KR20180012772A - 파브리 병 유전자 치료 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 서열번호 1의 서열과 적어도 85%의 동일성(identity)을 갖는, 기능성 α-갈락토시다제(galactosidase) A 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 숙주 세포 또는 형질 전환 동물; 및 상기 핵산 분자 또는 상기 벡터를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 파브리 병을 치료하는 방법에서의 핵산 분자의 용도가 기재되어 있다.

Description

파브리 병 유전자 치료
본 발명은 파브리 병을 치료하기 위한 신규한 유전자 치료법에 관한 것이다.
파브리 병(Fabry disease)은 약 1:40,000으로 추정되는 유병률을 가진 희소한 X-연관 유전성 다중체계 리소좀 저장 장애(X-linked inherited multisystem lysosomal storage disorder)이다. 이는 α-갈락토시다제(galactosidase) A 효소가 결핍되어 혈관 내피 세포 및 평활근 세포를 비롯한 다양한 장기의 리소좀 내 중성 글리코스핑고리피드(glycosphingolipids)가 축적되어 발생한다. 이러한 축적은 말기 신장 질환, 심장 합병증 및 뇌졸중으로 이끄는 장기 기능의 손상으로 이어지고 약 58 년의 평균 수명 감소와 연관이 있다.
조혈 줄기 세포 이식은 파브리 병에서 임상적 이점을 입증했으나, 높은 병적 상태 및 사망률과 관련이 있다. 2002 년에 유럽 의약청(European Medicines Agency)은 파브리 병의 유일한 치료법인 두 가지 재조합 효소, 아갈시다제 알파(agalsidase alfa)(Shire HGT, Boston MA, USA) 및 아갈시다제 베타(agalsidase beta)(Genzyme Inc, Boston MA, USA)를 승인하였다. 효소 대체 요법(Enzyme replacement therapy, ERT)은 파브리 병 치료에 있어 합리적이고 유망한 접근법이나, 대표적인 치료법은 아니며, 환자의 평생 동안 약 ￡200K/년의 NHS 비용이 예상되는 주 1회의 정맥 투여를 필요로 한다. 또한 환자의 상당 부분(55-88 %)이 α-갈락토시다제 A에 대한 중화 항체를 생성하여 ERT를 비효율적으로 만든다.
대조적으로, 파브리 병에 대한 유전자 치료법은, 영향을 받은 환자에게 α-갈락토시다제 A 유전자의 정상적인 복제(copy)를 전달하여 α-갈락토시다제 A를 지속적으로 내인성으로 생산하도록 하여 치료하는 가능성을 제공한다.
본 발명자들은 AAV(adeno-associated viral vectors)를 이용하여 α-갈락토시다제 A 유전자의 전달 및 발현을 매개하는 유전자 치료 접근법을 개발하였다. 파브리 병은 단일 유전자의 결함으로 인해 발생하므로 상대적으로 낮은 수준의 효소 교정(correction)은 글리코스핑고리피드의 저장을 감소시킨다. 또한, 적은 수의 세포를 교정하면 대사성 교차-보정 메커니즘의 결과로 원거리 세포도 교정할 수 있으며, 교정된 세포는 주변세포(bystander cell)를 교정할 수 있는 α-갈락토시다제 A를 분비한다. 마지막으로, 본 발명자의 방법은 생체 내, 간세포의 AAV-매개 유전자 전달에 따라 간 매개된 α-갈락토시다제 A의 발현을 수반하여 형질 전환 단백질에 대한 내성을 초래하고, 이에 의해 생성되는 α-갈락토시다제 A에 대한 중화 항체의 위험을 감소시킨다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 서열과 적어도 85%의 동일성(identity)을 갖는, 기능성 α-갈락토시다제(galactosidase) A 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명자들은 놀랍게도, 서열번호 1의 신규한 코돈 최적화된 서열이 간 특이적인 프로모터의 조절하에 AAV 벡터로 형질도입된 간세포에서, 야생형 α-갈락토시다제 A cDNA를 함유하는 동일한 컨스트럭트에 비해, α-갈락토시다제 A 단백질의 발현을 증가시킨다는 것을 발견하였다.
상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 85%의 동일성(identity)을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 86%의 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 87%의 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 88%의 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 89%의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 91%의 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 92%의 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 93%의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 94%의 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열과 96% 이상의 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 98%의 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 99%의 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열을 갖는다.
상기 뉴클레오타이드 서열은 기능성 α-갈락토시다제(galactosidase) A 단백질을 코딩한다. 기능성 α-갈락토시다제 A 단백질은 당지질 및 당 단백질로부터 말단 알파-갈락토실 모이어티를 가수분해한다. α-갈락토시다제 A 활성을 분석하는 적합한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 바람직하게는, 상기 뉴클레오타이드 서열은 야생형 아미노산 서열을 갖는 α-갈락토시다제 A 단백질을 코딩한다. 이 서열은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 이 정보는 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)의 수탁 번호 CAA29232.1 (GI: 757912)에서 찾을 수 있다. 이 단백질에 대한 더 자세한 정보는 NCBI Reference Sequence: NP_000160.1 (GI: 4504009)에서 찾을 수 있다. 야생형 단백질 서열은 429 개의 아미노산을 갖는다.
본 발명의 제 2 양태에서, 본 발명은 α-갈락토시다제 A 단백질을 발현하기위한 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 상술한 핵산 분자를 포함한다. 이는 상기 벡터가 기능성 α-갈락토시다제 A 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유함으로써, 이 서열이 발현될 때 기능성 α-갈락토시다제 A 단백질이 벡터가 함유된 세포에 의해 생산되도록 한다는 것을 의미한다.
상기 서열번호 1의 서열은 코돈 최적화된 α-갈락토시다제 A 뉴클레오타이드 서열이다. 이 서열은 정상적인 방법으로 코돈 최적화되지 않았다. 대신, 상기 코돈은 간에서 높은 수준으로 발현되는 단백질에 사용되는 코돈을 기반으로 선택되었다. 그 이유는 상기 벡터가 보통 간에서 발현되기 때문이다. 이 특별한 코돈 최적화 과정은 놀라울 정도로 높은 발현을 제공하는 뉴클레오타이드 서열을 생성하는 것으로 밝혀졌다.
상기 α-갈락토시다제 A 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 길이가 1265 내지 1315 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 상기 기능성 α-갈락토시다제 A 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 길이가 1270 내지 1310 뉴클레오타이드이다. 다른 구현예에서, 상기 기능성 α-갈락토시다제 A 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 길이가 1275 내지 1305 뉴클레오타이드이다. 특정 구현예에서, 기능성 α-갈락토시다제 A 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 길이가 1280 내지 1300 뉴클레오타이드이다.
바람직하게는, 상기 벡터는 프로모터를 추가적으로 포함한다. 상기 프로모터는 기능성 α-갈락토시다제 A 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 일으킨다. HLP, LP1, HCR-hAAT, ApoE-hAAT 및 LSP와 같은 임의의 적절한 프로모터가 사용될 수 있다. 이들 프로모터는 하기 참조 문헌에 보다 상세히 기술되어 있다: HLP: McIntosh J. et al., Blood 2013 Apr 25, 121(17):3335-44; LP1: Nathwani et al., Blood. 2006 April 1, 107(7): 2653-2661; HCR-hAAT: Miao et al., Mol Ther. 2000;1: 522-532; ApoE-hAAT: Okuyama et al., Human Gene Therapy, 7, 637-645 (1996); and LSP: Wang et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 March 30, 96(7): 3906-3910. 바람직한 프로모터는 WO 2011/005968에도 기술되어 있다. 다른 바람직한 프로모터는 서열번호 2의 서열을 가지며 HLP2라고 한다. 상기 서열번호 2를 갖는 프로모터는 간에서 특히 높게 발현되도록 하는 것으로 밝혀진 간 특이 프로모터이다. 또한, 고발현이 되도록 하는 동안, 이 프로모터는 상대적으로 작아서 벡터를 보다 효율적으로 패기징할 수 있다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 간 특이 프로모터이다.
서열번호 3은 프로모터 및 기능성 α-갈락토시다제 A 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터 컨스트럭트의 뉴클레오타이드 서열이다. 따라서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 3의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 서열과 적어도 91%의 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 서열과 적어도 92%의 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 서열과 적어도 93%의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 서열과 적어도 94%의 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 서열과 적어도 96%의 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 서열과 적어도 97%의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 서열과 적어도 98%의 동일성을 갖는다. 다른 구현 예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 서열과 적어도 99%의 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 서열을 갖는다.
상기 벡터는 바이러스성 벡터 및 비-바이러스성 벡터를 포함하며, α-갈락토시다제 A 단백질을 발현하기 위한 임의의 적합한 벡터일 수 있다. 바이러스성 벡터는 파보바이러스, 아데노 바이러스, 레트로 바이러스, 렌티 바이러스 또는 단순 포진 바이러스를 포함한다. 파보바이러스는 아데노 바이러스 관련 바이러스(AAV)일 수 있다. 벡터는 바람직하게는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터 또는 렌티 바이러스 벡터이다. 보다 바람직하게는, 벡터는 rAAV 벡터이다.
본 발명에 따른 벡터는 유전자 전달 벡터일 수 있다. 이러한 유전자 전달 벡터는 바이러스성 유전자 전달 벡터 또는 비-바이러스성 유전자 전달 벡터일 수 있다.
따라서, 본 발명은 포유류 세포에서의 α-갈락토시다제 A 단백질의 도입 및/또는 발현용 벡터로 이용하기 위한, 동물 파보바이러스, 특히 감염성 인간 또는 시미안(simian) AAV와 같은 데펜도바이러스(dependoviruses), 및 이의 구성성분(예를 들어, 동물 파보바이러스 게놈)을 기반으로 하는 유전자 전달 벡터를 제공한다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "파보바이러스"는 임의의 유형의 AAV와 같은 데펜도바이러스를 포함한다.
파보비리다에(Parvoviridae) 계통의 바이러스는 작은 DNA 동물성 바이러스이다. 파보비리다에 계통은 두 개의 서브 패밀리로 나눌 수 있는데, 척추 동물을 감염시키는 파보비리나에(Parvovirinae)와 곤충을 감염시키는 덴소비리나에(Densovirinae)이다. 파보비리나에 서브 패밀리의 구성원은 본 명세서에서 파보바이러스(parvoviruses)로 불리며, 데펜도바이러스(Dependovirus) 속을 포함한다. 이들의 속의 이름에서 추론할 수 있는 바와 같이, 데펜도바이러스의 구성원은 대개 세포 배양에서 생산적인 감염을 위한 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스와 같은 헬퍼 바이러스와의 동시 감염이 필요하다는 점에서 독특하다. 데펜도바이러스 속에는 인간(예컨대, 혈청형 1, 2, 3A, 3B, 4, 5, 및 6) 또는 영장류(예컨대, 혈청형 1 및 4)를 감염시키는 AAV와 기타 온혈 동물(예컨대, 소, 개, 말 및 양 아데노-관련 바이러스)을 감염시키는 관련 바이러스가 포함된다. 파보바이러스와 파보비리다에의 다른 구성원에 대한 자세한 내용은 Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Chapter 69 in Fields Virology (3d Ed. 1996)에 설명되어 있다. 편의상, 본 발명은 AAV를 참조로 하여 본 명세서에서 추가로 예시되고 설명된다. 그러나, 본 발명은 AAV에 한정되지 않고 다른 파보바이러스에도 동일하게 적용될 수 있음이 이해된다.
알려져 있는 모든 AAV 혈청형의 게놈 구조는 매우 유사하다. AAV의 게놈은 길이가 약 5,000 뉴클레오타이드(nt) 미만인 선형의 단일 가닥 DNA 분자이다. ITRs(Inverted terminal repeats)은 비-구조적 복제 (Rep) 단백질 및 구조적 (VP) 단백질의 독특한 코딩 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치한다. VP 단백질 (VP1, -2 및 -3)은 캡시드를 형성한다. 말단 145 nt는 자기-상보적이고, T-형 헤어핀을 형성하는 에너지적으로 안정한 분자 내 이합체가 형성될 수 있도록 구성된다. 이러한 헤어핀 구조는 바이러스성 DNA 복제(replication)의 기점으로 기능하여 세포 DNA 중합 효소 복합체에 대한 프라이머 역할을 한다. 포유 동물 세포에서 야생형 (wt) AAV 감염 후, Rep 유전자(즉, Rep78 및 Rep52 단백질을 코딩)는 P5 프로모터 및 P19 프로모터로부터 각각 발현되며, 두 Rep 단백질 모두 바이러스 게놈의 복제에 기능한다. Rep ORF의 스플라이싱 현상은 실제로 4 개의 Rep 단백질 (즉, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40)의 발현을 초래한다. 그러나, 포유류 세포에서 Rep78 및 Rep52 단백질을 코딩하는 스플라이싱되지 않은 mRNA가 AAV 벡터 생산에 충분하다는 것이 밝혀졌다. 또한, 곤충 세포에서 Rep78 및 Rep52 단백질은 AAV 벡터 생산에 충분하다.
유전자 치료 벡터로서 사용하기에 적합한 AAV에서, 벡터 게놈은 표적 세포에 전달하기 위해 포장되는 핵산을 일반적으로 포함한다. 이 특정 구현예에 따르면, 이종 뉴클레오타이드 서열은 벡터 게놈의 양 말단에서 바이러스성 ITR 사이에 위치한다. 다른 바람직한 구현예에서, 파보바이러스(예를 들어, AAV) cap 유전자 및 파보바이러스(예를 들어, AAV) rep 유전자는 주형 게놈으로부터(따라서 이로부터 생산된 비리온 DNA로부터) 결실된다. 이러한 배열은 파보바이러스 캡시드에 의해 운반될 수 있는 핵산 서열의 크기를 최대화한다.
이 특정 구현예에 따르면, 상기 핵산은 기질의 양 말단에서 바이러스성 ITR 사이에 위치한다. 파보바이러스 게놈은 단지 하나의 ITR로 기능하는 것이 가능하다. 따라서, 파보바이러스를 기반으로 하는 본 발명의 유전자 치료 벡터에서, 상기 벡터 게놈은 적어도 하나의 ITR, 보다 전형적으로 두 개의 AAV ITR (일반적으로 벡터 게놈의 어느 한쪽, 즉 5' 말단 및 3' 말단 중 하나)이 양쪽에 위치한다. 벡터 게놈 내의 핵산과 하나 이상의 ITR 사이에는 개입 서열(intervening sequences)이 있을 수 있다.
바람직하게는, 기능성 α-갈락토시다제 A 단백질 (포유 동물 세포에서의 발현용)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 두 개의 규칙적인 ITR 사이에 위치하는 파보바이러스 게놈 또는 두 개의 D 부위로 조작된 ITR의 양쪽에 위치하는 파보바이러스 게놈에 도입될 것이다.
AAV 유전자 치료 벡터의 생산을 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 AAV 서열은 임의의 AAV 혈청형의 게놈으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, AAV 혈청형은 아미노산 및 핵산 수준에서 현저한 상동성을 갖는 게놈 서열을 가지며, 유전적 기능의 동일한 세트를 제공하고, 본질적으로 물리적 및 기능적으로 동등한 비리온을 생성하며, 실질적으로 동일한 메카니즘에 의해 복제 및 조립된다. 다양한 AAV 혈청 형의 게놈 서열 및 게놈 유사성에 대한 개요는 예를 들어 GenBank Accession number U89790; GenBank Accession number J01901; GenBank Accession number AF043303; GenBank Accession number AF085716; Chiorini et al, 1997; Srivastava et al, 1983; Chiorini et al, 1999; Rutledge et al, 1998; 및 Wu et al, 2000을 참고한다. 본 발명에서 AAV 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9를 사용할 수 있다. 그러나, AAV 혈청형 1, 5 또는 8은 본 발명과 관련하여 AAV 서열의 바람직한 공급원이다. AAV 혈청형의 서열은 유전자 치료 벡터의 생산에 사용되는 경우 변이되거나 조작될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명과 관련하여 사용하기 위한 AAV ITR 서열은 AAV1, AAV2, AAV4 및/또는 AAV6으로부터 유래된다. 마찬가지로, Rep (Rep78 및 Rep52) 코딩 서열은 바람직하게는 AAV1, AAV2, AAV4 및/또는 AAV6으로부터 유래된다. 그러나, 본 발명과 관련하여 사용하기 위한 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 서열은 공지된 42 개의 혈청형 중 임의의 것으로부터 취할 수 있고, 보다 바람직하게는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 또는 AAV9 또는 예를 들어, 캡시드 셔플링 기술 및 AAV 캡시드 라이브러리에 의해 획득된 신규 개발된 AAV-유사 분자로부터 취할 수 있다.
AAV Rep 및 ITR 서열은 대부분의 혈청형 중에서 특히 보존되어 있다. 다양한 AAV 혈청형의 Rep78 단백질은 예를 들어, 89% 이상의 동일성을 가지며, AAV2, AAV3A, AAV3B 및 AAV6 사이의 게놈 수준에서 전체 뉴클레오타이드 서열 동일성은 약 82%이다(Bantel-Schaal 등, 1999). 또한, 많은 AAV 혈청형의 Rep 서열 및 ITR은 포유 동물 세포내 AAV 입자의 생산에서 다른 혈청형으로부터의 상응하는 서열을 효율적으로 교차-보완(즉, 기능적으로 치환)하는 것으로 공지되어 있다. 또한, US 2003148506에는 AAV Rep 및 ITR 서열이 곤충 세포에서 다른 AAV Rep 및 ITR 서열을 효율적으로 교차-보완한다는 것을 보고하고 있다.
AAV VP 단백질은 AAV 비리온의 세포 영양가치(cellular tropicity)를 결정하는 것으로 알려져 있다. VP 단백질-코딩 서열은 다른 AAV 혈청형 중에서 Rep 단백질 및 유전자보다 현저히 덜 보존되어있다. Rep 및 ITR 서열이 다른 혈청형의 상응하는 서열을 교차-보완하는 능력은 혈청형(예컨대, AAV1, 5 또는 8)의 캡시드 단백질 및 또 다른 AAV 혈청형(예컨대, AAV2)의 Rep 및/또는 ITR 서열을 포함하는 위형 AAV 입자의 생산을 가능하게 한다. 이러한 위형 rAAV 파티클은 본 발명의 일부이다.
또한, 변형된 "AAV" 서열은, 본 발명과 관련하여, 예를 들어, AAV 유전자 치료 벡터의 생산에 사용될 수 있다. 이러한 변형된 서열은 예를 들어. AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 또는 AAV9 ITR, Rep 또는 VP에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열(예컨대, 약 75% 내지 99% 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 서열)을 포함하며, 야생형 AAV ITR, Rep 또는 VP 서열 대신에 사용될 수 있다.
많은 측면에서 다른 AAV 혈청형과 유사하지만, AAV5는 다른 공지된 인간 및 시미안 혈청형보다 다른 인간 및 시미안 AAV 혈청형과 더 다르다. 이를 고려하여, rAAV5의 생산은 곤충 세포에서 다른 혈청형의 생산과 다를 수 있다. 본 발명의 방법이 rAAV5를 생산하는데 사용될 때, 집합적으로 하나 이상의 컨스트럭트의 경우, AAV5 ITR을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 컨스트럭트인 것이 바람직하고, 뉴클레오타이드 서열은 AAV5 Rep 코딩 서열을 포함한다(즉, 뉴클레오타이드 서열은 AAV5 Rep78을 포함한다). 이러한 ITR 및 Rep 서열은 AAV5 또는 위형 AAV5 벡터의 효율적인 생산을 얻기 위해 원하는 대로 변형될 수 있다. 예를 들어, Rep 서열의 개시 코돈은 변형될 수 있고, VP 스플라이스 부위는 변형되거나 제거될 수 있고, 그리고/또는 VP1 개시 코돈 및 인근 뉴클레오타이드는 AAV5 벡터의 생산을 향상시키기 위해 변형될 수 있다.
따라서, 본 발명에서 사용되는 바이러스 캡시드는 임의의 파보 바이러스, 상기에 개시한 바와 같이, 자발적인 파보 바이러스 또는 데펜도바이러스와 같은 것일 수 있다. 바람직하게는, 바이러스 캡시드는 AAV 캡시드(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 또는 AAV6 캡시드)이다. 일반적으로, AAV1 캡시드 또는 AAV6 캡시드가 바람직하다. 파보 바이러스 캡시드의 선택은 당해 분야에 공지된 다수의 고려 사항, 예를 들어 표적 세포 유형, 원하는 발현 수준, 발현될 이종 뉴클레오타이드 서열의 성질, 바이러스 생산과 관련된 문제 등을 기반으로 할 수 있다. 예를 들어, AAV1 및 AAV6 캡시드는 골격근; AAV1, AAV5 및 AAV8은 간 및 중추 신경계 (예컨대, 뇌) 세포; AAV5는 기도와 폐 또는 뇌의 세포; AAV3은 골수 세포; 및 AAV4는 뇌 내의 특정 세포(예를 들면, appendable cells)에 유리하게 사용될 수 있다.
가장 적합한 바이러스, 바이러스 아형 또는 바이러스 혈청형을 선택하는 것은 당업자의 기술적 숙련 범위 내에 있다. 특정 유형의 조직에서는 일부 아형이나 혈청형이 다른 것보다 더 적절할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 핵산의 간-특이 발현은 간 세포의 AAV-매개 형질도입에 의해 유리하게 유도될 수 있다. 간은 AAV-매개 형질도입이 가능하고 다른 혈청 형(예컨대, AAV1, AAV5 또는 AAV8)이 사용될 수 있다. 근육의 형질도입은 혈류를 통해 핵산을 코딩하는 AAV의 투여에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 정맥 내 또는 동맥 내 투여가 가능하다.
본 발명에 따라 제조된 파보바이러스 유전자 치료 벡터는 바이러스 TR 및 바이러스 캡시드가 상이한 파보바이러스로부터 유래된 "하이브리드" 입자일 수 있다. 바람직하게는, 바이러스 TR 및 캡시드는 AAV의 상이한 혈청형으로부터 유래된다. 마찬가지로, 파보바이러스는 "키메라" 캡시드(예를 들어, 상이한 파보바이러스, 바람직하게는 상이한 AAV 혈청형으로부터의 서열을 함유) 또는 "표적화된" 캡시드(예를 들어, 지정된 방향성)를 가질 수 있다.
본 발명의 내용에서 "적어도 하나의 파보바이러스 ITR 뉴클레오타이드 서열"은 대부분 상보적이며 대칭으로 배열된 서열을 포함하는 팔린드롬 서열(palindromic sequence)을 의미하며, 또한, "A", "B" 및 "C" 영역(regions)으로 지칭되는 것으로 이해된다. ITR은 복제의 기점으로서, 복제에서 "시스(cis)" 역할을 갖는 부위, 즉 트랜스-작용(trans-acting) 복제 단백질, 예컨대, 팔린드롬 및 팔린드롬 내부의 특정 서열을 인식하는 Rep78 (또는 Rep68)의 인식 부위로써 역할을 한다. ITR 서열의 대칭에 대한 한 가지 예외는 ITR의 "D" 영역이다. 이것은 유일하다(하나의 ITR 내에 보체(complement)를 가지지 않음). 단일-가닥 DNA의 절단(Nicking)은 A 및 D 영역 사이의 교차점에서 발생한다. 새로운 DNA 합성이 시작되는 곳이다. D 영역은 일반적으로 팔린드롬의 한쪽면에 위치하고 핵산 복제 단계에 방향성을 제공한다. 포유류 세포에서 복제되는 파보바이러스는 전형적으로 2 개의 ITR 서열을 갖는다. 그러나, 결합 부위가 A 영역의 양쪽 가닥에 있고 D 영역이 팔린드롬의 각면에 하나씩 대칭으로 위치하도록 ITR을 조작할 수 있다. 이중-가닥 원형 DNA 주형(예를 들어, 플라스미드)상에서, Rep78- 또는 Rep68- 보조 핵산 복제는 양 방향으로 진행하고 단일 ITR은 원형 벡터의 파보바이러스를 복제하기에 충분하다. 따라서, 하나의 ITR 뉴클레오타이드 서열이 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 2 개 또는 또 다른 짝수 개의 정규 ITR이 사용된다. 가장 바람직하게는, 2 개의 ITR 서열이 사용된다. 바람직한 파보바이러스 ITR은 AAV ITR이다. 안전상의 이유로, 세포 내로의 초기 도입 후에 추가적으로 증식할 수 없는 파보바이러스(AAV) 벡터를 구성하는 것이 바람직할 수 있다. 수용체에서 바람직하지 않은 벡터 증식을 제한하기 위한 이러한 안전 메카니즘은 US 2003148506에 기술된 바와 같은 키메라 ITR을 갖는 AAV를 사용함으로써 제공될 수 있다.
당업자는 본 발명의 AAV 벡터를 생산하는데 사용되는 바이러스 Rep 단백질 (들)이 바이러스 ITR의 공급원을 고려하여 선택될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, AAV5 ITR은 전형적으로 AAV5 Rep 단백질과 보다 효율적으로 상호작용하나, ITR 및 Rep 단백질(들)의 혈청형이 일치할 필요는 없다.
본 발명에서 사용된 ITR은 전형적으로 기능적이며, 즉, 완전히 분해될 수 있고, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 혈청형이 바람직한 AAV 서열이다. 본 발명에 따른 분해가능한 AAV ITR은 ITR이 원하는 기능, 예를 들어, 바이러스 패키징, 통합 및/또는 프로바이러스 구출(rescue) 등을 매개하는 한, 야생형 ITR 서열을 가질 필요는 없다(예를 들어, 삽입, 결실, 절단 또는 미스센스 변이에 의해 야생형 서열이 변경될 수 있음).
유리하게는, 이전의 접근법과 비교하여 유전자 치료 벡터를 사용함으로써, 단백질 합성, 즉, α-갈락토시다제 A 합성의 복원은 형질도입된 세포가 영구적으로 또는 지속적인 기간 동안 획득하는 특성이며, 따라서, 치료 효과를 달성하기 위한 끊임없는 투여를 회피할 수 있다.
따라서, 본 발명의 벡터는 적절한 세포 유형, 예컨대 간세포를 효율적으로 형질전환시키는 유전자 치료 벡터 내 핵산을 조작함으로써 α-갈락토시다제 A 뉴클레오타이드 서열의 생체 내 전달을 위한 전략의 개발 도구를 나타낸다.
상기 벡터는 단일 가닥 벡터 또는 자기-상보적인 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 단일 가닥 벡터이다. 다른 구현예에서, 상기 벡터는 자기-상보적인 벡터이다.
상기 벡터는 폴리 A 꼬리를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이는 기능성 α-갈락토시다제 A 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 하류에 위치한다. 바람직하게는, 폴리 A 꼬리는 소 성장 호르몬(bovine growth hormone) 폴리 A 꼬리이다. 바람직하게는, 이것은 250 내지 270 뉴클레오타이드 길이이다.
상기 벡터는 기능성 α-갈락토시다제 A 단백질이 발현되도록 하는 다른 요소를 포함할 수 있다. 이러한 요소는 당업자에게 잘 알려져 있다.
바람직하게는, 상기 기술된 핵산은 분리된다.
숙련자의 능력으로 상기 기술된 핵산 분자를 생산하는 것이 바람직할 것이다. 이것은 예를 들어, 주어진 서열의 화학적 합성을 이용하여 수행될 수 있다.
또한, 숙련자는 핵산이 기능성 단백질을 발현하는지 여부를 쉽게 결정할 수있을 것이다. 적합한 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 적합한 시험 관내 방법 중 하나는 핵산을 렌티 바이러스 또는 AAV 벡터와 같은 벡터에 삽입하고, 293T 또는 HeLa 세포와 같은 숙주 세포를 벡터로 형질전환시킨 후, α-갈락토시다제 A 활성을 분석하는 것을 포함한다. 대안으로, 적합한 생체 내 방법은 핵산을 함유하는 벡터로 파브리 병을 갖는 마우스를 형질전환시키고 마우스의 혈장에서 기능성 α-갈락토시다제 A를 분석하는 것을 포함한다. 적합한 방법은 하기에서 보다 상세하게 설명된다.
상기 핵산은 뉴클레오타이드로 구성된 임의의 유형의 핵산일 수 있다. 상기 핵산은 단백질이 생산되도록 발현될 수 있어야 한다. 바람직하게는, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA이다.
또한, 본 발명은 상술한 핵산 분자 또는 벡터 중 임의의 하나를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게는, 벡터는 숙주에서 α-갈락토시다제 A 뉴클레오타이드 서열을 발현할 수 있다. 숙주는 임의의 적절한 숙주일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주"는 재조합 유전자 또는 단백질을 발현시키는 데 사용하기에 적합한 생물체 및/또는 세포뿐만 아니라 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터를 보유하는 생물체 및/또는 세포를 지칭한다. 본 발명이 임의의 특정 유형의 세포 또는 유기체에 한정되는 것은 아니다. 실제로, 임의의 적합한 유기체 및/또는 세포가 본 발명에서 숙주로서 사용되는 것으로 고려된다. 숙주 세포는 단일 세포의 형태, 유사하거나 상이한 세포의 집단, 예를 들어 배양물(예를 들어, 액체 배양물 또는 고체 기질상의 배양물), 유기체 또는 그의 일부 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 숙주 세포는 본 발명의 핵산 분자가 발현되도록 할 수 있다. 따라서, 숙주 세포는 예를 들어, 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유 동물 세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 기능성 α-갈락토시다제 A 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 상술한 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 형질 전환 동물을 제공한다. 바람직하게는 동물은 비인간 포유 동물, 특히 영장류이다. 대안적으로는, 동물은 설치류, 특히 마우스일 수 있으며; 또는 개, 고양이, 양 또는 돼지일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 하나 이상의 부형제는 담체, 희석제 및/또는 다른 의학적 제제, 약제 또는 보조제 등을 포함한다.
또한, 본 발명은 파브리 병을 앓고 있는 환자에게 치료적으로 유효한 양의 상술한 바와 같은 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 파브리 병의 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, 환자는 인간이다.
파브리 병이 상기 방법으로 "치료"되면, 이는 파브리 병의 하나 이상의 증상이 완화된다는 것을 의미한다. 이는 파브리 병의 증상이 완전히 치료되어 환자에게 더 이상 존재하지 않는다는 것을 의미하지는 않으나, 일부 방법에서는 이것이 가능할 수 있다. 상기 치료 방법은 파브리 병의 하나 이상의 증상이 치료 전보다 덜 심한 상태를 초래한다.
"치료적으로 유효한 양"은 개체에서 기능성 α-갈락토시다제 A의 수준을 높이는 것과 같이 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 필요한 시간 동안(파브리 병의 증상을 완화시키기에 충분한 수준으로 기능성 α-갈락토시다제 A 생산을 유도하도록) 효과적인 양을 지칭한다.
생체 내에서 본 발명의 핵산 또는 벡터의 숙주 세포로의 전달은 숙주에서 기능적 α-갈락토시다제 A의 증가를 초래할 수 있는데, 예를 들어 파브리 병의 하나 이상의 증상을 완화시키는 수준이다.
파브리 병을 앓고 있는 대상에서 자연적으로 발생한 α-갈락토시다제 A의 수준은 파브리 병의 중증도에 따라 다양하다. 심한 형태의 질환을 가진 환자는 정상적인 건강한 대상에서 발견되는 수준보다 약 1% 미만의 α-갈락토시다제 A 수준을 갖는다(본 명세서에서는 "정상 수준"으로 언급됨). 본 발명의 치료 방법을 사용하는 경우, 기능성 α-갈락토시다제 A의 수준을 정상 수준의 적어도 약 1%까지 증가시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 일부 구현예에서, 본 발명의 치료 방법은 기능성 α-갈 락토시다제 A의 수준을 정상 수준의 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20% 또는 적어도 약 25%로 증가시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 치료 방법은 기능성 α-갈락토시다제 A의 수준을 정상 수준의 적어도 약 30%까지 증가시킨다.
일 구현예에서, 본 발명의 치료 방법은 기능성 α-갈락토시다제 A의 수준을 최대 정상 수준으로 증가시킨다.
기능성 α-갈락토시다제 A의 활성은 비교적 쉽게 측정될 수 있고, α-갈락토시다제 A 활성을 측정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. α-갈락토시다제의 활성은 Clin. Biochem. 45(15):1233-8(2012)에 기재된 바와 같이, 혈액 스폿을 이용하여 혈액에서 용이하게 측정할 수 있다. 이 방법의 원리는 산성 pH에서 α-갈락토시다제가 4-메틸움벨리페릴-α-D-갈락토피라노시드(4-methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside)를 4-메틸움벨리페론(4-methylumbelliferone)과 갈락토스(galactose)로 가수 분해한다는 것이다. 알칼리성 완충액을 첨가하면 효소 반응이 멈추고 4-메틸움벨리페론은 비가수분해된 기질과 상이한 파장에서 형광을 일으키므로 과도한 과량의 비가수분해된 기질이 존재할 때 측정이 가능하다. 백혈구에서는 전체 α-갈락토시다제 활성의 95% 이상이 α-갈락토시다제 A인 반면, 혈장 및 배양된 세포에서는 아이소효소(isoenzyme)인 α-갈락토시다제 B가 전체 α-갈락토시다제 활성에 유의하게 기여할 수 있다. α-갈락토시다제 A는 A 아이소효소의 증가된 열 책임(heat liability)을 이용하여 α-갈락토시다제 B의 존재 하에서 측정 될 수 있으며 혈장에서 α-갈락토시다제 B는 a-NAc 갈락토사민(galactosamine)의 첨가에 의해 저해될 수 있다. 이 방법의 주요 이점은 여과지에 건조된 전혈의 5 ㎕ 스폿만 필요하다는 것이다. 이것은 벡터 투여 후 파브리 Ko 마우스의 실험이 진행됨에 따라 α-갈락토시다제 수준을 실시간으로 측정할 수 있는 이점을 제공한다.
대안적으로, 혈장에서의 α-갈락토시다제 A 활성은 유전자 전달 후 마우스의 말단 출혈로 평가할 수 있다. 이 방법은 상술한 바와 같이, 산성 pH에서 α-갈락토시다제가 4-메틸움벨리페릴-α-D-갈락토피라노시드(4-methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside)를 4-메틸움벨리페론(4-methylumbelliferone)과 갈락토스(galactose)로 가수 분해한다는 사실에 기초한다. 또한 α-갈락토시다제는 항원 수준을 나타내는 표준 웨스턴 블롯 방법 또는 표준 (ELISA 형) 면역방법을 사용하여 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 치료, 예를 들어 파브리 병의 치료에 사용하기 위한 상술한 바와 같은 기능성 α-갈락토시다제 A 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 또는 상술된 바와 같은 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 파브리 병 치료용 약제의 제조에서의 상술한 바와 같은 기능성 α-갈락토시다제 A 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 상술한 바와 같은 벡터의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 기능적 α-갈락토시다제 A 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 대상에게 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상에게 상술한 기능적 α-갈락토시다제 A 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 상술한 벡터를 투여하는 단계를 포함한다.
위의 설명에서, "동일성(identity)"이라는 용어는 두 서열의 유사성을 나타 내기 위해 사용된다. 본 발명의 목적 상, 두 개의 뉴클레오타이드 서열의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 본 명세서에서 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다 (예를 들어, 갭은 제2 아미노 또는 핵산 서열에 대한 최적의 정렬을 위해 제1 핵산의 서열에 도입될 수 있다). 이어서, 뉴클레오타이드 위치의 뉴클레오타이드 잔기를 비교한다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 대응되는 위치와 동일한 아미노산 또는 뉴클레오타이드 잔기로 점유되면, 상기 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 동일성 퍼센트는 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수(즉, 동일성 %=동일한 위치의 수/총 위치 수(즉, 중첩 위치)×100)의 함수이다. 바람직하게는, 2 개의 시퀀스는 동일한 길이이다.
서열 비교는 비교되는 두 서열의 전체 길이 또는 두 서열의 단편에 대해 수행될 수 있다. 전형적으로, 비교는 비교되는 2 개의 서열의 전장에 걸쳐 수행될 것이다. 그러나, 서열 동일성은 예를 들어 약 20 개, 약 50 개, 약 백개, 약 200 개, 약 500 개, 약 1000 개 또는 약 2000 개 또는 그 이상의 연속적인 핵산 잔기의 영역에 걸쳐 수행될 수 있다.
당업자는 두 개의 서열 사이의 상동성(homology) 또는 동일성을 결정하기 위해 여러 다른 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다는 사실을 인식할 것이다. 바람직한 구현예에서, 2 개의 서열 간의 동일성은 소프트웨어 패키지 클론 매니저 프로페셔널 버전 9(바람직하게는 버전 9.4)를 사용하여 분석된다. 이 분석 도구는 Sci-Ed Software (Scientific & Educational Software, 11010 Lake Grove Blvd, Ste 100, PMB 122, Morrisville, NC 27560, USA - http://www.scied.com/index.htm)에서 생산되었다. 서열을 비교하기 위해 사용된 설정은 바람직하게는 다음과 같다: Global DNA alignment; parameters: both strands; scoring matrix: linear (mismatch 2, OpenGap 4, ExtGap 1). 대안적으로, 또한 Fast Scan -MaxScore 및 Fast Scan MaxQual과 같은 다음 방법을 로컬 설정을 사용하여 동일한 소프트웨어와 함께 사용할 수 있다.
또한, 다른 방법이 서열 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 두 아미노산 또는 핵산 서열 간의 동일성 퍼센트(percent identity)는, Blosum 62 matrix 또는 PAM250 matrix, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭(gap) 가중치(weight) 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 이용하는, Accelrys GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman and Wunsch (1970) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다(http://www.accelrys.com/products/gcg/ 이용 가능).
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 인용되어있다.
당업자라면, 예를 들어 핵산, 벡터, 숙주 세포 또는 용도와 관계없이 본 발명의 모든 측면이 본 발명의 모든 다른 양태에 동등하게 적용 가능하다는 것을 이해할 것이다. 특히, 치료 방법의 양태, 예를 들어, 핵산 또는 벡터의 투여는, 파브리 병 치료용 핵산 또는 벡터의 이용과 관련하여, 본 발명의 다른 양태 중 일부에서 보다 상세하게 기술될 수 있다. 그러나, 당업자는 본 발명의 특정 양태에 대해보다 상세한 정보가 주어졌을 때, 이 정보는 일반적으로 본 발명의 다른 양태에 동등하게 적용가능하다. 또한, 당업자는 치료 방법에 관한 설명이 파브리 병 치료에있어서의 핵산 또는 벡터의 이용에도 동등하게 적용 가능하다는 것을 이해할 것이다.
요약
본 발명자들의 연구 프로그램의 최우선 목표는 안전하고 효과적이며 널리 이용 가능한 파브리 병 치료법을 확립하는 것이다. 이 목표를 추구함에 있어서, 본 발명자는 독특한 코돈 최적화된 α-갈락토시다제 A 서열을 갖는 간 표적 AAV 유전자 전달 접근법을 개발하였다.
본 발명의 장점은 다음과 같다:
1. α-갈락토시다제 A를 코딩하는 AAV의 단일 말초 정맥 주입은 파브리 병 환자에서 α-갈락토시다제 A의 장기간 발현을 초래할 수 있다. AAV 매개 유전자 전달에 따른 안정적 장기간 발현은:
a. 효소 대체 요법(ERT)으로 가능한 것보다 패브리 병 환자의 말기 장기 손상 예방 및 기대 수명 개선을 위한 더 많은 임상의 혜택을 제공하며;
b. α-갈락토시다제 A를 규칙적으로 평생 주입할 필요가 없으므로 삶의 질이 향상되고;
c. 값비싼 ERT의 필요성을 줄이거나 없애고 NHS에 잠재적인 절약 효과를 가져온다.
2. 코돈 최적화된 발현 카세트로부터 더욱 강력하게 발현됨으로써 더 적은 용량의 AAV 벡터를 사용하여 치료 효과를 얻을 수 있다.
3. AAV 매개 유전자 전달에 따른 α-갈락토시다제 A의 계속적인 높은 혈장 수준은 중추 신경계 내에서 병리를 교정하는 측면을 개선한다.
4. 간으로부터의 α-갈락토시다제 A의 발현은 ERT 후 55-88%의 환자에서 중화 항체가 발생할 위험이 줄어들 것이다.
본 발명자는 성인(생후 3 개월) 및 새로 태어난(2 일된) 파브리 모델 마우스에서 scAAV8-매개 유전자 전달이 주요한 장기에서 α-gal A의 수준을 이러한 효소의 흡수에 관련된 생리학적 수준보다 상당히 높은 수준으로 초래하는 것을 관찰하였으며, 이는 파브리 병 환자에서 질병의 표현형을 개선할 수 있는 가능성을 높였다. 상기 단백질에 대한 면역 반응은, 초기에 벡터를 투여한 결과 α-gal A 발현 수준이 낮아진 동물에서, 간 매개 형질도입 유전자 발현 후에 관찰되지 않았고, 이는 간이 성인 크기로 성장을 계속하므로, 에피솜(episomally)에서 유지된 AAV 벡터 게놈의 손실이 반영됐을 가능성이 가장 높다.
본 발명은 도면을 참조하여 단지 예로서 상세히 기술될 것이다:
도 1은 야생형(wt) α-갈락토시다제 A(좌측 레인 래더 옆) 및 코돈 최적화(codop) α-갈락토시다제 A(우측 레인)를 발현하는 scAAV8 벡터가 모두 일부 게놈의 검출없이 완전히 패키징된 것을 나타내는 알칼리겔 분석을 도시한다. 이들 벡터는 간 특이 HLP 프로모터의 조절하에 있는 wt 또는 코돈 최적화된 α-갈락토시다제 A 유전자에서 혈청형 8 캡시드로 위형(pseudotyped)되었다.
도 2는 1x107 vg/세포의 MOI(Multiplicity of Infection)로 HUH7 간암 세포내로 형질도입시켰을 때, 코돈 최적화된 α-갈락토시다제 A를 포함하는 scAAV 벡터(scAAV-GLA-codop)는 α-갈락토시다제 A 전사체의 내인성 수준에는 영향을 미치지 않았으나(왼쪽 위 패널), 코돈-최적화 α-갈락토시다제 A mRNA는 높은 수준으로 발현시킨다(오른쪽 상단 패널)는 것을 보여준다. scAAV-GLA-codop은 증가하는 MOI로 HUH7 세포내로 형질도입되어 α-갈락토시다제 A 전사체의 증가 및 용량-특이 발현으로 이어진다(하단 패널).
도 3은 야생형(WT-GLA) 및 코돈-최적화(codop-GLA) α-갈락토시다제 A(α-gal A)를 발현하는 scAAV 벡터를 이용하여 HUH7 세포를 형질도입시킨 2 회 반복결과를 보여준다. GLA-codop 벡터는 GLA 단백질의 높은 발현을 매개하는 것으로 나타났다.
도 4는 성체 파브리 마우스(생후 3 개월) 또는 1 주, 2 주 또는 3 주령의 마우스에게 AAV8-위형(pseudotyped) scAAV-GLA-codop을 각각 4e10vg/마우스(=~2x1012vg/kg) 또는 4e11vg/마우스(=~2x1013vg/kg)로 단일 볼루스 꼬리 정맥 주사한 후의 α-갈락토시다제 A 활성을 보여준다. 도입 유전자(transgene) 발현이 정점에 도달할 것으로 예상되는 유전자 전달 후 3 개월 째에 활성을 결정하였다. 데이터는 말단 출혈(혈장 수준)에서 수집하였다.
도 5는 성체 파브리 마우스(생후 3 개월) 또는 1 주, 2 주 또는 3 주령의 마우스에게 AAV8-위형(pseudotyped) scAAV-GLA-codop을 각각 4e10vg/마우스(=~2x1012vg/kg) 또는 4e11vg/마우스(=~2x1013vg/kg)로 단일 볼루스 꼬리 정맥 주사한 후의 α-갈락토시다제 A 활성을 보여준다. 도입 유전자(transgene) 발현이 정점에 도달할 것으로 예상되는 유전자 전달 후 3 개월 째에 활성을 결정하였다. 데이터는 혈액 스폿을 사용하여 "실시간"으로 수집되었다.
도 6은 형질도입된 동물의 간에 대한 웨스턴 블랏 분석을 나타낸다. α-갈락토시다제 A는 4e11vg/마우스의 용량으로 형질도입된 경우 높은 수준으로 발현되었지만 4e10vg/마우스의 용량으로 형질도입된 경우는 그렇지 않았다.
도 7은 형질도입된 동물의 신장, 백혈구(WBC) 및 심장에서의 α-갈락토시다제 A 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 8은 벡터의 초기 단계 i.p. 주입에 따른 α-GLA 녹아웃 마우스의 신장에서의 글리코스핑고리피드 침전물의 전자 현미경 사진이다. A) 비투여, B) 저용량(2e12 vg/kg) 및 C) 고용량(2e13 vg/kg)으로 투여한 1 주령의 AAV 투여 마우스. 투여된 마우스를 i.p. 주사 후 5 개월 째에 도살하였다(배율: x5000 및 x2000).
도 9는 벡터의 중기 단계 i.p. 주입에 따른 α-GLA 녹아웃 마우스의 신장에서의 글리코스핑고리피드 침전물의 전자 현미경 사진이다. A) 비투여, B) 저용량(2e12 vg/kg) 및 C) 고용량(2e13 vg/kg)으로 투여한 3 주령의 AAV 투여 마우스. 투여된 마우스를 i.p. 주사 후 1 개월 째에 도살하였다(배율: x5000 및 x2000).
도 10은 벡터의 중기 단계 i.v. 주입에 따른 α-GLA 녹아웃 마우스의 신장에서의 글리코스핑고리피드 침전물의 전자 현미경 사진이다. A) 비투여, B) 저용량(2e12 vg/kg) 및 C) 고용량(2e13 vg/kg)으로 투여한 1 월령의 AAV 투여 마우스. 투여된 마우스를 i.v. 주사 후 10 개월 째에 도살하였다(배율: x5000, x2000 및 x200).
도 11은 벡터의 후기 단계 i.v. 주입에 따른 α-GLA 녹아웃 마우스의 신장에서의 글리코스핑고리피드 침전물의 전자 현미경 사진이다. A) 비투여, B) 저용량(2e12 vg/kg) 및 C) 고용량(2e13 vg/kg)으로 투여한 3 월령의 AAV 투여 마우스. 투여된 마우스를 i.v. 주사 후 13 개월 째에 도살하였다(배율: x5000, x2000 및 x200).
재료 및 방법
야생형(WT-GLA) 및 코돈-최적화(codop-GLA) α-갈락토시다제 A를 발현하는 scAAV8 벡터를 간암 세포주인 HUH7 세포에 형질 전환시켜 효능을 평가하였다. 요약하면, 6-웰 배양 플레이트에서 10% FBS가 함유된 DMEM에 배양하고 5x104 세포/웰로 분주한 HUH7 세포를 OPTIMEM 배지(Life Technologies)로 2 회 세척한 후 AAV 벡터로 형질도입하였다. 72 시간 후 세포를 수확하여 DNA, RNA 또는 단백질을 추출하였다. DNEasy Blood and Tissue Kit(Qiagen)를 사용하여 DNA 추출을 수행하고, 세포내 하우스키핑 유전자(마우스 또는 인간 GAPDH 또는 베타-액틴) 뿐만 아니라 형질 전환 유전자 특이 프라이머 및 QPCR 방법을 사용하여 게놈 카피 수(genome copy number)를 계산하였다. AAV 벡터의 게놈 카피 수를 계산할 수 있는 QPCR 동안 표준 곡선을 설정하였다. 숙주 게놈 카피 수는 추출 후 게놈 DNA의 농도를 측정하고 각 세포의 DNA 함량이 6.6pg라고 가정하여 계산하였다. 이들을 두 값으로 나누어서 숙주 세포 당 벡터 게놈 카피를 계산하였다. 제조사의 지시에 따라 Trizol(Life Technologies)을 사용하여 RNA를 추출하고 Superscript II(Life Technologies)를 사용하여 cDNA를 생성하였다. 내인성 또는 코돈-최적화 형태의 α-갈락토시다제 A에 특이적인 프라이머를 사용하여 QRTPCR을 수행하였다. 웨스턴 블롯팅을 위해, 세포를 프로테아제 및 포스파타제 저해제가 첨가된 RIPA 완충액(Sigma-Aldrich)으로 추출하였다.
전자 현미경 분석
코돈-최적화된 α-갈락토시다제 A의 유전자 전달 후 다양한 시점에서 마우스 신장 실질의 미세 구조를 고해상도 전자 현미경으로 평가하였다. 저용량(2e12 vg/kg) 또는 고용량(2e13 vg/kg)의 벡터를 투여하였다.
Figure pct00001
유전자 전달 후 마우스를 다양한 시점에서 죽였다. 신장을 제거하고 10% 중성 완충 포르말린, 메틸 카르노이 용액에 고정시키고 작은 블록을 2.5% 글루타르 알데하이드 및 2% 파라포름알데하이드로 고정시킨 후 1% 오스뮴 테트록시드에서 후 고정시키고 표준 절차를 사용하여 Epon에 포매하였다. 다이아몬드 나이프로 Epon-포매 블록을 80 nm로 절단하였다. 그런 다음 초박막 절편을 전자 현미경 검사를 위해 우라닐 아세테이트와 리드 시트레이트로 이중염색하였다. 동일한 블록면을 다이아몬드 나이프를 대체하는 사파이어 나이프로 1 μm로 절단하였다. 절편을 H-7650 전자 현미경으로 검사하였다.
결과
초기 평가에서, 간 특이적 프로모터의 조절하에 코돈-최적화된 α-갈락토시다제 A를 코딩하는 AAV 벡터로 간세포를 형질전환시킨 경우, 형질전환된 α-갈락토시다제 A의 발현 수준이 야생형 α-갈락토시다제 A cDNA를 함유하는 동일한 컨스트럭트보다 4 배 더 높게 관찰되었고, 이는 종래 기술에 기초하여 예상치 못한 것이다(도 2 및 도 3).
파브리 모델 마우스는 Kulkarni(T. Ohshima et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (1997), pp. 2540-2544)로부터 얻은 C57BL/6 반접합성(hemizygous) 수컷 마우스(0/-) 및 동형 접합성(homozygous) 암컷 마우스(-/-)를 이용하였다. 검증된 q-PCR 분석 및 겔 기반 정량 분석법을 기반으로 하여 성체 파브리 마우스(생후 3 개월)에게 AAV8-위형(pseudotyped) scAAV-GLA-codop을 각각 4e10vg/마우스(=~2x1012vg/kg) 또는 4e11vg/마우스(=~2x1013vg/kg)로 단일 볼루스 꼬리 정맥 주사하였다. 1 주, 2 주 또는 3 주령의 새로 태어난 마우스에게 동일한 양의 벡터를 복강 내 주사하였다. 이후 2 주마다 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 수집하였다. α-갈락토시다제 A 활성은 도입 유전자(transgene) 발현이 정점에 도달할 것으로 예상되는 유전자 전달 후 3 개월 째에 말단 출혈(혈장 수준)에서 상술한 바와 같은 기능 분석에 의해 결정되었다(도 4). 또한, 작은 샘플 용량(일반적으로 혈액 20㎕)을 필요로 하는 혈액 스폿 방법(도 5)을 이용하여 "실시간"으로 α-갈락토시다제 A 활성 수준을 평가하였다.
성체 마우스(3 개월 = 3M) 또는 1-3 주 사이의 초기 생후 기간(1주, 2주, 3주에서 단일 볼러스 주입)에 벡터를 투여했는지 여부에 관계없이, 높은 수준의 기능성 α-갈락토시다제 A 활성이 모든 코호트(N=4 동물/그룹)에서 관찰되었다. 활성 수준은 평균 ± SD = 544 nmol/hr/ml로 3 개월에 2x1012vg/kg의 벡터를 주입한 동물에서 더 높았다. 동일한 투여량의 벡터를 사용하였으나 출생 후 1 주일째에 주사한 동물의 수준은 80 nmol/hr/ml로 7 배 더 낮았다. 이것은 4.0-21.9 nmol/hr/ml의 범위를 갖는 인간의 정상 수준보다 여전히 4 배 이상 높다. 동형 접합체 파브리 마우스에서 0-0.9 nmol/hr/ml의 활성 수준이 관찰되었으나 이형 접합체 동물은 ~7.4 nmol/hr/ml에 근접한 수준을 보였다. 따라서, 유전자 전달 후 α-갈락토시다제 A 활성이 4-26 배 증가하는 것으로 나타났다. 혈액 스팟 분석에서 관찰된 수준은 다소 낮으나, 이러한 분석은 성체 마우스에서 저용량 및 고용량 코호트 각각 118 ± 6 및 176 ± 4 nmol/hr/ml로서 α-갈락토시다제 A 활성이 용량 의존적으로 증가한다는 것을 확인하였다. 1 월령에 벡터를 투여한 코호트에서 유사한 수준이 관찰되었다. 출생 후 2 주째에 형질전환된 동물은 저용량 및 고용량 코호트에 대해 각각 10 ± 2 및 117 ± 7 nmol/hr/ml의 α-갈락토시다제 A 활성을 보였다. 대조적으로, 1 주령에 벡터를 투여받은 동물은 각각 2x1012 또는 2x1013vg/kg 농도 수준의 복강 내 투여 후 2 ± 0.4 및 8 ± 3nmol/hr/ml의 최저 수준의 α-갈락토시다제 A 활성을 나타냈다.
본 발명자들은 다음으로 주요 기관에서 α-갈락토시다제 A 수준을 평가하였다. 4e11vg/마우스의 용량으로 형질전환한 동물의 간의 웨스턴 블롯 분석 결과는 높은 수준의 내인성 인간 α-갈락토시다제 A 발현을 나타났으나(도 6) 4e10vg/마우스로 형질전환된 동물에서는 그렇지 않았다.
4e11vg/마우스(= 2e13vg/kg) 형질전환된 동물에서, 백혈구(WBC)는 혈장으로부터의 흡수를 시사하는 인간 α-갈락토시다제 A의 존재를 나타냈다. 사실 이것은 신장과 심장을 포함한 다른 조직에서 일관된 발견이었다(도 7). 유전자 전달에 이어, α-갈락토시다제 A의 수준은 야생형 C57Bl6 마우스에서 볼 수 있는 수준과 유사하였고, 이는 생리학적 수준의 100%에 근접하는 수준의 발현을 암시한다. 이것은 효소 대체 요법에 대한 본 발명자들의 경험을 바탕으로 봤을 때 예상치 못한 결과이다. 따라서 이것은 AAV 매개 유전자 전달 후 α-갈락토시다제 A의 지속적이고 장기적인 발현이 파브리 병으로 영향을 받는 중요 장기에서 α-갈락토시다제 A의 흡수를 촉진한다는 것을 시사한다. 이러한 중요 장기의 실패는 파브리 병 환자의 평균 수명 단축의 원인이며 효소 대체 요법의 효능에 대해 의문을 제기한다.
신장 관련은 중성 글리코스핑고리피드, 주로 Gb3(globotriaosylceramide)의 축적으로 인한 패브리 병의 주요 특징이다. 따라서 마우스 신장 실질의 미세 구조를 고해상도 전자 현미경으로 평가하였다. 투여하지 않은 파브리 마우스에서 족세포(podocyte)는 족부 과정 융합을 형성하고 저장 과정은 Gb3 축적으로 발생한 반면, 여과극(filtration slits)은 다소포체(multivesicular bodies)를 형성하고 분해되었으며, 세극막(slits diaphragm)은 복합체를 형성했다. 이러한 현상이 발생하면 단백뇨와 사구체 경화증이 발생할 수 있다. 주 산기 기간, 출생 후 1 개월 또는 출생 후 3 개월(투여하지 않은 동물에서 신장 병리학이 확립된 경우)에 AAV8-위형, 용량 의존적이긴 하나 전체 신장 실질에서 많이 제거된 지질 축적은 정상적인 신장 구조로 관찰되었다(도 8-11). 따라서 2x1011 및 2x1012 vg/kg 용량 수준 모두는 축적된 Gb3을 고갈시켰고, 투여된 마우스의 모든 그룹의 신장 조직에서 더 적고, 더 작으며, 또는 덜 조밀한 리소좀의 미세 구조 발견에 의해 설명되는 바와 같이 마우스에서의 재-축적을 방지할 수 있다. 이러한 결과는 α-Gal A가 신장에서 기질을 함유하고 있는 리소좀에 의한 후속 처리를 위해 엔도좀 내로 쉽게 세포내 이입(endocytosed)된다는 것을 제시한다.
시퀀스
서열번호 1: 코돈 최적화된 α-갈락토시다제의 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 2 : 프로모터 HLP2의 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 3 : 프로모터 및 코돈 최적화된 α-갈락토시다제 A 서열(scAAV8-LP1-GLAco)을 포함하는 벡터 컨스트럭트의 뉴클레오타이드 서열. 이 서열은 LP1 프로모터를 포함한다. 코돈 최적화된 α-갈락토시다제 A 서열은 722-2011 염기에 존재한다.
SEQUENCE LISTING <110> UCL Business PLC <120> Fabry Disease Gene Therapy <130> P530226PCT <150> GB1508025.2 <151> 2015-05-11 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1290 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence of codon optimised alpha-galactosidase A <400> 1 atgcagctgc ggaaccccga actgcacctg ggatgcgccc tggcactgag atttctggca 60 ctggtctctt gggatattcc tggagcaagg gccctggaca acggactggc tcgaaccccc 120 acaatgggct ggctgcactg ggagaggttc atgtgcaatc tggactgtca ggaggaacct 180 gatagctgca tctccgaaaa gctgtttatg gagatggccg aactgatggt gtctgagggc 240 tggaaagatg ctgggtacga atatctgtgc attgacgatt gttggatggc accacagcga 300 gacagtgagg gccggctgca ggcagatcca cagagattcc ctcacgggat caggcagctg 360 gccaactacg tgcatagcaa ggggctgaaa ctgggaatct acgcagacgt gggcaataag 420 acatgtgccg gcttccccgg gtcctttgga tactatgaca tcgatgcaca gactttcgcc 480 gactggggcg tggatctgct gaagtttgac ggatgctact gtgatagtct ggagaacctg 540 gctgatggat ataaacacat gtcactggca ctgaatagga ccggccgcag catcgtctac 600 tcctgcgagt ggcccctgta tatgtggcca ttccagaagc ccaactacac agaaatccgc 660 cagtattgta accattggcg aaattttgct gacattgacg attcttggaa gagtatcaaa 720 tcaattctgg actggactag cttcaaccag gaacgaatcg tggatgtcgc aggacctggc 780 gggtggaatg acccagatat gctggtcatc ggcaacttcg ggctgagctg gaatcagcag 840 gtcacccaga tggccctgtg ggctatcatg gccgctccac tgtttatgtc aaatgacctg 900 agacacatta gcccccaggc aaaggccctg ctgcaggaca aagatgtgat cgccattaac 960 caggaccctc tgggaaagca gggctaccag ctgcgacagg gggataattt tgaagtgtgg 1020 gaacgccctc tgtccggact ggcttgggca gtcgccatga tcaaccggca ggagattgga 1080 ggcccaagat cctacacaat cgctgtggca tctctgggga aaggagtcgc ttgcaatccc 1140 gcatgtttca ttactcagct gctgcctgtg aagcgcaaac tgggctttta tgaatggacc 1200 tctcggctga gaagtcatat caacccaact ggcactgtcc tgctgcagct ggagaacact 1260 atgcagatga gcctgaaaga cctgctgtaa 1290 <210> 2 <211> 335 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence of promoter HLP2 <400> 2 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaca cctctctggg cccatgccac ctccaactgg 120 acacaggacg ctgtggtttc tgagccaggg ggcgactcag atcccagcca gtggacttag 180 cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg accttggtta atattcacca gcagcctccc 240 ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat acggacgagg acagggccct gtctcctcag 300 cttcaggcac caccactgac ctgggacagt gaatc 335 <210> 3 <211> 2330 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence of vector construct including promoter and codon optimised alpha-galactosidase A sequence <400> 3 gggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc 60 gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga gagggagtgg 120 ccaactccat cactaggggt tcctggaggg gtggagtcgt gacccctaaa atgggcaaac 180 attgcaagca gcaaacagca aacacacagc cctccctgcc tgctgacctt ggagctgggg 240 cagaggtcag agacctctct gggcccatgc cacctccaac atccactcga ccccttggaa 300 tttcggtgga gaggagcaga ggttgtcctg gcgtggttta ggtagtgtga gaggggaatg 360 actcctttcg gtaagtgcag tggaagctgt acactgccca ggcaaagcgt ccgggcagcg 420 taggcgggcg actcagatcc cagccagtgg acttagcccc tgtttgctcc tccgataact 480 ggggtgacct tggttaatat tcaccagcag cctcccccgt tgcccctctg gatccactgc 540 ttaaatacgg acgaggacag ggccctgtct cctcagcttc aggcaccacc actgacctgg 600 gacagtgaat ccggactcta aggtaaatat aaaattttta agtgtataat gtgttaaact 660 actgattcta attgtttctc tcttttagat tccaaccttt ggaactgaat tcgcggccgc 720 catgcagctg cggaaccccg aactgcacct gggatgcgcc ctggcactga gatttctggc 780 actggtctct tgggatattc ctggagcaag ggccctggac aacggactgg ctcgaacccc 840 cacaatgggc tggctgcact gggagaggtt catgtgcaat ctggactgtc aggaggaacc 900 tgatagctgc atctccgaaa agctgtttat ggagatggcc gaactgatgg tgtctgaggg 960 ctggaaagat gctgggtacg aatatctgtg cattgacgat tgttggatgg caccacagcg 1020 agacagtgag ggccggctgc aggcagatcc acagagattc cctcacggga tcaggcagct 1080 ggccaactac gtgcatagca aggggctgaa actgggaatc tacgcagacg tgggcaataa 1140 gacatgtgcc ggcttccccg ggtcctttgg atactatgac atcgatgcac agactttcgc 1200 cgactggggc gtggatctgc tgaagtttga cggatgctac tgtgatagtc tggagaacct 1260 ggctgatgga tataaacaca tgtcactggc actgaatagg accggccgca gcatcgtcta 1320 ctcctgcgag tggcccctgt atatgtggcc attccagaag cccaactaca cagaaatccg 1380 ccagtattgt aaccattggc gaaattttgc tgacattgac gattcttgga agagtatcaa 1440 atcaattctg gactggacta gcttcaacca ggaacgaatc gtggatgtcg caggacctgg 1500 cgggtggaat gacccagata tgctggtcat cggcaacttc gggctgagct ggaatcagca 1560 ggtcacccag atggccctgt gggctatcat ggccgctcca ctgtttatgt caaatgacct 1620 gagacacatt agcccccagg caaaggccct gctgcaggac aaagatgtga tcgccattaa 1680 ccaggaccct ctgggaaagc agggctacca gctgcgacag ggggataatt ttgaagtgtg 1740 ggaacgccct ctgtccggac tggcttgggc agtcgccatg atcaaccggc aggagattgg 1800 aggcccaaga tcctacacaa tcgctgtggc atctctgggg aaaggagtcg cttgcaatcc 1860 cgcatgtttc attactcagc tgctgcctgt gaagcgcaaa ctgggctttt atgaatggac 1920 ctctcggctg agaagtcata tcaacccaac tggcactgtc ctgctgcagc tggagaacac 1980 tatgcagatg agcctgaaag acctgctgta agatatctga tcatgactcg atgctttatt 2040 tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt 2100 aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt 2160 taaactagtc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg 2220 tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg 2280 gacagatccg ggcccgcatg cgtcgacaat tcactggccg tcgttttaca 2330

Claims (17)

  1. 기능성 α-갈락토시다제(galactosidase) A 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자로서,
    상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 85%의 동일성(identity)을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 95%의 동일성(identity)을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는, α-갈락토시다제 A 단백질을 발현하기 위한 벡터.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 벡터는 간(liver) 특이 프로모터를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 벡터는 AAV 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 단일 가닥(single stranded) 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 서열번호 3의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 서열번호 3의 서열을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 형질 전환 동물.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 벡터 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  13. 치료적으로 유효한 양의 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 벡터를 파브리 병(Fabry disease) 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 파브리 병의 치료 방법.
  14. 치료에 이용하기 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 벡터.
  15. 파브리 병의 치료에 이용하기 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 벡터.
  16. 파브리 병의 치료용 약제의 제조에서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 벡터의 용도.
  17. α-갈락토시다제(galactosidase) A 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 대상에게 전달하는 방법으로서,
    상기 방법은 상기 대상에게 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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