CN109207520A - Leber遗传性视神经病变的基因药物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供重组腺相关病毒介导的Leber遗传性视神经病变治疗药物。重组腺相关病毒载体携带细胞核表达ND4蛋白表达框。体内实验表明，该重组腺相关病毒载体经玻璃体腔注射能够高效地导入视网膜中，持续稳定地表达产生ND4蛋白，定位于线粒体，缓解或恢复ND4基因突变带来的不良症状。结果提示，该重组腺相关病毒载体有希望开发成为新的Leber遗传性视神经病变治疗药物。

Description

Leber遗传性视神经病变的基因药物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于重组腺相关病毒载体的Leber遗传性视神经病变基因药物。
背景技术
Leber遗传性视神经病变（Leber’s Hereditary Optic Neuropathy，LHON）（OMIM535000）是一种累及视网膜、巩膜筛板前部乳头黄斑束纤维，导致视神经退行性病变的母系遗传病（即母系后代发病而父系后代不发病）（Yu-Wai-Man P，et al. Prog RetinEye Res. 2011;30(2):81-114）。1871年德国眼科医生Leber T首次报道该病的临床症状、体征和遗传特性（Leber T. Graefe’s Arch Ophthalmol. 1871; 17:249-291.）。LHON主要累及青壮年男性，发病年龄常在15-20岁，临床上主要表现为双眼同时或先后急性或亚急性无痛性视力减退，可同时伴有中心视野缺失及色觉障碍。患者可呈现1级、2级、3级到4级等不同程度的视力损伤，病程可表现为视力突然完全丧失，也可呈渐进性下降（Yu-Wai-ManP, et al. J Med Genet. 2009; 46(3): 145-158.）。
1972年，Erickson RP等发现LHON呈母系遗传的特征，提示mtDNA（线粒体DNA）突变为LHON发病的主要分子基础。但是，携带相同mtDNA突变的不同家系和同一家系的不同成员之间LHON的外显率和表现度具有显著性差异，这表明其他因素（如核基因、线粒体单体型和/或环境因素等）在LHON发病过程中起着重要作用（Yu-Wai-Man P，et al. Prog RetinEye Res. 2011;30(2):81-114）。
mtDNA突变是LHON发病的分子基础。自1988年Wallace DC等在LHON家系中首次发现MT-ND4m.11778G>A突变以来（Wallace DC，et al. Science. 1988; 242(4884): 1427-1430.），目前已发现60多个LHON相关的mtDNA突变（Ruiz-Pesini E, et al. NucleicAcids Res. 2007;35: D823-828.），这些突变分为原发突变和继发突变。原发突变，如MT-ND1 m.3460G>A (Huoponen K, et al. Am J Hum Genet. 1991; 48(6):1147-1153.)、MT-ND4 m.11778G>A (Wallace DC，et al. Science. 1988; 242(4884): 1427-1430.)和MT-ND6 m.14484T>C（Johns DR, et al. Biochem Biophys Res Commun. 1992; 187(3):1551-1557.）是LHON的3个原发突变，仅发生在LHON家系中，他们改变了进化上中度或高度保守的氨基酸，导致呼吸链复合体I结构和功能改变，造成线粒体功能障碍，最终导致LHON的发生。继发突变，如MT-TM m.4435A>G(Qu J, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci.2006; 47(2):475-483.)，MT-TT m.15951A>G(Li R, et al. Gene. 2006; 376(1):79-86.)常与原发突变协同作用而影响LHON的表型表达，这类突变在LHON家系中存在，但也在正常人群中以低于LHON病人的频率出现。
文献报道结果显示不同的国家LHON的发病率存在差异。英格兰东北地区LHON 的发病率约为 1/25 000（Chinnery PF，et al. Ann Neurol. 2000; 48(2): 188-193. ManPYW, et al. Am J Hum Genet. 2003; 72(2): 333-339.）, 荷兰的发病率为 1/39 000(Spruijt L, et al. Am J Ophthalmol. 2006; 141(4): 676-682.), 而芬兰发病率为1/50 000(Puomila A, et al. Eur J Hum Genet. 2007; 15(10): 1079-1089.)。在我国和亚洲其他地区, 目前尚未见流行病学调查资料。超过95%的LHON患者由3个mtDNA的原发突变（m.11778G>A、m.3460G>A和m.14484T>C）引起。不同地区LHON患者人群中这3个原发突变所占的比例不尽相同。在欧洲,m.11778G>A引起的LHON患者占56.6%, m.3460G>A和m.14484T>C突变致病的患者分别占22.6%和20.8%(Hudson G, et al. Am J Hum Genet.2007; 81(2): 228-233.) ;在我国 LHON人群中,携带m.11778G>A突变的患者所占比率显著高于欧洲LHON人群,可达90.2%, 而m.3460G>A和m.14484T>C突变在我国LHON患者人群中比率分别为1.1%和8.7%(Yu DD, et al. PLoS ONE. 2010; 5(10): e13426. Yu D, etal. Neurogenetics. 2010; 11(3): 349-356. Ji Y, et al. Am J Hum Genet. 2008;83(6): 760-768.)。
由于LHON多由基因突变引起，目前并没有有效的治疗方法。通常建议戒烟戒酒、尝试线粒体呼吸链障碍治疗药物、神经保护剂等治疗手段进行辅助治疗。基因治疗是治疗LHON最有希望的治疗方式之一。主要的难点在于：1、LHON突变基因位于mtDNA，如何高效地将野生型基因导入线粒体，并保证导入基因的长期稳定表达；2、如果选择细胞核异位表达LHON致病突变基因的野生型基因，那么如何保证表达蛋白正确地定位于线粒体内，并发挥功能；3、如何高效地将LHON致病突变基因的野生型基因转导至细胞核内或线粒体内。针对这些难点，不少的研究者做了不少的尝试。为了将基因导入线粒体中，主要的策略是改造AAV载体。把线粒体定位序列插入AAV载体的外壳蛋白2（VP2）的N端，得到一种进入细胞后定位于细胞线粒体的AAV载体，外加线粒体特异性启动子调控LHON正确基因（ND4基因）的表达，实现了ND4基因高效导入线粒体（Yu H，et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109(20): E1238-1247. Yu H, et al. Mol Vis. 2012; 18: 1668-1683. Yu H，et al. MolVis. 2013;19:1482-1491.Yu H, et al. Sci Rep. 2018;8(1): 5587.）。对于核基因异位表达蛋白高效定位于线粒体的问题，主要通过在表达蛋白的N端添加线粒体定位肽和在mRNA的3’UTR（untranslated region，UTR）加入线粒体锚定RNA序列来解决。Koilkonda RD等通过在ND4蛋白的N端加入ATP1蛋白的线粒体定位序列，用双链AAV载体携带设计的ND4表达框，使表达ND4蛋白定位于视网膜神经节细胞（RGC）线粒体中(Koilkonda RD, et al.Arch Ophthalmol. 2010; 128(7): 876-883.)。Bonnet C等则通过在ND4蛋白的N端引入人COX10蛋白的线粒体定位肽以及在ND4表达框的3’UTR中加入人COX10 mRNA的线粒体锚定序列，用单链AAV载体携带构建的ND4表达框，也实现了表达ND4蛋白定位成纤维细胞线粒体中(Bonnet C，et al. Rejuvenation Res. 2007;10(2):127-144.)。两个研究小组的主要差异在于ND4表达框的设计和AAV载体的选择。Koilkonda RD等主要通过线粒体定位肽来实现表达ND4蛋白的线粒体靶向（Koilkonda RD, et al. Arch Ophthalmol. 2010; 128(7):876-883.），而Bonnet C等除了应用线粒体定位肽外，还利用了线粒体锚定RNA序列（BonnetC，et al. Rejuvenation Res. 2007;10(2):127-144.），理论上效率更高，但是增加了表达框的碱基数，导致只能采用单链AAV载体携带。目前基于上述两种设计的基因治疗药物都有相应的专利报道，且进入临床试验阶段。单独应用线粒体定位肽设计的LHON基因治疗药物的临床1期试验结果表明，设计的LHON基因药物（Feuer WJ, et al. Ophthalmology.2016; 123(3): 558-570. Guy J, et al. Ophthalmology. 2017; 124(11): 1621-1634.）安全有效。结合线粒体定位肽和线粒体表面锚定RNA设计的LHON基因药物由两个独立的研究团队分别进入临床试验或临床研究阶段。法国GenSight公司的GS010（rAAV2/2-ND4）已进入临床3期试验。2018年6月公布的临床3期试验结果显示GS010均已达到预期的临床试验终点（https://www.gensight-biologics.com/wp-content/uploads/2018/06/GENSIGHT-BIOLOGICS-PR-REVERSE-KOL-Event-Highlights-vdef.pdf），且安全性良好（Vignal C, et al. Ophthalmology. 2018; 125(6): 945-947.）。华中科技大学同济医院的李斌教授带领团队设计的rAAV2-ND4在9个LHON患者中进行了小规模的临床研究。研究结果表明rAAV2-ND4对LHON安全有效，为后续更大规模的临床研究实验奠定了基础(Yang S,et al. EBioMedicine. 2016; 10: 258-268. Wan X, et al. Sci Rep. 2016; 6:21587.)。
本发明拟在上述已有LHON基因治疗工作的基础上，提出更为高效的LHON基因治疗药物设计。基因治疗药物的设计采用细胞核异位表达产生ND4 mRNA翻译蛋白定位于线粒体策略。为此我们拟设计独特的ND4基因表达框。该表达框采用更加高效的启动子、对ND4基因编码序列进行人源表达优化、选择两种不同大小的线粒体表面锚定RNA序列以及在ND4蛋白编码序列的5’端前添加线粒体定位肽编码序列等设计。得到序列长度一大一小的两种表达框设计。长度更大的表达框用单链AAV载体携带，长度较小的表达框用双链AAV载体携带。除了AAV2血清型载体外，我们还选择AAV2载体外壳蛋白1（VP1）3个表面突出酪氨酸突变为苯丙氨酸的AAV2（3YF）以及AAV2载体外壳蛋白1（VP1）4个表面突出酪氨酸突变为苯丙氨酸的AAV2（4YF）的AAV外壳，玻璃体腔注射对视网膜神经节细胞转导效率更高。然后，将设计好的药物在LHON模型小鼠中评价其有效性。具体的过程如本发明实施例所示。
腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）因在腺病毒制品中发现而得名（Atchison RW, et al. Science. 1965; 149: 754-756.Hoggan MD, et al. Proc NatlSci USA. 1966; 55: 1467-1474.）。AAV是微小病毒科 (Parvovirus)成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNA(Rose JA, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1969; 64: 863-869.)，其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒(Geoffroy MC, et al. Curr Gene Ther. 2005; 5(3):265-271.)，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态(Chiorini JA, et al. Curr Top MicrobiolImmunol. 1996; 218:25-33.)，而不产生子代病毒。
最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV（AAV2）(Atchison RW, et al. Science.1965; 149: 754-756.)。AAV2基因组长约4.7kb，基因组两端为长度145bp的 “反向末端重复序列”（ inverted terminal repeat, ITR），呈回文-发卡结构(Lusby E, et al. JVirol. 1980; 34: 402-409.)。基因组中有两个大开放阅读框（ORF），分别编码rep和cap基因。AAV2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中(Samulski RJ, et al. Proc Natl AcadSci USA. 1982; 79: 2077-2081. Laughlin CA, et al. Gene. 1983; 23: 65-73.)。
ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用(Xiao X, et al. J Virol. 1997; 71(2): 941-948. )。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点（Rep binding site，RBS）和末端解链位点trs（terminal resolutionsite），能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口(Linden RM, et al. Proc Natl AcadSci USA. 1996; 93(15): 7966-7972.)。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用(Ashktorab H, et al. J Virol. 1989; 63(7):3034-3039.)。
AAV2基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区(Srivastava A,et al. J Virol. 1983; 45(2): 555-564.)。rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs（terminal resolution site）和GAGY重复基序（repeat motif）特异性结合(Hüser D, et al. PLoS Pathog. 2010; 6(7): e1000985.)，启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序是AAV基因组复制的中心，因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同，但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子，分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40没有结合DNA的功能，而有ATP依赖的DNA解旋酶活性。cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中，VP3分子量最小，但数量最多，在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1:1:10。VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。
随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解，AAV病毒被改造成了一种高效的外源基因转移工具，即AAV载体。改造后的AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带转运的外源基因表达框，病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过外源质粒反式提供，降低了rep和cap基因包装入AAV载体可能带来的危害。加之，AAV病毒本身不具有致病性，使AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs（terminal resolution site）序列还能够使包装得到的重组AAV病毒载体携带基因组自我互补，形成双链，显著提高AAV载体的体内外转导效率（Wang Z, et al. Gene Ther.2003;10(26):2105-2111. McCarty DM, et al. Gene Ther. 2003;10(26):2112-2118.）。包装得到的病毒成为scAAV（self-complementary AAV）病毒，即所谓的双链AAV病毒。不同于双侧ITR均未突变的ssAAV（single-stranded AAV），即传统的AAV病毒。scAAV病毒的包装容量更小，仅为ssAAV包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。AAV病毒血清型众多，不同的血清型具有不同的组织感染嗜性，因此应用AAV载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织(Wu Z, et al. Mol Ther. 2006; 14(3): 316-327.)。有些血清型AAV载体（如AAV2）经玻璃体腔注射后能够有效地转导视网膜中靠近玻璃体侧的神经节细胞（Hellström M, et al. Gene Therapy. 2009; 16: 521-532.）。某些血清型AAV载体（如AAV8）通过视网膜下腔注射后可以高效地转导感光细胞和视网膜色素上皮细胞（Natkunarajah M, et al. Gene Therapy. 2008; 15: 463-467.）。而且将AAV2载体外壳蛋白表面突出的酪氨酸突变为苯丙氨酸，能够提高AAV载体经玻璃体腔注射或视网膜下注射后对视网膜细胞的转导效率，如将AAV2载体外壳表面的1个酪氨酸突变为苯丙氨酸（Petrs-Silva H, et al. Molecular Therapy. 2009; 17(3): 463-471.）、AAV2载体外壳表面的3个酪氨酸突变为苯丙氨酸以及AAV2载体外壳表面的4个酪氨酸突变为苯丙氨酸（Petrs-Silva H, et al. Molecular Therapy. 2011; 19(2): 293-301.）。此外，AAV载体的理化性质稳定，对酸碱和高温体现出较强的耐受性(Gruntman AM, et al. Hum GeneTher Methods. 2015; 26(2): 71-76.)，容易开发出稳定性较高的生物制品。
AAV载体还具有相对成熟的包装系统，便于规模化生产。目前国内外常用的AAV载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒为辅助病毒系统、单纯疱疹病毒（Herpessimplex virus type 1，HSV1）为辅助病毒的包装系统以及基于杆状病毒的包装系统。其中，三质粒转染包装系统因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的AAV载体包装系统，也是目前国际上主流的生产系统。略显不足的是，高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染系统在AAV载体大规模制备中的应用。Yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的AAV大规模包装系统（Yuan Z, et al. Hum Gene Ther, 2011,22(5):613-624.），该系统生产效率高，但包装系统中腺病毒在最后AAV成品中的痕量存在，影响了AAV成品的安全性。HSV1作为辅助病毒的包装系统是另一类应用较为广泛的AAV载体包装系统。伍志坚和Conway等几乎同时在国际上提出了以HSV1为辅助病毒的AAV2载体包装策略（伍志坚，吴小兵等。科学通报，1999，44（5）：506-509。Conway JE, et al. Gene Ther, 1999,6:986-993.）。随后Wustner等提出了以HSV1为辅助病毒的AAV5载体包装策略（Wustner JT, et al. Mol Ther, 2002,6(4):510-518.）。在此基础上，Booth等利用两个HSV1分别携带AAV的rep/cap基因和AAV的反向末端序列（Inverted terminal repeat，ITR）/外源基因表达框，然后两个重组HSV1病毒共同感染生产细胞，包装产生AAV病毒（Booth MJ,et al. Gene Ther,2004,11:829-837.）。Thomas等进一步建立双HSV1病毒AAV生产的悬浮细胞系统（Thomas DL, et al.Gene Ther,2009,20:861-870.），使更大规模的AAV病毒生产成为可能。另外，Urabe等利用三个杆状病毒分别携带AAV的结构、非结构和ITR/外源基因表达框，构建了AAV载体的杆状病毒包装系统。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性，随后减少了生产系统中所需杆状病毒的个数，逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两或一个杆状病毒（Chen H. MolTher.2008;16(5):924-930. Galibert L,et al.J Invertebr Pathol, 2011,107 Suppl:S80-93.）以及一个杆状病毒加一株诱导细胞株策略（Mietzsch M, et al. Hum GeneTher. 2014;25:212-222. Mietzsch M, et al. Hum Gene Ther. 2015;26(10):688-697.）。每种包装系统都各具特点，可根据需要做出合适的选择。
由于上述特点，AAV载体逐渐成为一种广泛应用于基因治疗，特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具。截至2017年11月，世界上批准的机遇AAV载体的基因治疗临床试验方案有204项（http://www.abedia.com/wiley/vectors.php）。更为重要的是，基于AAV载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物Glybera已于2012年被欧洲药监局批准上市，成为西方世界批准的第一个基因治疗药物（Ylä-Herttuala S. Mol Ther. 2012; 20(10): 1831-1832.）；2017年12月19日美国FDA批准先天性黑曚症（RPE65基因突变引起）基因治疗药物Luxturna上市，成为美国第一个罕见病的基因治疗药物（https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm589467.htm）。血友病B（Kay MA, et al.Nat Genet. 2000; 24(3): 257-261.）的AAV载体基因治疗药物均取得不错的临床试验效果，预期在不久的将来会上市销售，造福广大患者。
本发明中，我们选择AAV载体来携带ND4基因表达框，主要是基于AAV载体的以下特点。其一，AAV载体仅保留野生型病毒中包装需要的两个ITR序列，不含有野生型病毒基因组中的蛋白编码基因（Salgenik M, et al. Microbiol Spectr. 2015; 3(4).），免疫原性低。其二，AAV通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带基因读框的持续稳定表达（Chen ZY, et al. Mol Ther. 2001; 3(3): 403-410.），避免引导入基因随机整合而带来的安全性问题。其三，AAV载体通过玻璃体腔注射能够高效地转导视网膜神经节细胞（PangJJ, et al. Vision Res. 2008; 48(3): 377-385. Natkunarajah M, et al. GeneTherapy. 2008; 15: 463-467.），保证ND4基因表达框能够在神经节细胞中表达产生ND4蛋白，恢复神经节细胞功能，从而达到治疗LHON的目的。
基于此，本发明提出了新型LHON基因治疗药物设计。设计基因药物的结构为携带人工设计的ND4基因表达框的重组腺相关病毒载体。基因药物导入体内后，在细胞核中异位表达产生ND4 mRNA，经核糖体翻译得到ND4蛋白，定位于线粒体中。选用的重组腺相关病毒载体血清型除AAV2外，还包括AAV2载体外壳蛋白1（VP1）3个表面突出酪氨酸突变为苯丙氨酸的AAV2（3YF）以及AAV2载体外壳蛋白1（VP1）4个表面突出酪氨酸突变为苯丙氨酸的AAV2（4YF）的AAV外壳。三种血清型AAV载体经玻璃体腔注射后可高效地转导视网膜中神经节细胞，表达产生正常的ND4蛋白。人工设计的ND4基因表达框包含一大一小两种不同的长度结构。较大的ND4基因表达框中包含人巨细胞病毒启动子（CMV启动子）、人源密码子优化的融合线粒体定位肽和ND4蛋白序列的融合蛋白编码序列以及COX10基因mRNA的3’UTR（3’untranslated region，3’非编码区）（Bonnet C，et al. Rejuvenation Res. 2007;10(2):127-144.）。较小的ND4基因表达框中含有自主设计的序列短小启动子、人源密码子优化的融合线粒体定位肽和ND4蛋白序列的融合蛋白编码序列以及序列长度小于200bp的ATP5B基因的3’UTR序列（Sylvestre J, et al. Molecular Biology of the Cell, 2003, 14(9):3848.）。采用单链AAV载体携带较大的ND4基因表达框；采用自身互补的双链AAV载体携带较小的ND4基因表达框。将设计多种LHON基因药物同含有ND4突变（11778G>A）表达框的AAV载体（scAAV2-HSP-mND4）经玻璃体腔注射至小鼠中，评价设计LHON基因药物的有效性。结果表明设计LHON基因药物能够有效地抑制scAAV2-HSP-mND4对小鼠视网膜中神经节细胞的破坏作用，保护视网膜的正常生理功能，为LHON的治疗提供了新的选择。
发明内容
有鉴于此，本发明提供Leber遗传性视神经病变的基因治疗药物。本发明提出了新型LHON基因治疗药物设计，用重组腺相关病毒载体携带人为设计的ND4基因表达框。将该基因药物导入体内后，在细胞核中异位表达产生ND4 mRNA，经核糖体翻译得到ND4蛋白，定位于线粒体中，补偿突变ND4蛋白的功能，从而达到缓解或治疗LHON的目的。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了治疗Leber遗传性视神经病变（LHON）的基因药物，其特征在于，该药物基于重组AAV载体，利用AAV载体通过玻璃体腔注射能高效地把药物效应元件导入视网膜细胞（尤其是视网膜神经节细胞）的特点，实现药物效应元件高效表达产生治疗作用的ND4蛋白。为了实现ND4蛋白表达框的高效表达，根据不同AAV载体的转导特点，选用的AAV载体主要为AAV2和AAV2外壳突变体载体，AAV2外壳突变体载体具体为AAV2（3YF）和AAV2（4YF），即AAV2载体外壳蛋白1（VP1）3个表面突出酪氨酸突变为苯丙氨酸的AAV2（3YF）以及AAV2载体外壳蛋白1（VP1）4个表面突出酪氨酸突变为苯丙氨酸的AAV2（4YF）的AAV外壳。本发明实施例6中，我们展示了不同AAV外壳对LHON基因药物有效性影响的研究结果。
本发明提供了治疗Leber遗传性视神经病变（LHON）的基因药物，其特征还在于，该药物经玻璃体腔注射后能高效地在视网膜细胞（尤其是视网膜神经节细胞）表达产生ND4蛋白。为了实现ND4蛋白的高效表达，人为设计了一大一小两种不同长度结构的ND4基因表达框。较大的ND4基因表达框中包含人巨细胞病毒启动子（CMV启动子）、人源密码子优化的融合线粒体定位肽和ND4蛋白序列的融合蛋白编码序列以及人COX10基因mRNA的3’UTR（3’untranslated region，3’非编码区）（Bonnet C，et al. Rejuvenation Res. 2007;10(2):127-144.）。较小的ND4基因表达框中含有自主设计的序列短小启动子、人源密码子优化的融合线粒体定位肽和ND4蛋白序列的融合蛋白编码序列以及序列长度小于200bp的人ATP5B基因的3’UTR序列（Sylvestre J, et al. Molecular Biology of the Cell, 2003, 14(9):3848.）。采用单链AAV载体携带较大的ND4基因表达框；采用自身互补的双链AAV载体携带较小的ND4基因表达框。本发明实施例5和实施例6的实验结果表明两种不同设计的表达框都能够在视网膜细胞中有效表达产生ND4蛋白，缓解或恢复LHON的病理改变。
本发明提供了治疗Leber遗传性视神经病变（LHON）的基因药物，其特征还在于，该药物经玻璃体腔注射后能高效地转导视网膜细胞（尤其是视网膜神经节细胞）。由于LHON的靶细胞神经节细胞位于视网膜靠近玻璃体侧，因此重组AAV病毒经玻璃体腔注射后能够有效地感染神经节细胞。相比于视网膜下腔注射，玻璃体腔注射操作简单，对视网膜损伤小，在临床应用中具有明显优势。本发明实施例4用EGFP报告基因证明了玻璃体腔注射重组AAV病毒（实施例中为AAV2）能够有效地转导视网膜神经节细胞。实施例5和实例6中采用玻璃体腔注射评价了设计LHON基因药物的有效性，实验结果表明玻璃体腔注射方式能够使重组AAV病毒高效地转导视网膜神经节细胞，表达产生ND4蛋白，缓解或恢复ND4突变蛋白带来的LHON病理改变。
本发明提供的LHON基因治疗药物，其特征还在于，经玻璃体腔一次给药就能够长期持续地在小鼠视网膜中表达产生ND4蛋白，恢复或延缓ND4基因突变带来的不良症状。
本发明用到的重要原始实验材料如下所示：
pHelper质粒，来源于AAV Helper Free System（Agilent Technologies，美国），由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。该质粒包含三质粒共转染HEK293细胞制备重组AAV病毒所需要的腺病毒来源辅助功能基因E2A、E4和VA RNA等。
pAAV-R2C2质粒，为AAV Helper Free System（Agilent Technologies，美国）中的pAAV-RC质粒，由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。为了明确指示pAAV-RC质粒的功能，将pAAV-RC质粒重新命名为pAAV-R2C2质粒。pAAV-R2C2质粒包含完整的AAV2的rep和cap基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV2病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV2外壳蛋白。
pAAV-DJ质粒，包含完整的AAVDJ的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAVDJ病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAVDJ外壳蛋白。由本公司购自美国Cell Biolabs公司并保存。
C57BL/6J小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，用作动物实验的野生型对照和实验用动物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1pAAV2neo载体结构示意图。本公司保存的两侧ITR均为145bp野生型ITR的AAV载体pAAV2neo（Dong X, et al. PLoS ONE. 2010; 5(10):e13479.）。ITR，invertedterminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。
图2 pscAAV-CAM载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的ITR，抑制AAV包装过程中ITR序列的切割，提高包装得到病毒携带自身互补的双链基因组的概率。CAM，人工设计的启动子，由人巨细胞病毒增强子、鸡β-actin启动子和小鼠细小病毒内含子（minute virus of mice，mvm）拼接而成，序列信息见SEQ ID NO.1。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。
图3 pAAV-CMV-EGFP-COX10载体结构示意图ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。MTS，来源于人COX10蛋白的线粒体定位肽编码DNA序列，详细序列信息见SEQ ID NO.2。EGFP，增强型绿色荧光蛋白编码序列。COX10 polyA，人COX10基因的加尾信号序列，序列信息见SEQ ID NO.3。
图4 pscAAV-CAM-EGFP-ATP5B载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的ITR，抑制AAV包装过程中ITR序列的切割，提高包装得到病毒携带自身互补的双链基因组的概率。CAM，人工设计的启动子，由人巨细胞病毒增强子、鸡β-actin启动子和小鼠细小病毒内含子（minute virus of mice，mvm）拼接而成，序列信息见SEQ ID NO.1。MTS，来源于人COX10蛋白的线粒体定位肽编码DNA序列，详细序列信息见SEQ ID NO.2。EGFP，增强型绿色荧光蛋白编码序列。ATP5B 3’UTR，人ATP5B基因的3’非翻译区，作为基因转录的终止加尾信号，序列信息见SEQ ID NO.4。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。
图5 pAAV-CMV-ND4-COX10载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。ND4，人COX10蛋白线粒体定位肽和人线粒体ND4蛋白序列融合序列的核基因编码序列，序列信息见SEQ ID NO.5。COX10 polyA，人COX10基因的加尾信号序列，序列信息见SEQ ID NO.3。
图6 pAAV-CMV-ocND4-COX10载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。ocND4，人COX10蛋白线粒体定位肽和人线粒体ND4蛋白序列融合序列的人源优化后的核基因编码序列，序列信息见SEQ ID NO.6。COX10 polyA，人COX10基因的加尾信号序列，序列信息见SEQ ID NO.3。
图7 pscAAV-CAM-ocND4-ATP5B载体结构示意图。ITR，inverted terminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的ITR，抑制AAV包装过程中ITR序列的切割，提高包装得到病毒携带自身互补的双链基因组的概率。CAM，人工设计的启动子，由人巨细胞病毒增强子、鸡β-actin启动子和小鼠细小病毒内含子（minute virus ofmice，mvm）拼接而成，序列信息见SEQ ID NO.1。ocND4，人COX10蛋白线粒体定位肽和人线粒体ND4蛋白序列融合序列的人源优化后的核基因编码序列，序列信息见SEQ ID NO.6。ATP5B3’UTR，人ATP5B基因的3’非翻译区，作为基因转录的终止加尾信号，序列信息见SEQ IDNO.4。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。
图8 pscAAV-HSP-mND4载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的ITR，抑制AAV包装过程中ITR序列的切割，提高包装得到病毒携带自身互补的双链基因组的概率。HSP，人线粒体重链启动子，序列信息见SEQ ID NO.7。mND4，人线粒体突变ND4基因（G11778A），序列信息见SEQ ID NO.8。BGHpolyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。
图9 pAAV-VP2A-COX8-EGFP载体结构示意图。Rep2，AAV2病毒的rep基因序列。COX8-EGFP，人COX8蛋白线粒体定位肽和绿色荧光蛋白融合蛋白序列的编码序列，序列信息见SEQ ID NO.9。VP2A-COX8-EGFP，人为设计的含有COX8-EGFP序列的AAV2的VP2（三种病毒外壳蛋白组分之一，分子量第二大）。HindIII、PmeI，限制性酶切位点。
图10 pAAV-VP1-VP3载体结构示意图。Rep2，AAV2病毒的rep基因序列。VP1-VP3，将AAV2病毒的cap基因序列中VP2起始密码子由“ACG”突变为“GCG”得到，序列信息详见SEQ IDNO.10。HindIII、PmeI，限制性酶切位点。
图11 pAAV-R2C2载体结构示意图。Rep2，AAV2病毒的rep基因序列。Cap2，AAV2病毒的cap基因序列，序列信息详见SEQ ID NO.11。HindIII、PmeI，限制性酶切位点。
图12 pAAV-R2C2-3YF载体结构示意图。Rep2，AAV2病毒的rep基因序列。Cap2-3YF，将AAV2病毒的cap基因序列中VP1序列中730、500、444位酪氨酸密码子突变为苯丙氨酸密码子，序列信息详见SEQ ID NO.12。HindIII、PmeI，限制性酶切位点。
图13 pAAV-R2C2-4YF载体结构示意图。Rep2，AAV2病毒的rep基因序列。Cap2-4YF，将AAV2病毒的cap基因序列中VP1序列中730、500、444和272位酪氨酸密码子突变为苯丙氨酸密码子，序列信息详见SEQ ID NO.13。HindIII、PmeI，限制性酶切位点。
图14 异位表达绿色荧光蛋白亚细胞定位观察结果。采用三质粒包装系统，将pAAV-CMV-EGFP-COX10和pscAAV-CAM-EGFP-ATP5B质粒分别包装成AAVDJ-EGFP-COX10和scAAVDJ-EGFP-ATP5B。包装得到的AAVDJ-EGFP-COX10和scAAVDJ-EGFP-ATP5B病毒分别以1×105vg/cell的剂量感染人成纤维细胞BJ细胞。病毒转导细胞72h后，共聚焦显微镜（LeicaTSC 4D）观察绿色荧光蛋白表达情况及在细胞中分布。用ATP合成酶α亚基定位细胞中线粒体。同一视野下，细胞内绿色荧光蛋白分布和ATP合成酶α亚基分布的重叠区域即为线粒体中绿色荧光蛋白的分布区域。图14A，转导AAVDJ-EGFP-COX10病毒的BJ细胞的绿色荧光蛋白表达情况；图14B，同一视野下，转导AAVDJ-EGFP-COX10病毒的BJ细胞的ATP合成酶α亚基分布（红色表示）；图14C，图14A和图14B叠加结果，黄色部分表示表达绿色荧光蛋白的线粒体；图14D，转导scAAVDJ-EGFP-ATP5B病毒的BJ细胞的绿色荧光蛋白表达情况；图14E，同一视野下，转导scAAVDJ-EGFP-ATP5B病毒的BJ细胞的ATP合成酶α亚基分布（红色表示）；图14F，图14D和图14E叠加结果，黄色部分表示表达绿色荧光蛋白的线粒体。
图15 玻璃体腔注射scAAV2-EGFP-ATP5B转导小鼠视网膜细胞结果。采用三质粒包装系统，将pscAAV-CAM-EGFP-ATP5B质粒分别包装成scAAV2-EGFP-ATP5B。包装得到的scAAV2-EGFP-ATP5B病毒分别以2×109vg/1μL/只眼的剂量经玻璃体腔注射C57BL/6J小鼠。注射病毒2周后，处死小鼠，分离小鼠视网膜，冰冻切片后，用细胞核染料DAPI处理标记细胞核，荧光显微镜下分别观察绿色荧光蛋白表达情况和DAPI染料结合情况。同一视野下两种观察情况下成像结果叠加，得到如图15所示的结果。GCL，ganglion cell layer，神经节细胞层；INL，inner nuclear cell，内核细胞层；ONL，outer nuclear layer，外核细胞层；RPE，retinal pigment epithelium，视网膜色素上皮细胞层。
图16 不同病毒组合注射C57BL/6J小鼠后图形视网膜电位振幅变化。包装得到scAAV2-HSP-mND4、AAV2-EGFP-COX10、AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10和scAAV2-ocND4-ATP5B等5种病毒。将scAAV2-HSP-mND4病毒经玻璃体腔注射至C57BL/6J小鼠眼球中，注射剂量为2×109vg/1μL/只眼，共注射20只小鼠。注射scAAV2-HSP-mND4病毒72h后，将20只小鼠随机分为4组，每组5只小鼠。4组小鼠分别经玻璃体腔注射AAV2-EGFP-COX10或AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10以及scAAV2-ocND4-ATP5B病毒，注射剂量为2×109vg/1μL/只眼。以未注射病毒的正常C57BL/6J小鼠为对照，注射病毒2个月、6个月和12个月后，分别记录图形视网膜电位振幅。Control，未注射病毒C57BL/6J小鼠；EGFP-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠；ND4-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-ND4-COX10病毒小鼠；ocND4-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-ocND4-COX10病毒小鼠；ocND4-ATP5B，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠。
图17 不同病毒组合注射C57BL/6J小鼠后图形视网膜电位延迟时间变化。包装得到scAAV2-HSP-mND4、AAV2-EGFP-COX10、AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10和scAAV2-ocND4-ATP5B等5种病毒。将scAAV2-HSP-mND4病毒经玻璃体腔注射至C57BL/6J小鼠眼球中，注射剂量为2×109vg/1μL/只眼，共注射20只小鼠。注射scAAV2-HSP-mND4病毒72h后，将20只小鼠随机分为4组，每组5只小鼠。4组小鼠分别经玻璃体腔注射AAV2-EGFP-COX10或AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10以及scAAV2-ocND4-ATP5B病毒，注射剂量为2×109vg/1μL/只眼。以未注射病毒的正常C57BL/6J小鼠为对照，注射病毒2个月、6个月和12个月后，分别记录图形视网膜电位延迟时间。Control，未注射病毒C57BL/6J小鼠；EGFP-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠；ND4-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-ND4-COX10病毒小鼠；ocND4-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-ocND4-COX10病毒小鼠；ocND4-ATP5B，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠。
图18 不同病毒组合注射C57BL/6J小鼠后视网膜中GCL和IPL细胞层厚度变化。包装得到scAAV2-HSP-mND4、AAV2-EGFP-COX10、AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10和scAAV2-ocND4-ATP5B等5种病毒。将scAAV2-HSP-mND4病毒经玻璃体腔注射至C57BL/6J小鼠眼球中，注射剂量为2×109vg/1μL/只眼，共注射20只小鼠。注射scAAV2-HSP-mND4病毒72h后，将20只小鼠随机分为4组，每组5只小鼠。4组小鼠分别经玻璃体腔注射AAV2-EGFP-COX10或AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10以及scAAV2-ocND4-ATP5B病毒，注射剂量为2×109vg/1μL/只眼。以未注射病毒的正常C57BL/6J小鼠为对照，注射病毒2个月、6个月和12个月后，用光学相干断层成像术（optical coherence tomography，OCT）检测视网膜中GCL和IPL细胞层厚度。GCL，ganglion cell layer，神经节细胞层；IPL，inner plexiformlayers，内丛状层。 Control，未注射病毒C57BL/6J小鼠；EGFP-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠；ND4-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-ND4-COX10病毒小鼠；ocND4-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-ocND4-COX10病毒小鼠；ocND4-ATP5B，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠。
图19 不同血清型AAV病毒组合注射C57BL/6J小鼠后图形视网膜电位振幅变化。包装得到scAAV2-HSP-mND4、scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B和scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B等4种病毒。将scAAV2-HSP-mND4病毒经玻璃体腔注射至C57BL/6J小鼠眼球中，注射剂量为2×109vg/1μL/只眼，共注射15只小鼠。注射scAAV2-HSP-mND4病毒72h后，将15只小鼠随机分为3组，每组5只小鼠。3组小鼠分别经玻璃体腔注射scAAV2-ocND4-ATP5B或scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B以及scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B病毒，注射剂量为2×109vg/1μL/只眼。以未注射病毒的正常C57BL/6J小鼠为对照，注射病毒2个月、6个月和12个月后，分别记录图形视网膜电位振幅。Control，未注射病毒C57BL/6J小鼠；AAV2，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠；AAV2(3YF)，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B病毒小鼠；AAV2(4YF)，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B病毒小鼠。
图20 不同血清型AAV病毒组合注射C57BL/6J小鼠后图形视网膜电位延迟时间变化。包装得到scAAV2-HSP-mND4、scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B和scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B等4种病毒。将scAAV2-HSP-mND4病毒经玻璃体腔注射至C57BL/6J小鼠眼球中，注射剂量为2×109vg/1μL/只眼，共注射15只小鼠。注射scAAV2-HSP-mND4病毒72h后，将15只小鼠随机分为3组，每组5只小鼠。3组小鼠分别经玻璃体腔注射scAAV2-ocND4-ATP5B或scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B以及scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B病毒，注射剂量为2×109vg/1μL/只眼。以未注射病毒的正常C57BL/6J小鼠为对照，注射病毒2个月、6个月和12个月后，分别记录图形视网膜电位延迟时间。Control，未注射病毒C57BL/6J小鼠；AAV2，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠；AAV2(3YF)，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B病毒小鼠；AAV2(4YF)，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B病毒小鼠。
图21 不同血清型AAV病毒组合注射C57BL/6J小鼠后视网膜中GCL和IPL细胞层厚度变化。包装得到scAAV2-HSP-mND4、scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B和scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B等4种病毒。将scAAV2-HSP-mND4病毒经玻璃体腔注射至C57BL/6J小鼠眼球中，注射剂量为2×109vg/1μL/只眼，共注射15只小鼠。注射scAAV2-HSP-mND4病毒72h后，将15只小鼠随机分为3组，每组5只小鼠。3组小鼠分别经玻璃体腔注射scAAV2-ocND4-ATP5B或scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B以及scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B病毒，注射剂量为2×109vg/1μL/只眼。以未注射病毒的正常C57BL/6J小鼠为对照，注射病毒2个月、6个月和12个月后，用光学相干断层成像术（optical coherence tomography，OCT）检测视网膜中GCL和IPL细胞层厚度。GCL，ganglion cell layer，神经节细胞层；IPL，inner plexiformlayers，内丛状层。Control，未注射病毒C57BL/6J小鼠；AAV2，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠；AAV2(3YF)，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B病毒小鼠；AAV2(4YF)，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B病毒小鼠。
具体实施方式
本发明公开了Leber遗传性视神经病变的基因治疗药物，包含药物的设计、小量制备及功能验证，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 质粒载体构建
首先我们构建本发明实施例中需要用到的AAV载体质粒（pAAV-CMV-EGFP-COX10（图3）、pscAVV-CAM-EGFP-ATP5B（图4）、pAAV-CMV-ND4-COX10（图5）、pAAV-CMV-ocND4-COX10（图6）、pscAAV-CAM-ocND4-ATP5B（图7）、pscAAV-HSP-mND4（图8）），然后构建了包装靶向线粒体的AAV载体包装外壳质粒（pAAV-VP2A-COX8-EGFP（图9）和pAAV-VP1-VP3（图10））以及AAV2外壳中酪氨酸突变为苯丙氨酸的AAV载体包装外壳质粒（pAAV-R2C2-3YF（图12）、pAAV-R2C2-4YF（图13））。其中单链AAV载体包装载体质粒（pAAV-CMV-EGFP-COX10（图3）、pAAV-CMV-ND4-COX10（图5）、pAAV-CMV-ocND4-COX10（图6））以公司保存的pAAV2neo（图1）为基本骨架。双链AAV载体包装质粒（pscAVV-CAM-EGFP-ATP5B（图4）、pscAAV-CAM-ocND4-ATP5B（图7）、pscAAV-HSP-mND4（图8））则是在pscAAV-CAM载体（图2）的基础上构建而来，pscAAV-CAM载体的前体质粒是公司保存的pAAV2neo（图1）。
（1）单链AAV载体质粒构建
为了使表达蛋白有效地靶向线粒体，我们在表达蛋白的N端融合了线粒体定位肽序列（mitochondrial targeting signal peptide，MTS）以及在表达蛋白mRNA的3’UTR（3’untranslated region）加入线粒体表面靶向mRNA序列。MTS序列来源于人COX10 蛋白的MTS序列，长度为28个氨基酸，编码氨基酸序列详见SEQ ID NO.2。线粒体表面靶向mRNA序列来源于人COX10 mRNA（GenBank ID：U09466.1）序列，序列信息详见SEQ ID NO.3。MTS序列和线粒体表面靶向mRNA序列选择参考文献（Bonnet C, et al. Rejuvenation Res. 2007; 10(2): 127-144.）。
根据上述思路，我们首先构建了靶向线粒体的绿色荧光蛋白（EGFP）表达AAV载体pAAV-CMV-EGFP-COX10。设计合成了含有人COX10 蛋白MTS编码序列（SEQ ID NO.2）、EGFP编码序列（SEQ ID NO.14）和人COX10 mRNA中靶向线粒体表面序列（SEQ ID NO.3）的融合序列MTS-EGFP-COX10（SEQ ID NO.15）。在MTS-EGFP-COX10序列的两端分别添加KpnI和BamHI酶切位点，以方便克隆。将添加酶切位点的MTS-EGFP-COX10序列发送南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57-1.8K（南京金斯瑞生物科技有限公司）载体，得到pUC57-1.8K-MTS-EGFP-COX10载体。KpnI和BamHI双酶切消化pUC57-1.8K-MTS-EGFP-COX10载体，回收长度为2.2kb的MTS-EGFP-COX10序列片段备用。KpnI和BamHI双酶切消化pAAV2neo载体，回收长度为6.7kb的载体片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coli JM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pAAV-CMV-EGFP-COX10质粒（图3）。
接下来，我们构建了靶向线粒体的ND4表达AAV载体pAAV-CMV-ND4-COX10。设计合成了含有人COX10 蛋白MTS编码序列（SEQ ID NO.2）、ND4核基因编码序列（SEQ ID NO.5）和人COX10 mRNA中靶向线粒体表面序列（SEQ ID NO.3）的融合序列MTS-ND4-COX10（SEQ IDNO.16）。在MTS-ND4-COX10序列的两端分别添加KpnI和BamHI酶切位点，以方便克隆。将添加酶切位点的MTS-ND4-COX10序列发送南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57-1.8K（南京金斯瑞生物科技有限公司）载体，得到pUC57-1.8K-MTS-ND4-COX10载体。KpnI和BamHI双酶切消化pUC57-1.8K-MTS-ND4-COX10载体，回收长度为2.9kb的MTS-ND4-COX10序列片段备用。KpnI和BamHI双酶切消化pAAV2neo载体，回收长度为6.7kb的载体片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coli JM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pAAV-CMV-ND4-COX10质粒（图5）。
最后，我们构建了人源优化的ND4表达AAV载体pAAV-CMV-ocND4-COX10。设计合成了含有人COX10 蛋白MTS编码序列（SEQ ID NO.2）、人源化的ND4核基因编码序列ocND4（SEQID NO.6）和人COX10 mRNA中靶向线粒体表面序列（SEQ ID NO.3）的融合序列MTS-ocND4-COX10（SEQ ID NO.17）。在MTS-ocND4-COX10序列的两端分别添加KpnI和BamHI酶切位点，以方便克隆。将添加酶切位点的MTS-ocND4-COX10序列发送南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57-1.8K（南京金斯瑞生物科技有限公司）载体，得到pUC57-1.8K-MTS-ocND4-COX10载体。KpnI和BamHI双酶切消化pUC57-1.8K-MTS-ocND4-COX10载体，回收长度为2.9kb的MTS-ocND4-COX10序列片段备用。KpnI和BamHI双酶切消化pAAV2neo载体，回收长度为6.7kb的载体片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coli JM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pAAV-CMV-ocND4-COX10质粒（图6）。
（2）双链AAV载体质粒构建
为了构建双链AAV载体，我们首先以pAAV2neo为基础，构建通用的pscAAV-CAM质粒。构建过程如下，以AAV2基因组（GenBank No. AF043303）中的3’端ITR序列为基础，根据文献报道删除ITR序列中的trs序列和D序列（ Wang Z, et al. Gene Ther. 2003;10:2105-2111.），得到ΔITR序列（SEQ ID No.18）。为了便于克隆操作，将pAAV2neo载体中1392-2127bp之间序列（靠近BGH polyA的ITR和SwaI酶切位点之间序列）同ΔITR序列融合，得到融合序列ΔITR-BS（SEQ ID No.19）。在ΔITR-BS融合序列两端分别添加BamHI和SwaI酶切位点后，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57 simple载体，获得pUC57-ΔITR-BS。BamHI和SwaI双酶切分别消化pUC57-ΔITR-BS载体和pAAV2neo载体，回收ΔITR-BS片段以及切去ITR序列的pAAV2neo载体片段。将回收ΔITR-BS片段同切去ITR序列的pAAV2neo载体片段连接，转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定获得pscAAV2neo载体。将人巨细胞病毒早期基因增强子序列、鸡β-actin启动子序列和小鼠细小病毒内含子序列拼接，得到CAM启动子序列，序列信息见SEQ ID No.1。在CAM启动子序列的两端分别添加XhoI和KpnI酶切位点。添加酶切位点后序列由金斯瑞生物科技有限公司合成，合成序列克隆入金斯瑞生物科技有限公司的pUC57 simple载体（金斯瑞生物科技，南京），得到pUC57-CAM。用XhoI和KpnI分别双酶切消化pUC57-CAM载体和pAAV2neo载体，回收CAM片段和切去CMV启动子的pscAAV2neo载体片段（约6.3kb），两片段连接后转化E.coliJM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有CAM启动子的AAV质粒载体pscAAV-CAM（图2）。
接下来，我们以构建获得的pscAAV-CAM（图2）为基础，构建pscAAV-CAM-EGFP-ATP5B（图4）、pscAAV-CAM-ocND4-ATP5B（图7）、pscAAV-HSP-mND4（图8）载体。为了使表达蛋白有效地靶向线粒体，我们在表达蛋白的N端融合了线粒体定位肽序列（mitochondrialtargeting signal peptide，MTS）以及在表达蛋白mRNA的3’UTR（3’untranslated region）加入线粒体表面靶向mRNA序列。MTS序列来源于人COX10 蛋白的MTS序列，长度为28个氨基酸，编码氨基酸序列详见SEQ ID NO.2。线粒体表面靶向mRNA序列来源于人ATP5B mRNA（GenBank ID：NM_001686.3）序列，序列信息详见SEQ ID NO.4。MTS序列选择参考文献（Bonnet C, et al. Rejuvenation Res. 2007; 10(2): 127-144.）。线粒体表面靶向mRNA序列选择参考文献（Sylvestre J, et al. Mol Biol Cell. 2003; 14(9):3848-3856.）。
根据上述思路构建靶向线粒体的绿色荧光蛋白（EGFP）表达AAV载体pAAV-CAM-EGFP-ATP5B。设计合成了含有人COX10 蛋白MTS编码序列（SEQ ID NO.2）、EGFP编码序列（SEQ ID NO.14）和人ATP5B mRNA中靶向线粒体表面序列（SEQ ID NO.4）的融合序列MTS-EGFP-ATP5B（SEQ ID NO.20）。在MTS-EGFP-ATP5B序列的两端分别添加KpnI和BamHI酶切位点，以方便克隆。将添加酶切位点的MTS-EGFP-ATP5B序列发送南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57-1.8K（南京金斯瑞生物科技有限公司）载体，得到pUC57-1.8K-MTS-EGFP-ATP5B载体。KpnI和BamHI双酶切消化pUC57-1.8K-MTS-EGFP-ATP5B载体，回收长度约为1.0kb的MTS-EGFP-ATP5B序列片段备用。KpnI和BamHI双酶切消化pscAAV2neo-CAM载体，回收长度为6.6kb的载体片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coli JM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pscAAV-CAM-EGFP-ATP5B（图4）。
进一步，我们构建了人源优化的ND4表达双链AAV载体pscAAV-CAM-ocND4-ATP5B。设计合成了含有人COX10 蛋白MTS编码序列（SEQ ID NO.2）、人源化的ND4核基因编码序列ocND4（SEQ ID NO.6）和人ATP5B mRNA中靶向线粒体表面序列（SEQ ID NO.4）的融合序列MTS-ocND4-ATP5B（SEQ ID NO.21）。在MTS-ocND4-ATP5B序列的两端分别添加KpnI和BamHI酶切位点，以方便克隆。将添加酶切位点的MTS-ocND4-ATP5B序列发送南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57-1.8K（南京金斯瑞生物科技有限公司）载体，得到pUC57-1.8K-MTS-ocND4-ATP5B载体。KpnI和BamHI双酶切消化pUC57-1.8K-MTS-ocND4-ATP5B载体，回收长度为1.6kb的MTS-ocND4-ATP5B序列片段备用。KpnI和BamHI双酶切消化pscAAV2neo-CAM载体，回收长度为6.6kb的载体片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coli JM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pscAAV-CAM-ocND4-ATP5B质粒（图7）。
最后，我们构建了用于包装转导线粒体的AAV载体质粒pscAAV-HSP-mND4（图8）。设计合成了含有人线粒体重链启动子（HSP）（SEQ ID NO.7）、人线粒体突变ND4基因（G11778A）(mND4)（SEQ ID NO.7）的融合序列HSP-mND4（SEQ ID NO.22）。HSP序列来源于人线粒体基因组（GenBank ID：MF152677.1）。mND4序列由人线粒体基因组（GenBank ID：MF152677.1）中ND4基因突变而来，将基因组中11778位的“G”突变为“A”。在HSP-mND4序列的两端分别添加XhoI和BglII酶切位点，以方便克隆。将添加酶切位点的HSP-mND4序列发送南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57-1.8K（南京金斯瑞生物科技有限公司）载体，得到pUC57-1.8K- HSP-mND4载体。XhoI和BglII双酶切消化pUC57-1.8K- HSP-mND4载体，回收长度为1.4kb的HSP-mND4序列片段备用。XhoI和BglII双酶切消化pscAAV2neo-CAM载体，回收长度为6.1kb的载体片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coli JM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pscAAV-HSP-mND4（图8）。
（3）AAV载体包装外壳质粒构建
参考文献（Warrington KH Jr，et al. J Virol. 2004;78(12): 6595-6609. Yu H，etal. Mol Vis. 2012;18:1668-1683.），我们首先构建了高效靶向转导线粒体的AAV载体包装外壳质粒之一，pAAV-VP2A-COX8-EGFP（图9）。以AAV Helper Free System中的pAAV-R2C2质粒（Agilent Technologies，美国）为基础，参考文献（Warrington KH Jr，et al. JVirol. 2004;78(12): 6595-6609.）将VP1蛋白中的第1位甲硫氨酸突变为亮氨酸（对应密码子由“ATG”突变为“CTG”）、第138位苏氨酸突变为甲硫氨酸（对应密码子由“ACG”突变为“ATG”），得到的序列命名为VP2A，序列信息见SEQ ID NO.23。依据文献（Warrington KH Jr，et al. J Virol. 2004;78(12): 6595-6609.）在VP2A基因第414位和第415位碱基之间（即第138位甲硫氨酸密码子后）插入“COX8-EGFP”编码序列，得到VP2A-COX8-EGFP，序列信息见SEQ ID NO.24。COX8-EGFP序列来源参考文献（Yu H，et al. Mol Vis. 2012;18:1668-1683.），序列信息详见SEQ ID NO.8。用VP2A-COX8-EGFP序列替换pAAV-R2C2质粒中Cap2编码序列，获得质粒pAAV-VP2A-COX8-EGFP的序列信息。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成pAAV-VP2A-COX8-EGFP中HindIII和PmeI酶切位点之间序列且包含HindIII和PmeI两个酶切位点，合成序列命名为VP2A-COX8-EGFP-HP，序列信息详见SEQ ID NO.25。将合成VP2A-COX8-EGFP-HP序列克隆入pUC57-1.8K载体（南京金斯瑞生物科技有限公司），得到pUC57-1.8K-VP2A-COX8-EGFP-HP载体。HindIII和PmeI双酶切消化pUC57-1.8K-VP2A-COX8-EGFP-HP载体，回收长度为3.4kb的VP2A-COX8-EGFP-HP序列片段备用。HindIII和PmeI双酶切消化pAAV-R2C2载体，回收长度为4.7kb的载体片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coliJM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pAAV-VP2A-COX8-EGFP（图9）。
接下来，我们构建了另一个高效靶向转导线粒体的AAV载体包装外壳质粒pAAV-VP1-VP3（图10）。以AAV Helper Free System中的pAAV-R2C2质粒（Agilent Technologies，美国）为基础，参考文献（Warrington KH Jr，et al. J Virol. 2004;78(12): 6595-6609.）将VP1蛋白中的第138位苏氨酸突变为丙氨酸（对应密码子由“ACG”突变为“GCG”），得到的序列命名为VP1-VP3，序列信息见SEQ ID NO.10。用VP1-VP3序列替换pAAV-R2C2质粒中Cap2编码序列，获得质粒pAAV-VP1-VP3的序列信息。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成pAAV-VP1-VP3中HindIII和PmeI酶切位点之间序列且包含HindIII和PmeI两个酶切位点，合成序列命名为VP1-VP3-HP，序列信息详见SEQ ID NO.26。将合成VP1-VP3-HP序列克隆入pUC57-1.8K载体（南京金斯瑞生物科技有限公司），得到pUC57-1.8K-VP1-VP3-HP载体。HindIII和PmeI双酶切消化pUC57-1.8K-VP1-VP3-HP载体，回收长度为2.7kb的VP1-VP3-HP序列片段备用。HindIII和PmeI双酶切消化pAAV-R2C2载体，回收长度为4.7kb的载体片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coli JM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pAAV-VP1-VP3（图10）。
最后，我们构建了两种包装外壳突变AAV载体的AAV外壳突变质粒pAAV-R2C2-3YF（图12）、pAAV-R2C2-4YF（图13）。相比于pAAV-R2C2载体，pAAV-R2C2-3YF（图12）载体表达产生的AAV外壳（VP1、VP2和VP3）表面特定位置的酪氨酸突变为苯丙氨酸，具体为VP1序列中的第730位、第500位和第444位酪氨酸（Y）突变为苯丙氨酸（F）及VP2和VP3序列中同VP1序列中第730位、第500位和第444位酪氨酸位置对应的酪氨酸突变为苯丙氨酸。同样，相比于pAAV-R2C2载体，pAAV-R2C2-4YF（图13）载体表达产生的AAV外壳（VP1、VP2和VP3）表面特定位置的酪氨酸也突变为苯丙氨酸，具体为VP1序列中的第730位、第500位、第444位和第272位酪氨酸（Y）突变为苯丙氨酸（F）及VP2和VP3序列中同VP1序列中第730位、第500位、第444位和第272位酪氨酸位置对应的酪氨酸突变为苯丙氨酸。以AAV Helper Free System中的pAAV-R2C2质粒（Agilent Technologies，美国）为基础，参考文献（Zhong L，et al. Proc NatlAcad Sci USA. 2008;105(22): 7827-7832. Mowat FM，et al. Gene Ther. 2014; 21(1):96-105.），将VP1蛋白中的第730位、第500位、第444位酪氨酸（Y）突变为苯丙氨酸（F），得到的序列命名为Cap2-3YF，序列信息见SEQ ID NO.12。将VP1蛋白中的第730位、第500位、第444位和第272位酪氨酸（Y）突变为苯丙氨酸（F），得到的序列命名为Cap2-4YF，序列信息见SEQ ID NO.13。用Cap2-3YF序列或Cap2-4YF序列分别替换pAAV-R2C2质粒中Cap2编码序列，获得pAAV-R2C2-3YF或pAAV-R2C2-4YF质粒的序列信息。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成pAAV-R2C2-3YF或pAAV-R2C2-4YF质粒中HindIII和PmeI酶切位点之间序列且包含HindIII和PmeI两个酶切位点，合成序列分别命名为Cap2-3YF-HP或Cap2-4YF-HP。Cap2-3YF-HP序列信息详见SEQ ID NO.27，Cap2-4YF-HP序列信息详见SEQ ID NO.28。将合成Cap2-3YF-HP或Cap2-4YF-HP序列分别克隆入pUC57-1.8K载体（南京金斯瑞生物科技有限公司），得到pUC57-1.8K-Cap2-3YF-HP或pUC57-1.8K-Cap2-4YF-HP载体。HindIII和PmeI双酶切消化pUC57-1.8K-Cap2-3YF-HP或pUC57-1.8K-Cap2-4YF-HP载体，回收长度为2.7kb的Cap2-3YF-HP或Cap2-4YF-HP序列片段备用。HindIII和PmeI双酶切消化pAAV-R2C2载体，回收长度为4.7kb的载体片段备用。将Cap2-3YF-HP或Cap2-4YF-HP序列片段分别同回收载体片段连接后，转化E.coli JM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pAAV-R2C2-3YF（图12）或pAAV-R2C2-4YF（图13）载体。
实施例2 重组AAV病毒制备及检定
参照文献（Xiao X, et al. J Virol. 1998;72(3):2224-2232.），应用三质粒包装系统包装重组AAV病毒，采用氯化铯密度梯度离心法分离纯化包装得到AAV病毒。简要地，AAV载体质粒（pAAV-CMV-EGFP-COX10、pscAAV-CAM-EGFP-ATP5B、pAAV-CMV-ND4-COX10、pAAV-CMV-ocND4-COX10或pscAAV-CAM-ocND4-ATP5B）、辅助质粒（pHelper）和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒（pAAV-DJ（用于包装AAVDJ病毒）、pAAV-R2C2、pAAV-R2C2-3YF或pAAV-R2C2-4YF）按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到AAVDJ-EGFP-COX10、scAAVDJ-EGFP-ATP5B、AAV2-EGFP-COX10、scAAV2-EGFP-ATP5B、AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10、scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B 、scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B等9重组病毒。
参考文献（Warrington KH Jr，et al. J Virol. 2004;78(12): 6595-6609.），应用四质粒包装系统包装重组AAV病毒scAAV2-HSP-mND4，采用氯化铯密度梯度离心法分离纯化包装得到AAV病毒。简要地，AAV载体质粒（pscAAV-HSP-mND4）、辅助质粒（pHelper）和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒（pAAV-VP2A-COX8-EGFP、pAAV-VP1-VP3）按照1:1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到scAAV2-HSP-mND4重组病毒。
采用定量PCR方法测定制备得到AAV病毒的基因组滴度。其中，AAVDJ-EGFP-COX10、scAAVDJ-EGFP-ATP5B、AAV2-EGFP-COX10、scAAV2-EGFP-ATP5B等4种病毒定量PCR检测时采用针对EGFP序列的引物和探针。AAV2-ND4-COX10病毒采用针对ND4序列的引物和探针。AAV2-ocND4-COX10、scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B 、scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B采用针对ocND4序列的引物和探针。scAAV2-HSP-mND4病毒采用针对mND4序列的引物和探针。
以AAVDJ-EGFP-COX10、scAAVDJ-EGFP-ATP5B、AAV2-EGFP-COX10、scAAV2-EGFP-ATP5B等4种病毒的定量PCR检测过程为例，示意操作过程。其他病毒的检测过程类似，只需要替换对应的检测引物、探针和质粒DNA标准品即可。具体过程如下：
针对EGFP序列设计定量PCR检测用引物和探针：
EGFP-Q-F：5’- CACATGAAGCAGCACGACTT-3’ (SEQ ID NO.29)
EGFP-Q-R：5’- TCGCCCTTGAAGAAGATGGT-3’ (SEQ ID NO.30)
EGFP-Q-P：5’- AGTCCGCCATGCCCGAAGGCT-3’ (SEQ ID NO.31)
EGFP-Q-F和EGFP-Q-R为引物，EGFP-Q-P为探针。探针5’端用FAM荧光蛋白标记，3’端连接BlackBerry quencher。引物和探针由Thermofisher Scientific合成。以EGFP-Q-F和EGFP-Q-R为引物特异性地扩增EGFP序列中长度为80bp片段，采用TaqMan探针结合法，以108拷贝数/μl的pAAV-CMV-EGFP-COX10质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用PremixEx Taq (Probe qPCR)试剂（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500fast，ABI）检测病毒基因组滴度。操作过程参见Premix Ex Taq (Probe qPCR)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献（Aurnhammer C, et al. Hum Gene Ther Methods. 2012; 23(1): 18-28.）。
AAV2-ND4-COX10病毒定量PCR检测的标准品为108拷贝数/μl的pAAV-CMV-ND4-COX10质粒及其10倍梯度稀释的样品。针对ND4序列的定量PCR检测引物和探针：
ND4-Q-F：5’- CTAAAGCCCATGTCGAAGCC-3’ (SEQ ID NO.32)
ND4-Q-R：5’- GAGGCGCATCATACCATAGC-3’ (SEQ ID NO.33)
ND4-Q-P：5’- TGCGGCAAGTACCATTGACCCAGCG-3’ (SEQ ID NO.34)
定量PCR检测时扩增片段大小为89bp。
AAV2-ocND4-COX10、scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B 、scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B病毒定量PCR检测的标准品为108拷贝数/μl的pAAV-CMV-ocND4-COX10质粒及其10倍梯度稀释的样品。针对ND4序列的定量PCR检测引物和探针：
ocND4-Q-F：5’- CTGAACATCCTGCTGCTGAC-3’ (SEQ ID NO.35)
ocND4-Q-R：5’- ACCATGAAGGCCATGGTGTA-3’ (SEQ ID NO.36)
ocND4-Q-P：5’- ACTGACCGCCCAGGAGCTGTCC-3’ (SEQ ID NO.37)
定量PCR检测时扩增片段大小为95bp。
scAAV2-HSP-mND4病毒定量PCR检测的标准品为108拷贝数/μl的pscAAV-HSP-mND4质粒及其10倍梯度稀释的样品。针对ND4序列的定量PCR检测引物和探针：
mND4-Q-F：5’- CCCACCTTGGCTATCATCAC-3’ (SEQ ID NO.38)
mND4-Q-R：5’- TAGGAAGTATGTGCCTGCGT-3’ (SEQ ID NO.39)
mND4-Q-P：5’- AGGCAACCAGCCAGAACGCCTGA-3’ (SEQ ID NO.40)
定量PCR检测时扩增片段大小为69bp。
实施例3 携带EGFP报告基因AAV病毒体外细胞实验
采用三质粒包装系统，将pAAV-CMV-EGFP-COX10和pscAAV-CAM-EGFP-ATP5B质粒分别包装成AAVDJ-EGFP-COX10和scAAVDJ-EGFP-ATP5B。包装得到的AAVDJ-EGFP-COX10和scAAVDJ-EGFP-ATP5B病毒分别以1×105vg/cell的剂量感染人BJ细胞（购自ATCC（American TissueCulture Collection，美国组织培养库），ATCC NO.CRL-2522）。病毒转导细胞72h后，共聚焦显微镜（Leica TSC 4D）观察绿色荧光蛋白表达情况及在细胞中分布。用ATP合成酶α亚基定位细胞中线粒体。同一视野下，细胞内绿色荧光蛋白分布和ATP合成酶α亚基分布的重叠区域即为线粒体中绿色荧光蛋白的分布区域。检测操作过程参见文献（Bonnet C，et al.Rejuvenation Res. 2007;10(2): 127-144.）。检测结果如图14所示。从图14的结果可知，两种病毒都能够有效地转导人BJ细胞，且在细胞内表达绿色荧光蛋白。表达产生绿色荧光蛋白在细胞内的分布区域同ATP合成酶α亚基的分布区域一致，说明表达绿色荧光蛋白有效地定位于线粒体中，提示线粒体定位肽加上线粒体靶向mRNA序列策略可有效地将细胞核表达产生基因定位于线粒体中，使线粒体基因在细胞核中异位表达成为可能。
实施例4 玻璃体腔注射scAAV2-EGFP-ATP5B转导小鼠视网膜细胞实验
采用三质粒包装系统，将pscAAV-CAM-EGFP-ATP5B质粒分别包装成scAAV2-EGFP-ATP5B。包装得到的scAAV2-EGFP-ATP5B病毒分别以2×109vg/1μL/只眼的剂量经玻璃体腔注射C57BL/6J小鼠。注射病毒2周后，处死小鼠，分离小鼠视网膜，冰冻切片后，用细胞核染料DAPI处理标记细胞核，荧光显微镜下分别观察绿色荧光蛋白表达情况和DAPI染料结合情况。同一视野下两种观察情况下成像结果叠加，得到如图15所示的结果。
从图15的结果可知，玻璃体腔注射scAAV2-EGFP-ATP5B病毒后，神经节细胞层（GCL，ganglion cell layer）细胞，内核细胞层（INL，inner nuclear cell）细胞，视网膜色素上皮细胞层（RPE，retinal pigment epithelium）细胞都检测到绿色荧光蛋白表达，其中GCL细胞绿色荧光蛋白表达强度最高，说明scAAV2-EGFP-ATP5B病毒经玻璃体腔注射后能够有效地转导神经节细胞。而外核细胞层（ONL，outer nuclear layer）细胞中几乎未检测到绿色荧光蛋白表达，说明scAAV2-EGFP-ATP5B病毒经玻璃体腔注射后对ONL细胞转导效率偏低。
实施例5 不同病毒组合注射C57BL/6J小鼠实验
包装得到scAAV2-HSP-mND4、AAV2-EGFP-COX10、AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10和scAAV2-ocND4-ATP5B等5种病毒。将scAAV2-HSP-mND4病毒经玻璃体腔注射至C57BL/6J小鼠眼球中，注射剂量为2×109vg/1μL/只眼，共注射20只小鼠。注射scAAV2-HSP-mND4病毒72h后，将20只小鼠随机分为4组，每组5只小鼠。4组小鼠分别经玻璃体腔注射AAV2-EGFP-COX10或AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10以及scAAV2-ocND4-ATP5B病毒，注射剂量为2×109vg/1μL/只眼。以未注射病毒的正常C57BL/6J小鼠为对照，注射病毒2个月、6个月和12个月后，分别记录图形视网膜电位振幅、图形视网膜电位延迟时间，用光学相干断层成像术（optical coherence tomography，OCT）检测视网膜中GCL和IPL细胞层厚度。检测操作过程参见文献（Koilkonda RD，et al. Arch Ophthalmol. 2010;128(7): 876-883.），检测结果如图16、图17和图18所示。其中图16为图形视网膜电位振幅检测结果，图17为图形视网膜电位延迟时间检测结果，图18为GCL和IPL细胞层厚度检测结果。
从图16的检测结果可知，相比于未注射病毒C57BL/6J小鼠（Control），先后注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠的图形视网膜电位振幅显著降低，注射后3个不同的时间点（注射后2个月、6个月和12个月）呈现出相似的规律。这是因为scAAV2-HSP-mND4病毒转导视网膜神经节细胞后能够表达产生突变的ND4蛋白，而AAV2-EGFP-COX10病毒又不能表达产生正常的ND4蛋白，导致神经节细胞功能障碍，模拟ND4基因突变带来的生物学作用（Koilkonda RD，et al. Arch Ophthalmol. 2010;128(7): 876-883.）。相反先注射scAAV2-HSP-mND4病毒后，再注射AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10或scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位振幅则明显高于先后注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠，且再注射AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10或scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位振幅的大小关系为AAV2-ND4-COX10< AAV2-ocND4-COX10<scAAV2-ocND4-ATP5B，提示ND4编码基因人源化表达优化、双链AAV载体携带优化后的人源化表达ND4基因都能够提高病毒注射小鼠后的ND4基因表达效率。但只有再注射scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位振幅能够恢复到接近未注射病毒野生型小鼠的水平。
从图17的检测结果可知，相比于未注射病毒C57BL/6J小鼠（Control），先后注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠的图形视网膜电位延迟时间增加，注射后3个不同的时间点（注射后2个月、6个月和12个月）呈现出相似的规律。这是因为scAAV2-HSP-mND4病毒转导视网膜神经节细胞后能够表达产生突变的ND4蛋白，而AAV2-EGFP-COX10病毒又不能表达产生正常的ND4蛋白，导致神经节细胞功能障碍，模拟ND4基因突变带来的生物学作用（Koilkonda RD，et al. Arch Ophthalmol. 2010;128(7): 876-883.）。相反先注射scAAV2-HSP-mND4病毒后，再注射AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10或scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位延迟时间则明显短于先后注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠，且再注射AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10或scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位延迟时间的大小关系为AAV2-ND4-COX10>AAV2-ocND4-COX10>scAAV2-ocND4-ATP5B，提示ND4编码基因人源化表达优化、双链AAV载体携带优化后的人源化表达ND4基因都能够提高病毒注射小鼠后的ND4基因表达效率。但只有再注射scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位延迟时间接近未注射病毒野生型小鼠的水平。
从图18的检测结果可知，神经节细胞层（GCL，ganglion cell layer）和内丛状层（IPL，inner plexiform layers）总厚度变化同病毒注射后时间关系明显。病毒注射2个月后，不同病毒组合注射小鼠组间的GCL和IPL总厚度未见明显差异；病毒注射6个月后，虽然注射病毒组的GCL和IPL总厚度低于未注射病毒对照组，但差异不明显；病毒注射12个月后，先后注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠的神经节细胞层（GCL，ganglion cell layer）和内丛状层（IPL，inner plexiform layers）总厚度明显低于未注射病毒对照组小鼠以及其他3种病毒组合注射小鼠。可能的原因是GCL和IPL总厚度的变化需要时间，所以在观察初期（病毒注射2个月后和病毒注射6个月后）GCL和IPL总厚度变化不大，至病毒注射12个月后GCL和IPL总厚度观察到明显变化。病毒注射12个月后，先注射scAAV2-HSP-mND4病毒后，再注射AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10或scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠等3种病毒组合注射小鼠的GCL和IPL总厚度明显大于先后注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-ND4-COX10病毒小鼠，且再注射AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10或scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠的GCL和IPL总厚度的大小关系为AAV2-ND4-COX10<AAV2-ocND4-COX10<scAAV2-ocND4-ATP5B，提示ND4编码基因人源化表达优化、双链AAV载体携带优化后的人源化表达ND4基因都能够提高病毒注射小鼠后的ND4基因表达效率。
总之，以未注射病毒的C57BL/6J小鼠为对照，4种不同的病毒组合分别注射C57BL/6J小鼠。结果相比于未注射病毒C57BL/6J小鼠，先后注射scAAV2-HSP-mND4和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠的图形视网膜振幅电位变小、图形视网膜电位延迟时间增加以及GCL和IPL总厚度减小。scAAV2-HSP-mND4病毒采用改造后的AAV外壳，病毒外壳中含有线粒体靶向定位肽，有助于AAV病毒进入细胞后进一步转运至线粒体中，释放出病毒携带基因组，在线粒体启动子（HSP）的调控下，表达产生突变的ND4蛋白，造成视网膜中神经节细胞的损伤，形成LHON小鼠模型（Koilkonda RD，et al. Arch Ophthalmol. 2010;128(7): 876-883.）。AAV2-EGFP-COX10病毒表达产生EGFP蛋白，不表达产生ND4蛋白，故无法恢复突变ND4（mND4）蛋白对视网膜神经节细胞的损伤，导致各种LHON病理特征的出现。相反注射scAAV2-HSP-mND4病毒后，再注射表达正常ND4蛋白的病毒（AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10或scAAV2-ocND4-ATP5B）可在不同程度上缓解或恢复注射scAAV2-HSP-mND4病毒带来的生理变化，提示用AAV载体携带正常ND4蛋白表达框转导视网膜细胞可有效地治疗LHON，具有开发成为LHON基因治疗药物的潜力。而且ND4编码基因人源化表达优化、双链AAV载体携带优化后的人源化表达ND4基因等方式基因治疗药物结构设计可以提升药物的治疗效果。
实施例6 不同AAV外壳对于设计LHON基因药物有效性影响实验
本实验着眼于比较不同AAV外壳对LHON基因药物的有效性的影响。包装得到scAAV2-HSP-mND4、scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B和scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B等4种病毒。scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B和scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B等3种病毒携带相同的人源化表达优化的ND4表达框，为3种不同的AAV载体外壳病毒。scAAV2-ocND4-ATP5B为双链AAV2病毒，scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B和scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B为外壳改造后的双链AAV2病毒，具体的改造过程详见实施例1和实施例2。
将scAAV2-HSP-mND4病毒经玻璃体腔注射至C57BL/6J小鼠眼球中，注射剂量为2×109vg/1μL/只眼，共注射15只小鼠。注射scAAV2-HSP-mND4病毒72h后，将15只小鼠随机分为3组，每组5只小鼠。3组小鼠分别经玻璃体腔注射scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B或scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B病毒，注射剂量为2×109vg/1μL/只眼。以未注射病毒的正常C57BL/6J小鼠为对照，注射病毒2个月、6个月和12个月后，分别记录图形视网膜电位振幅、图形视网膜电位延迟时间，用光学相干断层成像术（optical coherencetomography，OCT）检测视网膜中GCL和IPL细胞层厚度。检测操作过程参见文献（KoilkondaRD，et al. Arch Ophthalmol. 2010;128(7): 876-883.），检测结果如图19、图20和图21所示。其中图19为图形视网膜电位振幅检测结果，图20为图形视网膜电位延迟时间检测结果，图21为GCL和IPL细胞层厚度检测结果。
从图19的检测结果可知，3种不同外壳的AAV病毒（scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B和scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B）对小鼠图形视网膜电位振幅恢复程度存在差异，注射scAAV2-ocND4-ATP5B或scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位振幅仍低于未注射病毒的C57BL/6J小鼠，而注射scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位振幅则高于未注射病毒的C57BL/6J小鼠，提示3种不同外壳的AAV病毒可能会影响药物的有效性。
从图20的检测结果可知，3种不同外壳的AAV病毒（scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B和scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B）对小鼠图形视网膜电位延迟时间的影响也存在差异，注射scAAV2-ocND4-ATP5B或scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位延迟时间仍长于未注射病毒的C57BL/6J小鼠，而注射scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位振幅则短于未注射病毒的C57BL/6J小鼠，再次提示3种不同外壳的AAV病毒可能会影响药物的有效性。
从图21的检测结果可知，神经节细胞层（GCL，ganglion cell layer）和内丛状层（IPL，inner plexiform layers）总厚度变化同病毒注射后时间关系明显。病毒注射2个月后，不同病毒组合注射小鼠组间的GCL和IPL总厚度未见明显差异；病毒注射6个月后，虽然注射病毒组的GCL和IPL总厚度低于未注射病毒对照组，但差异不明显；病毒注射12个月后，注射scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B病毒小鼠的神经节细胞层（GCL，ganglion cell layer）和内丛状层（IPL，inner plexiform layers）总厚度低于未注射病毒对照组小鼠，而注射scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B病毒小鼠的神经节细胞层（GCL，ganglioncell layer）和内丛状层（IPL，inner plexiform layers）总厚度则同未注射病毒对照组小鼠差异不大。再次证明AAV外壳可能影响LHON基因药物的有效性。
总之，以未注射病毒的C57BL/6J小鼠为对照，3种不同的病毒组合分别注射C57BL/6J小鼠，比较分析了3种不同的AAV外壳对LHON药物有效性的影响。结果发现相比于天然的AAV2外壳，改造后的AAV2外壳AAV2(AAV2(3YF)和AAV2(4YF))携带ND4蛋白表达框（scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B和scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B）表现出更好的有效性，具体为注射小鼠后的图形视网膜振幅电位恢复更好、图形视网膜电位延迟时间增加更少以及GCL和IPL总厚度减少程度更低，而且scAAV2(4YF)-ocND4-ATP5B的效果优于scAAV2(3YF)-ocND4-ATP5B。
序列表
<110> 北京五加和分子医学研究所有限公司
<120> Leber遗传性视神经病变的基因药物
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 60
tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 120
gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 180
gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 240
tacccatggt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc 300
cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg 360
gggggggggg gcgcgcgcca ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc 420
ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga 480
ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcgacg cgtgtaagtt 540
ggcgccgttt aagggatggt tggttggtgg ggtattaatg tttaattacc ttttttacag 600
<210> 3
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggccgcat ctccgcacac tctctcctca cgcctcctga caggttgcgt aggaggctct 60
gtctggtatc ttgaaagaag aact 84
<210> 3
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgagcactgg gacgcccacc gcccctttcc ctccgctgcc aggcgagcat gttgtggtaa 60
ttctggaaca caagaagaga aattgctggg tttagaacaa gattataaac gaattcggtg 120
ctcagtgatc acttgacagt tttttttttt tttaaatatt acccaaaatg ctccccaaat 180
aagaaatgca tcagctcagt cagtgaatac aaaaaaggaa ttatttttcc ctttgagggt 240
cttttataca tctctcctcc aaccccaccc tctattctgt ttcttcctcc tcacatgggg 300
gtacacatac acagcttcct cttttggttc catccttacc accacaccac acgcacactc 360
cacatgccca gcagagtggc acttggtggc cagaaagtgt gagcctcatg atctgctgtc 420
tgtagttctg tgagctcagg tccctcaaag gcctcggagc acccccttcc ttgtgactga 480
gccagggcct gcatttttgg ttttccccac cccacacatt ctcaaccata gtccttctaa 540
caataccaat agctaggacc cggctgctgt gcactgggac tggggattcc acatgtttgc 600
cttgggagtc tcaagctgga ctgccagccc ctgtcctccc ttcaccccca ttgcgtatga 660
gcatttcaga actccaagga gtcacaggca tctttatagt tcacgttaac atatagacac 720
tgttggaagc agttccttct aaaagggtag ccctggactt aataccagcc ggatacctct 780
ggcccccacc ccattactgt acctctggag tcactactgt gggtcgccac tcctctgcta 840
cacagcacgg ctttttcaag gctgtattga gaagggaagt taggaagaag ggtgtgctgg 900
gctaaccagc ccacagagct cacattcctg tcccttgggt gaaaaataca tgtccatcct 960
gatatctcct gaattcagaa attagcctcc acatgtgcaa tggctttaag agccagaagc 1020
agggttctgg gaattttgca agttacctgt ggccaggtgt ggtctcggtt accaaatacg 1080
gttacctgca gctttttagt cctttgtgct cccacgggtc tacagagtcc catctgccca 1140
aaggtcttga agcttgacag gatgttttcg attactcagt ctcccagggc actactggtc 1200
cgtaggattc gattggtcgg ggtaggagag ttaaacaaca tttaaacaga gttctctcaa 1260
aaatgtctaa agggattgta ggtagataac atccaatcac tgtttgcact tatctgaaat 1320
cttccctctt ggctgccccc aggtatttac tgtggagaac attgcatagg aatgtctgga 1380
aaaagcttct acaacttgtt acagccttca catttgtaga agctttggat c 1431
<210> 4
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggggtctttg tcctctgtac tgtctctctc cttgccccta acccaaaaag cttcattttt 60
ctgtgtaggc tgcacaagag ccttgattga agatatattc tttctgaaca gtatttaagg 120
tttccaataa aatgtacacc cctca 145
<210> 5
<211> 1464
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggccgcat ctccgcacac tctctcctca cgcctcctga caggttgcgt aggaggctct 60
gtctggtatc ttgaaagaag aactatgcta aaactaatcg tcccaacaat tatgttacta 120
ccactgacat ggctttccaa aaaacacatg atttggatca acacaaccac ccacagccta 180
attattagca tcatccctct actatttttt aaccaaatca acaacaacct atttagctgt 240
tccccaacct tttcctccga ccccctaaca acccccctcc taatgctaac tacctggctc 300
ctacccctca caatcatggc aagccaacgc cacttatcca gtgaaccact atcacgaaaa 360
aaactctacc tctctatgct aatctcccta caaatctcct taattatgac attcacagcc 420
acagaactaa tcatgtttta tatcttcttc gaaaccacac ttatccccac cttggctatc 480
atcacccgat ggggcaacca gccagaacgc ctgaacgcag gcacatactt cctattctac 540
accctagtag gctcccttcc cctactcatc gcactaattt acactcacaa caccctaggc 600
tcactaaaca ttctactact cactctcact gcccaagaac tatcaaactc ctgggccaac 660
aacttaatgt ggctagctta cacaatggct tttatggtaa agatgcctct ttacggactc 720
cacttatggc tccctaaagc ccatgtcgaa gcccccatcg ctgggtcaat ggtacttgcc 780
gcagtactct taaaactagg cggctatggt atgatgcgcc tcacactcat tctcaacccc 840
ctgacaaaac acatggccta ccccttcctt gtactatccc tatggggcat gattatgaca 900
agctccatct gcctacgaca aacagaccta aaatcgctca ttgcatactc ttcaatcagc 960
cacatggccc tcgtagtaac agccattctc atccaaaccc cctggagctt caccggcgca 1020
gtcattctca tgatcgccca cgggcttaca tcctcattac tattctgcct agcaaactca 1080
aactacgaac gcactcacag tcgcatcatg atcctctctc aaggacttca aactctactc 1140
ccactaatgg ctttttggtg gcttctagca agcctcgcta acctcgcctt accccccact 1200
attaacctac tgggagaact ctctgtgcta gtaaccacgt tctcctggtc aaatatcact 1260
ctcctactta caggactcaa catgctagtc acagccctat actccctcta catgtttacc 1320
acaacacaat ggggctcact cacccaccac attaacaaca tgaaaccctc attcacacga 1380
gaaaacaccc tcatgttcat gcacctatcc cccattctcc tcctatccct caaccccgac 1440
atcattaccg ggttttcctc ttga 1464
<210> 6
<211> 1464
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggccgcca gccctcacac actgagctcc aggctgctga ccggatgcgt gggaggcagc 60
gtgtggtatc tggagcggag aaccatgctg aagctgatcg tgcctacaat catgctgctg 120
ccactgacct ggctgagcaa gaagcacatg atctggatca ataccacaac ccactctctg 180
atcatcagca tcatccctct gctgttcttt aaccagatca acaataacct gttctcttgt 240
agcccaacat tttctagcga cccactgaca acccccctgc tgatgctgac aacctggctg 300
ctgccactga ccatcatggc ctcccagagg cacctgtcct ctgagcccct gtctcgcaag 360
aagctgtacc tgtccatgct gatctctctg cagatcagcc tgatcatgac cttcacagcc 420
accgagctga tcatgttcta catcttcttt gagacaaccc tgatccccac actggccatc 480
atcacccggt ggggcaatca gcctgagaga ctgaacgccg gcacatactt cctgttttat 540
accctggtgg gctctctgcc actgctgatc gccctgatct atacacacaa taccctgggc 600
agcctgaaca tcctgctgct gacactgacc gcccaggagc tgtccaattc ttgggccaat 660
aacctgatgt ggctggccta caccatggcc ttcatggtga agatgcccct gtatggactg 720
cacctgtggc tgccaaaggc acacgtggag gcacctatcg caggcagcat ggtgctggca 780
gccgtgctgc tgaagctggg aggctacggc atgatgcggc tgacactgat cctgaaccca 840
ctgaccaagc acatggccta tccctttctg gtgctgtccc tgtggggcat gatcatgaca 900
agctccatct gcctgagaca gaccgacctg aagtctctga tcgcctactc tagcatcagc 960
cacatggccc tggtggtgac agccatcctg atccagacac cctggagctt caccggcgcc 1020
gtgatcctga tgatcgccca cggcctgacc tcctctctgc tgttttgtct ggccaattcc 1080
aactatgaga ggacacactc ccgcatcatg atcctgtctc agggcctgca gaccctgctg 1140
cctctgatgg cattctggtg gctgctggcc tccctggcaa atctggccct gccacctacc 1200
atcaacctgc tgggcgagct gtctgtgctg gtgacaacct tcagctggtc caatatcaca 1260
ctgctgctga ccggcctgaa catgctggtg acagccctgt acagcctgta tatgtttaca 1320
accacacagt ggggctccct gacccaccac atcaataaca tgaagccctc tttcacacgg 1380
gagaataccc tgatgtttat gcacctgagc cctatcctgc tgctgtccct gaacccagat 1440
atcatcaccg gctttagctc ctga 1464
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taaccccata ccccgaacca accaaacccc aaagacac 38
<210> 8
<211> 1378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgctaaaac taatcgtccc aacaattata ttactaccac tgacatgact ttccaaaaaa 60
cacataattt gaatcaacac aaccacccac agcctaatta ttagcatcat ccctctacta 120
ttttttaacc aaatcaacaa caacctattt agctgttccc caaccttttc ctccgacccc 180
ctaacaaccc ccctcctaat actaactacc tgactcctac ccctcacaat catggcaagc 240
caacgccact tatccagtga accactatca cgaaaaaaac tctacctctc tatactaatc 300
tccctacaaa tctccttaat tataacattc acagccacag aactaatcat attttatatc 360
ttcttcgaaa ccacacttat ccccaccttg gctatcatca cccgatgagg caaccagcca 420
gaacgcctga acgcaggcac atacttccta ttctacaccc tagtaggctc ccttccccta 480
ctcatcgcac taatttacac tcacaacacc ctaggctcac taaacattct actactcact 540
ctcactgccc aagaactatc aaactcctga gccaacaact taatatgact agcttacaca 600
atagctttta tagtaaagat acctctttac ggactccact tatgactccc taaagcccat 660
gtcgaagccc ccatcgctgg gtcaatagta cttgccgcag tactcttaaa actaggcggc 720
tatggtataa tacgcctcac actcattctc aaccccctga caaaacacat agcctacccc 780
ttccttgtac tatccctatg gggcataatt ataacaagct ccatctgcct acgacaaaca 840
gacctaaaat cgctcattgc atactcttca atcagccaca tagccctcgt agtaacagcc 900
attctcatcc aaaccccctg aagcttcacc ggcgcagtca ttctcataat cgcccacggg 960
cttacatcct cattactatt ctgcctagca aactcaaact acgaacgcac tcacagtcac 1020
atcataatcc tctctcaagg acttcaaact ctactcccac taatagcttt ttgatgactt 1080
ctagcaagcc tcgctaacct cgccttaccc cccactatta acctactggg agaactctct 1140
gtgctagtaa ccacgttctc ctgatcaaat atcactctcc tacttacagg actcaacata 1200
ctagtcacag ccctatactc cctctacata tttaccacaa cacaatgggg ctcactcacc 1260
caccacatta acaacataaa accctcattc acacgagaaa acaccctcat gttcatacac 1320
ctatccccca ttctcctcct atccctcaac cccgacatca ttaccgggtt ttcctctt 1378
<210> 9
<211> 788
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgtccgtcc tgacgccgct gctgctgcgg ggcttgacag gctcggcccg gcggctccca 60
gtgccgcgcg ccaagtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg 120
tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg 180
atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc 240
cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg 300
accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc 360
gcaccatctt cttcaagggc gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg 420
gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca 480
tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca 540
agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg 600
tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc 660
ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg 720
atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc 780
tgtacaag 788
<210> 10
<211> 2208
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa ggcggctccg 420
ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480
aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540
tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600
aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660
gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720
accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780
tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840
tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900
aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960
aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020
caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080
tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140
aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200
cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260
cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320
tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ccaccacgca gtcaaggctt 1380
cagttttctc aggccggagc gagtgacatt cgggaccagt ctaggaactg gcttcctgga 1440
ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acatctgcgg ataacaacaa cagtgaatac 1500
tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560
ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620
atctttggga agcaaggctc agagaaaaca aatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680
gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740
accaacctcc agagaggcaa cagacaagca gctaccgcag atgtcaacac acaaggcgtt 1800
cttccaggca tggtctggca ggacagagat gtgtaccttc aggggcccat ctgggcaaag 1860
attccacaca cggacggaca ttttcacccc tctcccctca tgggtggatt cggacttaaa 1920
caccctcctc cacagattct catcaagaac accccggtac ctgcgaatcc ttcgaccacc 1980
ttcagtgcgg caaagtttgc ttccttcatc acacagtact ccacgggaca ggtcagcgtg 2040
gagatcgagt gggagctgca gaaggaaaac agcaaacgct ggaatcccga aattcagtac 2100
acttccaact acaacaagtc tgttaatgtg gactttactg tggacactaa tggcgtgtat 2160
tcagagcctc gccccattgg caccagatac ctgactcgta atctgtaa 2208
<210> 11
<211> 2208
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420
ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480
aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540
tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600
aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660
gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720
accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780
tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840
tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900
aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960
aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020
caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080
tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140
aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200
cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260
cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320
tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ccaccacgca gtcaaggctt 1380
cagttttctc aggccggagc gagtgacatt cgggaccagt ctaggaactg gcttcctgga 1440
ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acatctgcgg ataacaacaa cagtgaatac 1500
tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560
ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620
atctttggga agcaaggctc agagaaaaca aatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680
gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740
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<400> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggatccgccc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg 60
tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg 120
gacagatccc caggaagctc ctctgtgtcc tcataaaccc taacctcctc tacttgagag 180
gacattccaa tcataggctg cccatccacc ctctgtgtcc tcctgttaat taggtcactt 240
aacaaaaagg aaattgggta ggggtttttc acagaccgct ttctaagggt aattttaaaa 300
tatctgggaa gtcccttcca ctgctgtgtt ccagaagtgt tggtaaacag cccacaaatg 360
tcaacagcag aaacatacaa gctgtcagct ttgcacaagg gcccaacacc ctgctcatca 420
agaagcactg tggttgctgt gttagtaatg tgcaaaacag gaggcacatt ttccccacct 480
gtgtaggttc caaaatatct agtgttttca tttttacttg gatcaggaac ccagcactcc 540
actggataag cattatcctt atccaaaaca gccttgtggt cagtgttcat ctgctgactg 600
tcaactgtag cattttttgg ggttacagtt tgagcaggat atttggtcct gtagtttgct 660
aacacaccct gcagctccaa aggttcccca ccaacagcaa aaaaatgaaa atttgaccct 720
tgaatgggtt ttccagcacc attttcatga gttttttgtg tccctgaatg caagtttaac 780
atagcagtta ccccaataac ctcagtttta acagtaacag cttcccacat caaaatattt 840
ccacaggtta agtcctcatt taaat 865
<210> 20
<211> 956
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atggccgcca gccctcacac actgagctcc aggctgctga ccggatgcgt gggaggcagc 60
gtgtggtatc tggagcggag aaccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 120
gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 180
gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 240
aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 300
agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 360
tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag ggcgacggca actacaagac ccgcgccgag 420
gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 480
gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 540
atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 600
gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 660
cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 720
aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 780
ggcatggacg agctgtacaa gtaatgtcga cggggtcttt gtcctctgta ctgtctctct 840
ccttgcccct aacccaaaaa gcttcatttt tctgtgtagg ctgcacaaga gccttgattg 900
aagatatatt ctttctgaac agtatttaag gtttccaata aaatgtacac ccctca 956
<210> 21
<211> 1618
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atggccgcca gccctcacac actgagctcc aggctgctga ccggatgcgt gggaggcagc 60
gtgtggtatc tggagcggag aaccatgctg aagctgatcg tgcctacaat catgctgctg 120
ccactgacct ggctgagcaa gaagcacatg atctggatca ataccacaac ccactctctg 180
atcatcagca tcatccctct gctgttcttt aaccagatca acaataacct gttctcttgt 240
agcccaacat tttctagcga cccactgaca acccccctgc tgatgctgac aacctggctg 300
ctgccactga ccatcatggc ctcccagagg cacctgtcct ctgagcccct gtctcgcaag 360
aagctgtacc tgtccatgct gatctctctg cagatcagcc tgatcatgac cttcacagcc 420
accgagctga tcatgttcta catcttcttt gagacaaccc tgatccccac actggccatc 480
atcacccggt ggggcaatca gcctgagaga ctgaacgccg gcacatactt cctgttttat 540
accctggtgg gctctctgcc actgctgatc gccctgatct atacacacaa taccctgggc 600
agcctgaaca tcctgctgct gacactgacc gcccaggagc tgtccaattc ttgggccaat 660
aacctgatgt ggctggccta caccatggcc ttcatggtga agatgcccct gtatggactg 720
cacctgtggc tgccaaaggc acacgtggag gcacctatcg caggcagcat ggtgctggca 780
gccgtgctgc tgaagctggg aggctacggc atgatgcggc tgacactgat cctgaaccca 840
ctgaccaagc acatggccta tccctttctg gtgctgtccc tgtggggcat gatcatgaca 900
agctccatct gcctgagaca gaccgacctg aagtctctga tcgcctactc tagcatcagc 960
cacatggccc tggtggtgac agccatcctg atccagacac cctggagctt caccggcgcc 1020
gtgatcctga tgatcgccca cggcctgacc tcctctctgc tgttttgtct ggccaattcc 1080
aactatgaga ggacacactc ccgcatcatg atcctgtctc agggcctgca gaccctgctg 1140
cctctgatgg cattctggtg gctgctggcc tccctggcaa atctggccct gccacctacc 1200
atcaacctgc tgggcgagct gtctgtgctg gtgacaacct tcagctggtc caatatcaca 1260
ctgctgctga ccggcctgaa catgctggtg acagccctgt acagcctgta tatgtttaca 1320
accacacagt ggggctccct gacccaccac atcaataaca tgaagccctc tttcacacgg 1380
gagaataccc tgatgtttat gcacctgagc cctatcctgc tgctgtccct gaacccagat 1440
atcatcaccg gctttagctc ctgataagtc gacggggtct ttgtcctctg tactgtctct 1500
ctccttgccc ctaacccaaa aagcttcatt tttctgtgta ggctgcacaa gagccttgat 1560
tgaagatata ttctttctga acagtattta aggtttccaa taaaatgtac acccctca 1618
<210> 22
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
taaccccata ccccgaacca accaaacccc aaagacacgg taccatgcta aaactaatcg 60
tcccaacaat tatattacta ccactgacat gactttccaa aaaacacata atttgaatca 120
acacaaccac ccacagccta attattagca tcatccctct actatttttt aaccaaatca 180
acaacaacct atttagctgt tccccaacct tttcctccga ccccctaaca acccccctcc 240
taatactaac tacctgactc ctacccctca caatcatggc aagccaacgc cacttatcca 300
gtgaaccact atcacgaaaa aaactctacc tctctatact aatctcccta caaatctcct 360
taattataac attcacagcc acagaactaa tcatatttta tatcttcttc gaaaccacac 420
ttatccccac cttggctatc atcacccgat gaggcaacca gccagaacgc ctgaacgcag 480
gcacatactt cctattctac accctagtag gctcccttcc cctactcatc gcactaattt 540
acactcacaa caccctaggc tcactaaaca ttctactact cactctcact gcccaagaac 600
tatcaaactc ctgagccaac aacttaatat gactagctta cacaatagct tttatagtaa 660
agatacctct ttacggactc cacttatgac tccctaaagc ccatgtcgaa gcccccatcg 720
ctgggtcaat agtacttgcc gcagtactct taaaactagg cggctatggt ataatacgcc 780
tcacactcat tctcaacccc ctgacaaaac acatagccta ccccttcctt gtactatccc 840
tatggggcat aattataaca agctccatct gcctacgaca aacagaccta aaatcgctca 900
ttgcatactc ttcaatcagc cacatagccc tcgtagtaac agccattctc atccaaaccc 960
cctgaagctt caccggcgca gtcattctca taatcgccca cgggcttaca tcctcattac 1020
tattctgcct agcaaactca aactacgaac gcactcacag tcacatcata atcctctctc 1080
aaggacttca aactctactc ccactaatag ctttttgatg acttctagca agcctcgcta 1140
acctcgcctt accccccact attaacctac tgggagaact ctctgtgcta gtaaccacgt 1200
tctcctgatc aaatatcact ctcctactta caggactcaa catactagtc acagccctat 1260
actccctcta catatttacc acaacacaat ggggctcact cacccaccac attaacaaca 1320
taaaaccctc attcacacga gaaaacaccc tcatgttcat acacctatcc cccattctcc 1380
tcctatccct caaccccgac atcattaccg ggttttcctc tttaa 1425
<210> 23
<211> 2205
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa ggctccggga 420
aaaaagaggc cggtagagca ctctcctgtg gagccagact cctcctcggg aaccggaaag 480
gcgggccagc agcctgcaag aaaaagattg aattttggtc agactggaga cgcagactca 540
gtacctgacc cccagcctct cggacagcca ccagcagccc cctctggtct gggaactaat 600
acgatggcta caggcagtgg cgcaccaatg gcagacaata acgagggcgc cgacggagtg 660
ggtaattcct cgggaaattg gcattgcgat tccacatgga tgggcgacag agtcatcacc 720
accagcaccc gaacctgggc cctgcccacc tacaacaacc acctctacaa acaaatttcc 780
agccaatcag gagcctcgaa cgacaatcac tactttggct acagcacccc ttgggggtat 840
tttgacttca acagattcca ctgccacttt tcaccacgtg actggcaaag actcatcaac 900
aacaactggg gattccgacc caagagactc aacttcaagc tctttaacat tcaagtcaaa 960
gaggtcacgc agaatgacgg tacgacgacg attgccaata accttaccag cacggttcag 1020
gtgtttactg actcggagta ccagctcccg tacgtcctcg gctcggcgca tcaaggatgc 1080
ctcccgccgt tcccagcaga cgtcttcatg gtgccacagt atggatacct caccctgaac 1140
aacgggagtc aggcagtagg acgctcttca ttttactgcc tggagtactt tccttctcag 1200
atgctgcgta ccggaaacaa ctttaccttc agctacactt ttgaggacgt tcctttccac 1260
agcagctacg ctcacagcca gagtctggac cgtctcatga atcctctcat cgaccagtac 1320
ctgtattact tgagcagaac aaacactcca agtggaacca ccacgcagtc aaggcttcag 1380
ttttctcagg ccggagcgag tgacattcgg gaccagtcta ggaactggct tcctggaccc 1440
tgttaccgcc agcagcgagt atcaaagaca tctgcggata acaacaacag tgaatactcg 1500
tggactggag ctaccaagta ccacctcaat ggcagagact ctctggtgaa tccgggcccg 1560
gccatggcaa gccacaagga cgatgaagaa aagttttttc ctcagagcgg ggttctcatc 1620
tttgggaagc aaggctcaga gaaaacaaat gtggacattg aaaaggtcat gattacagac 1680
gaagaggaaa tcaggacaac caatcccgtg gctacggagc agtatggttc tgtatctacc 1740
aacctccaga gaggcaacag acaagcagct accgcagatg tcaacacaca aggcgttctt 1800
ccaggcatgg tctggcagga cagagatgtg taccttcagg ggcccatctg ggcaaagatt 1860
ccacacacgg acggacattt tcacccctct cccctcatgg gtggattcgg acttaaacac 1920
cctcctccac agattctcat caagaacacc ccggtacctg cgaatccttc gaccaccttc 1980
agtgcggcaa agtttgcttc cttcatcaca cagtactcca cgggacaggt cagcgtggag 2040
atcgagtggg agctgcagaa ggaaaacagc aaacgctgga atcccgaaat tcagtacact 2100
tccaactaca acaagtctgt taatgtggac tttactgtgg acactaatgg cgtgtattca 2160
gagcctcgcc ccattggcac cagatacctg actcgtaatc tgtaa 2205
<210> 24
<211> 2993
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ctggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gatgtccgtc 420
ctgacgccgc tgctgctgcg gggcttgaca ggctcggccc ggcggctccc agtgccgcgc 480
gccaagtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg 540
acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct 600
acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca 660
ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga 720
agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct 780
tcttcaaggg cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc 840
tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc 900
acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga 960
acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg 1020
ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc 1080
actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg 1140
tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagg 1200
ctccgggaaa aaagaggccg gtagagcact ctcctgtgga gccagactcc tcctcgggaa 1260
ccggaaaggc gggccagcag cctgcaagaa aaagattgaa ttttggtcag actggagacg 1320
cagactcagt acctgacccc cagcctctcg gacagccacc agcagccccc tctggtctgg 1380
gaactaatac gatggctaca ggcagtggcg caccaatggc agacaataac gagggcgccg 1440
acggagtggg taattcctcg ggaaattggc attgcgattc cacatggatg ggcgacagag 1500
tcatcaccac cagcacccga acctgggccc tgcccaccta caacaaccac ctctacaaac 1560
aaatttccag ccaatcagga gcctcgaacg acaatcacta ctttggctac agcacccctt 1620
gggggtattt tgacttcaac agattccact gccacttttc accacgtgac tggcaaagac 1680
tcatcaacaa caactgggga ttccgaccca agagactcaa cttcaagctc tttaacattc 1740
aagtcaaaga ggtcacgcag aatgacggta cgacgacgat tgccaataac cttaccagca 1800
cggttcaggt gtttactgac tcggagtacc agctcccgta cgtcctcggc tcggcgcatc 1860
aaggatgcct cccgccgttc ccagcagacg tcttcatggt gccacagtat ggatacctca 1920
ccctgaacaa cgggagtcag gcagtaggac gctcttcatt ttactgcctg gagtactttc 1980
cttctcagat gctgcgtacc ggaaacaact ttaccttcag ctacactttt gaggacgttc 2040
ctttccacag cagctacgct cacagccaga gtctggaccg tctcatgaat cctctcatcg 2100
accagtacct gtattacttg agcagaacaa acactccaag tggaaccacc acgcagtcaa 2160
ggcttcagtt ttctcaggcc ggagcgagtg acattcggga ccagtctagg aactggcttc 2220
ctggaccctg ttaccgccag cagcgagtat caaagacatc tgcggataac aacaacagtg 2280
aatactcgtg gactggagct accaagtacc acctcaatgg cagagactct ctggtgaatc 2340
cgggcccggc catggcaagc cacaaggacg atgaagaaaa gttttttcct cagagcgggg 2400
ttctcatctt tgggaagcaa ggctcagaga aaacaaatgt ggacattgaa aaggtcatga 2460
ttacagacga agaggaaatc aggacaacca atcccgtggc tacggagcag tatggttctg 2520
tatctaccaa cctccagaga ggcaacagac aagcagctac cgcagatgtc aacacacaag 2580
gcgttcttcc aggcatggtc tggcaggaca gagatgtgta ccttcagggg cccatctggg 2640
caaagattcc acacacggac ggacattttc acccctctcc cctcatgggt ggattcggac 2700
ttaaacaccc tcctccacag attctcatca agaacacccc ggtacctgcg aatccttcga 2760
ccaccttcag tgcggcaaag tttgcttcct tcatcacaca gtactccacg ggacaggtca 2820
gcgtggagat cgagtgggag ctgcagaagg aaaacagcaa acgctggaat cccgaaattc 2880
agtacacttc caactacaac aagtctgtta atgtggactt tactgtggac actaatggcg 2940
tgtattcaga gcctcgcccc attggcacca gatacctgac tcgtaatctg taa 2993
<210> 25
<211> 3454
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aagcttcgat caactacgca gacaggtacc aaaacaaatg ttctcgtcac gtgggcatga 60
atctgatgct gtttccctgc agacaatgcg agagaatgaa tcagaattca aatatctgct 120
tcactcacgg acagaaagac tgtttagagt gctttcccgt gtcagaatct caacccgttt 180
ctgtcgtcaa aaaggcgtat cagaaactgt gctacattca tcatatcatg ggaaaggtgc 240
cagacgcttg cactgcctgc gatctggtca atgtggattt ggatgactgc atctttgaac 300
aataaatgat ttaaatcagg tctggctgcc gatggttatc ttccagattg gctcgaggac 360
actctctctg aaggaataag acagtggtgg aagctcaaac ctggcccacc accaccaaag 420
cccgcagagc ggcataagga cgacagcagg ggtcttgtgc ttcctgggta caagtacctc 480
ggacccttca acggactcga caagggagag ccggtcaacg aggcagacgc cgcggccctc 540
gagcacgaca aagcctacga ccggcagctc gacagcggag acaacccgta cctcaagtac 600
aaccacgccg acgcggagtt tcaggagcgc cttaaagaag atacgtcttt tgggggcaac 660
ctcggacgag cagtcttcca ggcgaaaaag agggttcttg aacctctggg cctggttgag 720
gaacctgtta agatgtccgt cctgacgccg ctgctgctgc ggggcttgac aggctcggcc 780
cggcggctcc cagtgccgcg cgccaagtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg 840
tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 900
agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca 960
agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca 1020
gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 1080
acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg gcgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 1140
tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 1200
aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 1260
tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 1320
aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 1380
ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca 1440
acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg 1500
gcatggacga gctgtacaag gctccgggaa aaaagaggcc ggtagagcac tctcctgtgg 1560
agccagactc ctcctcggga accggaaagg cgggccagca gcctgcaaga aaaagattga 1620
attttggtca gactggagac gcagactcag tacctgaccc ccagcctctc ggacagccac 1680
cagcagcccc ctctggtctg ggaactaata cgatggctac aggcagtggc gcaccaatgg 1740
cagacaataa cgagggcgcc gacggagtgg gtaattcctc gggaaattgg cattgcgatt 1800
ccacatggat gggcgacaga gtcatcacca ccagcacccg aacctgggcc ctgcccacct 1860
acaacaacca cctctacaaa caaatttcca gccaatcagg agcctcgaac gacaatcact 1920
actttggcta cagcacccct tgggggtatt ttgacttcaa cagattccac tgccactttt 1980
caccacgtga ctggcaaaga ctcatcaaca acaactgggg attccgaccc aagagactca 2040
acttcaagct ctttaacatt caagtcaaag aggtcacgca gaatgacggt acgacgacga 2100
ttgccaataa ccttaccagc acggttcagg tgtttactga ctcggagtac cagctcccgt 2160
acgtcctcgg ctcggcgcat caaggatgcc tcccgccgtt cccagcagac gtcttcatgg 2220
tgccacagta tggatacctc accctgaaca acgggagtca ggcagtagga cgctcttcat 2280
tttactgcct ggagtacttt ccttctcaga tgctgcgtac cggaaacaac tttaccttca 2340
gctacacttt tgaggacgtt cctttccaca gcagctacgc tcacagccag agtctggacc 2400
gtctcatgaa tcctctcatc gaccagtacc tgtattactt gagcagaaca aacactccaa 2460
gtggaaccac cacgcagtca aggcttcagt tttctcaggc cggagcgagt gacattcggg 2520
accagtctag gaactggctt cctggaccct gttaccgcca gcagcgagta tcaaagacat 2580
ctgcggataa caacaacagt gaatactcgt ggactggagc taccaagtac cacctcaatg 2640
gcagagactc tctggtgaat ccgggcccgg ccatggcaag ccacaaggac gatgaagaaa 2700
agttttttcc tcagagcggg gttctcatct ttgggaagca aggctcagag aaaacaaatg 2760
tggacattga aaaggtcatg attacagacg aagaggaaat caggacaacc aatcccgtgg 2820
ctacggagca gtatggttct gtatctacca acctccagag aggcaacaga caagcagcta 2880
ccgcagatgt caacacacaa ggcgttcttc caggcatggt ctggcaggac agagatgtgt 2940
accttcaggg gcccatctgg gcaaagattc cacacacgga cggacatttt cacccctctc 3000
ccctcatggg tggattcgga cttaaacacc ctcctccaca gattctcatc aagaacaccc 3060
cggtacctgc gaatccttcg accaccttca gtgcggcaaa gtttgcttcc ttcatcacac 3120
agtactccac gggacaggtc agcgtggaga tcgagtggga gctgcagaag gaaaacagca 3180
aacgctggaa tcccgaaatt cagtacactt ccaactacaa caagtctgtt aatgtggact 3240
ttactgtgga cactaatggc gtgtattcag agcctcgccc cattggcacc agatacctga 3300
ctcgtaatct gtaattgctt gttaatcaat aaaccgttta attcgtttca gttgaacttt 3360
ggtctctgcg tatttctttc ttatctagtt tccatggcta cgtagataag tagcatggcg 3420
ggttaatcat taactacagc ccgggcgttt aaac 3454
<210> 26
<211> 2669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aagcttcgat caactacgca gacaggtacc aaaacaaatg ttctcgtcac gtgggcatga 60
atctgatgct gtttccctgc agacaatgcg agagaatgaa tcagaattca aatatctgct 120
tcactcacgg acagaaagac tgtttagagt gctttcccgt gtcagaatct caacccgttt 180
ctgtcgtcaa aaaggcgtat cagaaactgt gctacattca tcatatcatg ggaaaggtgc 240
cagacgcttg cactgcctgc gatctggtca atgtggattt ggatgactgc atctttgaac 300
aataaatgat ttaaatcagg tatggctgcc gatggttatc ttccagattg gctcgaggac 360
actctctctg aaggaataag acagtggtgg aagctcaaac ctggcccacc accaccaaag 420
cccgcagagc ggcataagga cgacagcagg ggtcttgtgc ttcctgggta caagtacctc 480
ggacccttca acggactcga caagggagag ccggtcaacg aggcagacgc cgcggccctc 540
gagcacgaca aagcctacga ccggcagctc gacagcggag acaacccgta cctcaagtac 600
aaccacgccg acgcggagtt tcaggagcgc cttaaagaag atacgtcttt tgggggcaac 660
ctcggacgag cagtcttcca ggcgaaaaag agggttcttg aacctctggg cctggttgag 720
gaacctgtta aggcggctcc gggaaaaaag aggccggtag agcactctcc tgtggagcca 780
gactcctcct cgggaaccgg aaaggcgggc cagcagcctg caagaaaaag attgaatttt 840
ggtcagactg gagacgcaga ctcagtacct gacccccagc ctctcggaca gccaccagca 900
gccccctctg gtctgggaac taatacgatg gctacaggca gtggcgcacc aatggcagac 960
aataacgagg gcgccgacgg agtgggtaat tcctcgggaa attggcattg cgattccaca 1020
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aaccacctct acaaacaaat ttccagccaa tcaggagcct cgaacgacaa tcactacttt 1140
ggctacagca ccccttgggg gtattttgac ttcaacagat tccactgcca cttttcacca 1200
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aagctcttta acattcaagt caaagaggtc acgcagaatg acggtacgac gacgattgcc 1320
aataacctta ccagcacggt tcaggtgttt actgactcgg agtaccagct cccgtacgtc 1380
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cagtatggat acctcaccct gaacaacggg agtcaggcag taggacgctc ttcattttac 1500
tgcctggagt actttccttc tcagatgctg cgtaccggaa acaactttac cttcagctac 1560
acttttgagg acgttccttt ccacagcagc tacgctcaca gccagagtct ggaccgtctc 1620
atgaatcctc tcatcgacca gtacctgtat tacttgagca gaacaaacac tccaagtgga 1680
accaccacgc agtcaaggct tcagttttct caggccggag cgagtgacat tcgggaccag 1740
tctaggaact ggcttcctgg accctgttac cgccagcagc gagtatcaaa gacatctgcg 1800
gataacaaca acagtgaata ctcgtggact ggagctacca agtaccacct caatggcaga 1860
gactctctgg tgaatccggg cccggccatg gcaagccaca aggacgatga agaaaagttt 1920
tttcctcaga gcggggttct catctttggg aagcaaggct cagagaaaac aaatgtggac 1980
attgaaaagg tcatgattac agacgaagag gaaatcagga caaccaatcc cgtggctacg 2040
gagcagtatg gttctgtatc taccaacctc cagagaggca acagacaagc agctaccgca 2100
gatgtcaaca cacaaggcgt tcttccaggc atggtctggc aggacagaga tgtgtacctt 2160
caggggccca tctgggcaaa gattccacac acggacggac attttcaccc ctctcccctc 2220
atgggtggat tcggacttaa acaccctcct ccacagattc tcatcaagaa caccccggta 2280
cctgcgaatc cttcgaccac cttcagtgcg gcaaagtttg cttccttcat cacacagtac 2340
tccacgggac aggtcagcgt ggagatcgag tgggagctgc agaaggaaaa cagcaaacgc 2400
tggaatcccg aaattcagta cacttccaac tacaacaagt ctgttaatgt ggactttact 2460
gtggacacta atggcgtgta ttcagagcct cgccccattg gcaccagata cctgactcgt 2520
aatctgtaat tgcttgttaa tcaataaacc gtttaattcg tttcagttga actttggtct 2580
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atcattaact acagcccggg cgtttaaac 2669
<210> 27
<211> 2669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aagcttcgat caactacgca gacaggtacc aaaacaaatg ttctcgtcac gtgggcatga 60
atctgatgct gtttccctgc agacaatgcg agagaatgaa tcagaattca aatatctgct 120
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<211> 2669
<212> DNA
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<400> 28
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<400> 29
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 39
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aggcaaccag ccagaacgcc tga 23

Claims (10)

1.人线粒体ND4基因的细胞核表达框，其特征在于，
（Ⅰ）包含细胞核启动子序列；
（Ⅱ）含有线粒体定位肽编码序列和细胞核表达ND4基因编码区序列的融合序列；
（III）线粒体表面锚定mRNA序列。
2.如权利要求1所述的细胞核启动子序列，具体为人为设计的CAM启动子，序列信息见SEQ ID NO.1。
3.如权利要求1所述的融合序列，序列信息见SEQ ID NO.6。
4.如权利要求1所述的线粒体表面锚定mRNA序列，序列信息见SEQ ID NO.4。
5.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于携带如权利要求1所述的基因表达框或权利要求2、3、4要求序列的组合。
6.如权利要求5所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，重组腺相关病毒载体包括AAV2和AAV2外壳突变体。
7.如权利要求5所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，重组腺相关病毒载体携带基因组DNA自身互补形成双链DNA分子。
8.一种基因药物，其特征在于，包括权利要求1所述的基因表达框或权利要求2、3、4要求序列的组合以及权利要求5、6、7所述的重组腺相关病毒载体。
9.权利要求8所述的基因药物，其特征在于，给药方式为玻璃体腔注射。
10.权利要求8所述的基因药物，其特征在于，一次给药可持续表达产生靶向线粒体的ND4蛋白，有效缓解或治愈因ND4蛋白编码基因突变引起的Leber遗传性视神经病变。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111088264A (zh) * 2019-04-12 2020-05-01 北京五加和分子医学研究所有限公司 携带c3基因表达框的腺相关病毒载体及其应用
CN113874387A (zh) * 2019-03-28 2021-12-31 总医院公司 用于转基因表达的工程化腺相关(aav)载体

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006117250A2 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Importation of mitochondrial protein by an enhanced allotopic approach
CN104450747A (zh) * 2014-09-23 2015-03-25 李斌 用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组腺相关病毒-NADH脱氢酶亚单位4基因全长以及药剂
CN106520830A (zh) * 2016-11-16 2017-03-22 福建师范大学 利用CRISPR/Cas9对线粒体基因组进行靶向编辑的方法
CN108103103A (zh) * 2017-05-10 2018-06-01 北京五加和分子医学研究所有限公司 一种高脂血症的基因治疗药物

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006117250A2 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Importation of mitochondrial protein by an enhanced allotopic approach
CN104450747A (zh) * 2014-09-23 2015-03-25 李斌 用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组腺相关病毒-NADH脱氢酶亚单位4基因全长以及药剂
CN106520830A (zh) * 2016-11-16 2017-03-22 福建师范大学 利用CRISPR/Cas9对线粒体基因组进行靶向编辑的方法
CN108103103A (zh) * 2017-05-10 2018-06-01 北京五加和分子医学研究所有限公司 一种高脂血症的基因治疗药物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CWERMAN-THIBAULT H等: "Nuclear expression of mitochondrial ND4 leads to the protein assembling in complex I and prevents optic atrophy and visual loss", 《MOL THER METHODS CLIN DEV》 *
DAVID RIMOIN等 主编: "《Emery and Rimoin"s Principles and Practice of Medical Genetics (Sixth Edition)》", 29 March 2013, ACADEMIC PRESS *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113874387A (zh) * 2019-03-28 2021-12-31 总医院公司 用于转基因表达的工程化腺相关(aav)载体
CN111088264A (zh) * 2019-04-12 2020-05-01 北京五加和分子医学研究所有限公司 携带c3基因表达框的腺相关病毒载体及其应用
CN111088264B (zh) * 2019-04-12 2022-04-29 北京锦篮基因科技有限公司 携带c3基因表达框的腺相关病毒载体及其应用

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