切去CAM启动子的pscAAV-CAM-Gluc载体或切去CAM启动子的pscAAV-CAM-C3载体连接，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有Gluc基因编码区的AAV质粒载体pscAAV-MGP-Gluc（图8）和含有C3基因编码区的AAV质粒载体pscAAV-MGP-C3（图9）。

实施例2重组AAV病毒制备及检定

参照文献（XiaoX,etal.JVirol.1998;72(3):2224-2232.），应用三质粒包装系统包装重组AAV病毒，采用氯化铯密度梯度离心法分离纯化包装得到AAV病毒。简要地，AAV载体质粒（pscAAV-CAM-C3、pscAAV-CAM-EGFP、pscAAV-CAM-Gluc、pscAAV-CH3L1-C3、pscAAV-CH3L1-Gluc、pscAAV-MGP-C3或pscAAV-MGP-Gluc）、辅助质粒（pHelper）和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒（pAAV-R2C2）按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到scAAV2-C3、scAAV2-EGFP、scAAV2-CAM-Gluc、scAAV2-CH3L1-C3、scAAV2-CH3L1-Gluc、scAAV2-MGP-C3、scAAV2-MGP-Gluc等7种重组病毒。其中scAAV2-C3由pscAAV-CAM-C3包装制备而来，scAAV2-EGFP由pscAAV-CAM-EGFP包装制备而来，scAAV2-CAM-Gluc由pscAAV-CAM-Gluc包装制备而来，scAAV2-CH3L1-Gluc由pscAAV-CH3L1-Gluc包装制备而来，scAAV2-CH3L1-C3由pscAAV-CH3L1-C3包装制备而来，scAAV2-MGP-Gluc由pscAAV-MGP-Gluc包装制备而来，scAAV2-MGP-C3由pscAAV-MGP-C3包装制备而来。

采用定量PCR方法测定制备得到AAV病毒的基因组滴度。其中，scAAV2-C3、scAAV2-EGFP、scAAV2-CAM-Gluc等3种病毒定量PCR检测时采用针对 CAM启动子的引物和探针。scAAV2-CH3L1-C3和scAAV2-CH3L1-Gluc病毒采用针对CH3L1启动子序列的引物和探针。scAAV2-MGP-C3和scAAV2-MGP-Gluc病毒采用针对MGP启动子序列的引物和探针。

以scAAV2-C3、scAAV2-EGFP、scAAV2-CAM-Gluc等3种病毒的定量PCR检测过程为例，示意操作过程。其他病毒的检测过程类似，只需要替换对应的检测引物、探针和质粒DNA标准品即可。具体过程如下：

针对CAM启动子序列设计定量PCR检测用引物和探针：

CAM-Q-F：5’-ACGCCAATAGGGACTTTCCA-3’(SEQIDNO.17)

CAM-Q-R：5’-AGTCCCATAAGGTCATGTACTGG-3’(SEQIDNO.18)

CAM-Q-P：5’-ACGGTAAATGGCCCGCCTGGCA-3’(SEQIDNO.19)

CAM-Q-F和CAM-Q-R为引物，CAM-Q-P为探针。探针5’端用FAM荧光蛋白标记，3’端连接BlackBerryquencher。引物和探针由ThermofisherScientific合成。以CAM-Q-F和CAM-Q-R为引物特异性地扩增CAM启动子序列中长度为166bp片段，采用TaqMan探针结合法，以10⁸拷贝数/μl的pscAAV-CMV-EGFP质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用PremixExTaq(ProbeqPCR)试剂（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI7500fast，ABI）检测病毒基因组滴度。操作过程参见PremixExTaq(ProbeqPCR)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献（AurnhammerC,etal.HumGeneTherMethods.2012;23(1):18-28.）。

scAAV2-CH3L1-C3和scAAV2-CH3L1-Gluc病毒定量PCR检测的标准品为10⁸拷贝数/μl的pscAAV-CH3L1-Gluc质粒及其10倍梯度稀释的样品。针对CH3L1启动子序列的定量PCR检测引物和探针：

CH3L1-Q-F：5’-CCTTACCCAGCCTGAAGACA-3’(SEQIDNO.20)

CH3L1-Q-R：5’-CCACAGTGCCCTAAACAAGG-3’(SEQIDNO.21)

CH3L1-Q-P：5’-CCCAGGCTCAGCATTGCCCTGC-3’(SEQIDNO.22)

CH3L1-Q-F和CH3L1-Q-R为引物，CH3L1-Q-P为探针。探针5’端用FAM荧光蛋白标记，3’端连接Black Berry quencher。引物和探针由Thermo fisher Scientific合成。定量PCR检测时扩增片段大小为110bp。

scAAV2-MGP-C3和scAAV2-MGP-Gluc病毒定量PCR检测的标准品为10⁸拷贝数/μl的pscAAV-MGP-Gluc质粒及其10倍梯度稀释的样品。针对MGP启动子序列的定量PCR检测引物和探针：

MGP-Q-F：5’-GCTCTGTCTGTGGACCAAAC-3’(SEQIDNO.23)

MGP-Q-R：5’-TTCCCTAACTGCTGGACCTG-3’(SEQIDNO.23)

MGP-Q-P：5’-TCCTGGCCCTGACCGCAGGC-3’(SEQIDNO.25)

MGP-Q-F和MGP-Q-R为引物，MGP-Q-P为探针。探针5’端用FAM荧光蛋白标记，3’端连接Black Berry quencher。引物和探针由Thermo fisher Scientific合成。定量PCR检测时扩增片段大小为178bp。

实施例3scAAV2-C3病毒体内外评价实验

为了验证scAAV2-C3病毒能否有效地转导小梁网细胞，表达产生C3蛋白，降低细胞内肌动蛋白的稳定性，改变小梁网细胞的形态结构，增加小梁网的通透性，有利于房水排出，降低眼压，从而达到治疗青光眼的目的，我们设计了一系列实验。首先我们以scAAV2-EGFP为对照，将scAAV2-C3病毒转导原代培养的人小梁网细胞，观察细胞形态和肌动蛋白变化情况，以验证scAAV2-C3病毒转导小梁网细胞后能否发挥作用。接下来，我们将scAAV2-C3病毒经前房注射至C57BL/6J小鼠眼球中，观察小鼠眼压降低情况。然后，以scAAV-EGFP为对照，将scAAV2-C3经前房注射至恒河猴眼球中，不同时间点观察恒河猴眼压降低情况，记录scAAV2-C3病毒注射可能带来的副作用。

（一）scAAV2-C3病毒转导HTMC病毒后肌动蛋白组织结构变化

原代人小梁网细胞（human trabecular meshwork cell，HTMC）来源于ScienCellResearch Laboratories（Carlsbad, CA, USA; 细节见网站http://www.sciencellonline.com ），参照文献培养（Tan J, et al. Invest Ophthalmol VisSci. 2018;59(12):4937-4944.）。将HTMC以5×10⁵cells/孔的密度接种6孔板。培养过夜后，AAV病毒以1×10⁵vg/cell的剂量感染HTM细胞，scAAV2-EGFP和scAAV2-C3病毒分别各感染3个细胞培养孔。设置未感染病毒的空白细胞对照。病毒感染48h后，倒置光学显微镜（IX71，Olympus，Tokyo，Japan）下观察细胞形态变化。用罗丹明标记的鬼笔环肽（rhodamine-phalloidin）检测细胞中肌动蛋白，检测到的肌动蛋白在荧光显微镜下显示为红色。用DAPI检测细胞核，检测到的细胞核在荧光显微镜下显示为蓝色。荧光显微镜下观察细胞中肌动蛋白和细胞核情况。结果如图10所示。

从图10的结果可知，相比于未感染病毒的空白对照（Mock），感染scAAV2-EGFP病毒的HTMC细胞形态未见明显变化，而感染scAAV2-C3病毒的HTMC形态则出现变圆、皱缩。进一步观察3种处理情况下细胞的细胞内肌动蛋白含量，结果显示，同未感染病毒的空表对照细胞相比，感染scAAV2-EGFP病毒细胞的细胞内肌动蛋白含量未见明显差异，但感染scAAV2-C3病毒细胞的细胞内肌动蛋白的含量却明显减少，提示C3蛋白可能通过减少细胞内肌动蛋白的数量来改变细胞的形态。

（二）scAAV2-C3病毒小鼠体内评价结果

scAAV2-EGFP病毒和scAAV2-C3病毒分别经颞侧前房以1×10⁹vg的剂量注射C57BL/6J小鼠，共注射3只小鼠。同一只实验小鼠，scAAV2-EGFP注射左眼，scAAV2-C3病毒注射右眼。注射病毒14d后，用小动物视网膜影像系统（Micron IV Retinal ImagingMicroscope，PhoenixResearchlabs）观察小鼠眼前节中绿色荧光蛋白表达情况。结果如图11所示。从图11的结果可知，注射scAAV2-EGFP病毒小鼠，在眼前节中观察到绿色荧光蛋白表达，而注射scAAV2-C3病毒小鼠，则未在眼前节中观察到绿色荧光蛋白表达。这是因为scAAV2-EGFP病毒的表达产物为绿色荧光蛋白，scAAV2-C3病毒的表达产物为C3蛋白，两者表达产物不一样。图11显示结果同预期一致。

接下来，小鼠注射scAAV2-EGFP病毒14d后，用小动物视网膜影像系统（Micron IVRetinal Imaging Microscope，Phoenix Researchlabs），从颞侧、前侧和鼻侧等3个方向观察小鼠眼前节中绿色荧光蛋白表达情况。选择代表性的结果进行展示，结果如图12所示。从图12的结果可知，从颞侧和鼻侧等2个方向观察到小鼠眼前节中存在绿色荧光蛋白表达，而前侧方向则未观察到绿色荧光蛋白表达。

最后，scAAV2-EGFP病毒和scAAV2-C3病毒分别经颞侧前房以1×10⁹vg的剂量注射C57BL/6J小鼠，共注射14只小鼠。同一只实验小鼠，scAAV2-EGFP病毒注射左眼，scAAV2-C3病毒注射右眼。其中一只小鼠右眼注射scAAV2-C3病毒失败。故scAAV2-EGFP病毒注射了14只小鼠的左眼，scAAV2-C3病毒注射了13只小鼠的右眼。同时设置8只未注射病毒对照小鼠。注射病毒7d后，用TonoLab回弹式眼压计（Icare，芬兰）检测小鼠眼球眼压。用T检验进行了注射不同病毒小鼠眼球眼压的统计学分析，P小于0.05具有统计学意义。结果见图13。从图13的结果可知，注射scAAV2-C3病毒眼球的眼压平均值明显低于注射scAAV2-EGFP病毒眼球的眼压平均值以及未注射病毒眼球的眼压平均值，且这种差异具有显著的统计学差异（P<0.001）。而注射scAAV2-EGFP病毒眼球的眼压平均值同未注射病毒眼球的眼压平均值之间未见明显差异。结果提示scAAV2-C3病毒注射小鼠眼球后能够有效地降低眼压。

（三）scAAV2-C3病毒恒河猴体内评价结果

scAAV2-EGFP病毒和scAAV2-C3病毒分别经颞侧前房以2.5×10¹⁰vg的剂量注射恒河猴，共注射5只恒河猴，分别编号为346、352、368、285和309。同一只实验恒河猴，scAAV2-EGFP注射左眼，scAAV2-C3病毒注射右眼。注射scAAV2-EGFP病毒3d、35d和70d后，用小动物视网膜影像系统（Micron IV Retinal Imaging Microscope，Phoenix Researchlabs）观察恒河猴眼前节中绿色荧光蛋白表达情况。注射scAAV2-C3病毒70d后，用小动物视网膜影像系统（Micron IV Retinal Imaging Microscope，Phoenix Researchlabs）观察恒河猴眼前节中绿色荧光蛋白表达情况。检测结果如图14所示。

从图14的结果可知，注射scAAV2-EGFP病毒3d后，编号为346、352、368、285和309等5只恒河猴眼前节中都未观察到绿色荧光蛋白表达，对编号309的恒河猴的角膜组织进行观察，也未检测到绿色荧光蛋白表达；注射scAAV2-EGFP病毒35d后，编号为346、352、368、285和309等5只恒河猴眼前节中都观察到绿色荧光蛋白表达，对编号309的恒河猴的角膜组织进行观察，也检测到绿色荧光蛋白表达；注射scAAV2-EGFP病毒70d后，呈现出同注射scAAV2-EGFP病毒35d后一致的结果，即，编号为346、352、368、285和309等5只恒河猴眼前节中都观察到绿色荧光蛋白表达，对编号309的恒河猴的角膜组织进行观察，也检测到绿色荧光蛋白表达。因为scAAV2-C3病毒不表达绿色荧光蛋白，所以注射70d后，编号为346、352、368、285和309等5只恒河猴眼前节中都观察到绿色荧光蛋白表达，对编号309的恒河猴的角膜组织进行观察，也检测到绿色荧光蛋白表达。结果说明scAAV2病毒经前房注射恒河猴后能够持续稳定地表达病毒携带基因。

同时，注射scAAV2-EGFP病毒35d后，用小动物视网膜影像系统（Micron IVRetinal Imaging Microscope，Phoenix Researchlabs），从眼前节颞侧观察了恒河猴角膜和虹膜中绿色荧光蛋白表达情况。选取代表结果进行展示，结果如图15所示。从图15的结果可知，注射scAAV2-EGFP病毒35d后，在恒河猴角膜和虹膜中都检测到绿色荧光蛋白的表达，且角膜中的表达水平强于虹膜。结果说明scAAV2-EGFP经前房注射恒河猴后，能够有效地转导角膜、虹膜等非小梁网结构组织。

在检测病毒注射后眼前节中绿色荧光蛋白表达情况的同时，我们还在不同的时间点（注射病毒0d、3d、7d、14d、21d、35d、49d、63d、77d、91d、105d、119d、133d、147d、161d和175d后），用TonoLab回弹式眼压计（Icare，芬兰）检测恒河猴眼球眼压。结果如图16所示。从图16的结果可知，在所有的检测时间点，注射scAAV2-C3病毒恒河猴眼球的眼压的平均值都低于注射scAAV2-EGFP病毒恒河猴眼球的眼压平均值，差异最大时达到3mmHg。结果说明scAAV2-C3病毒经前房注射能够有效地转导恒河猴眼前节，表达产生C3蛋白，增加房水排出，降低眼压。

随后，我们用裂隙灯显微镜（康华瑞明，重庆）进行眼前节检查，检查时间为注射病毒后7d、35d、63d、91d、119d、147d和175d。检查时主要观察角膜水肿情况，记录标准如下：+角膜水肿厚度增加；++ 角膜浑浊水肿，仍可见虹膜；+++ 角膜浑浊水肿，中央虹膜虹膜窥不见；++++ 整个角膜浑浊水肿，周边虹膜窥不见。结果表1所示。

表1 scAAV2-EGFP和scAAV2-C3注射恒河猴后眼球角膜水肿检测结果

*，恒河猴编号；**, 注射scAAV2-EGFP病毒眼球；***,注射scAAV2-C3病毒眼球。

从表1的结果可知，注射scAAV2-EGFP病毒的恒河猴眼球，除了编号285号恒河猴在注射病毒35d后观察到轻微的角膜水肿外，其余恒河猴在所有的检测时间点都未发现角膜水肿。相反，注射scAAV2-C3病毒的恒河猴眼球，除了编号368号恒河猴在注射病毒35d后观察到轻微角膜水肿，然后自行恢复，未观察到角膜水肿外，其余恒河猴都在注射病毒7d后开始观察到角膜水肿，且在整个观察阶段都检查到角膜水肿。编号285、346和352号恒河猴尤为严重，都随着注射病毒后时间的增加，角膜水肿日益严重，达到“++++”最高级别。而编号309号恒河猴眼球的角膜水肿维持在“+”或“++”级别，角膜水肿较轻。

接下来，我们单独分析了未观察到角膜水肿的编号为368恒河猴眼球的眼压变化趋势。结果如图17所示。从图17的结果可知，注射scAAV2-C3病毒3d后，即检测到眼压下降。截止注射病毒217d后的数据，注射病毒3d后的所有检测时间点注射scAAV2-C3病毒眼球的眼压都低于注射scAAV2-EGFP病毒眼球的眼压，且两者之间的眼压差值保持在2mmHg-6mmHg之间。目前仍在监测之中。结果说明，对于368号恒河猴，scAAV2-C3病毒能够有效持续地降低其眼球眼压且作用时间长。

我们进一步单独分析了观察到轻度角膜水肿的编号为309恒河猴眼球的眼压变化趋势。结果如图18所示。从图18的结果可知，同编号为368恒河猴一样，注射scAAV2-C3病毒3d后，即检测到眼压下降。而且截止注射病毒217d后的数据，注射病毒3d后的所有检测时间点注射scAAV2-C3病毒眼球的眼压也都低于注射scAAV2-EGFP病毒眼球的眼压，但两者之间的眼压差值小于编号为368恒河猴，保持在1mmHg-6mmHg之间。目前编号为309恒河猴的眼球眼压也仍在监测之中。

在观察到眼球眼压降低的基础上，我们再注射病毒175d后，处死了眼压降低不再明显的编号为285、346和352等3只恒河猴。取出眼球。其中编号285恒河猴眼球用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。切片，用苏木素/伊红染色后光学显微镜下观察小梁网结构变化。编号346恒河猴眼球用固定液（1.25％甲醛、2.5％戊二醛，0.03%三硝基酚，0.03%CaCl2配入0.05M的二甲基胂酸盐缓冲液中，pH7.3）固定，包埋于环氧树脂中。切片，厚度为70埃。用醋酸盐铀及柠檬酸铅染色后，透射电镜下观察角膜内皮细胞形态。编号352号恒河猴眼球保存备用。

小梁网结构变化结果如图19所示。从图19的结果可知，相比于注射scAAV2-EGFP病毒的眼球小梁网组织细胞，注射scAAV2-C3病毒的眼球小梁网组织细胞的细胞间隙增大，小梁网组织通透性增加，有助于房水的排出。提示scAAV2-C3病毒表达C3蛋白，改变小梁网细胞形态是其能够降低眼压的结构基础。

角膜内皮细胞形态结果如图20所示。从图20的结果可知，相比于注射scAAV2-EGFP病毒的眼球角膜内皮细胞，注射scAAV2-C3病毒的眼球角膜内皮细胞的形态发生明显变化，主要体现在细胞变得皱缩，细胞体积变小，角膜内皮层变薄，提示scAAV2-C3病毒在角膜内皮细胞中表达产生C3蛋白可能对细胞带来损伤，可能是引起角膜水肿的重要原因之一。

实施例4、启动子对基因药物治疗青光眼效果评价实验

scAAV2-C3病毒经前房注射至恒河猴眼球后会转导角膜内皮细胞，表达产生C3蛋白，改变角膜内皮细胞的形态，引起角膜水肿，显著降低了C3蛋白带来的眼球眼压降低效果。因此有必要抑制C3蛋白在角膜内皮细胞中表达，且不改变C3蛋白在小梁网细胞中的表达水平。本发明中，我们选择了小梁网细胞特异性的启动子来调控C3蛋白的表达，让C3蛋白特异性地在小梁网细胞中表达，而在非小梁网细胞中不表达，从而达到更好的降低眼球眼压效果。

首选我们参考文献选择了两种小梁网细胞特异性的启动子，构建了这两种启动子调控的分泌型荧光素酶Gluc的AAV质粒载体，包装成重组AAV2病毒。详细过程见本发明说明书中实施例1和实施例2。以scAAV2-C3病毒采用的CAM启动子调控的scAAV2-CMA-Gluc病毒为对照，比较了小梁网细胞特异性启动子调控的Gluc报告基因病毒（scAAV2-CH3L1-Gluc或scAAV2-MGP-Gluc）在原代培养的人小梁网细胞（human trabecular meshwork cell，HTMC）、人角膜内皮细胞（human cornea endothelial cell，HCEC）和Schlemm管细胞（SC）中的表达水平，以验证小梁网细胞特异性启动子的功能。

接下来，我们以scAAV2-EGFP病毒为对照，将3种不同启动子调控的含有C3基因表达框的scAAV2病毒（scAAV2-C3病毒、scAAV2-CH3L1-C3病毒或scAAV2-MGP-C3病毒）经前房注射恒河猴眼球中，不同时间检测眼压变化和角膜水肿情况。

原代人小梁网细胞（human trabecular meshwork cell，HTMC）来源于ScienCellResearch Laboratories（Carlsbad, CA, USA; 细节见网站http://www.sciencellonline.com ），参照文献培养（Tan J,etal.InvestOphthalmol Vis Sci.2018;59(12):4937-4944.）。参照文献（Stamer WD, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci.1998;39:1804–1812.）分离培养Schlemm管细胞（SC）细胞。人角膜内皮细胞（human corneaendothelial cell，HCEC）来源和培养见文献（Gruenert A K , et al. PLoS ONE. 2016;11(3):e0152589.）。将原代培养的人小梁网细胞（human trabecular meshwork cell，HTMC）、原代培养的Schlemm管细胞（SC）以及人角膜内皮细胞（human cornea endothelialcell，HCEC）细胞系1×10⁵cells/孔的密度接种24孔板，每种细胞各接种9孔细胞。培养过夜后，AAV病毒（scAAV2-CAM-Gluc、scAAV2-CH3L1-Gluc或scAAV2-MGP-Gluc）分别以1×10⁵vg/cell的剂量感染3种细胞，每种病毒每种细胞感染3个复孔。病毒感染48h后，取细胞培养上清，用BioLuxGluc Assay Kit（NEB，美国）检测试剂盒在发光检测仪中测定培养上清中Gluc活性。检测结果如图21所示。

从图21的结果可知，在HTMC细胞中，3种病毒感染后都呈现出较高的Gluc表达活性，且无明显差异。相反在HCEC细胞和SC细胞中，scAAV2-CAM-Gluc病毒感染后的Gluc表达活性明显高于scAAV2-CH3L1-Gluc病毒或scAAV2-MGP-Gluc病毒感染后的Gluc表达活性。scAAV2-CH3L1-Gluc病毒或scAAV2-MGP-Gluc病毒感染HCEC细胞和SC细胞后的Gluc表达活性都低于1000RLU，接近本底水平，说明CH3L1启动子和MGP启动子在HCEC细胞和SC细胞中表达水平较低，特异性较好。

以scAAV2-EGFP病毒为对照，将scAAV2-C3病毒、scAAV2-CH3L1-C3病毒或scAAV2-MGP-C3病毒分别经颞侧前房以2.5×10¹⁰vg的剂量注射恒河猴，其中scAAV2-EGFP病毒注射9只恒河猴，scAAV2-C3病毒、scAAV2-CH3L1-C3病毒或scAAV2-MGP-C3病毒各注射3只恒河猴。9只恒河猴编号为401、421、429、436、451、462、478、489和497，随机分为3组。其中scAAV2-C3病毒注射编号为401、462和489等3只恒河猴；scAAV2-CH3L1-C3病毒注射编号为429、436和497等3只恒河猴；scAAV2-MGP-C3病毒注射编号为421、451和478等3只恒河猴。scAAV2-EGFP病毒和scAAV2-C3病毒、scAAV2-CH3L1-C3病毒或scAAV2-MGP-C3病毒分别注射同一只恒河猴的左右眼，scAAV2-EGFP病毒注射左眼，scAAV2-C3病毒、scAAV2-CH3L1-C3病毒或scAAV2-MGP-C3病毒注射右眼。注射病毒前以及注射病毒后不同时间点（注射病毒3d、7d、14d、21d、28d、42d、56d、84d、112d、168d、224d后），用TonoLab回弹式眼压计（Icare，芬兰）检测恒河猴眼球眼压。检测结果如图22所示。

从图22的结果可知，在所有的检测时间点，注射scAAV2-C3病毒、scAAV2-CH3L1-C3病毒或scAAV2-MGP-C3病毒恒河猴眼球的眼压的平均值都低于注射scAAV2-EGFP病毒恒河猴眼球的眼压平均值，但不同病毒之间同scAAV2-EGFP病毒的眼压差值大小存在差异，scAAV2-MGP-C3病毒同scAAV2-EGFP病毒的眼压差值最大，scAAV2-CH3L1-C3次之，scAAV-C3最小。结果说明3种病毒（scAAV2-C3病毒、scAAV2-CH3L1-C3病毒和scAAV2-MGP-C3病毒）经前房注射能够有效地转导恒河猴眼前节，表达产生C3蛋白，增加房水排出，降低眼压。但三者的眼压降低程度存在差异。考虑到3种病毒体外转导HTMC细胞的表达水平差异不大，且采用了相同的scAAV2载体。因此我们进一步检测了病毒注射后角膜水肿情况，以分析眼压降低程度存在差异的原因。

随后，我们用裂隙灯显微镜（康华瑞明，重庆）进行眼前节检查，检查时间为注射病毒后7d、28d、56d、112d、224d。检查时主要观察角膜水肿情况，记录标准如下：+ 角膜水肿厚度增加；++ 角膜浑浊水肿，仍可见虹膜；+++ 角膜浑浊水肿，中央虹膜虹膜窥不见；++++ 整个角膜浑浊水肿，周边虹膜窥不见。注射scAAV2-C3病毒眼球的结果见表2所示。注射scAAV2-CH3L1-C3病毒眼球的结果如表3所示。注射scAAV2-MGP-C3病毒眼球的结果如表4所示。

表2 scAAV2-EGFP和scAAV2-C3注射恒河猴后眼球角膜水肿检测结果

*，恒河猴编号；**, 注射scAAV2-EGFP病毒眼球；***,注射scAAV2-C3病毒眼球。

从表2的结果可知，同实施例3结果一样。注射scAAV2-C3病毒眼球角膜水肿较为严重，可能是其眼压降低作用不够的原因之一。

表3 scAAV2-EGFP和scAAV2-CH3L1-C3注射恒河猴后眼球角膜水肿检测结果

*，恒河猴编号；**, 注射scAAV2-EGFP病毒眼球；***,注射scAAV2-CH3L1-C3病毒眼球。

从表3的结果可知，3只注射scAAV2-CH3L1-C3病毒恒河猴眼球都只观察到轻度的角膜水肿，且在注射病毒56d后角膜水肿消失，不再出现。结果说明，相比于scAAV2-C3病毒，scAAV2-CH3L1-C3病毒安全性更好。

表4 scAAV2-EGFP和scAAV2-MGP-C3注射恒河猴后眼球角膜水肿检测结果

*，恒河猴编号；**, 注射scAAV2-EGFP病毒眼球；***,注射scAAV2-MGP-C3病毒眼球。

从表4的结果可知，同scAAV2-CH3L1-C3病毒一样，3只注射scAAV2-MGP-C3病毒恒河猴眼球都只观察到轻度的角膜水肿，且在注射病毒56d后角膜水肿消失，不再出现。结果说明，相比于scAAV2-C3病毒，scAAV2-MGP-C3病毒安全性更好。

序列表

<110> 北京五加和分子医学研究所有限公司

<120> 携带C3基因表达框的腺相关病毒载体及其应用

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 60

tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 120

gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 180

gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 240

tacccatggt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc 300

cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg 360

gggggggggg gcgcgcgcca ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc 420

ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga 480

ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcgacg cgtgtaagtt 540

ggcgccgttt aagggatggt tggttggtgg ggtattaatg tttaattacc ttttttacag 600

<210> 2

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcctact ctatcaatca gaaggcctac agcaacacct atcaggagtt tacaaatatc 60

gaccaggcaa aggcatgggg aaacgcacag tacaagaagt atggcctgtc taagagcgag 120

aaggaggcca tcgtgtccta taccaagtcc gcctctgaga tcaatggcaa gctgcggcag 180

aacaagggcg tgatcaatgg cttccccagc aacctgatca agcaggtgga gctgctggac 240

aagtccttca ataagatgaa gacacccgag aacatcatgc tgtttagggg cgacgatcct 300

gcatacctgg gaaccgagtt ccagaataca ctgctgaact ctaatggcac catcaacaag 360

acagccttcg agaaggccaa ggccaagttt ctgaataagg ataggctgga gtacggctat 420

atcagcacct ccctgatgaa cgtgagccag ttcgccggcc gccctatcat cacaaagttt 480

aaggtggcca agggctccaa ggccggctac atcgacccaa tctctgcctt tgccggacag 540

ctggagatgc tgctgccaag gcactctacc tatcacatcg acgatatgag actgagctcc 600

gatggcaagc agatcatcat caccgccaca atgatgggca cagccatcaa cccaaagtga 660

taa 663

<210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaagggcg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 4

<211> 558

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60

gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120

gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagatg 180

gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240

aagtgcacgc ccaagatgaa gaagttcatc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300

aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360

ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420

acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480

ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540

ggggccggtg gtgactaa 558

<210> 5

<211> 1130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttaagcctgc aaagaatgga gttgtcctgg atatttggcc aaaaaaaaaa tgtatccaca 60

aacagggacg taatcaggca gggagcctcg ttaagaagtt ttgttcttgt cctaggagtg 120

atgagagatc actgaaggat ttagagaggg gctgtatcat caggcttggg ttccaaagcc 180

tcactgagag agttggggag ctgactgatg tcagatgctc gtgcagccgc cccgtagggc 240

ctgtatttcc tccatggtgc ctcactgcag caccgagctt gcaaaagatc ctctctcttt 300

atgggaattt caaaacagaa gcaaaatagc accggggctt aaagcattct tgggaatttc 360

cctgtctttc cctctaaata atcagcatgt aaattgcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420

aaaagacacg ggcccaaaag ggagcgctca gtttcaggct ctttgctttc cttcctcccg 480

aggctctctg gcccttaccc agcctgaaga cagaaagtgt gagggggagg gtaggaaggt 540

aggtcaagca gggcaatgct gagcctggga agaaaacaac agccttgttt agggcactgt 600

ggcttacgta actaaattgt gcccagtttc cacctggcca ggggcctgga gtgaatgctg 660

aagatgcaaa ggtagaggct gccagaaaag ccaggaaatt gctggcaaga aaggccagtg 720

gtggggtgca ggagtgggag gaaggctggg aaatgcggct gagtcacatc tccagaagcc 780

ccccatcatc accctagtgg ctcttctgct ggcaggtgcc tcatgaagac ctgacccaaa 840

gttttcaaaa ctctgcggtt tctcaaccct cctctggtaa tccatagtac tcccccgcct 900

ccacttgcca gcctcgtgat tccttcattg acacatagct cagttcccat aaaagggctg 960

gtttgccgcg tcggggagtg gagtgggaca ggtatataaa ggaagtacag ggcctgggga 1020

agaggccctg tctaggtagc tggcaccagg agccgtggga ggtaagttgg cgccgtttaa 1080

gggatggttg gttggtgggg tattaatgtt taattacctt ttttacaggc 1130

<210> 6

<211> 574

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

attcagccct actgggaaga tgtctaaatt ataatcagtg tagaaagcga agttctccta 60

gaagaagagg caaaggttaa aaagaagaaa agaaaagaaa gtgaagtcct ttctccccca 120

aaacctctca tcaatcaatc agggtaacaa acagaacact agggctctgt ctgtggacca 180

aacccaaaag cctgcggtca gggccaggag ggtagatcat gtgtttgtgg caacttcctc 240

tgtgggcttt tgcccaggtc tgtccccaag catacgatgg ccaaaacttc tgcaccagag 300

cagcatcctg tgtaacacag tcaggtccag cagttaggga aaactgccca ctcagagtag 360

ataatatctg gaaggaatga ctgtttggga aaagttccaa tgctagttca gtgccaaccc 420

ttccccacct tctccagctc tctcccactg gttcctcccc tctcaactgc tctggttctt 480

ataaaaacct cacagccttc cactaacatc ccataggagc ctctctccct actgctgcta 540

cacaagaccc tgagactgac ctgcaggacg aaac 574

<210> 7

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 60

gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggacagatcc 120

c 121

<210> 8

<211> 865

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggatccgccc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg 60

tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg 120

gacagatccc caggaagctc ctctgtgtcc tcataaaccc taacctcctc tacttgagag 180

gacattccaa tcataggctg cccatccacc ctctgtgtcc tcctgttaat taggtcactt 240

aacaaaaagg aaattgggta ggggtttttc acagaccgct ttctaagggt aattttaaaa 300

tatctgggaa gtcccttcca ctgctgtgtt ccagaagtgt tggtaaacag cccacaaatg 360

tcaacagcag aaacatacaa gctgtcagct ttgcacaagg gcccaacacc ctgctcatca 420

agaagcactg tggttgctgt gttagtaatg tgcaaaacag gaggcacatt ttccccacct 480

gtgtaggttc caaaatatct agtgttttca tttttacttg gatcaggaac ccagcactcc 540

actggataag cattatcctt atccaaaaca gccttgtggt cagtgttcat ctgctgactg 600

tcaactgtag cattttttgg ggttacagtt tgagcaggat atttggtcct gtagtttgct 660

aacacaccct gcagctccaa aggttcccca ccaacagcaa aaaaatgaaa atttgaccct 720

tgaatgggtt ttccagcacc attttcatga gttttttgtg tccctgaatg caagtttaac 780

atagcagtta ccccaataac ctcagtttta acagtaacag cttcccacat caaaatattt 840

ccacaggtta agtcctcatt taaat 865

<210> 9

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ala Tyr Ser Ile Asn Gln Lys Ala Tyr Ser Asn Thr Tyr Gln Glu Phe

1 5 10 15

Thr Asn Ile Asp Gln Ala Lys Ala Trp Gly Asn Ala Gln Tyr Lys Lys

20 25 30

Tyr Gly Leu Ser Lys Ser Glu Lys Glu Ala Ile Val Ser Tyr Thr Lys

35 40 45

Ser Ala Ser Glu Ile Asn Gly Lys Leu Arg Gln Asn Lys Gly Val Ile

50 55 60

Asn Gly Phe Pro Ser Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Leu Leu Asp Lys

65 70 75 80

Ser Phe Asn Lys Met Lys Thr Pro Glu Asn Ile Met Leu Phe Arg Gly

85 90 95

Asp Asp Pro Ala Tyr Leu Gly Thr Glu Phe Gln Asn Thr Leu Leu Asn

100 105 110

Ser Asn Gly Thr Ile Asn Lys Thr Ala Phe Glu Lys Ala Lys Ala Lys

115 120 125

Phe Leu Asn Lys Asp Arg Leu Glu Tyr Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Leu

130 135 140

Met Asn Val Ser Gln Phe Ala Gly Arg Pro Ile Ile Thr Lys Phe Lys

145 150 155 160

Val Ala Lys Gly Ser Lys Ala Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Ser Ala Phe

165 170 175

Ala Gly Gln Leu Glu Met Leu Leu Pro Arg His Ser Thr Tyr His Ile

180 185 190

Asp Asp Met Arg Leu Ser Ser Asp Gly Lys Gln Ile Ile Ile Thr Ala

195 200 205

Thr Met Met Gly Thr Ala Ile Asn Pro Lys

210 215

<210> 10

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtaccgcca ccatggccta ctctatcaat cagaaggcct acagcaacac ctatcaggag 60

tttacaaata tcgaccaggc aaaggcatgg ggaaacgcac agtacaagaa gtatggcctg 120

tctaagagcg agaaggaggc catcgtgtcc tataccaagt ccgcctctga gatcaatggc 180

aagctgcggc agaacaaggg cgtgatcaat ggcttcccca gcaacctgat caagcaggtg 240

gagctgctgg acaagtcctt caataagatg aagacacccg agaacatcat gctgtttagg 300

ggcgacgatc ctgcatacct gggaaccgag ttccagaata cactgctgaa ctctaatggc 360

accatcaaca agacagcctt cgagaaggcc aaggccaagt ttctgaataa ggataggctg 420

gagtacggct atatcagcac ctccctgatg aacgtgagcc agttcgccgg ccgccctatc 480

atcacaaagt ttaaggtggc caagggctcc aaggccggct acatcgaccc aatctctgcc 540

tttgccggac agctggagat gctgctgcca aggcactcta cctatcacat cgacgatatg 600

agactgagct ccgatggcaa gcagatcatc atcaccgcca caatgatggg cacagccatc 660

aacccaaagt gataaagatc t 681

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ataggtaccg ccaccatggt gagcaagggc gag 33

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgcagatctt tacttgtaca gctcgtc 27

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ataggtaccg ccaccatggg agtcaaagtt ctg 33

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgcagatctt tagtcaccac cggcccc 27

<210> 15

<211> 1142

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctcgagttaa gcctgcaaag aatggagttg tcctggatat ttggccaaaa aaaaaatgta 60

tccacaaaca gggacgtaat caggcaggga gcctcgttaa gaagttttgt tcttgtccta 120

ggagtgatga gagatcactg aaggatttag agaggggctg tatcatcagg cttgggttcc 180

aaagcctcac tgagagagtt ggggagctga ctgatgtcag atgctcgtgc agccgccccg 240

tagggcctgt atttcctcca tggtgcctca ctgcagcacc gagcttgcaa aagatcctct 300

ctctttatgg gaatttcaaa acagaagcaa aatagcaccg gggcttaaag cattcttggg 360

aatttccctg tctttccctc taaataatca gcatgtaaat tgcaaaaaaa aaaaaaaaaa 420

aaaaaaaaaa gacacgggcc caaaagggag cgctcagttt caggctcttt gctttccttc 480

ctcccgaggc tctctggccc ttacccagcc tgaagacaga aagtgtgagg gggagggtag 540

gaaggtaggt caagcagggc aatgctgagc ctgggaagaa aacaacagcc ttgtttaggg 600

cactgtggct tacgtaacta aattgtgccc agtttccacc tggccagggg cctggagtga 660

atgctgaaga tgcaaaggta gaggctgcca gaaaagccag gaaattgctg gcaagaaagg 720

ccagtggtgg ggtgcaggag tgggaggaag gctgggaaat gcggctgagt cacatctcca 780

gaagcccccc atcatcaccc tagtggctct tctgctggca ggtgcctcat gaagacctga 840

cccaaagttt tcaaaactct gcggtttctc aaccctcctc tggtaatcca tagtactccc 900

ccgcctccac ttgccagcct cgtgattcct tcattgacac atagctcagt tcccataaaa 960

gggctggttt gccgcgtcgg ggagtggagt gggacaggta tataaaggaa gtacagggcc 1020

tggggaagag gccctgtcta ggtagctggc accaggagcc gtgggaggta agttggcgcc 1080

gtttaaggga tggttggttg gtggggtatt aatgtttaat tacctttttt acaggcggta 1140

cc 1142

<210> 16

<211> 586

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctcgagattc agccctactg ggaagatgtc taaattataa tcagtgtaga aagcgaagtt 60

ctcctagaag aagaggcaaa ggttaaaaag aagaaaagaa aagaaagtga agtcctttct 120

cccccaaaac ctctcatcaa tcaatcaggg taacaaacag aacactaggg ctctgtctgt 180

ggaccaaacc caaaagcctg cggtcagggc caggagggta gatcatgtgt ttgtggcaac 240

ttcctctgtg ggcttttgcc caggtctgtc cccaagcata cgatggccaa aacttctgca 300

ccagagcagc atcctgtgta acacagtcag gtccagcagt tagggaaaac tgcccactca 360

gagtagataa tatctggaag gaatgactgt ttgggaaaag ttccaatgct agttcagtgc 420

caacccttcc ccaccttctc cagctctctc ccactggttc ctcccctctc aactgctctg 480

gttcttataa aaacctcaca gccttccact aacatcccat aggagcctct ctccctactg 540

ctgctacaca agaccctgag actgacctgc aggacgaaac ggtacc 586

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acgccaatag ggactttcca 20

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agtcccataa ggtcatgtac tgg 23

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acggtaaatg gcccgcctgg ca 22

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccttacccag cctgaagaca 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccacagtgcc ctaaacaagg 20

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cccaggctca gcattgccct gc 22

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gctctgtctg tggaccaaac 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ttccctaact gctggacctg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tcctggccct gaccgcaggc 20

Claims (8)

1.一种重组腺相关病毒，其携带人为设计的C3基因表达框，特征在于，

(I)所述表达框中启动子是小梁网细胞特异的启动子，序列信息为SEQ ID NO.5，和/或SEQ ID NO.6；

(II)所述表达框中编码氨基酸序列信息为SEQ ID NO.9的DNA序列，其DNA序列信息为SEQ ID NO.2；且

(III)所述病毒中基因组DNA自身互补形成双链DNA分子。

2.权利要求1所述的重组腺相关病毒，其特征在于，特异性地在眼前节小梁网细胞中高效表达C3基因。

3.权利要求1所述的重组腺相关病毒，其特征在于，编码氨基酸序列信息为SEQ IDNO.9的DNA序列是经过人源表达优化的DNA序列，便于在灵长类及人中高效表达。

4.权利要求1所述的重组腺相关病毒，其特征还在于AAV外壳血清型为AAV2。

5.一种基因药物，其特征在于，包括权利要求1至4中任一项所述的重组腺相关病毒。

6.权利要求5所述的基因药物，其特征在于，给药方式为前房注射。

7.权利要求5所述的基因药物，其特征在于，一次给药可持续在小梁网细胞中表达产生C3蛋白，改变小梁网细胞形态，增加小梁网通透性，降低眼压，有效缓解或治疗青光眼的不良症状。

8.权利要求5至7中任一项所述的基因药物的用途，用于制备治疗青光眼的药物组合物，其中所述青光眼的特征在于，眼压升高是主要的危险因素，包括原发性开角型青光眼和原发性闭角型青光眼。

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